JP2710610B2 - 機能遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents
機能遺伝子を含むｄｎａ断片Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は組換ＤＮＡ技術分野に
関するものである。その側面の一つとしては、この発明
はピキア属の酵母菌株からの単離された機能遺伝子に関
するものである。他のもう一つの側面としては、この発
明は遺伝子生産物、すなわちポリペプチド、の発現を調
節するＤＮＡ断片に関するものである。
関するものである。その側面の一つとしては、この発明
はピキア属の酵母菌株からの単離された機能遺伝子に関
するものである。他のもう一つの側面としては、この発
明は遺伝子生産物、すなわちポリペプチド、の発現を調
節するＤＮＡ断片に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】現在まで、種々のポリペプチドを生産す
るために組換ＤＮＡ技術を商業的に使用しようとする試
みは宿主生物として大腸菌を用いるものに集中してい
る。しかし、ある場合には大腸菌は宿主として適切でな
いということが判明している。例えば、大腸菌は、医薬
品として有用なポリペプチドから除外しなければならな
い有害な発熱因子を多数含有している。この精製が良好
に実施されるための効率は、勿論、特定のポリペプチド
により異なる。更に、大腸菌の蛋白分解能がある種の有
用な製品の収率を著るしく制限する。これら及びその他
の点を配慮し、代替宿主、特にポリペプチドの生産のた
めに真核生物を使用することに興味の対象が移りつつあ
る。
るために組換ＤＮＡ技術を商業的に使用しようとする試
みは宿主生物として大腸菌を用いるものに集中してい
る。しかし、ある場合には大腸菌は宿主として適切でな
いということが判明している。例えば、大腸菌は、医薬
品として有用なポリペプチドから除外しなければならな
い有害な発熱因子を多数含有している。この精製が良好
に実施されるための効率は、勿論、特定のポリペプチド
により異なる。更に、大腸菌の蛋白分解能がある種の有
用な製品の収率を著るしく制限する。これら及びその他
の点を配慮し、代替宿主、特にポリペプチドの生産のた
めに真核生物を使用することに興味の対象が移りつつあ
る。
【０００３】真核系すなわち酵母におけるポリペプチド
製品の生産の手段が存在することは、組換ＤＮＡにより
遺伝情報の指定されたポリペプチドの生産に大腸菌など
の原核系を使用することを比較して、顕著な利点を提供
できることとなった。酵母は、大腸菌の大規模醗酵が比
較的最近になり到来したのに比し、数世紀にもわたり大
規模醗酵に使用されてきている。酵母は、細菌に比較し
て一般的に高い菌体濃度でも成長でき、連続醗酵工程に
容易に応用しうる。事実、ピキア パストリス( Pichia
pastoris ）などの酵母は、極めて高い細胞濃度、す
なわち１００ｇ／リットルを越える細胞濃度でも成育で
きることが米国特許第４，４１４，３２９号（フィリッ
プス石油（株）所有）にウエグナーにより開示されてい
る。酵母宿主の別の利点の中には、生物の多くの臨界的
機能、例えば酸化的リン酸化反応が細胞機関の中に存在
するので、そのため野性型の宿主細胞にとっては異物で
あるポリペプチドの当該生物による生産により、場合に
よっては起りうる恐ろしい作用にさらされることがない
という事実も含んでいる。真核生物として、酵母は発現
されたポリペプチド生産物にグルコース附加ができ、そ
のグルコース附加はポリペプチド生産物の生物活性にと
っては重要である。真核生物として酵母は高等生物と同
様のコードン優位性を示し、哺乳動物の遺伝子又は例え
ば哺乳動物のｍＲＮＡからの逆転写により得られた相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）由来の発現製品の効率的生産へと
資することもまた可能である。充分に特性が明らかには
されていない酵母類の宿主／ベクター系としての開発
は、形質転換条件についての知識の欠如と適用なベクタ
ーが存在していないことによりずいぶんと妨害された。
更に、栄養要求突然変異株はしばしば入手出来なく、こ
のため栄養要求的補体により形質転換体を直接選抜する
ことを不可能としている。もしも、組換ＤＮＡ技術が充
分にその約束をはたせたら、ＤＮＡの操作を可能とし、
挿入したＤＮＡ配列の発現を適正化し、その結果、所望
のポリペプチド製品が制御された条件下で、かつ、高収
率で調製出来ることとなる新しい宿主／ベクター系が発
明されるにちがいない。
製品の生産の手段が存在することは、組換ＤＮＡにより
遺伝情報の指定されたポリペプチドの生産に大腸菌など
の原核系を使用することを比較して、顕著な利点を提供
できることとなった。酵母は、大腸菌の大規模醗酵が比
較的最近になり到来したのに比し、数世紀にもわたり大
規模醗酵に使用されてきている。酵母は、細菌に比較し
て一般的に高い菌体濃度でも成長でき、連続醗酵工程に
容易に応用しうる。事実、ピキア パストリス( Pichia
pastoris ）などの酵母は、極めて高い細胞濃度、す
なわち１００ｇ／リットルを越える細胞濃度でも成育で
きることが米国特許第４，４１４，３２９号（フィリッ
プス石油（株）所有）にウエグナーにより開示されてい
る。酵母宿主の別の利点の中には、生物の多くの臨界的
機能、例えば酸化的リン酸化反応が細胞機関の中に存在
するので、そのため野性型の宿主細胞にとっては異物で
あるポリペプチドの当該生物による生産により、場合に
よっては起りうる恐ろしい作用にさらされることがない
という事実も含んでいる。真核生物として、酵母は発現
されたポリペプチド生産物にグルコース附加ができ、そ
のグルコース附加はポリペプチド生産物の生物活性にと
っては重要である。真核生物として酵母は高等生物と同
様のコードン優位性を示し、哺乳動物の遺伝子又は例え
ば哺乳動物のｍＲＮＡからの逆転写により得られた相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）由来の発現製品の効率的生産へと
資することもまた可能である。充分に特性が明らかには
されていない酵母類の宿主／ベクター系としての開発
は、形質転換条件についての知識の欠如と適用なベクタ
ーが存在していないことによりずいぶんと妨害された。
更に、栄養要求突然変異株はしばしば入手出来なく、こ
のため栄養要求的補体により形質転換体を直接選抜する
ことを不可能としている。もしも、組換ＤＮＡ技術が充
分にその約束をはたせたら、ＤＮＡの操作を可能とし、
挿入したＤＮＡ配列の発現を適正化し、その結果、所望
のポリペプチド製品が制御された条件下で、かつ、高収
率で調製出来ることとなる新しい宿主／ベクター系が発
明されるにちがいない。
【０００４】組換ＤＮＡ技術に使用される基本的要素は
プラスミドであり、染色体外で、二重鎖のＤＮＡで、あ
る種の微生物内で見出されたものである。天然に微生物
中に存在するとして見出されたプラスミドの場合、細胞
１個あたり多数のコピーがしばしば存在することが見出
されている。天然に存在するプラスミドに加えて、種々
の人工プラスミドやハイブリッドベクターも作成されて
いる。プラスミドＤＮＡ中に暗号化されている情報中に
含まれているもので、娘細胞中でプラスミドを再生する
ときに必要とされるもの、それは自律複製配列である。
一つ又はそれ以上の遺伝子表現型の淘汰特性が、プラス
ミドＤＮＡ中に暗号化されている情報中に含まれていな
ければならない。この遺伝子表現型の淘汰特性は、淘汰
培地中で細胞の優先的成育により区別され、選抜されう
る利益を有する当該プラスミドを含有する宿主細胞のク
ローン化を可能とする。
プラスミドであり、染色体外で、二重鎖のＤＮＡで、あ
る種の微生物内で見出されたものである。天然に微生物
中に存在するとして見出されたプラスミドの場合、細胞
１個あたり多数のコピーがしばしば存在することが見出
されている。天然に存在するプラスミドに加えて、種々
の人工プラスミドやハイブリッドベクターも作成されて
いる。プラスミドＤＮＡ中に暗号化されている情報中に
含まれているもので、娘細胞中でプラスミドを再生する
ときに必要とされるもの、それは自律複製配列である。
一つ又はそれ以上の遺伝子表現型の淘汰特性が、プラス
ミドＤＮＡ中に暗号化されている情報中に含まれていな
ければならない。この遺伝子表現型の淘汰特性は、淘汰
培地中で細胞の優先的成育により区別され、選抜されう
る利益を有する当該プラスミドを含有する宿主細胞のク
ローン化を可能とする。
【０００５】
【解決課題及びその手段】本発明にもとづき、本発明者
はピキア属の酵母の菌株からのＨＩＳ４を発見し、単離
し、及び特性化した。加えて本発明者は、ピキア属の酵
母の機能遺伝子の単離のための一般的手順を開発した。
本発明者が単離したこの新しい遺伝子は、ピキア属の酵
母菌株を宿主として用いる宿主／ベクター系内での遺伝
表現型の淘汰用マーカーとして有用である。本発明の他
のもう一つの実施態様により、本発明者は、培養培地中
のアミノ酸の存在の有無に応答性の調節領域を発見し、
単離し、特性化した。この調節領域は、例えば、酵母内
でのポリペプチド産物の制御された発現に有用である。
次の略号は、使用した制限酵素を表示するために、本明
細書を通して使用されている。略 号 制限酵素 Ｂ ＢａｍＨＩ Ｂ2 Ｂｇｌ II Ｃ ＣｌａＩ Ｈ3 Ｈｉｎｄ III Ｎｒ ＮｒｕＩ Ｐｓ ＰｓｔＩ Ｐｖ2 Ｐｖｕ II Ｒ1 ＥｃｏＲＩ Ｒ5 ＥｃｏＲＶ Ｓ ＳａｌＩ Ｓｍ ＳｍａＩ Ｓｐ ＳｐｈＩ Ｓｓ ＳｓｔＩ Ｓ3 Ｓａｕ３Ａ Ｔ ＴａｑＩ Ｘｂ ＸｂａＩ Ｘｈ ＸｈｏＩ 添付した図面の中で、ＤＮＡの操作に使用した制限部位
でリゲーションの際破壊したところは、破壊部位に対応
する省略記号をカッコで囲んで表示した。核酸配列によ
り予測しうる制限部位ではあるが、実際の制限酵素処理
により立証されていない個所は、星印を当該制限部位に
つけて表示した。
はピキア属の酵母の菌株からのＨＩＳ４を発見し、単離
し、及び特性化した。加えて本発明者は、ピキア属の酵
母の機能遺伝子の単離のための一般的手順を開発した。
本発明者が単離したこの新しい遺伝子は、ピキア属の酵
母菌株を宿主として用いる宿主／ベクター系内での遺伝
表現型の淘汰用マーカーとして有用である。本発明の他
のもう一つの実施態様により、本発明者は、培養培地中
のアミノ酸の存在の有無に応答性の調節領域を発見し、
単離し、特性化した。この調節領域は、例えば、酵母内
でのポリペプチド産物の制御された発現に有用である。
次の略号は、使用した制限酵素を表示するために、本明
細書を通して使用されている。略 号 制限酵素 Ｂ ＢａｍＨＩ Ｂ2 Ｂｇｌ II Ｃ ＣｌａＩ Ｈ3 Ｈｉｎｄ III Ｎｒ ＮｒｕＩ Ｐｓ ＰｓｔＩ Ｐｖ2 Ｐｖｕ II Ｒ1 ＥｃｏＲＩ Ｒ5 ＥｃｏＲＶ Ｓ ＳａｌＩ Ｓｍ ＳｍａＩ Ｓｐ ＳｐｈＩ Ｓｓ ＳｓｔＩ Ｓ3 Ｓａｕ３Ａ Ｔ ＴａｑＩ Ｘｂ ＸｂａＩ Ｘｈ ＸｈｏＩ 添付した図面の中で、ＤＮＡの操作に使用した制限部位
