SU1642956A3 - Способ получени лошадиного @ - и @ -интерферона - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии . Получают ген-библиотеку ДНК, ткани печени лошади, осуществл ют скрининг с помощью радиоактивно мар кированных генов человека с выделением гомологенных последовательностей , клонируют к ДНК в случае Oi-ин- терферона в вектор pUC 9 с последую щим реклонированием к ДНК в вектор, parp ATER 103 и pBR 322 с получением экспрессионных плазмид, в случае ft-интерферона клонируют к ДНК в вектор pUC9, реклонируют фрагмент к ДНК, кодирующий -интерферон в плаэмиду parpATER 103 и конструированием экс- прессионной плазмиды рАН62, полученные плазмиды экспрессии трансформируют в штамм бактерий E.coli IM 101, трансформанты культивируют с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 2 з.п. , 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии .

Способ получени  лошадиного OL - у ft-интерферона заключаетс  в том, ЧЕГО ткань печени лошади инкубируют $ присутствии буфера, рН 8,0, экстрагируют ДНК с использованием фенола диализом и осаждением ДНК этанолом, полученную ДНК центрифугируют при 40000 об/мин в буфере, рН 8,0, диали- зуют и осаждают этанолом ДНК длиной более 50 к.Ъ. (пар оснований), которую подвергают частичному перевариванию эндонуклеазой Sau ЗА в присутствии буфера, рН 7,5, полученные фрагменты фракционируют путем электрофореза , выдел ют фрагменты длиной 10-23 к.Ь,, которые после дефосфори лировани  клонируют в векторе

ЕМВЬЗ(-ЗА), полученную ген-библиотеку ДНК подвергают скринингу с помощью радиоактивно маркированных ин- терфероновых генов человека с выделением гомологичных последовательностей , при этом дл  получени  fltf -ан- терферона Hind Ill-Фрагмент клона Eg-ftil лигируют с гидролизованным с помощью Stnal и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомби- нантными ДНК трансформируют бактерии Escherichia coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАН50, далее плазмиду рАН50 обрабатывают Hind III-эндонук- леазой и лигируют с обработанными полинуклеотидкиназой SphI-св зками, получают плазмиду рАН51, плазмиду рАНЗО гидролизуют PvuII, лигируют f

С

олигонуклеотидом 5 - TGTGACCTGCCTCAC, который предварительно обрабатывают полинуклеотидкиназой, денатурируют ДНК кип чением, удлин ют олигонук- леотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии,dATP, dGTP, dCTP и dTTP, удал ют 3 -выступ инкубацией с Т4-ДНК-полимеразой в присутствии dATP, dGTP, dCIP и dTTP, далее фрагмент лигируют с олигонуклеотидами, 12-мером 5 -AGCTTAAAGATG и 8-мером 5 -САТСТТТА полученную ДНК обрабатывают эндо- нуклеазами Hind III и Bgl II полу- ценный фрагмент длиной 190 к.Ь. лиги руют с гидролиз о ванным Hind III и Bgl II вектором рАН51, полученную плазмиду рАН5 1/2 режут Sph I и Hind III и лигируют с Hind III -

Sph I или Hind III - BatnH I фрагментом плазмиды parpATER 103 с получением экспрессионной плазмиды рАН52 или рАН 52/2, или плазмчду рАН52 гидролизу ют эндонуклеазами Sph I и EcoRI, затупл ют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP, получают ДНК длиной 1,1 к.Ь., плазмиду pBR 322 переваривают с помощью Pvu II и

EcoRI, затупл ют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова и дефосфорилируют с получением ДНК длиной 2,4 к.Ь., которую лигируют с ДНК длиной 1,1 к.Ь. с получением экспрессионной плазмиды рАН53, дл  получени  р-интерферона Pvu 11-фрагмент отобранного клона Eg--ft&, лигируют с гидролизе ванным с помощью 5таа I и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомби- нантными ДНК трансформируют бактерии E.coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАНбО, затем плазмиду рАНбО обрабатывают Hgi А1-эндонуклеазой и после выпр млени  3 -выступающих концов ДНК с помощью Т4-ДНК-полимеразы тупые концы лигируют с обработанными лолинуклеотидкиназой Sph 1-св зками, полученную ДНК режут Sph I и Hind III полученный фрагмент длиной 1,85 к.Ь. лигируют с разрезанной Hind III и SphI плазмидой parpATER 103, получен кую плазмиду рАН61 режут BamHI и Sail с получением фрагмента длиной 1,3 к.Ь., которой лигируют с переваренной BamHI и Sail M13tnp9-фаговой . ДНК, полученную однонитевую ДНК лигируют с олигонуклеотидом

о

5

0

5

0

5

5 -GTGAACTATGACTTG, который предварительно обрабатывают полинуклеотидки- назой , денатурируют ДНК кип чением, удлин ют олигонуклеотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP и полученную ДНК осаждают, оставшиес  од- нонитевые участки ДНК переваривают с помощью SI-нукпеаэы и полученную ДНК с тупыми концами лигируют с олиго- нуклеотидами, 12-мером 5 -AGCTTAAAGATG и 8-мером 5 -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Hind III и SphI, полученный фрагмент длиной Ц1 к.Ь. лигируют с Hind II - SphI фрагментом parpATER 103 с получением экспрессионной плазмиды рАН62, полученными экспрессионными плазмидами трансформируют штамм бактерии E.coli Ш 101 и трансформанты культивируют с последующим выделением и очисткой конечного продукта.

I

Пример 1. Получение экспрессионных плазмид рАН52, рАН52/2 и рАН53.

Стади  А. Выделение лошадиной ДНК.

Замороженную ткань печени лошади размалывают в жидком азоте до порошка и в течение 3 ч при 55°С инкубируют в 0,5 М этилеидинитрилтетpa- уксусной кислоты (ЭДТА), 10 мМ трис- НС1, рН 8,0, 0,5% додецилсульфата натри  (ДСН), 0,1 мг/мл протеиназы К (20 мл/г ткани). Полученный в зкий раствор освобождают от белка путем экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), диализуют против буфера 50 мМ , рН 8,0, 10 мМ ЭДТА и 10 мМ хлористого натри , ДНК осаждают двум  объемами этанола. После полного высушивани  в вакууме ДНК раствор ют в ТЕ-буфере (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) при 4 С и вместе с хлористым цезием в количестве 1,273 г/мл раствора центрифугируют в течение 62 ч при 20°С со скоростью 40000 об/мин. После полного удалени  CsCl-градиента содержащие ДНК фракции диализуют против ТЕ-буфера, затем ДНК осаждают двум  объемами этанола, промывают 70%-ным этанолом, высушивают и снова раствор ют в ТЕ-буфере (4°С).

