JPS6229985A - クロ−ン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子の製造方法 - Google Patents
クロ−ン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子の製造方法Info
- Publication number
- JPS6229985A JPS6229985A JP61141206A JP14120686A JPS6229985A JP S6229985 A JPS6229985 A JP S6229985A JP 61141206 A JP61141206 A JP 61141206A JP 14120686 A JP14120686 A JP 14120686A JP S6229985 A JPS6229985 A JP S6229985A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human serum
- serum albumin
- gene
- prepro
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はクローン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝
子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を
含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生
物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アル
ブミン遺伝子の製造方法に関する。
子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を
含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生
物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アル
ブミン遺伝子の製造方法に関する。
（従来の技術）
ヒト血清アルブミン（時々、以下でＩ Ｓ Ａと呼称す
る）は血傾の主要な蛋白構成成分である。この蛋白は肝
臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する責
を負う。また、血液を介して各種の小分子を結合し、輸
送することができる。
る）は血傾の主要な蛋白構成成分である。この蛋白は肝
臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する責
を負う。また、血液を介して各種の小分子を結合し、輸
送することができる。
ＩＳＡは種々の臨床−にの状況において投与される。例
えば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻し、それ
により外傷に関連するいくつかの症状を改善させるため
に、通常はＩ Ｓ Ａの頻回投与を必要とする。低蛋白
血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者にも血清アルブ
ミンによる治療を必要とすることがある。
えば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻し、それ
により外傷に関連するいくつかの症状を改善させるため
に、通常はＩ Ｓ Ａの頻回投与を必要とする。低蛋白
血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者にも血清アルブ
ミンによる治療を必要とすることがある。
今日では、）（ＳＡは採取した血液の分画からの副産物
として主に作られている。この欠点は費用と血液の供給
量が大幅に変わりうるということである。また、血液は
肝炎ウィルスのように好ましくない物質を含んでいるこ
とがある。従って、■１ＳＡの代替の原料を開発するこ
とが有益となろう。
として主に作られている。この欠点は費用と血液の供給
量が大幅に変わりうるということである。また、血液は
肝炎ウィルスのように好ましくない物質を含んでいるこ
とがある。従って、■１ＳＡの代替の原料を開発するこ
とが有益となろう。
多型性がヒト血清アルブミンで知られている。
蛋白電気泳動法は２０以上のＩＳＡの遺伝子の異型体を
示している（ウェイトカンプ（Ｗｅｔ ｔｋａｍｐ）う
、アニュアル・オブ・ヒユーマン・ジエネテイクスーロ
ンドン（八ｎｎ、 Ｈｕｍ、 Ｇｅｎｅｔ、 Ｌｏｎｄ
ｏｎ） ３６＋３８１−３９１（１９７３） ）。これ
らの異型体のアミノ酸配列は未だ比較されておらず、ヒ
トでの分布状態もわかっていない。
示している（ウェイトカンプ（Ｗｅｔ ｔｋａｍｐ）う
、アニュアル・オブ・ヒユーマン・ジエネテイクスーロ
ンドン（八ｎｎ、 Ｈｕｍ、 Ｇｅｎｅｔ、 Ｌｏｎｄ
ｏｎ） ３６＋３８１−３９１（１９７３） ）。これ
らの異型体のアミノ酸配列は未だ比較されておらず、ヒ
トでの分布状態もわかっていない。
（発明が解決しようとする問題点）
従って、本発明の目的は微生物中でヒト血清アルブミン
を産生ずることにある。さらに本発明の目的は経済的に
ＩＳＡを産生ずることにある。また、本発明の目的は他
の血清蛋白に応用できるりｂ ローン化手法を開発することにある。
を産生ずることにある。さらに本発明の目的は経済的に
ＩＳＡを産生ずることにある。また、本発明の目的は他
の血清蛋白に応用できるりｂ ローン化手法を開発することにある。
（問題点を解決するための手段）
本発明により、新規のヒト血清アルブミン遺伝子はクロ
ーン化され、遺伝子の微生物発見が説明される。完全長
Ｉ Ｓ Ａ遺伝子のヌクレオチド配列および、その遺伝
子によって特定化されたポリペプチドのアミノ酸配列も
本文中で報告される。
ーン化され、遺伝子の微生物発見が説明される。完全長
Ｉ Ｓ Ａ遺伝子のヌクレオチド配列および、その遺伝
子によって特定化されたポリペプチドのアミノ酸配列も
本文中で報告される。
Ｉ−Ｉ Ｓ Ａを産生ずる微生物を提供する手法は、以
下の段階に分けることができ、それらは本文中で充分に
開示されている。ずなわち、（１）Ｈ３ＡｍＲＮＡの回
収ｙ単離、（２）ｍＲＮＡを鋳型として用い、相補的Ｄ
ＮＡ （ｃＤＮＡ）のインビトロでの合成、（３）適当
なりローニング・ベクターへのｃＤＮＡの挿入および、
そのクローニング・ベクターによる微生物細胞の形質転
換、（４）クローン化した遺伝子の回収および単離であ
る。
下の段階に分けることができ、それらは本文中で充分に
開示されている。ずなわち、（１）Ｈ３ＡｍＲＮＡの回
収ｙ単離、（２）ｍＲＮＡを鋳型として用い、相補的Ｄ
ＮＡ （ｃＤＮＡ）のインビトロでの合成、（３）適当
なりローニング・ベクターへのｃＤＮＡの挿入および、
そのクローニング・ベクターによる微生物細胞の形質転
換、（４）クローン化した遺伝子の回収および単離であ
る。
本文中に開示した手法で完全長クローン化Ｈ３ＡｃＤＮ
Ａの単離ができる。
Ａの単離ができる。
有核細胞遺伝子は細胞核の染色体ＤＮＡ中に含まれる。
この染色体ＤＮＡは染色質（ｃｈｒｏｍａ ｔｉ ｎ）
と呼ばれる小型の核蛋白複合体中に存在する。有核細胞
染色体ＤＮＡはコード化配列〔エクソン（ｅｘｏｎ）
）中に介在する配列〔イントロン（１ｎ−ｔｒｏｎ）
）を含む。これは細胞中では正しく発現しない。このた
めに、特定の蛋白質の隣接コード化ブロックを産生ずる
好ましい方法は伝達ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の使用を必要と
する。伝達ＲＮＡは、イントロンなしで目的の遺伝子に
相応するりボヌクレオチド配列を有し、遺伝子により特
定される蛋白質を産生ずる有核細胞から都合良く回収す
ることができる。
と呼ばれる小型の核蛋白複合体中に存在する。有核細胞
染色体ＤＮＡはコード化配列〔エクソン（ｅｘｏｎ）
）中に介在する配列〔イントロン（１ｎ−ｔｒｏｎ）
）を含む。これは細胞中では正しく発現しない。このた
めに、特定の蛋白質の隣接コード化ブロックを産生ずる
好ましい方法は伝達ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の使用を必要と
する。伝達ＲＮＡは、イントロンなしで目的の遺伝子に
相応するりボヌクレオチド配列を有し、遺伝子により特
定される蛋白質を産生ずる有核細胞から都合良く回収す
ることができる。
ヒト血清アルブミンｍＲＮＡはヒト肝細胞から使用でき
る程の量を回収することができる。肝細胞により産出さ
れたＨ３ＡｍＲＮＡはＨＳ Ａ遺伝子の二本鎖の一つに
対し相補的であり、本文中で後述するように相補的ＤＮ
Ａ （ｃＤＮＡ、）の合成の鋳型として用いられうる。
る程の量を回収することができる。肝細胞により産出さ
れたＨ３ＡｍＲＮＡはＨＳ Ａ遺伝子の二本鎖の一つに
対し相補的であり、本文中で後述するように相補的ＤＮ
Ａ （ｃＤＮＡ、）の合成の鋳型として用いられうる。
ｃＤＮＡの合成のためにｍＲＮＡを効果的に用いるには
、細胞から比較的純粋な形で都合良（回収する。マツカ
ントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ）ら、メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ）７９．５１（１９８１）により記述され
たグアニジンチオシアネート／グアニジン塩酸塩抽出法
は、ＨＳ Ａ ｍ ＲＮ Ａを回収、精製するために、
都合良く用いられる。ＲＮＡは本質的にはＤＮＡはど安
定ではなく、特に、細胞中に存在するりボヌクレアーゼ
類による分解を受ける。従って、ｍＲＮＡ回収法は一般
に、存在するりボヌクレアーゼ類をす早く不活化する手
段を用いる。
、細胞から比較的純粋な形で都合良（回収する。マツカ
ントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ）ら、メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ）７９．５１（１９８１）により記述され
たグアニジンチオシアネート／グアニジン塩酸塩抽出法
は、ＨＳ Ａ ｍ ＲＮ Ａを回収、精製するために、
都合良く用いられる。ＲＮＡは本質的にはＤＮＡはど安
定ではなく、特に、細胞中に存在するりボヌクレアーゼ
類による分解を受ける。従って、ｍＲＮＡ回収法は一般
に、存在するりボヌクレアーゼ類をす早く不活化する手
段を用いる。
一般に、全ＲＮＡの回収はりボヌクレアーゼー不活化物
質の存在下に細胞を破壊することで始まる。細胞破壊は
溶解剤に細胞を接触処理すること、凍結／融解、あるい
は、機械的破壊により、好ましくは、それらの組み合わ
せにより、なされうる。
質の存在下に細胞を破壊することで始まる。細胞破壊は
溶解剤に細胞を接触処理すること、凍結／融解、あるい
は、機械的破壊により、好ましくは、それらの組み合わ
せにより、なされうる。
グアニジンチオシアネートと還元剤、例えば、メルカプ
トエタノールの混合物は、リボヌクレアーゼ不活化剤と
して有効に機能することが見出されている（マツカント
リス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ）ら、前述）。
トエタノールの混合物は、リボヌクレアーゼ不活化剤と
して有効に機能することが見出されている（マツカント
リス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ）ら、前述）。
細胞破壊後、固体状の細胞片は例えば、遠心分離により
除去される。そして、ＲＮＡは得られたｌ ソ 清澄液から沈澱させる。沈澱は公知の技術、例えば、混
合水−アルコール（例えば、エタノール）を沈澱を生じ
る程の量を溶液に加えることによりなされる。その後、
ＲＮＡはグアニジン塩酸塩溶液中に再懸濁し、２回連続
してエタノールで沈澱させる。この時点でＲＮＡは高品
質化され、蛋白質やＤＮＡを含まない。
除去される。そして、ＲＮＡは得られたｌ ソ 清澄液から沈澱させる。沈澱は公知の技術、例えば、混
合水−アルコール（例えば、エタノール）を沈澱を生じ
る程の量を溶液に加えることによりなされる。その後、
ＲＮＡはグアニジン塩酸塩溶液中に再懸濁し、２回連続
してエタノールで沈澱させる。この時点でＲＮＡは高品
質化され、蛋白質やＤＮＡを含まない。
次の段階は、全沈澱ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離である
。ヒト血清アルブミンｍＲＮＡはポリアデニル化され、
それ故、オリゴデオキシチミジレート（オリゴｄＴ）セ
ルロースを用いたアフィニティクロマトグラフィーによ
り非アデニル化ＲＮＡから容易に分離することができる
（アビブ、エイチ（＾ｖｉｖ、 Ｈ）ら、プロシーディ
ンゲス オブナショナル アカデミ−オブ サイエンス
ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ＋ Ａｃａｄ
、 Ｓｃｔ、 ｔｌｓＡ）６９＋１４０８（１９７２）
；マツカントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ） ら、
前述）。全ＲＮＡは約０．５ Ｍ塩化ナトリウム含有溶
液でカラムにアプライさせる。これらの条件下でのみ、
ポリＡ” ＲＮＡはオリゴｄＴセルロースと結合し、塩
不含溶液でカラムを洗浄することにより特異的に溶出す
ることができる。
。ヒト血清アルブミンｍＲＮＡはポリアデニル化され、
それ故、オリゴデオキシチミジレート（オリゴｄＴ）セ
ルロースを用いたアフィニティクロマトグラフィーによ
り非アデニル化ＲＮＡから容易に分離することができる
（アビブ、エイチ（＾ｖｉｖ、 Ｈ）ら、プロシーディ
ンゲス オブナショナル アカデミ−オブ サイエンス
ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ＋ Ａｃａｄ
、 Ｓｃｔ、 ｔｌｓＡ）６９＋１４０８（１９７２）
；マツカントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ） ら、
前述）。全ＲＮＡは約０．５ Ｍ塩化ナトリウム含有溶
液でカラムにアプライさせる。これらの条件下でのみ、
ポリＡ” ＲＮＡはオリゴｄＴセルロースと結合し、塩
不含溶液でカラムを洗浄することにより特異的に溶出す
ることができる。
ＨＳ Ａ ｍ ＲＮ Ａ用の調整物を増やすために、ポ
ＩＪＡ″ＲＮＡは蔗糖密度勾配遠心分離で大きさにより
分画されうる。種々の密度勾配画分中のＲＮＡ活性は、
網状赤血球リゼー１− （Ｉｙｓａｔｅ）中でインビト
ロでの翻訳（ベルハム、エイチ（Ｐｅｌｈａｍ。
ＩＪＡ″ＲＮＡは蔗糖密度勾配遠心分離で大きさにより
分画されうる。種々の密度勾配画分中のＲＮＡ活性は、
網状赤血球リゼー１− （Ｉｙｓａｔｅ）中でインビト
ロでの翻訳（ベルハム、エイチ（Ｐｅｌｈａｍ。
ｎ、） ラ、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオ
ケミストリー（Ｒｕｒ、Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）
６７、２４７（１９７６）により、あるいは、蛋白生成
物の電気泳動分析（ラエムリ、ニー（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｕ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７．６８０