でリゲーションの際破壊したところは、破壊部位に対応
する省略記号をカッコで囲んで表示した。核酸配列によ
り予測しうる制限部位ではあるが、実際の制限酵素処理
により立証されていない個所は、星印を当該制限部位に
つけて表示した。
【０００６】この発明の一つの実施態様は、ピキア属の
酵母菌株から機能遺伝子の単離の方法を提供するもので
ある。この方法は、ピキア属遺伝子及び遺伝子産品がサ
ッカロミセス セレビシェ変異株の遺伝表現型における
欠損を相補する能力を有するという認識にもとづくもの
であり、それにより宿主変異株遺伝表現型を逆転する。
この方法は次の工程よりなる： (1) サッカロミセス セレビシエ欠損菌株の、エス・セ
レビシエ−大腸菌シャトルベクターに組換られたピキア
属の染色体ＤＮＡ断片での形質転換 (2) 特に特定の栄養素を欠くか又は欠損宿主菌株の成育
のために必要とされる条件を提供しない淘汰成育培地中
で生存し成長できる能力による形質転換菌株の選抜 (3) 当該選抜された形質転換菌株に含有されたプラスミ
ドから所望の遺伝子を含むピキアＤＮＡ断片の単離及び
回収。 ピキア属及びサッカロミセス属の微生物からの機能遺伝
子は、充分に類似しているので、良く特性が明らかにさ
れているサッカロミセス セレビシエ欠損菌株を、相補
的機能遺伝子をピキアから単離するために利用しうるこ
とを見出した。例えば、本発明者は、ピキアからサッカ
ロミセスＨＩＳ３及びＨＩＳ４遺伝子に相当する遺伝子
を分離した。本発明者が単離したこれらの新規な遺伝子
は、この開示に際しては、ピキアＨＩＳ３及びＨＩＳ４
遺伝子と称する。これらの新規の遺伝子は、エス・セレ
ビシエの適当な変異株をピキア染色体ＤＮＡのライブラ
リーで形質転換し、培地中でヒスチジンの補充なしで生
存する形質転換菌株を選抜することにより単離される。
ピキア染色体ＤＮＡのライブラリーでｌｅｕ２エス・セ
レビシエ変異株を形質転換し、培地中にロイシンの補充
がなされないままで生存する形質転換された菌株を選択
することによりピキアＬＥＵ２遺伝子を単離しうるであ
ろうことは当業者ならば承知している。同様に、ピキア
ＡＲＧ４遺伝子の分離も適当なエス・セレビシエ変異株
をピキア染色体ＤＮＡのライブラリーで形質転換し、淘
汰培地がアルギニンの補充がないことを除き、上記の如
き方法をくりかえすことにより可能となろう。
酵母菌株から機能遺伝子の単離の方法を提供するもので
ある。この方法は、ピキア属遺伝子及び遺伝子産品がサ
ッカロミセス セレビシェ変異株の遺伝表現型における
欠損を相補する能力を有するという認識にもとづくもの
であり、それにより宿主変異株遺伝表現型を逆転する。
この方法は次の工程よりなる： (1) サッカロミセス セレビシエ欠損菌株の、エス・セ
レビシエ−大腸菌シャトルベクターに組換られたピキア
属の染色体ＤＮＡ断片での形質転換 (2) 特に特定の栄養素を欠くか又は欠損宿主菌株の成育
のために必要とされる条件を提供しない淘汰成育培地中
で生存し成長できる能力による形質転換菌株の選抜 (3) 当該選抜された形質転換菌株に含有されたプラスミ
ドから所望の遺伝子を含むピキアＤＮＡ断片の単離及び
回収。 ピキア属及びサッカロミセス属の微生物からの機能遺伝
子は、充分に類似しているので、良く特性が明らかにさ
れているサッカロミセス セレビシエ欠損菌株を、相補
的機能遺伝子をピキアから単離するために利用しうるこ
とを見出した。例えば、本発明者は、ピキアからサッカ
ロミセスＨＩＳ３及びＨＩＳ４遺伝子に相当する遺伝子
を分離した。本発明者が単離したこれらの新規な遺伝子
は、この開示に際しては、ピキアＨＩＳ３及びＨＩＳ４
遺伝子と称する。これらの新規の遺伝子は、エス・セレ
ビシエの適当な変異株をピキア染色体ＤＮＡのライブラ
リーで形質転換し、培地中でヒスチジンの補充なしで生
存する形質転換菌株を選抜することにより単離される。
ピキア染色体ＤＮＡのライブラリーでｌｅｕ２エス・セ
レビシエ変異株を形質転換し、培地中にロイシンの補充
がなされないままで生存する形質転換された菌株を選択
することによりピキアＬＥＵ２遺伝子を単離しうるであ
ろうことは当業者ならば承知している。同様に、ピキア
ＡＲＧ４遺伝子の分離も適当なエス・セレビシエ変異株
をピキア染色体ＤＮＡのライブラリーで形質転換し、淘
汰培地がアルギニンの補充がないことを除き、上記の如
き方法をくりかえすことにより可能となろう。
【０００７】ピー・パストリスＮＲＲＬ Ｙ１１４３０
株（米国イリノイ州ＮＲＲＬに国際寄託済）から、全染
色体ＤＮＡのＳａｕ３Ａによる一部消化及び引き続いて
の蔗糖濃度勾配遠心法により、ＨＩＳ４遺伝子の分離を
行なった（実施例ＩＩ参照）。エス・セレビシエ−大腸
菌シャトルベクターＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５；
図１参照）のＢａｍＨＩ切断部位に、５ないし２０Ｋｂ
ｐの断片をクローン化し、大腸菌を形質転換した。約５
０，０００コロニーを一緒にし、全プラスミドＤＮＡを
抽出した。エス・セレビシエ５７９９−４Ｄ株（ＮＲＲ
ＬＹ−１５８５９米国イリノイ州ＮＲＲＬに国際寄託
済）、ｈｉｓ４ＡＢＣ変異株のスフェロプラストを約１
μｇのヒンネン等の方法（１９７８年）によるＹＥｐ１
３ピキアＤＮＡライブラリーと混合し、ヒスチジン欠損
培地で再生させた。全再生スフェロプラスト５×１０７
個から、形質転換体としては、約１×１０３コロニーの
原栄養性酵母が得られた。ＤＮＡなしで培養した比較対
照サンプルではコロニーの発生はなかった。２０のＨｉ
ｓ＋コロニーから全酵母ＤＮＡを抽出し、大腸菌を逆形
質転換させた。１７の酵母ＤＮＡ調製物がアンピシリン
抵抗性コロニーを形成した。これらのクローン化された
断片は制限酵素（切断物の）大きさ及び地図化並びに比
較的厳格でない条件下での標識されたエス・セレビシエ
ＨＩＳ４断片とクロスハイブリダイゼーション（ポスト
ハイブリダイゼーション洗浄は５５℃でＳＳＣを用い２
回実施；ＳＳＣは０．１５モルのＮａＣｌと１５ミリモ
ルのクエン酸ソーダを含み、ｐＨをＮａＯＨで７．０に
調整したもの）により更に特性が明らかにされた。この
プラスミドの大部分は、一つ以上のエス・セレビシエＨ
ＩＳ４遺伝子とハイブリッド化した断片を含有してい
た。そのうちの１つのＨＩＳ４含有プラスミドを再びク
ローン化して、ｐＹＪ８と命名したＨＩＳ４含有プラス
ミドが得られた（大腸菌に移入しＥ．ｃｏｌｉ ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１５８８９としてＮＲＲＬに国際寄託済）が、
それは第４図に示している。プラスミドｐＹＪ８はｐＢ
Ｒ３２５配列を含有し、この配列は機能的クロラムフェ
ニコール及びアンピシリン抵抗性遺伝子と更にピキアＨ
ＩＳ４遺伝子を含んでいる。
株（米国イリノイ州ＮＲＲＬに国際寄託済）から、全染
色体ＤＮＡのＳａｕ３Ａによる一部消化及び引き続いて
の蔗糖濃度勾配遠心法により、ＨＩＳ４遺伝子の分離を
行なった（実施例ＩＩ参照）。エス・セレビシエ−大腸
菌シャトルベクターＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５；
図１参照）のＢａｍＨＩ切断部位に、５ないし２０Ｋｂ
ｐの断片をクローン化し、大腸菌を形質転換した。約５
０，０００コロニーを一緒にし、全プラスミドＤＮＡを
抽出した。エス・セレビシエ５７９９−４Ｄ株（ＮＲＲ
ＬＹ−１５８５９米国イリノイ州ＮＲＲＬに国際寄託
済）、ｈｉｓ４ＡＢＣ変異株のスフェロプラストを約１
μｇのヒンネン等の方法（１９７８年）によるＹＥｐ１
３ピキアＤＮＡライブラリーと混合し、ヒスチジン欠損
培地で再生させた。全再生スフェロプラスト５×１０７
個から、形質転換体としては、約１×１０３コロニーの
原栄養性酵母が得られた。ＤＮＡなしで培養した比較対
照サンプルではコロニーの発生はなかった。２０のＨｉ
ｓ＋コロニーから全酵母ＤＮＡを抽出し、大腸菌を逆形
質転換させた。１７の酵母ＤＮＡ調製物がアンピシリン
抵抗性コロニーを形成した。これらのクローン化された
断片は制限酵素（切断物の）大きさ及び地図化並びに比
較的厳格でない条件下での標識されたエス・セレビシエ
ＨＩＳ４断片とクロスハイブリダイゼーション（ポスト
ハイブリダイゼーション洗浄は５５℃でＳＳＣを用い２
回実施；ＳＳＣは０．１５モルのＮａＣｌと１５ミリモ
ルのクエン酸ソーダを含み、ｐＨをＮａＯＨで７．０に
調整したもの）により更に特性が明らかにされた。この
プラスミドの大部分は、一つ以上のエス・セレビシエＨ
ＩＳ４遺伝子とハイブリッド化した断片を含有してい
た。そのうちの１つのＨＩＳ４含有プラスミドを再びク
ローン化して、ｐＹＪ８と命名したＨＩＳ４含有プラス
ミドが得られた（大腸菌に移入しＥ．ｃｏｌｉ ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１５８８９としてＮＲＲＬに国際寄託済）が、
それは第４図に示している。プラスミドｐＹＪ８はｐＢ
Ｒ３２５配列を含有し、この配列は機能的クロラムフェ
ニコール及びアンピシリン抵抗性遺伝子と更にピキアＨ
ＩＳ４遺伝子を含んでいる。
【０００８】
オリジンからの
制限酵素 切断部位 距離 (pb)
Ｒ1 ４ ２００，３９００，
４９００，５０５０
Ｘｂ ２ ４５０，３４００
Ｂ ２ ７００，１１００
Ｂ2 ２ ７５０，３５００
Ｐｖ2 ２ ８５０，４３００
Ｓ １ ２３００
Ｘｈ １ ４１００
Ｃ ２ ４５５０，５１００
Ｈ3 １ ５５５０
この６．０Kbp 断片のサブクローン化により、このピキ
アＤＮＡの２．７KbpＢｇｌ II 断片はＨＩＳ４Ａ、Ｈ
ＩＳ４Ｂ又はＨＩＳ４Ｃの遺伝子が指定する遺伝情報に
よる活性を欠くピキア又はサッカロミセスを形質転換で
きる能力を有していることが判明した。それ故、例えば
ｈｉｓ+ 変異株であるピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ
−１５８５１（ＧＳ−１１５）株は、プラスミドｐＢＰ
ｆ１（実施例II及び第５図参照）で形質転換すると、ヒ
スチジンの添加されていない培地中でも成育できる。プ
ラスミドｐＢＰｆ１は、図３ｂの図面に示したピキア染
色体ＤＮＡの２．７Kbp Ｂｇｌ II 断片を含有する。
アＤＮＡの２．７KbpＢｇｌ II 断片はＨＩＳ４Ａ、Ｈ
ＩＳ４Ｂ又はＨＩＳ４Ｃの遺伝子が指定する遺伝情報に
よる活性を欠くピキア又はサッカロミセスを形質転換で
きる能力を有していることが判明した。それ故、例えば
ｈｉｓ+ 変異株であるピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ
−１５８５１（ＧＳ−１１５）株は、プラスミドｐＢＰ
ｆ１（実施例II及び第５図参照）で形質転換すると、ヒ
スチジンの添加されていない培地中でも成育できる。プ
ラスミドｐＢＰｆ１は、図３ｂの図面に示したピキア染
色体ＤＮＡの２．７Kbp Ｂｇｌ II 断片を含有する。
【０００９】ｐＢＰｆ１の利用性を高めるために、ピキ
アＨＩＳ４遺伝子を含む２．７KbpＢｇｌ II 断片内に
