WO2009139464A1 - ドライアイおよび／または角結膜障害処置のための医薬組成物 - Google Patents

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WO2009139464A1
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serum albumin
human serum
dry eye
yeast
eye
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PCT/JP2009/059052
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行彦 真島
中行 岸本
玲子 田渕
直子 島
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株式会社アールテック・ウエノ
田辺三菱製薬株式会社
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    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • the present invention provides an ophthalmic pharmaceutical composition comprising human serum albumin produced by recombinant yeast cells obtained by genetic manipulation using yeast as a host as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for the treatment of dry eye and keratoconjunctival disorder.
  • the present invention further provides methods of treating dry eye and keratoconjunctival disorders using the pharmaceutical composition.
  • the keratoconjunctival disorder is caused by a defect in the epithelium from the surface.
  • causes include dry eye, various types of keratoconjunctivitis, allergies, pathological factors caused by infection with microorganisms (viruses, bacteria, fungi, etc.), chemical factors based on drug cytotoxicity, acid and alkali corrosion, and dryness of the eye surface.
  • pathological factors caused by infection with microorganisms (viruses, bacteria, fungi, etc.)
  • chemical factors based on drug cytotoxicity based on drug cytotoxicity, acid and alkali corrosion
  • dryness of the eye surface and dryness of the eye surface.
  • physical factors such as trauma caused by foreign matter (contact lenses, etc.), hot water, and the like.
  • Dry eye is a disorder of the tear film caused by lack of tears or excessive evaporation, and is known as a disease that damages the surface of the eye (cornea, conjunctiva, etc.) between the eyelids or has an indefinite complaint.
  • dry eye has discomfort, visual impairment, tear film instability, and is a multifactorial disease of tears and eye surfaces leading to ocular surface damage. Is defined.
  • the osmotic pressure of the tear film is increased and inflammation is caused on the surface of the eye.
  • the main types of dry eye are tear-deficient dry eye and Evaporative dry eye.
  • the cause of dry eye is a lack of tear secretion from the lacrimal gland. Further, the evaporation-type dry eye is caused by excessive disappearance of water from the exposed eye surface when the lacrimal secretion function is normal.
  • an intrinsic cause caused by an intrinsic disease that affects the structure and dynamics of the eyelid, or an exogenous cause that causes a disease on the eye surface by exposure to the outside (Non-patent Document 1). ).
  • Non-patent Document 1 There are various causes of dry eye, but no method has been found to restore the reduced tear volume to normal.
  • dry eye treatment includes artificial tears for the purpose of supplementing tears, chondroitin sulfate, glutathione, hyaluronic acid, fibronectin, serum eye drops, etc. for the purpose of alleviating the patient's subjective symptoms
  • tears chondroitin sulfate, glutathione, hyaluronic acid, fibronectin, serum eye drops, etc.
  • HSA Human serum albumin
  • This protein is made in the liver and is primarily responsible for maintaining normal osmotic pressure in the bloodstream. It is also known to have a function as a carrier for various serum molecules.
  • HSA is used to treat conditions where there is fluid loss from blood vessels, such as surgery, shock, burns, and hypoproteinemia. For example, in shock and burn patients, HSA is frequently administered to restore the reduced blood volume and thereby improve some symptoms associated with trauma. HSA is also used to treat patients with hypoproteinemia and fetal erythroblastosis.
  • HSA is manufactured by fractionating donated human blood.
  • the disadvantages of this manufacturing method are that it is uneconomical and that it is difficult to stably supply human blood.
  • human blood may contain undesirable substances such as hepatitis virus. It is therefore desirable to develop alternative raw materials for HSA.
  • Patent Document 1 describes human serum albumin (hereinafter also referred to as rHSA) obtained by genetic manipulation using Pichia yeast as a host.
  • rHSA human serum albumin
  • this rHSA has been approved by the Ministry of Health, Labor and Welfare as “Medway (registered trademark) Note” (Mitsubishi Tanabe Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan).
  • Medway (registered trademark) Note Mitsubishi Tanabe Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan.
  • Non-Patent Document 2 describes human serum albumin obtained by genetic manipulation using Saccharomyces yeast as a host. This rHSA has been approved by the US Food and Drug Administration as a stabilizer for vaccines and the like, and is sold under the name “Recommubumin (registered trademark)” (Novozymes).
  • Patent Document 2 describes that human serum albumin is useful for the treatment of dry eye and keratoconjunctival disorders, which are ophthalmic diseases.
  • Patent Document 3 describes that the treatment of dry eye requires that the HSA concentration be as low as 0.001 to 0.3 mg / ml. According to Patent Document 3, eye drops with a high concentration of HSA concentration of 1.0 mg / ml (0.1 W / V%) or more have an eye irritation action, and local administration to the eye causes problems such as local irritation. It is disclosed that it has.
  • Patent Documents 2 and 3 describe that, as a general theory, human serum albumin obtained by general genetic manipulation can be used instead of HSA. However, it is not known what effect human serum albumin obtained by genetic manipulation using yeast as a host has on ophthalmic diseases such as dry eye and keratoconjunctival disorder.
  • An object of the present invention is to provide a novel pharmaceutical composition for the treatment of dry eye and / or keratoconjunctival disorder.
  • human serum albumin obtained by genetic manipulation using yeast differs from the effects described in the publicly known literature of human serum albumin produced as a product from a fraction of human blood. No effect on dry eye or keratoconjunctival disorder is observed at low concentrations of ⁇ 0.3 mg / ml, and no eye irritation is observed even at high concentrations of 10 mg / ml (1.0 W / V%) or higher.
  • the present invention has been found to be effective against dry eye and keratoconjunctival disorder.
  • the present invention is as follows: (1) A pharmaceutical composition for treating dry eye, comprising human serum albumin produced by recombinant yeast obtained by transforming yeast with a gene encoding human serum albumin as an active ingredient. (2) A pharmaceutical composition for treating keratoconjunctival disorders, comprising human serum albumin produced by recombinant yeast obtained by transforming yeast with a gene encoding human serum albumin as an active ingredient. (3) The composition according to (1) or (2), wherein the yeast is Pichia yeast or Saccharomyces yeast. (4) the yeast is Pichia pastoris (Pichia pastoris) or Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces c cerevisiae), (3) composition.
  • the composition according to (1) or (2), wherein the recombinant human serum albumin is human serum albumin having the following characteristics:
  • the human serum albumin has a purity of 99.999% or more based on the content ratio of human serum albumin and antigenic protein and polysaccharide other than human serum albumin derived from yeast, and human serum albumin and human derived from yeast Contamination of antigenic proteins and polysaccharides other than serum albumin is below the detection limit of the yeast immunoassay (EIA method).
  • the composition according to (1), wherein the dry eye is tear-deficient dry eye and enhanced evaporation type dry eye.
  • composition according to (1) which is selected from the group consisting of tear reduction in the whole body caused by a decrease in tears of a VDT (Visual Display Terminal) worker and drying of a room by air conditioning.
  • VDT Visual Display Terminal
  • Keratoconjunctival disorder is a pathological factor selected from the group consisting of dry eye, keratoconjunctivitis, allergy and infection of microorganisms (virus, bacteria or fungus), drug cytotoxicity, chemical factor, eye Keratoconjunctival epithelial defect, keratoconjunctival erosion, or keratoconjunctivitis caused by factors selected from the group consisting of surface dryness, preservatives in eye drops and active ingredients of eye drops, wounds after eye surgery, wounds by intraocular injection
  • the composition according to (2) which is an ulcer.
