JPH0353884A - ポリペプチドの発現ベクター及びポリペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組み替えＤＮＡ、これにより形質転換された
生物及びこの生物を培養して目的ポリペプチドを製造す
る方法に関するものである。

〔従来の技術〕

組の替えＤＮＡ技術を用いて大腸菌により真核生物由来
の遺伝子を高レヘルで発現させるためには、一般に大腸
菌のｔｒｐプロモーターなどのプロモーターを用い、さ
らに大腸菌遺伝子の有ずるリボゾーム結合領域であるシ
ャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ配列）を、翻訳開始のた
めのＡＴＧを付加した真核生物由来遺伝子の上流に連結
する方法がとられる。

しかし、この方法の場合、真核生物の目的ポリベプチド
が大腸菌体内に顆粒状（封入体ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂ
ｏｄｉｅｓ）となって蓄積されるほど高レベルに生産さ
れることは稀であり、通常は菌体内に微量、溶解した状
態で蓄積されるにとどまる。このような顆粒状に蓄積さ
れない場合の蓄積量を顆粒状に蓄積された場合の蓄積量
と比較すると、蛋白質の性質により異なるが、通常Ｖ，
。。ないし’／＋０００と極めて少量である。従って、
真核生物由来のポリペプチドを大腸菌を用いて工業的に
生産する場合、目的ポリペブヂドを顆粒状にかつ大量に
蓄積せしめることが出来るか否かは工業生産を実施する
場合にはきわめて重要な要素となる。

一方、外来遺伝子の発現性を高める手段として、大腸菌
が本来、高レベルに生産している蛋白質の遺伝子、例え
ば、ＩａｃＺ，　ｔｕｆＢ等の遺伝子に外来遺伝子を連
結すると大腸菌の高レヘル発現蛋白質と外来遺伝子由来
蛋白質が融合蛋白質の形で多量に生産される場合が多い
ことが知られている（ヤング（Ｙｏｕｎｇ，　Ｒ．　Ａ
．）　　ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．八ｃａｄ．　Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８０、１１９４−１１９８、１９８３）。

これは遺伝子発現系が、大腸菌の本来的にもっている蛋
白質をコードする遺伝子を含むものであるために翻訳反
応がスムーズに開始されることが主要因と考えられる。

しかし、この方法で得られる蛋白質はその分子内に外来
目的ポリベブチドの構造を含んではいるものの目的ボリ
ペフ゜チドそのものではない。またさその融合蛋白質よ
り目的ポリペプチドを切断し、分離取得するための方法
として、臭化シアンによるＭｅｔ残基のあるいはヒドロ
キシルア弓ンによるＡｓｎ−Ｇｌｙ結合の特異的切断と
いう化学処理的切断法や、リシルエンドペプチダーゼに
よるＬｙｓ残基のあるいは血液凝固囚子Ｘａを用いるＩ
Ｉｅ−ＧｌｕＧＩｙ−Ａｒｇ配列の切断という酵素的切
断法等の開発もあるが、これら特異的切断法の適用には
いくつかの以下に述べるような制限がある。一般に、化
学的切断法はその実施コス１・は安くなるが、切断の特
異性が１７ｉノ酸残基等に限定されているため、目的ポ
リベプチド中にその該アごノ酸残基が存在しない確率は
きわめて低く適用範囲が狭まってしまう。他方、酵素的
切断法においては、その酵素が非常に高価格で、また大
量入手が困難な場合が多く、目的ポリペプチドの大量工
業生産に対して充分には適合しえない。

以上のような現状を踏まえた上で、真核生物由来の目的
ポリペプチドを工業的に得るためには、融合蛋白質とし
てではなく、目的ポリペプチドをコードする遺伝子の効
率よい直接発現系の構築が重要となってくる。

佐藤ら（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０１，　５２５
−５３４、１９８７）はヒトインターロイキン２の直接
発現プラスミドを構築するに当り、　ｔｒｐプロモータ
ー、ＳＤ配列であるｔｒｐＬのリボゾーム結合配列の下
流にＩＬ−　２ｃＤＮＡを連結したところ、これだけで
は高発現せずに、さらにｃＤＮＡ下流の３゛非翻訳領域
の削除、及びｔｒｐＡターごネーターの導入によって、
ヒトインターロイキン２の高発現、さらには菌体内５ にＩＬ−２の顆粒を蓄積せしむるに至った。木遺伝子発
現系の構戒はｔｒｐプロモーター、ｔｒｐＬのＳＤ配列
、目的ポリペプチドのコード流域、３゛非翻訳領域の削
除、転写終結部位（ｔｒｐＡ）という外来遺伝子発現系
の基本的装置を備えているものであった。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで、本発現ベクターに或熟型ヒトインターロイキン
６（ＩＬ−６）をコードするｃＤＮＡを導入し、ＩＬ−
６の生産を試みたが、その結果、大腸菌体内に微量のＩ
Ｌ−６が可溶化状態で生産されるにとどまっていること
が判明した。つまり、上記の一般的に採用される基本的
外来遺伝子発現装置のみでは、まだ目的ポリペプチドの
顆粒状高蓄積に至るには不完全な点が存在していること
を示すものである。

本発明の目的は真核生物由来の多くの目的ポリペブチド
を直接発現の形で大腸菌体内に著量、顆粒状態に蓄積せ
しむる遺伝子発現系の構築並びにその目的ポリペプチド
の取得方法の提供にある。

６ 〔課題を解決するための手段〕 真核生物のポリペプチドあるいは蛋白質を大腸菌を用い
て工業的に有利に生産するためには、融合蛋白質として
ではなく目的とするポリペプチドだけを大腸菌の菌体内
に著量に、顆粒状に蓄積せしめる遺伝子発現系、及び遺
伝子発現ベクターを構築しなくてはならない。

本発明者らは、遺伝子の直接発現能力を飛躍的に高める
ために、リボゾームのｍＲＮＡへの結合力を適度に高め
ること、及び翻訳開始反応を妨害しうるｍＲＮＡ二次構
造の形威を抑えること、について、検酎し改良を加える
ことによって、実際に目的ポリペプチドを大腸菌体内に
顆粒状に高蓄積させ得る遺伝子発現系の構築に威功し、
本発明を完或するに至った。

即ち、本発明は、ペプチドの遺伝子発現系が上流から少
なくともプロモーター、２つ以上のリボゾーム結合領域
、翻訳開始コドン、ペプチドコード領域及び転万終結部
位がこの順序で配列している遺伝子発現ベクター、この
ベクターを含有する生物、及び該生物を用いるポリペプ
チドの製造法に関するものである。