Готовый ДНК-препарат свободен от РНК и имеет длину более 50 к.Ь., что

определено путем электрофореза на 0,45%-ном агаровом геле.

Стади  Б. Частичное переваривание эндонуклеазой и фракционирование по размерам лошадиной ДНК.

50 мкг лошадиной ДНК двукратно ингибируют при 37°С с 1,6 ед Sau3A в 450 мкл реакционной среды (10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ хлористого магни , 1 мМ дитиотрейтола). Спуст  15, 25 и 40 мин отбирают по 150 мл раствора и смешивают с 15 мМ ЭДТА и путем нагревани  в течение 10 мин при 70 С прекращают реакцию. После добавлени  0,3 М ацетата натри , рН 6,0, ДНК осаждают с помощью 2,5 объемов этанола После повтор ного растворени  в ТЕ-буфере ДНК раздел ют по величине путем электро- фореза в течение ночи на 0,45%-ном агаровом геле в ТВЕ буфере (10,8 г/л трис, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л На2ЭДТА) примерно при 1 В/см с использованием маркеров величины Ј переваренна  с помощью EcoRI и Hind III и с помощью Hind II л мбда ДНК) вырезают ДНК длиной 10 23 к.Ь., ДНК электроэлюируют в течение 3 ч при 300 В (буфер 0,1хТВЕ), очищают на колонке Элютип и дефосфо- рилируют следующим образом.

ДНК инкубируют в течение 30 мин при 37°С в 140 мкл реакционной среды (50 мМ трис-HCl, рН 9,5, 10 ммоль хлористого магни , 0,1 мМ ацетата цинка, 1 ммоль спермидина) вместе с 5 ед. кишечной фосфатазы крупного рогатого скота, добавл ют следующие 5 ед фермента и инкубируют 30 мин После добавлени  ЭДТА до конечной концентрации 25 мМ ДНК экстрагируют однократно смесью фенола с хлороформом и иэоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), двукратно смесью хлоро форма с изоамиповым спиртом (24:1 по объему) и трехкратно диэтиловым эфиром , осаждают этанолом, высушивают и раствор ют в 0,1хТЕ-буфере.

Стади  В. Построение лошадиной ген-библиотеки ДНК

Дефосфорилированные длиной 10- 23 . фрагменты лошадиной ДНК клонируют в л мбда-векторе, л мбда- EMBL3 (или-ЗА) , с тупыми G-A-T-C- концами, полученными путем удалени  внутреннего BamHI-фрагмента фаговой ДНК.

I

10

42956°

8 мкг фрагмента EMBL-3A лигируют примерно с 5 мкг фрагментов длиной 10-23 к.Ь. лошадиной ДНК длиной 10- 23 к.Ь. в присутствии 10 ед. Т4-ДНК лигазы, инкубируют в течение ночи при 14°С и один день при 4°С в 50 мкл реакционной среды (66 мМ , рН 7,2, 0,1 М хлористого натри , 10 мМ хлористого магни , 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотрейтола, 0,5 мМ АТФ). Продукт лигировани  упаковывают в зрелые фаговые частит цы с использованием in vitro л мбда- упаковывающей системы

Компоненты этой системы, т.е. ультразвуковой экстракт (УЭ), лизат, получаемый путем замораживани -размораживани  (ЛЗР), буферы Ml и А, приготавливают известным способом, 10 мкл продукта лигировани  в течение 2 мин инкубируют при комнатной температуре вместе с 25 мкл УЭ, который так же,как и ЛЗР, в течение

25 30 мин инкубируют во льду, смешивают с 100 мкл ЛЗР и инкубируют далее в течение 60 мин при комнатной температуре Смесь разбавл ют 150 мкл л мбда-разбавител  (100 мМ трис-НС1,

30 рН 7,5, 10 мМ сульфата магни , 1 мМ ЭДТА) и хран т при 4°С

Часть упакованных л мбда-фагов

15

20

титруют на Eocoli NM 528 SupF. В целом получают примерно 1 неза-

висимых лошадиных рекомбинантных ДНК Остаток упакованного материала размножают путем нанесени  на содержащие штамм NM 528 и сульфат магни  LB-агаровые пластины плотностью

30000 п тнообразующих единиц на 13,5 см пластины.

Стади  Г Скрининг лошадиной ген- библиотеки

По 10 мкг высокомолекул рной ло-

шадиной ДНК полностью переваривают с помощью EcoRI (Hind III), путем электрофореза раздел ют в 0,8%-ном агаровом геле и перенос т на нитро- целлюлозные фильтры Hind III-фраг-

мент плазмиды рЕКЗЗ длиной 845 к,Ъ., который содержит всю кодирующую белок область дл  зрелого человеческого р6 2АРС-интерферона получают маркированную Р-32 ДНК.

Нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизируют в течение 7 ч при 65°С в (0,9 М хлорисг того натри , 50 мМ гидрогенфосфата

натри  5 мМ ЭДТА, рН 7,4), 5 раст вор .Денхардта (0,1% Фиколла, 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота), 0,1% ДСН, 20 мг/мл ДНК из спермы лосос  и затем гибридиэируют .в таком же растворе, но без ДНК из спермы лосос , с использованием 13-10 срт маркированной пробы После инкубации при 65°С в течение ночи фильтры промывают четырехкратно в течение 1- 1,5 ч в 3xSSC (0,45 М NaCl, 45 мМ цитрата натри ), 0,1% ДСН при 65°С и экспонируют в течение 7 дней на рентгеновской пленке фирмы Кодак с помощью усиливающих пленок фирмы Кодэк По влени-2 нескольких полос доказывает наличие семейства интер- фероновых генов у лошадей, как оно было ранее обнаружено у крупного ро- гатого скота, свиней и у человека

Поэтому дл  скрининга генов интерферона в библиотеке лошадиных ДНК примен ютс  такие же услови  гибридизации