  • Recombinant human serum albumin produced by genetically engineered yeast according to the present invention is produced as a product from the fraction of human blood described in Patent Document 3 etc. against dry eye and keratoconjunctival disorder It was shown to have an effect different from that of albumin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention provides an effective treatment for dry eye and / or keratoconjunctival disorders.
  • Recombinant yeast capable of producing human serum albumin obtained by genetic manipulation used in the present invention is not particularly limited as long as it has been prepared through genetic manipulation using yeast, in addition to those already described in known literature, it will be developed in the future. Can be used as appropriate.
  • the yeast is preferably Kluyveromyces yeast, Saccharomyces yeast or Pichia yeast, specifically, Kluyveromyces laactis , Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris ( Pichia pastoris ).
  • Kluyveromyces lactis CBS 2360 strain, Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (a, his 4, leu 2, can 1), Pichia pastoris GTS 115 strain (his 4) and the like are preferably used.
  • a yeast of the genus Pichia or Saccharomyces yeasts specifically, the use of Pichia pastoris (Pichia pastoris) or Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) is preferable.
  • RHSA-producing cells the production method of rHSA by culturing the cells, and the method of separating and collecting rHSA from the culture are all carried out by adopting known methods and similar methods.
  • a method for preparing an rHSA production strain for example, a method using a normal human serum albumin gene (Japanese Patent Laid-Open Nos.
  • the method for causing mutation in yeast in a medium containing methanol is specifically performed as follows. That is, a transformant is obtained by introducing a plasmid having a transcription unit that expresses HSA under the control of the AOX1 promoter into the AOX1 gene region of Pichia yeast, specifically, GTS115 strain (NRRL deposit number Y-15851) by a conventional method. (See JP-A-2-104290).
  • This transformant has a weak growth ability in methanol medium. Therefore, the transformant is cultured in a methanol-containing medium to cause mutation, and only viable strains are collected. In this case, the methanol concentration is exemplified by about 0.0001 to 5%.
  • the medium may be an artificial medium or a natural medium. Examples of the culture conditions include 15 to 40 ° C. and about 1 to 1000 hours.
  • high-concentration glucose is supplied in small amounts by fed batch culture.
  • a method of obtaining a high concentration of bacterial cells and products while avoiding high concentration substrate inhibition of the produced bacterial cells Japanese Patent Application No. 1-219561
  • a method of enhancing the production of rHSA by adding a fatty acid to the medium examples include Kaihei 4-293495 (EP-A-504823 and USP 5,334,512).
  • protease inactivation by heat treatment JP-A-3-103188
  • anion exchanger anion exchanger
  • hydrophobic carrier hydrophobic carrier
  • activated carbon examples thereof include a coloring suppression method (Japanese Patent Laid-Open No. 4-54198) by separating rHSA and a coloring component using at least one selected from the group.
  • the medium used for culturing the transformed yeast is usually a medium known in this field to which a fatty acid having 10 to 26 carbon atoms or a salt thereof is added, and the culture conditions are carried out in accordance with a general ordinary method.
  • the medium may be either a synthetic medium or a natural medium, and is preferably a liquid medium.
  • various sugars are generally used as a carbon source, urea, ammonium salt, nitrate, etc. as a nitrogen source, various vitamins, nucleotides, etc. as micronutrients, and Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn as inorganic salts , Co, Cu and the like.
  • YNB liquid medium [0.7% yeast nitride base (Difco®), 2% glucose] and the like.
  • examples of the natural medium include YPD liquid medium [1% yeast extract (manufactured by Difco®), 2% bactopeptone (manufactured by Difco®), 2% glucose].
  • the pH of the medium may be neutral, weakly basic, or weakly acidic.
  • a methanol-containing medium can be used. In this case, the methanol concentration is about 0.01 to 5%.
  • the culture temperature is preferably 15 to 43 ° C, particularly 20 to 30 ° C.
  • the culture time is about 1 to 1000 hours, and the culture is carried out by a batch culture method, a semi-batch culture method or a continuous culture method with standing, shaking, stirring or aeration. In addition, it is preferable to perform preculture prior to the culture.
  • a YNB liquid medium or a YPD liquid medium is used as the medium at this time.
  • the culture conditions for pre-culture are as follows. That is, the culture time is preferably 10 to 100 hours, and the temperature is preferably about 30 ° C.
  • rHSA is collected from the culture filtrate or yeast cells by a known separation means.
  • purification step of the rHSA of the present invention known methods such as various fractionation methods, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration, density gradient centrifugation, and dialysis are employed. Suitable examples of the purification step include the following steps (1) to (7).
  • Treatment is performed using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of 100,000 to 500,000.
  • Elution step below or instead of the step (7), after contacting with an anion exchanger under conditions of pH 6-8 and salt concentration of 0.001-0.05M, pH 6-8, salt concentration of 0 Elution under the condition of 0.05-1M, and further between step (5) and (6), between (6) and (7), or after (7), pH 3-5, salt concentration It may further include a step of salting out under a condition of 0.5 to 3M and collecting the precipitated fraction.
  • the rHSA decolorization step of the present invention is particularly preferably incorporated at the end of the purification step, and is performed by contacting a chelate resin having a specific ligand moiety with rHSA.
  • the carrier portion of the chelate resin is preferably a hydrophobic carrier, and examples thereof include a copolymer of styrene and divinylbenzene and a copolymer of acrylic acid and methacrylic acid.
  • the ligand portion includes a polyamine group having a polyol group such as an N-methylglucamine group, an imino group, an amino group, an ethyleneimino group, etc. in the molecule (including polyalkylene polyamine groups such as polyethylene polyamine).
  • chelate resins having a carrier part and a ligand part include DIAION CRB02 (ligand part; N-methylglucamine group, manufactured by Mitsubishi Kasei), which is a copolymer of styrene and divinylbenzene, and DIAION.
  • DIAION CRB02 ligand part; N-methylglucamine group, manufactured by Mitsubishi Kasei
  • DIAION CRB02 ligand part; N-methylglucamine group, manufactured by Mitsubishi Kasei
  • LEWATIT TP ligand part; —NHCSNH 2 , manufactured by Bayer
  • Amberlite CG4000 are preferably used.
  • the treatment conditions with the chelate resin are preferably as follows. pH condition: acidic or neutral (3 to 9, preferably 4 to 7), time: at least 1 hour or more, preferably 6 hours or more, ionic strength: 50 mmho or less, preferably 1 to 10 mmho, mixing ratio: relative to 250 mg of rHSA 0.1 to 100 g of resin, preferably 1 to 10 g (wet weight)
  • the coloring degree of rHSA that can be obtained through the above steps (including (1) to (7), salting-out treatment, and further chelate resin treatment) is 0.001 to 0.000 for A500 nm / A280 nm in the case of 25% HSA solution. About 005.
  • the coloring degree of rHSA is reduced to 1/2 to 1/10 by the chelate resin treatment.
  • the absorption wavelength near 500 nm, that is, the red coloring degree is reduced to 1/3 to 1/10.
  • the rHSA of the present invention is a single substance having a molecular weight of about 67,000 and an isoelectric point of 4.6 to 5.0.
  • the rHSA is composed of a monomer and substantially does not contain a dimer, a polymer or a decomposition product. Specifically, the total content of the dimer, polymer, and decomposition product is about 0.01% or less.
  • the rHSA of the present invention is substantially free from contaminating components derived from the production recombinant yeast (proteins and polysaccharide components other than rHSA), and the purity of rHSA calculated from the content ratio with the contaminating components is 99.99999999% As mentioned above, Preferably it is 99.9999999% or more.
  • the protein component other than rHSA is 1 ng / ml or less, preferably 0.1 ng / ml or less.
