JPS6339576A - 酵母の遺伝子修飾方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は醸造酵母の遺伝子操作に関する。

組換えＤＮＡを形質転換法によって酵母実験室法に導入
することはよく行なわれており、１９７０年代後期に始
めてこの現像が報告されて以来（Ｈｉｎｎｅｎら、１９
７８年；　Ｂｅｇｇｓ　、　１９７８年）高度に、かな
シ進歩してきた。酵母の形質転換に通常使用されるベク
ターは二つのタイプに分類される： （１）複製ベクター、即ち、ＤＮＡ複製の機能的開始点
が存在するため、酵母の染色体ＤＮＡとは独立に自己維
持を仲介できるベクター、および（１１）複製のため、
またさらに宿主中での組換えＤＮＡの維持のために染色
体ＤＮＡとの組換えを必要とする組込みベクターである
。複製ベクターは格らに次のように分類できる。

（ａ）　　ＤＮＡ複製の開始点が酵母固有の２μｍシラ
スミドに由来する２μｍプラスミドベクター。

（ｂ）「見かけ」の複製開始点が酵母の染色体ＤＮＡに
由来する自律複製ベクター（ＡＲ８）　、および （Ｃ）　　上記ＤＮＡ複製開始点の一つに加え、動態体
を保有することが知られている酵母染色体ＤＮＡの配列
を含有する動態体７″ラスミド（ＣＥＮ　）である。

上記ベクターのいずれかで酵母全効率よく形質転換する
ためには、組換えＤＮＡを保有する形質転換３株を同定
する選択マーカーを分裂酵母細胞に賦与することが必要
である。実験室酵母ではベクター　ＤＮＡに、使用する
受容菌株の栄養要求性を補足する遺伝子を組込むことに
よりこれが達成できる。

倍数体であシ、栄養要求性を示さない醸造酵母を形質転
換するためには、優性選択遺伝子に基づく選択系を利用
する必要がある。この点から、複製２μｍプラスミドベ
クターは次のような物質に対する耐ｅｆ仲介する遺伝子
を保有することが報告され℃いる。

（１）抗生物質、例えばＧ　４１８　（Ｊｉｍｉｎｅｚ
ら。

１９８０年；　Ｗｅｂｓｔｓｒら、１９８３年）、ハイ
グｏマイシンＢ　（Ｇｒｉｔ、ｚら、１９８３年）、ク
ロラムフェニコール（Ｃｏｈｅｎ　ｔ；）　、　１９８
０年）、および （１１）毒性物質、例えば、除草剤スルホメチュロンメ
チル（酵母α−アセト乳酸合成酵素遺伝子ＩＴ、Ｖ　−
２の変異により耐性）　（Ｆａｌｃｏ　ラ、　１９８５
年）および銅（酵母のＣＵＰ　−１遺伝子を介して耐性
）　（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９８５年）。

複製型プラスミドで酵母を形質転換すると全ての場合、
形質転換表現型の安定性は細胞増殖の非選択条件下で低
い。即ち、２μｍｆｆ１ベクターは選択なしで一回の分
裂につきおよそ１−５パーセントの頻度で受容酵母実験
室法から欠失していく（Ｂｅｇｇｓ　、　１９７８年；
　Ｂｒｏａｃｈ　５　、１９７９年；Ｇｅｒｂａｕｄら
、１９７９年；　５ｔｒｕｈｌら、Ｌ９７９年）。

このようなプラスミドの酵母に於ける相対的安定性は酵
母宿主に依る。この点で、銅耐性を保有する２μｍ型プ
ラスミドは、醸造酵母で一回の分裂につきおよそ０．１
８％の頻度で失なわれることがわかっている（　Ｈｉｎ
ｃｈｌｉｆｆｅおよびＤａｕｂｎｅｙ　。

１９８６年）。受容酵母がプラスミドの安定性に影響す
るのと同じように、プラスミド自体の性質も重要な役割
を有する。例えば、ＡＲＳプラスミドは細胞分裂当シ１
０％以上の頻度で失なわれる（　Ｋｉｋｕｃｈｉ　、　
１９８３年）。細胞の連続増殖後も形質転換表現型を安
定に維持するためにはプラスミドの選択を持続する必要
がある。実験室酵母形質転換株の場合には受容酵母株が
要求する栄養素を欠損する最少培地で通常選択する必要
があるため細胞増殖に用いる培地の性状に制限がかかる
。

