JPS5890515A - ヒト血清アルブミン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血清アルブミンに対する遺伝子は開発が規制されている
。哺乳類では血清アルブミンは成人の肝臓により合成さ
れ、その合成は初期の発達に於ける低水準から増加して
成人になったときの＾いプラトー値に増加する。一方胚
の肝臓及び卵黄嚢は主としてα−フェトプロティンを製
造゛するが、合成は生まれてから急徹に減少する。近年
、マウスのα−フェトゾロティンｍＲＮＡの完全な配列
が染定された。〔ローニス　ダブリュー及びダガイクジ
ク　ニー（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９１，２０１
−２０５　）。導かれたα−フェトプロティンの構造は
哺乳類の血清アルブミンへの非常な類似性を示し、２つ
の蛋白が同じ遺伝子ファミリー中でコード化されている
ことを示している。同じ機な結論がラットのα−フェト
プロティン遺伝子の研究〔ジャゴドジンスキーエルエル
、サルゲント　ティニブイー、ヤン′　　グエム、グラ
ツキンシー及びボンナー　リュー（１９８１）　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　８ｃ１．　Ｕ８Ａ　７
８３５２１−３５２５　（１９８１）　）及びマウスの
α−７エトグロテイン遺伝子の研究〔ボリン、エノ、ビ
ー、クー・４’　−ティーエル、エイ７アーマンアイ　
／＜　７７’リジ人の血清アルブミンｍＲＮＡの完全な
ヌクレオチド配列を組換えｃＤＮＡクローンから及びｍ
ＲＮＡ鋳型上での！ライマー延長ｃＤＮＡ合成から決定
した。この配列は２０７８個のヌクレオチドからな抄、
５′−非翻訳領域中の潜在的リポソーム橋かけ位置の上
流から始まっている。これはすべての翻訳されたコドン
を含み、３′−末端でのぼり（Ａ）Ｋ延びている。翻訳
配列の一部は疎水プレペプチドｍｅｔ　−１７ｓ　−ｔ
ｒｐ　−ｚａｌ−ｔｈｒ　−ｐｈｅ　−ｉ　１ｅ−ｓｅ
ｒ　−１ｅｕ　−１ｅｕ　−ｐｈｅ　−１ｅｕ　−ｐｈ
ｅ−ａａｒ　−ｓｉｒ　−ａｌａ　−ｔｙｒ　−ｍａｒ
に対してコードをなしており、続いて塩基プロペプチド
ａｒｇ　−ｇｌｙ　−ｖａｌ−ｐｈｅ−ａｖｇ−ａｒｇ
　ＩＩＣ対してコードをなす。これらの罐号ペプチドは
完全に出来上がった血清アルブミｙにはなく、これまで
に人間中ではその発生期の状態で同定されてい々い。残
りの翻訳ｍＲＮＡ配列の１７５５個のヌクレオチドは５
８５のアミノ酸に対してコードをなし、これらは少しの
例外はあるが人の血清アルブミンに対する出版され九ア
ンノ酸データと一致する。このｍＲＮＡ配列は血清アル
ブミン分子の三領域構造に於けろ繰返しの相同性を実証
しかつ洗練されたものとする。

ヒトの血清アルブミンのｃＤＮＡをオリゴ（ｄＧ）　−
オリゴ（ｄＣ）ティリング技術によってテラスミドｐＢ
Ｒ３２２のｐｓｔ　ｒ位置にクローン化する。！ラスミ
ドＤＮＡは濃厚にしたアルブミンｃＤＮＡ７’ロープに
ハイブリッド化され九貿の陽性クローンから単離し、そ
して組換え！ラス建ドｐＨＡ　３６がアルブミンｃ　Ｄ
ＮＡ配列の最大挿入物を含んでいることが見出された。

この制限エンドヌクレアーゼ地図は、ゾライマー延長！
ラス電ドクローンｐｌ（Ａ２０６の制限地図と共に川面
中に示される。後者は内部プライマーからのｃＤＮＡ合
成を開始した後、１１２の形質転換実験で得九。このプ
ライマーはｐＨＡ　３６から単離し九９１の塩基対の長
さのＤＮＡ断片Ｍｓｐ　Ｉ　（１５２）−Ｔａｇ　Ｉ−
（ｌｓ２／３　）であつ九。２つのプラｘｉドをわかち
持っている。これらは−緒に７’レペグチドの１ｅｕ−
１０に対するＣＴ’ｌ’コドンから始まりポリ囚の３′
−非−４ｉＡＡ’ｌｅ領域に延びるヒト血清アルブミン
に対する全配列をコード化している。