  • the polysaccharide component is 10 ng / ml or less, preferably 1 ng / ml or less.
  • the purity of rHSA referred to in the present invention means the purity of rHSA calculated from the content ratio with contaminating components (proteins and polysaccharide components other than rHSA) derived from the production host.
  • the degree of coloration is about 0.01 to 0.05 for A350 / A280, 0.001 to 0.02 for A450 / A280, and about 0.001 to 0.005 for A500 / A280.
  • the amount of fatty acid bonded to HSA is 1 molecule or less, preferably 0.1 molecule or less per molecule of rHSA.
  • the rHSA of the present invention commercially available one may be used as long as it is obtained by genetic manipulation using yeast as a host.
  • Medway (registered trademark) Note Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Osaka, Japan is preferable. Used for.
  • keratoconjunctive disorder includes dry eye, various keratoconjunctivitis, allergy, pathological factors caused by infection with microorganisms (viruses, cells, fungi, etc.), drug cytotoxicity, chemicals caused by acid, alkali corrosion, etc.
  • ocular surface dryness causes, ocular surface dryness, trauma due to foreign matter (contact lenses, etc.), physical factors such as boiling water, and preservatives, aminoglycoside antibiotics, non-steroidal anti-inflammatory agents included in eye drops such as benzalkonium chloride and chlorobutanol
  • corneal and conjunctival disorders such as corneal and conjunctival epithelial defects, corneal erosions, and corneal ulcers caused by eye drops such as IDU and pimaricin.
  • keratoconjunctival disorders include corneal transplantation, refractive surgery (RK) refractive keratectomy, (PRK) photorefractive keratectomy, (LASIK) laser-associated in situ keratomileusis) intracorneal ring insertion (ICRS) anterior chamber Lens insertion (including fake kick IOL), pterygium surgery, capsular extraction (ICCE) extracapsular extraction (ECCE), subsequent cataract incision, intraocular lens insertion, vitrectomy, trabeculectomy Caused by trabeculostomy, sustained drug implant insertion, and post-operative wounds such as foreign body entry and removal of stye, etc., as well as wounds and punctum closure by intravitreal injection Things are included.
  • RK refractive surgery
  • PRK photorefractive keratectomy
  • LASIK laser-associated in situ keratomileusis
  • ICRS anterior chamber Lens insertion
  • ICCE capsular extraction
  • ECCE extracapsular extraction
  • dry eye includes tear-deficient dry eye and Evaporative dry eye.
  • specific examples include various dry eye diseases such as lacrimation, dry eye, Sjogren's syndrome, dry keratoconjunctivitis, Stevens-Jenson syndrome, ocular pemphigoid, and eyelid margin inflammation.
  • dry eyes associated with anterior segment surgery such as cataracts and refractive surgery, allergic conjunctivitis, and tears in VDT (Visual Display Terminal) workers and drying of the room due to cooling and heating, etc.
  • dry eye-like diseases such as normal tear reduction.
  • treatment includes all management of symptoms such as symptom prevention, treatment, symptom reduction, symptom reduction, progression stoppage and the like.
  • Examples of the pharmaceutical form of the pharmaceutical composition of the present invention include tablets, pills, powders, suspensions, capsules, suppositories, injections, ointments, eye drops and the like. Particularly preferred is an eye drop for topical administration.
  • the composition of the present invention has an rHSA of about 1 mg / ml to 1000 mg / ml (0.1 to 100 wt / v%), more preferably about 10 mg / ml to 1000 mg / ml (1-100 wt / v%), more preferably 10 mg / ml to 100 mg / ml (1-10 wt / v%), and optionally a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the “pharmaceutically acceptable diluent” used in the present application may be any diluent used in ophthalmic preparations and known to those skilled in the art, including water, physiological saline, artificial tears, and the like. Illustrated.
  • the composition of the present invention further contains various components that can be used as ordinary ophthalmic preparations, such as stabilizers, bactericides, buffers, isotonic agents, chelating agents, pH adjusters, surfactants, and the like. Administration may be performed using the composition.
  • the pH is preferably adjusted to 5-8.
  • the composition of the present invention may be applied at about 1 to about 100 ⁇ l / eye, preferably about 10 to about 50 ⁇ l / eye, more preferably about 30 to 50 ⁇ l / eye per administration.
  • the present invention also provides the use of rHSA for the production of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the present invention provides a method for treating keratoconjunctival disorders, comprising administering an effective amount of rHSA to a subject in need of treatment for keratoconjunctival disorders.
  • the “subject requiring treatment for keratoconjunctival disorder” refers to a patient having or suspected of having keratoconjunctival disorder. Also included are patients who are at high risk of developing keratoconjunctival disorders, such as after corneal transplant surgery.
  • the present invention provides a dry eye treatment method comprising administering an effective amount of rHSA to a subject in need of treatment for dry eye.
  • subject in need of treatment for dry eye means a patient having or suspected of having dry eye symptoms as described above.
  • the route of administration is not particularly limited, but it is preferably administered by eye drops.
  • the “effective amount” of rHSA is the amount necessary for the desired treatment, and includes the patient's symptoms, age, gender, weight, diet, other pharmaceuticals used in combination and other medical fields.
  • the optimal amount should be selected according to various factors recognized by those skilled in the art. This effective amount also varies depending on the type and activity of rHSA.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is about 1 to about 100 ⁇ l per eye, preferably about 10 to 50 ⁇ l / eye, more preferably about 30 to 50 ⁇ l / eye per administration.
  • the amount is about 1 to about 20 times per day, particularly 1 to 10 times per day, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition used in the present invention can also be administered with other pharmaceutically active compounds as long as the effects of the present invention are not inhibited.
  • “Simultaneous administration” means that the other pharmaceutically active compound is administered before, simultaneously (eg, in the same formulation or in another formulation) or after administration of the medicament of the present invention.
  • artificial tears sulfated polysaccharides (hyaluronic acid, chondroitin sulfate, etc.), cyclosporine, glutathione, flavin adenine nucleotide sodium, corticosteroid, tetracycline, vitamin A (retinol) and derivatives thereof (retinol palmitate, retinol acetate, etc.) Vitamin A esters, etc.), cell growth factors (hepatocyte growth factor (HGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor (IGF), nerve growth factor (NGF) Platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factors (TGF- ⁇ and TGF- ⁇ ), keratinocyte growth factor (KGF), etc.) can be co-administered.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • Test example 1 Rabbit forced opening dry eye model (test method) A rabbit (Std: JW / CSK) was subjected to urethane anesthesia (2 g / kg, 8 mL / kg subcutaneous administration), a forced open device was attached to both eyes, and the device was fixed to the prone position for 3 hours. After the compulsive opening, an excessive amount of 5% pentobarbital sodium was intravenously administered to rabbits, euthanized, and the eyeballs were removed. 50 ⁇ L of 1% methylene blue solution was dropped onto the cornea, and after 1 minute, it was placed in a container containing 15 mL of physiological saline to wash out methylene blue.
  • the cornea was cut off with a razor and immersed in acetone sodium sulfate (100% acetone: 9% sodium sulfate; 7: 3) overnight to extract methylene blue. Absorption at 660 nm was measured using an absorptiometer (Multskan (registered trademark) Spectrum, Thermo) (methylene blue absorbance). In the evaluation, the absorbance of each group was expressed as an average value ⁇ standard error (SE) and used as an index of corneal injury. In addition, methylene blue absorbance of untreated animals (Group 1) was suppressed by 100% corneal injury, forced cleaving, and methylene blue absorbance of the group administered with physiological saline (Group 2) was 0% suppression of corneal injury. The inhibition rate (%) of corneal injury of the group was calculated. In the above table, (Group I), (Group II) and (Test group) show the average methylene blue absorbance of each group, respectively. The test group is any group from III to VI.