しかし、醸造酵母の場合通常の生育培地であるホップ入
）ビール麦芽汁に抗生物質、或いは銅のような毒性物質
を添加することは、それらが高価であシまだ発酵の主要
産物であるビールの質に悪い影響を及ぼすため、実用的
でなくまた望ましくない０ 非選択生育条件下で酵母に於ける組換え遺伝子の維持を
確保する一つの方法としては受容体に導入された時ベク
ターと染色体ＤＮＡの相同配列での遺伝子組換えによる
宿主染色体への組込みを起す組込み酵母ベクターの使用
がある。しかし、そのようなベクターは極端に低い形質
転換効率を有し、μＩのＤＮＡ当シ約１−１０個の転換
株しか得られない（Ｈｌｎｎｅｎら、１９７８年；　Ｈ
ｉｃｋｓら；１９７９年）。この頻度は形質転換するＤ
ＮＡをＤＮＡ相同性領域で切断するような制限エンドヌ
クレアーゼで切断することにより高い組換え性分子を形
成して高めることが出来る（　Ｈ１ｃｋｓら。

１９７９年）。この現象は、組込みベクターによる形質
転換効率を制限する主要因子がＤＮＡ取込みではなく、
むしろ組換えにあることを示唆している。この事は、組
換えのための目的ＤＮＡ配列が宿主細胞の代謝に影響を
与えない領域にさえあれば組込みベクター系の醸造゛酵
母への応用を制限しない。上述の原理に基づき、組込み
酵母ベクターが最近醸造酵母に応用されている（酵母ベ
クター、ヨーロッパ特許公報ＩＩ＆Ｌ１６３，４９１゜
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｉｎｃ、　）　。この系は醸造酵母での遺伝子安定性
を与えるが、組換えＤＮＡの高コピー維持はせず、醸造
酵母の本質的な低形質転換効率のため実施するのにより
困難である。

本発明は酵母、特に醸造酵母の２μｍ型組換えプラスミ
ドによる形質転換の方法を提供する。醸造酵母の形質転
換はプラスミド上に酵母のＣＵＰ　−１遺伝子が存在す
ることにより銅耐性の転換株を選択できることで行なう
事が可能であるが、抗生物質耐性を含むどんな優性選択
マーカーをも使用することができ、実際に目的のペプチ
ド産物をコードする遺伝子とは異なる別のマーカー遺伝
子を使用することができる。組換えの「目的遺伝子」を
安定に維持するためには遺伝子を醸造酵母の内生２μｍ
　プラスミド内の部位に遺伝組換えにより組込むことを
行なう。本プラスミドは今まで調べられた限シ全ての所
有酵母菌株に存在する（　Ｈｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよび
Ｄａｕｂｎｅｙ　ａ　１９８６年）。

内因性２μｍプラスミドの普遍的存在はこのプラスミド
が醸造酵母中で見かけ止弁選択生育下で多くの世代を経
ても安定に維持されることを示す。

従って理想的には、目的遺伝子の組込みを２μｍプラス
ミド中の内生２μｍプラスミドの遺伝的安定性に悪影響
を及ぼさない部位に行なう事が必要である。

酵母の２μｍプラスミドは６３１８塩基対の環状ＤＮＡ
分子で、全ヌクレオチド配列が決定されている（　Ｈａ
ｒｚｌｅｙおよびＤｏｎｅｌｓｏｎ　ａ　１９８０年）
。

本プラスミドは醸造酵母（Ａｉｇｌら、１９８４年；Ｈ
ｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよびＤａｕｂｎｅｙ　ｅ　１９８
６年）を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのほとんどの菌株（Ｃ１ａｒｋｅ−Ｗａｌｋ
ｅｒおよびＭｉｋｌｏｓ　、　１９７４年）に細胞１４
）およそ５０−１００コを一存在する。

本プラスミドは非メンデル様式で遺伝しく　Ｌｉ’／ｉ
ｎｇｓＺＯｎ、１９７７年）、そのため細胞中で細胞質
性と考えられている。しかし、本プラスミドが核内に存
在することを示す多くの重要なデータもある（　Ｎｅ１
ｓｏｎおよびＦａｎｇｍａｎ　ｘ　１９７９年：Ｌｉｖ
ｉｎｇｓ　ｚｏｎおよびＨａｈｎｅ　、　１９７９年；
　Ｓｅｌｉｇｙら、１９８０年；　Ｔａｋａｎｏら、１
９８０年；Ｓｉｇｕｒｄｓｏｎ　ＩＱ）　＋　１９８１
年）。本プラスミドの重要なコードしては、二つの逆転
したくシ返えしく長さが５９９塩基対）が存在し、この
ため分子が二つの特有な領域に分離されていることであ
る。

逆くり返えしでの分子内組換えの結果、一方の特有領域
が他方に対し℃逆位し、生体内でＡおよびＢと呼ばれる
二つのシラスミド構造体の混合を形成する（　Ｂｅｇｇ
ｓ　、　１９７８年）。二つの逆くシ返えしでの組換え
は、プラスミド自体に存在するＦＬＰと呼ばれる遺伝子
の産物により仲介される。