600000 рекомбинантных л мбда-фагов нанос т на содержащие штамм E.coli NM 528 пластины плотностью 30000 п тнообразующих единиц на 13,5 см пластины Четырехкратные нитроцеллюлозные реплики готов т с каждой пластины После высушивани  в течение 2 ч при 80°С фильтры промывают в течение 1,5 ч при 65 С в 1 М хлористого натри , 10 мМ трис- НС1, рН 8,0, 0,17. ДСН, предварительно гибридизируют в течение ночи и по 2 реплики каждой пластины гибри- дизируют в течение 24 ч с использова нием на 1 фильтр 1, сртп пробы радиоактивного оЈ-интерферона После трехкратно повторенного скрининга получают 8 клонов лошадиного { -интерферона , которые дают положительные сигналы гибридизации

Стади  Д Характеристика ре комби нантных фагов I

Из 7 гибридизирующихс  с человеческим Об-интерфероном рекомбинантных ДНК готов т фаговую ДНК. ДНК переваривают рестриктазами EcoRI, BamHI, Hind III, PstI, Bglll, Sail, Smal и путем электрофореза раздел ют в 0,8%-ном агаровом геле Величина гибридиризующих фрагментов определ етс  по способу Саусерна Положение рестрикционных мест внутри л мбда-

10

15

20

25

(

- 40

6429568

вставки определ ют после частичного рестрикционного переваривани  л мбда- ДНК, маркировки правых или левых тупых концов л мбда-ветвей синтетическими , маркированными Р-32 олигонук- леотидами и электрофореза в 0,45%- ном агаровом геле

Стади  Е Субклонирование гена лошади ного&б -интерферона

Рестрикцнонный фрагмент клона Eg-odl, который гибридизуетс  с маркером чело вече ско го об интерферона, субклонируют в векторе pUC9 плазми- ды pBR322. Вставка чужого ДНК-фрагмента приводит к прерыванию lac z-гена ft - галактозидазы и таким образом измен ет фенотип трансформированного плазмидой штамма E.coli IM 101 от lac до lac. Колонии бактерий с фенотипом 1ас отбирают по белой окраске.

Hind Ill-фрагмент длиной 3,2 к.Ь. из клона Eg-0Ј-l элюируют из агарового гел , очищают на колонке Элю- тип-Д, лигируют с 40 нг разрезанного с помощью Slal и дефосфорилирован- ного вектора pUC9 в примерно 10-кратном мол рном избытке, трансформируют в E.coli IM 101 и нанос т на LB-топ- агар с 0,2 мг/мл БХИГ (5-бром-4- -хлор-З-индолил-Д-О-галактозид) , 0,17 мг/мл ИПТГ (изопропилтиогалак- тозид) и 0,1 мг/мл ампициллина Белые колонии выращивают в 5 мл LB-бульона с О,1 мг/мл ампициллина в течение ночи при 37 С с последующим скринингом Полученную при этом плазмиду обозначают как рАН50.

Стади  Ж. ДНК-последовательность гена лошадиного Об-интерферона из клона Eg-Cil.

Hind Ill-вставку плазмидыvpAHSO длиной 3,2 к.Ь. подвергают анализу последовательностей по методу Санге- ра, 50 мкг плазмидной ДНК из рАН50 полностью переваривают рестриктазой Hind III, фрагмент длиной 3,2 , выдел ют из 1%-ного агарового гел  и очищают. 15 мкг этого фрагмента в 100 мкл среды лигировани  лигируют /с 14 ед. Т4-ДНК-лигазы при 14°С в течение ночи и затем при 4°С следующие 4 дн  Лигированную ДНК фрагмен- тируют с помощью ультразвука импульсами в 20 с в течение 140 с в лед ной бане. ДНК-фрагменты в течение 2 ч при 14°С в 250 мкл реакционной среды (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ

30

35

45

50,

55

91642956Ю

хлористого магни , 1 мМ дитиотренто-ной репликативной формой бактериофагла , 0,5 мг/мл альбумина сывороткига М13тр8 и трансформируют E.coli

крупного рогатого скотэ, по О,1 мМIM 101. Однонитевую ДНК полученного dATP, dCTP, dCTP, dTTP) обрабатывают , рекомбинантного фага выдел ют и пос15 ед.большого фрагмента полимеразы-1ле св зывани  с одним синтетическим

из E.coli (фрагмент Кленова) . Послеолигонуклеотидом осуществл ют син

концентрировани  путем осаждени  второй нити в четырех отдельных

нолом ДНК раздел ют в 1%-ном агаро-реакци х с использованием фрагмента вом геле и ДНК-фрагменты длиной 10 Кленова ДНК-полимеразы 1 из E.coli. О,,0 к.Ь. выдел ют и очищают.Ниже привод тс  нуклеотидна 

Примерно в 10-кратном мол рном избыт-Hind Ill-вставки плазмиды рАН50,

ке фрагменты лигируют с разрезаннойаминокислотна  и полна  нуклеотидна 

рестриктаэой Smal и дефосфорилирован-последовательности Eg-рб-интерферона.

«л:.:ГГА Г111А5-1ГСЛГ1СИМ1СГТ5С 51еА:зАйА1Л «ГДЛ«ПГАОЧ:ТГ1СТГТ 7 ПСТ«тТ.А5Г М #{ 5С«М ™СЧШГга5ТШIU

ш «ть у:ллсбк; мгеетоис- ч гессак: з

иТГО« ҐАТЈУ 7«ПСШШТ« АСАГКАСШ6ва« J

W-IS-I -3-IIJ

fet «I In fra tr In 1м Rtt «I In Til 111 In r Cri Hii S«r ll« Cy ttr U StrfFQjJip Ln Г9 n «

ATS ta ere ест ш tec ft cis «is ccc trt ITB ere crc c rsc rec rc TIC гст ств ш т SAC c;e en c «x ш

19ISИ23 3

J«r In Sly   Ш V) 7il Ln Ittt Ln In flf SI 1rt «г; Arf II Pr« P $«(cJTJlio lyi A$p Vf In lie fh (Ir

KC tie esc   AW ETC m «те стс cie es см «те «5 « АТС тсс crc ттс тсс тес ств ил sec ASA ш esc ш ш ж

W43XЯМ43

Й1 Гго Sin fl« Vil fbt Atf (I; AM 51 П Ar« Lri fro Alt lit br Mi l HI tl« THr lit Sti SJe И П 4it IN

nt ccc s« «те m мс кс АЛ с« гтс си А« ест см «ее «тс тег see etc САГ м чх тс см см АТС пс сх стс и