  • the rHSA solution was prepared by diluting and preparing 25% Medway (registered trademark) injection (rHSA 25 wt / v%: Mitsubishi Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka, Japan) to various concentrations with physiological saline.
  • Table 2 shows the results of measuring the absorbance (methylene blue absorbance) of the corneal extract that is an indicator of corneal injury after forced cleaving for 3 hours. Based on the results in Table 2, the corneal injury inhibition rate was calculated. Effect on corneal injury ** p ⁇ 0.01, * p ⁇ 0.05 vs study group II (Dunnett's test)
  • the methylene blue absorbance (Absorbance at 660nm) of the corneal extract after 3 hours forced cleaving decreased significantly with respect to the physiological saline administration group (Group II) at 1%, 3% and 5% rHSA, respectively.
  • the 3% and 5% rHSA administration groups Group III-V
  • a concentration-dependent corneal protective effect was observed against corneal damage caused by dryness on the rabbit eyeball surface.
  • Test example 2 Rabbit forced opening dry eye model
  • Test method A rabbit (Std: JW / CSK) was subjected to urethane anesthesia (2 g / kg, 8 mL / kg subcutaneous administration), a forced open device was attached to both eyes, and the device was fixed to the prone position for 3 hours. After the compulsive opening, an excessive amount of 5% pentobarbital sodium was intravenously administered to rabbits, euthanized, and the eyeballs were removed. 50 ⁇ L of 1% methylene blue solution was dropped onto the cornea, and after 1 minute, it was placed in a container containing 15 mL of physiological saline to wash out methylene blue.
  • the cornea was cut off with a razor and immersed in acetone sodium sulfate (100% acetone: 9% sodium sulfate; 7: 3) overnight to extract methylene blue. Absorption at 660 nm was measured using an absorptiometer (Multskan® Spectrum, Thermo) (methylene blue absorbance). In the evaluation, the absorbance of each group was expressed as an average value ⁇ standard error (SE) and used as an index of corneal injury.
  • SE standard error
  • the base was 0.28% D (+)-glucose, 0.33% sodium monohydrogen phosphate, 0.55% sodium chloride (NaCl), 0.16% potassium chloride (KCl), 0.0024%
  • a reagent was added to water for injection to prepare sodium acetyltryptophan and 0.00135% sodium caprylate.
  • the 0.0001% and 0.03% rHSA solutions are based on an rHSA stock solution (28.7% rHSA, 0.341% sodium chloride: Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation) according to the description in JP-A-2000-319194. Each solution was diluted and prepared with each agent.
  • the 5% rHSA solution was prepared by diluting and preparing 25% Medway (registered trademark) injection (rHSA 25%: Mitsubishi Tanabe Seiyaku Co., Ltd.) in the same manner as in Test Example 1.
  • Table 4 shows the results of measuring the absorbance (methylene blue absorbance) of the corneal extract, which is an index of corneal injury after forced cleaving for 3 hours. Effect on corneal injury * p ⁇ 0.01 vs contralateral eye (Paired Student's t-test)
  • the absorbance of the corneal extract (methylene blue absorbance), which is an index of corneal damage in the 3-hour forced eye opening model
  • the methylene blue absorbance of the treated eye did not change at all as compared to the contralateral eye, and the cornea protective effect was completely against corneal damage caused by drying of the rabbit eyeball surface. I was not able to admit.
  • Test example 3 Ocular mucosal irritation test by short-term frequent instillation (test method)
  • the 10% rHSA solution was prepared by diluting and preparing 25% Medway (registered trademark) Note (rHSA 25%: Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation) with a 1.03% sodium chloride solution.
  • rHSA 25% Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation
  • the 10% HSA solution was prepared by diluting and preparing 25% blood donated albumin (HSA 25%: Benesis Co., Ltd.) with a 1.03% sodium chloride solution.
  • the total score obtained for the cornea, iris and conjunctiva is used as an index of eye stimulation.

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Abstract

　本発明は、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られる組み換え酵母により産生されたヒト血清アルブミンを有効成分とする、ドライアイおよび／または角結膜障害処置のための医薬組成物を提供する。本発明はさらに、ドライアイおよび／または角結膜障害処置の必要な患者へ、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンの有効量を投与することを含む、ドライアイおよび／またはの処置方法を提供する。

Description

ドライアイおよび／または角結膜障害処置のための医薬組成物
　本発明は、宿主として酵母を使用し遺伝子操作により得られる組み換え酵母細胞により産生されたヒト血清アルブミンを有効成分とする眼科用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ドライアイや角結膜障害の処置に有用である。さらに本発明は、該医薬組成物を用いてドライアイおよび角結膜障害を処置する方法を提供する。