アルジオンＣＤ賢人の配列 正確を期する九めに配列は大部分両方のＤＮＡストラン
ドに対して決定した。ＤＮＡ断片を末端ラベルするのく
使用したすべての制限位置は近隣の制限位置をラベル化
することにより縦断して配列決定し丸。ｐＨＡ　３６、
ｐＨＡ　２０６中のりｔ：ｘ　−’　７　化ＤＮＡ　１
１にら、及びメツセンジャーの５′−末端に於けるブラ
イマー延長（！ＤＮＡから決定し九血清アルブミンのｍ
ＲＮＡの全ヌクレオチド配列は次の表１に示される。

推論される７２）配列も示されている。ｍＲＮＡの長さ
は２０７８ヌクレチオで、その３８１１Ｉは５′−非翻
訳領域を表わし、５４個は１８個のアミノ酸のプレペグ
チドを同定し、１８個は６個のアミノ酸のゾロ（デチド
を同定し、１７５５個は血清アルブミンの５８５個のア
ミノ酸に対するコードをなし、１８９個は３′−非る。

５′−非翻訳領域（表１）中のヌクレオチド５〜１５　
（−Ｍ〜−２４）は真核性１８　Ｓ　ＲＮＡの３′−末
端領域〔アザノドＡ、ん及びディーコン　Ｎ、Ｊ、　（
１９８０）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　８．４
３６５−４３７６　）と相補的で従ってリポソーム結合
位置を表わす。

（５’）・・・’ｒＴｃＴＣＴＴＣ’ＴＧＴ・・・・・
・・・・・・・　アルブミンｍＲＮＡ（３リ　−・・Ｇ
ＡＧＧＡＡＧＧＣＧ［７ＣＣｍ２Ａｍ２Ａ　−”’−”
”１８８　ＦＬＮＡｍＲＮＡ配列の翻訳部分は信号ペプ
チド及びアヤブミンポリ（グチド鎖の主体に対してコー
ドをなす。

信号ペプチドは１８個のアさ〕酸の鴫水性プレペゾチド
及び６個のアミノ酸の塩基性プロペプチドからなる（表
１）。小胞体（内部原形質網状構造）中の初期分泌蛋白
（アルブミ／の様な）からプレ（ゾチドは除かれている
ので、これらは異種翻訳系でのインビトロ（試噛管内）
でのみみら、れる。

これまでこれらは細胞内では見出されていない〔ジュダ
ー　Ｊ、１）、、及びフィン　ｐ、　Ｓ、　（１９７７
）？１１ＢＢ　１１ｔｈ　Ｍｔｇ、　Ｃｏｐｅｎｈａｇ
ｅｎ　５０．２１−２９．及びストラ６ス　Ａ、Ｗ、　
、　　ドナヒユー　Ａ瓜、ペネットＣ，Ｄ、　、ロドキ
ー　、Ｔ、Ａ、、及びアルノ＜−）Ａ、Ｗ。

（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
８ｃｉ、　ＵＳ、へ７４．１３５８−１３６２）。これ
は人の血清アルブミンのプレペプチドの存在及び配列の
最初の報告である。池の分泌蛋白の場合と同じ様に、プ
ロアルブミンのアルブミンへの転換はゴルジ体中で行な
われ、この開裂に対して責任ある酔素はシそらくカテデ
シンＢである〔ジュダＪ、Ｔ）、及びフィン　Ｐ、！’
！、　（１９７Ｆ１”ＩＮａｔｕｒｅ　２７１．３８４
−３８５　）。これは正常な人血清アルブミンに対する
プロペプチドの配＋ｌＪに対する最初の報告でもある。

