JP2002512812A - 抗真菌性物質のサッカロミセス・セレビシエ由来の必須遺伝子を用いるスクリーニング法 - Google Patents
抗真菌性物質のサッカロミセス・セレビシエ由来の必須遺伝子を用いるスクリーニング法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、抗真菌性物質をスクリーニングする方法であって、真菌類由来の必須遺伝子若しくは機能的に類似する真菌類遺伝子又は対応するコードされる蛋白質を標的として利用し、必須遺伝子を、ＹＭＬ１１４ｃ、ＹＬＲ１８６ｗ、ＹＬＲ２１５ｃ、ＹＬＲ２２２ｃ、ＹＬＲ２４３ｗ、ＹＬＲ２７２ｃ、ＹＬＲ２７５ｗ、ＹＬＲ２７６ｃ、ＹＬＲ３１７ｗ、ＹＬＲ３５９ｗ、ＹＬＲ３７３ｃ、ＹＬＲ４２４ｗ、ＹＬＲ４３７ｃ、ＹＬＲ４４０ｃ、ＹＭＬ０２３ｃ、ＹＭＬ０４９ｃ、ＹＭＬ０７７ｗ、ＹＭＬ０９３ｗ、ＹＭＬ１２７ｗ、ＹＭＲ０３２ｗ、ＹＭＲ０９３ｗ、ＹＭＲ１３１ｃ、ＹＭＲ１８５ｗ、ＹＭＲ２１２ｃ、ＹＭＲ２１３ｗ、ＹＭＲ２１８ｃ、ＹＭＲ２８１ｗ、ＹＭＲ２８８ｗ、ＹＭＲ２９０ｃ、ＹＭＲ２１１ｗ、ＹＭＲ０４９ｃ、ＹＭＲ１３４ｗ、ＹＤＲ１９６ｃ、ＹＤＲ２９９ｗ、ＹＤＲ３６５ｃ、ＹＤＲ３９６ｗ、ＹＤＲ４０７ｃ、ＹＤＲ４１６ｗ、ＹＤＲ４４９ｃ、ＹＤＲ４７２ｗ、ＹＤＲ４９９ｗ、ＹＤＲ１４１ｃ、ＹＤＲ３２４ｃ、ＹＤＲ３２５ｗ、ＹＤＲ３９８ｗ、ＹＤＲ２４６ｗ、ＹＤＲ２３６ｃ、ＹＤＲ３６１ｃ、ＹＤＲ３６７ｗ、ＹＤＲ３３９ｃ、ＹＤＲ４１３ｃ、ＹＤＲ４２９ｃ、ＹＤＲ４６８ｃ、ＹＤＲ４８９ｗ、ＹＤＲ５２７ｗ、ＹＤＲ２８８ｗ、ＹＤＲ２０１ｗ、ＹＤＲ４３４ｗ、ＹＤＲ１８１ｃ、ＹＤＲ５３１ｗ、ＹＰＬ１２６ｗ、ＹＰＬ０９３ｗ、ＹＰＬ０６３ｗ、ＹＰＬ０２４ｗ、ＹＰＬ０２０ｃ、ＹＰＬ０１２ｗ、ＹＰＬ００７ｃ、ＹＰＬ２３３ｗ、ＹＰＬ１４６ｃ、ＹＩＬ０９１ｃ、ＹＩＬ０８３ｃ、ＹＩＬ０１９ｗ、ＹＩＬ１０９ｃ、ＹＩＬ１０４ｃ、ＹＦＬ０２４ｃ、ＹＦＲ００３ｃ、ＹＦＲ０２７ｗ、ＹＦＲ０４２ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＲ０１５ｗ、ＹＰＲ０４８ｗ、ＹＰＲ０７２ｗ、ＹＰＲ０８２ｃ、ＹＰＲ０８５ｃ、ＹＰＲ１０５ｃ、ＹＰＲ１１２ｃ、ＹＰＲ１３７ｗ、ＹＰＲ１４３ｗ、ＹＰＲ１４４ｃ及びＹＰＲ１６９ｗよりなる群から選択する当該方法に関係する。
Description
【０００１】 本発明は、真菌類特にサッカロミセス・セレビシエ(Ｓ．セレビシエ)由来の必
須遺伝子並びに他の真菌類由来の機能的に類似の遺伝子又は対応するコードされ
る蛋白質を標的として利用する抗真菌性物質のスクリーニング方法に関係する。
須遺伝子並びに他の真菌類由来の機能的に類似の遺伝子又は対応するコードされ
る蛋白質を標的として利用する抗真菌性物質のスクリーニング方法に関係する。
【０００２】 公知のカビの感染スペクトルは、皮膚又は爪へのカビの攻撃から潜在的に危険
な内臓の真菌感染に及び；かかる感染及びその結果の病気は、真菌症として知ら
れている。
な内臓の真菌感染に及び；かかる感染及びその結果の病気は、真菌症として知ら
れている。
【０００３】 抗真菌性物質(静真菌性又は殺真菌性の物質)が、真菌症の治療に用いられてい
る。しかしながら、現在まで、薬理学的効果を有する物質は、アンホテリシンＢ
、ナイスタチン、ピマリシン、グリセオフルビン、クロトリマゾール、５−フル
オロ−シトシン及びバトラフェン等、比較的少数である。真菌感染症の薬物治療
は、特に、宿主細胞と真菌類が両方とも真核細胞であるために、極めて困難であ