　角結膜障害は、その表面から上皮に欠損が生じることによって引き起こされる。その原因としてはドライアイ、各種角結膜炎、アレルギー、微生物（ウイルス、細菌、真菌等）の感染による病的要因、薬物の細胞毒性、酸、アルカリによる腐食等に基づく化学的要因、眼表面の乾燥、異物（コンタクトレンズ等）による外傷、熱湯等の物理的要因などが挙げられる。また近年では、塩化ベルザルコニウム、クロロブタノール等の点眼薬に含まれる防腐剤やアミノグリコシド系抗生物質、非ステロイド系消炎剤、IDU、ピマリシン等の点眼薬など角膜上皮に障害を与えることが報告されている。 現在、角結膜障害の処置のためにコンドロイチン硫酸、グルタチオン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、EGF等の投与あるいは涙液の補充の目的で人口涙液の投与などが行われているが、その効果はいまだ十分ではない。
　ドライアイは、涙液の欠乏または過剰な蒸発による涙液層の障害で、眼瞼間の眼表面（角膜、結膜等）に損傷を与えたり、眼不定愁訴を有する疾患として知られている。近年、世界ドライアイワークショップの定義・分類分科委員会によりドライアイは、不快感、視覚障害、涙液層の不安定性を有し、眼表面ダメージにいたる涙液および眼表面の多因子疾患として定義されている。なお、ドライアイでは、涙液層の浸透圧が上昇し、眼表面に炎症が起こるとされる。ドライアイの主な種類は、涙液欠乏性ドライアイ（Aqueous tear-deficient dry eye）や蒸発亢進型ドライアイ（Evaporative dry eye）である。涙液欠乏性ドライアイは、ドライアイの原因が涙腺からの涙液の分泌不全である。また蒸発亢進型ドライアイは涙液分泌機能が正常な場合に、露出した眼表面から水分が過剰に消失して起こる。その原因としては、眼瞼の構造や動力学に影響する内因性疾患を原因とする内因的なもの、あるいは外部への暴露により眼表面に疾患が生じる外因的なものが挙げられる（非特許文献１）。ドライアイの原因には様々なものがあるが、低下した涙液の量を正常に戻す方法は未だ見いだされていない。現在のところドライアイの治療としては、涙液の補充を目的とする人工涙液の投与、患者の自覚症状の緩和を図ることを目的とするコンドロイチン硫酸、グルタチオン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、血清点眼等の投与が行われているが、その効果は未だ十分ではない。
　ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡともいう）はヒト血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持っていることが知られている。ＨＳＡは、外科手術、ショック、火傷、低蛋白血症のように血管からの体液の損失がある様な状態を治療するために用いられている。例えば、ショックや熱傷患者において、減少した血液量を元に戻し、それにより外傷に関連するいくつかの症状を改善させるために、ＨＳＡが頻回投与されている。低蛋白血症や胎児性赤芽球症の患者の治療にもＨＳＡが用いられる。
　現在、ＨＳＡは、献血されたヒト血液を分画することによって製造されている。この製造法の欠点は不経済であることと、ヒト血液の安定な供給が困難であるということである。また、ヒト血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡの代替の原料を開発することが望まれている。
　組み換えＤＮＡ技術の出現により多種多様の有用なポリペプチド類が種々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製する技術が確立されている。特許文献１には、宿主としてピキア属酵母を使用し遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＳＡともいう）が記載されている。実際にこのｒＨＳＡは「メドウェイ（登録商標）注」（田辺三菱製薬株式会社、日本国大阪）として厚生労働省より製造承認を受けており、ＨＳＡと同様に、外科手術、ショック、火傷、低蛋白血症のように血管からの体液の損失がある様な状態を治療するために有用であることが知られている。さらに宿主としてピキア属酵母を使用し遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンが米国食品医薬品局より医薬品用添加剤として承認を受け、「アルバゲン（Albagen）TM」（New Century Pharmaceuticals社米国ＡＬ）という名称で販売されている。非特許文献２には、宿主としてサッカロマイセス属酵母を使用し遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンが記載されている。このｒＨＳＡは米国食品医薬品局よりワクチンなどの安定化剤として製造承認を受け、「リコンムブミン（登録商標）」（ノボザイムス社）という名称で販売されている。
　特許文献２には、ヒト血清アルブミンが、眼科疾患であるドライアイや角結膜障害の処置に有用であることが記載されている。特許文献３には、ドライアイの処置にはＨＳＡ濃度が０．００１～０．３ｍｇ／ｍｌの低濃度であることが必要と記載されている。特許文献３によればＨＳＡ濃度が１．０ｍｇ／ｍｌ（０．１Ｗ／Ｖ％）以上の高濃度の点眼剤は眼への刺激作用があり、眼へ局所投与すると局所刺激性などの問題を有することが開示している。
　特許文献２および３には、一般論としてＨＳＡの代わりに一般的な遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンを用いることができることが記載されている。しかしながら、宿主として酵母を使用し遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンが眼科疾患であるドライアイや角結膜障害に対してどのような作用効果を有するかは知られていない。
特開平０６－１００５９２号公報 国際公開第１９９７／０３９７６９号 特開２０００－３１９１９４号公報 The Ocular Surface 2007年4月；第5巻、第2号：12-28 Journal of Clinical Pharmacology 2005;45:57-67上記文献はいずれも、引用により本願に含まれる。
　本発明は、ドライアイおよび／または角結膜障害の処置のための新規医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、酵母を使用し遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンが、ヒト血液の分画からの産物として製造されるヒト血清アルブミンの公知文献に記載される効果とは異なり、０．００１～０．３ｍｇ／ｍｌの低濃度ではドライアイや角結膜障害に対して効果が認められず、１０ｍｇ／ｍｌ（１．０Ｗ／Ｖ％）以上の高濃度においても、眼刺激性を有さず、ドライアイや角結膜障害に対して有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って本発明は以下の通りである：
　（１）ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンを有効成分とする、ドライアイ処置のための医薬組成物。
　（２）ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンを有効成分とする、角結膜障害処置のための医薬組成物。
　（３）酵母が、ピキア属酵母あるいはサッカロマイセス属酵母である、（１）または（２）記載の組成物。
　（４）酵母がピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、（３）記載の組成物。
　（５）組み換えヒト血清アルブミンが以下の特徴を有するヒト血清アルブミンである、（１）または（２）記載の組成物：
ヒト血清アルブミンと酵母に由来するヒト血清アルブミン以外の抗原性を有する蛋白質及び多糖類との含量比によるヒト血清アルブミンの純度が９９．９９９％以上であり、且つヒト血清アルブミンと酵母に由来するヒト血清アルブミン以外の抗原性を有する蛋白質及び多糖類の夾雑が酵母免疫測定法（ＥＩＡ法）の検出限界未満である。
　（６）点眼投与のためのものである、（１）または（２）記載の組成物。
　（７）ドライアイが、涙液欠乏性ドライアイおよび蒸発亢進型ドライアイである、（１）記載の組成物。
　（８）ドライアイが、欠涙症、眼乾燥症、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、スティーブンス-ジェンソン症候群、眼類天疱胞、眼手術後に伴われるドライアイ、アレルギー結膜炎に伴われるドライアイ、ＶＤＴ（Visual Display Terminal）作業者の涙液減少症および冷暖房による部屋の乾燥等により起こる全身に異常のない涙液減少症からなる群から選択される、（１）記載の組成物。
　（９）ドライアイが、蒸発亢進型ドライアイである、（１）記載の組成物。
　（１０）角結膜障害が角結膜障害がドライアイ、角結膜炎、アレルギーおよび微生物（ウイルス、細菌または真菌）の感染からなる群から選択される病的要因、薬物の細胞毒性、化学的要因、眼表面の乾燥、点眼薬中の防腐剤および点眼薬の有効成分、眼手術後の傷、眼内注射による創傷からなる群から選択される要因に起因する角結膜上皮欠損、角結膜びらんまたは角結膜潰瘍である、（２）記載の組成物。
　（１１）ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンの、ドライアイ処置用医薬組成物の製造のための使用。
　（１２）ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンの、角結膜障害処置用医薬組成物の製造のための使用。
　（１３）ドライアイ処置の必要な患者へ、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンの有効量を投与することを含む、ドライアイの処置方法。
　（１４）角結膜障害処置の必要な患者へ、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンの有効量を投与することを含む、角結膜障害の処置方法。