このメツセンジャーＲＮＡの３′末端に、アミノ酸停止
コドンＴＡＡから１６４男クレオチド°下流、そしてＩ
す（４）配列の開始から１６ヌクレオチド上流に推定ポ
リアデニル化信号配列１１ｉＡＴ入舵が位置する。ポリ
アデニル化位置の近くに位置する別の特徴的配列は４ツ
イスト（Ｂｅｎｏｉｓｔ　）等によって同定されている
〔ペノイスト　（コ６、オフ１ラ　Ｋ、ブレスナック　
Ｒ１及びチャンポン　Ｐ、　（１９８０）　Ｎｕｃｌ、
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　　８，１２７　１４２　）６幾
つかのｍ　ＲＮＡから合意され九配列はＴＴＴＴＣＡＣ
’ＴＧＣと結論された。類似の配列ＴＴＴＴＣＴＣＴ（
）Ｔが人のアルブミンｍＲＮＡ（表１）中で大人ＴＡへ
Ａへキサヌクレオチドから１９ヌクレオチド上流に位置
している。

ＧＣＴＴＴｒＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＡ
ＧＣＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡ表１ 最喪の方法を含めて本発明実施の手順を例示している実
施例を以下に示す。これらの実施例は制限するものと解
釈されるべきでない。すべてのパーセントは重重によ抄
、すべての溶媒混合物割合は他に記されなければ容量に
よる。

実施例１　メツセンジャーＲＮＡの単離チルゲイン（Ｃ
ｈｉｒｇｖｒｌｎ　）等〔チルゲインＪ、Ｍ、。

プルズビラ（Ｐｒｙｚｂｙｌａ　）　、Ａ、に、　、マ
クドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ　）、　、　Ｒ，、Ｔ、
及びルター（Ｒｕｔｔｅｒ　）　、　Ｗ、、Ｔ。

（１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８．５２９
４−５２９９　）の手１［Ｋ従って人の肝臓ｍＲＮＡを
得た。／　ＩＪシームを含んでいるアルブミンのインエ
ノプレシピテーション（免疫沈殿）をティラーとツエ（
Ｔａｙｌｏｒ　％Ｊ、Ｍ、及びＴｓｅ　、　Ｔ、Ｐ、Ｈ
（１９７６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５１
．７４６１−７４６７　）に従って実施した。ｍＲＮＡ
のインビトロ（試験管内）翻訳を網赤血球のない系中で
、製作者の指示書に従って実施したにューイングランド
ニュークリアー）。翻訳生成物はラエムニ（Ｌａｅｍｍ
ｌｔ、Ｊ、に、　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７
　、　６８０〜６８５　）に従って電気泳動により分離
した。

実施例２　コード解読手順 二重鎖のｃＤＮＡを前言−に合成した。〔ロー、Ｓ、。

タマオ；Ｔ、、クロイザラー、Ｆｏ、及びドウガイチク
　Ａ、　（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１０５３−６１　）
。これをＰｓｔ　ｒで％ 線状にしたｐＢＲ３２２ＤＮＡに対してアニーリングさ
せた〔ポリバーＦ５、ロドリグエス　Ｒ，Ｌ、　、グリ
ーン　Ｐ、Ｊ、　、ベトラツノｓ　Ｍ、Ｃ１，／％イネ
ツカーＨ，Ｌ、　。

ボイヤーＨ，Ｗ、、クロツサ、Ｔ、Ｔ（、、及びファル
コウ８．（１９７７’）−止ジぴ−２，９５−１１３）
。上記ｐＢ’Ｒ３２２ＤＮＡはその前に１５　ｄＧ残基
／３′−末端でテーリングしておいた〔ドガイチク　Ａ
、、ロノ（−ソンＤ、　Ｌ、及びウルリツヒ　ん（、１
９８０）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９　、５８６９
−５８７３　）。アニーリングしたＤＮＡ　Ｉｔ前記の
様に大腸菌株ＲＲＩを形質転換するために！用した〔上
記ロー　８０等〕。アルブミンクローンはグルンステイ
／及びホブネスのコロニーノ゛イブリッド化法を使用し
て〔グル／スタイン　Ｍ、及びホグネス　Ｄ、　Ｓ、　
（１９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７２．３９６１−３９６５　）イ之ユ
ノ沈殿ポリゾームｍＲＮＡを鋳ｌｌ１Ｋ合成され九（３
２ｐ）−標１１１ｃＤＮＡで選択した。