70ПWСtoП

fl S«r Thr tif «1| Sir S«f «a III Trf to Ui S«r LM In 111 Lri Ln Tfr TV ftr In Туг Jlt He In TV fli In fit

nc AK iu «вес тез тп tec re та ад w sc стс о ж л пс ГАС «сг ш стс ш САС см ст$ «т ss cie SM w

IN1W- 11«(131Л13

Ui(r|ln.:(r tit Til (If VU ill 81 TV fri In IKt As П« Aip 5«f In LH III Vii Ar Arg Tjr П| tb V9 II

ta T6I CT A6C US M ПС KS CTf 6M SM «С CCt СП ATg A«C 6A6 6AC TCC CTS CTS GC7 tT6 W« ASA ТДС ITC CM АЫ JTC 174

:«шi«itsIM . is

Alt Ln Tjr In It в П« In IT ff S «( ff SI lit Та Arf Oil Ui tit Htt Ar| Str П S«r Str Sir Ttr DM

tCT СТС («Г СТв CM GAS AM Mft T«C AK СП ПТ «СС ТИ 6А5 АТС «ТС ASA SCA вМ АТС ATS ЛИ ТСС ПС ТП ТО ТСС АС ИС Ш

1Й

IM fr til 8«f

ГТС CCS CM AST TM (8М«Д«ЖГ6К«ОТШТСААиТЕ МТЮ7ПиП{ иТААТАТСАС tOTt

шмт« 1 хтб«гтвллтслттттаюшт1шт HW

тпАтлЈ тлтйт«тт тАге т пАтптт«пбаАГАОГТАгет5САОтпАСдсгегАбгттАйтдгА№ u

штАптттстетшсАтПЗГтаийСтвтАбЛА 11Л

: Пат СаГЫГТвТиТАТТСААША6А«ТАЛА: ТАйЮТО1СТААбаТКПвТАиПЕ«Та«Ы 134

ГШГ|1т1ППТПСв(ТА«аГМ1МС«ТАДС1МПК1ГТиТМГТ6А«Т«ТТМиАЩПМА1ТААШU7

1ТМ1Я1МТвС 1 иМААМ1ПА5ТЮиЛТСТССХТ6аАТАПССА$ПТССААТПКА С 1712

ОТКЕА ЈА:5& ЕААТ«АЕААААС6ЖТТШДПСАТТеСТАЗ€АаТТСААССП«иАе9б6АбБАСАА IMI

Јг«$ :и1езтздЈгздсдт$тм5шттААКтсшАбААЕ«сод :о:о

и

5 1«езитстшбтитв5Алпис

тста мз ад: «54с;шш

«игтб :с итткц;бтимшт

гтйтстзглиттз САКСАсти:

«5й;;: сгк«г«1:и тгс1еда 51йадект™

ииэш пс вмюкм«оиштаа   :

18С СС«Л«С ТС1СйСТ51СааШСП«Т6« ™2

 аднтшв ииттиштааттемаш

«Я1 го «стбаытю«л« « « 5™

1642956

12

« :ПКГКШ;АА«СГГ

Стади  К. Конструкци  экспрес- сионных плазмид рАН52, рАН52/2, рАН53.

20 мкг плазмиды рАНЗО (см. ста дню Е) переваривают с помощью 30 ед. Hind III и ДНК-фрагмент длиной 4,2 к.Ь., который содержит весь ген uil-интерферона, выдел ют из агарового гел  с помощью ДЕ81-бумаги и очищают. Дл  этого после разделе- ни  ДНК-фрагментов в агаровом геле перед и после выдел емой ДНК-полосы вырезают щель, в которую вставл ют полосу ДЕ81-бумаги. Электрофорез продолжают до тех пор, пока желаемый ДНК-фрагмент полностью не будет св зан с передней полосой бумаги. Задн   полоса, предотвращает загр знение более крупными фрагментами ДНК i

ДЕ81-бумагу со св занным ДНК-фрагментом промывают дважды в течение 5 мин в 400 мкл буфера с низким содержанием соли (0,2 М хлористого натри , 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и затем ДНК дважды в течение 10 мин элюируют с бумаги ДЕ81 с помощью 200 мкл буфера с высоким содержанием соли (I M хлористого натри , 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и осаждают 1 мл этанола. Концы Hind Ill-фрагмента снабжают св зками Sphl. Дл  этого 0,2 мкг св зки SphI вместе с 2 ед. полинуклеотидкиназы инкубируют в 10 мкл реакционной сред в течение 45 мин при 37 С (70 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ хлористого магни , 1 мМ АТФ, 5 мМ дитиотреитола Sphl-св зки лигируют с Hind

+

5

0

5

0

5

0

5

фрагментом с помощью 8 ед. Т4-ДНК-ли- газы в течение 20 ч при 4°С. Затем фрагмент инактивируют при 70°С и ДНК переваривают с помощью 30 ед. Sphl в общем объеме 100 мкл, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом. ДНК лигируют и трансформируют E.coli НВ 101. Получаемую плаз- миду обозначают как рАН51 Она содержит ген рб1-интерферона с укороченной 3 -нетранслированной областью и дополнительным Sphl-местом разреза.

Дл  того, чтобы встроить ДНК- последовательность зрелого лошадиного -ант ер феро на на нужном рассто нии от последовательности промотора, используют ДНК-фрагмент длиной 0,4 к.Ь. который выдел ют из 200 мкг разрезанной PvuII плазмиды рАН50. 1 нмоль синтетического 1,5-мерного олигонук- леотида с последовательностью 5X-TGTGACCTGCCTCAC обрабатывают поли- нуклеотидкиназой Он содержит последовательность , котора  кодирует первые 5 аминокислот зрелого Oil-интерферона из клона рАН50. 15-мер смешивают примерно с 7 пмоль PvuII-фраг- мента длиной 0,4 к.Ь. и в общем объеме 34 мкл кип т т в течение 5 мин, чтобы денатурировать двунитевую ДНК. После охлаждени  св занную с одной- нитью олигонуклеотидную затравку в 70 мкл реакционной среды (50 мМ трис- HCl, рН 7,2, 10 мМ сульфата магни , 0,1 мМ дитиотреитола, 50 мкг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ dATP, dGPT, dCTP, dTTP) удлин ют с помощью 30 ед. фрагмента