　本発明により、遺伝子操作された酵母により産生された組み換えヒト血清アルブミンが、ドライアイおよび角結膜障害に対して特許文献３等に記載されるヒト血液の分画からの産物として製造されるヒト血清アルブミンの効果とは異なる効果を有することが示された。本発明の医薬組成物により、ドライアイおよび／または角結膜障害に対する有効な治療が提供される。
　本発明において用いられる遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの産生性組み換え酵母は酵母を使用して遺伝子操作を経て調整されたものであれば特に限定されず、既に公知文献記載のもののほか、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。酵母としては、クルイベロミセス属酵母、サッカロマイセス属酵母もしくはピキア属酵母が好ましく、具体的には、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces laactis)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)もしくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）が使用され、特にクルイベロミセス・ラクチスＣＢＳ２３６０株、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（a,his 4,leu 2,can 1）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（his 4）等が好適に用いられる。
　本発明においては、特にピキア属酵母あるいはサッカロマイセス属酵母、具体的には、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）あるいはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の使用が好ましい。
　ｒＨＳＡ産生性細胞およびその培養によるｒＨＳＡの生産方法、培養物からのｒＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施される。例えば、ｒＨＳＡ産生株の調製方法としては、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭５８－５６６８４(EP-A-73646)、同５８－９０５１５(EP-A-79739)、同５８－１５０５１７(EP-A-91527)号公報）、新規なヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭６２－２９９８５、特開平１－９８４８６(EP-A-206733)号公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１－２４０１９１(EP-A-329127)号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２－１６７０９５(EP-A-319641)号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法（特開平３－７２８８９(EP-A-399455)号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３－５３８７７(EP-A-409156)号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プロモーターを用いる方法（特願平３－６３５９８、同３－６３５９９号公報）、枯草菌によるｒＨＳＡの発現（特開昭６２－２５１３３(EP-A-229712)号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０－４１４８７(EP-A-123544)、同６３－３９５７６(EP-A-248657)、同６３－７４４９３(EP-A-251744)号公報）、ピキア酵母によるｒＨＳＡの発現（特開平２－１０４２９０(EP-A-3444S9)号公報）等が例示される。
　このうち、メタノール含有培地中で酵母に変異を起こさせる方法は具体的には以下の様に行う。すなわち、ピキア酵母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ－１５８５１）のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２－１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．０００１～５％程度が例示される。培地は人工培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５～４０℃、１～１０００時間程度が例示される。
　また、ｒＨＳＡ産生性組み換え細胞の培養方法（すなわちｒＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度のグルコースを適度に少量ずつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特願平１－２１９５６１号公報）、培地中に脂肪酸を添加してｒＨＳＡの産生を増強する方法（特開平４－２９３４９５(EP-A-504823 および USP 5,334,512)号公報）等が例示される。さらにｒＨＳＡの分離採取方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３－１０３１８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用いてｒＨＳＡと着色成分を分離することによる着色抑制方法（特開平４－５４１９８号公報）等が例示される。
　形質転換酵母の培養に用いられる培地は、通常この分野で既知の培地に炭素数１０～２６の脂肪酸またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕなどが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イーストナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコース〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基性、弱酸性でよい。またメタノール資化性酵母の場合は、メタノール含有培地を用いることができる。この場合メタノール濃度は０．０１～５％程度である。
　培養温度は、１５～４３℃、特に２０～３０℃が好ましい。培養時間は１～１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間は１０～１００時間、温度は３０℃程度が好ましい。
　培養終了後、ｒＨＳＡは培養濾液または酵母細胞からそれぞれ公知の分離手段により採取される。
　本発明のｒＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離法、透析等の公知の方法が採用される。当該精製工程としては、例えば以下の（１）～（７）を含む工程が好適に挙げられる。（１）ヒト血清アルブミンの産生組み換え酵母細胞の培養上清を分画分子量１０万～５０万、及び１０００～５万の限外濾過膜を用いて処理する。（２）５０～７０℃で３０分～５時間加熱処理する。（３）ｐＨ３～５で酸処理する。（４）分画分子量１０万～５０万の限外濾過膜を用いて処理する。（５）ｐＨ３～５、塩濃度０．０１～０．２Ｍの条件下で陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８～１０、塩濃度０．２～０．５Ｍの条件下で溶出する。（６）ｐＨ６～８、塩濃度０．０１～０．５Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収する、そして（７）ｐＨ６～８、塩濃度０．０１～０．１Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。また、前記工程（６）の代わりに、ｐＨ６～８、塩濃度１～３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６～８、塩濃度０．０１～０．５Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程（７）の代わりに、ｐＨ６～８、塩濃度０．００１～０．０５Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６～８、塩濃度０．０５～１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには前記工程（５）と（６）の間、（６）と（７）の間、または（７）の後で、ｐＨ３～５、塩濃度０．５～３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱画分を回収する工程をさらに含むものであってもよい。
　本発明のｒＨＳＡの脱色工程は、上記精製工程において、特に好ましくはその最後に組み込まれ、特定のリガンド部を有するキレート樹脂とｒＨＳＡを接触することにより行われる。キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体等が挙げられる。一方、リガンド部は、Ｎ－メチルグルカミン基等のポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレンイミノ基等を分子内に複数個有するポリアミン基（この中にはポリエチレンポリアミン等のポリアルキレンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンとジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRB02（リガンド部；Ｎ－メチルグルカミン基、三菱化成製）、DIAION CR20 （リガンド部；－ＮＨ(CH2CH2NH)nＨ、三菱化成製）、LEWATIT TP（リガンド部；－ＮＨＣＳＮＨ2、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００好適に使用される。