（１９７０））により確かめることができる。
ケミストリー（Ｒｕｒ、Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）
６７、２４７（１９７６）により、あるいは、蛋白生成
物の電気泳動分析（ラエムリ、ニー（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｕ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７．６８０
（１９７０））により確かめることができる。
一旦、ＨＳ Ａの大きさの蛋白質を合成できるボＩＪＡ
”ＲＮＡが単離できれば、ｃＤＮＡ合成用の鋳型を提供
できる。この手法は、本来の染色体遺伝子のコード化配
列と同一の核酸塩基対配列を有する二本鎖ＤＮＡを酵素
的に構築することを含む。
”ＲＮＡが単離できれば、ｃＤＮＡ合成用の鋳型を提供
できる。この手法は、本来の染色体遺伝子のコード化配
列と同一の核酸塩基対配列を有する二本鎖ＤＮＡを酵素
的に構築することを含む。
ｃＤＮＡは有核細胞遺伝子中に存在しうるコード化領域
内に非情報切片（イントロン）を含んでいない。こうし
て究極的には原核細胞系中で転写され、翻訳される。
内に非情報切片（イントロン）を含んでいない。こうし
て究極的には原核細胞系中で転写され、翻訳される。
Ｈ３ＡｃＤＮＡの合成は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクリノウ・フラグメント、および、Ｓ１ヌクレ
アーゼという酵素を用いる（カシアン、ディー （Ｋａ
ｃｉａｒ＋、 Ｄ、） ら、プロシーデインダス オブ
ナショナル アカデミ−オブ ザイエンス ニーニス
ニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ １．八ｃａｄ。
ーゼＩのクリノウ・フラグメント、および、Ｓ１ヌクレ
アーゼという酵素を用いる（カシアン、ディー （Ｋａ
ｃｉａｒ＋、 Ｄ、） ら、プロシーデインダス オブ
ナショナル アカデミ−オブ ザイエンス ニーニス
ニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ １．八ｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７３．２１９１（１９７６） ；マソ
ヵンドリス、アール（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ、 Ｒ，）
ら、メソソズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７９．６０１（１９
８１，））。逆転写酵素はｍＲＮＡ鋳型上でデオキシヌ
クレオシド三リン酸からＤＮＡの一本鎖の合成を触媒す
る。ｍＲＮＡのポリｒ （Ａ）テール（ｔａｉｌ）は、
約１２〜１８個のヌクレオチドのオリゴ（ｄＴ）がｃＤ
ＮＡ合成用プライマーとして用いられることを許す。放
射活性標識されたデオキシヌクレオシド酸リン酸の使用
は合成反応のモニターを容易にする。一般に、α３２ｐ
含有デオキシヌクレオシド三リン酸はこの目的のために
有利に用いられうる。ｃＤＮＡ合成は一般的に、緩衝液
中でｍＲＮＡ、デオキシヌクレオシド三リン酸、オリゴ
（ｄ Ｔ）および、逆転写酵素を３、■み合わせること
により処理される。この溶液は、高’Ｉｎ、例えば４０
〜５０’Ｃで、ｃＤＮＡ複写をするのに充分な時間、例
えば、約５〜２０分間インキュベートされる。反応条件
は根本的にはカシアン、ディー・アル（Ｋａｃｉａｎ、
Ｄ、 １．、ら前述）、により記述された通りである
。−インキュヘーション後、エチレンジアミン四酢酸二
すトリウム塩（以下、Ｎａｇ・ＥＤＴＡ）を？８液に添
Ｊ用し、？容？夜はフェノール：クロロホルム（容積比
１：１）で抽出される。
ヵンドリス、アール（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ、 Ｒ，）
ら、メソソズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７９．６０１（１９
８１，））。逆転写酵素はｍＲＮＡ鋳型上でデオキシヌ
クレオシド三リン酸からＤＮＡの一本鎖の合成を触媒す
る。ｍＲＮＡのポリｒ （Ａ）テール（ｔａｉｌ）は、
約１２〜１８個のヌクレオチドのオリゴ（ｄＴ）がｃＤ
ＮＡ合成用プライマーとして用いられることを許す。放
射活性標識されたデオキシヌクレオシド酸リン酸の使用
は合成反応のモニターを容易にする。一般に、α３２ｐ
含有デオキシヌクレオシド三リン酸はこの目的のために
有利に用いられうる。ｃＤＮＡ合成は一般的に、緩衝液
中でｍＲＮＡ、デオキシヌクレオシド三リン酸、オリゴ
（ｄ Ｔ）および、逆転写酵素を３、■み合わせること
により処理される。この溶液は、高’Ｉｎ、例えば４０
〜５０’Ｃで、ｃＤＮＡ複写をするのに充分な時間、例
えば、約５〜２０分間インキュベートされる。反応条件
は根本的にはカシアン、ディー・アル（Ｋａｃｉａｎ、
Ｄ、 １．、ら前述）、により記述された通りである
。−インキュヘーション後、エチレンジアミン四酢酸二
すトリウム塩（以下、Ｎａｇ・ＥＤＴＡ）を？８液に添
Ｊ用し、？容？夜はフェノール：クロロホルム（容積比
１：１）で抽出される。
水相はゲル濾過クロマトグラフィーで有利に精製され、
溶出液中のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体はアルコールで沈
澱される。
溶出液中のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体はアルコールで沈
澱される。
ｍＲＮＡはｃＤＮＡの存在下、希薄水酸化ナトリウム（
約０．１Ｍ）で、高温（例、約６０〜８０°Ｃ）、約１
５〜３０分間、特異的に加水分解される。アルカリ性溶
液による中和とアルコール沈澱が、−重鎖ｃＤＮＡ複製
物をもたらす。
約０．１Ｍ）で、高温（例、約６０〜８０°Ｃ）、約１
５〜３０分間、特異的に加水分解される。アルカリ性溶
液による中和とアルコール沈澱が、−重鎖ｃＤＮＡ複製
物をもたらす。
−重鎖ｃＤＮＡ複製物は５′−ポリ （ｄ Ｔ）テール
と重複化ＤＮＡの小切片をもたらす３′末端ヘアピン構
造をもっことが示された（エフストラチアディス、エイ
（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ、 Ａ、） ら、セル（
Ｃｅｌｌ）、 ７． ２７９（１９７６）。この３′ヘ
アピン構造は相補的ＤＮＡ鎖合成用のプライマーとして
働きうる。この相補的鎖の合成は、デオキシヌクレオシ
ド三リン酸を含む反応混合物中でＤＮＡポリメラーゼ■
のクリノウ・フラグメント（クリノウ。
と重複化ＤＮＡの小切片をもたらす３′末端ヘアピン構
造をもっことが示された（エフストラチアディス、エイ
（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ、 Ａ、） ら、セル（
Ｃｅｌｌ）、 ７． ２７９（１９７６）。この３′ヘ
アピン構造は相補的ＤＮＡ鎖合成用のプライマーとして
働きうる。この相補的鎖の合成は、デオキシヌクレオシ
ド三リン酸を含む反応混合物中でＤＮＡポリメラーゼ■
のクリノウ・フラグメント（クリノウ。
エイチ（Ｋｌｅｎｏｗ、 Ｈ，） ら、ヨーロピアン
ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ、
ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、η、 ３７１ （１９７１）
）を用いてなされる。この手法により回収した重複化ｃ
ＤＮＡは３′ループを有し、結果的に一本鎖ｃＤＮＡ複
製物の３′ヘアピン構造をもたらす。この３′ループは
基本的にはマツカントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ）ら
、メソソズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）互、６０１ （１９８
１，）の手法を用いて、酵素Ｓ１ヌクレアーゼでの分解
により・開裂する。Ｓ１ヌクレア一ゼ分解産物はフェノ
ール−クロロホルムで抽出し、水相からアルコールで結
果的にｃＤＮＡを沈澱させる。
ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ、
ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、η、 ３７１ （１９７１）
）を用いてなされる。この手法により回収した重複化ｃ
ＤＮＡは３′ループを有し、結果的に一本鎖ｃＤＮＡ複
製物の３′ヘアピン構造をもたらす。この３′ループは
基本的にはマツカントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ）ら
、メソソズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）互、６０１ （１９８
１，）の手法を用いて、酵素Ｓ１ヌクレアーゼでの分解
により・開裂する。Ｓ１ヌクレア一ゼ分解産物はフェノ
ール−クロロホルムで抽出し、水相からアルコールで結
果的にｃＤＮＡを沈澱させる。
ヒト血清アルブミン遺伝子に相応する完全な（ｉｎｔａ
ｃｔ）二本鎖ＤＮＡ （約２０００塩基対）は例えば、
マツカントリス（ＭｃＣａｎｄＨｓｓ、前述、５１頁）
の手法を用いて、蔗糖密度勾配遠心分離により単離され
うる。扉糖密度勾配中のＤＮＡの大きさを測定するため
に、密度勾配画分の部分標品をポリアクリルアミドゲル
中で分子量マーカーと共に電気泳動する。得られたゲル
はまず、マーカーを視覚化するために臭化エチジウムで
染色した後、放射性ｃＤＮＡを検出するためにオートラ
ジオグラフィーを行う。１０００塩基対以上のＤＮＡ分
子を含む密度勾配の両分をプールし、ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱する。
ｃｔ）二本鎖ＤＮＡ （約２０００塩基対）は例えば、
マツカントリス（ＭｃＣａｎｄＨｓｓ、前述、５１頁）
の手法を用いて、蔗糖密度勾配遠心分離により単離され
うる。扉糖密度勾配中のＤＮＡの大きさを測定するため
に、密度勾配画分の部分標品をポリアクリルアミドゲル
中で分子量マーカーと共に電気泳動する。得られたゲル
はまず、マーカーを視覚化するために臭化エチジウムで
染色した後、放射性ｃＤＮＡを検出するためにオートラ
ジオグラフィーを行う。１０００塩基対以上のＤＮＡ分
子を含む密度勾配の両分をプールし、ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱する。
増殖と選択のため、上述のように調整した二本鎖ｃＤＮ
Ａ遺伝子は、一般的に適当な宿主細胞を形質転換するた
めに用いる適当なりローニングベクターに挿入される。
Ａ遺伝子は、一般的に適当な宿主細胞を形質転換するた
めに用いる適当なりローニングベクターに挿入される。
適当なりローニングベクターは種々のプラスミドおよび
ファージを含むが、この場合、プラスミドが好ましい。
ファージを含むが、この場合、プラスミドが好ましい。
クローニングベクターを選択するための基準は、その大
きさ、宿主細胞中での複製する能力、選択できる遺伝子
の存在、そして遺伝子の挿入部位の存在がある。
きさ、宿主細胞中での複製する能力、選択できる遺伝子
の存在、そして遺伝子の挿入部位の存在がある。
大きさに関して、ベクターは、大遺伝子の挿入ができる
ように、大量の細胞の栄養分およびエネルギーを好まざ
る巨大分子の生成に同番ノないように、比較的小さいこ
とが有利である。ベクターばまた、遺伝子挿入後の機能
を維持する完全なレプリコンを含む。このレプリコンは
好ましくは、プラスミド複製の所要態様（例えば、細胞
当たり単回複写の複数複写、あるいは、細胞当たり制御
可能な複写数）を制御する。１つ以−トの表現型の特性
（好ましくは抗生物質耐性）を特定する遺伝子は形質転
換体の選択を容易にする。その挿入部位は有利には制限
エンドヌクレアーゼ用の独自の制限部位である。これら
の基準の全てに適合するクローニングベクターはプラス
ミドｐＢＲ３２２である。
ように、大量の細胞の栄養分およびエネルギーを好まざ
る巨大分子の生成に同番ノないように、比較的小さいこ
とが有利である。ベクターばまた、遺伝子挿入後の機能
を維持する完全なレプリコンを含む。このレプリコンは
好ましくは、プラスミド複製の所要態様（例えば、細胞
当たり単回複写の複数複写、あるいは、細胞当たり制御
可能な複写数）を制御する。１つ以−トの表現型の特性
（好ましくは抗生物質耐性）を特定する遺伝子は形質転
換体の選択を容易にする。その挿入部位は有利には制限
エンドヌクレアーゼ用の独自の制限部位である。これら
の基準の全てに適合するクローニングベクターはプラス
ミドｐＢＲ３２２である。
ｃＤＮＡはホモポリメリック・テーリング法によりこの
プラスミドへ都合良く挿入される。ポモポリマー・テー
ルは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの
存在下、適当なデオキシヌクレオシド三リン酸を用いた
反応により、ヒト血清アルブミン二本鎖ｃＤＮＡ遺伝子
の３′−水酸基に付加される。プラスミドは適当なエン
ドヌクレアーゼを用いた分解により開裂され、相補的ホ
モポリマー・テールは開裂したプラスミドの３′−水酸
基に、ホモポリメリック・テーリング法を用いて付加さ
れる。至適反応条件は二本鎖ｃ ＤＮＡにｄＣ残基を付
加すること（マツカントリス、アール（ＭｃＣａｎｄｌ
ｉｓｓ、 Ｒ，）ら、６０１頁、前述二ロイコウドバリ
ー、アール（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ、 Ｒ，）ら、
ヌクレイツク アシソズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ八
ｃｉｄｓへへｅ５ｅａｒｃｈ） ３，１０１ （１，９
７６）および、Ｐｓｔ Ｉ処理したｐＢＲ３２２にｄＧ
残基を付加すること（マエダ、ニス（Ｍａｅｄａ、 Ｓ
、）、メソソズ インエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ｌＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７９゜６０７ （
１９８］））だと記載がある。しかし、好ましい態様は
３′末端に対するｄＸＴＰの過剰モル比は３０００から
５０００の範囲である。反応の進行ｌ は鎖長が約１５になるまでモニターされる。テール化ｃ
ＤＮＡおよびプラスミドは、例えばフェノール抽出後の
アルコール沈澱により回収される。
プラスミドへ都合良く挿入される。ポモポリマー・テー
ルは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの
存在下、適当なデオキシヌクレオシド三リン酸を用いた
反応により、ヒト血清アルブミン二本鎖ｃＤＮＡ遺伝子
の３′−水酸基に付加される。プラスミドは適当なエン
ドヌクレアーゼを用いた分解により開裂され、相補的ホ
モポリマー・テールは開裂したプラスミドの３′−水酸
基に、ホモポリメリック・テーリング法を用いて付加さ
れる。至適反応条件は二本鎖ｃ ＤＮＡにｄＣ残基を付