Кпенова в течение 3 ч при 37°С. Дл  удалени  возможного 3- выступа ДНК затем инкубируют вместе с 16 ед. Т4-ДНК-полимеразы в течение 20 мин

при 37°С в J20 мкл реакционной среды (33 мМ трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ ацетата кали , 10 мМ ацетата магни , 0,5 мМ дитиотрейтола, 0,1 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогато- го скота, по 1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Образовавшуюс  ДНК с тупыми концами экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают при 0°С в течение 15 мин 0,45 М ацетата натри  и

0,6 об.ч. 2-пропанола. С полученной ДНК лигируют смесь олигонуклеотидов: 12-мера S -AGCTTAAAGATG, 8-мера 5 -САТСТССА,котора  дает Hind Ill- место разреза и трансл ционный старт кодон АТС. По 1 нмоль этих двух оли- гонуклеотидов лигируют с ДНК-фрагментом в 20 мкл с помощью 14 ед. лигазы в течение 40 ч при 4°С. После инактивации фермента при 70°С полу- ченную ДНК в 100 мкл разрезают с помощью 80 ед. Hind III и 20 ед. Bglll и ДНК-фрагменты длиной примерно 190 к.Ь. выдел ют из 2%-ного агарового гел  на Е81-бумагу и очищают. Полученный ДНК-фрагмент лигируют с 50 нг разрезанным Hind III-и Bglll рАН51-вектором и транслируют E.coli НВ 101. Из 65 полученных колоний выдел ют 4 плазмиды, которые обладают желательным рестрикционным рисунком. Из них выдел ют один Hind III - BamHI-ДНК-фрагмент, который подвергают анализу последовательностей по методу Сангера. Эту плазмиду обозна- чают как рАН51/2. 20 мгк плазмиды рАН51/2 разрезают рестриктазами SphI и Hind III, образовавшийс  ДНК- фрагмент длиной 1,0 к.Ь. выдел ют из агарового гел  и лигируют с 40 нг

разрезанной с помощью Hind III- и Sphl-плазмиды рагрАТЕКЮЗ.

Полученную после трансформации E.coli HB 101 экспрессионную плазмиду обозначают как рАН52. Она содержит все необходимые дл  индуцируемой экспрессии зрелого лошадиного оЈ1 интерферона информации. Аналогичным образом из разрезанной Hind III

„

„

и Bam HI плазмиды рагрАТЕЕЮЗ полу1 чают экспрессионную плазмиду рАН52/2. Эта экспрессионна  плазмида примерно на 0,2 . длиннее, чем рАН52, и

с

jg J5

20 25 30 ,, - до 45

50

55

дополнительно имеет сингул рное BamHI-место разреза.

В плазмиде рАН53 триптофановые промоторы , ген об 1-интерферона, устойчивый к ампициллину ген и начало репликации ориентированы в одном направлении .

Плазмиду рАН53 получают из плаз- мид рАН52 и pBR322 следующим образом.

10 мкг рАН52 разрезают с помощью SphI и EcoRI, ферменты инактивируют при 70°С и после добавлени  по 0,15 мМ dATP, dGTP, dCTP и dTTP ДНК- концы делают тупыми с помощью фрагмента Кпенова в течение 1 ч при 22 °С.

ДНК-фрагменты фракционируют по величине в агаровом геле и выдел ют фрагмент длиной 1,1 к.Ь,, который содержит промотор и ген интерферона. 10 мкг плазмиды pBR322 переваривают с помощью EcoRI и Pvul; концы также выпр мл ют с помощью фрагмента Клено- ва и затем дефосфорилируют с помощью фосфатазьг тел чьего кишечника. ДНК-фрагмент длиной 2,4 к.Ь. выдел ют из агарового гел . Оба полученных таким образом фрагмента ДНК лигируют с помощью Т4-ДНК лигазы и трансформируют E.coli HB 101.. Таким образом получают экспрессионную плаэмиду рАН53, котора , содержит два места распознавани  EcoRI.

Пример 2. Получение экспрес- сионной плазмиды рАН62 дл  получени  лошадиного Л-интерферона.

Стадии А-В осуществл ют аналогично примеру 1.

Стади  Г. Скрининг лошадиной ген- библиотеки генов интерферона.

Но 10 мкг высокомолекул рной лошадиной ДНК полностью переваривают с помощью EcoRI (Hind III), раздел ют путем электрофореза в 0,8%- ном агаровом геле и перенос т на нитроцеллюлозные фильтры. Готов т радиоактивно маркированную ДНК-пробу из PstI - BglII-фрагмента, кодирующего человеческий ft-интерферон кДНК-клона P1F12. Эта проба кодирует аминокислоты 48-166 зрелого 3-интерферона

Нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизируют в течение 7 ч при 65°С в 5XSSPE (0,9 М хлористого натри , 50 мМ гидрогенофосфата натри , 5 мМ ЭДТА, рН 7,4), 5 X раст вора Денхардта (0,1% фиколла, 0,1%

15.1

поливинилпирролидона, 0,1% альбуми- на сыворотки крупного рогатого ско- та, 0,1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота), 0,1% ДСН, 20 мг/мп ДНК из спермы лосос , затем гибридизируют в таком же растворе , но без ДНК из спермы лосос  с использованием 13X10 ерш маркированной пробы После инкубации при 65°С в течение ночи, фильтры промывают четырехкратно в течение 1-1,5 ч в 3 х SSC (0,45 М хлористого натри , 45 мМ цитрата натри ), 0,1% ДСН при 65°С и экспонируют в течение 7 дней на рентгеновской пленке 4ирмы Кодак с помощью усиливающих пленок фирмы Кодак.

Дл  скрининга генов интерферона в библиотеке лошадиных ДНК примен ютс  такие же услови  гибридизации.

600000 рекомбинантных л мбда- фагов нанос т на содержащие штамм E.coli HM 528 плотностью 30000 п тно образующих единиц на 13,5 см пластины . Четырехкратные нитроцеллюлозные репликаты готов т с каждой пластины. После высушивани  в течение 2 ч

PvuIII-фрагмент длиной 4,5 к.Ь., который гибридизуетс ; с пробой человеческого jb -интерферона выдел ют очищают, лигируют по Smal сайту плаз

при 80°С фильтры промывают в течение

1,5 ч при 65°С в 1 М хлористого нат- 30 миды pUC9 и трансформируют E.coli

ри , 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,1%Ш 101. Трансформант с желательной

ДСН, предварительно гибридизируют в

течение ночи и по 2 реплики каждой

пластины гибридизируют в течение

вставкой (рАНбО) выращивают и плазми- ду характеризуют.