る。それ故、公知の抗真菌性物質に基づく薬物の投与は、しばしば、望ましくな
い副作用を生じる(例えば、アンホテリシンＢは、腎毒性作用を有する)。それ故
、免疫抑制状態での病気の予防処置又は存在する真菌感染症の治療に適した薬物
の製造に用いることのできる薬理学的に有効な物質に対する強い要求がある。そ
の上更に、これらの物質は、治療する宿主生物に影響を及ぼすことなく真菌類の
生育及び繁殖を選択的に阻止するための作用の特異的スペクトルを示すべきであ
る。
る。しかしながら、現在まで、薬理学的効果を有する物質は、アンホテリシンＢ
、ナイスタチン、ピマリシン、グリセオフルビン、クロトリマゾール、５−フル
オロ−シトシン及びバトラフェン等、比較的少数である。真菌感染症の薬物治療
は、特に、宿主細胞と真菌類が両方とも真核細胞であるために、極めて困難であ
る。それ故、公知の抗真菌性物質に基づく薬物の投与は、しばしば、望ましくな
い副作用を生じる(例えば、アンホテリシンＢは、腎毒性作用を有する)。それ故
、免疫抑制状態での病気の予防処置又は存在する真菌感染症の治療に適した薬物
の製造に用いることのできる薬理学的に有効な物質に対する強い要求がある。そ
の上更に、これらの物質は、治療する宿主生物に影響を及ぼすことなく真菌類の
生育及び繁殖を選択的に阻止するための作用の特異的スペクトルを示すべきであ
る。
【０００４】 本発明の目的は、抗真菌性物質を同定するための方法を提供することである。
この方法の本質的特徴は、真菌類由来の必須遺伝子をスクリーニングのための標
的として利用することである。
この方法の本質的特徴は、真菌類由来の必須遺伝子をスクリーニングのための標
的として利用することである。
【０００５】 本発明は、それ故、抗真菌性物質をスクリーニングする方法であって、真菌類
由来の必須遺伝子若しくは他の真菌類由来の機能的に類似する遺伝子又は対応す
るコードされる蛋白質を標的として利用し、及び必須遺伝子を下記よりなる群か
ら選択する、上記の抗真菌性物質をスクリーニングする方法に関係する ＹＭＬ１１４ｃ、ＹＬＲ１８６ｗ、ＹＬＲ２１５ｃ、ＹＬＲ２２２ｃ、ＹＬＲ２
４３ｗ、ＹＬＲ２７２ｃ、ＹＬＲ２７５ｗ、ＹＬＲ２７６ｃ、ＹＬＲ３１７ｗ、
ＹＬＲ３５９ｗ、ＹＬＲ３７３ｃ、ＹＬＲ４２４ｗ、ＹＬＲ４３７ｃ、ＹＬＲ４
４０ｃ、ＹＭＬ０２３ｃ、ＹＭＬ０４９ｃ、ＹＭＬ０７７ｗ、ＹＭＬ０９３ｗ、
ＹＭＬ１２７ｗ、ＹＭＲ０３２ｗ、ＹＭＲ０９３ｗ、ＹＭＲ１３１ｃ、ＹＭＲ１
８５ｗ、ＹＭＲ２１２ｃ、ＹＭＲ２１３ｗ、ＹＭＲ２１８ｃ、ＹＭＲ２８１ｗ、
ＹＭＲ２８８ｗ、ＹＭＲ２９０ｃ、ＹＭＲ２１１ｗ、ＹＭＲ０４９ｃ、ＹＭＲ１
３４ｗ、ＹＤＲ１９６ｃ、ＹＤＲ２９９ｗ、ＹＤＲ３６５ｃ、ＹＤＲ３９６ｗ、
ＹＤＲ４０７ｃ、ＹＤＲ４１６ｗ、ＹＤＲ４４９ｃ、ＹＤＲ４７２ｗ、ＹＤＲ４
９９ｗ、ＹＤＲ１４１ｃ、ＹＤＲ３２４ｃ、ＹＤＲ３２５ｗ、ＹＤＲ３９８ｗ、
ＹＤＲ２４６ｗ、ＹＤＲ２３６ｃ、ＹＤＲ３６１ｃ、ＹＤＲ３６７ｗ、ＹＤＲ３
３９ｃ、ＹＤＲ４１３ｃ、ＹＤＲ４２９ｃ、ＹＤＲ４６８ｃ、ＹＤＲ４８９ｗ、
ＹＤＲ５２７ｗ、ＹＤＲ２８８ｗ、ＹＤＲ２０１ｗ、ＹＤＲ４３４ｗ、ＹＤＲ１
８１ｃ、ＹＤＲ５３１ｗ、ＹＰＬ１２６ｗ、ＹＰＬ０９３ｗ、ＹＰＬ０６３ｗ、
ＹＰＬ０２４ｗ、ＹＰＬ０２０ｃ、ＹＰＬ０１２ｗ、ＹＰＬ００７ｃ、ＹＰＬ２
３３ｗ、ＹＰＬ１４６ｃ、ＹＩＬ０９１ｃ、ＹＩＬ０８３ｃ、ＹＩＬ０１９ｗ、
ＹＩＬ１０９ｃ、ＹＩＬ１０４ｃ、ＹＦＬ０２４ｃ、ＹＦＲ００３ｃ、ＹＦＲ０
２７ｗ、ＹＦＲ０４２ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＲ０１５ｗ、ＹＰＲ０４８ｗ、