遺伝子発現ベクターに組み込まれるプロモーターの由来
は問うところではなく、例えば大腸菌のｔｒｐプロモー
ター　ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター　１ａ
ｃプロモーターや、さらにはλファ−ジのλＰｔプロモ
ーター、λＰＲプロモーターなどを用いることができる
。

リボゾーム結合領域は、例えば大腸菌のｔｒｐＬやｔｒ
ｐＥ，　１ａｃＺのりポゾーム結合領域や、λファージ
のＣ■タンパクのリボゾーム結合領域を用いることがで
きる。あるいは化学合威したＤＮＡ配列を用いることも
できる。

本発明のベクターにおいては２つ以上のリボゾーム結合
領域を連結さ一已るが、これらのリボゾーム結合領域は
同し配列であっても、また異なった配列の組合わせでも
よい。リボゾーム結合領域の連結様式は特に制約はない
が、好ましくは２つのリボゾーム結合領域の隔たりは、
５塩基から２０塩基程度である。大腸菌の１（ｉＳリボ
ゾームＲＮＡの３゛末端配列は３゜−　ＡＵＵＣＣＵＣ
ＣＡＣＬＩ八であり、この部分と相補性を有する配列を
リボゾーム結合領域とすることができるが、本発明者ら
は特に適度な親和性を持つ配列としてＤＮＡ塩基配列上
５’　−　ＴＡＡＧＧＡＧＧＴ−３”の採用が優れてい
ることを発見した。

翻訳開始コドンはＤＮＡ塩基配列上、目的ポリペプチド
をコードする領域の直前にＡＴＧを付加することになる
。

ペプチドコード領域は真核生物由来で目的ペプチドをコ
ードするものである。真核生物の種類は問うところでは
なく、例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツ
ジ、ヤギ、サケ、マグロ、酵母等である。目的ペプチド
の種類も問わないが、各種生理活性物質を含み、例えば
、各種インターロイキン、インターフェロン、コロニー
形威因子、リンホトキシン等のリンホカイン、や各種或
長ホルモン類等である。ヒトインターロイキン６　（Ｉ
Ｌ６）はＢ　Ｓ　Ｆ−２　（Ｂ−ｃｅｌｌ　Ｓｔｉｍｕ
ｌａｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ２）とも呼ばれ、当初Ｂ細
胞を抗体産生細胞へ分化させる因子（ＢＣＤＦ　：　Ｂ
−ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ９ Ｆａｃｔｏｒ）　　としてクローニングされたリンフメ
力インである。［Ｔ．　ｌｌｉｒａｎｏ　ｅｔ．　ａｌ
．　Ｎａｔｕｒｅ　３２４．　７３（１９８６））　Ｌ
かし、その後、ＩＬ−６は単にＢ細胞分化能を担ってい
るのではなく、種々の細胞で産生きれ、抗体産生増強能
に加えて造血機能冗進能、分化誘導能等を有することが
確認されている。

また、目的ポリペプチドをコードする遺伝子の前半部分
（目的ポリペプチドのＮ末端側領域をコードするＤＮＡ
部分）としては生産させるポリペプチドのアミノ酸配列
を変えない範囲でアデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）に
富む塩基配列を有するＤＮＡを用いるほうがより好まし
い。

転写終結部位は、例えば大腸菌のｔｒｐＡターξネータ
ー、ｒｒｎＢターミネーター、ｒｅｃＡターミネーター
などを用いることができる。

さらに、目的ポリペブチドの翻訳終止コドンがアンバー
（ＴＡＧ）である時は、アンバー（ＴＡＧ）よりもオー
カー（ＴＡＡ）やオハ−）Ｌｔ（ＴＧＡ）が、さらには
ＴＡＡかつ、またはＴＧＡの２重の翻訳終結コドン（ｄ
ｏｕｂｌｅ　ｓｔｏｐｐｅｒ）を配置す１０ ることか望ましい。また、発現プラスごドのコピー数は
一般に多い方が好ましく、複製起点として、ｐＢＲ系の
複製起点よりｐｕｃ系の方が望ましい。

本発明の遺伝子発現ベクターは他のＤＮＡ配列を含むこ
とができる。特に、リボゾーム結合領域と翻訳開始コド
ンの間にアデニン（Ａ）、チ旦ン（Ｔ）に富む塩基配列
を挿入することにより目的ポリペプチドをより効率よく
発現させることが可能となる。Ａ，Ｔに富む塩基配列と
はＡあるいはＴのみによる場合でも、ＡとＴの混合配列
であってもよく、その長さは特に制約はないが、好まし
くは３塩基から１３塩基である。ＡとＴがこの塩基配列
に占める割合は、７０％以上が好ましい。

このような遺伝子の構築方法としては、まず、強力で制
御可能なプロモーター（例ｔｒｐプロモーター）とそれ
に続く第１のリボゾーム結合領域、及びその下流に転写
終結部位（例ｔｒｐＡターくネーター）が配備された発
現ベクター（複製起点はｐＬｌｃ系）を構築しておく。

次に、目的ポリペプチドをコードする遺伝子部分を用意
するが、この時、５゛側のＤ　Ｎ　Ａ　領域（Ｎ末端約
ｌＯアミノ酸程度をコードずる領ＭＵ）を、アごノ酸配
列を変えない範囲で化学合或ＤＮＡにて置換し、さらに
第２リボゾーム結合領域、Ａ−Ｔに富むＤＮＡ配列も同
時に合威ＤＮＡにて作製し、それらを発現ベクター上の
第１リボゾーム結合領域とべブチドコード領域との間に
挿入し、目的遺伝子を連結することにより高発現可能な
目的遺伝子の発現ベクターが構築できる。

上記の遺伝子発現ベクターを組込む生物は原核生物及び
真核生物のいずれであってもよい。原核生物の例として
は大腸菌、枯草菌などを挙げることができる。真核生物
は例えば酵母などである。

遺伝子発現ベクターをこれらの生物に組込む方法も公知
の方法を利用すればよく、例えば大腸菌では、対数増殖
期の細胞を５０ｍＭの塩化カルシウ１・で氷中約３０分
処理する事により、大腸菌の細胞壁の構造が変化し、続
いてＤＮＡを注入し、約１０分後３０゜Ｃ〜４２゜Ｃで
２分間の熱処理を施した後、培地を加え３０゜Ｃ〜３７
゜Ｃで約６０分培養することで遺伝子発現ベクターを生
物に組み込むことができる。