加すること（マツカントリス、アール（ＭｃＣａｎｄｌ
ｉｓｓ、 Ｒ，）ら、６０１頁、前述二ロイコウドバリ
ー、アール（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ、 Ｒ，）ら、
ヌクレイツク アシソズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ八
ｃｉｄｓへへｅ５ｅａｒｃｈ） ３，１０１ （１，９
７６）および、Ｐｓｔ Ｉ処理したｐＢＲ３２２にｄＧ
残基を付加すること（マエダ、ニス（Ｍａｅｄａ、 Ｓ
、）、メソソズ インエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ｌＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７９゜６０７ （
１９８］））だと記載がある。しかし、好ましい態様は
３′末端に対するｄＸＴＰの過剰モル比は３０００から
５０００の範囲である。反応の進行ｌ は鎖長が約１５になるまでモニターされる。テール化ｃ
ＤＮＡおよびプラスミドは、例えばフェノール抽出後の
アルコール沈澱により回収される。
二本のＤＮＡのホモポリメリック末端は相補的であり、
適当な条件下で了ニール（ａｎｎｅａ＋） シ、１１Ｓ
Ａ遺伝子を含む組換えプラスミドを生ずる（マエダ、ニ
ス（Ｍａｅｄａ、 Ｓ、）、メソソズ インエンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏＢＶ
）７９゜６１１ （１，９８１））。
適当な条件下で了ニール（ａｎｎｅａ＋） シ、１１Ｓ
Ａ遺伝子を含む組換えプラスミドを生ずる（マエダ、ニ
ス（Ｍａｅｄａ、 Ｓ、）、メソソズ インエンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏＢＶ
）７９゜６１１ （１，９８１））。
イー・コリ （Ｅ、ｃｏｌｉ 大腸菌）の好ましい菌
株は基本的にはレーデルベルグ（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ）
法、ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉ−ｏ１ｏｇｙＨ１９，１０７２（１９７４）を
用いて、この組換えプラスミドにより形質転換され、無
制限に維持される。
株は基本的にはレーデルベルグ（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ）
法、ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉ−ｏ１ｏｇｙＨ１９，１０７２（１９７４）を
用いて、この組換えプラスミドにより形質転換され、無
制限に維持される。
−ｉ的に、数百数千のクローンがこれらの手法により産
生され、例えば、ラット血清アルブミンｅＤＮ’Ａを用
いてＨ８Ａ遺伝子の存在をスクリーンする。ヒト由来Ｃ
ＤＮＡと８５％の相同性を有する二・ツク・トランスレ
ート化した（マニアティス、ティー （Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、 Ｔ、）ら、プロシーディンゲス オブ ナショナ
ル アカデミ−オブ サイエンス ニーニスニー（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ八ｃａｄへ ５ｃｉＵＳＡ ７２，
３９６１． （１９７５））ラット由来ｃＤＮＡはニト
ロセルロース フィルターに付したプラスミドＣＤＮＡ
にハイブリッド化させるために用いられる（グルンステ
イン、エム（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、 Ｍ、）ら、プロシ
ーディンゲス オブ ナショナル アカデミ−オブ サ
イエンス ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ−ｔ’ｌ
Ａｃａ、ｄ、 Ｓｃｉ ＵＳＡ ） ７２．３９６１
Ｇ１９７５） ｉザザン。
生され、例えば、ラット血清アルブミンｅＤＮ’Ａを用
いてＨ８Ａ遺伝子の存在をスクリーンする。ヒト由来Ｃ
ＤＮＡと８５％の相同性を有する二・ツク・トランスレ
ート化した（マニアティス、ティー （Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、 Ｔ、）ら、プロシーディンゲス オブ ナショナ
ル アカデミ−オブ サイエンス ニーニスニー（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ八ｃａｄへ ５ｃｉＵＳＡ ７２，
３９６１． （１９７５））ラット由来ｃＤＮＡはニト
ロセルロース フィルターに付したプラスミドＣＤＮＡ
にハイブリッド化させるために用いられる（グルンステ
イン、エム（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、 Ｍ、）ら、プロシ
ーディンゲス オブ ナショナル アカデミ−オブ サ
イエンス ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ−ｔ’ｌ
Ａｃａ、ｄ、 Ｓｃｉ ＵＳＡ ） ７２．３９６１
Ｇ１９７５） ｉザザン。
イーーＸム（Ｓｏｕｔｈｅｒｒ＋＋ ’Ｅ、 Ｍ、）、
ジャーナル オブモレキュラー バイオわジー（Ｊ、
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、９８、５０３ （１９７５）
）。この手法において、各々のコロニー由来（あるいは
コロニ一群由来）のＤＮＡはニトロセルロース・フィル
ターの不連続なゾーンに固定され、変質する。代わりに
、ＤＮＡは、フィルターに固定する前にゲル中で電気泳
動することもできる。放射活性標識したラット由来ｃＤ
ＮＡの溶液は、ハイブリッド条件下に処理される。
ジャーナル オブモレキュラー バイオわジー（Ｊ、
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、９８、５０３ （１９７５）
）。この手法において、各々のコロニー由来（あるいは
コロニ一群由来）のＤＮＡはニトロセルロース・フィル
ターの不連続なゾーンに固定され、変質する。代わりに
、ＤＮＡは、フィルターに固定する前にゲル中で電気泳
動することもできる。放射活性標識したラット由来ｃＤ
ＮＡの溶液は、ハイブリッド条件下に処理される。
非ハイブリッド化ラット由来ｃＤＮＡはフィルタ−から
洗い流され、ラット由来ｃＤＮＡがハイブリッド化され
たＤＮＡを含むコロニーはオー１〜ラジオグラフイーで
同定される。一つの陽性のクローンは同定されたが、Ｄ
ＮＡ配列決定により不完全なＨ３ＡｃＤＮＡであること
が判った。このＨ３ＡｃＤＮＡ部分は、クローンの完全
なバンク（ｂａｎｋ）を再スクリーンするためにニック
・トランスレート化（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ
）された。こうして９０の陽性ハイブリダイゼーション
・シグナル（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａ
ｌ）が得られた。
洗い流され、ラット由来ｃＤＮＡがハイブリッド化され
たＤＮＡを含むコロニーはオー１〜ラジオグラフイーで
同定される。一つの陽性のクローンは同定されたが、Ｄ
ＮＡ配列決定により不完全なＨ３ＡｃＤＮＡであること
が判った。このＨ３ＡｃＤＮＡ部分は、クローンの完全
なバンク（ｂａｎｋ）を再スクリーンするためにニック
・トランスレート化（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ
）された。こうして９０の陽性ハイブリダイゼーション
・シグナル（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａ
ｌ）が得られた。
陽性クローンを適当な成長培地で培養し、プラスミドＤ
ＮＡを抽出するために大量の細胞を得る。
ＮＡを抽出するために大量の細胞を得る。
プラスミドＤＮＡを通常の技術（例えば、細胞破壊によ
り抽出した後、フェノール抽出およびアルコール沈澱）
を行う。プラスミドＤＮＡおよび染色体ＤＮＡは例えば
、電気泳動法あるいは塩化セシウム平衡遠心法により分
離される。塩基対約１５００〜２５００の挿入部を含む
プラスミドＤＮＡがさらなる特徴付けのために選択され
る。
り抽出した後、フェノール抽出およびアルコール沈澱）
を行う。プラスミドＤＮＡおよび染色体ＤＮＡは例えば
、電気泳動法あるいは塩化セシウム平衡遠心法により分
離される。塩基対約１５００〜２５００の挿入部を含む
プラスミドＤＮＡがさらなる特徴付けのために選択され
る。
クローン化遺伝子はプラスミドＤＮＡから切り取られた
後、配列分析により特徴付けられる（ザンガー・エフ（
Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、）ら、プロシーディンゲス オフ
ナショナル アカデミ−オフ サイエンス ニーニス
ニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ、 ５ｃｉＵ
ＳＡ ７４．５４６３ （１９７７） ；マキサム、
ニー（Ｍａｘａｍ。
後、配列分析により特徴付けられる（ザンガー・エフ（
Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、）ら、プロシーディンゲス オフ
ナショナル アカデミ−オフ サイエンス ニーニス
ニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ、 ５ｃｉＵ
ＳＡ ７４．５４６３ （１９７７） ；マキサム、
ニー（Ｍａｘａｍ。
八、）ら、プロシーディンゲス オフ゛ ナショナルア
カデミ−オフ サイエンス フ、−ニスニー（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ ｌｌ５
Ａ）７４，５６０ （１９７７））。
カデミ−オフ サイエンス フ、−ニスニー（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ ｌｌ５
Ａ）７４，５６０ （１９７７））。
これらの手法により、プレプロ−Ｈ３Ａクローンは単離
されている。このプレプローＨＳ Ａ遺伝子を含むプラ
スミドで形質転換したイー・コリ（大腸菌）Ｉ（ＢＩＯ
Ｉ培養はイリノイ州ベオリアにある米国農務省北部調査
研究所（ｔｈｅ ｊｌ、ｓ。
されている。このプレプローＨＳ Ａ遺伝子を含むプラ
スミドで形質転換したイー・コリ（大腸菌）Ｉ（ＢＩＯ
Ｉ培養はイリノイ州ベオリアにある米国農務省北部調査
研究所（ｔｈｅ ｊｌ、ｓ。
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にＮＲＲＬ Ｂ
１５７８４として寄託されている。特徴的なこのＨ３Ａ
遺伝子挿入部の部分制限地図は、図面の第１図で示され
、第２図は非コード化およびコード化領域の５′から３
′の連鎖とともに、その遺伝子により特定化されたアミ
ノ酸配列を示す。
ｒｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にＮＲＲＬ Ｂ
１５７８４として寄託されている。特徴的なこのＨ３Ａ
遺伝子挿入部の部分制限地図は、図面の第１図で示され
、第２図は非コード化およびコード化領域の５′から３
′の連鎖とともに、その遺伝子により特定化されたアミ
ノ酸配列を示す。
単離した遺伝子は“テール部”を欠如した２０５０塩基
対からなる。その遺伝子は５′末端（塩基対１−３１）
および３′末端（塩基対１８５８−２０５０）に非コー
ド化領域を有する。コード化領域の５′末端（３２−１
０３塩基対）は２４のアミノ酸リーダー（ｌｅａｄｅｒ
） （すなわち、１８のアミノ酸“プレ”配列、その
後位に６のアミノ酸“プロ”配列）を含み、完全な（ｍ
ａ ｔｕｒｅ）ヒト血清アルブミン蛋白は塩基対１０４
番目から１８５８番目までの領域により特定化される。
対からなる。その遺伝子は５′末端（塩基対１−３１）
および３′末端（塩基対１８５８−２０５０）に非コー
ド化領域を有する。コード化領域の５′末端（３２−１
０３塩基対）は２４のアミノ酸リーダー（ｌｅａｄｅｒ
） （すなわち、１８のアミノ酸“プレ”配列、その
後位に６のアミノ酸“プロ”配列）を含み、完全な（ｍ
ａ ｔｕｒｅ）ヒト血清アルブミン蛋白は塩基対１０４
番目から１８５８番目までの領域により特定化される。
第２図および本文中地の所で用いたように、略号以下の
標準的な意味を有する。
標準的な意味を有する。
Ａ ：デオキシアデニル
Ｔ ：デオキシチミジル
Ｇ ：デオキシグアニル
Ｃ：デオキシシトシル
Ｇｌｙニゲリシン
Ａｌａ：アラニン
Ｖａｌ：バリン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｉｃｅ：イソロイシン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｒ：スレオニン
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｔｒｐ：）リプトファン
ＣｙＳニジスティン
Ｍｅｔ：メチオニン
ＡＳＩ）：アスパラギン酸
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ｌｙｓ：リジン
Ａｒｇ：アルギニン
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｐｒ’ｏニブロリン
Ｇｉｎ：グルタミン
Ａｓｎ：アスパラギン
遺伝子コードの変性のために、遺伝子の核酸配列は実質
的に変化しうろことは明らかであろう。例えば、遺伝子
の一部あるいは全部を化学的に合成して、第２図になし
たものとは異なる核酸配列を与えることができる。しか
し、特定のコドン−アミノ酸の指定が観察されれば、ア
ミノ酸配列は保持されよう。ヒト血清アルブミン遺伝子
の核酸配列と蛋白のアミノ酸配列を確立したが、′本発
明の遺伝子は特定の核酸配列に限定されず、遺伝子コー
ドにより認められる全ての変化を含む。
的に変化しうろことは明らかであろう。例えば、遺伝子
の一部あるいは全部を化学的に合成して、第２図になし
たものとは異なる核酸配列を与えることができる。しか
し、特定のコドン−アミノ酸の指定が観察されれば、ア
ミノ酸配列は保持されよう。ヒト血清アルブミン遺伝子
の核酸配列と蛋白のアミノ酸配列を確立したが、′本発
明の遺伝子は特定の核酸配列に限定されず、遺伝子コー
ドにより認められる全ての変化を含む。
本発明は、ＩＳＡ遺伝子を含む組換えＤＮＡの宿主菌と
して大腸菌（Ｌ ｃｏｌｉ） を使って記述した。し
かし、分子生物学の当業者は、例えばシュードモナス（
Ｐｓｅｕ＋３ｏｍｏｎａｓ）のような他のダラム陰性菌
、バチラス（Ｂａｃｉ １ｌｕｓ）のようなダラム陽性
菌、酵母とカビ類のようなより高等な単細胞生物、そし
て哺乳動物細胞も、Ｈ３Ａ遺伝子のクローニング及び／
又は発現のために使用できることを理解するだろう。
して大腸菌（Ｌ ｃｏｌｉ） を使って記述した。し
かし、分子生物学の当業者は、例えばシュードモナス（
Ｐｓｅｕ＋３ｏｍｏｎａｓ）のような他のダラム陰性菌
、バチラス（Ｂａｃｉ １ｌｕｓ）のようなダラム陽性
菌、酵母とカビ類のようなより高等な単細胞生物、そし
て哺乳動物細胞も、Ｈ３Ａ遺伝子のクローニング及び／