ＹＰＲ０７２ｗ、ＹＰＲ０８２ｃ、ＹＰＲ０８５ｃ、ＹＰＲ１０５ｃ、ＹＰＲ１
１２ｃ、ＹＰＲ１３７ｗ、ＹＰＲ１４３ｗ、ＹＰＲ１４４ｃ及びＹＰＲ１６９ｗ
。
由来の必須遺伝子若しくは他の真菌類由来の機能的に類似する遺伝子又は対応す
るコードされる蛋白質を標的として利用し、及び必須遺伝子を下記よりなる群か
ら選択する、上記の抗真菌性物質をスクリーニングする方法に関係する ＹＭＬ１１４ｃ、ＹＬＲ１８６ｗ、ＹＬＲ２１５ｃ、ＹＬＲ２２２ｃ、ＹＬＲ２
４３ｗ、ＹＬＲ２７２ｃ、ＹＬＲ２７５ｗ、ＹＬＲ２７６ｃ、ＹＬＲ３１７ｗ、
ＹＬＲ３５９ｗ、ＹＬＲ３７３ｃ、ＹＬＲ４２４ｗ、ＹＬＲ４３７ｃ、ＹＬＲ４
４０ｃ、ＹＭＬ０２３ｃ、ＹＭＬ０４９ｃ、ＹＭＬ０７７ｗ、ＹＭＬ０９３ｗ、
ＹＭＬ１２７ｗ、ＹＭＲ０３２ｗ、ＹＭＲ０９３ｗ、ＹＭＲ１３１ｃ、ＹＭＲ１
８５ｗ、ＹＭＲ２１２ｃ、ＹＭＲ２１３ｗ、ＹＭＲ２１８ｃ、ＹＭＲ２８１ｗ、
ＹＭＲ２８８ｗ、ＹＭＲ２９０ｃ、ＹＭＲ２１１ｗ、ＹＭＲ０４９ｃ、ＹＭＲ１
３４ｗ、ＹＤＲ１９６ｃ、ＹＤＲ２９９ｗ、ＹＤＲ３６５ｃ、ＹＤＲ３９６ｗ、
ＹＤＲ４０７ｃ、ＹＤＲ４１６ｗ、ＹＤＲ４４９ｃ、ＹＤＲ４７２ｗ、ＹＤＲ４
９９ｗ、ＹＤＲ１４１ｃ、ＹＤＲ３２４ｃ、ＹＤＲ３２５ｗ、ＹＤＲ３９８ｗ、
ＹＤＲ２４６ｗ、ＹＤＲ２３６ｃ、ＹＤＲ３６１ｃ、ＹＤＲ３６７ｗ、ＹＤＲ３
３９ｃ、ＹＤＲ４１３ｃ、ＹＤＲ４２９ｃ、ＹＤＲ４６８ｃ、ＹＤＲ４８９ｗ、
ＹＤＲ５２７ｗ、ＹＤＲ２８８ｗ、ＹＤＲ２０１ｗ、ＹＤＲ４３４ｗ、ＹＤＲ１
８１ｃ、ＹＤＲ５３１ｗ、ＹＰＬ１２６ｗ、ＹＰＬ０９３ｗ、ＹＰＬ０６３ｗ、
ＹＰＬ０２４ｗ、ＹＰＬ０２０ｃ、ＹＰＬ０１２ｗ、ＹＰＬ００７ｃ、ＹＰＬ２
３３ｗ、ＹＰＬ１４６ｃ、ＹＩＬ０９１ｃ、ＹＩＬ０８３ｃ、ＹＩＬ０１９ｗ、
ＹＩＬ１０９ｃ、ＹＩＬ１０４ｃ、ＹＦＬ０２４ｃ、ＹＦＲ００３ｃ、ＹＦＲ０
２７ｗ、ＹＦＲ０４２ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＲ０１５ｗ、ＹＰＲ０４８ｗ、
ＹＰＲ０７２ｗ、ＹＰＲ０８２ｃ、ＹＰＲ０８５ｃ、ＹＰＲ１０５ｃ、ＹＰＲ１
１２ｃ、ＹＰＲ１３７ｗ、ＹＰＲ１４３ｗ、ＹＰＲ１４４ｃ及びＹＰＲ１６９ｗ
。
【０００６】 この発明の方法の一具体例によれば、必須遺伝子又は機能的に類似の真菌遺伝
子を様々なレベルに発現する真菌細胞を試験すべき物質と共にインキュベートし
て、その物質の生育阻止効果を測定する。
子を様々なレベルに発現する真菌細胞を試験すべき物質と共にインキュベートし
て、その物質の生育阻止効果を測定する。
【０００７】 他の具体例によれば、前記の標的遺伝子又は対応する標的遺伝子にコードされ
た蛋白質をイン・ビトロで試験すべき物質と接触させて、その物質の標的に対す
る効果を測定する。
た蛋白質をイン・ビトロで試験すべき物質と接触させて、その物質の標的に対す
る効果を測定する。
【０００８】 他の具体例によれば、スクリーニングされた物質は、必須遺伝子の機能的発現
又はそれらのコードされた蛋白質の機能的活性を部分的に又は全面的に阻害する
。
又はそれらのコードされた蛋白質の機能的活性を部分的に又は全面的に阻害する
。
【０００９】 他の具体例によれば、これらの真菌種は、担子菌類、子嚢菌類及び線菌類(Hyp
homycetes)よりなる群から選択される。
homycetes)よりなる群から選択される。
【００１０】 この発明の方法の他の具体例によれば、前記の機能的類似遺伝子は、カンジダ
種(好ましくは、カンジダ・アルビカンス)由来の又はアスペルギルス種(好まし