目的ポリペプチドはこのような生物を培養することによ
って当該生物の体内あるいは培地中に蓄積させることが
できる。培地は各生物を培養しうるそれぞれの公知の培
地を利用すればよく、培養条件も公知の条件でよい。培
養後は目的ポリベブチドを公知の方法で取得すればよい
。

〔作用〕

本発明のポリペプチド発現ベクターにおいてはプロモー
ターはＤＮＡを鋳型にｍＲＮＡ合成（転写）を開始する
ＤＮＡ上のシグナルとして機能し、リボゾーム結合６Ｎ
Ｍ（ＳＤ配列）はりポゾームが最初にｍＲＮＡに結合す
るための結合部位として働く。またその下流に位置する
翻訳開始コドンからポリベプチドの合或が始まる。ベブ
チドコード領域は対応するペプチドを作或する。そして
、転写終結部位は、プロモーターから転写されたｍＲＮ
Ａの合成を終了する働きをなす。

本発明の遺伝子発現ベクターにおいては２つ以上のリボ
ゾーム結合領域を組込むことによってリ１３ ボゾームのｍＲＮＡへの親和性を高め、結合力を増して
いる。そして、リボゾーム結合領域と翻訳開始コドンの
間にアデニンやチ旦ンの含有量の多い塩基配列を組込む
ことによって翻訳開始反応を妨害するｍＲＮＡ二次構造
の形威を抑えて目的遺伝子の発現量を高めている。

〔実施例〕

（１）ＩＬ−５発現プラスミドの構築およびＩＬ−６の
取得例 ■ブラスミドＤＮＡの構築と組み替え菌の取得ｐＢＳＦ
−２０．　（本プラスミドを含有するＥ．　ｃｏｌｉ　
ｐＴＢＣＩＩＦ−０２／［８１０１　は、ＦＥＲＭ　Ｐ
−９０６１　として寄託されている。）は、Ｊ，　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．　１０４、３０−３４　（１９８８）に記
載されているＩＬ−６の直接発現プラスごドである。こ
れはｐＢＲ系の複製起点を持ち、遺伝子発現系としては
ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐＬのＳＤ配列を配備し、ま
た遺伝子の下流にはｔｒｐＡターごネークーが配置され
ている。しかしながら、ｐＢＳＦ２Ｄはインドールアク
リル酸（以下ＩＡＡと略す）添加によるｔｒｐプロモー
ター誘導後もＩＬ−６発現１４ 量は低く、また菌体内にＩＬ−６の顆粒は確認できなか
った。

また、ＩＬ−６のｃＤＮＡ上の翻訳終止コドンはアンハ
ー（ＴＡＧ）であり、大腸菌ＪＩ８　１０１はアンバー
サブレッサーを有するため完全にＴＡＧコドンでＩＬ−
６ポリベプチドの合威を終止させることができず、不用
部分が付加したＩｔ−６の産生を引き起こす可能性があ
る。

そこでます、ｐＢＳＦ−２０の複製起点のｐＵＣへの転
換とＩＬ−６翻訳終止コドンのオーカー（ＴＡＡ）へ変
換を目指して、プラスξドｐＢＳＦ２Ｃ−［ＩＵＣを第
１図に示すようにして構築した。図中の黒帯部分はｔｒ
ｐプロモーター／オペレータ一部分を、黒三角部分はｔ
ｒｐ＾ターミネータ一部分をモして白帯部分はＩＬ−６
コード領域をそれぞれ示している。

第１図に示したように、まずｐＢｓＦ〜２Ｄを制限酵素
ＥｃｏＲ　Ｉ　，　Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉで切断し、ＩＬ−６
ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片とｐ　Ｕ　Ｃ１９　（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ，　Ｊ．（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　［！ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　ＩＯＬ　２０−７８）を
制限酵素Ｈｉｎｃ　Ｉ　Ｉ　，　ＥｃｏＲ　Ｉで切断し
得られる大きいＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼで連
結することにより複製起点をｐＵＣ系とするｐＢＳＦ２
−ＤＵＣを得た。

またｐＴ１３３Ｎｃｏ　（本プラス呉ドを含有するＩＥ
．　ｃｏ１ｉ　ＡＪ−１２４４７はＦＥＲＭ　’Ｐ−１
０７５７として寄託されている。）　（Ｊ．　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．　１０４、３０−３４　（１９８Ｂ）に記載〕
を制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉ　，　Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉで切断し
、得られる小ＤＮＡ断片と上記のｐＵｃＩ９断片を連結
することにより、ｐＴ１３ｓＮｃｏ−ＵＣを構築した。

次に、ｐＢｓＦ２−ＤＬＩＣを制限酵素１１ｉｎｄ　Ｔ
　Ｉ　Ｉ　，　Ｂａｎ　ＴＩで切断して得られる大きい
ＤＮＡ断片と、通常の方法で作製した合或ＤＮＡ断片Ｂ
ＳＣＴ　（ＩＬ−　６翻訳終止コドン変換用）と、さら
にｐＴ１３ｓＮｃｏ−ＵＣを制限酵素Ｂａｍｌｌ　１　
，　Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで消化して得られるｔｒｐＡ
ターミネーターを有するＤＮＡ断片との３つのＤＮＡ断
片を７４ＤＮＡリガーゼで連結することによりｐＢＳＦ
２Ｃ−ＤＵＣを構築した。尚、合威ＤＮＡ断片ＢＳＣＴ
は下記の配列を有している。

ＣＴＧＣＧＴＣＡＡＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧＧＴＡＣＣＧ
ＣＣＧＡＧＡＣＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＴＴＡＣＴＣＣＡ
ＴＧＧＣＣＴＡＧ一方、ＩＬ−６コード領域の前にＳＤ
配列を２つ配備するためにＩＬ−６ｃＤＮＡの一部を化
学合或ＤＮＡにより第２図に示したように改変した（合
成ＤＮＡ断片ＢＳＦＮ　）。図中の破線部分はＳＤ配列
を示している。