あるＢａｍＨＩ切断部位をｐＢＰｆ１に挿入するに先き
立って破壊した。かくして、他にはＢａｍＨＩ切断部位
を有さないベクター中に含まれたこのピキアＨＩＳ４遺
伝子をＢａｍＨＩで切断し、得られた接着末端を、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩの存在下で平滑末端を生産するために
４つの全デオキシヌクレオチドの混合物で満した。新た
に形成された平滑末端をリゲートして、ＢａｍＨＩによ
る認識部位を有しない修飾されたＨＩＳ４遺伝子を得
た。この修飾されたＨＩＳ４遺伝子は、プラスミドｐＢ
ＰｆＩの構築に使用された２．７Kbp Ｂｇｌ II 断片の
給源であった。この破壊されたＢａｍＨＩ切断部位の位
置は図４中ではＢ* 記号により示している。ｐＢＰｆＩ
のポリリンカーにおけるこのＢａｍＨＩ切断部位は、当
該ベクターにとっては、特異的な制限（酵素）切断部位
であることを留意されたい。加えて、更に特異的Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳｍａＩの制限（酵素）切断部位がｐＢＰｆ１
をして形質転換されたピキア パストリスにおける遺伝
子産物の発現を促進及び／又は抑制するためにＤＮＡ断
片の能力を探索するための有用なベクターとする。この
発明のもう１つ別の実施態様により、培養培地中でのア
ミノ酸の存在の有無に応答性の調節領域よりなる１つの
ＤＮＡ断片を単離し、特性を明らかにした。かくして、
図３ｃにおいて、ピキアＨＩＳ４遺伝子を含む６．０Kb
p 断片の５′末端から得たＤＮＡの約６００pbのＥｃｏ
ＲＩ−Ｐｖｕ II 断片を示す。この断片は、培養培地中
でのアミノ酸の存在の有無に応答性である。本願明細書
中では、培地中のアミノ酸の存在の有無に応答性とは以
下の如き意味を有する。即ち、ＹＰＤなどの富化培地中
では、調節領域は“オフ”状態となる。つまり、ピキア
ＨＩＳ４遺伝子の遺伝情報による生産物は全く合成され
ないのである。逆に、培養培地中でヒスチジンが低濃度
でしか存在しない場合には、当該調節領域は“オン”の
状態となる。つまり、ピキアＨＩＳ４遺伝子の遺伝情報
による生産物が合成される。このように培養培地中の特
定のアミノ酸の存在に対してその機能が発現し又は発現
しないことを応答性という。
アＨＩＳ４遺伝子を含む２．７KbpＢｇｌ II 断片内に
あるＢａｍＨＩ切断部位をｐＢＰｆ１に挿入するに先き
立って破壊した。かくして、他にはＢａｍＨＩ切断部位
を有さないベクター中に含まれたこのピキアＨＩＳ４遺
伝子をＢａｍＨＩで切断し、得られた接着末端を、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩの存在下で平滑末端を生産するために
４つの全デオキシヌクレオチドの混合物で満した。新た
に形成された平滑末端をリゲートして、ＢａｍＨＩによ
る認識部位を有しない修飾されたＨＩＳ４遺伝子を得
た。この修飾されたＨＩＳ４遺伝子は、プラスミドｐＢ
ＰｆＩの構築に使用された２．７Kbp Ｂｇｌ II 断片の
給源であった。この破壊されたＢａｍＨＩ切断部位の位
置は図４中ではＢ* 記号により示している。ｐＢＰｆＩ
のポリリンカーにおけるこのＢａｍＨＩ切断部位は、当
該ベクターにとっては、特異的な制限（酵素）切断部位
であることを留意されたい。加えて、更に特異的Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳｍａＩの制限（酵素）切断部位がｐＢＰｆ１
をして形質転換されたピキア パストリスにおける遺伝
子産物の発現を促進及び／又は抑制するためにＤＮＡ断
片の能力を探索するための有用なベクターとする。この
発明のもう１つ別の実施態様により、培養培地中でのア
ミノ酸の存在の有無に応答性の調節領域よりなる１つの
ＤＮＡ断片を単離し、特性を明らかにした。かくして、
図３ｃにおいて、ピキアＨＩＳ４遺伝子を含む６．０Kb
p 断片の５′末端から得たＤＮＡの約６００pbのＥｃｏ
ＲＩ−Ｐｖｕ II 断片を示す。この断片は、培養培地中
でのアミノ酸の存在の有無に応答性である。本願明細書
中では、培地中のアミノ酸の存在の有無に応答性とは以
下の如き意味を有する。即ち、ＹＰＤなどの富化培地中
では、調節領域は“オフ”状態となる。つまり、ピキア
ＨＩＳ４遺伝子の遺伝情報による生産物は全く合成され
ないのである。逆に、培養培地中でヒスチジンが低濃度
でしか存在しない場合には、当該調節領域は“オン”の
状態となる。つまり、ピキアＨＩＳ４遺伝子の遺伝情報
による生産物が合成される。このように培養培地中の特
定のアミノ酸の存在に対してその機能が発現し又は発現
しないことを応答性という。
【００１０】この新規の調節領域の制御下でのポリペプ
チド生産の調節は図４に示した新しいプラスミドｐＢＰ
ｆ３により実証された。当該プラスミドは、なかんず
く、当該ＨＩＳ４調節領域と当該ＬａｃＺ遺伝子を含有
する。プラスミドｐＢＰｆ３で形質転換したピキア パ
ストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１はヒスチジン欠缺
培地中で成育させるとかなりの量のβ−ガラクトシダー
ゼを生産するが、ヒスチジンを含有するＹＰＤなどの富
化培地で成育させるとすくなくとも１０分の１未満のβ
−ガラクトシダーゼを生産するにすぎない。
チド生産の調節は図４に示した新しいプラスミドｐＢＰ
ｆ３により実証された。当該プラスミドは、なかんず
く、当該ＨＩＳ４調節領域と当該ＬａｃＺ遺伝子を含有
する。プラスミドｐＢＰｆ３で形質転換したピキア パ
ストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１はヒスチジン欠缺
培地中で成育させるとかなりの量のβ−ガラクトシダー
ゼを生産するが、ヒスチジンを含有するＹＰＤなどの富
化培地で成育させるとすくなくとも１０分の１未満のβ
−ガラクトシダーゼを生産するにすぎない。
【００１１】
【実施例】以下の実施例で使用する緩衝液及び溶液の組
成は次の通りである。 １モル トリス緩衝液： ８００mlの水に１２１．１ｇのトリス塩基、pHを所望 の値に濃塩酸（３５％）を加えて調整。最終pH調整前に溶液を室 温まで冷却し、最終液量を１リットルとする。 デンハート（Denhardt's) 氏溶液： ５ｇのファイコール（Ficoll) ５ｇのポリビニルピロリドン ５ｇの牛の血精アルブミン（ＢＳＡ；ペンタックスフラクション Ｖ）水で全量を５００mlとする。 ＴＥ緩衝液： １．０ミリモルＥＤＴＡを０．０１モルのトリス緩衝液（pH＝７ ．４）に添加 ＬＢ（Luria-Bertani)培地：５ｇのバクト−トリプトン ５ｇのバクト−イースト抽出物 ２．５ｇの NaCl を１リットルの水に含み、pHは７．５にNaOHで調整 ２Ｂ培地 ： ０．２％ NH4PO4 １．２％ Na2PO4 ０．０１３％ MgSO4・７H2O ０．０７４％ CaCl2・２H2O １μｇ／mlチアミン ０．４％デキストローズ ＹＰＤ培地： １％のバクト−イースト抽出物 ２％のバクト−ペプトン ２％のデキストローズ ＳＤ培地 ： ６．７５ｇのアミノ酸を含まない酵母用窒素基剤（ＤＩＦＣＯ製 ） ２％のデキストローズ を１リットルの水に含む。 ＨＡＭ ： ０．６７％のアミノ酸を含まない酵母用窒素基剤（ＤＩＦＣＯ製 ） １％デキストローズ ２％ヒスチジン測定用培地（ＤＩＦＣＯ製） 各５０μｇ／mlの イソロイシン ロイシン リジン メチオニン グルタミン ＳＥＤ ： １モルのソルビトール ２５ミリモルのＥＤＴＡ ５０ミリモルのＤＴＴ ＳＣＥ緩衝液：９．１ｇのソルビトール １．４７ｇのクエン酸ソーダ ０．１６８ｇのＥＤＴＡ ５０mlの H2O pHを HClで５．８とする。 ＣａＳ ： １モルのソルビトール １ミリモルの CaCl2 濾過後、滅菌 ＰＥＧ溶液： ２０％のポリエチレングリコール−３３５０ １０ミリモルのCaCl2 １０ミリモルのトリス塩酸塩 （pH７．４） 濾過後、滅菌 ＳＯＳ ： １モルのソルビトール ０．３倍のＹＰＤ培地 １０ミリモルのCaCl2 次の略号を実施例で使用しているが、以下の意味を有す
るものである。 ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸 ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ソーダ ＤＴＴ＝ジチオスレイトール(dithiothreitol)
成は次の通りである。 １モル トリス緩衝液： ８００mlの水に１２１．１ｇのトリス塩基、pHを所望 の値に濃塩酸（３５％）を加えて調整。最終pH調整前に溶液を室 温まで冷却し、最終液量を１リットルとする。 デンハート（Denhardt's) 氏溶液： ５ｇのファイコール（Ficoll) ５ｇのポリビニルピロリドン ５ｇの牛の血精アルブミン（ＢＳＡ；ペンタックスフラクション Ｖ）水で全量を５００mlとする。 ＴＥ緩衝液： １．０ミリモルＥＤＴＡを０．０１モルのトリス緩衝液（pH＝７ ．４）に添加 ＬＢ（Luria-Bertani)培地：５ｇのバクト−トリプトン ５ｇのバクト−イースト抽出物 ２．５ｇの NaCl を１リットルの水に含み、pHは７．５にNaOHで調整 ２Ｂ培地 ： ０．２％ NH4PO4 １．２％ Na2PO4 ０．０１３％ MgSO4・７H2O ０．０７４％ CaCl2・２H2O １μｇ／mlチアミン ０．４％デキストローズ ＹＰＤ培地： １％のバクト−イースト抽出物 ２％のバクト−ペプトン ２％のデキストローズ ＳＤ培地 ： ６．７５ｇのアミノ酸を含まない酵母用窒素基剤（ＤＩＦＣＯ製 ） ２％のデキストローズ を１リットルの水に含む。 ＨＡＭ ： ０．６７％のアミノ酸を含まない酵母用窒素基剤（ＤＩＦＣＯ製 ） １％デキストローズ ２％ヒスチジン測定用培地（ＤＩＦＣＯ製） 各５０μｇ／mlの イソロイシン ロイシン リジン メチオニン グルタミン ＳＥＤ ： １モルのソルビトール ２５ミリモルのＥＤＴＡ ５０ミリモルのＤＴＴ ＳＣＥ緩衝液：９．１ｇのソルビトール １．４７ｇのクエン酸ソーダ ０．１６８ｇのＥＤＴＡ ５０mlの H2O pHを HClで５．８とする。 ＣａＳ ： １モルのソルビトール １ミリモルの CaCl2 濾過後、滅菌 ＰＥＧ溶液： ２０％のポリエチレングリコール−３３５０ １０ミリモルのCaCl2 １０ミリモルのトリス塩酸塩 （pH７．４） 濾過後、滅菌 ＳＯＳ ： １モルのソルビトール ０．３倍のＹＰＤ培地 １０ミリモルのCaCl2 次の略号を実施例で使用しているが、以下の意味を有す
るものである。 ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸 ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ソーダ ＤＴＴ＝ジチオスレイトール(dithiothreitol)
【００１２】実施例Ｉ ピキア パストリスの形質転換手順
Ａ 細胞の成育
1. ＹＰＤ培地約１０ml中へピキア パストリスＧＳ１