Последовательность Hind III-фраг-

24 ч с использованием I к10 срт про- 35 мента, аминокислотна  и нуклеотидна  бы радиоактивного ft-интерферона напоследовательности Eg-Й-интерферона,

фильтр. После трехкратно повторен-рАНбО представлены ниже.

AASCrii:AlTCCrft3IITTCA6nATArT6rA6AIS6TT6AGSTI6CtA6ftfMrt6C -C;SAT6iKCISA«A ai«f3rSAT6rcneCTSISCA 6 101

тббЈ1ШгаАА т««АТбШАбПбА;и:АПйТ МАтатАб гу

«тМП666МТТАШСТ«Т СтаТ6ААААА6 ТТаШАСШ6АJJ1

АС7абТ«ТА5СЙ«ТтАШСАтАвтАтТ67ТСеТ1ШАтААСААТ «8

АСАТ«Ш КАЙТА68«ПТАМ6А1АСАвА8ТтА6А8АСТАС 5

Т66««СагаШАТААГ ТА6СОАС«1С/ША6 SoCTttiASSSASTAAASSCAACACTSneCTSTCTTWrC

М-15-10-5-II3

tt Пг Гут ATI Iff lit 1м Pro fot All Liu In LIB Cys Pit Sw tbf fhr Ma Leu Ser Til Asi Тут Asp let In Arf Sir Sin

АГ8 ACC TAC A6fi IЈ3 АТС CTC Ctt AI6 BCS CTC CT6 CIS 1ST ПС TCC ACS ACS 6CT ОТ ID STS AAC TAT VЈ П6 СП С68 tCC CAA Kb

1«13 иЗвЯ

Ui rf Sir Au Str AljfCrsllM Kt{ In In Ar; 61 a Lw Asa 61т la fn SIa flu Aifl TV Ntt,Asa Phc 61  

C1B «4 A6C АЯ AAT T« SCA Ш CT6 AT6 CTC CIS J38 CA8 П8 AAT 6fiA ЙХ CtT CAA CSt I6C CCC ttS 6AC АСА ATS AAC ПС C« I7t

U«M -S3МИ

il Pro Sit Sli tit Sli Sin AU Slo 6la PD« Sli Irs 6U Asp All All Lea Vil fl( Тут 61 a Kit In (III TV Trp Jrij lit JTC CCT 6AS «A3 АП 6AG CAA KA O8 CAS ПС СДв ЛА6 6A6 «AT KT «CA Пв 6ТС АТС AT 6AS АТв CTC «в CAC ACC T6S СбГ АП fit

16

ного скрининга получают 6 клонов лошадиного А-интерферона, которые«дают положительные сигналы гибридизации.

Стади  Д. Характеристика рекомбинантных фагов.

Из 3 гибридизирующихс  с человеческим /3-интерфероном рекомбинантных ДНК готов т фаговую ДНК.ДНК , переваривают с помощью EcoRI,, BatnHI, Hind III, PstI, Bglll, Sail, Smal и путем электрофореза раздел ют в 0,8%-ном агаровом геле. Величина гибридизирующихс  фрагментов опреде- л етс  по способу Саусерна. Положение рестрикционных мест внутри л мбда- вставки определ ют после частичного рестрикцийиного переваривани  л мбды- ДНК, маркировки правых или левых тупых концов л мбда-ветвей синтетическими , маркированными Р-32 олигонук- леотидами и электрофореза в 0,45%- ном агаровом геле.

Стади  Е Субклонирование гена лошадиного fi -интерферона,

PvuIII-фрагмент длиной 4,5 к.Ь., который гибридизуетс ; с пробой человеческого jb -интерферона выдел ют, очищают, лигируют по Smal сайту плаз0

вставкой (рАНбО) выращивают и плазми- ду характеризуют.

Последовательность Hind III-фраг-

7 73W«3W«

t. «П Irf In П «U S«r TV «If TfBfA 64 TV (It Vil in I I v l n« Ґl1 «« lw « J |Ј J1 ,,„

,-тс MA «и мт TTC KT we «т esc tee ш см MX Ate en ш мс cic en STB KA STC MI ere CAS STB еле CST ere м 10,1

M103tl«115IMИ

V AM In fli 61, lit Ret «« Ив И Str fcr TV Trp TV, lit LN «r« l« lyi LT Тут Sir И III S«r

о AAC CTS ess SAA ATA дтв t we «АЛ «с тсс лес тте e« «AC лсл ACC in СТБ м« AM тле ESA «s АТС тсв ни

О113КОИЗИ 1Я

;« Trr In L,« Mi 1Я LfJ Trr Sir «iR«lAU trp TV Vil Vil (la Ml 6I« «ft leu «r| In Ita « L J «У I

-.8 ГАС CIS «S КС ftAS Мб TSC ASC САСШбСС TE8 AM STS STC CAA SCS 6АЛ T6 CTC AS6 MC TT« КС ПС ttt AAC 65Я CTC I2J4

A143

а ere мс т« «итстсювсствсмсгсббдвй   тбствммтватвс твтспа 1S«

Л8С«ГЛ1166 БИАетА(ММтЮ1ППТТМТАаПАТ6ААПМСгаПТПСТ 1ТТАПТС

тс«мватвттйАтсжпмттшА5Автасс«€ШША«тбсм с:мс1бТААмт8тте

леттсиабмгпАлмгсшззшхАТба

ЗматгеевегвАС«ва5А58сгетв5«асА(Мбйешвстзс1кттстбсествТ8тсюжтстстб8се r i6Tc TciTa3tTTsttT66A6ci«icccTttTATCi6C6 ssiscTciЈCCTceccccAecttTCAACcec«eE:sfTe;AssATATTTCT6t6eccisw i«5

С«5 ТСССМ8СК1ТСТ686««Т6ТМвТв5Ы8ТаСПТАГ6в СТСГТСТТЕ:8АСД«С6А6СТ6Т СЙ6Гбге Й

К«С йС«АИ68«6ЙМИАСТеТВПТС6ТЙССССТСССАТСв«ХТ66ТТП6СТет

MSCC«SOTrcaCAAASC1 6«AAS6Ca«BTEtA6WSATTAS6TCeA6TCTC;fiBeCAST6M

-ACiMCSTrccc scTT;c«T:-:.5A;An6c;eArTTCCTA6SAECTCt i63ЈCAtcK4c;3c;T;ЈciscTTTTCT5TCTS SCTe;accc;tEc3A;cs; TRT Ar ZIP

СГЗНСГТаСАПАбСАСрвАТССБТСЪССгеСАЗССАМСТТ

Стади  Ж, Конструкци  экспрессион ной плазмиды рАН62 дл  зрелого лошадиного /3 -интерферона.