又は発現のために使用できることを理解するだろう。
本発明は、さらに次の実施例によって説明するが、本発
明は、これらに限定されるものでない。
明は、これらに限定されるものでない。
実施例 Ｉ
Ａ！ＩｍｍからのＨ３ＡｍＲＮＡの＼準伝令ＲＮＡ （
ｍＲＮＡ）は、１０才の偶然の犠牲者から採取された人
肝臓組織より単離した。ｍＲＮＡ試料へのりボヌクレア
ーゼの夾雑を防ぐために処理工程中格別の注意を払った
。これらの処置には、新規な滅菌実験用ガラス器具を使
用し、可能であればジエチルビロカーボネ−１〜で溶液
を処理し、好ましければついでオートクレーピング（圧
熱滅菌）をなし、できれば試料を低温に保ち、試料と皮
膚との接触を避けるため手袋を使用した。
ｍＲＮＡ）は、１０才の偶然の犠牲者から採取された人
肝臓組織より単離した。ｍＲＮＡ試料へのりボヌクレア
ーゼの夾雑を防ぐために処理工程中格別の注意を払った
。これらの処置には、新規な滅菌実験用ガラス器具を使
用し、可能であればジエチルビロカーボネ−１〜で溶液
を処理し、好ましければついでオートクレーピング（圧
熱滅菌）をなし、できれば試料を低温に保ち、試料と皮
膚との接触を避けるため手袋を使用した。
凍結人肝臓！ｆＪ］′＃ｉ（１０，５グラム）を、ビル
チス（Ｖｉｒｔｉｓ）ホモゲナイザーをつかって２１０
ｍＡの溶解ｉ （４Ｍ グアニジン チオシ７ネー）
１０．１Ｍ ）リス−ＨＣ７！、ｐＨ７，５１０゜１
Ｍ２−、ｔルカプトエタノール）で、均質化した。細胞
片は、ソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ） Ｇ Ｓ Ａ ｔｌ
−ターで、１０分間、４℃、８７５０ｒｐｍで、遠心分
離しペレット化した。上清を、新しい遠心管に移した。
チス（Ｖｉｒｔｉｓ）ホモゲナイザーをつかって２１０
ｍＡの溶解ｉ （４Ｍ グアニジン チオシ７ネー）
１０．１Ｍ ）リス−ＨＣ７！、ｐＨ７，５１０゜１
Ｍ２−、ｔルカプトエタノール）で、均質化した。細胞
片は、ソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ） Ｇ Ｓ Ａ ｔｌ
−ターで、１０分間、４℃、８７５０ｒｐｍで、遠心分
離しペレット化した。上清を、新しい遠心管に移した。
上清に、０．０４容量の１Ｍ酢酸と０．５容量の９５％
エタノールを加えた。−２０°Ｃで２時間後、混合物を
７５０Ｏｒｐｍ、１０分、４℃でソ Ｃ 遠心分離した。得られたベレットは、５０ｍ１ｌ洗浄液
（６Ｍグアニジン ヒドロクロライド／１０ｍＭ Ｎ
ａｇ ・ＥＤＴＡ、ｐＨ７，０／１０ｍＭジチオスレイ
トール）中に再懸濁した。５５００ｒｐｍ、１０分の遠
心分離でペレット化した微細粒子片と上清を、新しい遠
心管に移した。上清に０．０４容量の１Ｍ酢酸と０．５
容量の９５％エタノールを加えた。−２０℃で２時間後
、混合物を、７２００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
エタノールを加えた。−２０°Ｃで２時間後、混合物を
７５０Ｏｒｐｍ、１０分、４℃でソ Ｃ 遠心分離した。得られたベレットは、５０ｍ１ｌ洗浄液
（６Ｍグアニジン ヒドロクロライド／１０ｍＭ Ｎ
ａｇ ・ＥＤＴＡ、ｐＨ７，０／１０ｍＭジチオスレイ
トール）中に再懸濁した。５５００ｒｐｍ、１０分の遠
心分離でペレット化した微細粒子片と上清を、新しい遠
心管に移した。上清に０．０４容量の１Ｍ酢酸と０．５
容量の９５％エタノールを加えた。−２０℃で２時間後
、混合物を、７２００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
ベレットは、２０ｍｊ！洗浄液で再懸濁し、０．０４容
量の１Ｍ酢酸と０．５容量の９５％エタノールを添加し
た。
量の１Ｍ酢酸と０．５容量の９５％エタノールを添加し
た。
混合物は、−２０℃で１２時間保たれ、次いでソーパル
（Ｓｏｒｖａｌｌ） Ｓ Ｓ ３４０−ターで４０℃
１０分間８０００ｒｐｎ＋で遠心分離をした。ベレット
は、１５ｍ７！滅菌蒸留水（ｄＨｚｏ）に再懸濁し、ク
ロロホルム：ブタノール（４： １）の等量で抽出した
。水相を、新しい管に移し、０．１容量の２．４Ｍ酢酸
ナトリウムと２．５容量の９５％エタノールを添加した
。−２０℃で２．５時間後、ＲＮＡを、遠心分離でペレ
ット化した。ベレットは、２ｍｌ滅菌蒸留水に再懸濁し
た。総量１９゜２■のＲＮＡを回収した。
（Ｓｏｒｖａｌｌ） Ｓ Ｓ ３４０−ターで４０℃
１０分間８０００ｒｐｎ＋で遠心分離をした。ベレット
は、１５ｍ７！滅菌蒸留水（ｄＨｚｏ）に再懸濁し、ク
ロロホルム：ブタノール（４： １）の等量で抽出した
。水相を、新しい管に移し、０．１容量の２．４Ｍ酢酸
ナトリウムと２．５容量の９５％エタノールを添加した
。−２０℃で２．５時間後、ＲＮＡを、遠心分離でペレ
ット化した。ベレットは、２ｍｌ滅菌蒸留水に再懸濁し
た。総量１９゜２■のＲＮＡを回収した。
次いでｍＲＮＡをオリゴ（ｄ Ｔ） ・セルロース・
アフィニティー・クロマトグラフィー法（アビブ（八ｖ
ｉｖ）ら：前述およびマンカントリス（ＭｃＣａｎｄＨ
ｓｓ）ら：前述）により全ＲＮＡから分離した。
アフィニティー・クロマトグラフィー法（アビブ（八ｖ
ｉｖ）ら：前述およびマンカントリス（ＭｃＣａｎｄＨ
ｓｓ）ら：前述）により全ＲＮＡから分離した。
５グラムのオリゴ（ｄＴ） ・セルロースのカラムを
１カラム容量の０６１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄し、存
在する全てのりボヌクレアーゼを変性させた。次いで高
塩緩衝液で平衡化した（１０ｍＭトリス−ＨＣｐ、、
ｐロア、４１０．５Ｍ ＮａＣ１！７０．５％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））。
１カラム容量の０６１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄し、存
在する全てのりボヌクレアーゼを変性させた。次いで高
塩緩衝液で平衡化した（１０ｍＭトリス−ＨＣｐ、、
ｐロア、４１０．５Ｍ ＮａＣ１！７０．５％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））。
上記２ｍ７！蒸留水に溶解させた全ＲＮＡ試料を１分間
７０℃で加熱した。次いで氷で室温まで冷やし、次に０
． １容量の５Ｍ Ｎａ（１１，０，０４ｍ１ｌの０
．５Ｍ）リス−Ｈ（ｌ ｐＨ７，５及び０゜１ｍｌの
１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓＤＳ）をＲＮＡに添
加した。次いで、８ｍｌの高塩緩衝液をＲＮＡに添加し
た。そして溶液は、約１０ドロツプ／分の流速でカラム
に充填した。この溶液をカラムに通過させた後、非結合
ＲＮＡは高塩緩衝液でカラムから洗浄・溶出させた。両
分（各１／ ２ ｍ ｊ！ ）を採取し、各両分の２６
０μｍの吸光度（Ａ ｚ６ｏ）を分光計で測定した。カ
ラムは、Ａ２６０の値が０．０５以下に落ちるまで洗浄
した。
７０℃で加熱した。次いで氷で室温まで冷やし、次に０
． １容量の５Ｍ Ｎａ（１１，０，０４ｍ１ｌの０
．５Ｍ）リス−Ｈ（ｌ ｐＨ７，５及び０゜１ｍｌの
１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓＤＳ）をＲＮＡに添
加した。次いで、８ｍｌの高塩緩衝液をＲＮＡに添加し
た。そして溶液は、約１０ドロツプ／分の流速でカラム
に充填した。この溶液をカラムに通過させた後、非結合
ＲＮＡは高塩緩衝液でカラムから洗浄・溶出させた。両
分（各１／ ２ ｍ ｊ！ ）を採取し、各両分の２６
０μｍの吸光度（Ａ ｚ６ｏ）を分光計で測定した。カ
ラムは、Ａ２６０の値が０．０５以下に落ちるまで洗浄
した。
好ましくないＲＮＡを、さらに低温濃度の緩衝液（１０
ｍＭ）リス−ＨＣｊ２．ｐｌ＋７．４１０．２ＭＮａＣ
７！１０．１％５ＤＳ）でカラムから洗浄した。両分は
、Ａ２６０が０．０５に落ちるまで上記のようにして採
取した。
ｍＭ）リス−ＨＣｊ２．ｐｌ＋７．４１０．２ＭＮａＣ
７！１０．１％５ＤＳ）でカラムから洗浄した。両分は
、Ａ２６０が０．０５に落ちるまで上記のようにして採
取した。
次に、ｍＲＮＡを、溶出緩衝液（１０ｍＭ）リス−ＨＣ
ＣｐＨ７，４／１ｍＭ、ＥＤＴＡｌｏ。
ＣｐＨ７，４／１ｍＭ、ＥＤＴＡｌｏ。
１％５ＤＳ）でカラムから溶出した。１ｍ１画分を、Ａ
ｚ６ｏが、０．０５より低くなりまで採取した。最初
の１５の両分（ＯＤ ｚ６ｏ値が、最も高い）が、プー
ルされ、そしてｍＲＮＡは、０．１容量の２．４Ｍ酢酸
ナトリウムと２．５容量の９５％エタノールを添加した
沈澱させ、１２時間、−２０℃においた。次いで？８出
したｍＲＮＡを、遠心分離でペレット化し、８００μｌ
の溶出緩衝液中に再懸濁した。再懸濁化したペレットを
７゜°Ｃで９０秒間加熱した後、氷で冷し、０．１容債
の５Ｍ Ｎａ＋１！と０．０５容量（７）１０％ＳＤ
Ｓを添加した。
ｚ６ｏが、０．０５より低くなりまで採取した。最初
の１５の両分（ＯＤ ｚ６ｏ値が、最も高い）が、プー
ルされ、そしてｍＲＮＡは、０．１容量の２．４Ｍ酢酸
ナトリウムと２．５容量の９５％エタノールを添加した
沈澱させ、１２時間、−２０℃においた。次いで？８出
したｍＲＮＡを、遠心分離でペレット化し、８００μｌ
の溶出緩衝液中に再懸濁した。再懸濁化したペレットを
７゜°Ｃで９０秒間加熱した後、氷で冷し、０．１容債
の５Ｍ Ｎａ＋１！と０．０５容量（７）１０％ＳＤ
Ｓを添加した。
次いで上記で調製した溶出ｍＲＮＡを、さらに２つ目の
オリゴ（ｄ Ｔ） ・セルロース・カラムに通過させ
て精製した。０．１グラム オリゴ（ｄＴ）・セルロー
スを充填したカラムを水酸化ナトリウムで洗浄し、次い
で前述の高塩濃度緩衝液で洗浄した。ＲＮＡをカラムク
ロマトグラフィーにかけ、高塩緩衝液、低温緩衝液、そ
して溶出緩衝液で、最初のカラムと同様に両分を採取し
た。溶出緩衝液の工程で得られたピーク画分を集め、そ
して２度精製ｍＲＮＡを前記と同様に沈澱化させペレッ
ト化した。
オリゴ（ｄ Ｔ） ・セルロース・カラムに通過させ
て精製した。０．１グラム オリゴ（ｄＴ）・セルロー
スを充填したカラムを水酸化ナトリウムで洗浄し、次い
で前述の高塩濃度緩衝液で洗浄した。ＲＮＡをカラムク
ロマトグラフィーにかけ、高塩緩衝液、低温緩衝液、そ
して溶出緩衝液で、最初のカラムと同様に両分を採取し
た。溶出緩衝液の工程で得られたピーク画分を集め、そ
して２度精製ｍＲＮＡを前記と同様に沈澱化させペレッ
ト化した。
次いで、ｍＲＮＡは１２ｍ１シユークロース勾配で粒子
径分画をした（マツカントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ
） ラ、メソッド イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）＋７９． ｐｐ、
５６−５８）。５〜２０％のシュークロース勾配が、
勾配緩衝液（０，０２Ｍ酢酸ナトリウム、 ｐｌ＋５．
６）中に調整され、３時間４℃で冷した。ｍＲＮＡの
１００μｇを１００μｌの勾配緩衝液で、再懸濁し、２
分間８０℃で加熱した。水浴で急冷し、次いで勾配の上
端部に装填した。第２の５〜２０％勾配、分子量マーカ
ーとしてイー・コリの１６３と２３ＳｒＲＮＡ（総量１
００．ｃｏｇ）を装填した。２つの勾配は、ベックマン
５Ｗ４０ローターで、３８゜０００ｒｐｍ １２．５時
間４℃の条件下遠心分離した。次いで約Ｑ、５ｍｊ２の
画分を採取して、Ａ２６０を測定した（画分＃１は勾配
管の最下端部から採取されたものである。）Ａ、ｚ６ｏ
のピークは、第３回に示すようにグループＡからＦの６
つの両分に分けられた。各々のグループの両分をプール
し、０．１容量の２．４Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量
の９５％エタノールでｍＲＮＡを沈澱させた。
径分画をした（マツカントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ
） ラ、メソッド イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）＋７９． ｐｐ、
５６−５８）。５〜２０％のシュークロース勾配が、
勾配緩衝液（０，０２Ｍ酢酸ナトリウム、 ｐｌ＋５．
６）中に調整され、３時間４℃で冷した。ｍＲＮＡの
１００μｇを１００μｌの勾配緩衝液で、再懸濁し、２
分間８０℃で加熱した。水浴で急冷し、次いで勾配の上
端部に装填した。第２の５〜２０％勾配、分子量マーカ
ーとしてイー・コリの１６３と２３ＳｒＲＮＡ（総量１
００．ｃｏｇ）を装填した。２つの勾配は、ベックマン
５Ｗ４０ローターで、３８゜０００ｒｐｍ １２．５時
間４℃の条件下遠心分離した。次いで約Ｑ、５ｍｊ２の
画分を採取して、Ａ２６０を測定した（画分＃１は勾配
管の最下端部から採取されたものである。）Ａ、ｚ６ｏ
のピークは、第３回に示すようにグループＡからＦの６
つの両分に分けられた。各々のグループの両分をプール
し、０．１容量の２．４Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量
の９５％エタノールでｍＲＮＡを沈澱させた。
Ｈ３Ａで、推定されるサイズの蛋白質をコードするｍＲ
ＮＡを含む両分のグループは、３５３−メチオニンで補
足されたウサギの網状赤血球リゼー） （ｌｙｓａｔｅ
）キット（ベセスダ調査研究所から提ｌ Ｕ １１ 供され、製造元マニュアルに準じて使った）によってイ
ンビトロでの翻訳で同定された。各々の両分グループの
反応混合物は、１２．５％ポリアクリルアミド／ＳＤＳ
ゲル上での電気泳動によって検出される放射活性標識蛋
白質中へのｍＲＮＡの翻訳をするために必要な組成物を
含んでおり、フルオログラフィーに供された。
ＮＡを含む両分のグループは、３５３−メチオニンで補
足されたウサギの網状赤血球リゼー） （ｌｙｓａｔｅ
）キット（ベセスダ調査研究所から提ｌ Ｕ １１ 供され、製造元マニュアルに準じて使った）によってイ
ンビトロでの翻訳で同定された。各々の両分グループの
反応混合物は、１２．５％ポリアクリルアミド／ＳＤＳ
ゲル上での電気泳動によって検出される放射活性標識蛋
白質中へのｍＲＮＡの翻訳をするために必要な組成物を
含んでおり、フルオログラフィーに供された。
フルオロダラムは、両分グループＢとＣの翻訳産物中に
Ｈ３Ａ （６８，，０００ダルトン）と推定される大き
さの顕著な蛋白質バンドを示した。グループＢは、好ま
しくない低分子量域中の蛋白質産物を非常に低い比率で
含有しており、そのためグループＢ中のｍＲＮＡは、ｃ
ＤＮＡの合成のための鋳型として使うために選別された
。
Ｈ３Ａ （６８，，０００ダルトン）と推定される大き
さの顕著な蛋白質バンドを示した。グループＢは、好ま
しくない低分子量域中の蛋白質産物を非常に低い比率で
含有しており、そのためグループＢ中のｍＲＮＡは、ｃ
ＤＮＡの合成のための鋳型として使うために選別された
。
実施例 ２
Ｈ３Ａ ｃＤＮＡＯ人
一般に、ｃＤＮＡの合成は、マツカントリス（ＭｃＣａ
ｎｄｌｉｓｓ）らの方法メソッズ イン エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＩＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）＋ ７９＋ ＰＰ、６０１−６０７ （１９８１）
）を使った。放射活性標識デオキシヌクレオチドの利用
は、合成のモニタリング及び各工程における生産物の計