１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）のコロニーを植えつ
け、３０℃で１２−２０時間振とう培養する。 2. 約１２−２０時間後、ＯＤ600 で約０．０１から
０．１となるように細胞を希釈し、ＹＰＤ培地中で３０
℃で約６〜８時間細胞を対数増殖期に保持する。 3. 約６〜８時間後、ＯＤ600 で約０．１（又はその相
当量）の種培養０．５mlを、ＹＰＤ培地１００mlに植付
ける。３０℃で約１２−２０時間振とう培養する。 4. ＯＤ600 が約０．２−０．３となったとき（約１６
−２０時間後）培養物を１５００Ｇで５分間遠心分離
し、回収する。 Ｂ スフェロプラストの調製 1. 細胞を１度１０mlの滅菌水中で洗う。（ステップ１
ないし５の遠心分離はすべて１５００Ｇ、５分間であ
る）。 2. 新たに調製したＳＥＤ１０ml中で細胞を洗う。 3. 滅菌１モルソルビトール溶液１０ml中で細胞を２度
洗う。 4. １０mlのＳＣＥ緩衝液に細胞を再分散する。 5. チモリアーゼ６０，０００（マイルズ ラボラトリ
ーズ社製）ml当り４mg含む溶液を５−１０μｌ加える。
約３０−６０分、３０℃で細胞をインキュベートする。
スフェロプラストの調製は形質転換手順においては、危
険をはらんだ工程であるため、スフェロプラストの形成
を次の如くモニターする必要がある。細胞（を含む液）
１００μｌを９００μｌの５％ＳＤＳ及び９００μｌの
１モルのソルビトールに、チモリアーゼの添加前又は添
加直後及びインキュベート期間中種々な間隔で加える。
ＳＤＳ中では細胞が溶解するが、ソルビトール中では溶
解しない点（通常３０から６０分のインキュベーショ
ン）でインキュベーションを停める。 6. スフェロプラストを滅菌した１モルのソルビトール
１０ml中で、１，０００Ｇで５−１０分遠心分離しなが
ら二度洗浄する（遠心分離のための時間及び速度は変動
する。スフェロプラストがペレット化するに充分なだけ
遠心分離する。しかし、その力で破壊されるほどであっ
てはならない）。 7. 滅菌したCaS １０ml中で１度洗う。 8. 全量で０．６mlのCaS に細胞を再分散させる。
１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）のコロニーを植えつ
け、３０℃で１２−２０時間振とう培養する。 2. 約１２−２０時間後、ＯＤ600 で約０．０１から
０．１となるように細胞を希釈し、ＹＰＤ培地中で３０
℃で約６〜８時間細胞を対数増殖期に保持する。 3. 約６〜８時間後、ＯＤ600 で約０．１（又はその相
当量）の種培養０．５mlを、ＹＰＤ培地１００mlに植付
ける。３０℃で約１２−２０時間振とう培養する。 4. ＯＤ600 が約０．２−０．３となったとき（約１６
−２０時間後）培養物を１５００Ｇで５分間遠心分離
し、回収する。 Ｂ スフェロプラストの調製 1. 細胞を１度１０mlの滅菌水中で洗う。（ステップ１
ないし５の遠心分離はすべて１５００Ｇ、５分間であ
る）。 2. 新たに調製したＳＥＤ１０ml中で細胞を洗う。 3. 滅菌１モルソルビトール溶液１０ml中で細胞を２度
洗う。 4. １０mlのＳＣＥ緩衝液に細胞を再分散する。 5. チモリアーゼ６０，０００（マイルズ ラボラトリ
ーズ社製）ml当り４mg含む溶液を５−１０μｌ加える。
約３０−６０分、３０℃で細胞をインキュベートする。
スフェロプラストの調製は形質転換手順においては、危
険をはらんだ工程であるため、スフェロプラストの形成
を次の如くモニターする必要がある。細胞（を含む液）
１００μｌを９００μｌの５％ＳＤＳ及び９００μｌの
１モルのソルビトールに、チモリアーゼの添加前又は添
加直後及びインキュベート期間中種々な間隔で加える。
ＳＤＳ中では細胞が溶解するが、ソルビトール中では溶
解しない点（通常３０から６０分のインキュベーショ
ン）でインキュベーションを停める。 6. スフェロプラストを滅菌した１モルのソルビトール
１０ml中で、１，０００Ｇで５−１０分遠心分離しなが
ら二度洗浄する（遠心分離のための時間及び速度は変動
する。スフェロプラストがペレット化するに充分なだけ
遠心分離する。しかし、その力で破壊されるほどであっ
てはならない）。 7. 滅菌したCaS １０ml中で１度洗う。 8. 全量で０．６mlのCaS に細胞を再分散させる。
【００１３】Ｃ 形質転換
1. ＤＮＡのサンプル（２０μｌの容量まで）を１２×
７５mmの滅菌したポリプロピレン管に加える（ＤＮＡは
水又はＴＥ緩衝液中に分散されていること；少量のＤＮ
Ａで最大限の形質転換頻度を上げるためには各サンプル
に、超音波処理した大腸菌を５mg／ml含む溶液１μｌを
加えるのが好ましい）。 2. １００μｌのスフェロプラストを各ＤＮＡサンプル
に加えて、室温で約２０分間インキュベートする。 3. １mlのＰＥＧ溶液を各サンプルに１ml加え、室温で
約２０分間インキュベートする。 4. サンプルを１５００Ｇで５〜１０分間遠心分離し、
ＰＥＧ溶液をデカンテーションにより除く。 5. サンプルを、ＳＯＳ１５０μｌ中に再分散し、室温
で３０分間インキュベートする。 6. 滅菌した１モルのソルビトール溶液８５０μｌを加
え、以下に記載した様に適当量のサンプルを取り平板増
着する。 Ｄ スフェロプラストの再生 1. 再生用寒天培地の組成 a. 寒天−ソルビトール培地；９ｇのバクト寒天、５
４．６ｇのソルビトール、２４０mlの水、高温滅菌す
る。 b. グルコース１０倍培地；２０ｇのデキストローズ、
１００mlの水、高温滅菌する。 c. ＳＣ１０倍培地；６．７５ｇのアミノ酸を含まない
酵母窒素基材、１００mlの水、高温滅菌する（所望のア
ミノ酸又は核酸を２００μｇ／mlの濃度まで高温滅菌前
又はその後に加える） d. ３０mlのグルコース１０倍培地及び３０mlのＳＣ１
０倍培地を３００mlの溶解した寒天−ソルビトール溶液
に加える。０．２mg／mlのビオチン液０．６ml、及び所
望のアミノ酸又は核酸を２０μｇ／mlの濃度まで加え
る。溶解した再生用寒天培地を５５−６０℃に保つ。
７５mmの滅菌したポリプロピレン管に加える（ＤＮＡは
水又はＴＥ緩衝液中に分散されていること；少量のＤＮ
Ａで最大限の形質転換頻度を上げるためには各サンプル
に、超音波処理した大腸菌を５mg／ml含む溶液１μｌを
加えるのが好ましい）。 2. １００μｌのスフェロプラストを各ＤＮＡサンプル
に加えて、室温で約２０分間インキュベートする。 3. １mlのＰＥＧ溶液を各サンプルに１ml加え、室温で
約２０分間インキュベートする。 4. サンプルを１５００Ｇで５〜１０分間遠心分離し、
ＰＥＧ溶液をデカンテーションにより除く。 5. サンプルを、ＳＯＳ１５０μｌ中に再分散し、室温
で３０分間インキュベートする。 6. 滅菌した１モルのソルビトール溶液８５０μｌを加
え、以下に記載した様に適当量のサンプルを取り平板増
着する。 Ｄ スフェロプラストの再生 1. 再生用寒天培地の組成 a. 寒天−ソルビトール培地；９ｇのバクト寒天、５
４．６ｇのソルビトール、２４０mlの水、高温滅菌す
る。 b. グルコース１０倍培地；２０ｇのデキストローズ、
１００mlの水、高温滅菌する。 c. ＳＣ１０倍培地；６．７５ｇのアミノ酸を含まない
酵母窒素基材、１００mlの水、高温滅菌する（所望のア
ミノ酸又は核酸を２００μｇ／mlの濃度まで高温滅菌前
又はその後に加える） d. ３０mlのグルコース１０倍培地及び３０mlのＳＣ１
０倍培地を３００mlの溶解した寒天−ソルビトール溶液
に加える。０．２mg／mlのビオチン液０．６ml、及び所
望のアミノ酸又は核酸を２０μｇ／mlの濃度まで加え
る。溶解した再生用寒天培地を５５−６０℃に保つ。
【００１４】2. 形質転換したサンプルの平板培養
形質転換サンプルが用意できる少なくとも３０分前に、
プレートあたり１０mlの再生用寒天培地よりなる基底部
寒天層を注ぐ。試験管に再生用寒天培地１０mlを、形質
転換サンプルがＳＯＳ中に入れてある間に、４５−５０
℃のバス上で、分散させる。再生用寒天培地の入った試
験管に適当量の形質転換サンプルを加え、プレート内の
基底部寒天層上に注ぐ。４５−５０℃に保った溶融状態
の再生用寒天培地１０mlにそれぞれのサンプルを適当量
加え、再生用寒天培地よりなる固まった１０mlの基底部
寒天層上にそれぞれを注ぐ。 3. スフェロプラスト調製品の品質の決定 １サンプル当り１０μｌをとり、１Ｍのソルビトール９
９０μｌを加えて１００倍に希釈する。１００倍希釈液
を１０μｌとり、９９０μｌ量の１Ｍのソルビトールを
再び加えて更に１００倍希釈する。ＹＰＤ培地上に上記
二つの希釈液１００μｌを、調製品中にスフェロプラス
ト化されずに残存している完全細胞の濃度を測定するた
め、ＹＰＤ寒天培地上に塗布する。４０μｇ／mlヒスチ
ジンを加えた再生寒天１０mlに、全再生可能なスフェロ
プラストを測定するため各希釈液を１００μｌ加える。
形質転換実験のための良好な値としては、ml当り１−３
×１０7 の全再生可能なスフェロプラストとml当り約１
×１０3 の完全細胞である。
プレートあたり１０mlの再生用寒天培地よりなる基底部
寒天層を注ぐ。試験管に再生用寒天培地１０mlを、形質
転換サンプルがＳＯＳ中に入れてある間に、４５−５０
℃のバス上で、分散させる。再生用寒天培地の入った試
験管に適当量の形質転換サンプルを加え、プレート内の
基底部寒天層上に注ぐ。４５−５０℃に保った溶融状態
の再生用寒天培地１０mlにそれぞれのサンプルを適当量
加え、再生用寒天培地よりなる固まった１０mlの基底部
寒天層上にそれぞれを注ぐ。 3. スフェロプラスト調製品の品質の決定 １サンプル当り１０μｌをとり、１Ｍのソルビトール９
９０μｌを加えて１００倍に希釈する。１００倍希釈液
を１０μｌとり、９９０μｌ量の１Ｍのソルビトールを
再び加えて更に１００倍希釈する。ＹＰＤ培地上に上記
二つの希釈液１００μｌを、調製品中にスフェロプラス
ト化されずに残存している完全細胞の濃度を測定するた
め、ＹＰＤ寒天培地上に塗布する。４０μｇ／mlヒスチ
ジンを加えた再生寒天１０mlに、全再生可能なスフェロ
プラストを測定するため各希釈液を１００μｌ加える。
形質転換実験のための良好な値としては、ml当り１−３
×１０7 の全再生可能なスフェロプラストとml当り約１
×１０3 の完全細胞である。
【００１５】4. 平板培地を３０℃で３−５日間培養す
る。実施例 II ピキア パストリスＨＩＳ４遺伝子の分離 Ａ．菌株 使用した菌株は次の通りである。 (a) ピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０株 (b) ピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１
（ＧＳ１１５−ｈｉｓ４） (c) エス・セレビシエ５７９９−４Ｄ株（ｈｉｓ４−２
６０ ｈｉｓ４−３９；ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５９）、
及び (d) 大腸菌８４８株（ F- met thi gal T1 R φ80S h