　当該キレート樹脂による処理条件は、好適には次の通りである。ｐＨ条件：酸性または中性（３～９、好ましくは４～７)、時間：少なくとも１時間以上、好ましくは６時間以上、イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１～１０ｍｍｈｏ、混合比：ｒＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１～１００ｇ、好ましくは１～１０ｇ（湿重量）
　上記の工程（（１）～（７）および塩析処理、さらにキレート樹脂処理を含む）を経て得られうるｒＨＳＡの着色度は、ＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ５００ｎｍ／Ａ２８０ｎｍが０．００１～０．００５程度である。キレート樹脂処理によりｒＨＳＡの着色度は１／２～１／１０に低減される。特に吸収波長５００ｎｍ付近、すなわち赤色系の着色度が１／３～１／１０に低減される。
　本発明のｒＨＳＡは、分子量約６万７千、等電点４．６～５．０の単一物質である。当該ｒＨＳＡは単量体からなり、実質的に二量体、重合体または分解物を含まない。具体的には、二量体、重合体および分解物の全含有量は０．０１％以下程度である。また本発明のｒＨＳＡは、産生組み換え酵母に由来する夾雑成分（ｒＨＳＡ以外の蛋白質及び多糖成分）を実質的に含まず、該夾雑成分との含量比から算出されるｒＨＳＡの純度は９９．９９９９９９％以上、好ましくは９９．９９９９９９９％以上である。具体的には、ｒＨＳＡ２５％溶液の場合で、ｒＨＳＡ以外の蛋白質成分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以下が例示される。また、同じく多糖成分が１０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下が例示される。尚、本発明でいうｒＨＳＡの純度とは、産生宿主に由来する夾雑成分（ｒＨＳＡ以外の蛋白質及び多糖成分）との含量比から算出されるｒＨＳＡの純度を意味する。着色度はＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ３５０／Ａ２８０が０．０１～０．０５、Ａ４５０／Ａ２８０が０．００１～０．０２、Ａ５００／Ａ２８０が０．００１～０．００５程度が例示される。また、ＨＳＡに結合している脂肪酸量がｒＨＳＡ１分子当たり１分子以下、好ましくは０．１分子以下が例示される。
　本発明のｒＨＳＡとしては、酵母を宿主として遺伝子操作により得られたものであれば市販のものを用いてもよく、例えばメドウェイ（登録商標）注（田辺三菱製薬株式会社、日本国大阪）が好適に用いられる。
　本出願において「角結膜障害」には、ドライアイ、各種角結膜炎、アレルギー、微生物（ウイルス、細胞、真菌等）の感染による病的要因、薬物の細胞毒性、酸、アルカリによる腐食等による化学的要因、眼表面の乾燥、異物（コンタクトレンズ等）による外傷、熱湯等の物理的要因および塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール等の点眼薬に含まれる防腐剤やアミノグリコシド系抗生物質、非ステロイド系消炎剤、IDU、ピマリシン等の点眼薬に起因する角結膜上皮欠損、角膜びらん、角膜潰瘍などの角結膜の障害が挙げられる。
　さらに本出願において、角結膜障害には角膜移植術、屈折矯正手術 (RK) refractive keratectomy, (PRK)photo refractive keratectomy, (LASIK) laser-associated in situ keratomileusis）イントラ角膜リング挿入術（ICRS）前房レンズ挿入術（フェイキックIOL含む）、翼状片手術、水晶体嚢内摘出術（ICCE）水晶体嚢外摘出術（ECCE）、後発白内障切開術、眼内レンズ挿入術、硝子体手術、線維柱帯切除術、　　　　　　　線維柱帯切開術、薬剤徐放剤のインプラント挿入術、および異物飛入、麦粒腫などの摘出手術等の手術後の傷に起因するもの並びに硝子体内注射による創傷や涙点閉鎖術に起因するものが含まれる。
　本出願において「ドライアイ」には、涙液欠乏性ドライアイ（Aqueous tear-deficient dry eye）や蒸発亢進型ドライアイ（Evaporative dry eye）が含まれる。具体的には、欠涙症、眼乾燥症、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、スティーブンス－ジェンソン症候群、眼類天疱胞、眼瞼縁炎症等の各種ドライアイ疾患が挙げられる。さらに、白内障や屈折矯正手術などの前眼部手術の術後やアレルギー結膜炎に伴われるドライアイ、及びVDT（Visual Display Terminal）作業者の涙液減少症及び冷暖房による部屋の乾燥等により起こる全身に異常のない涙液減少等の、ドライアイ様疾患も挙げられる。
　本出願において「処置」の語は症状の予防、治療、症状の軽減、症状の減退、進行停止等、症状のあらゆる管理が含まれる。
　本発明の医薬組成物の製剤形態としては錠剤、丸剤、散剤、懸濁剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、点眼剤等が例示される。特に好ましくは、局所投与のための点眼剤である。
　本発明の医薬組成物を点眼用剤として製剤する場合、本発明の組成物はｒＨＳＡを約1ｍｇ／ｍｌ～１０００ｍｇ／ｍｌ（０．１～１００ｗｔ／ｖ％）、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ～１０００ｍｇ／ｍｌ（１～１００ｗｔ／ｖ％）、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ（１～１０ｗｔ／ｖ％）、および所望により薬学上許容される希釈剤を含有する。
　本出願において用いられる「薬学上許容される希釈剤」としては、眼科用製剤に用いられ、当業者に知られているあらゆる希釈剤であり得、水、生理的食塩水、人口涙液等が例示される。 本発明の組成物にはさらに通常の眼科用製剤として使用し得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、pH調節剤、界面活性剤等を含む組成物を用いて投与を行ってもよい。
　点眼用製剤の場合は、pHは５～８に調整するのが好ましい。本発明の組成物は１回の投与につき約１～約１００μｌ/眼、好ましくは約１０～約５０μｌ/眼、より好ましくは約３０～５０μｌ/眼を点眼すればよい。
　別の観点において、本発明は、上記本発明の医薬組成物の製造のためのｒＨＳＡの使用についても提供する。
　さらに別の観点において本発明は、角結膜障害に対する処置を必要とする対象に対して有効量のｒＨＳＡを投与することを含む、角結膜障害処置方法を提供する。本明細書において「角結膜障害に対する処置を必要とする対象」とは、角結膜障害を有するかまたはその疑いのある患者であり、実際に角結膜障害が認められた患者のみならず、その疑いがある患者および角膜移植手術後等の角結膜障害を発症する可能性が高い状態にある患者も含まれる。
　さらに他の観点において本発明は、ドライアイに対する処置を必要とする対象に対して有効量のｒＨＳＡを投与することを含む、ドライアイ処置方法を提供する。本明細書において「ドライアイに対する処置を必要とする対象」とは、上記のごときドライアイの症状を有するか、またはその疑いのある患者を意味する。投与経路については特に限定的ではないが、点眼投与することが好ましい。
　本発明のこれらの方法において、ｒＨＳＡの「有効量」としては所望の処置のために必要な量であり、患者の症状、年齢、性別、体重、食餌、併用する他の医薬およびその他医学分野の当業者に認識されている様々な要因に応じて最適量を選択すべきである。また、この有効量はｒＨＳＡの種類や活性によっても異なる。本発明のこれらの方法において、具体的には上記本発明の医薬組成物を１回の投与につき約１～約１００μｌ眼、好ましくは約１０～５０μl/眼、より好ましくは約３０～５０μl/眼の量、１日につき約１～約２０回、特に１日に１～１０回投与することが例示されるが、これに限定されるものではない。
　本発明で用いられる医薬組成物はまた、本発明の効果を阻害しない限り、他の薬学的に活性な化合物を同時投与することができる。「同時投与」は、他の薬学的に活性な化合物を、本発明の医薬の投与前に、同時に（例えば、同一の製剤中または別の製剤中で）または投与後に投与することを意味する。例えば、人工涙液、硫酸多糖類（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等）、シクロスポリン、グルタチオン、フラビンアデニンヌクレオチドナトリウム、コルチコステロイド、テトラサイクリン、ビタミンＡ（レチノール）およびその誘導体（パルミチン酸レチノール、酢酸レチノールなどのビタミンＡのエステル類等）、細胞成長因子（肝細胞成長因子（HGF）、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インシュリン様成長因子（IGF）、神経成長因子（NGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、形質転換成長因子（TGF-αおよびTGF-β）、角質細胞成長因子（KGF）等）を同時投与することができる。
　以下、本発明を試験例により、さらに詳細に説明するが、これは本発明を限定するものではない。
試験例１
ウサギ強制開瞼ドライアイモデル
（試験方法）
　ウサギ（Std:JW/CSK）にウレタン麻酔（2ｇ/kg, 8mL/kg皮下投与）を施し、両眼に強制開瞼器を付け、固定器に3時間腹臥位に固定した。強制開瞼終了後、過剰量の５％ペントバルビタールナトリウムをウサギに静脈内投与し、安楽死させた後、眼球を摘出した。１％ メチレンブルー溶液５０μＬを角膜に滴下し、1分後、15 mL生理食塩液が入った容器に入れ、メチレンブルーを洗い流した。角膜を剃刀で切り取り、アセトン硫酸ナトリウム（１００％ アセトン:９％ 硫酸ナトリウム;7:3）に一晩浸漬し、メチレンブルーを抽出した。660 nmにおける吸収を吸光度計（Multskan（登録商標） Spectrum, Thermo）を用いて測定した（メチレンブルー吸光度）。評価は各群の吸光度を平均値 ± 標準誤差（S.E.）で表し、角膜障害の指標とした。また、無処置動物（第1群）のメチレンブルー吸光度を100％角膜障害抑制、強制開瞼を行い、生理食塩液を投与した群（第2群）のメチレンブルー吸光度を0％角膜障害抑制とし、各群の角膜障害抑制率（%）を算出した。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 上記表において、(群I)、(群II)および(試験群)はそれぞれ各群の平均メチレンブルー吸光度を示す。試験群はIIIからVIいずれかの群である。