30 мкг плазмиды рАНбО разрезают с помощью 30 ед. HgiAI в 1.50 мкл объема . После инактивации фермента при 70°С 3 -выступающие ДНК-концы затупл ют в течение 30 мин при 37°С с помощью 1 ед Т4-ДНК-плазмиды (в присутствии по 1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP) . На т.упые концы лигируют Sphl- св зки, полученную ДНК разрезают с помощью SphI и Hind III. Образовавшийс  ДНК-фрагмент длиной 1,85 к.Ь. выдел ют из агарового гел  и лигируют с 50 нг разрезанной Hind III и SphI плазмиды рагрАТЕЕЮЗ. Полученный после трансформации E.coli HB 101 клон содержит плазмиду рАНб1 Эта плазмида представл ет собой промежуточную ступень дл  дальнейшего построени  экспрессионной плазмиды. 20 мкг плазмиды рАНб1 разрезают BamHI и Sail и образовавшийс  фрагмент ДНК длиной 1,3 к.Ь. выдел ют из агарового гел , очищают и лигируют с переваренной рестриктазами BamHI и Sail M13mp9:u )

5

0

5

0

5

фаговой ДНК. После трансформации E.coli IM 101 из рекомбинантного Ml 3- фага (М13рАН61) выдел ют однонитевую фаговую ДНК. 3 пмоль этой однонитевой ДНК смешивают с 38 пмоль 15-мерного олигонуклеотида 5 CTGAACTATGACTTG в 50 мкл 20 мМ трис-HCl, рН 8,0 и 10 мМ хлористого магни , нагревают до 95°С и медленно охлаждают до комнатной температуры. Олигонуклеотид точно св зывают начина  с первого основани  последовательности зрелого й-интерферона. Синтез двунитевой ДНК исход  из 15-мерной затравки осуществл ют в 100 мкл объема после добавлени  по 3 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 15 ед. фрагмента Кленова в течение 1 часа при . После добавлени  20 мМ ЭДТА ДНК экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом.

Остающиес  однонитевые участки ДНК переваривают с 150 ед. SI-нук- леазы в 400 мкл реакционной смеси в течение 2 ч при 14 С (14 мМ ацетата цинка, 30 мМ ацетата натри , 250 мМ

19ч

хлористого натри , 5% глицерина, рН 4,6). Реакцию прекращают путем добавлени  ЭДТА, экстрагируют фено- лом и хлороформом и ДНК осаждают этанолом. Полученную ДНК с тупыми концами лигируют со смесью олиго- нуклеотидов 12-мера 5; -AGCTTAAAGATG и 8-мера 5Г-САТСТТТА, образовавшую- с  ДНК разрезают Hind III и Sphl.

ДНК-фрагмент длиной 1,1 к.Ь. выдел ют из агарового гел  и лигируют плазмидой parpATER.103, разрезанной по Hind III- и Sphl-сайтам. После трансформации E.coli HB 101 получа 54 колонии. Из 9 изолированных из них плазмидных ДНК выдел ют фрагме EcoRI - Sail длиной 1,3 к.Ь., который подвергают анализу последовательностей по методу Сангера. Полученную из него плазмиду обозначают как рАН62. Она позвол ет осуществл ть эффективную экспрессию зрелог лошадиного и-интерферона в E.coli.

Пример 3. Экспресси  ин- терфероновой активности штаммом E.coli HB 101, содержащей экспрес- сионную плазмиду рАН52, рАН52/2, рАН53 или рАН62.

100 мл бактериальной культуры и

кубируют при 37 С при интенсивном встр хивании вплоть до указанной в таблице оптической плотности при 600 нм в следующей, не .содержащей триптофана, среде (на 1 л среды):

10г фосфата аммони , 3,5 г гидро- генфосфата кали , рН 7,3, 0,5 г хлористого натри , 21 г-CaS-аминокислот (кислотно-гидрализованных),

11г глюкозы, 1 мМ сульфата магни , 0,1 мМ хлористого кали , 1 мг тиани- на-НС1, 20 мг L-цистеина, 20 мг 3-й-индолакриловой кислоты (индуктора триптофаневого оперона). Кроме того, среда может еще содержить 50- 100 мг ампициллина. Затем бактерии

центрифугируют в течение 5 мин при 4000 об/мин, суспендируют в охлажденной льдом среде 50 мМ , рН 8,0 и 30 мМ хлористого натри , вз той в количестве 1/10 объема культуры,и при охлаждении во льду в течение 30 с дважды обрабатывают с помощью ультразвука (20 кГц, 100 В). Остатки разрушенных клеток удал ют в течение 10 мин при 10000 об/мин (4°С) и после стерильной фильтрации надосадоч- ную жидкость исследуют на интерфе- роновую (ИФ) активность в общеприн 

20

том опыте дл  определени  цитопати- ческого эффекта везикул рного вируса стоматита (ВВС) или вируса энцефало- миокардита (ВЭЦК).

Результаты представлены в таблице

Титр на А549-клетки нормирован в международных единицах с использованием человеческого интерферона.