sd R- hsd M+ ） Ｂ．プラスミド ｐＹＡ２は、ｐＢＲ３２５のＰｓｔＩ部位に挿入された
９．３Kb ＰｓｔＩ断片上のエス・セレビシエのＨＩＳ
４遺伝子より構成されて居り、それはエス・セレビシエ
ＨＩＳ４遺伝子断片の給源であり、大腸菌宿主に移入し
てありＮＲＲＬＢ−１５８７４として公衆が入手可能で
ある。ＹＥｐ１３はアメリカンタイプカルチャーコレク
ションから入手可能であり、寄託番号はＡＴＣＣ３７１
１５が割り当てられている。
る。実施例 II ピキア パストリスＨＩＳ４遺伝子の分離 Ａ．菌株 使用した菌株は次の通りである。 (a) ピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０株 (b) ピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１
（ＧＳ１１５−ｈｉｓ４） (c) エス・セレビシエ５７９９−４Ｄ株（ｈｉｓ４−２
６０ ｈｉｓ４−３９；ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５９）、
及び (d) 大腸菌８４８株（ F- met thi gal T1 R φ80S h
sd R- hsd M+ ） Ｂ．プラスミド ｐＹＡ２は、ｐＢＲ３２５のＰｓｔＩ部位に挿入された
９．３Kb ＰｓｔＩ断片上のエス・セレビシエのＨＩＳ
４遺伝子より構成されて居り、それはエス・セレビシエ
ＨＩＳ４遺伝子断片の給源であり、大腸菌宿主に移入し
てありＮＲＲＬＢ−１５８７４として公衆が入手可能で
ある。ＹＥｐ１３はアメリカンタイプカルチャーコレク
ションから入手可能であり、寄託番号はＡＴＣＣ３７１
１５が割り当てられている。
【００１６】Ｃ．培地 ピキア
パストリスはＹＰＤ（富化）培地又はＩＭＧ
（最少）培地で成育させた。ＩＭＧ、最少培地、は次の
ものより構成されている。 1. ＩＭ1 塩類、最終濃度で３６．７ミリモルのKH2P
O4、２２．７ミリモルの(NH4)2SO4 、２．０ミリモルの
MgSO4・７H2O 、６．７ミリモルのKCl 、０．７ミリモ
ルの CaCl2・２H2O ；１０倍の貯蔵液として調製し、高
温滅菌したもの。 2. 微量塩類、最終濃度で０．２マイクロモルの CuSO4
・５H2O 、１．２５マイクロモルのＫＩ、４．５マイク
ロモルの MnSO4・H2O 、２．０マイクロモルのNaMoO4・
２H2O 、０．７５マイクロモルのH3BO3 、１７．５マイ
クロモルの ZnSO4・７H2O 、４４．５マイクロモルの F
eCl3・６H2O ４００倍貯蔵液として調製し、濾液を滅
菌した。 3. ０．４μｇ／mlのビオチン及び 4. ２％デキストローズ 大腸菌はＬＢ培地又は２Ｂ培地１００μｌ／mlのトリプ
トファン及び０．２％カザミノ酸を追加添加したもので
培養した。
（最少）培地で成育させた。ＩＭＧ、最少培地、は次の
ものより構成されている。 1. ＩＭ1 塩類、最終濃度で３６．７ミリモルのKH2P
O4、２２．７ミリモルの(NH4)2SO4 、２．０ミリモルの
MgSO4・７H2O 、６．７ミリモルのKCl 、０．７ミリモ
ルの CaCl2・２H2O ；１０倍の貯蔵液として調製し、高
温滅菌したもの。 2. 微量塩類、最終濃度で０．２マイクロモルの CuSO4
・５H2O 、１．２５マイクロモルのＫＩ、４．５マイク
ロモルの MnSO4・H2O 、２．０マイクロモルのNaMoO4・
２H2O 、０．７５マイクロモルのH3BO3 、１７．５マイ
クロモルの ZnSO4・７H2O 、４４．５マイクロモルの F
eCl3・６H2O ４００倍貯蔵液として調製し、濾液を滅
菌した。 3. ０．４μｇ／mlのビオチン及び 4. ２％デキストローズ 大腸菌はＬＢ培地又は２Ｂ培地１００μｌ／mlのトリプ
トファン及び０．２％カザミノ酸を追加添加したもので
培養した。
【００１７】Ｄ．ＤＮＡ分離
1. 酵素ＤＮＡの大規模調製 ピキア
パストリス及びエス・セレビシエＤＮＡ調製
は、酵母細胞をＡ600 が１−２となるまで最少培地１０
０mlを成育させ、次いで２，０００Ｇで５分間遠心分離
して細胞を回収することにより行なった。当該細胞を
水、ＳＥＤ、１モルのソルビトール中でそれぞれ１度洗
浄し、次いで１Ｍのソルビトールに分散した細胞を５ml
の０．１モルのトリス−塩酸（pH＝７．０）に分散し
た。細胞をチモラーゼ６０，０００（マイルズ ラボラ
トリーズ社製）の４mg／ml溶液５０−１００μｌと混合
して、細胞壁を消化するために１時間３０℃でインキュ
ベートした。スフェロプラスト調製品を１，０００Ｇで
５−１０分間遠心分離し、溶菌用緩衝液（０．１％ＳＤ
Ｓ、１０ミリモルのトリス−塩酸（pH７．４）、５ミリ
モルのＥＤＴＡ及び５０ミリモルのNaCl）に懸濁した。
プロテナーゼＫ（ベーリンガー マンハイム社製）及び
ＲＮナーゼＡ（シグマ社製）それぞれ１００μｌ／mlの
割合で加え、混合物を３７℃３０分間インキュベートし
た。ＤＮＡは、イソアミルアルコールを含有するクロロ
ホルム（２４：１、ｖ／ｖ）を当該調製物と等量しずか
に混合し、蛋白を除き、各相を１２，０００Ｇで２０分
間遠心分離することにより分離した。上の（水）相を新
しい試験管に移し、当量のフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ／ｖ）
混合液で抽出した。各相を前と同様分離し、最上相を２
−３倍量の冷１００％エタノールを含む試験管に入れ
た。サンプルをしずかに混合し、ＤＮＡをプラスチック
製棒の上にまきつけて回収した。当該ＤＮＡをただちに
１mlのＴＥ緩衝液に溶解し、１００倍量のＴＥ緩衝液で
４０℃で１晩透析した。
は、酵母細胞をＡ600 が１−２となるまで最少培地１０
０mlを成育させ、次いで２，０００Ｇで５分間遠心分離
して細胞を回収することにより行なった。当該細胞を
水、ＳＥＤ、１モルのソルビトール中でそれぞれ１度洗
浄し、次いで１Ｍのソルビトールに分散した細胞を５ml
の０．１モルのトリス−塩酸（pH＝７．０）に分散し
た。細胞をチモラーゼ６０，０００（マイルズ ラボラ
トリーズ社製）の４mg／ml溶液５０−１００μｌと混合
して、細胞壁を消化するために１時間３０℃でインキュ
ベートした。スフェロプラスト調製品を１，０００Ｇで
５−１０分間遠心分離し、溶菌用緩衝液（０．１％ＳＤ
Ｓ、１０ミリモルのトリス−塩酸（pH７．４）、５ミリ
モルのＥＤＴＡ及び５０ミリモルのNaCl）に懸濁した。
プロテナーゼＫ（ベーリンガー マンハイム社製）及び
ＲＮナーゼＡ（シグマ社製）それぞれ１００μｌ／mlの
割合で加え、混合物を３７℃３０分間インキュベートし
た。ＤＮＡは、イソアミルアルコールを含有するクロロ
ホルム（２４：１、ｖ／ｖ）を当該調製物と等量しずか
に混合し、蛋白を除き、各相を１２，０００Ｇで２０分
間遠心分離することにより分離した。上の（水）相を新
しい試験管に移し、当量のフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ／ｖ）
混合液で抽出した。各相を前と同様分離し、最上相を２
−３倍量の冷１００％エタノールを含む試験管に入れ
た。サンプルをしずかに混合し、ＤＮＡをプラスチック
製棒の上にまきつけて回収した。当該ＤＮＡをただちに
１mlのＴＥ緩衝液に溶解し、１００倍量のＴＥ緩衝液で
４０℃で１晩透析した。
【００１８】2. 小規模酵母ＤＮＡ調製
Ａ600 で１−５でなるまで５mlの酵母の培養物を最少培
地で成長させ、次いで２，０００Ｇで５分間遠心分離
し、収集した。細胞を１mlのＳＥＤに懸濁し、１．５ml
の極小遠心管に移し、１モルのソルビトール中で１度洗
い、１モルのソルビトールに分散させた細胞を０．１モ
ルトリス塩酸（pH７．４）０．５ml中に懸濁した。チモ
リアーゼ６０，０００（マイル ラボラトリーズ社；４
mg／mlの溶液を１０μｌ）各サンプルに加え、当該細胞
を３０℃で、３０−６０分間インキュベートした。細胞
は次いで１分間遠心分離し、溶菌用緩衝液中に懸濁し、
６５−７０℃でインキュベートした。１５分後にサンプ
ルを５モルの酢酸カリウム１００μｌと混合し、氷浴中
に１５分間保持し、５分間遠心分離した。上澄液を１０
０％のエタノール１mlを含む新しい極小遠心管中へデカ
ンテーションし、混合後ただちに１０秒間遠心分離し
た。最終的にペレットを１０−１５分間風乾し、５μｌ
のＴＥ緩衝液に溶かした。
地で成長させ、次いで２，０００Ｇで５分間遠心分離
し、収集した。細胞を１mlのＳＥＤに懸濁し、１．５ml
の極小遠心管に移し、１モルのソルビトール中で１度洗
い、１モルのソルビトールに分散させた細胞を０．１モ
ルトリス塩酸（pH７．４）０．５ml中に懸濁した。チモ
リアーゼ６０，０００（マイル ラボラトリーズ社；４
mg／mlの溶液を１０μｌ）各サンプルに加え、当該細胞
を３０℃で、３０−６０分間インキュベートした。細胞
は次いで１分間遠心分離し、溶菌用緩衝液中に懸濁し、
６５−７０℃でインキュベートした。１５分後にサンプ
ルを５モルの酢酸カリウム１００μｌと混合し、氷浴中
に１５分間保持し、５分間遠心分離した。上澄液を１０
０％のエタノール１mlを含む新しい極小遠心管中へデカ
ンテーションし、混合後ただちに１０秒間遠心分離し
た。最終的にペレットを１０−１５分間風乾し、５μｌ
のＴＥ緩衝液に溶かした。
【００１９】3. 大規模大腸菌ＤＮＡの分離
大規模（０．５−１リットル）のプラスミド調製用の大
腸菌の培養物は、上述の如く補足され、かつ適当な抗生
物質を含む２Ｂ培地中で３７℃で振とう培養により成育
させた。ｐＢＲ３２２由来のプラスミドを含む細胞の場
合には、Ａ550で約０．７まで培養し、その時点で１０
０μｇ／mlとなるように充分量のクロラムフェニコール
を加え、細胞をおおよそ１５時間後に収集した。ｐＢＲ
３２５由来のプラスミドを含む菌株は、補足された２Ｂ
の培地中に、当初のＡ550 が約０．０１−０．０５とな
るよう移植し、収集前２０−２４時間３７℃で振とうイ
ンキュベートした。プラスミドをビルンボイム（Birnbo
im) 及びドーリー（Doly)のアルカリ溶菌法（１９７９
年）により分離した。
腸菌の培養物は、上述の如く補足され、かつ適当な抗生
物質を含む２Ｂ培地中で３７℃で振とう培養により成育
させた。ｐＢＲ３２２由来のプラスミドを含む細胞の場
合には、Ａ550で約０．７まで培養し、その時点で１０
０μｇ／mlとなるように充分量のクロラムフェニコール
を加え、細胞をおおよそ１５時間後に収集した。ｐＢＲ
３２５由来のプラスミドを含む菌株は、補足された２Ｂ
の培地中に、当初のＡ550 が約０．０１−０．０５とな
るよう移植し、収集前２０−２４時間３７℃で振とうイ
ンキュベートした。プラスミドをビルンボイム（Birnbo
im) 及びドーリー（Doly)のアルカリ溶菌法（１９７９
年）により分離した。
【００２０】4. 小規模大腸菌ＤＮＡ調製
少量の迅速プラスミド分離のために、抗生物質を含み、
補充した２Ｂ培地中の２mlの培養物を３７℃で振とう培
養し、１．５mlの極小遠心管中で遠心分離により収集し