実施例５に示される様にプラスミドｐＨＡ　３６及びｐ
ＨＡ　２０６は大腸菌（ｇ、　ｃｏｌｉ　）　ＨＢ　１
０１宿主中に託し友。グラスミドはこの実施例に記され
る大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　ＲＲ１宿主から得られ
、当業者によく知られた手順により大腸菌ＨＢＩＯＩに
形質転換した。

大腸菌ＲＲＩ宿主は溶菌し、次に染色体ＤＮＡ　、細胞
ＤＮＡ　、及びプラスミドＤＮＡを分離するために遠心
した。上澄に残っているグラスミドＤＮＡをエタノール
で沈殿させ、沈殿物を緩衝液例えばＴＭＣ（１０ｍＭ　
）リスＨＣＩ、ｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＣａＣｊｓ　、
　１０ｍＭ　ＭｑＣｌａ　）中に再懸濁した。形質転換
用の細胞は次の樟Ｋ１１１製した。１２０−のＬ−プル
ロス（１％）リゾトン、０．５　ｍ酵母エキス、　０．
５　＊ＮａＣ１）に）（Ｂ　１０１　Ｎ’ＲＲＬＢ　−
１１３７１の１８時間培養基を接種し、６００　ｎｍに
於ける光学密度０．６まで生育させる。細胞を冷たい１
００ｍＭのＮａＣｌ中で洗い、１５分間２０ｇｌ１ｌの
冷やした関ｍＭ　ＣａＣｊｍの中に再懸濁させる。細菌
を次にこの容量の１７１ＯにＣａＣ６寓の中で濃縮し、
上記の様に調製し九アニーリングし九プラスミドＤＮＡ
と２：１（ｖ：ｖ）Ｓ合する。細胞−ＤＮＡ混合物′ｔ
−１５分間冷却後これを４２℃で２分間熱シヨツクさせ
、次に室温で１０分間平衡させ次に細胞−ＤＮＡ懸濁液
容緻の１０倍のし一ブロスを添加する。形質転換した細
胞をブロス中で３７’Ｃで１時間培養した後、１１１択
培地（Ｌ−寒天プラス１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン
）Ｋ　２００μｌ／ｆレートで接種する。プレート１３
７℃で絽時間球権して形質転換物を生育させる。

ＩＮ［３ｆｌｌｌＪ限エンドヌクレ了−上位置のマツピ
ング 制限エンドヌクレアーゼはペセスダリサーチラボラトリ
ーズ及びニューイングランドバイオラボから得られ、製
作者の指示に従って使用した。消化ＤＮＡ断片はアガロ
ース上で〔ヘリング、　Ｒ，Ｂ。

グツドマンＴ（、Ｍ、及びボイヤー　Ｈ，Ｗ、　（１９
７４）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１４．１２３５−１２４４
　）　、又はアクリルアミド（ディングマン、Ｃ，フィ
ッシャー　Ｍ、Ｐ、及びカフエ７ダＴ、　（１９７２）
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌｌ、１２４２−１２！５
０）ゲル上で電気泳動により分析した。

実施例４　　ＤＮＡ配列 ＤＮＡ　断片ｔ　ＩＩＡ　ＩＩアルカリホスファターゼ
（ワーシントン）で脱ホスホリル化し、５７−木場で４
リヌクレオチドキナーゼ（ボエリンガーーマンハイム）
及びγ（３２ｐ）Ａ丁Ｐで標識し九。第２の制限エンド
ヌクレアーゼ消化及び断片の電気泳動での分＠に続き、
ＤＮＡ配列の決、定をマクサム及びギルバートの手順に
従って行い〔マクサム　Ａ６及びギルパ　−　ト　　Ｗ
、　　　（１９８０）　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｋｎｚｙ
ｍ、６５、’　　４９９　−５６０〕減成生成物を、サ
ンガーとコウルソンによって記載された様Ｋ　Ｏ，４Ｍ
アクリルア建ドゲル上で電気泳動で分離した〔サンガー
　Ｆ、及びコウルンン　Ｒ，（１９７８）　ｐＥＢｓ　
Ｌｅｔｔｅｒｓ　ｓ’７，１０７−１１０　）。