この合威ＤＮＡは３９マー（ｍｅｒ）から４５７−の化
学合或ＤＮＡ断片６本（ＢＳＦＮＩＦ，　ＩＲ，　２Ｆ
，　２Ｒ，　３Ｆ，３Ｒ）より次のように作製した。す
なわち、ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製ｍｏｄｅ１３８０Ｂ）により化学合威した
各ＤＮＡ断片を燐酸化後（ＢＳＦＮＩＦ，　ＢＳＦＮ３
Ｒは燐酸化しない）、ＢＳＦＮＩＦとＢＳＦＮＩＲ，　
ＢＳＦＮ２ＦとＢＳＦＮ２Ｒ，　ＢＳＦＮ３ＦとＢＳＦ
Ｎ３Ｒとをアニールさせ、続いてそれらを混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにより連結させた。次に、その反応液を
５％ポリアクリルアξドゲル電気泳動にかけ、泳動、エ
チジュウムブロマイド染色の後、目的合威ＤＮＡ断片Ｂ
ＳＦＮに相当するＤＮＡのハンド（約１３０ｂｐ）を分
取し、精製することにより合成部分ＩＬ−６ＤＮＡを得
た。この合威ＤＮＡ断片ＢＳＦＮは、第３図に示すよう
に制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉ　，　Ａｃｅ　Ｉで消化したｐ
ＵＣ１９の大きいＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼにて
連１７ 結させ、ｐ　Ｕ　Ｃ−ＳＤ６Ｎを得た。図中の格子帯部
分は合或ＤＮＡ部分を示している。なお、合威ＤＮＡ断
片ＢＳＦＮのＤＮＡ塩基配列は、このｐ　Ｕ　Ｃ　−Ｓ
Ｄ６Ｎを用い、両方向からｄｉｄｅｏｘｙ法にて確認し
た。

続いて、第４図に示すように、ｐ　Ｕ　Ｃ　−ＳＤ６Ｎ
を制限酵素Ｃｌａ　Ｉで切断し、クレノウフラグメント
により平滑末端とした後、Ｔｔｈｌｌ８８１で消化する
ことにより得られるＩＬ−６の一部を有するＤＮＡ断片
（約１２０ｂｐ）　と、ｐＢｓＦ２ｃ−ＤｔｌＣをＰｖ
ｕ　Ｉ　ｒ　．．Ｂａｍｌｌ　Ｉ、Ｔｔｈｌｌ８８１で
消化し得られるＩＬ−６の後半部分を有するＤＮＡ断片
（約４７０ｂｐ）　と、ｐＢＲ３２２をＥ　ｃ　ｏ　Ｒ
　Ｖ、Ｂａｍｌｌ　Ｉで消化し、得られる大きいＤＮＡ
断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結することにより
ｐＢＲＳＤ７を構築した。図中、黒帯部分はｔｒｐプロ
モーター／オペレータ一部分を、黒三角部分ばｔｒｐＡ
夕一くネータ一部分を、白帯部分はＩＬ−６コード領域
をそして格子帯部分は合成ＤＮＡ部分をそれぞれ示して
いる。

次に、同じ第４図に示すように、ｐＢＲ　−　Ｓ［ｌ７
をｄａｍ−株の大腸菌に通常の方法により形質転換後、
プ１８ ラスミドを調製しｐＢＲ−ＳＤ７　（ｄａｍ−）を得、
これをＣＩａ　Ｉ　、ＢａｍＩｆ　Ｔ切断することによ
り、半合成１［．−６ＤＮＡを有するＤＮＡ断片を取得
した。そして、このＤＮＡ断片に、再びｐＢＳＦ２Ｃ−
ＤＵＣを制限酵素Ｃｌａ　Ｉ　ＸＢａｍｌｌ　１で切断
して得られるｔｒｐプロモーターおよびｔｒｐＡクーξ
ネーターを有するＤＮＡ断片とを７４ＤＮＡリガーゼに
よって連結する事によりＩＬ−６の高発現、かつ直接発
現プラス旦ドｐＢＳＦ２ＳＤ７を構築、取得した。

続いて、ｐＢＳＦ２−ＳＤ７を大腸菌ＨＢ　１０１に形
質転換し、ＩＬ−６高生産菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｐＢＳ
Ｆ２−ＳＤ７／ＩＩＢＩＯＩ＾Ｊ−１２４４８、ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１０７５８）を得た。

■培養、及び生産物の取得 選択した形質転換株Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｐＢＳＦ２−ＳＤ
７／ＨＢＩＯＩ（ＦＥＩ？Ｍ　Ｐ−１０７５８）を５０
　ｔｔｇ　／　ｍｆｌのアンピシリンを含む２ｘＴＹ　
（１．６％バクトトリプトン、１％酵母エキス、０．５
％ＮａＣＩ、ｐＨ７．０）５ｍＲ中で３０゜Ｃ一晩生育
させた。ついで、その培養懸濁液５　ｍｆｌを１０　０
　ｍｌのＭ９カザξノ酸培地（０．６％Ｎａ２ＨＰ０４
−　１２Ｈｚ０，　０．３％ＫＩＩ２ＰＯ．，　０．０
５％ＮａＣｌ，　　０．１％Ｎｌ１４ＣＩ，　０．０５
％ＭＢＳＯ４−７１１２０．　　０．００１４７％Ｃａ
Ｃ１２．　０．２％グルコース，０．２％カザミノ酸，
　０．０２％Ｌ−ロイシン，　０．０２％Ｌ−ブロリン
，　　０．０００２％チアミン塩酸塩，　１００ｔｌｇ
７ｍｌアンビシリンｐｌ１６．９）　ヘ接種し、３７゜
Ｃにて、３時間培養した。その後、２５μｇ　／　ｍｆ
ｌになるように３インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を添
加し、さら番こ、３７゜Ｃにて、２１時間誘導培養した
。

この一部の菌体懸濁液を位相差顆微鏡により、約１５０
０倍にて観察すると大腸菌体内の顆粒の形成が認められ
た。

続いて、上記の如く培養した菌体懸濁液を遠心分離機に
かけ、菌体を集め２倍濃縮になるように、３０ｍＭ　Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｌＩｃｌｔｉ街液（
ｐｌｌ７．５）を添加し、懸濁後、そこへ０．５ＭＥＤ
Ｔへ（ｐｌ１８．０）でＩ　ｍｇ　／　ｒｒｄｌになる
ように溶かしたりゾチーム溶液３７．５ｍＲを添加し、
撹拌した後、水中にて１時間放置した。ついで超音波破
砕で菌休を破壊し、６０００ｒｐｍ，５ｍｉｎの遠心分
離で顆粒を回収した。