くは、アスペルギルス・フミガーツス)由来の必須遺伝子である。
種(好ましくは、カンジダ・アルビカンス)由来の又はアスペルギルス種(好まし
くは、アスペルギルス・フミガーツス)由来の必須遺伝子である。
【００１１】 上記の方法の更なる具体例によれば、前記の真菌細胞は、一倍体のＳ．セレビ
シエ細胞である。
シエ細胞である。
【００１２】 この発明の方法の特別の具体例によれば、Ｓ．セレビシエの必須遺伝子は、調
べるべき遺伝子の遺伝子座における相同組換えによる選択マーカーの組み込みに
より同定される。
べるべき遺伝子の遺伝子座における相同組換えによる選択マーカーの組み込みに
より同定される。
【００１３】 本発明は又、機能的に類似する遺伝子を下記により同定する上記の方法にも関
係する： ａ）調べるべきＳ．セレビシエの遺伝子が、調節されるプロモーターの制御下
で染色体に組み込まれ又は染色体外に存在するＳ．セレビシエ変異株を用意し、 ｂ）該変異株を、調節されるプロモーターが活性である生育条件下で培養し、 ｃ）この変異株を、異種真菌種から調製して適当なベクターに挿入したｃＤＮ
Ａ又はゲノムＤＮＡによりトランスフォームし、 ｄ）培養条件を、調節されるプロモーターがスイッチ・オフされて、機能的に
類似の遺伝子を含むＳ．セレビシエ細胞のみが生存し得るように変化させ、 ｅ）このｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを単離して分析する。
係する： ａ）調べるべきＳ．セレビシエの遺伝子が、調節されるプロモーターの制御下
で染色体に組み込まれ又は染色体外に存在するＳ．セレビシエ変異株を用意し、 ｂ）該変異株を、調節されるプロモーターが活性である生育条件下で培養し、 ｃ）この変異株を、異種真菌種から調製して適当なベクターに挿入したｃＤＮ
Ａ又はゲノムＤＮＡによりトランスフォームし、 ｄ）培養条件を、調節されるプロモーターがスイッチ・オフされて、機能的に
類似の遺伝子を含むＳ．セレビシエ細胞のみが生存し得るように変化させ、 ｅ）このｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを単離して分析する。
【００１４】 こうして、この発明は、第一のステップにおいて、Ｓ．セレビシエ由来の必須
遺伝子が同定されることを開示する。この発明は又、他の真菌類由来の必須遺伝
子がＳ．セレビシエにおいて同定された必須遺伝子から出発して同定されること
をも開示する。Ｓ．セレビシエの必須遺伝子を同定するためには、個々のゲノム
の遺伝子を相同組換えにより除去する。そうして除去されたＤＮＡセグメントが
必須遺伝子に関係するものであれば、その欠失は、一倍体型のＳ．セレビシエ細
胞にとって致死的である。
遺伝子が同定されることを開示する。この発明は又、他の真菌類由来の必須遺伝
子がＳ．セレビシエにおいて同定された必須遺伝子から出発して同定されること
をも開示する。Ｓ．セレビシエの必須遺伝子を同定するためには、個々のゲノム
の遺伝子を相同組換えにより除去する。そうして除去されたＤＮＡセグメントが
必須遺伝子に関係するものであれば、その欠失は、一倍体型のＳ．セレビシエ細
胞にとって致死的である。
【００１５】 調べるＳ．セレビシエ遺伝子をマーカー遺伝子で置き換える方法を用いて、Ｓ
．セレビシエの対応するゲノムの欠失を生成し、その欠失を含むＳ．セレビシエ
細胞を測定することができる。
．セレビシエの対応するゲノムの欠失を生成し、その欠失を含むＳ．セレビシエ
細胞を測定することができる。
【００１６】 選択マーカーとして、例えば、優性選択マーカー(例えば、カナマイシン耐性