た。プラスミドはビルンボイム及びドーリーのアルカリ
溶菌法（１９７９年）により分離した。
補充した２Ｂ培地中の２mlの培養物を３７℃で振とう培
養し、１．５mlの極小遠心管中で遠心分離により収集し
た。プラスミドはビルンボイム及びドーリーのアルカリ
溶菌法（１９７９年）により分離した。
【００２１】Ｅ．ＤＮＡの制限（酵素）及び断片の分離
制限酵素はニュー・イングランド バイオラボズ及びベ
セスダ（Bethesda) リサーチ ラボラトリーズから入手
し消化は常套手段により行なった。制限（酵素）の地図
化は、挿入ＤＮＡを有するか又は有しないプラスミドの
並行消化物との比較により実施した。制限断片はアガロ
ーズゲルから透析管材料でバックアップされたワットマ
ン３ＭＭ紙片への電気溶出により純化した。断片は、紙
及び管材料から０．１モルのNaCl、５０ミリモルのトリ
ス−塩酸（pH８．０）と１ミリモルのＥＤＴＡを含む溶
液０．１ないし０．２mlを用い、３〜４回洗浄し、回収
した。最後に、当該断片をフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコールで抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、少量のＴＥ緩衝液に再溶解した。
セスダ（Bethesda) リサーチ ラボラトリーズから入手
し消化は常套手段により行なった。制限（酵素）の地図
化は、挿入ＤＮＡを有するか又は有しないプラスミドの
並行消化物との比較により実施した。制限断片はアガロ
ーズゲルから透析管材料でバックアップされたワットマ
ン３ＭＭ紙片への電気溶出により純化した。断片は、紙
及び管材料から０．１モルのNaCl、５０ミリモルのトリ
ス−塩酸（pH８．０）と１ミリモルのＥＤＴＡを含む溶
液０．１ないし０．２mlを用い、３〜４回洗浄し、回収
した。最後に、当該断片をフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコールで抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、少量のＴＥ緩衝液に再溶解した。
【００２２】Ｆ．大腸菌内でのピー・パストリスのライ
ブラリー構築 ピキア パストリスＤＮＡ−ＹＥｐ１３ライブラリー構
築のために、５０μｇのＹＥｐ１３をＢａｍＨＩで完全
に消化し、仔牛の腸アルカリンフォスファターゼで処理
し、ＤＮＡから末端の５′ホスフェートを除去した。ピ
キア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０からのＤＮ
Ａ１００μｇを、全量で１mlとし、１０単位のＳａｕ３
ＡＩを用いて、３７℃で５分間インキュベートすること
により一部消化を行なった。５ないし２０Kbp の断片を
５−２０％の蔗糖濃度勾配遠心法を用いて大きさにより
分離した。当該ベクターの１μｇと２ μｇのピキア
Ｓａｕ３ＡＩ断片とを、総容量２００μｌ中でＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ）の
２０単位と混合し、４℃で１晩インキュベートした。当
該リゲートしたＤＮＡで大腸菌を、同８４８菌細胞液２
mlに全リゲーション反応混液を加え、０℃で１５分間イ
ンキュベートすることにより形質転換した。混合物を５
分間で３７℃までに加温し、その時間経過後ＬＢ培地４
０mlを加え、３７℃のインキュベーションを更に１時間
つづけた。次いでアンピシリンを加え、全濃度で１００
μｇ／mlとし、インキュベーションを再び１時間つづけ
た。最後に、細胞を３，０００Ｇで１０分間遠心分離
し、新しいＬＢ培地１ml中に再び懸濁させ、１００μｇ
／mlのアンピシリンを含む１０個のＬＢ寒天平板培地上
に等量づつ広げた。結果として約５０，０００コロニー
が発生したが、それを平板培地からかき取り、細胞の１
部分を、当初のＡ550 が約０．１となるまで５００mlの
補充した２Ｂ培地に接種した。培養物を成育させ、プラ
スミドを上述の方法により抽出した。ライブラリー用と
してプールしたコロニーの中で、１００試験したところ
９６がテトラサイクリン感受性で、１０試験したとこ
ろ、７つが挿入ＤＮＡを有するプラスミドを含有してい
た。
ブラリー構築 ピキア パストリスＤＮＡ−ＹＥｐ１３ライブラリー構
築のために、５０μｇのＹＥｐ１３をＢａｍＨＩで完全
に消化し、仔牛の腸アルカリンフォスファターゼで処理
し、ＤＮＡから末端の５′ホスフェートを除去した。ピ
キア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０からのＤＮ
Ａ１００μｇを、全量で１mlとし、１０単位のＳａｕ３
ＡＩを用いて、３７℃で５分間インキュベートすること
により一部消化を行なった。５ないし２０Kbp の断片を
５−２０％の蔗糖濃度勾配遠心法を用いて大きさにより
分離した。当該ベクターの１μｇと２ μｇのピキア
Ｓａｕ３ＡＩ断片とを、総容量２００μｌ中でＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ）の
２０単位と混合し、４℃で１晩インキュベートした。当
該リゲートしたＤＮＡで大腸菌を、同８４８菌細胞液２
mlに全リゲーション反応混液を加え、０℃で１５分間イ
ンキュベートすることにより形質転換した。混合物を５
分間で３７℃までに加温し、その時間経過後ＬＢ培地４
０mlを加え、３７℃のインキュベーションを更に１時間
つづけた。次いでアンピシリンを加え、全濃度で１００
μｇ／mlとし、インキュベーションを再び１時間つづけ
た。最後に、細胞を３，０００Ｇで１０分間遠心分離
し、新しいＬＢ培地１ml中に再び懸濁させ、１００μｇ
／mlのアンピシリンを含む１０個のＬＢ寒天平板培地上
に等量づつ広げた。結果として約５０，０００コロニー
が発生したが、それを平板培地からかき取り、細胞の１
部分を、当初のＡ550 が約０．１となるまで５００mlの
補充した２Ｂ培地に接種した。培養物を成育させ、プラ
スミドを上述の方法により抽出した。ライブラリー用と
してプールしたコロニーの中で、１００試験したところ
９６がテトラサイクリン感受性で、１０試験したとこ
ろ、７つが挿入ＤＮＡを有するプラスミドを含有してい
た。
【００２３】Ｇ．サザンハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションはサザンの方法（１９７５年）
により実施した。大きい、又はスーパーコイル型ＤＮＡ
分子のニトロセルローズへの移転には、アルカリ変性に
先立って、アガロースゲルを１０分間０．２５モルのHC
l 中に浸漬することによりＤＮＡをまず一部加水分解し
た。エス・セレビシエのＨＩＳ４遺伝子由来の標識した
断片の、ピキア パストリスＤＮＡへのハイブリダイゼ
ーションは５０％のホルムアミド、６倍のＳＳＣ、５倍
のデンハルト氏液、０．１％ＳＤＳ、１ミリモルのＥＤ
ＴＡ、１００μｇ／mlの変性したニシンの精子ＤＮＡの
存在下で４２℃で行なった。エス・セレビシエＨＩＳ４
遺伝子から標識された断片のピキア パストリスＤＮＡ
のハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーシ
ョン後の洗浄は、２倍のＳＳＣ、１ミリモルのＥＤＴ
Ａ、０．１％のＳＤＳ及び１．０％のピロリン酸ソーダ
中で５５℃で行なった。
により実施した。大きい、又はスーパーコイル型ＤＮＡ
分子のニトロセルローズへの移転には、アルカリ変性に
先立って、アガロースゲルを１０分間０．２５モルのHC
l 中に浸漬することによりＤＮＡをまず一部加水分解し
た。エス・セレビシエのＨＩＳ４遺伝子由来の標識した
断片の、ピキア パストリスＤＮＡへのハイブリダイゼ
ーションは５０％のホルムアミド、６倍のＳＳＣ、５倍
のデンハルト氏液、０．１％ＳＤＳ、１ミリモルのＥＤ
ＴＡ、１００μｇ／mlの変性したニシンの精子ＤＮＡの
存在下で４２℃で行なった。エス・セレビシエＨＩＳ４
遺伝子から標識された断片のピキア パストリスＤＮＡ
のハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーシ
ョン後の洗浄は、２倍のＳＳＣ、１ミリモルのＥＤＴ
Ａ、０．１％のＳＤＳ及び１．０％のピロリン酸ソーダ
中で５５℃で行なった。
【００２４】Ｈ． 32ｐ−標識
ニック翻訳はリグビイ（Rigby)らの方法（１９７７年）
で実施した。 Ｉ．酵母形質転換 エス ・セレビシエの形質転換はヒンネン（Hinnen) らの
方法（１９７８年）のスフェロプラスト世代法により実
施した。ピキア パストリスの形質転換は上述した手順
に順じ実施した。 Ｊ．ピキア ＨＩＳ４遺伝子の単離 ピキア ＨＩＳ４遺伝子を含むＤＮＡ断片をエス・セレビ
シエｈｉｓ４株を相補する彼らの能力を用いピキアＤＮ
Ａライブラリーから単離した。当該ライブラリーは、エ
ス・セレビシエ−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ１３の
ＢａｍＨＩ部位へと挿入された野性型ピキアＤＮＡの５
−２０Kbp Ｓａｕ３ＡＩの部分消化断片より構成されて
いた。
で実施した。 Ｉ．酵母形質転換 エス ・セレビシエの形質転換はヒンネン（Hinnen) らの
方法（１９７８年）のスフェロプラスト世代法により実
施した。ピキア パストリスの形質転換は上述した手順
に順じ実施した。 Ｊ．ピキア ＨＩＳ４遺伝子の単離 ピキア ＨＩＳ４遺伝子を含むＤＮＡ断片をエス・セレビ
シエｈｉｓ４株を相補する彼らの能力を用いピキアＤＮ
Ａライブラリーから単離した。当該ライブラリーは、エ
ス・セレビシエ−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ１３の
ＢａｍＨＩ部位へと挿入された野性型ピキアＤＮＡの５
−２０Kbp Ｓａｕ３ＡＩの部分消化断片より構成されて
いた。
【００２５】エス・セレビシエＮＲＲＬ Ｙ−１５８５
９（５７９９−４Ｄ；ｈｉｓ４ＡＢＣ株の一つ）のスフ
ェロプラストをヒンネン等の方法（１９７８年）により
作り出し、当該ピキアＤＮＡライブラリーと混合し、ヒ
スチジン欠缺培地中で再生させた。形質転換により５×
１０7 の全再生可能なスフェロプラストから１×１０ 3
の原栄養性の酵母コロニーが得られた。全酵母ＤＮＡを
２０のＨｉｓ+ コロニーから抽出し、大腸菌を形質転換
した。１７の酵母ＤＮＡ調製物がアンピシリン抵抗性コ
ロニーを形成し、いずれのコロニーもＹＥｐ１３と挿入
ＤＮＡよりなるプラスミドを含有していた。Ｈｉｓ+ 形
質転換プラスミドがピキアＨＩＳ４遺伝子を含有してい
るがサプレッサー活性をもつＤＮＡ遺伝子を含まないこ
とを確認するために、当該プラスミドの制限（酵素）消
化物をエス・セレビシエＨＩＳ４遺伝子の大きな部分を
含む、標識されたＤＮＡ断片へとハイブリダイゼーショ
ンし、低い厳密度で洗浄した。当該ｈｉｓ４エス・セレ
ビシエ株を相補したプラスミドのいずれもが、当該エス
・セレビシエＨＩＳ４遺伝子とハイブリダイゼーション
された配列を含有していた。Ｈｉｓ+ 形質転換プラスミ