ＦＬＰ遺伝子は逆くシ返えし領域での高頻度組換えを仲
介できる蛋白質をコードする。

驚くことに、「目的の遺伝子」が内生２μｍプラスミド
の遺伝的安定性に悪影響を及ばずことなく２μｍプラス
ミド内に組込まれることを見つけた。

本発明によると、目的の蛋白質またはぺプチドをコード
するＤＮＡ配列を酵母固有の２μｍプラスミド内に組込
むことによる酵母の遺伝的修飾方法は、先ず相同な２μ
ｍプラスミドＤＮＡ配列が相互に直列方向に位置する２
コぎ−および該ＤＮＡ配列を含有する組込みベクターで
酵母を形質転換し、次に得られる転換株より、ベクター
は含まないが目的のＤＮＡ配列を組込んだ、Ｂ１飾内生
２μｍプラスミドを含有する細胞を単離することから成
る。目的のＤＮＡ配列は組込みベクター内に該配列を挿
入できる例えばＢａｍＨＩ部位またはＫｐｎ　Ｉ部位な
どの適当な制限酵素部位を介して組込まれる。ベクター
は通常、無関係なりＮＡ配列、即ち、酵母中でのプラス
ミドの複製に必要でなく、好１しくもないが、バｊテリ
アまたは他の酵母以外の宿主微生物での複製のために好
ましい配列を含有する。このようなりＮＡ配列は目的の
蛋白質またはぺプチド全コードするＤＮＡ配列から直列
方向の相同配列により隔てられる。好ましくはこの配列
は酵母に対して外来性であってバクテリア中でのベクタ
ーの複製を助ける配列である。

本発明はさらに、直列方向に相同な２コピーの２μｍ　
ＤＮＡ配列、通常は酵母に外来性で酵母以外でのプラス
ミドの複製を助けるＤＮＡ配列、およびプラスの複製を
助ける該ＤＮＡ配列から直列方向の該相同配列で隔てら
れた目的の異種蛋白質またはぺプチドをコードするＤＮ
Ａ配列とから成る２μｍプラスミド組込みベクターを提
供する。

本発明の方法では、組込みは組換えを通して起り、ベク
ターの相同ＤＮＡ　＜　Ｄ返えし配列の間に囲まれてい
ない残シのベクターＤＮＡを除外し℃組換え遺伝子（目
的のＤＮＡ配列）の組込みを行なう。

本方法では、「目的の遺伝子」のみが酵母、例えば醸造
酵母、中で非選択生育条件下において何世代も安定に維
持され、それにより余分なりＮＡ配列で起シ得る酵母の
技術上の性状或いは酵母により生産される生成物である
ビールの風味および品質に対する悪影響を回避できる。

本発明はこの理論の真実性に依存してはいないが、本ベ
クターは酵母に導入されると相同ＤＮＡ　（シ返えし配
列の間の分子内組換えが起り、それぞれ内生２μｍプラ
スミドに相同な一つのＤＮＡ配列を有する二つのプラス
ミド断片を生成すると考えられている。これらの断片の
一つが元のベクターが保有していた２μｍの複製開始点
を有し、もう一方は最初ベクターのくシ返えし配列の間
に存在した他のＤＮＡ配列を保有する。後者のプラスミ
ド断片が酵母の内因性２μｍプラスミドと相同領域で組
換えを起こし、酵母内生２μｍプラスミドと元のベクタ
ーの直列方向の二つの相同ＤＮＡ　＜り返えしの間に含
まれていた目的のＤＮＡ配列を相同領域に挿入されて保
有する安定な組込み体を生成する。

実際には「目的の遺伝子」は酵母にとり同種ま。

たは多くの場合異種のいかなる組換え遺伝子でもよい。

例えば、本性はヒト血清アルブミン遺伝子を醸造酵母に
安定に組込むために利用され、その結果、例えばホスフ
ォグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ　）のよ
うな酵母構成プロモーター、或いは例えばヨーロッパ特
許出願４８６３０３０３９．１　。

隘２０１２３９として公開の「Ｆｅｒｍｅｎｔ、ａｔ、
ｉｏｎｗｉｔ、ｈ　ａｎ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｇａｎ
ｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｚｅｍ　Ｊ（Ｄｅｌｔ
ａ　Ｂｉｏｚｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｚｄ、　）に記載
格れるＧＡＬ　１０／ＣＹＣ１雑種プロモーター或いは
英国特許出願Ｎ１８６２０９２６．１９８６年８月２６
日出願の「Ｙｅａｓｉ　Ｐｒｏｍｏｚｅｒ　Ｊ　（Ｄｅ
ｌｚａ　Ｂｉｏｔ、ｅｃｈｎｏ−１ｏｇｙ　Ｌｔ、ｄ、
　）　Ｋ記載のＧＡＬ　１０　／　Ｐ（）Ｋプロモータ
ー　（ＰＡＬ　）のような酵母調節プロモーターから該
遺伝子が発現される。