（被験物質の投与）
　強制開瞼開始直後、両眼に生理食塩液、１、３および５ｗｔ／ｖ％ｒＨＳＡ溶液あるいはヒアレイン(登録商標)ミニ0.3（ヒアルロン酸ナトリウム0.3％：参天製薬株式会社）をそれぞれ５０μＬずつ点眼した。
　なお、ｒＨＳＡ溶液は、２５％メドウェイ（登録商標）注（ｒＨＳＡ２５ｗｔ／ｖ％：田辺三菱製薬株式会社、日本国大阪）を生理食塩液にて各濃度に希釈・調製した。
（試験区分）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（結果）
　３時間強制開瞼後、角膜障害の指標となる角膜抽出液の吸光度(メチレンブルー吸光度)を測定した結果を表２に示した。表２の結果に基づき、角膜障害抑制率を算出した。
角膜障害に対する効果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 **p<0.01, *p<0.05 vs 試験群II (Dunnett’s test)
　３時間強制開瞼後の角膜抽出液のメチレンブルー吸光度（Absorbance at ６６０ｎｍ）は１％、３％および５％ ｒＨＳＡにおいて、生理食塩液投与群（群II）に対し、それぞれ有意に減少し、１％、３％および５％ ｒＨＳＡ投与群（群III-V)はウサギ眼球表面の乾燥による角膜障害に対し、濃度依存的な角膜保護効果が認められた。
　角膜障害抑制率についてはそれぞれ２１％、２５％、および３９％とｒＨＳＡの濃度依存的な増加が認められた。
試験例２
ウサギ強制開瞼ドライアイモデル
（試験方法）
　ウサギ（Std:JW/CSK）にウレタン麻酔（2ｇ/kg, 8mL/kg皮下投与）を施し、両眼に強制開瞼器を付け、固定器に3時間腹臥位に固定した。強制開瞼終了後、過剰量の５％ペントバルビタールナトリウムをウサギに静脈内投与し、安楽死させた後、眼球を摘出した。１％ メチレンブルー溶液５０μＬを角膜に滴下し、1分後、15 mL生理食塩液が入った容器に入れ、メチレンブルーを洗い流した。角膜を剃刀で切り取り、アセトン硫酸ナトリウム（１００％ アセトン:９％ 硫酸ナトリウム;7:3）に一晩浸漬し、メチレンブルーを抽出した。６６０ ｎｍにおける吸収を吸光度計（Multskan（登録商標） Spectrum, Thermo）を用いて測定した（メチレンブルー吸光度）。評価は各群の吸光度を平均値 ± 標準誤差（S.E.）で表し、角膜障害の指標とした。
（被験物質の投与）
　強制開瞼開始直後に片眼には生理食塩液を、対側眼には基剤、0.0001％、0.03％および5％rHSA溶液をそれぞれ５０μＬずつ点眼した。
　なお、基剤は０．２８％ Ｄ（＋）－グルコース、０．３３％ リン酸一水素ナトリウム、０．５５％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１６％ 塩化カリウム（ＫＣｌ）、０．００２４％アセチルトリプトファンナトリウムおよび０．００１３５％カプリル酸ナトリウムとなるように注射用水に試薬を加え調製した。０．０００１％、０．０３％ｒＨＳＡ溶液は、特開２０００－３１９１９４号公報の記載に準じてｒＨＳＡ原液（２８．７％ ｒＨＳＡ、０．３４１％ 塩化ナトリウム含有：田辺三菱製薬株式会社）を基剤にて各濃度に希釈・調製した。５％ｒＨＳＡ溶液は、上記試験例１と同様に２５％メドウェイ（登録商標）注（ｒＨＳＡ２５％：田辺三菱製薬株式会社）を生理食塩液にて希釈・調製した。
（試験区分）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（結果）
　３時間強制開瞼後、角膜障害の指標となる角膜抽出液の吸光度(メチレンブルー吸光度)を測定した結果を表４に示した。
角膜障害に対する効果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 *p<0.01 vs 対側眼(Paired Student’s t-test)
　３時間強制開瞼モデルにおいて角膜障害の指標となる角膜抽出液の吸光度（メチレンブルー吸光度）を測定した結果、基剤群では、対側眼および処置眼のメチレンブルー吸光度に差はなく、基剤点眼による影響は認められなかった。また、０．０００１％ｒＨＳＡ群および０．０３％ｒＨＳＡ群では、対側眼に比較し、処置眼のメチレンブルー吸光度にまったく変化せず、ウサギ眼球表面の乾燥による角膜障害に対し全く角膜保護効果は認められなかった。
　一方、5% ｒＨＳＡ群では、処置眼のメチレンブルー吸光度は、対側眼に対し、有意に減少し、上記試験例１と同様にウサギ眼球表面の乾燥による角膜障害に対し角膜保護効果が認められた。
試験例３
短期頻回点眼による眼粘膜刺激性試験
（試験方法）
　ウサギ（Kbl:JW/SPF）の左眼に生理食塩液、３％、５％、１０％ｒＨＳＡ溶液および１０％ＨＳＡ溶液をそれぞれ５０μLずつ、３０分間隔で計１０回点眼した。右眼は無処置眼とした。
　10％ｒＨＳＡ溶液は、25％メドウェイ（登録商標）注（ｒＨＳＡ２５％：田辺三菱製薬株式会社）を1.03％塩化ナトリウム溶液にて希釈・調製した。３％および５％ｒＨＳＡ溶液は、調製した１０％ｒＨＳＡ溶液の必要量を分取し、生理食塩液にて希釈・調製した。１０％ＨＳＡ溶液は、２５％献血アルブミン（ＨＳＡ２５％：株式会社ベネシス）を１．０３％塩化ナトリウム溶液にて希釈・調製した。
（試験区分）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（観察）
　最終投与後１時間、初回投与および最終投与後24時間に1回、左眼について観察した。
　眼刺激性の眼反応の評価は、下記に示したDraizeら（Draize,J.H., Woodard, G. and Calvery, H.O. : Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes., J. Pharmacol. Exptl. Therap., 82, 377～390 (1944)）の基準に従った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 角膜、虹彩並びに結膜について得られたスコアの合計を目刺激の指標とする。
（結果）
各動物の観察結果を表７に示した。
ウサギ前眼部の眼刺激性評価
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　　　　　　1): 最終の投与後の経過時間
　　　　　　2): 最初の投与後の経過時間
　３、５および１０％ｒＨＳＡ群では、いずれの観察時点においても眼反応は認められなかった。１０％ｒＨＳＡ群では、最終投与後１時間から最終投与後２４時間の間、２／３例に結膜の発赤（評点１）が認められた。 

Claims (14)

  1. ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られる組み換え酵母により産生されたヒト血清アルブミンを有効成分とする、ドライアイ処置のための医薬組成物。
  2. ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されたヒト血清アルブミンを有効成分とする、角結膜障害処置のための医薬組成物。
  3. 酵母が、ピキア属酵母あるいはサッカロマイセス属酵母である、請求項１または２記載の組成物。
  4. 酵母がピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項３記載の組成物。
  5. 組み換えヒト血清アルブミンが以下の特徴を有するヒト血清アルブミンである、請求項１または２記載の組成物：
    ヒト血清アルブミンと酵母に由来するヒト血清アルブミン以外の抗原性を有する蛋白質及び多糖類との含量比によるヒト血清アルブミンの純度が９９．９９９％以上であり、且つヒト血清アルブミンと酵母に由来するヒト血清アルブミン以外の抗原性を有する蛋白質及び多糖類の夾雑が酵母免疫測定法（ＥＩＡ法）の検出限界未満である。
  6. 点眼投与のためのものである、請求項１または２記載の組成物。
  7. ドライアイが、涙液欠乏性ドライアイおよび蒸発亢進型ドライアイである、請求項１記載の組成物。
  8. ドライアイが、欠涙症、眼乾燥症、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、スティーブンス-ジェンソン症候群、眼類天疱胞、眼手術後に伴われるドライアイ、アレルギー結膜炎に伴われるドライアイ、ＶＤＴ（Visual Display Terminal）作業者の涙液減少症および冷暖房による部屋の乾燥等により起こる全身に異常のない涙液減少症からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
  9. ドライアイが、蒸発亢進型ドライアイである、請求項７記載の組成物。
  10. 角結膜障害がドライアイ、角結膜炎、アレルギーおよび微生物（ウイルス、細菌または真菌）の感染からなる群から選択される病的要因、薬物の細胞毒性、化学的要因、眼表面の乾燥、点眼薬中の防腐剤および点眼薬の有効成分、眼手術後の傷、眼内注射による創傷からなる群から選択される要因に起因する角結膜上皮欠損、角結膜びらんまたは角結膜潰瘍である、請求項２記載の組成物。
  11. ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンの、ドライアイ処置用医薬組成物の製造のための使用。
  12. ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンの、角結膜障害処置用医薬組成物の製造のための使用。
  13. ドライアイ処置の必要な患者へ、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンの有効量を投与することを含む、ドライアイの処置方法。
  14. 角結膜障害処置の必要な患者へ、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子にて酵母を形質転換して得られた組み換え酵母により産生されるヒト血清アルブミンの有効量を投与することを含む、角結膜障害の処置方法。
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