この顆粒を６Ｍ塩酸グアニジンで可熔化し、目的ポリベ
プチドＩＬ−６Ｆ！度が１　０　０　ｐｇ　／　ｍｌ　
，及び２Ｆ１塩酸グアニジン溶液となるように、濃度調
製を行い、これに酸化型グルタチオン１ｍＭと還元型グ
ルタチオン１０ｍＭとなるように添加し、ｐｌ１８．０
で室温で１０〜１６時間放置した。次６こ、Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ−２５によるゲル濾過で塩酸グアニジンを除
去し、ＩＬ−６画分を得た。

本物質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
、その分子量はアミノ酸組戒から計算した値とほぼ一致
し、またプロテインシークエンサーにてＮ末端側のアミ
ノ酸配列を検定した結果、目的産物である成熟型ＩＬ−
６の配列と一部そのＮ末端にメチオニンが付加したＩＬ
−６の配列であることが確認された。

また、生理活性としてはＩｇＭを産生ずるしトＢ細胞株
ＣＬ４　（Ｔ．ｌＩｉｒａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　８２．，　５４９０．　
１９８５）を用いて、ＩｇＭ産生活性を測定した。つま
り、抗体産生活性を測定する検液と６ｘｌＯ’個（７）
　ＣＬ４を２００Ｉ１ｌノ１ｏ％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ
１６４０培地（　１　ｍｆｌ当りペニシリン１００単位
、ストレプｌ・マイシン１００μｇ１ゲンタマイシン１
ｏｐｇ及びＮａＨ２１ Ｃ０．　１６ｍＭを含む）に入れ、この混合物を９６穴
マイクロプレ−１・中で３日間、５％ＣＯ２存在下、３
７゜Ｃで培養し、培養上清のＩｇＭ生産量（最高のＣＬ
４の反応）の５０％を示す抗体産仕活性をｌｕ／ｍＲと
した。

その結果、上記の如く取得した組み替えＩＬ−６は、約
６　．Ｏｕ／ｎｇの比活性を示し、それは、動物細胞よ
り得られた天然のＩＬ−６と同程度の生理活性を持つこ
とが判明した。

以上のようにして、本発明によるポリペプチド製造方法
を用いることにより、効率よ＜ＩＩ．−６ポリベブチド
を製造、取得することができた。

なお、第１表に従来からｆ１４築されていた直接発現プ
ラス貴ドρＢＳＦ−２１）と今回作製した高効率型の直
接発現プラスくドｐＢＳＦ２−ＳＤ７との発現性を比較
して示した。

第１表 ブラスミト名　　ｏｒｉ　　＾−Ｔ豊冨化　ＳＤ配列数
　発現性ｐＢＳＦ−２Ｄ　　　ｐＢＲ系　　　　　　　
　　１　　　　±ｐＢｓＦ２＝ｓＤ７　　ｐＵＣ系　　
　＋　　　　２　　　千十２２ （注）　ｏｒｉ　；複製開始部位の由来、Ａ−Ｔ豊富化
；　ＳＤ−ＡＴＧ間領域の特徴士．ＩＬ−６が菌休全蛋
白の１％以下である十十；　ＩＬ−６が菌体全蛋白の約
２０％である（２）ヒトα−グロビン蛋白誘導体の例グ
ロビン蛋白質はヘモグロビンを構或する蛋白部分である
が、戚人ヒトの場合、それはα−グロビンとβ−グロビ
ンで構威されている。

本発明者らは、各々のグロビンを大腸菌で直接大量発現
させるにあたり、それらのＮ末端に遺伝子の翻訳開始に
必要なメチオニン残基（Ｍｅｔ）とブロリン残基（　Ｐ
　ｒｏ）を付加した各グロビン蛋白の誘導体を計画し、
これらの大腸菌体内に顆粒状蓄積させ得る直接発現プラ
スミドの構築を行い、上記、各ヒ１・−グロビン蛋白誘
導体の効率よい、かつ経済的な取得に戒功した。

■プラスミドＤＮＡの構築と組み替え菌の取得Ｍ．　Ｏ
．　Ｄａｙｈｏｆｆ，　　　“八ｔｌａｓ　　ｏｆ　　
Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ　　　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｉ　　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，　Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ　Ｄ．Ｃ．＋　Ｖｏｌ．５　（１９７２）
に記載のヒトα−グロビンのアξノ酸配列に従い、第５
図に示すようにそれをコーＩ・しうる合成ＤＮＡを作製
した。

α−グロビン１４１アミノ酸を含む領域をコードしうる
合威ＤＮＡを３つのフ゛口・ンク、ＡＯＰＴＩ　　（サ
ブフラグメント１２本）　、ＡＯＰＴ２　（り・ブフラ
グメント１０本）　、ＡＯＰＴ３　（サブフラグメン口
４本）に分割して、実施例（１）と同様にしてｆＪｌみ
立てた。なお、＾ＯＰＴ　１の末端はＳａｃ　Ｔ　、Ｈ
ｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで、八ＯＰＴ　２はＥｃｏＲ　Ｉ　
．．Ｓｐｈ　Ｉで、そしてＡＯＰＴ　３はＳｐｈ　Ｉ　
．．Ｂａｍｌｌ　ＩでそれぞれｐＵｃ１ＢまたはｐＵｃ
１９にクローニングされるようにデザインした。

第６図に示したように、ＡＯＰＴ　１をＳａｃ　Ｉ　，
　ｌｌｉｎｄＩＩＩで処理したｐＵｃ１８へ組み入れ、
ｐｕｃ１ｌｂ（Ａ）を構築した。同様に、ＡＯＰＴ　２
はＥｃｏＲＩ，ｓｐｈ　Ｉ処理したｐＵｃ１Ｂへ組み入
れることにより、また八ＯＰＴ　３はＳｐｈ　　Ｉ　，
　Ｂａｍｌｌ　Ｉ処理したｐＵｃ１９にクローニングす
る事により、それぞれ、ｐＵＣ１ｌｂ（Ｂ）、ｐ　Ｕ　
Ｃ　−１ｌｂ　（Ｃ）を構築した。次にこれらのプラス
ミドはサンガー法によるＤＮＡ塩基配列決定法を用いて
、正しい塩基配列を有していることを確認した。