本システムにより安定に組込むことの出来る他の遺伝子
としては、醸造酵母で菌体外にグル；アミラーゼ酵素を
生産するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉ＆５ｔａｔｉ
ｃｕａのＤＥＸ　−１遺伝子および醸造酵母で工、ンド
ー１．３−１．４−β−グルカナーゼの生産を指示する
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ＋１ｌｉｓのβ−グルカナ
ーゼ遺伝子（ＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよびＢｏｘ　、　
１９８５年）がある。異種遺伝子は先ず遺伝子修飾して
遺伝子発現レベルを調節し、または遺伝子にょシ生産が
仲介される蛋白質が醸造酵母にょＩ）菌体外に分泌され
るようにする。

本発明の遺伝子組込み方法では、目的の遺伝子が高コを
一部で非選択生育条件下で安定に維持される。これは特
にヨーロッパ特許出願 Ｎｎ　８６３０３０３９．１　　（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔ
ｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｎＩｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｇｅｎｅ
　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｚｅｍ　）　Ｋ記載さ
れる方法を実施する際に有利である。それはこれらの条
件下で目的遺伝子の発現は制御され、主要ビール発酵の
工程中では発現されないが発酵後に誘導されるからであ
る。目的遺伝子の高コピー数を確保することにより発酵
後に高レベルの誘導を達成することが可能で、従って生
産する異種蛋白質の量を増加できる。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｉａｓｚａｔ、１ｃｕ
ｓ　ＤＥＸ　−１遺伝子を安定に組込むことにより、菌
体外グルコアミラーゼが特に存在する麦芽汁中のでん粉
（デキストリン）を浦水分解するためにビールの生産ｒ
高める。

従って、このシステムを用いることによって高価な市販
の酵素を添加することなく、非発酵性のでん粉の一部を
発酵性の糖に、そしてアルコールに変換してｅ−ルを生
産することが可能である。

〈実施例１〉 プラスミドｐＥＨＢ１１（ヨーロッパ特許出願述８６３
０３［］３９．１．公開洩２０１２３９゜Ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｉｉｏｎ　ｗｉｔｈ　　ａｎ　　Ｉｎｄｕｃｉｂｌ
ｅ　　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　
；　Ｄｅｉａ　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｔｄ、、
に記載）をビール酵母菌株ＮＣＹＣ２４０（エール酵母
　−Ｎｔｚｉｏｎａｌ　　Ｃｏ１１ｅｃｚｉｏｎ　　ｏ
ｆ　　ＹｅａｓｔＣｕｌｚｕｒｅｓ　ａ　　英国ノリツ
ジ、コルニーレーン）およびＢＢｌｏ、２（うが−酵母
−Ｂａ５ｓ　Ｙｅａｓｚの所有菌株）に形質転換し、Ｈ
ｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよびＤａｕｂｎｅｙ　（１９８６
年）に記載されるように銅耐性転換株を選択する。ＮＣ
ＹＣ２４０（ｐＥＨＢ　１１　）は１９８４年１２月１
２日に英国フリックＮＲ４，７ＡＵ、コルニーレーンの
Ｎａｔ、１ｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ　Ｙｅ
ａＳｔ＋　Ｃｕ１ｚｕｒｅｓにＮＣＹＣ１５４７として
寄託されている。

形質転換株は銅耐性（＞　１　ｍＭ　ＣｕＳＯ４・７Ｈ
２０）。

β−がラクトシダーゼ陽性（Ｍ−６３，２％ψがラクト
ースおよびＸ　−ｇａｌ上で青／緑色、ヨーロッパ特許
出願ｘａ６ｓｏ６ｏ３９．１）およびβ−ラクタマーゼ
陽性を確認する。形質転換株を２％　ｗ／ｖグルコース
および０．２　ｍＭ　ＣｕＳＯ４’７Ｈ２０を添加した
ＮＥＰ培地中で後期定常期まで生育させてから非選択培
地（ＮＥＰ　、　２％ｗ／ｙグルコース顎でＣｕＳＯ４
・７Ｈ２０を含有せず）に移す。およそ１５−２０回の
細胞分裂の後酵母細胞を集菌してＩＰ　。

２％Ｖｖグルコース寒天培地に単コロニー分離のためま
く。各コロニーにつき肌２　ｍＭ　ＣｕＳＯ４・７Ｈ２
０およびｉ　ｍＭ　ＣｕＳＯ４・７Ｈ２０を添加した同
培地にレプリカしてプラスミドｐＥＨＢ　ｌ　１の存在
を、また２、０％ｗ／ｖがラクトースおよびＸ　−ｇａ
ｌを添加したＭ６３培地にレプリカして表現型を確認す
る。

その結果、プラスミドｐＥＨＢ　１１はいずれのビール
酵母に於いても不安定であ）、コロニーの多くが銅感受
性でかつＸ−ｇａｌ上で青緑色を呈さない（β−がラク
トシダーゼ陰性）ことがわかった。