実施例５　組換えグラスミドｐＴ（Ａ　Ｖ５及びｐＨＡ
　２０６実鳩例２に記載した様と、アルラミンクローン
をａｉｍアルブミンｃＤＮＡグローブにハイブリッド化
することによ倹選択した。グラスミドｐＨ４３６はアル
ブミンｃ　ＤＮＡ配列の鏝大挿入物を含んでいた。

ｐＨＡ　３６及びｐＨＡ　２０８の両方のグラスミドは
ノーザ菌宿主中に託されたつこの寄託所におけるこれら
の寄託番号は次の通りである。

ＨＢ　１０１　（ｐＨＡ　３６　）　−ＮＲＲＬ　Ｂ−
１２５５１ＨＢ　１０１　（ｐＨＡ　２０６　）　−Ｎ
ＲＲＬ　Ｂ−１２５５０大暢薗ＨＢＩＯＩは既知の広く
入手出来る宿主微生物である。そのＮＲＲＬ入手番号Ｎ
ＲＲＬ　Ｂ　−１１３７１％である。。

ＮＲＲＬ　Ｂ　−１２５５０及びＮＲＲＬ　Ｂ　−１２
５５１は特許が付与されると一般に入手出来るようにな
る。これらの寄託物が入手出来ることは行政行為で本証
と共に与えられ九特許権を侵害して本発明を実施する実
施権を構成するものではないことを理解すべきである。

大腸菌ＲＲＩ及び大腸菌ＨＢＩＯＩは知られた広く入手
出来る宿主微生物である。それらのＮＲＲＬ寄託番号は
それぞれＮＲＲＬ　Ｂ　−１２１８６及びＮＲＲＬＢ　
−１１３７１である。

ｐＢＲ３２２は曳く知られ九そして広く入手出来るグラ
スミドである。これは次の宿主寄託物から標準手順によ
）得ることが出来る。

）ＪＲＲＬＢ　−１２０１４−大腸＠　ＲＲＩ　（ｐＢ
Ｒ３２２）ｙＥｐ　６は良く預られ、広く人手出来る酵
素エピゾームグラスミドである。これは次の宿主寄託書
から標準手頃によって得ることが出来る。

大＠、＠　　ＨＢ　ｂノ１　　（ＹＥｐ　　６　　）　
−ＮＬ（ＲＬＢ　　−１２０９３。

＋ｍ例６　血清アルブミン遺伝子の組立て片を組立てる
ことは制限酵素学の簡単な仕事である。２つのｃＤＮＡ
クローンの重複するＤＮＡ配列中にただ１つのＭｓｐ　
Ｔ位置がある。２つの辱ＩＬ段階叩ち（１）２つのＤＮ
Ａ　７）Ｍｓｐ　Ｉ消化、それに続＜（ｉＩ）Ｔ）ＮＡ
断片をシールする酵素であるリガーゼの使用によって所
望生成物が与えられる。２つの他の望まないＤＮ人種も
この組換え反応の過程で得られるが、これらは両方とも
寸法が実質的に異なる。このように望むＤＮＡ橿の分離
及び単離が達成される。′組立てたＤＮＡクローンを２
種のａ胞を形質転換するのに使用出来る。

（ａｌ　　大腸菌（ｇｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　）（ｂ）　　サッカロミセスセレビシア（８ａｃｃｈ
ａｒｏｍｙ−ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｔ　） （揃　より抜きのベクターはグラスミドｐＢＲ３２２で
あり、血清アルブミンｃ　ＤＮＡの２つの断片化した片
のクローニングに５まく使用出来たものと同じである。