続いて、α−グロビンの合或ＤＮＡを完成させるため、
第７図に示したようにＳａｃ　　Ｉ　％　Ｂａｍｌｌ　
Ｔ処理したｐＴｌ３５Ｎｃｏの大きいＤＮＡ断片に、ｐ
ＵＣ１｛ｂ（Ａ）をＳａｃ　Ｉ　，　Ｎｓｐ（７５２４
）Ｖ処理し得られる合或ＤＮＡ部分と、ｄａｍ一株から
調製したｐＵＣ−１ｌｂ（Ｂ　）ｄａｍ−をＣｌａ　Ｉ
　，　Ｓｐｈ　Ｉ消化し得られる合戒ＤＮＡ断片、そし
て、ｐ　Ｕ　Ｃ　−１ｌｂ（Ｃ　’）をＳｐｈ　Ｉ　，
　ＢａｍＨＩ処理し得られる合１’ｉＤＮＡ断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼにより連結することによりヒトインター
ロイキン２蛋白質の一部と融合したヒトα−グロビンを
発現し得るプラスミドＰＴ１３ＳＩｌｂα（Ｓ１）を構
築した。図中、白三角はｔｒｐプロモータ一部分を表し
ている。他の記号は第４図と同し意味を表している。

一方、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−グロビン直接発現のための合戒
ＤＮＡとしては第８図に示したものを用いた。

合成ＤＮＡ　．ＡＭＰはＭ　ｅ　＋、−Ｐｒｏ−ｔｘ−
グロビンの単純な直接遺伝子発現系の構築用 ２５ 合或ＤＮＡ　．ＡＭＰＳ　１は翻訳開始コドンの直前を
アデニンに富むＤＮＡ塩基配列にしたＭ　ｅ　ｔＰｒｏ
一α−グロビンの直接遺伝子発現系の構築用合成ＤＮＡ
　．ＡＭＰＳ２は翻訳開始コトンの直前をアデニンに富
むＤＮＡ塩基配列にし、かつ２つのＳＤ配列が配備され
るようにデザインしたＭｅｔ−Ｐｒｏ一α−グロビンの
直接遺伝子発現系の構築用 そこで、第９図に示すように、先ず合成ＤＮＡ．ＡＭＰ
を用いてＭｅｔ−Ｐｒｏ一α−グロビンの直接発現系の
作製を行った。゛プラスξドｐＴ］３Ｓｌｌｂｃｘ　（
Ｓｌ）を制限酵素Ｃｌａ　Ｉ　，　Ａｆｌ　Ｉ　．１で
切断し得られるグロビン遺伝子を有するＤＮＡ断片と合
成ＤＮＡ．ＡＭＰを７４ＤＮＡリガーゼにより連枯し、
Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−−α−グロビン直接発現プラスξドｐ
１１ｌｂ（α）一肝を構築した。

本プラスミドはｔｒｐプロモーターの制御下てＭｅｔ−
Ｐｒｏ−α−グロビンを直接発現させ得る従来用いられ
ている型の遺伝子発現系である。

次に、同し第９図に示すように、ｐＴｌｌｂ（α）−１
’ｌｌ）２６ の複製開始部位をｐＵｃ１９のものに変換した。プラス
ミドｐＵｃｌ９をＥｃｏＲ　Ｉ　，　Ｈｉｎｃ　Ｉ　Ｉ
で切断し得られる大きいＤＮＡ断片に、ｐＴＨｂ（α）
　一ＭＰをＥｃｏＲ１，ＰνｕＩＩで処理し得られるグ
ロビン遺伝子を有するＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結する事によりｐＮｌｌ　ｂ　（α）一肝を構築
した。

また、上で構築したｐＮｌｌｂ（α）−ＭＰを制限酵素
Ｃｌａ　Ｉ、Ａｆｌ　Ｔ　Ｉで切断し得られた大きいＤ
ＮＡ断片に合威ＤＮＡ断片．　ＡＭＰＳ　１をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより連結することにより、ＳＤ配列と翻訳
開始コドン間領域がアデニンに富む配列であるＭ　ｅ　
ｔＰｒｏ−α−グロビン遺伝子直接発現系を有するｐＮ
１１ｂ（α）　−　ＭＰＳＬを構築した。さらに２つの
ＳＤ配列を有するＭｅｔ−Ｐｒｏ一α−グロビン遺伝子
直接発現系は、同様にＣｌａ　Ｉ　、八ｆｌｌｌ処理し
たｐＮｌ｛ｂ　（　ｃｒ　）ＭＰの大きいＤＮＡ断片に
合威ＤＮＡ断片ｉ　ＡＭＰＳ２を連結ずる事により構築
し、第１０図に示すようにｐＮＨｂ（α）−ＭＰＳ２を
作製した。

以上の如く、作製したプラスミドは通常の方法により大
腸菌１１Ｂ　１０１株へ形質転換し、形質転換株を取得
した。なお、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴＨｂ（α）−ＭＰ／Ｉ
ＩＢ　１０１ＡＪ−１２４４９は微工研菌寄第１０７５
９号、ｌＥ．ｃｏｌｉ　ｐＮＩｌｂ（α）−ＭＰ／ＨＢ
　．１０１　ＡＪ−１２４５０ば微工研菌寄第１０７６
０号、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＮＩ｛ｂ（α）−ＭＰＳＩ／Ｈ
Ｂ　１０１　ＡＪ−１２４５１は微工研菌寄第１０７６
１号、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＮ１ｌｂ（α）−ＭＰＳ２／Ｉ
ＩＢＩＯＩ八Ｊ１２４５２は微工研菌寄第１０７６２号
である。

■培養及び生産物の取得 選択した各形質転換株を実施例（１）と同様にして培養
を行い、α−グロビン誘導体の生産性を検討した結果、
ＳＤ配列を２つ有するｐＮＩｌｂ　（α）−Ｍｌ”Ｓ２
においてα−グロビン誘導体の生産性が飛躍的に増大し
、大腸菌体内に顆粒形成が認められた。

なお、各ｐＴｌｌｂ　（α）一ＭＰ．．ｐＮＩｌｂ（α
）　−ＭＰ，　ｐＮＩｌｂ（α）ＭＰＳＩ、ｐＮＨｂ（
α）　−　ＭＰＳ２の生産性比較は第２表にまとめた。

第２表 ｐＴＨｂ（α）−ＭＰ　　ｐＢＲ系　　一　　　　ｌ　
　　　±ｐＮＩｌｂ　（α）−ＭＰ　　ｐＵｃ系　　−
　　　　１　　　　±ｐＮｌｌｂ（α）−ＭＰＳＩ　ｐ
Ｕｃ系　　＋　　　　１−１−ｐＮＩｌｂ（α）−Ｍｒ
’Ｓ２　ｐＬｌｃ系　　＋　　　　２　　　千十（注）
±；α−グロビン誘導体が菌体全蛋白の１％以下である ＋；α−グロビン誘導体が菌体全蛋白の約５％である ＋＋；α−グロビン誘導体が菌体全蛋白の約２０％であ
る 次に、培養した形質転換体ｐＮＨｂ　（α）　−ＭＰＳ
２／ＨＢ１０１より実施例（１）と同様にして、α−グ
ロビン誘導体を取得した。本物質はＳＯＳポリアクリル
アξドゲル電気泳動により、その分子量はアξノ酸組成
物から計算した値とほぼ一致し、またプロテインシーク
エンサーにてＮ末端側のアごノ酸配列を検定した結果、
目的産物であるα−グロビン誘導体配列であることが確
認された。