遺伝子)又は栄養要求性マーカーを用いることができる。栄養要求性マーカーと
しては、アミノ酸又は核酸塩基合成のキー酵素をコードする遺伝子を利用するこ
とができる。例えば、Ｓ．セレビシエ由来の下記の遺伝子を選択マーカーとして
利用することができる：ロイシン(例えば、ＬＥＵ２遺伝子)、ヒスチジン(例え
ば、ＨＩＳ３遺伝子)若しくはトリプトファン(例えば、ＴＲＰ１遺伝子)の代謝
経路をコードする遺伝子又はウラシルの核酸塩基の代謝のための遺伝子(例えば
、ＵＲＡ３遺伝子)。
遺伝子)又は栄養要求性マーカーを用いることができる。栄養要求性マーカーと
しては、アミノ酸又は核酸塩基合成のキー酵素をコードする遺伝子を利用するこ
とができる。例えば、Ｓ．セレビシエ由来の下記の遺伝子を選択マーカーとして
利用することができる：ロイシン(例えば、ＬＥＵ２遺伝子)、ヒスチジン(例え
ば、ＨＩＳ３遺伝子)若しくはトリプトファン(例えば、ＴＲＰ１遺伝子)の代謝
経路をコードする遺伝子又はウラシルの核酸塩基の代謝のための遺伝子(例えば
、ＵＲＡ３遺伝子)。
【００１７】 栄養要求性のＳ．セレビシエ株を用いることができる。これらの栄養要求株は
、対応するアミノ酸又はヌクレオチド塩基を含む栄養培地でのみ生育することが
できる。例えば、栄養要求性マーカーを含むすべての実験室Ｓ．セレビシエ株を
用いることができる。二倍体のＳ．セレビシエ株を用いる場合には、対応するマ
ーカー遺伝子は、ホモ接合的に変異していなければならない。ＣＥＮ．ＰＫ２株
又はその同質遺伝子的誘導体を用いることができる。
、対応するアミノ酸又はヌクレオチド塩基を含む栄養培地でのみ生育することが
できる。例えば、栄養要求性マーカーを含むすべての実験室Ｓ．セレビシエ株を
用いることができる。二倍体のＳ．セレビシエ株を用いる場合には、対応するマ
ーカー遺伝子は、ホモ接合的に変異していなければならない。ＣＥＮ．ＰＫ２株
又はその同質遺伝子的誘導体を用いることができる。
【００１８】 適当な栄養要求マーカーを含まない株(独立栄養性Ｓ．セレビシエ等)も又、利
用することができる。その場合、優性選択マーカー例えば耐性遺伝子(例えば、
カナマイシン耐性遺伝子)を利用することができる。ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌ
ｏｘＰカセットは、この目的のために有利に利用することができる。
用することができる。その場合、優性選択マーカー例えば耐性遺伝子(例えば、
カナマイシン耐性遺伝子)を利用することができる。ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌ
ｏｘＰカセットは、この目的のために有利に利用することができる。
【００１９】 １つのＳ．セレビシエ遺伝子の全ＤＮＡ配列又はその部分を置き換える相同組
換えのためには、調べるＳ．セレビシエ遺伝子の５’及び３’末端に相同な配列
がマーカー遺伝子の５’及び３’末端で隣接しているＤＮＡ断片を利用する。
換えのためには、調べるＳ．セレビシエ遺伝子の５’及び３’末端に相同な配列
がマーカー遺伝子の５’及び３’末端で隣接しているＤＮＡ断片を利用する。
【００２０】 対応するＤＮＡ断片を調製するために様々な方法を用いることができ、これら
は又、任意の特定のＳ．セレビシエの遺伝子の欠失のためにも適している。線状
ＤＮＡ断片が、適当なＳ．セレビシエ株のトランスフォーメーションのために用
いられる。この断片を、相同組換えによりＳ．セレビシエゲノム中に組み込む。