（ｂ）　　Ｉ！母を血清アルブミン構造遺伝子配列で形
質転換するためＫ　ＤＮＡを現存する酵母グラスミドベ
クター〇一つに挿入しなければならない。これは幾つか
の制限エンドヌクレアーゼ認識配列がクローン化血清ア
ルブミンＤＮＡに存在しないという蓼実を利用して達成
出来る。合成ＥｃｏＲＩＤＮＡリンカ−は血清アルブミ
ン配列を含んでいるＤＮＡ断岸に連結出来、続いて酵母
プラスミドベクターの一つ例えばＹｌｐ６にＥｃｏＲ１
クロ一ン化位置で挿入される（連結）。融合され九′１
怜ｆり的ラプラスミドを確立手順に従って酵母を形質転
換するのに使用出来ル。〔ヒニン　Ａ１、ヒツクス　Ｊ
、Ｂ、ＩＩＬヒフイ／り　　Ｇ、Ｒ，（１９７Ｂ）　　
Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　８ｃｉ、
　　ＵＳＡ７５　、１９２９　）　Ｙｌｐ　６は上に開
示される様にＮＲＲＬ寄託所から得ることが出来る。

実施例７　血清アルブミン遺伝子の表現構造遺伝子の主
体は大腸菌又は酵母の＃累によって転写される。選ばれ
九宿主で少ししか又は全くアルブミンが生成されないと
きは、開始コドン即ちＡＴＧを持っている大腸菌ノロモ
ーターＤＮＡ配列を血清アルブミン構造遺伝子の始めに
連結出来る。その様な要素は知られかつ入手出来る。例
えば大腸菌中での人のインターフェロン遺伝子の表現に
使用されるｌａｃグロゾロター（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　８ｃｉ、二５２３０（１９８０）　）　、
　ｆ　ｏ−Ｔ−一ターＤＮＡの給源（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　７６７６０（１９７
９）　）　。Ｎａｔ、ｕｒｅ、　　２８１４に、１９７
９年１０月１８日も参照。その様な大祷薗！ロモーター
配列が大腸菌中の外来遺伝子の表現に良く機能すること
は既に文献に記されている〔マルセロー！イジャロン（
゛、＜ｅｒｃｅｒｅａ１］−Ｐｕｉｊａｌｏｎ　）　Ｏ
，、ロイヤル（’　Ｒｏｙａｌ　）、Ａ、、カミ−（Ｃ
ａｍ１　）　Ｂ、、ガラビン（Ｇａｒａｐｌｎ　）　Ａ
、、クルスト（Ｋｒｕｓｔ　）、Ａ９、ガラｙ　（Ｇａ
ｎｎｏｎ　）、■０、及びコウリルスキー（Ｋｏｕｒｉ
ｌｓｋｙ　）、ｐ、　（１９７ｇ　）Ｎａｔｕｒｅ　２
７５．５０５及びゴエデル（Ｃ）ｏｅｄｄｅｌ　）　、
Ｄ、Ｖ、、り・レイド（Ｋｌｅｉｄ　）、Ｄ、Ｇｏ、ポ
リバー（Ｂｏｌｉｖａｒ　）、Ｆ９、ハイネツカー（Ｈ
ｅｙｎｅｋｅｒ　）　Ｈ，Ｌ、、ヤンスラ（Ｙａｎｓｕ
ｒａ　）　Ｄ、　Ｇ、、グレア（Ｇｒｅａ　）　Ｒ，、
−ヒロセ（Ｈｌｒｏｓｅ　）　Ｔ、、カラゼウスキー（
Ｋｒａｓｚｅｗｓｋｉ　）　。

Ａｏ、イタ−クラ（Ｉｔａｋｕｒａ　）　、　Ｋ、、及
び１）ッグス（Ｒ１ｇｇ８　）　Ａ、　（１９７９）　
Ｎａｔｌ、　＊ｃａｄ、　ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６゜１
０６〕。酵母中での表現についてはローズ（Ｒｏｓｅ−
）、Ｍ０％カサダバ７　（Ｃａ５ａｄａｂａｎ　）　、
　ｔ、ｔＪ、及びボトヱｌ 細菌中で製造された少量のアルブミンを検出するために
免疫学的方法を使用することが出来る。

柔軟なＩリビニルの平坦な円板を免疫血清力為らのＩｇ
Ｇフラクシ目ンで被覆し、円板を、その場で溶菌された
微生物′コロニーから放たれた抗原が固定された抗体に
結合出来るように嘩大平板上に押し付ける。グラスチッ
クの円板を次に、結合し九抗原上の他の決定因子が次に
ヨウ素化抗体と結合出来るよう放射性の冒つ素で標識さ
れた同じ金工ｇＧフックシ盲ンと培養する。円板上の放
射性の区域はオートラジオグラフィーの間にＸ−線フィ
ルムを露出し、スクリーニングされる蛋白製造コロニー
を同定する。この手順の詳細な取決めは刊行されている
。〔ブルーム　Ｓ、及びギルバートｗ。