この不安定性は非選択的に生育させた醸造酵母中での２
μｍ型プラスミドとして予想されるものである。しかし
、銅感受性β−がラクトシダーゼ陰性コロニー（ｐＥＨ
Ｂｉ１マイナス）および銅耐性β−がラクトンダーゼ１
＠性コロニー（ｐＥＨＢｌｌプクス）の他に、０．２ｍ
Ｍ　ＣｕＳＯ４・７Ｈ２０に耐性を示すがβ−がラクト
シダーゼを生産しないコロニーも少し得られた。この最
後のタイプのコロニーを単離し、さらして調べた。遺伝
解析の結果、これらのコロニーはβ−ガラクトシダーゼ
もβ−ラクタマーゼも生産することが出来なかった。

銅耐性でβ−がラクトシダーゼ陰性の細胞を分子生物学
的分析にかけた。酵母全ＤＮＡをＣｒｙｅｒら（１９７
５年）の方法により分離し、制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏ　ＲＩおよびＣ１ａ　Ｉで消化した。

消化および未消化ＤＮＡ断片をアがロースデル電気泳動
により分離し′″Ｃ５ｏｕｔ、ｈｅｒｎの方法（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓｌ”）、１９８１Ｅ）によりニトロセルロー
スフィルターに移す。フィルターを前ハイブリダイゼー
ション緩衝液（５ｍ９のサケ精子ＤＮＡ、１０〜のクシ
血清アルブミン、１０ｍｇのフィニル、１０ｍ９のポリ
ビニルピロリドン、０．１ｇのグリシンを含有する１０
成°の５０％ｖ／ｖホルムアミド＋１００ｍＭシん酸緩
衝液ｐＨ６，５を５倍ｏｓｓｃ　Ｃ０，１５ＭＮａＣＪ
、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム、−７、口］　）
中、４２℃で１〜２時間前ハイブリダイゼーションを行
なった後、Ｐ３２−でニック標識ＤＮＡプローブを用い
てＤＮＡ　：　ＤＮＡハイブリダイゼーションを行なう
（Ｒｉｇｂｙら、１９７７年）。

ＤＮＡ相同領域をオートラジオグラフィーで同定する。

ＣＵＰ　−１遺伝子（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９８５
）を含有するｐＥＴ　１３　：　１の１．２５キロベー
ス対の５ａｕ３Ａ断片とのハイブリダイゼーションの結
果、銅耐性β−がラクトシダーゼ陰性クローンはプラス
ミドｐＥＨＥ　１１を保有するビール酵母形質転換株で
観察されるパターンと異なるハイブリダイゼーションパ
ターンを示した。得られたハイブリダイゼーションパタ
ーンはｐＥＨＢ　１１のＣＵＰ　−１配列がビール酵母
菌株の固有２μｍプラスミドに組込まれていることを示
唆していた。さらに、未消化ＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションの結果、銅耐性β−がラクトシダーゼ陰性クロ
ーンは、プラスミドｐＥＨＢ　ｉ　１がおよそ１２．８
５キロベース対の犬ぎさを有するのに対し、ＣＵＰ　−
１遺伝子を含むおよそ９．１３キロベース対の小プラス
ミドを保有することが確認され、これは２μｍ　（６，
３キロベース対）とｐＥＨＢ　１１に存在する相同２μ
ｍ　ＤＮＡのくシ返えしの間に含有されるＣＵＰ　−１
配列の混成物である。

さらに全染色体ＤＮＡをＥ、　ｃｏｌｉの、１ａｃｚ遺
伝子および余分のＥ、　ｃ○１１プラスミドＤＮＡを保
有する３２ｐ標識プラスミドｐＭＣ１４０３ＤＮＡ　（
Ｃａ５ａｄａ　−ｂｏｎら、１９８０年）とハイブリダ
イゼーションした結果は、銅耐性β−がラクトシダーゼ
陰性クローンはｐＥＨＢ　１１が保有する実質的に全て
のバクテリアＤＮＡ配列を欠損していることを示した。

ＣＵＰ　−１遺伝子のビール酵母２μｍ７°ラスミド中
への組込み部位はｐＥＨＢ　１１の直列方向ＤＮＡ　（
り返えし配列が保有するＤＮＡ相同領域内であることが
わかった。これは全ＤＮＡ制限酵素消化物をプラスミド
ｐＪＤＢ　１１０（Ｂｅｇｇｓ　、　１９８１年）に由
来する２１６８塩基対の３２ｐ標識ＥｃｏＲＩ　−Ｈｉ
ｎｄｌ［断−の逆転くり返えしＤＮＡ配列とを含有する
。従つてＣＵＰ　−１遺伝子が逆転〈シ返えしの一方に
すぐ隣接したＤＮＡ領域に組込まれると、すずンハイプ
リダイゼーション後に見られる通常の制限パターンに乱
れが生じる。サヂントランスファおよびハイブリダイゼ
ーションと合せた標準の制限図作成により、為挿入部位
が２　、ｇｍ　Ｂ型の座標０のＥｃ。