ドの１つを更に特性化のため選択した。当該６．０Kbp
の断片の詳細な制限（酵素）地図は図３に示してある。
当該ｈｉｓ４変異株ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１（ＧＳ１
１５）を高頻度で形質転換できる最小のサブフラグメン
トは２．７Kbp のＢｇｌ II 断片（図３参照）である、
と当該６．０Kbp 断片の一部分でＧＳ１１５を形質転換
することにより決定された。このＢｇｌII 断片は、ま
たエス・セレビシエｈｉｓ４変異株ＮＲＲＬ−１５８５
９も高頻度で形質変換できた。かくして、この発明にも
とづき単離され、特性づけられた当該ＨＩＳ４遺伝子
は、エス・セレビシエ中で同定されているＨＩＳ４Ａ、
ＨＩＳ４Ｂ及びＨＩＳ４Ｃ遺伝子機能、すなわち、それ
ぞれホスホリボシル−ＡＴＰ−シクロハイドラーゼ、ホ
スホリボシル−ＡＴＰ−ピロホスホヒドラターゼ及びヒ
スチジノール脱水素酵素を含有していると信じられてい
る。
９（５７９９−４Ｄ；ｈｉｓ４ＡＢＣ株の一つ）のスフ
ェロプラストをヒンネン等の方法（１９７８年）により
作り出し、当該ピキアＤＮＡライブラリーと混合し、ヒ
スチジン欠缺培地中で再生させた。形質転換により５×
１０7 の全再生可能なスフェロプラストから１×１０ 3
の原栄養性の酵母コロニーが得られた。全酵母ＤＮＡを
２０のＨｉｓ+ コロニーから抽出し、大腸菌を形質転換
した。１７の酵母ＤＮＡ調製物がアンピシリン抵抗性コ
ロニーを形成し、いずれのコロニーもＹＥｐ１３と挿入
ＤＮＡよりなるプラスミドを含有していた。Ｈｉｓ+ 形
質転換プラスミドがピキアＨＩＳ４遺伝子を含有してい
るがサプレッサー活性をもつＤＮＡ遺伝子を含まないこ
とを確認するために、当該プラスミドの制限（酵素）消
化物をエス・セレビシエＨＩＳ４遺伝子の大きな部分を
含む、標識されたＤＮＡ断片へとハイブリダイゼーショ
ンし、低い厳密度で洗浄した。当該ｈｉｓ４エス・セレ
ビシエ株を相補したプラスミドのいずれもが、当該エス
・セレビシエＨＩＳ４遺伝子とハイブリダイゼーション
された配列を含有していた。Ｈｉｓ+ 形質転換プラスミ
ドの１つを更に特性化のため選択した。当該６．０Kbp
の断片の詳細な制限（酵素）地図は図３に示してある。
当該ｈｉｓ４変異株ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１（ＧＳ１
１５）を高頻度で形質転換できる最小のサブフラグメン
トは２．７Kbp のＢｇｌ II 断片（図３参照）である、
と当該６．０Kbp 断片の一部分でＧＳ１１５を形質転換
することにより決定された。このＢｇｌII 断片は、ま
たエス・セレビシエｈｉｓ４変異株ＮＲＲＬ−１５８５
９も高頻度で形質変換できた。かくして、この発明にも
とづき単離され、特性づけられた当該ＨＩＳ４遺伝子
は、エス・セレビシエ中で同定されているＨＩＳ４Ａ、
ＨＩＳ４Ｂ及びＨＩＳ４Ｃ遺伝子機能、すなわち、それ
ぞれホスホリボシル−ＡＴＰ−シクロハイドラーゼ、ホ
スホリボシル−ＡＴＰ−ピロホスホヒドラターゼ及びヒ
スチジノール脱水素酵素を含有していると信じられてい
る。
【００２６】実施例 III 調節領域−Ｌａｃ遺伝子融合体の構築
当該ＨＩＳ４プロモータ及び調節領域配列を含むＤＮＡ
断片を同定するために、プラスミドｐＹＪ８をＥｃｏＲ
Ｉ及びＰｖｕ II で切断し、電気泳動を用い溶出した。
ピキアＤＮＡの６００pbを回収し、ＥｃｏＲＩ及びＳｍ
ａＩでポリリンカー部位を切断したプラスミドｐＢＰｆ
Ｉへリゲートした。得られたプラスミド、ｐＢＰｆ３で
ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１で形質転
換し、それを当該ピキアＨＩＳ４調節領域の制御のもと
でのβ−ガラクトシダーゼの生産を目的とした次の試験
に使用した。
断片を同定するために、プラスミドｐＹＪ８をＥｃｏＲ
Ｉ及びＰｖｕ II で切断し、電気泳動を用い溶出した。
ピキアＤＮＡの６００pbを回収し、ＥｃｏＲＩ及びＳｍ
ａＩでポリリンカー部位を切断したプラスミドｐＢＰｆ
Ｉへリゲートした。得られたプラスミド、ｐＢＰｆ３で
ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１で形質転
換し、それを当該ピキアＨＩＳ４調節領域の制御のもと
でのβ−ガラクトシダーゼの生産を目的とした次の試験
に使用した。
【００２７】実施例 IV アミノ酸調節下でのβ−ガラクトシダーゼの発現 Ａ．平板培養による測定
ｐＢＰｆ３で形質転換されたピー・パストリスＮＲＲＬ
−１５８５１を０．４μｇ／mlのビチオン、４０μｇ／
mlのＸｇａｌ（５−ブロモ−４−クロル−３−インドリ
ル−β−Ｄ−グリコシド）で補充されたＹＰＤ及びＳＤ
２％平板寒天培地上に塗布した。ＳＤ含有平板培地は一
塩基性リン酸カリウム（monobasic potassium phosphat
e)を加えてpHを７．０に調節した。Ｘｇａｌ測定の原理
は、もしも細胞中に存在するならば、β−グリコシダー
ゼはＸｇａｌと反応して青色の化合物を生成するという
ことにある。生成した青い色は肉眼で検出できる。ｐＢ
Ｐｆ３形質転換ピー パストリス細胞中に、最少（ＳＤ
培地）平板上で約４−５時間以内に青い色があらわれた
が、一方富化（ＹＰＤ）培地を含む平板培地上に青い色
が表われるのには１週間のインキュベーションを必要と
した。対照として、形質転換されていないピー・パスト
リス細胞、ｐＢＰｆ１で形質転換したピー・パストリス
細胞、ｐＢＰｆ２（ピキアＨＩＳ４遺伝子の５′末端か
らの４００bpのＲ1 −Ｂ2 断片とｐＢＰｆ１の誘導体）
で形質転換されたピー・パストリス細菌のいずれもがい
ずれの試験した条件下では青い色にはならなかった。こ
れらの観察は、当該６００pbのＲ1 −Ｒ2 ピキアＨＩＳ
４断片−ＬａｃＺ遺伝子の融合体が発現し、アミノ酸を
調節した条件下で調節できることを示唆している。
−１５８５１を０．４μｇ／mlのビチオン、４０μｇ／
mlのＸｇａｌ（５−ブロモ−４−クロル−３−インドリ
ル−β−Ｄ−グリコシド）で補充されたＹＰＤ及びＳＤ
２％平板寒天培地上に塗布した。ＳＤ含有平板培地は一
塩基性リン酸カリウム（monobasic potassium phosphat
e)を加えてpHを７．０に調節した。Ｘｇａｌ測定の原理
は、もしも細胞中に存在するならば、β−グリコシダー
ゼはＸｇａｌと反応して青色の化合物を生成するという
ことにある。生成した青い色は肉眼で検出できる。ｐＢ
Ｐｆ３形質転換ピー パストリス細胞中に、最少（ＳＤ
培地）平板上で約４−５時間以内に青い色があらわれた
が、一方富化（ＹＰＤ）培地を含む平板培地上に青い色
が表われるのには１週間のインキュベーションを必要と
した。対照として、形質転換されていないピー・パスト
リス細胞、ｐＢＰｆ１で形質転換したピー・パストリス
細胞、ｐＢＰｆ２（ピキアＨＩＳ４遺伝子の５′末端か
らの４００bpのＲ1 −Ｂ2 断片とｐＢＰｆ１の誘導体）
で形質転換されたピー・パストリス細菌のいずれもがい
ずれの試験した条件下では青い色にはならなかった。こ
れらの観察は、当該６００pbのＲ1 −Ｒ2 ピキアＨＩＳ
４断片−ＬａｃＺ遺伝子の融合体が発現し、アミノ酸を
調節した条件下で調節できることを示唆している。
【００２８】Ｂ．液体培養測定 ピー
・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１をプラスミ
ドｐＢＰｆ３で形質転換した。形質転換した細胞を０．
４μｇ／mlのビオチンで補充したＳＤ培地に接種し、溶
液のml当のＡ600 が約０．７になるまで３０℃で振とう
培養した。次いで、３．５mlの培養物を９６．５mlの下
記のいずれか一つの培地を含む２本のフラスコに加え
た： Ｉ ０．４μｇ／mlビチオンを含むＳＤ培地、及び II ＨＡＭ これらの２つの培養体を、３０℃で８０時間振とうしな
がら培養し、対数増殖期まで成育させた。サンプルを各
特定時間経過後に採取し、β−ガラクトシダーゼについ
て測定した。β−ガラクトシダーゼ測定 ガラクトシダーゼは次のようにして測定した。1. 必要した溶液 Ｚ緩衝液： 最終濃度 Na2HPO4 ・７H2O １６．１ｇ ０．０６ Ｍ NaH2PO4 ５．５ｇ ０．０４ Ｍ KCl ０．７５ｇ ０．０１ Ｍ MgSO4 ・７H2O ０．２４６ｇ ０．００１Ｍ ２−メルカプトエタノール ２．７mL ０．０５ Ｍ １リットルに調製。pHは７とする。Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰ
Ｇ） ４００mgのＯＮＰＧ（シグマ Ｎ−１１２７）を１００
mlの蒸留水にとかし４mg／mlのＯＮＰＧ溶液をつくる。
ドｐＢＰｆ３で形質転換した。形質転換した細胞を０．
４μｇ／mlのビオチンで補充したＳＤ培地に接種し、溶
液のml当のＡ600 が約０．７になるまで３０℃で振とう
培養した。次いで、３．５mlの培養物を９６．５mlの下
記のいずれか一つの培地を含む２本のフラスコに加え
た： Ｉ ０．４μｇ／mlビチオンを含むＳＤ培地、及び II ＨＡＭ これらの２つの培養体を、３０℃で８０時間振とうしな
がら培養し、対数増殖期まで成育させた。サンプルを各
特定時間経過後に採取し、β−ガラクトシダーゼについ
て測定した。β−ガラクトシダーゼ測定 ガラクトシダーゼは次のようにして測定した。1. 必要した溶液 Ｚ緩衝液： 最終濃度 Na2HPO4 ・７H2O １６．１ｇ ０．０６ Ｍ NaH2PO4 ５．５ｇ ０．０４ Ｍ KCl ０．７５ｇ ０．０１ Ｍ MgSO4 ・７H2O ０．２４６ｇ ０．００１Ｍ ２−メルカプトエタノール ２．７mL ０．０５ Ｍ １リットルに調製。pHは７とする。Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰ
Ｇ） ４００mgのＯＮＰＧ（シグマ Ｎ−１１２７）を１００
mlの蒸留水にとかし４mg／mlのＯＮＰＧ溶液をつくる。
【００２９】2. 分析手順
(i) 適当量（ＯＤ600 で０．１−０．５の酵母細胞）
を培養培地からとり、遠心分離し、細胞ペレットを水で
洗う。 (ii) １mlのＺ緩衝液を細胞ペレット、３０μｌのCHCl
3 及び３０μｌの０．１％ＳＤＳに加え、かきまぜ（vo
rtex) ５分間３０℃インキュベートする。 (iii) ０．２mlのＯＮＰＧ（４mg／ml）を加え、かきま
ぜたのち反応を開始する。 (iv) 適当な時点（Ａ420 ＜１となった時点）で１Ｍの
Na2CO3溶液０．５ml加えて反応を停止させる。 (v) ４２０nmで上澄液の吸光度を読み取る。
を培養培地からとり、遠心分離し、細胞ペレットを水で
洗う。 (ii) １mlのＺ緩衝液を細胞ペレット、３０μｌのCHCl
3 及び３０μｌの０．１％ＳＤＳに加え、かきまぜ（vo
rtex) ５分間３０℃インキュベートする。 (iii) ０．２mlのＯＮＰＧ（４mg／ml）を加え、かきま
ぜたのち反応を開始する。 (iv) 適当な時点（Ａ420 ＜１となった時点）で１Ｍの