（３）ヒトβ−グロビン蛋白誘導体の例■プラスごドＤ
ＮＡの構築と組み替え菌の取得Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−β−グ
ロビンの直接発現プラス５ドも実施例（２）と同様にし
て構築した。

第１１図に示したようなβ−グロビン遺伝子を含む合戒
遺伝子を化学合Ｊ＆ＤＮＡオリゴマーにょり２　９一 作製した。第１２図に示すようムこ、それらは３つのブ
ロック、ＢＯＰＴ　ｌ　、ＢＯＰＴ　２、ロＯＩ’Ｔ　
３をまず合成し、それぞれ、ｐＵｃ１ＢをＳａｃ　Ｉ　
，　Ｓａｌ　Ｉで、Ｋｐｎ　（　，　ＳａｌＩで、そし
てＫｐｎ　Ｉ、Ｂａｍｌｌ　Ｉで各々処理した大きいＤ
ＮＡ断片に連結させることにより、ｐＵＣＨｂ（Ｄ）、
ｐ　Ｕ　Ｃ−１｛ｂ（Ｅ）、ｐ　Ｕ　Ｃ−Ｈｂ（Ｆ）を
得た。

またこれらのプラスくドを用いて、３つのブＩｌ’ｌン
クのＤＮＡ塩基配列を決定し、目的どおりの塩基配列で
あることを確認した。

続いて、第ｌ３図に示ずようにＳａｃ　Ｉ　、Ｂａｍｌ
ｌ　Ｔ処理したｐＴ１３３Ｎｃｏの大きいＤＮＡ断片に
、ｐＵＣ−Ｈｂ（Ｄ）をＳａｌ　Ｉ　，　Ｓａｃ　Ｉ処
理し得られる合戒ＤＮＡ部分と、ｐ　Ｕ　Ｄ−Ｈｂ（Ｅ
）をＳａｌ　Ｉ　，　Ｋｐｎ　Ｉ処理し得られる合威Ｄ
ＮＡ断片、そしてｐ　Ｕ　Ｃ　−１ｌｂ（Ｆ）を［ｐｎ
　Ｉ，　Ｂａｍｌｌ　Ｉ処理し得られる合或ＤＮＡ断片
をＴ４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼにより連結することにより
ヒトインターロイキン２蛋白質の一部と融合したヒトβ
−グロビン誘導体を発現し得るプラスごドｐＴ１３５Ｈ
ｂβ（Ｓ１）を構築した。

一方、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−グ口ビン直接発現のための３０ 合或ＤＮＡとしては第８図に示したものを用いた。

合或ＤＮＡ　．ＢＭＰはＭｅｔ−Ｐｒｏ−β−グ・ロビ
ンの単純な直接遺伝子発現系の構築用 合或ＤＮＡ．ＢＭＰＳ２は翻訳開始コドンの直前をアデ
ニンに富むＤＮＡ塩基配列にし、かつ２つのＳＤ配列が
配備されるようにデザインしたＭｅｔ−Ｐｒｏ一β−グ
ロビンの直接遺伝子発現系の構築用 そこで、先ず合或ＤＮＡ　．ＢＭＰを用いてＭ　ｅ　ｔ
Ｐｒｏ一β−グロビンの直接発現系の作製を行った。第
１４図に示したように、ｐＴ１３ｓＩＩｂβ（Ｓ１）を
制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ　，　ＢａｍＨ　Ｉで処理し得られ
るｔｒｐプロモーターを有するＤＮＡ断片と、同しｐ’
ｒｔｓｓｎｂβ（Ｓ１）をＰｓｔ　Ｉ　、Ｂａｍｌｌ　
Ｉで消化し得られるβ−グロビン遺伝子の多くを含むＤ
ＮＡ断片、そして合威ＤＮＡ断片ＢＭＰをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにより連結することでＭｅｔ−Ｐｒｏ−β−グロ
ビン直接発現プラスミドｐＴＨｂ（β）−ＭＰを構築し
た。本プラスミドは、ｔｒｐプロモーターの制御下でＭ
ｅｔ−Ｐｒｏ一β−グロビン直接発現させ得る従来用い
られている型の遺伝子発現系である。次に、ｐＴＩｌｂ
（β）−ＭＰの複製開始部位をｐＵｃ１９のものに変換
した。ブラスミドｐＵｃ１９をＥｃｏＲ　Ｉ　、Ｈｉｎ
ｃ　Ｉ　Ｉで切断し、得られる大きいＤＮＡ断片に、ｐ
Ｔｌｌｂ（β）−ＭＰをＥｃｏＲ　Ｉ　％ＰｖｕＴＴで
処理し得られるグロビン遺伝子を存ずるＤＮＡ断片とを
７４ＤＮＡリガーゼで連結する事によりｐＮＩｌｂ（β
）−ＭＰを構築した。さらに２つのＳＤ配列を有するＭ
ｅｔ−Ｐｒｏ一β−グロビン遺伝子直接発現系は、Ｃｌ
ａ　Ｉ　，　Ｐｓｔ　Ｉ処理したｐＮｌｌｂ　（β）Ｍ
Ｐの大きいＤＮＡ断片に合成ＤＮＡ断片；ＢＭＰＳ２を
連結する事により構築し、第１５図に示すようにｐＮ！
Ｉｂ（β）　−　ＭＰＳ２を作製した。

以上の如く、作製したプラスミドは通常の方法により大
腸菌ＪＩ８　１０１株へ形質転換し、形質転換株を取得
した。なお、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｐＴ１｛ｂ（β）−ＭＰ
／＋１＋３１０１八Ｊ−１２４５３は微工研菌寄第１０
７６３号、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｐＮＩＩｂ（β）−ＭＰ／
ＨＢＩＯＩ　ＡＪ−１２４５４は微工研菌寄第１０７６
４号、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｐＮＨｂ（β）−ＭＰＳ２／Ｈ
Ｂ１０１　ＡＪ−１２４５５は微工研菌寄第１０７６５
号である。