これらの方法は、下記を含む： １．欠失カセットの調製のための「慣用の方法」(Rothstein, R.J. (1983) Me
thods in Enzymology, 101巻、202-211)。 ２．ＰＣＲ技術を用いる「慣用の方法」(「改変した慣用の方法」)。 ３．ＳＦＨ(ショートフランキングホモロジー)−ＰＣＲ法(Wach, A.等(1994)
Yeast 10:1793-1808；Gultner, U.等(1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2
524)。
は又、任意の特定のＳ．セレビシエの遺伝子の欠失のためにも適している。線状
ＤＮＡ断片が、適当なＳ．セレビシエ株のトランスフォーメーションのために用
いられる。この断片を、相同組換えによりＳ．セレビシエゲノム中に組み込む。
これらの方法は、下記を含む： １．欠失カセットの調製のための「慣用の方法」(Rothstein, R.J. (1983) Me
thods in Enzymology, 101巻、202-211)。 ２．ＰＣＲ技術を用いる「慣用の方法」(「改変した慣用の方法」)。 ３．ＳＦＨ(ショートフランキングホモロジー)−ＰＣＲ法(Wach, A.等(1994)
Yeast 10:1793-1808；Gultner, U.等(1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2
524)。
【００２１】 １．Ｓ．セレビシエゲノムにおける欠失カセットの調製のための「慣用の方法
」において、調べるべき遺伝子は、適当なベクター中に既に存在するか又はかか
るベクター中に組み込まれる。この方法を用いると、例えば、任意のｐＢＲ−、
ｐＵＣ−及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商標)−誘導体を用いることができる
。標的遺伝子配列の主要部は、例えば適当な制限部位を用いてベクターから除去
されるが、ベクター内の調べられる遺伝子の３’−及び５’−領域は保存される
。選択したマーカー遺伝子を、残った領域の間に組み込む。
」において、調べるべき遺伝子は、適当なベクター中に既に存在するか又はかか
るベクター中に組み込まれる。この方法を用いると、例えば、任意のｐＢＲ−、
ｐＵＣ−及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商標)−誘導体を用いることができる
。標的遺伝子配列の主要部は、例えば適当な制限部位を用いてベクターから除去
されるが、ベクター内の調べられる遺伝子の３’−及び５’−領域は保存される
。選択したマーカー遺伝子を、残った領域の間に組み込む。
【００２２】 ２．この「慣用の方法」の改変形態においては、ＰＣＲを利用する。この方法
は、調べるＳ．セレビシエの遺伝子のコード配列の３’−及び５’−末端領域の
増幅を可能にする。この方法は、調べる遺伝子の両末端領域を選択的に増幅し、
それ故、各調べる遺伝子について２つのＰＣＲ反応を行わなければならない(遺
伝子の５’末端を一回増幅し、３’末端を一回増幅する)。増幅された末端ＤＮ
Ａ断片の長さは、存在する制限部位に依る。調べる遺伝子の増幅された末端は、
一般に、５０〜５０００塩基対(ｂｐ)の長さを有し、好ましくは、５００〜１０
００ｂｐの長さを有する。
は、調べるＳ．セレビシエの遺伝子のコード配列の３’−及び５’−末端領域の
増幅を可能にする。この方法は、調べる遺伝子の両末端領域を選択的に増幅し、
それ故、各調べる遺伝子について２つのＰＣＲ反応を行わなければならない(遺