（１９７８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
８ｃｉ、　ＵＳＡ　７５．２７４６）。

人血清アルブミンの精製はこの技術で良く知られ九手順
を用すて達成出来る。例えばティー　ビータース：ピエ
ーリフイケーシッンアンドプ四パテイーズオブセルムア
ルプ建ン、イン：ザプラズマ　ゾロテインズ、デトナム
編、アカデミックグレス、ニューヨーク、　１９７！Ｓ
Ｋよりある章に開示された手頃を使用することが出来る
。

ことに記載の研究はＮＴＨガイドラインに％定の物理的
及び生物的封じ込み要求を満九すようにしてすべてなさ
れ九ものでＴｏ石。

【図面の簡単な説明】

図面は人血清アルプζンｃｂＮ＊クローンの制限工／ド
ヌクレアーゼｊ４Ａｌｌｌｌを表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、図面に示される制限エンドヌクレアーセパターンを
   有するプラスミドｐＨＡ　３５゜２、図面に示される制
   限エンドヌクレアーゼパターンを有するプラスミドｐＨ
   １２０６゜３、寄託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１２５５１を有
   する大Ｉｌ＃Ｉ薗（１，ｃｏｌｉ　）　ＨＢ　１０１　
   （ｐＨＡ　３６　）。 ４、寄託番号ＮＲＲＬ　Ｂ　−１２５５０を有する大腸
   −（１，ｃｏｌｉ　）　ＨＢ　１０１　（ＰＨム２０６
   ）。 ５、人の血清アルブミンのアミノ酸配列に対するコード
   の以下のヌクレオチド配列を含んでいるように修飾され
   た微生物。 ＬｔＬ；Ｌ；　ＡＬＩＬ　　ＬＪｔ、ＬＪＬＡ　ＡＡＡ
   　ｒＬ−Ｋ　ＬＥＡ　にＭ　ＡＧＡ　ｕＵｒ　’ＩＴＣ
   ＡＡＡ　（Ｘ；Ａ　ＴＧＧ　ＧＣＡ−１０ ６、ヒト血清アルプ建ンのｃＤＮ人のヌクレオチド配列
   である以下のヌクレオチド配列物。 ＧＣＣＡＧＴ　　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ｍ　ＧＧＡ
   　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＧＣＴττＣＡＡＡ　ＧＣＡ　ＴＧ
   Ｇ　ＧＣＡ　ＧＴ＾ＧＣＴ１０２０ ２２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　２３０ａｒｇ　ｌａｕ　ｍａｒ　ｇｌｔ＞　
   ｅｒｇ　ｐｈａ　ｐｒｏ　ｌｙｓ　ａｌａｇｌｕ　ｐｈ
   ｅａｌａ　ｇｌｕＣＧＣＣＴＧ　ＡＧＣＣＡＧ　ＡＧＡ
   　ＴＴＴ　ＣＣＣＡＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＴＴＴ　Ｇ
   ＣＡ　ＧＡＡ　（３００）ＧＡｕｈ−Ｌ−Ｋ　ＡＡＴ　
   　しＣＴ　（ｊＡ＾　ＡＬａ　’ＩＴに　　Ａにに　Ｔ
   ’ｌＸ；　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　Ａ’ｌ：Ａ　Ｔ（
   Ｘ：　Ａ（：Ａ　　Ｃττ　ＴＣＴ　　（ｉｊｋ（ｉ　
   ＡＡＧ　ＧＡＧ＾ＧＡｃ＾Ａ＾τに　ＡＪｋＧ　ＪＬＡ
   Ａ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴｒ　渭　（１７００
   ン７、ヒト血清アルブミンの製造に対してコードを有し
   ている以下のヌクレオチド配列物。 ＧＣＴＴｒＴＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＡ
   ＧＣＣＣｒＴＴＧＧＣＡＣＡ−１８ｐ　　ｒ　　ｃ　　
   　　　　　　　　−１０ＡＴＧ　ＡＪＷ　ＴＧＧ　ＧＴ
   Ａ　Ａｔ；に　　τＴ■　＾ＩＴ　ＩＱ；　　ＬＴＩ　
   　υ１：Ｔ　　’ＡＴ五　し五し　１五ｒＡＬｊＬ；（
   ｊυＪ８、プロヒト血清アルブｉ）に対するコードを有