Ｒ工部位と座標７０３のＸｂａ　Ｉ部位に囲まれる７０
３塩基対のＤＮＡ領域内に位置することがわかった（　
Ｂｒｏａｃｈ、　１９８１年）。

ビール酵母の銅耐性β−がラクトシダーゼ陰性クローン
、以後「組込み体」と呼ぶ、の銅耐性表現型の遺伝的安
定性を非選択条件下で生育させた後分析した。

組込み体を単離し、２％ｗ／ｖグルコースおよびＱ、２
ｍＭ　ｃｕｓｏ４・７ｎ２ｏを含有する１０１ｄのＮＥ
Ｐ中で定常期まで増殖させる。遠心分離により酵母菌体
を集め、硫酸銅を含有しない新しい培地に移す。

酵母を中期対数増殖期まで生育てせ、新しい生育培地に
移す。ＣＵＰ　−１遺伝子の存在はＮ−ＥＰ、２％Ｗ／
ｖグルコース寒天培地にプレートした後０．５ｍＭ　Ｃ
ｕＳＯ４・７Ｈ２０を添加した同じ培地にレプリカする
ことにより追跡した。このような非選択条件下での連続
培養をおよそＩ　Ｄｏ−１３０世代続ける。

第２図に示す結果は銅耐性の表現型はこの期間中安定で
あることを示している。２μｍ組換えシラスミドｐＥＴ
　１３　：　１で形質転換したビール酵母を用いて同じ
実験を行なうと、かなシの程度の遺伝的不安定性が見ら
れた（第２図）。さらに、適当に標識したＤＮＡプロー
ブ（上述）でのＤＮＡ　／−イブリダイゼーションによ
る組込み体の分子解析結果は、非選択条件下での連続的
生育の後もＣＵＰ　−１遺伝子が内生２μｍプラスミド
中に維持されていることを示した。

醸造酵母は通常−コ聾−のＣＵＰ　−１遺伝子を染色体
上に５．２キロベース対Ｅｃｏ　ＲＩ断片内に保有して
いる。従って組込み体ビール酵母中のＣＵＰ　−１遺伝
子の染色体外コピー数を、全酵母ＤＮＡのＥｃｏ　ＲＩ
消化物を３２ｐ標識ＣＵＰ　−１プローブ（ｐＥＴ　１
３　：　１からの１．２５キロベース対の５ａｕ６Ａ断
片；　Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９８５年）でプロービ
ングすることにより決定することが出来る。このような
ハイブリダイゼーションの結果、５．２キロベース対の
染色体ＣＵＰ　−１断片および内生２μｍプラスミドに
組込まれたＣＵＰ　−１遺伝子に由来する３、０キロベ
一ス対断片に相当する二本のＤＮＡ相同バンドが得られ
た。

二つのバンドを露光したオートラジオグラムのデンシト
メータースキャンによる強度の比較で染色体遺伝子数に
対比した染色体外ＣＵＰ　−１遺伝子のおよそのコざ一
部を見積ることが出来る。このようにして、組込み体が
ＣＵＰ　−１染色体遺伝子当シおよそ８７コピーの染色
体外ＣＵＰ　−１遺伝子を保有することが推定された。

酵母の再くシ返えし５ＳリポゾームＤＮＡ（Ｆｅｔｅｓ
ら、１９８５年）に対するＣＵＰ　−１遺伝子の相同の
相対強度比較によるという他の方法での染色体外ＣＵＰ
　−１遺伝子のコピー数測定の結果組込み体では一倍体
遺伝子当シ５５のコピー数が得られた。

ｐＥＨＢ　１１の一般２μｍ組込みベクターとし℃の利
用 プラスミドｐＥＨＢ　１１は直列方向の７０３塩基対の
相同くシ返えし内にＣＵＰ　−１遺伝子の３′末端に隣
接して（第１図）特徴的なＫｐｎ　工制限エンドヌクレ
アーゼ部位を有する。この独特な部位はさらに新たなり
ＮＡ配列、例えば「目的の遺伝子」を挿入するのに都合
良く、その結果うまく形質転換するとビール酵母の内生
２μｍプラスミド中に組込むことが出来る。プラスミド
ｐＥＨＢ１１およびその独特なＫｐｎ　Ｉクローニング
部位を利用することにより、調節型ＧＡＬ　１０　／　
ＣＹＣｉプロモーターターミネータ−発現カセットによ
り発現されるヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ　）遺伝子を
選択的に組込むことが可能であシ、その結果、調節され
たＨ８Ａ発現二二ツＩｆ高コピー数で安定に維持できる
。これによりこの組込み遺伝子を保有するビール酵母が
既に記載されている方法（ヨーロッパ特許出願隘８６３
０３０３９．１）に従って発酵工程後にＩＳＡ生産を誘
導されると高レベルの遺伝子発現が起る。