伝子の５’末端を一回増幅し、３’末端を一回増幅する)。増幅された末端ＤＮ
Ａ断片の長さは、存在する制限部位に依る。調べる遺伝子の増幅された末端は、
一般に、５０〜５０００塩基対(ｂｐ)の長さを有し、好ましくは、５００〜１０
００ｂｐの長さを有する。
【００２３】 ＰＣＲ反応のためのテンプレートとしては、Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡ又
は野生型遺伝子を用いることができる。プライマー対(各々、センス及びアンチ
センスプライマーよりなる)は、調べるＳ．セレビシエ遺伝子の３’末端及び５
’末端配列に対応するように構築する。特に、このプライマーは、適当な制限部
位による組込みを可能にするように選択する。
は野生型遺伝子を用いることができる。プライマー対(各々、センス及びアンチ
センスプライマーよりなる)は、調べるＳ．セレビシエ遺伝子の３’末端及び５
’末端配列に対応するように構築する。特に、このプライマーは、適当な制限部
位による組込みを可能にするように選択する。
【００２４】 ベクターとしては、ｐＢＲ−、ｐＵＣ−及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商
標)−誘導体を用いることができる。特に、選択マーカーをコードする遺伝子を
既に含んでいるベクターは、適当である。特に、選択マーカーＨＩＳ３、ＬＥＵ
２、ＴＲＰ１又はＵＲＡ３の遺伝子を含むベクターを用いることができる。
標)−誘導体を用いることができる。特に、選択マーカーをコードする遺伝子を
既に含んでいるベクターは、適当である。特に、選択マーカーＨＩＳ３、ＬＥＵ
２、ＴＲＰ１又はＵＲＡ３の遺伝子を含むベクターを用いることができる。
【００２５】 ＰＣＲにより得られた調べるＳ．セレビシエ遺伝子のＤＮＡセグメントを、こ
のベクター中に選択マーカーの両側に組み込み、続いて、「慣用の方法」におけ
るように、選択マーカーが、調べる遺伝子と相同であるＤＮＡ配列と両端で隣接
するようにする。
のベクター中に選択マーカーの両側に組み込み、続いて、「慣用の方法」におけ
るように、選択マーカーが、調べる遺伝子と相同であるＤＮＡ配列と両端で隣接
するようにする。
【００２６】 ３．Ｓ．セレビシエにおける相同組換えは非常に効率的に且つ正確な様式で起
き、選択マーカー遺伝子に隣接している調べるＳ．セレビシエ遺伝子に相同なＤ
ＮＡ配列の長さは、事実上、「改変した慣用の方法」を用いた場合よりかなり短
くてよい。調べるＳ．セレビシエ遺伝子に相同な隣接する両末端部は、約２０〜
６０ｂｐ(好ましくは、３０〜４５ｂｐ)の長さを与えることを要するだけである
。このＳＦＨ−ＰＣＲ法は、面倒なクローニング工程を不必要にするので、特に
有利である。
き、選択マーカー遺伝子に隣接している調べるＳ．セレビシエ遺伝子に相同なＤ
ＮＡ配列の長さは、事実上、「改変した慣用の方法」を用いた場合よりかなり短
くてよい。調べるＳ．セレビシエ遺伝子に相同な隣接する両末端部は、約２０〜
６０ｂｐ(好ましくは、３０〜４５ｂｐ)の長さを与えることを要するだけである
。このＳＦＨ−ＰＣＲ法は、面倒なクローニング工程を不必要にするので、特に
有利である。
【００２７】 ＰＣＲ反応を、使用する選択マーカーの遺伝子を含むＤＮＡテンプレート上で
行い、ここに、プライマーは、センスプライマーのＤＮＡ配列が選択マーカー配
列の５’末端に相同であり且つこのプライマーが好ましくは４０ヌクレオチドの
領域(調べるＳ．セレビシエ遺伝子の５’末端配列に対応する)をその５’末端に