算を可能にする。
ｎｄｌｉｓｓ）らの方法メソッズ イン エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＩＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）＋ ７９＋ ＰＰ、６０１−６０７ （１９８１）
）を使った。放射活性標識デオキシヌクレオチドの利用
は、合成のモニタリング及び各工程における生産物の計
算を可能にする。
ｃＤＮＡの最初の鎖は、次の組織物のようにプライマー
としてオリゴ−ｄＴを使い、ｍＲＮ八を鋳型として合成
した。
としてオリゴ−ｄＴを使い、ｍＲＮ八を鋳型として合成
した。
〈あらかじめ混合し、水中に保持した〉０．５ Ｍ
）リス−ＨＣβ、ｐＨ８，３２０１ｔｌ！１．４
Ｍ Ｋ（１１０μ！ ０、２５ Ｍ Ｍ ｇＣＩ！、２
３ ／Ｚρ０．０５Ｍ ｄＡＴＰ、 ｐＨ７，ｏ
２μｐＯ，０５Ｍ ＴＴＰ、 ｐ
Ｈ７、ｏ ２ｐ（！０．０５Ｍ ｄＣＴＰ
、 ｐｐ（７，０２μρ０．０５Ｍ ｄＧＴＰ、
ｐＨ１７，ｏ ２１ｔ（１０，０１Ｍ
ジチオストレイトール ４μｐ滅菌蒸留水
４５μｌ水溶性標識、α”Ｐ−ｄ
ＣＴＰ （１，０μＣｉ／μｌ１）５μｐ １００μ！ くさらに次の組成物を加えた〉 オリゴ（ｄ Ｔ） ＋２−Ｉｌｌ （２５０，＋ｒ ｇ
／ｍ ｘ） ２０ ｐ ｐアクチノマインシＤ （５０
０１１ｇ ７ｍ １ 、水溶性）１６μｅ １０ ｔｔ Ｉ！ ｍｌ？ＮＡ、“Ｂ”画分
２０μρ滅菌藤留水 ３７
メ！ｅ※ＡＭＶ逆転写酵素（１６Ｕ／μＧ ７
μβ総 量： ２００μβ
※アビアン・ミニロブラストシス・ウィルス（八ｖｉａ
ｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓ ｉｓ ｖｉｒｕｓ／Δ
ＭＶ）逆転写酵素は、−８０℃に保たれているので、し
ばらくの間溶解してから最後の添加物として加える。
）リス−ＨＣβ、ｐＨ８，３２０１ｔｌ！１．４
Ｍ Ｋ（１１０μ！ ０、２５ Ｍ Ｍ ｇＣＩ！、２
３ ／Ｚρ０．０５Ｍ ｄＡＴＰ、 ｐＨ７，ｏ
２μｐＯ，０５Ｍ ＴＴＰ、 ｐ
Ｈ７、ｏ ２ｐ（！０．０５Ｍ ｄＣＴＰ
、 ｐｐ（７，０２μρ０．０５Ｍ ｄＧＴＰ、
ｐＨ１７，ｏ ２１ｔ（１０，０１Ｍ
ジチオストレイトール ４μｐ滅菌蒸留水
４５μｌ水溶性標識、α”Ｐ−ｄ
ＣＴＰ （１，０μＣｉ／μｌ１）５μｐ １００μ！ くさらに次の組成物を加えた〉 オリゴ（ｄ Ｔ） ＋２−Ｉｌｌ （２５０，＋ｒ ｇ
／ｍ ｘ） ２０ ｐ ｐアクチノマインシＤ （５０
０１１ｇ ７ｍ １ 、水溶性）１６μｅ １０ ｔｔ Ｉ！ ｍｌ？ＮＡ、“Ｂ”画分
２０μρ滅菌藤留水 ３７
メ！ｅ※ＡＭＶ逆転写酵素（１６Ｕ／μＧ ７
μβ総 量： ２００μβ
※アビアン・ミニロブラストシス・ウィルス（八ｖｉａ
ｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓ ｉｓ ｖｉｒｕｓ／Δ
ＭＶ）逆転写酵素は、−８０℃に保たれているので、し
ばらくの間溶解してから最後の添加物として加える。
反応混合物を、水中に５分間保ち、そして２ ｐｐが移
され、ｄＣＴＰの特異活性を決定するためにＡＳＣシン
チレーション液中で計数した。反応混合物は、次いで４
６℃で１０分間インキニーベートした。２０μｌの０．
２Ｍ ＥＤＴＡ’ｐｌ＋８゜０を加えた反応を停止さ
せ、そして次に混合物をフェノール：クロロボルム（１
：１）の等容量で抽出処理した。
され、ｄＣＴＰの特異活性を決定するためにＡＳＣシン
チレーション液中で計数した。反応混合物は、次いで４
６℃で１０分間インキニーベートした。２０μｌの０．
２Ｍ ＥＤＴＡ’ｐｌ＋８゜０を加えた反応を停止さ
せ、そして次に混合物をフェノール：クロロボルム（１
：１）の等容量で抽出処理した。
０．１４容量の８０％グリセロールを添加し、サンプル
を０．７Ｘ１７ｃｍのセファデックスＣ−１００カラム
でタラマドグラフィーにかけた。
を０．７Ｘ１７ｃｍのセファデックスＣ−１００カラム
でタラマドグラフィーにかけた。
一旦サンプルをカラムにかけた後、Ｇ１００緩衝液（１
０ｍＭ、）リス−Ｈ（１，ｐＨ８，０／１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ／１００ｍＭ ＮａＣＪ）をカラムに展開させ、
そして５滴（約２７５μｐ）の両分を採取した。放射活
性画分は、チェレンコフ計数じＣｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏ
ｕｎｔｅｄ”）した。そして分当りのカウントがピーク
となるｃＤＮＡ画分をプールした。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ
Ａイブリッドは、０゜１容量の２．４Ｍ酢酸ナトリウム
と２．５容量の９５％エタノールを添加し、３０分間ド
ライアイス／エタノール浴中に置き、次いで２０分間４
℃。
０ｍＭ、）リス−Ｈ（１，ｐＨ８，０／１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ／１００ｍＭ ＮａＣＪ）をカラムに展開させ、
そして５滴（約２７５μｐ）の両分を採取した。放射活
性画分は、チェレンコフ計数じＣｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏ
ｕｎｔｅｄ”）した。そして分当りのカウントがピーク
となるｃＤＮＡ画分をプールした。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ
Ａイブリッドは、０゜１容量の２．４Ｍ酢酸ナトリウム
と２．５容量の９５％エタノールを添加し、３０分間ド
ライアイス／エタノール浴中に置き、次いで２０分間４
℃。
１０、ＯＯＯｒｐｍで遠心分離することによってペレ・
ノド化し沈澱を得た。ペレットは３００μｌの０． １
Ｍ水酸化ナトリウム溶液中に再＠濁し、７０°Ｃ２０分
間加熱してＲＮＡを加水分解した。一本鎖ｃＤＮＡはそ
のまま残した。３０μｌのＩＭＨＣＸを加え溶液を中性
にした。ＤＮＡは、５μビｔＲＮＡ、１／１０容ｉｆの
２．４Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量の９５％エタ
ノールを加え、１０分間ドライアイス・エタノール浴に
置き、そして４℃で１０分間マイクロフユージ（ｍｉｃ
ｒｏｆｕｇｅ）中に遠心することによって沈澱させた。
ノド化し沈澱を得た。ペレットは３００μｌの０． １
Ｍ水酸化ナトリウム溶液中に再＠濁し、７０°Ｃ２０分
間加熱してＲＮＡを加水分解した。一本鎖ｃＤＮＡはそ
のまま残した。３０μｌのＩＭＨＣＸを加え溶液を中性
にした。ＤＮＡは、５μビｔＲＮＡ、１／１０容ｉｆの
２．４Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量の９５％エタ
ノールを加え、１０分間ドライアイス・エタノール浴に
置き、そして４℃で１０分間マイクロフユージ（ｍｉｃ
ｒｏｆｕｇｅ）中に遠心することによって沈澱させた。
ベレットは、次の混合液中で再懸濁した。
４０μｍ１ ０．５ Ｍ Ｋ２Ｓ０４ｐＨ７，
４８μＲ’ ０．２５Ｍ Ｍｇ（１２２μ＃０．
１Ｍ ジチオスレイトール１ μ ｆｆ
０．０ ５Ｍ ｄＡＴＰ、 ｐｌ
＋７．０１μＩｔ ０．０５Ｍ ｄＣＴＰ、
ｐＨ７，０１μ７！０．０５ Ｍ 、ｄＧＴＰ’
、 ｐｌ＋７．０１μＩｔ ’０．０５’Ｍ
ＴＴＰ、 、 ｐＨ７，０１２４μ７！
滅菌蒸留水 １７８μ１ 次に、２２μｉのＤＮＡポリメラーゼＩクリノウ（Ｋｌ
ｅｎｏｌｌ）フラグメント（５μ／１１！、ベーリンガ
ー・マンハイムからの提（ｊいを加えた。
４８μＲ’ ０．２５Ｍ Ｍｇ（１２２μ＃０．
１Ｍ ジチオスレイトール１ μ ｆｆ
０．０ ５Ｍ ｄＡＴＰ、 ｐｌ
＋７．０１μＩｔ ０．０５Ｍ ｄＣＴＰ、
ｐＨ７，０１μ７！０．０５ Ｍ 、ｄＧＴＰ’
、 ｐｌ＋７．０１μＩｔ ’０．０５’Ｍ
ＴＴＰ、 、 ｐＨ７，０１２４μ７！
滅菌蒸留水 １７８μ１ 次に、２２μｉのＤＮＡポリメラーゼＩクリノウ（Ｋｌ
ｅｎｏｌｌ）フラグメント（５μ／１１！、ベーリンガ
ー・マンハイムからの提（ｊいを加えた。
次いで反応混合物は、１２時間１５℃の水浴中でインキ
ュベートした。２０μβの０．２ＭＥＤＴＡ ｐｔ１
８．０を反応停止のために加えた。
ュベートした。２０μβの０．２ＭＥＤＴＡ ｐｔ１
８．０を反応停止のために加えた。
混合物は、フェノール：クロロホルム（１： ］）の等
容量で抽出処理した。０．１４容量のグリセロールを水
相に加えた。
容量で抽出処理した。０．１４容量のグリセロールを水
相に加えた。
サンプル、これは今や二本鎖ｃＤＮＡを含んでいる、を
セファデックス０１００カラムにかげ、ピークｃＤＮＡ
画分をプールし、前記と同様に沈澱させた。二本鎖ＤＮ
Ａは、前述のように３′“ヘアピン・ループ”をもち、
それば次のように８１ヌクレアーゼで除去された。ペレ
ットは、７２μｌの滅菌蒸留水中に再懸濁した。ついで
、１８μβの５倍希釈したＳ１緩衝液（ＬＭ ＮａＣ
７！１０．２５Ｍ酢酸ナトリウムｐｔ＋４．５１５ｍＭ
Ｚｎ５Ｏ４／２．５％グリセロール）が加えられた。
セファデックス０１００カラムにかげ、ピークｃＤＮＡ
画分をプールし、前記と同様に沈澱させた。二本鎖ＤＮ
Ａは、前述のように３′“ヘアピン・ループ”をもち、
それば次のように８１ヌクレアーゼで除去された。ペレ
ットは、７２μｌの滅菌蒸留水中に再懸濁した。ついで
、１８μβの５倍希釈したＳ１緩衝液（ＬＭ ＮａＣ
７！１０．２５Ｍ酢酸ナトリウムｐｔ＋４．５１５ｍＭ
Ｚｎ５Ｏ４／２．５％グリセロール）が加えられた。
酵素混合物は、Ｓ１ヌクレア一ゼ２０μｇ／μｌ）２．
５μ１（５０単位）を４７．５μｘｓｉ緩衝液に加えて
調製した。次いで酵素混合物の１０μρを、９０μｌの
ＤＮＡｊ容ン夜に力■え、３７℃２０分間インキュヘ−
１−した。２０７７１１．２ＭＥＤＴＡ Ｎａの添加
で反応を止め、そして反応混合物をフェノール：クロロ
ポルム（１： １） １７１等容量で抽出処理した。水
相は、５−２５％シュークロース勾配にかけ、３８，０
００ｒｐｍ １７． ５時間５℃の条件で超遠心分離処
理をした。
５μ１（５０単位）を４７．５μｘｓｉ緩衝液に加えて
調製した。次いで酵素混合物の１０μρを、９０μｌの
ＤＮＡｊ容ン夜に力■え、３７℃２０分間インキュヘ−
１−した。２０７７１１．２ＭＥＤＴＡ Ｎａの添加
で反応を止め、そして反応混合物をフェノール：クロロ
ポルム（１： １） １７１等容量で抽出処理した。水
相は、５−２５％シュークロース勾配にかけ、３８，０
００ｒｐｍ １７． ５時間５℃の条件で超遠心分離処
理をした。
１ｍＡの両分を採取し、パチェレンコフ（Ｃｅ−ｒｅｎ
ｋｏｖ）計数”にかけた。画分１−６． ７−９゜そし
て１０−１２の３つのプールを採取した。画分＃１は、
勾配の最下端部から採取された両分であった。ＤＮＡは
、０．１容量の２．４Ｍ酢酸ナトリウム、１−２メＩｇ
のｔＲＮＡ、そして２．５容量の９５％エタノールを各
々のプールに加え、ソシて一２０℃に一装置いて沈澱さ
せた。ＤＮＡは、４℃３０分間２５にの条件で遠心し、
ペレット化した。わずかにペレソ１〜を脱水した後、各
々のプールから得られたＤＮＡを脱水した後、各々のプ
ールから得られたＤＮＡは２００μｌの蒸留水中に再懸
濁し、再びエタノールと酢酸ナトリウムで沈澱させた。
ｋｏｖ）計数”にかけた。画分１−６． ７−９゜そし
て１０−１２の３つのプールを採取した。画分＃１は、
勾配の最下端部から採取された両分であった。ＤＮＡは
、０．１容量の２．４Ｍ酢酸ナトリウム、１−２メＩｇ
のｔＲＮＡ、そして２．５容量の９５％エタノールを各
々のプールに加え、ソシて一２０℃に一装置いて沈澱さ
せた。ＤＮＡは、４℃３０分間２５にの条件で遠心し、
ペレット化した。わずかにペレソ１〜を脱水した後、各
々のプールから得られたＤＮＡを脱水した後、各々のプ
ールから得られたＤＮＡは２００μｌの蒸留水中に再懸
濁し、再びエタノールと酢酸ナトリウムで沈澱させた。
ペレットば、２２μｌ蒸留水に再懸濁し、マイクロフユ
ージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で５分間遠心し、不溶性
物質をペレット化した。上清を含む各々ｃＤＮＡの２μ
βを６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ分
析した。ゲルのオートラジオグラフィーは、画分１−６
のプール中のＤＮＡは平均サイズがＬｌｏｏｂｐ（塩基
対）を有し、２０Ｏｂｐ域のＤＮＡを含むことを示した
。そして、このプールは、マツカントリス（ＭｃＣａｎ
ｄ］ ｊｓｓ）ら、前述６０１とその次の頁）に記述さ
れた一般的なホモポリメリックテーリング（ｈｏｍｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｉｃ ｔａｉｌｉｎｇ）法によるｃＤＮＡ
の３′末端へのポリＣテール（ｔａｉｌｓ）の付加のた
めに利用した。このためにｄＯＴＰを５０００モル過剰
用いるのが良い結果をうろことを見い出した。
ージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で５分間遠心し、不溶性
物質をペレット化した。上清を含む各々ｃＤＮＡの２μ
βを６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ分
析した。ゲルのオートラジオグラフィーは、画分１−６
のプール中のＤＮＡは平均サイズがＬｌｏｏｂｐ（塩基
対）を有し、２０Ｏｂｐ域のＤＮＡを含むことを示した
。そして、このプールは、マツカントリス（ＭｃＣａｎ
ｄ］ ｊｓｓ）ら、前述６０１とその次の頁）に記述さ
れた一般的なホモポリメリックテーリング（ｈｏｍｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｉｃ ｔａｉｌｉｎｇ）法によるｃＤＮＡ
の３′末端へのポリＣテール（ｔａｉｌｓ）の付加のた
めに利用した。このためにｄＯＴＰを５０００モル過剰
用いるのが良い結果をうろことを見い出した。
反応混合物は次の通りである。
２０ｐＨｃＤＮＡ（約４３ｎｇ）
−３Ｈｄ ＣＴＰ （６４５ｐｍｏｌ、凍結乾燥）２．
４μβ １０倍希釈したＴｄＴ緩衝液※１．６μβ 蒸
留水 ２４゜０μ１ ※１０ｘＴｄＴ緩衝液−１．４Ｍカコジルカリウム１０
．３Ｍ）リス−ＨＣｊ！、ｐＨ７，０／１０ｍＭＣｏ（
ｌｚ／１ｍＭ ＤＴＴ 反応混合物は、３７℃で２分間インキュベートされ、２
ｐ １２を計数に使用するため採取した。次いで２ｔｔ
１．（６，６６単位）のＩ”Ｌバイオケミカルズのター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを加
え、そして３７℃でのインキュベーションを５分間続け
た。３ＨｄＣＴＰの取り込みによる計数は、ｃＤＮＡの
３′末端は長さが平均１４ヌクレオチドの“ポリＣテー
ル”を担持することを示した。８０μＡＴ、Ｅ、緩衝液
（１０ｍＭ）リス−ＨＣｊ！、ｐＨ７，６／ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）をＤＮＡに加えて、溶液を、フェノール：クロ
ロホルム（１： １）の等容量で抽出した。
４μβ １０倍希釈したＴｄＴ緩衝液※１．６μβ 蒸
留水 ２４゜０μ１ ※１０ｘＴｄＴ緩衝液−１．４Ｍカコジルカリウム１０
．３Ｍ）リス−ＨＣｊ！、ｐＨ７，０／１０ｍＭＣｏ（
ｌｚ／１ｍＭ ＤＴＴ 反応混合物は、３７℃で２分間インキュベートされ、２