   する以下のヌクレオチド配列物。 ２１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　３０　　　　　　　　　　３４ＧＣＣＡＧＴ　　
   ＣｒＣＣＡＡ　　ＡＡＡ　　ｍ　　ＧＧＡ　　Ｌ；ＡＡ
   　　ＡもＡ　Ｉ；Ｌ；Ｅ　　Ｔ五し　ＡＡＡ　　ｕＬ；
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   　　　　　　　２０４０　　　　　　　　　　　　　　
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   Ａ　ｌｊｌ；Ｉ　　ＬｉＡｌｊ　　ＩＴＹ　　ＬｉＬ、
   Ａ　　ＬｙＡＡ　　（ｊＬＪＵＪ９、プレプロ　ヒト血
   清アルプ電ンに対するコードを有する以下のヌクレオチ
   ド配列物。 −４，ＩＬ；ＬｉＬ；Ｕ五（ｔ）ＬＩＪＬ；ＬＪｌａＡ
   ＬｉＡ’Ｌ−Ｌ−ＫＬ；Ｌ；Ｌ；ノＬ＾Ａ（ｉｔ；τ（
   ｉへ、ＧＴ■工ＧＣＡ＆、パノー（３（１０）ＧＡＧ　
   　ＴｒＴ　　ＡＡＴ　　［Ｋ；’１　　もＡＡ　　ＡＬ
   ＧＡ　　ＩＴに　　ＡＬ：Ｃ’ＡＴＬ：　　Ｌ；Δｒ（
   ｉｔ；Ａ　　も八ｌ　ΔＴＡ　　’Ｌもし　ＡＬＧＡ　
   　１．；’１７１　１２５０　　　　　　２５３　　　
   　　　　　　　　　　　　　　２６０３４０　　　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３５
   ０３６９３７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　３８０４００　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　　４１０４３０　
   　　　　　　　　　　　　　　　　４３７４３８　　　
   ４４０４６０４６１　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　４７０’、ＣＴ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　
   ＧＡＧ　Ａ（ｉＡ　にム＾ＡＴＣＡＡ（ｊ　ＡＡ＾ＣＡ
   Ｊｋ　ＡＬ；Ｔ　ｔｉＬＡ　ｔＴＫ　ｔｉＫ’Ｋ　　（
   １／ＵＬＩＪ１０、　　特許請求の範囲第５項に定義さ
   れるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ変換ベクター。 １１、微生物中に変換され、微生物中で複製された特許
   請求の範囲第１０項のＤＮＡ変換ベクター。 １２、微生物が細菌又は酵母−であってＤＮＡ変換ベク
   ターがプラスミドである特許請求の範囲第１１項のＤＮ
   Ａ変換ベクター。 １３、細菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ’ｏ
   ｌｉ　）　”（Ｒ１及び大腸菌１（ＢＩＯＩからなる群
   から選ばれ、酵母がサツカロミセスセレビシア（８ａｃ
   ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ−ｖ１５１ａｅ　’）
   でプラスミドがｐＢＲ３２２又はＹＦ、ｏ　６である特
   許請求の範囲第１２項のＤＮへ変換ベクター。 １４、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に対してコー
   ドを有する特許請求の範囲第５項に定義されるヌクレオ
   チド配列を含むように修飾した微生物を培養することか
   らなる人血清アルブミンを製造する方法。 １５、上記微生物が細菌である特許請求の範囲第１４項
   の方法。 １６、　　上記線菌が大１ｉ［である特許請求の範囲第
   １５項の方法。 １７、　　上記微生物が酵母である特許請求の範囲第１
   ４項の方法。 ＩＬ　　−母がサツーロミセスセレピシア（８ａｃｃｈ
   ａ−ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）である
   特許請求の範囲第１７項の方法。