引用文献 Ａｉｇｌｅ　ｅｔａｌ、ｓ　（１９８４）＊　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　ｔ、ｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅ
ｔｙ　ｏｆ　ＢｒｅｗｉｎｇＣｈｅｍｉｓｔｓｎ４２．
１゜ Ｂｅｇｇｓ、　（１９７８）、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７
５．１０４゜Ｂｅｇｇｓ　（１９８１）＊　Ｉｎ：　”
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　０ｅｎｅｔ、ｉｃｓ　１ｎＹｅａ
Ｓ？＋’　Ａｌｆｒｅｄ　Ｂｅｎｚｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ　Ｎｏ：１６ｊＭｕｎｋｓｇａａｒｄ、　Ｃｏｐ
ｅｎｈａｇｅｎ。

Ｂｒｏａｃｈ　（１９８１）＋　工ｎ：　”Ｔｈｅ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔ、ｈｅ　Ｙ
ｅａｓｚ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：　Ｌｉｆｅ　
Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ工ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ″、　Ｅｄ
ｓ、　Ｓｔ＋ｒａｔｈｅｒｎ　ｅｚ　ａｌ、　Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、ｓ　ｐｐ　４
４５゜Ｂｒｏａｃｈ　＆　Ｈｉｃｋｓ、　（１９８０）
、　Ｃｅ１ｌ、　２１．５０１　。

Ｃａ５ａｄａｂａｎ　ｅｃ　ａｌ、　（１９８０）、　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ１０８、１７９゜ Ｃ１ａｒｋ−Ｗａｌｋｅｒ　＆　ＭｉｋｌＯｓ、　（１
９７４）ｓ　ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｚｒｙａ　　４１，３５９゜１０
７８゜ Ｃｒｙｅｒ　ｅｖ　ａｌ、（１９７５）、　　工ｎ：　
　”Ｍｅｚｈｏｄｓ　　ｉｎ　ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ
’＋　　１２．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　
ｐｐ、３９−４４゜Ｆａｌｃｏ　ｅｔａｌｊ　（１９８
５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
＋１３．４０１１゜ Ｈａｒｔ、ｌｅｙ　＆　Ｄｏｎａｌｓｏｎ＝　　（１９
８０）ｎ　Ｎａｚｕｒｅ、２８６＋８６０゜Ｈｅｎｄｅ
ｒｓｏｎ　ｅｚ　ａｌ、（１９８５ル　Ｃｕｒｒｅｎｚ
　（）ｅｎｅｚｉｃｓ。

９．１３３゜ Ｈｉｃｋｓ　８Ｚ　ａｌ、　（１９７９）、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｕｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　
Ｑｕａｎｚｉｚａｔｉｖｅ　ＢｉｏｌｏｇＹ＋　　４３
ｍ　　１３０５゜Ｈｉｎｃｈｌｉｆｆｅ　Ｊｋ、Ｂｏｘ
　（１９８５）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｚｈｅ
Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｒｅｗｅｒｙ　Ｃｏｎｖｅｎｚｉ
ｏｎ　ＣＯｎｇｒｅＳＳ＋　　２Ｑｔ、ｈ。

Ｈｅ１Ｓｌｎｋｌ＋　　２６７− ９８゜ Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔａｌ、　　（１９７８）ｌ　Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔ、ｈｅＮａｔ、１ｏｎａｌ
　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ
ＳＡ＋　　７５＋１９２９゜ Ｊｉｍｉｎｅｚ　　ｅｖ　　ａｌ、　　（１９８０）ａ
　　Ｎａｚｕｒｅ＊　　２８７＃　　８６９゜Ｋｉｋｕ
ｃｈｉ、　　（１９８３）、　Ｃｅ１ｌ、　　３５．４
８７゜３７２７゜ Ｍａｎｉａｔ、ｉｓ　　ｅｃ　ａＬ　　（１９８２）ｊ
　Ｉｎ：　　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ　ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ１″、　　Ｃｏ１ｄ
　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ。

Ｎ５ｌｓｏｎ　＆　Ｆａｎｇｍａｎｊ　（１９７９）＋
　　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　ｏｆｚｈｅ　Ｎａｚｉ
ｏｎａｌ　　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅ
ｓ、ＵＳＡ。