ｐ １２を計数に使用するため採取した。次いで２ｔｔ
１．（６，６６単位）のＩ”Ｌバイオケミカルズのター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを加
え、そして３７℃でのインキュベーションを５分間続け
た。３ＨｄＣＴＰの取り込みによる計数は、ｃＤＮＡの
３′末端は長さが平均１４ヌクレオチドの“ポリＣテー
ル”を担持することを示した。８０μＡＴ、Ｅ、緩衝液
（１０ｍＭ）リス−ＨＣｊ！、ｐＨ７，６／ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）をＤＮＡに加えて、溶液を、フェノール：クロ
ロホルム（１： １）の等容量で抽出した。
さらに有機相は、１ｏ Ｏｐ ｅ蒸留水で再処理し、２
つの水相を混合した。
つの水相を混合した。
次いでＣテール化二本鎖ｃ’ＤＮＡは、制限エンドヌク
レアーゼＰｓｔｌで直線化され、次いでホモポリメリッ
ク・テーリング法によって“Ｇ−テ−ル化”されたプラ
スミドｐＢＲ３３２ＤＮＡに対してアニール化される。
レアーゼＰｓｔｌで直線化され、次いでホモポリメリッ
ク・テーリング法によって“Ｇ−テ−ル化”されたプラ
スミドｐＢＲ３３２ＤＮＡに対してアニール化される。
相補的な一木ｔｉ４ ＣとＧの“テール”はアニール化
され、ｙｌ」」部位に挿入されたｃＤＮＡを有する組換
えプラスミドを得た。
され、ｙｌ」」部位に挿入されたｃＤＮＡを有する組換
えプラスミドを得た。
２００μｍ２ ｃＤＮＡ、 Ｃ−テール化（３９，２
ｎｇ）１０．５＃ｌ１ｐＢＲ３２２−Ｐｓｔｌ、 Ｇ−
テール化（３０２ｎｇ） ９３μＡ １０倍希釈したアニーリング緩衝液※ ６２６．５μβ 蒸留水 ９３０μ１ 反応混合物を、７０℃の別の水浴中におき、ついで水浴
を、３７℃の部屋に移し、−夜かけて、徐々に３７℃に
冷やした。ついで室温に移し、そこで水浴は、数時間を
かけて３０℃に冷やした。
ｎｇ）１０．５＃ｌ１ｐＢＲ３２２−Ｐｓｔｌ、 Ｇ−
テール化（３０２ｎｇ） ９３μＡ １０倍希釈したアニーリング緩衝液※ ６２６．５μβ 蒸留水 ９３０μ１ 反応混合物を、７０℃の別の水浴中におき、ついで水浴
を、３７℃の部屋に移し、−夜かけて、徐々に３７℃に
冷やした。ついで室温に移し、そこで水浴は、数時間を
かけて３０℃に冷やした。
さらに反応混合物を、４℃に貯蔵した。
※（１０×アニーリング緩衝液＝１．５ＭＮａＣＪ！／
１００ｍＭ ）リス−塩酸。
１００ｍＭ ）リス−塩酸。
ｐＨ７，５／１０ｍＭ ＥＤＴＡ）
Ｅ、Ｃｏ１１ ＨＢＩσ１細胞は、既知の塩化カルシ
ウム処理法によって形質転換のために適合化された。適
合化ＨＢｉＯ１細胞の２００ ｔｔ ｅ了りコート（ａ
ｌｉｑｕｏｔ） ２つをアニーリング反応混合物の４０
μρと各々混合し、水中に２０分分間−た。
ウム処理法によって形質転換のために適合化された。適
合化ＨＢｉＯ１細胞の２００ ｔｔ ｅ了りコート（ａ
ｌｉｑｕｏｔ） ２つをアニーリング反応混合物の４０
μρと各々混合し、水中に２０分分間−た。
次いで、４２℃で２分間の加温処理を行った。
２、８ｍ７＋のルリアプロス（Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ
）を各々の管に加え、３７℃で１時間インキュベートシ
た。
）を各々の管に加え、３７℃で１時間インキュベートシ
た。
これらの管の中にある物は、０．７％寒寒天添加ソリア
ブロス含む管へアリコートされ（］／２ｍ ７！アリコ
ート）、次いで２５μｇ７ｍｌｌのテトラサイクリンを
含むルリアブロースー寒天板上に注入された。そして、
コロニーが表われるまで３７°Ｃでインキュベートした
。（ｃＤＮＡの挿入の有無にかかわらず） ｐＢＲ３２
２によって形質転換された細胞のみが、テトラサイクリ
ン・プレート上で生育できる。約２５００の形質転換コ
ロニーがプレート上で生育した。
ブロス含む管へアリコートされ（］／２ｍ ７！アリコ
ート）、次いで２５μｇ７ｍｌｌのテトラサイクリンを
含むルリアブロースー寒天板上に注入された。そして、
コロニーが表われるまで３７°Ｃでインキュベートした
。（ｃＤＮＡの挿入の有無にかかわらず） ｐＢＲ３２
２によって形質転換された細胞のみが、テトラサイクリ
ン・プレート上で生育できる。約２５００の形質転換コ
ロニーがプレート上で生育した。
実施例 ３
完全長Ｈ３Ａ ｃＤＮＡの
形質転換体は、最初、ラットの血清アルブミン（Ｒ３Ａ
）ｃＤＮＡ断片でスクリーンされた。
）ｃＤＮＡ断片でスクリーンされた。
Ｒ３ＡｃＤＮＡ断片は２０ＱＯｐｂのＲ３ＡｃＤＮＡ挿
入を含むｐＢＲ３２２プラスミドから得られた。この組
み換えプラスミドは、ブロシーデインダス オブ ナシ
ョナル アカデミ−オプ サイエンス ニーニスニー（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
入を含むｐＢＲ３２２プラスミドから得られた。この組
み換えプラスミドは、ブロシーデインダス オブ ナシ
ョナル アカデミ−オプ サイエンス ニーニスニー（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
」兆）、ユ四４３７０ （１９７９）に記述されたプラ
スミドｐｒＡ７！ｂｌと似ているが、これより長いｃＤ
ＮＡ挿入物を担持している。
スミドｐｒＡ７！ｂｌと似ているが、これより長いｃＤ
ＮＡ挿入物を担持している。
１４８０ｂｐラツト血清アルブミン（ＲＳ Ａ）断片は
、制限エンドヌクレアーゼ、Ｂｓ±ＥｌｌでＲ３ＡｃＤ
ＮＡを担持するプラスミドを消化することによって分離
された（本実施例で使用したすべての制限エンドヌクレ
アーゼは、製造元の説明書に記載の方法によって使用し
た）。
、制限エンドヌクレアーゼ、Ｂｓ±ＥｌｌでＲ３ＡｃＤ
ＮＡを担持するプラスミドを消化することによって分離
された（本実施例で使用したすべての制限エンドヌクレ
アーゼは、製造元の説明書に記載の方法によって使用し
た）。
次いで断片は、“二ツクトランスレーション”法（マニ
アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、州＾Ｓ ｌｌ５Ａ、
７２ ：３９６１ （１９７５）によってα３Ｚｐで放
射活性ラベルした。
アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、州＾Ｓ ｌｌ５Ａ、
７２ ：３９６１ （１９７５）によってα３Ｚｐで放
射活性ラベルした。
約８０の個々の形質転換体の１０ｍＡカルチャー （ｃ
ｕｌｔｕｒｅ）を生育させ、そしてプラスミドＤＮＡを
既知のプラスミド°ミニープレツブ法”によって分離し
た。部分精製プラスミドＤＮＡは、０．８％アガロース
ゲル上で電気泳動にかけられた。ＤＮＡは、“サザンブ
ロッティング法（サザン、イー・エム（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ＋ Ｅ、 Ｍ、）ジャーナルオプモレキュー バイオ
ロジー（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、 Ｂｉｏ−１ｏｇｙ）皿、
５０３ （１９７５）を使ってゲルからニトロセルロー
ス・フィルターに移された。
ｕｌｔｕｒｅ）を生育させ、そしてプラスミドＤＮＡを
既知のプラスミド°ミニープレツブ法”によって分離し
た。部分精製プラスミドＤＮＡは、０．８％アガロース
ゲル上で電気泳動にかけられた。ＤＮＡは、“サザンブ
ロッティング法（サザン、イー・エム（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ＋ Ｅ、 Ｍ、）ジャーナルオプモレキュー バイオ
ロジー（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、 Ｂｉｏ−１ｏｇｙ）皿、
５０３ （１９７５）を使ってゲルからニトロセルロー
ス・フィルターに移された。
ニトロセルロース・フィルターは、プレハイブリダイゼ
ーション溶液（５０％ホルムアミド１５倍希釈したＳＳ
Ｃ※１０．０５Ｍ Ｎ３３ＰＯ４。
ーション溶液（５０％ホルムアミド１５倍希釈したＳＳ
Ｃ※１０．０５Ｍ Ｎ３３ＰＯ４。
ｐＨ６，５１５倍希釈したＤｅｎｈａｒｄｔ’Ｓ ５ｔ
ｏｃｋ※／１００＃ｇ／ｍｎサケ精子ＤＮＡ）中に、４
２°Ｃで２時間漫した。該フィルターをハイブリダイゼ
ーション溶液（５０％ホルムアミド／１０％ デキスト
ラン硫酸／ＳＳＣの５倍希釈溶液／２０ｍＭＮａ５Ｐ○
ａ 、ｐＨ６、５／ Ｉ ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ５
ｔｏｃｋ１５０μｎ／ｍρサケ精子ＤＮＡ）中に浸した
。
ｏｃｋ※／１００＃ｇ／ｍｎサケ精子ＤＮＡ）中に、４
２°Ｃで２時間漫した。該フィルターをハイブリダイゼ
ーション溶液（５０％ホルムアミド／１０％ デキスト
ラン硫酸／ＳＳＣの５倍希釈溶液／２０ｍＭＮａ５Ｐ○
ａ 、ｐＨ６、５／ Ｉ ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ５
ｔｏｃｋ１５０μｎ／ｍρサケ精子ＤＮＡ）中に浸した
。
上記のように二ツクトランスレーションにより調製され
た１、 ４８０ ｂ ｐのＲ３Ａ断片を１００℃、５分
間加熱し、次いで水浴で急冷し、このプローブ゛を溶液
１ｍｎ当たり２Ｘ１０５ｃｐｍのプローブとなるまでハ
イブリダイゼーション溶液に添加した。
た１、 ４８０ ｂ ｐのＲ３Ａ断片を１００℃、５分
間加熱し、次いで水浴で急冷し、このプローブ゛を溶液
１ｍｎ当たり２Ｘ１０５ｃｐｍのプローブとなるまでハ
イブリダイゼーション溶液に添加した。
次いでフィルターを、４２℃１８時間ハイブリダイゼー
ション溶液中でインキュベートし、次いで２倍希釈した
ＳＳＣで２度、Ｏ，ｌＸ５ＳＣで１度室温で洗浄した。
ション溶液中でインキュベートし、次いで２倍希釈した
ＳＳＣで２度、Ｏ，ｌＸ５ＳＣで１度室温で洗浄した。
フィルターのオートラジオグラフィーは、すべてプラス
ミドＤＮＡに対して、プローブの特異的なハイブリダイ
ゼーションを表わした。
ミドＤＮＡに対して、プローブの特異的なハイブリダイ
ゼーションを表わした。
※５０ ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ５ｔｏｃｋ＝ １％
ポリビニルピロリドン／１％フィコール／１％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ） ※ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｊ！／１５ｒｎＭクエ
ン酸ナトリウム、クエン酸でｐｌ＋６．８１１！’１ に調製 それ故、いくつかのザザン・ブロン１−・フィルターは
、６５℃から８０°Ｃの種々の温度で２倍希釈したＳＳ
Ｃで洗浄された。６５°Ｃで洗浄されたフィルター上の
一つのプラスミドからのＤＮＡは、プローブと強くハイ
ブリダイゼーションしていた。
ポリビニルピロリドン／１％フィコール／１％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ） ※ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｊ！／１５ｒｎＭクエ
ン酸ナトリウム、クエン酸でｐｌ＋６．８１１！’１ に調製 それ故、いくつかのザザン・ブロン１−・フィルターは
、６５℃から８０°Ｃの種々の温度で２倍希釈したＳＳ
Ｃで洗浄された。６５°Ｃで洗浄されたフィルター上の
一つのプラスミドからのＤＮＡは、プローブと強くハイ
ブリダイゼーションしていた。
ＤＮＡのシーケンシングは、６Ｃ３と呼ばれる“陽性”
クローンが、部分長ヒト血清アルブミンクローンである
ことを示した。プラスミドＤＮＡは、６Ｃ３のカルチャ
ー（Ｃｕｌ ｔｏｒｅ） から分離され、制限エンド
ヌクレアーゼＰｓ↓Ｉで消化された。
クローンが、部分長ヒト血清アルブミンクローンである
ことを示した。プラスミドＤＮＡは、６Ｃ３のカルチャ
ー（Ｃｕｌ ｔｏｒｅ） から分離され、制限エンド
ヌクレアーゼＰｓ↓Ｉで消化された。
得られたＨ３ＡｃＤＮＡ断片の一つで約４７５ｂｐの長
さのものが単離され、プローブとして使うため“ニック
・１〜ランスレーｌ−”された。
さのものが単離され、プローブとして使うため“ニック
・１〜ランスレーｌ−”された。
約２５００クローンの全パンク（ｂａｎｋ）について、
グルンステイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、前述のハイ
ブリダイゼーション法の変法を使って、このプローブに
よってスクリーンされた。
グルンステイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、前述のハイ
ブリダイゼーション法の変法を使って、このプローブに
よってスクリーンされた。
形質転換コロニーは、０．２％グルコースと２５μｇ／
ｍβテトラサイクリン 加 リルアブロス（Ｌｕｒｉａ
ｂｒｏｔｈ）を含む９６穴マイクロタイタープレート
上の分離ウェルヘプレートから別々に摘出した。そして
３７℃で一夜インキュベートシた。４８コの金属プロン
グ（ｐｒｏｎｇ）を有する転換装置を使って、各々の培
地中のサンプルの２つのルリアブロス（Ｌｕｒｉａ ｂ
ｒｏｔｈ）／寒天／テトラザイクリン・プレートに移し
たが、１つは前もってニトロセルロース・フィルターで
おおわれたプレートである。そして３７℃で２日間イン
キュベート・した。次いでフィルターは、次の溶液の一
つ中に浸されたワットマンろ紙上で連続的に置かれた。
ｍβテトラサイクリン 加 リルアブロス（Ｌｕｒｉａ
ｂｒｏｔｈ）を含む９６穴マイクロタイタープレート
上の分離ウェルヘプレートから別々に摘出した。そして
３７℃で一夜インキュベートシた。４８コの金属プロン
グ（ｐｒｏｎｇ）を有する転換装置を使って、各々の培
地中のサンプルの２つのルリアブロス（Ｌｕｒｉａ ｂ
ｒｏｔｈ）／寒天／テトラザイクリン・プレートに移し
たが、１つは前もってニトロセルロース・フィルターで
おおわれたプレートである。そして３７℃で２日間イン
キュベート・した。次いでフィルターは、次の溶液の一
つ中に浸されたワットマンろ紙上で連続的に置かれた。
０．５Ｍ 水酸化ナトリウム；１Ｍトリス、ｐ１１７
．４；ＩＭ、）リス、 ｐＨ７，４； ２倍希釈したＳ
ＳＣｉ ９０％エタノール、および９０％エタノール（
この順で、溶液当り７分間） 次いでニトロセルロース・フィルター上、８０℃で２時
間真空中で加熱した。
．４；ＩＭ、）リス、 ｐＨ７，４； ２倍希釈したＳ
ＳＣｉ ９０％エタノール、および９０％エタノール（
この順で、溶液当り７分間） 次いでニトロセルロース・フィルター上、８０℃で２時
間真空中で加熱した。
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーショ
ン法は、３度室温で洗浄することを除いで」二連の方法
に準じた。９０の陽性ハイブリダイゼーション・シグナ
ルがオートラジオグラフィーで検知された。パ陽性クロ
ーン”は、さらに制限酵素分析法（例えば丑±±Ｉ消化
）及び上記の“ザザン・プロット”のハイブリダイゼー
ション法で分析した。
ン法は、３度室温で洗浄することを除いで」二連の方法
に準じた。９０の陽性ハイブリダイゼーション・シグナ
ルがオートラジオグラフィーで検知された。パ陽性クロ
ーン”は、さらに制限酵素分析法（例えば丑±±Ｉ消化
）及び上記の“ザザン・プロット”のハイブリダイゼー