Na2CO3溶液０．５ml加えて反応を停止させる。 (v) ４２０nmで上澄液の吸光度を読み取る。
【００３０】3. Ｃ，β−ガラクトシダーゼ単位の計
算： １単位＝３０℃、pH７で１分子当り形成されたオルトニ
トロフェノール（ＯＮＰ）の１ｎモル １cmのパスレングス(pathlength)で、１ｎモルのＯＮＰ
は、４２０nm（Ａ420）で０．００４５の吸光度を持
つ。従って、４２０nmでの吸光度１で１ml当り２２２ｎ
モル、又は分析した上澄液の全量が１．７mlであるので
３７８ｎモル／１．７mlである。従って、単位は次の通
り計算する。 これらの実験の結果は表にまとめて示す。
算： １単位＝３０℃、pH７で１分子当り形成されたオルトニ
トロフェノール（ＯＮＰ）の１ｎモル １cmのパスレングス(pathlength)で、１ｎモルのＯＮＰ
は、４２０nm（Ａ420）で０．００４５の吸光度を持
つ。従って、４２０nmでの吸光度１で１ml当り２２２ｎ
モル、又は分析した上澄液の全量が１．７mlであるので
３７８ｎモル／１．７mlである。従って、単位は次の通
り計算する。 これらの実験の結果は表にまとめて示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】上記の表に示した結果は、ピキアＨＩＳ４
プロモータ領域の制御のもとでβ−ガラクトシダーゼが
発現したことを示している。下記の文献を本明細書中で
引用した。 ビルボイム及びドーリー（１９７９年）核酸研究７巻、
１５１３−１５２３頁〔Birnboim and Doly （１９７
９）Nucl. Acids Res. ７，１５１３−１５２３；〕 ヒンネン等（１９７８年）米国国立教養学会大会講演
集、７５巻、１９２９−１９３３頁〔Hinnen et al（１
９７８）Proc. Nat. Acad. Sci., USA ７５，１９２９
−１９３３〕 リグビイ等（１９７７年）分子微生物学誌、１１３巻、
２３７頁〔Rigby et al （１９７７）J. Mol. Biol. １
１３，２３７〕 サザン（１９７５年）分子微生物学誌、９８巻、５０３
−５１７頁〔Southern（１９７５）J. Mol. Biol. ９
８，５０３−５１７〕
プロモータ領域の制御のもとでβ−ガラクトシダーゼが
発現したことを示している。下記の文献を本明細書中で
引用した。 ビルボイム及びドーリー（１９７９年）核酸研究７巻、
１５１３−１５２３頁〔Birnboim and Doly （１９７
９）Nucl. Acids Res. ７，１５１３−１５２３；〕 ヒンネン等（１９７８年）米国国立教養学会大会講演
集、７５巻、１９２９−１９３３頁〔Hinnen et al（１
９７８）Proc. Nat. Acad. Sci., USA ７５，１９２９
−１９３３〕 リグビイ等（１９７７年）分子微生物学誌、１１３巻、
２３７頁〔Rigby et al （１９７７）J. Mol. Biol. １
１３，２３７〕 サザン（１９７５年）分子微生物学誌、９８巻、５０３
−５１７頁〔Southern（１９７５）J. Mol. Biol. ９
８，５０３−５１７〕
【図１】図１はプラスミドＹＥｐ１３の制限（酵素）地
図（restriction map)である。
図（restriction map)である。
【図２】図２はプラスミドｐＹＡ４の制限（酵素）地図
である。
である。
【図３】図３はピキアＨＩＳ４遺伝子及び特定の重要な
サプフラグメントを含むピキア染色体ＤＮＡの６．０キ
ロ塩基対（Kbp)の制限酵素地図である。
サプフラグメントを含むピキア染色体ＤＮＡの６．０キ
ロ塩基対（Kbp)の制限酵素地図である。
【図４】図４はプラスミドｐＢＰｆ３の制限酵素地図で
ある。
ある。
【図５】図５はプラスミドｐＢｆ１の制限酵素地図であ
る。
る。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ピキア パストリス ＮＲＲＬ １１４３０のＨＩ
Ｓ遺伝子坐由来の６００ｐｂのＤＮＡ断片で、以下の制
限酵素地図 により規定されるＤＮＡ断片の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
ＰｖｕＩＩによる消化により得られるものである調節領
域よりなる単離ＤＮＡ断片であって、以下の制限酵素地
図 によって規定され、かつ該調節領域が当該ＤＮＡ断片用
の宿主生物が接触している培養培地中のヒスチジンの存
在の有無に応答性であり、そして、ポリペプチドの生産
についての遺伝情報をコードするＤＮＡの５′末端位置
についているとき当該ポリペプチドの生産を制御できる
ものである当該ＤＮＡ断片。 ２．当該調節領域の３′末端の位置についているＬａｃ
Ｚ遺伝子を更に含有する特許請求の範囲第１項記載のＤ
ＮＡ断片。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/666,578 US4885242A (en) | 1984-10-30 | 1984-10-30 | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof |
| US666578 | 1984-10-30 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60243783A Division JP2617443B2 (ja) | 1984-10-30 | 1985-10-30 | 機能遺伝子の分離法、同遺伝子を含むｄｎａ断片及びその製法、組換プラスミド及び同プラスミドによる酵母の形質転換法並びに同発現法 |
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|---|---|
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| JP2710610B2 true JP2710610B2 (ja) | 1998-02-10 |
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ID=24674601
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|---|---|---|---|
| JP60243783A Expired - Lifetime JP2617443B2 (ja) | 1984-10-30 | 1985-10-30 | 機能遺伝子の分離法、同遺伝子を含むｄｎａ断片及びその製法、組換プラスミド及び同プラスミドによる酵母の形質転換法並びに同発現法 |
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| JP8328822A Expired - Lifetime JP2710610B2 (ja) | 1984-10-30 | 1996-12-09 | 機能遺伝子を含むｄｎａ断片 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60243783A Expired - Lifetime JP2617443B2 (ja) | 1984-10-30 | 1985-10-30 | 機能遺伝子の分離法、同遺伝子を含むｄｎａ断片及びその製法、組換プラスミド及び同プラスミドによる酵母の形質転換法並びに同発現法 |
| JP6213968A Pending JPH07163354A (ja) | 1984-10-30 | 1994-09-07 | 機能遺伝子を含むｄｎａ断片 |
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| ES (1) | ES8609477A1 (ja) |
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| GR (1) | GR852608B (ja) |
| IL (1) | IL76764A0 (ja) |
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| PT (1) | PT81401B (ja) |
| ZA (1) | ZA858182B (ja) |
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| IL89992A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
| IL90021A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Process for the production of interferon |
| CA2000101A1 (en) * | 1988-12-22 | 1990-06-22 | Mary E. Digan | Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene |
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| EP0578746B1 (en) * | 1991-04-01 | 2002-07-03 | Merck & Co., Inc. | GENES WHICH INFLUENCE $i(PICHIA) PROTEOLYTIC ACTIVITY, AND USES THEREFOR |
| CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
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| US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| JP3811186B2 (ja) * | 1994-10-18 | 2006-08-16 | コーバス インターナショナル， インコーポレイテッド | 線虫から抽出されるセリンプロテアーゼ阻害剤および抗凝固性タンパク質 |
| US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
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| JP2002512812A (ja) * | 1998-04-24 | 2002-05-08 | ヘキスト・マリオン・ルセル | 抗真菌性物質のサッカロミセス・セレビシエ由来の必須遺伝子を用いるスクリーニング法 |
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| US6261820B1 (en) * | 1999-10-01 | 2001-07-17 | Amgen Inc. | Fibronolytically active polypeptide |
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