Claims (3)

1. Способ получени  лошадиногооб- и Jl-интерферона , заключающийс  в том, что ткань печени лошади инкубируют в присутствии буфера, рН 8,0, экстрагируют ДНК с использованием фенола, диалиэуют и осаждают ДНК этанолом, полученную ДНК центрифугируют при 40000 об/мин в буфере, рН 8,0, далее диализуют и осаждают этанолом ДНК длиной более 50 к.Ь., которую подвергают частичному перевариванию эндонуклеазой Sau3A в присутствии буфера , рН 7,5, полученные фрагменты фракционируют электрофорезом, затем выдел ют фрагменты длиной 10-23 к.Ь., дефосфорилируют и клонируют в векторе EMBL3(-3A), полученную ген-библиотеку ДНК подвергают скринингу с помощью радиоактивно маркированных интерфероновых генов человека с выделением гомологичных последовательностей , при этом дл  получени  (-интерферона Hind Ill-фрагмент клона лигируют с гидролизованным с помощью Smal и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомби- нантными ДНК трансформируют бактерии Escherichia coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАН50, далее плаз- миду рАН50 обрабатывают эндонуклеазой и лигируют с обработанными полинуклеотидкиназой Sphl-св зками , получают плазмиду рАН51, плаз- миду рАН50 гидролизуют PvuII, лигируют с олигонуклеотидом S -TGTGACCTGCCTCAC, который предварительно обрабатывают полинуклеотидкиназой , денатурируют ДНК кип чением, удлин ют олигонуклеотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP, удал ют З -выступ инкубацией с Т4-ДНК-полимеразой в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP, далее фрагмент лигируют с олигонуклеотидами,

21

12-мером S -AGCTTAAAGATG и 8-мером 5 -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Hind III и Bglll, и фрагмент длиной 190 к.Ь. лигируют с гидролизов энным Hind III и Bglll вектором рАН51, полученную плазмиду рАН51/2 обрабатывают SphI и Hind III и лигируют с Hind III - SphI или Hind III - BamHI фрагментом плазмиды parpATER 103 с получением экспрессионной плазмиды рАН52 или рАН52/2 , или плазмиду рАН52 гидролизую эндонуклеазами SphI и EcoRI, затупл ют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP, получают ДНК длиной 1,1 к.Ь., затем плазмиду pBR 322 переваривают с помощью PvuII и EcoRI затупл ют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова и дефосфорилируют с получением ДНК длиной 2,4 к.Ь., которую лигируют с ДНК длиной 1,1 к.Ь. с получением экспрессионной плазми- ды рАНЗЗ, дл  получени Oi-2-интер- ферона плазмиду р№63, получаемую путем субклонировани  рестрикционного фрагмента EcoRI длиной 3,3 к.Ь, из л мбда-клона Eg-0616 в EcoRI сайт плазмиды pUC8, обрабатывают Bglll и BamHI и получаемый при этом фрагмент ДНК длиной 1,0 к.Ь., содержащий кодирующую последовательность дл  0 2-интерферона 64-и аминокислоты, лигируют с большим фрагментом, содер жащим плазмидный вектор, промотор и кодирующую последовательность дл  первых 63 аминокислот зрелого интерферона , который получают в результате обработки Bglll- и BamHI-плазмиды рАН52/2, дефосфорилируют с помощью фосфатазы тел чьего кишечника, продуктом лигировани  трансформируют бактерии Escheri hia coli HB 101 с получением экспрессионной плазмиды рАН55, а дл  получени  А-интерферона PvuII-фрагмент отобранного клона Eg-йб лигируют с гидролизованным с помощью Smal и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомби- нантными ДНК трансформируют бактерии E.coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАНбО, затем плазмиду рАНбО обрабатывают HgiAI-эндонукпеазой и после выпр млени  Зг-выступающих концов ДНК с помощью Т4-ДНК-полимера- зы тупые концы лигируют с обработанными полинуклеотидкиназой Sphl-св з

5622

ками, ДНК гидролизуют SphI и Hind III, полученный фрагмент длиной 1,85 к.Ь., лигируют с разрезанной Hind III и SphI плазмидой parpATER 103, полученную плазмиду рАН61 обрабатывают BamHI и Sail с получением фрагмента длиной 1,3 к.Ь., который лигируют с переваренной BamHI и Sail М13тр9-фа говой ДНК, полученную однонитевую

5

0

5

с

0

0

5

0

5

ДНК лигируют с олигонуклеотидом S -GTGAACTATGACTTG, который предварительно обрабатывают полинуклеотид- кинаэой, затем денатурируют ДНК кип чением , удлин ют олигонуклеотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, aGTP, dCTP и dTTP и осаждают, оставшиес  однони- тевые участки ДНК переваривают с помощью SI-нуклеазы и ДНК с тупыми концами лигируют с олигонуклеотидами, 12-мером 5 -AGCTTAAAGAG и 8-мером Ь -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Hind III и SphI, фрагмент длиной 1,1 к.Ь. лигируют с Hind II - SphI фрагментом parpATER103 с получением экспрессионной плазмиды рАН62, экспрессионными плазмидами трансформируют штамм бактерии Е.со- li IM 101, культивируют штаммы-продуценты в жидкой питательной среде, выдел ют и осаждают белок из культураль - ной жидкости с последующей очисткой хро мато г р афн ей

2.Способ поп.1, отличающийс  тем, при получении0Ј-ин- терферона осаждение белка осуществл ют путем добавлени  сульфата аммони  до 65%-го насыщени , центрифугировани  и диализа, а очистку провод т двустадийной колоночной хроматографией с использованием на второй стадии моноклинального лошадиного интер- феронового иммуноглобулина с последую щей элюциеи св занного с антителом интерферона раствором, содержащим лимонную кислоту, доведением рН до

4,5 и хроматографией полученного су- пернатанта на катионите и элюциеи раствором ацетата аммони .

3.Способ по п. 2, отличающий с   тем, что при получении Л-интерферона выделение белка провод т путем добавлени  сахарозного буфера , содержащего лизоцим, центрифугировани , добавлени  к супернатанту полиэтиленимина и повторного центри фугировани , а осаждение провод т добавлением к над о с ад очно и жидкости

23

сульфата аммони  50%, трехкратным центрифугированием суспендированием полученного осадка в буферном раст jBOpe с добавлением полиэтиленгликол  после первого центрифугировани  и в

164295624

сахарозном буфере после второго, с последующей очисткой центрифугиро,ва- нием, аффинной хроматографией с ис пользованием сахарозного буфера и хроматографией с обратной фазой.

Тест-система: NBIX6-клетки (АТСС CCL 57, клетки эпидермиса кожи лошади)/ВВС; клетки А549 (АТСС CCL 185, .клеточна  лини  река легких человека)/ВЭЦК

ин

4,2

6,06,0 5,75,7 3,03,0

1,8х10ь 2,0х10€ 1,8x10

1,1x10

5,2x10

5,2x10 7,6x1О4 6,2х104

2.6Х104