ション法で分析した。
完全長Ｈ３ＡｃＤＮＡをもつクローンは、ＤＮＡシーケ
ンシングによって同定・確認された。このＨＳ Ａ ｃ
’Ｄ’ＮＡ挿入物を含む組み換えプラスミドは、ｐＧＸ
４０１と名付けられ、それは第４図に示した。Ｈ３Ａｃ
ＤＮＡの部分制限酵素地図を第１図に示し、第２図は、
クローン化遺伝子のＤＮＡ配列（５’−３’８Ｎ）と、
それを特定するアミノ酸配列を示した。
ンシングによって同定・確認された。このＨＳ Ａ ｃ
’Ｄ’ＮＡ挿入物を含む組み換えプラスミドは、ｐＧＸ
４０１と名付けられ、それは第４図に示した。Ｈ３Ａｃ
ＤＮＡの部分制限酵素地図を第１図に示し、第２図は、
クローン化遺伝子のＤＮＡ配列（５’−３’８Ｎ）と、
それを特定するアミノ酸配列を示した。
ｐＧＸ４０１で形質転換されたＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ
のサンプルは、受付けＩ’ｉ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５’
７８４として、イリノイ州ペオリアの米国農務省北部調
査研究所（ｔｈｅ Ｕ、 Ｓ、 Ｄｅｐｔ、 ｏｆ Ａ
ｇ−ｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託され
ている。
のサンプルは、受付けＩ’ｉ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５’
７８４として、イリノイ州ペオリアの米国農務省北部調
査研究所（ｔｈｅ Ｕ、 Ｓ、 Ｄｅｐｔ、 ｏｆ Ａ
ｇ−ｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託され
ている。
第１図は、本文中に記載された手法によって単離された
完全長（ｆｕｌｌ−１ｅｎｇｔｈ） Ｈ３ＡｃＤＮＡク
ローンの部分制限地図を示す。 第２図（ａ）、第２図（ｂ）および第２図（ｃ）は同図
（ａ） 、 （ｂ） 、 （ｃ）の順に完全長Ｈ３Ａｃ
ＤＨＡの非コード化およびコード化領域の５′から３′
の連鎖のＤＮＡ配列とともに、ＤＮＡ配列によって特定
されたアミノ酸配列を示す。 第３図ばｍＲＮＡの駕糖密度勾配画分のＡｚｂ。 曲線（ｐｌｏｆｉｌｅ）を示す。Ｂグループ画分は）（
Ｓ ＡｃＤＮＡを合成する際に鋳型として使用された。 第４図はｐＧＸ４０１、ずなわち完全長ＨＳ ＡｃＤＮ
Ａ挿入部を含む組換えプラスミドを示す。 ただし、５’ＰｓｔＩ部位は再生させなかった。 第５図（ａ）は、ｍＲＮＡから直接的にヒト血清アルブ
ミン遺伝子のヌクレチオド配列を決定した時の５′端か
ら９５〜１１２番目のアミノ酸に対応する塩基配列を示
した図であり、ｐＧＸ４０１に組み込まれたヒト肝臓（
ＨＬ ８ ）のヒト血清アルブミン遺伝子の場合であり
、第５図（ｂ）は、他の異なる二人の肝臓（ＨＬ３３お
よびＨＬ ３９ ）の場合である。 Ｚ１訴本石舅市鰺韮市 ０Ｊ（Ｊ 、−１１−４４１ｏ Ｐ−ＩＬＩ ’
ｓ＜ ｍｕ ｃｒＪ＞＜の＜ＩｔＩ日 ｏＪｌ−４
−８ΦＢ −リ −く −〇＜ｔｐ ＞Ｑ Ｅ＜
：）Ｑ −ｕ ＜ａ じＵ Ｏａ句８ 山
Ｅ−１＞Ｕ 駒８ しＨし日 ｏＨコ日Ｉ−Ｉ
ｕ Ｉ／Ｉ＜ 、−＋ａ ０ＪＣＪ ｘ：ｕ
＞＜ Ｌｌ（Ｊ ａｓｈ＜じ ＜Ｌｌ じ
０ θＥ−Ｉ Ｅ＠＜ Ｅ−ｊＥ−１山ＣＪ
ＪＵＯＥ−１ｔｌｌｔ！ｌ ：Ｉじ ｕＩＪ
１ａ（Ｊ ＩＩＩＬ＋ ’：Ｎｊ ｅ（！１と８
ごて ３七 〜ｉ 画定 δ８ 四６ ｇご■ム％針
韮市書４市閥 市啄珪紡おＨ畦涯茫ト ＣｂＥ４ Ｉ−ＩＦ４ ａｓｈ ＨＦ２
Ｗ＜ 、Ｏｌ”４ ｏｈ コト切＜
づＥ−１ｖ＋＜ ・−ぺ 、αＵ しυ
しＵ ω８＜○ 〉○ くり 丁Ｑ 日く
山Ｕ 山ＣＪ ｔｊ（Ｊ（：Ｅ−１Φト 切り
いＵ 切Ｃαト ０ト コじ芝≦ ｇＩ ３乏 曝冨
ごて 芝ご と８ ＝６Ｊｄ茹市牙七市３ヨ肺 、！暮 、２Ｈ２４、ｇ乙 ゴ８ 起１ 芝炬：１ 二
８ 誓６ 賎 暉 二８ ぶて 二能ＵＯ＜０ にＣ
！ｌ Ｅ４１−１ ＜＜ に０ じＬｌ
ｌ ｏｕ市茫ｉおＨ市Ｓ目綽韮３１ Φ１−ＩＬＪり 仁Ｕ −シ りじ 田○
ΦＵ ωＵ号ミ エ８ 芝乏 υｉ ３Ｓ δＨ起
上 号ギｕ、ｕ ｏＨ，Ｈ２３ｇ ；ｇｇ Ｈ７
２ｇ 芸＜Ｕ）Ｉ ０４（Ｊ Ｑ＜ 山
８ ４０ −く シＵ −８琢 → つ ？ ト 境 堰 ψ ト ク ペ ベ ト 仁 ト ト ベ く ゴ く 一ｒ％２ｎ− Ｊａミグ鰺ｄ目庇お８ぢ 側ワ肺市胚囲畦肺 肺■Ｓ１肋市駁ユ１ ３１ 四８ 起上 ｇ拐 ＝≦ ミソ 冒８３１ｙ翳ル
に屁月市ａＨ 浣゛百 ３０ 口ご 曝８ ヨご ＝ギ 起し刹ぎ包
韮肚ｒ「琢３し Ｓ目δ葺５２北卸にＥ ５３ 召腎市紡足０肺卦菖肝 市ジ目５ａ三瑚■おコＩ 計計市言扉涯分卸 Ｍご ｙむ ミ≦ 鼾ギ 控 計 芸号ｔＱｅ ！−
４＜ ａ＜ ＜ａ ＜ａ ｑｈ ｃｂｈ第
５ 図 （ａ） ５’ ＧＡＡ ＣＣＴ Ｇ鳩ＡＧＡ ＡＡＴ ＧＡＡ
ＴＧＣＴＴＣｐＧｘ４０’ ３’ ＣＴＴ ＧＧＡ Ｃ
ＸＴＣＴ ＴＴＡ ＣＴＴ ＡＣＧ ＡＡＧ第 ５
図 （ｂ） Ｈ１３３Ｈ１３９ ＧＡＴＣＧＡＴＣ
完全長（ｆｕｌｌ−１ｅｎｇｔｈ） Ｈ３ＡｃＤＮＡク
ローンの部分制限地図を示す。 第２図（ａ）、第２図（ｂ）および第２図（ｃ）は同図
（ａ） 、 （ｂ） 、 （ｃ）の順に完全長Ｈ３Ａｃ
ＤＨＡの非コード化およびコード化領域の５′から３′
の連鎖のＤＮＡ配列とともに、ＤＮＡ配列によって特定
されたアミノ酸配列を示す。 第３図ばｍＲＮＡの駕糖密度勾配画分のＡｚｂ。 曲線（ｐｌｏｆｉｌｅ）を示す。Ｂグループ画分は）（
Ｓ ＡｃＤＮＡを合成する際に鋳型として使用された。 第４図はｐＧＸ４０１、ずなわち完全長ＨＳ ＡｃＤＮ
Ａ挿入部を含む組換えプラスミドを示す。 ただし、５’ＰｓｔＩ部位は再生させなかった。 第５図（ａ）は、ｍＲＮＡから直接的にヒト血清アルブ
ミン遺伝子のヌクレチオド配列を決定した時の５′端か
ら９５〜１１２番目のアミノ酸に対応する塩基配列を示
した図であり、ｐＧＸ４０１に組み込まれたヒト肝臓（
ＨＬ ８ ）のヒト血清アルブミン遺伝子の場合であり
、第５図（ｂ）は、他の異なる二人の肝臓（ＨＬ３３お
よびＨＬ ３９ ）の場合である。 Ｚ１訴本石舅市鰺韮市 ０Ｊ（Ｊ 、−１１−４４１ｏ Ｐ−ＩＬＩ ’
ｓ＜ ｍｕ ｃｒＪ＞＜の＜ＩｔＩ日 ｏＪｌ−４
−８ΦＢ −リ −く −〇＜ｔｐ ＞Ｑ Ｅ＜
：）Ｑ −ｕ ＜ａ じＵ Ｏａ句８ 山
Ｅ−１＞Ｕ 駒８ しＨし日 ｏＨコ日Ｉ−Ｉ
ｕ Ｉ／Ｉ＜ 、−＋ａ ０ＪＣＪ ｘ：ｕ
＞＜ Ｌｌ（Ｊ ａｓｈ＜じ ＜Ｌｌ じ
０ θＥ−Ｉ Ｅ＠＜ Ｅ−ｊＥ−１山ＣＪ
ＪＵＯＥ−１ｔｌｌｔ！ｌ ：Ｉじ ｕＩＪ
１ａ（Ｊ ＩＩＩＬ＋ ’：Ｎｊ ｅ（！１と８
ごて ３七 〜ｉ 画定 δ８ 四６ ｇご■ム％針
韮市書４市閥 市啄珪紡おＨ畦涯茫ト ＣｂＥ４ Ｉ−ＩＦ４ ａｓｈ ＨＦ２
Ｗ＜ 、Ｏｌ”４ ｏｈ コト切＜
づＥ−１ｖ＋＜ ・−ぺ 、αＵ しυ
しＵ ω８＜○ 〉○ くり 丁Ｑ 日く
山Ｕ 山ＣＪ ｔｊ（Ｊ（：Ｅ−１Φト 切り
いＵ 切Ｃαト ０ト コじ芝≦ ｇＩ ３乏 曝冨
ごて 芝ご と８ ＝６Ｊｄ茹市牙七市３ヨ肺 、！暮 、２Ｈ２４、ｇ乙 ゴ８ 起１ 芝炬：１ 二
８ 誓６ 賎 暉 二８ ぶて 二能ＵＯ＜０ にＣ
！ｌ Ｅ４１−１ ＜＜ に０ じＬｌ
ｌ ｏｕ市茫ｉおＨ市Ｓ目綽韮３１ Φ１−ＩＬＪり 仁Ｕ −シ りじ 田○
ΦＵ ωＵ号ミ エ８ 芝乏 υｉ ３Ｓ δＨ起
上 号ギｕ、ｕ ｏＨ，Ｈ２３ｇ ；ｇｇ Ｈ７
２ｇ 芸＜Ｕ）Ｉ ０４（Ｊ Ｑ＜ 山
８ ４０ −く シＵ −８琢 → つ ？ ト 境 堰 ψ ト ク ペ ベ ト 仁 ト ト ベ く ゴ く 一ｒ％２ｎ− Ｊａミグ鰺ｄ目庇お８ぢ 側ワ肺市胚囲畦肺 肺■Ｓ１肋市駁ユ１ ３１ 四８ 起上 ｇ拐 ＝≦ ミソ 冒８３１ｙ翳ル
に屁月市ａＨ 浣゛百 ３０ 口ご 曝８ ヨご ＝ギ 起し刹ぎ包
韮肚ｒ「琢３し Ｓ目δ葺５２北卸にＥ ５３ 召腎市紡足０肺卦菖肝 市ジ目５ａ三瑚■おコＩ 計計市言扉涯分卸 Ｍご ｙむ ミ≦ 鼾ギ 控 計 芸号ｔＱｅ ！−
４＜ ａ＜ ＜ａ ＜ａ ｑｈ ｃｂｈ第
５ 図 （ａ） ５’ ＧＡＡ ＣＣＴ Ｇ鳩ＡＧＡ ＡＡＴ ＧＡＡ
ＴＧＣＴＴＣｐＧｘ４０’ ３’ ＣＴＴ ＧＧＡ Ｃ
ＸＴＣＴ ＴＴＡ ＣＴＴ ＡＣＧ ＡＡＧ第 ５
図 （ｂ） Ｈ１３３Ｈ１３９ ＧＡＴＣＧＡＴＣ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、以下のデオキシリボヌクレオチドおよびアミノ酸配
列を含むヒト血清アルブミン遺伝 子。 【アミノ酸配列があります】 ここで５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まり、各
々の三塩基連鎖はコードするアミノ酸を示している。又
、略号は以下の一般的な意味を有する。 Ａ：デオキシアデニル Ｔ：デオキシチミジル Ｇ：デオキシグアニル Ｃ：デオキシシトシル Ｘ：Ａ、Ｔ、ＣあるいはＧ Ｙ：ＴあるいはＣ Ｚ：ＹがＣの時はＡ、Ｔ、ＣあるいはＧ ＹがＴの時はＡあるいはＧ Ｈ：Ａ、Ｔ、あるいはＣ Ｑ：ＴあるいはＡ Ｒ：ＱがＴの時はＣ ＱがＡの時はＧ Ｓ：ＱがＴの時はＡ、Ｔ、ＣあるいはＧ ＱがＡの時はＴあるいはＣ Ｍ：ＡあるいはＧ Ｌ：ＡあるいはＣ Ｎ：ＬがＡの時はＡあるいはＧ ＬがＣの時はＡ、Ｔ、ＣあるいはＧ Ｇｌｙ：グリシン Ａｌａ：アラニン Ｖａｌ：バリン Ｌｅｕ：ロイシン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｔｙｒ：チロシン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｃｙｓ：システィン Ｍｅｔ：メチオニン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｌｙｓ：リジン Ａｒｇ：アルギニン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｐｒｏ：プロリン Ｇｌｎ：グルタミン Ａｓｎ：アスパラギン ２、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含む、特許
請求の範囲第１項に記載のヒト血清アルブミン遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
れている。 ３、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含むプレプ
ロ−ヒト血清アルブミン遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まる各
々の三塩基連鎖がコードするアミノ酸を示している。又
、略号は特許請求の範囲第１項において定義されている
。 ４、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含む、特許
請求の範囲第３項に記載のプレプロ−ヒト血清アルブミ
ン遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
れている。 ５、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含む、特許
請求の範囲第３項に記載のプレプロ−ヒト血清アルブミ
ン遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
れている。 ６、原核あるいは有核生物中で複製する能力を有し、以
下のヒト血清アルブミン又はプレプロ−ヒト血清アルブ
ミンをコードするデオキシリボヌクリオチド配列を坦持
するプラスミド。 ヒト血清アルブミンをコードするデオキシ リボヌクリオチド配列： 【遺伝子配列があります】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
れている。 プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリ
ボヌクリオチド配列： 【遺伝子配列があります】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まる各
々の三塩基連鎖がコードするアミノ酸を示している。又
、略号は特許請求の範囲第１項において定義されている
。 ７、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含むヒト血
清アルブミン遺伝子又はプレプロ−ヒト血清アルブミン
遺伝子を担持する特許請求の範囲第６に記載のプラスミ
ド。 ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリボヌクレオ
チド配列： 【遺伝子配列があります】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
れている。 プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリ
ボヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 又は、 【遺伝子配列があります】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
れている。 ８、原核あるいは有核生物中で複製する能力を有し、以
下のヒト血清アルブミン又はプレプロ−ヒト血清アルブ
ミンをコードするデオキシリボヌクレオチド配列を担持
するプラスミドによって形質転換された微生物。 ヒト血清アルブミンをコードするデオキシ リボヌクリオチド配列： 【遺伝子配列があります】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
れている。 プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリ
ボヌクリオチド配列： 【遺伝子配列があります】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まる各
々の三塩基連鎖がコードするアミノ酸を示している。又
、略号は特許請求の範囲第１項において定義されている
。 ９、以下のデオキシリボヌクレオチド配列わ含むヒト血
清アルブミン遺伝子又はプレプロ−ヒト血清アルブミン
遺伝子を担持する特許請求の範囲第６に記載のプラスミ
ドによって形質転換された特許請求の範囲第８項に記載
の微生物。 ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリボヌクレオ
チド配列： 【遺伝子配列があります】 又は、 【遺伝子配列があります】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
れている。 １０、微生物がエスケリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
）属コリ（Ｃｏｌｉ）種である特許請求の範囲第８又は
９項に記載のプラスミド。 １１、微生物がＮＲＲＬＮｏ．１５７８４（ｐＧＸ４０
１）と実質的に同等である特許請求の範囲第１０項に記
載の微生物。 １２、吸収性の炭素、窒素および必須ミネラル源、成長
因子を含む水性栄養培地で、プレプロヒト血清アルブミ
ンを産生する条件下で、その生物中で複製することがで
き、かつ以下のプレプロ−ヒト血清アルブミンをコード
するデオキシリボヌクレオチド配列を有するプラスミド
によって形質転換された微生物を培養すること、および
、そのようにして産生されたプレプロ−ヒト血清アルブ