７６、　６５１５゜ Ｐｅｚｅｓ　ＱＺ　ａｌ＊　（１９７８）＃　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｚｅｒｉｏｌｏｇｙ１３４．２９
５゜ Ｒ１，ｇｂｙ　ｅｔ、ａｌ、（１９７７）＃　　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＳ　Ｆ３１１　ｇ
７　ＬｒＬＡ２＋ｊ（１９８Ｑ　）　＃　Ｎ　ｕ　Ｃｌ
　ｅ　Ｉ　ＣＡＣ１ｄ　５Ｒｅｓｅａｒｃｈｓ　　ＥＬ
　　３３７１゜Ｓｉｇｕｒｄｓｏｎ　ｅｔ、ａｌ、（１
９８１）ｊ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄＧｅｎｅｒａ
ｌ　　Ｇｅｎｅｔ、ｉｃｓ、１ｓ６ｊ　５９゜５ｚｒｕ
ｈｌ　ｅｔ、　ａｌ、　　（１９７９）、　Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｚｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａ
ｄｅｍｙ　　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、７６
ｓ−一一畷一−−■−−−肯−−−− １０３５゜ Ｔａｋｅｚｏ　ｅｔＩａｌｊ（１９８０）ｓ　Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｚｈｅＮａｔ、１ｏｎａｌ　Ａ
ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、７
７ｘ３１４４゜ Ｗｅｂｓｔｅｒ　ｅｚ　ａｌ、　　（１９８３）、　　
（）ｅｎｅ、　２６．　２４３゜

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＥＨＢ　１ｉの構成を示す模式図であシ、第
２図はラガー酵母菌株ＢＢ　１０．２におけるＣＴＪＰ
−１の安定性を示すグラフである（ラガー酵母菌株ＢＢ
　１口、２の表現型の安定性。ＢＢ　１０．２　ＣｐＥ
Ｔ１３：１１、→；　ＢＢ　１０．２　Ｃ組込み体〕、
ト１）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）相同な２μｍプラスミドＤＮＡ配列の２コピーが相
   互に直列方向に連結し、目的の蛋白質またはペプチドを
   コードするＤＮＡ配列を含む組込みベクターで酵母を先
   ず形質転換し、次に得られる形質転換酵母から該ＤＮＡ
   配列を組みこんでいるが該ベクターは含有しない内因性
   ２μｍプラスミドを保有する細胞を単離することより成
   る、目的蛋白質またはぺプチドをコードするＤＮＡを内
   因性２μｍプラスミドに取り込むことによる酵母の遺伝
   的修飾方法。 ２）組込みベクターが、目的の蛋白質またはペプチドを
   コードするＤＮＡ配列から直列方向の該相同配列により
   隔てられるＤＮＡ配列をも含有する特許請求の範囲第１
   ）項記載の方法。 ３）該外来ＤＮＡ配列がバクテリア中でのベクターの増
   殖を助け、酵母に対して異種のＤＮＡ配列である特許請
   求の範囲第２）項記載の方法。 ４）該ベクターが目的の蛋白質またはペプチドをコード
   するＤＮＡ配列から直列方向の相同配列により隔てられ
   ることのない選択マーカーＤＮＡ配列をも含有する特許
   請求の範囲第１）項記載の方法。 ５）選択マーカーＤＮＡ配列が銅に対する耐性をコード
   する遺伝子である特許請求の範囲第４）項記載の方法。 ６）該ベクターが酵母の２μｍプラスミド固有の複製開
   始点を含有する特許請求の範囲第１）項記載の方法。 ７）目的の蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配
   列がヒト血清アルブミンまたはその誘導体をコードする
   特許請求の範囲第１）項記載の方法。 ８）直列方向の相同な２μｍプラスミド配列の夫夫が酵
   母の内因性２μｍプラスミドからのＤＮＡのＥｃｏＲＩ
   部位およびＸｂａＩ部位で囲まれる７０３塩基対より成
   る特許請求の範囲第１）項記載の方法。 ９）酵母が醸造酵母である特許請求の範囲第１）項記載
   の方法。 １０）相同な２μｍプラスミド配列が直列方向に２コピ
   ー、酵母以外でのプラスミド増殖を助けるＤＮＡ配列お
   よびプラスミド増殖を助ける該ＤＮＡ配列から直列方向
   の該相同配列により隔離される目的の異種蛋白質または
   ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する２μｍプラ
   スミドベクター。 １１）目的の蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ
   配列から直列方向の相同配列により隔離されない選択マ
   ーカーＤＮＡをも含有する特許請求の範囲第１０）項記
   載の２μｍプラスミドベクター。 １２）選択マーカーＤＮＡ配列が銅に対する耐性をコー
   ドする遺伝子である特許請求の範囲第１１）項記載の２
   μｍプラスミドベクター。 １３）酵母の２μｍプラスミド固有の複製開始点を含有
   する特許請求の範囲第１０）項記載の２μｍプラスミド
   ベクター。 １４）目的の異種蛋白質またはペプチドがヒト血清アル
   ブミンまたはその誘導体である特許請求の範囲第１０）
   項記載の２μｍプラスミドベクター。 １５）直列方向の相同な２μｍプラスミド配列の夫夫が
   酵母固有の２μｍプラスミドからのＤＮＡのＥｃｏＲＩ
   部位およびＸｂａＩ部位に囲まれた７０３塩基対より成
   る特許請求の範囲第（１０）項記載の２μｍプラスミド
   ベクター。