■培養及び生産物の取得 選択した各形質転換株を実施例（１）と同様にして培養
を行い、β−グロビン誘導体の生産性を検討した結果、
α−グロビン誘導体の場合と同じくＳＤ配列を２つ有す
るｐＮＨｂ（β）　−　ＭＰＳ２においてβグロビン誘
導体の生産性が飛躍的に増大し、大腸菌体内に顆粒形威
が認められた。なお、各ｐ　Ｔ　ＩＩ　ｂ（β）一肝、
ｐＮＩｌｂ（β）一肝、ｐＮＩｌｂ（β）−ＭＰＳ２の
生産性比較は第３表にまとめた。

第３表 ｐＴＩｌｂ（β）−ＭＰ　　　ｐＢＲ系　　−　　　１
　　　±ｐＮｌｌｂ（β）−ＭＰ　　　ｐｌｌｃ系　　
−　　　１　　　±ｐＮｌｌｂ（β）−ＭＰＳ２　　ｐ
ＵＣ系　　＋　　　２　　　＋」−（注）±；β−グロ
ビン誘導体が菌体全蛋白の１％以下である １−＋；β−グロビン誘導体が菌体全蛋白の約２０％で
ある 次に、培養した形質転換体ｐＮＩＩｂ（β）　−　ＭＰ
Ｓ２／ＨＢ１０１より実施例（１）と同様にして、β−
グロビン誘導体を取得した。本物質＆ｉ　Ｓ　Ｄ　Ｓポ
リアクリルア３３ ξドゲル電気泳動により、その分子量はアミノ酸組或か
ら計算した値とほぼ一致し、またプロテインシークエン
サーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した結果、目的
産物であるβ−グロビン誘導体配列であることが確認さ
れた。

〔発明の効果〕

２つ以上のＳＤ配列をＩＬ−６ポリペプチドコード領域
の上流に配備すること（プラスミドｐＢｓＦ２ＳＤ７の
場合）により既存の一般的な遺伝子発現装置を配置した
もの（プラスミドｐＢＳＦ−２０の場合）に比べ飛躍的
にＩＬ−６生産性の向上が確認できた。

また、ＩＬ−６以外にもα−グロビン誘導体、βグロビ
ン誘導体の飛躍的発現、生産においても本発明の効果が
確認できた。

本発明によれば、目的ポリペプチドが従来の一般的な直
接発現法では高発現せず、菌体内に顆粒状蓄積されない
ものであっても、木遺伝子発現系を適用することにより
、目的ポリベブチドを多量に、かつ安価に製造すること
が出来る。

【図面の簡単な説明】

３４ 第１図はプラスξドｐＢｓＦ２ｃ−ＤＵＣの構築工程を
示す図面である。 第２図は合威ＤＮＡ断片ＢＳＦＮの塩基配列を示す図面
である。 第３図はプラスミドｐＵＣ−ＳＤ６Ｎの構築工程を示す
図面である。 第４図はＩＬ−６の直接発現プラスミドであるｐＢＳＦ
２−ＳＤ７の構築工程を示す図面である。 第５図はヒトα−グロビン誘導体をコードする合或ＤＮ
Ａの塩基配列を示す図面である。 第６図はプラスミドｐｔＪｃ−｝｛ｂ（Ａ）、ｐＵＣＨ
ｂ（Ｂ）、ｐＵＣ−Ｈｂ（Ｃ）の構築工程を示す図面で
ある。 第７図はプラスミドｐＴ１３ｓＨｂα（Ｓ１）の構築工
程を示す図面である。 第８図はＭｅｔ−Ｐｒｏ−グロビンの直接発現に必要な
合成ＤＮＡ断片である。ＡＭＰ．．ＢＭＰ，ＡＭＰＳＩ
、ＡＭＰＳ２、ＢＭＰＳ２の塩基配列を示した図面であ
る。 第９図はプラスミドｐＴＨｂ（α）−ＭＰ及びｐＮＨｂ
（α）−ＭＰの構築工程を示す図面である。 第１０図はプラス稟ドｐ　Ｎ　Ｈ　ｂ　（α）−ＭＰＳ
Ｌ及びｐＮＨｂ（α）−ＭＰＳ２の構築工程を示す図面
である。 第１１図はヒトβ−グロビン誘導体をコードずる合威Ｄ
ＮＡの塩基配列を示す図面である。 第１２図はプラスごドｐＵＣ−１−｛ｂ（Ｄ）、ｐＵＣ
Ｈ　ｂ　（Ｅ）、ｐＵＣ−Ｈｂ（Ｆ）の構築工程を示す
図面である。 第１３図はプラスごドｐＴ１３ｓＨｂβ（Ｓ１〉の構築
工程を示す図面である。 第１４図はプラスごドｐ　′Ｊ”　Ｊ｛　ｂ　（β）−
ＭＰ及びｐＮＨｂ（β）−ＭＰの構築工程を示す図面で
ある。 第１５図はプラスミドｐＮＨｂ（β）−ＭＰＳ２の構築
工程を示す図面である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペプチドの遺伝子発現系が上流から少なくともプ
   ロモーター、２つ以上のリボゾーム結合領域、翻訳開始
   コドン、ペプチドコード領域及び転写終結部位がこの順
   序で配列している遺伝子発現ベクター
2. （２）リボゾーム結合領域が２つである請求項（１）に
   記載のベクター
3. （３）２つ以上のリボゾーム結合領域と翻訳開始コドン
   の間がアデニン及び／又はチミンに富む塩基配列を有す
   る請求項（１）に記載の遺伝子発現ベクタ
4. （４）ペプチドコード領域がインターロイキン６をコー
   ドする領域である請求項（１）に記載のベクター
5. （５）請求項第（１）、（２）、（３）又は（４）記載
   のベクターが組み込まれた生物
6. （６）生物が原核生物である請求項（５）に記載の生物
7. （７）生物が真核生物である請求項（５）に記載の生物
8. （８）原核生物が大腸菌である請求項（６）に記載の原
   核生物
9. （９）請求項（５）に記載の生物を培地中で培養し、ペ
   プチドコード領域に対応するアミノ酸配列を有するポリ
   ペプチドを菌体内及び／又は培地中に蓄積せしめ該ポリ
   ペプチドを採取することを特徴とする該ポリペプチドの
   製造方法