ミンを回収することを含む、実質的に純粋なプレプロ−
ヒト血清アルブミンを産生する方法。 プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードす るデオキシリボヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まる各
々の三塩基連鎖がコードするアミノ酸を示している。又
、略号は特許請求の範囲第１項において定義されている
。 １３、プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードするデオ
キシリボヌクレオチド配列が、以下である特許請求の範
囲第１２項の方法。 【遺伝子配列があります】 又は、 【遺伝子配列があります】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
れている。 １４、微生物がエスケリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
）属コリ（Ｃｏｌｉ）種である特許請求の範囲第１２又
は１３項に記載の方法。 １５、微生物がＮＲＲＬＮｏ．１５７８４（ｐＧＸ４０
１）と実質的に同等である特許請求の範囲第１４項に記
載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30361386A JPH0198486A (ja) | 1986-06-17 | 1986-12-19 | クロ−ン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アルブミンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US74552485A | 1985-06-17 | 1985-06-17 | |
| US745524 | 1985-06-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6229985A true JPS6229985A (ja) | 1987-02-07 |
Family
ID=24997050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61141206A Pending JPS6229985A (ja) | 1985-06-17 | 1986-06-17 | クロ−ン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0206733A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6229985A (ja) |
| KR (1) | KR870000428A (ja) |
| AU (1) | AU5890286A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0319641A1 (en) | 1987-12-02 | 1989-06-14 | Green Cross Corporation | Method for preparing foreign protein in yeast, recombinat DNA, transformant |
| JPH02194A (ja) * | 1987-10-30 | 1990-01-05 | Delta Biotechnol Ltd | ヒト血清アルブミンのｎ‐未端を含有するポリペプチド |
| US4996592A (en) * | 1988-08-12 | 1991-02-26 | Oki Electric Industry Co., Ltd. | Video communication apparatus capable of electronically adjusting the field of view of a video frame |
| JPH03501323A (ja) * | 1987-09-14 | 1991-03-28 | スカンデイジェン、アクチエボラーグ | 真正のヒト血清アルブミンをコードする人工遺伝子、その使用およびその製造法 |
| EP0683233A2 (en) | 1994-05-18 | 1995-11-22 | The Green Cross Corporation | Process for producing recombinant human serum albumin |
| WO2009139464A1 (ja) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | 株式会社アールテック・ウエノ | ドライアイおよび／または角結膜障害処置のための医薬組成物 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU619495B2 (en) * | 1987-09-14 | 1992-01-30 | Mta Szegedi Biologiai Kozpontja | Artificial gene coding for authentic human serum albumin, use thereof, and method of producing the same |
| US5879907A (en) * | 1987-09-14 | 1999-03-09 | Skandigen Ab | Artificial gene coding for authentic human serum albumin, use thereof and method |
| JPH01215289A (ja) * | 1988-02-22 | 1989-08-29 | Toa Nenryo Kogyo Kk | 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンａの製造方法 |
| IL89992A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
| US5759802A (en) * | 1988-10-26 | 1998-06-02 | Tonen Corporation | Production of human serum alubumin A |
| JPH0671432B2 (ja) * | 1991-03-20 | 1994-09-14 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
| CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP2267026A1 (en) | 2000-04-12 | 2010-12-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7507413B2 (en) | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| PT1463751E (pt) | 2001-12-21 | 2013-08-26 | Human Genome Sciences Inc | Proteínas de fusão de albumina |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL66614A (en) * | 1981-08-28 | 1985-09-29 | Genentech Inc | Method of constructing a dna sequence encoding a polypeptide,microbial production of human serum albumin,and pharmaceutical compositions comprising it |
| EP0079739A3 (en) * | 1981-11-12 | 1984-08-08 | The Upjohn Company | Albumin-based nucleotides, their replication and use, and plasmids for use therein |
| EP0091527A3 (en) * | 1981-12-14 | 1984-07-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human serum albumin-like polypeptides |
-
1986
- 1986-06-17 AU AU58902/86A patent/AU5890286A/en not_active Abandoned
- 1986-06-17 JP JP61141206A patent/JPS6229985A/ja active Pending
- 1986-06-17 KR KR1019860004804A patent/KR870000428A/ko not_active Application Discontinuation
- 1986-06-17 EP EP86304656A patent/EP0206733A1/en not_active Withdrawn
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03501323A (ja) * | 1987-09-14 | 1991-03-28 | スカンデイジェン、アクチエボラーグ | 真正のヒト血清アルブミンをコードする人工遺伝子、その使用およびその製造法 |
| JPH02194A (ja) * | 1987-10-30 | 1990-01-05 | Delta Biotechnol Ltd | ヒト血清アルブミンのｎ‐未端を含有するポリペプチド |
| EP0319641A1 (en) | 1987-12-02 | 1989-06-14 | Green Cross Corporation | Method for preparing foreign protein in yeast, recombinat DNA, transformant |
| US4996592A (en) * | 1988-08-12 | 1991-02-26 | Oki Electric Industry Co., Ltd. | Video communication apparatus capable of electronically adjusting the field of view of a video frame |
| EP0683233A2 (en) | 1994-05-18 | 1995-11-22 | The Green Cross Corporation | Process for producing recombinant human serum albumin |
| WO2009139464A1 (ja) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | 株式会社アールテック・ウエノ | ドライアイおよび／または角結膜障害処置のための医薬組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR870000428A (ko) | 1987-02-18 |
| EP0206733A1 (en) | 1986-12-30 |
| AU5890286A (en) | 1986-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS6229985A (ja) | クロ−ン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子の製造方法 | |
| Minty et al. | Mouse actin messenger RNAs | |
| JPH0789934B2 (ja) | 構造遺伝子の製造および発現 | |
| US4652525A (en) | Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes | |
| JPH0574345B2 (ja) | ||
| JPH0998791A (ja) | ヒト−グリア由来神経突起因子 | |
| JPS61275223A (ja) | ヒト血清アルブミンの微生物学的調製法 | |
| JPH0659218B2 (ja) | Ｄｎａ導入ベクタ− | |
| Sala-Trepat et al. | Isolation and characterization of poly (adenylic acid)-containing messenger ribonucleic acid from rat liver polysomes | |
| US5089406A (en) | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences | |
| JP2525023B2 (ja) | 組み換えインタ―ロイキン―１の精製 | |
| CN114015676B (zh) | 一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法 | |
| FI86993C (fi) | Foerfarande foer skyddande av en bakterie mot en i naturen foerekommande bakteriofag | |
| JPS62171695A (ja) | 発光蛋白アクアリン遺伝子を用いるアクアリン活性を有する蛋白質の製造法 | |
| JP2854902B2 (ja) | 遺伝子工学処理された中熱性宿主細胞からの熱安定性酵素の単離 | |
| EP0125818A1 (en) | Cloned ovine growth hormone gene | |
| JPS62278986A (ja) | ハイブリツドポリペプチド | |
| Sodek et al. | Large-scale preparation and some properties of penicillopepsin, the acid proteinase of Penicillium janthinellum | |
| KR940003653B1 (ko) | 인체 췌장 엘라스타제의 제조방법 | |
| CN114958893B (zh) | 一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法 | |
| US4870015A (en) | Method and composition for producing lectin in microorganisms | |
| JPH06510428A (ja) | Ｔ−型遺伝子６エキソヌクレアーゼでのｄｎａ配列決定 | |
| CN114230644A (zh) | 一种gp32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用 | |
| JPH0198486A (ja) | クロ−ン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アルブミンの製造方法 | |
| Chelm et al. | Mapping of transcribed regions of Euglena gracilis chloroplast DNA |