更に与えるように構築したものである。アンチセンスプライマーは、同様にして
構築し(即ち、それは、選択マーカーの遺伝子配列の３’末端に相補的である)、
ここに、このプライマーは、その５’末端に、やはり、好ましくは４０ヌクレオ
チドの領域(調べる遺伝子の３’末端コード配列の相補鎖に対応する)を含む。
行い、ここに、プライマーは、センスプライマーのＤＮＡ配列が選択マーカー配
列の５’末端に相同であり且つこのプライマーが好ましくは４０ヌクレオチドの
領域(調べるＳ．セレビシエ遺伝子の５’末端配列に対応する)をその５’末端に
更に与えるように構築したものである。アンチセンスプライマーは、同様にして
構築し(即ち、それは、選択マーカーの遺伝子配列の３’末端に相補的である)、
ここに、このプライマーは、その５’末端に、やはり、好ましくは４０ヌクレオ
チドの領域(調べる遺伝子の３’末端コード配列の相補鎖に対応する)を含む。
【００２８】 調べるＳ．セレビシエ遺伝子のＳＦＨ−ＰＣＲ法による増幅のためには、栄養
要求マーカー又は選択マーカーの遺伝子を含むベクターを用いることができる。
特に、プラスミドｐＵＧ６をテンプレートとして用いることができる。このプラ
スミドは、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを含有する(Gultner, U等(
1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2524)。換言すれば、カナマイシン耐性
遺伝子は、両端で、ｌｏｘＰ配列と隣接している(ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏ
ｘＰ)。このカセットは、カナマイシン耐性遺伝子が、調べるべきＳ．セレビシ
エ遺伝子中へのｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットの組み込みの後に、最
後にはＳ．セレビシエゲノムから除去され得るという点において有利である。バ
クテリオファージＰ１のＣｒｅ−レコンビナーゼを、この目的のために利用する
ことができる。Ｃｒｅ−レコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列を認識して、２つのｌ
ｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡの相同組換え過程による除去を誘導する。結果
として、１つのｌｏｘＰ配列だけが残り、いわゆるマーカー再生が起きる(即ち
、このＳ．セレビシエ株は、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを用いて
再びトランスフォームされ得る)。これは、致死的表現型を得るために少なくと
も２つの機能的に類似する遺伝子を欠失させるべき場合に、特に有利である。
要求マーカー又は選択マーカーの遺伝子を含むベクターを用いることができる。
特に、プラスミドｐＵＧ６をテンプレートとして用いることができる。このプラ
スミドは、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを含有する(Gultner, U等(
1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2524)。換言すれば、カナマイシン耐性
遺伝子は、両端で、ｌｏｘＰ配列と隣接している(ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏ
ｘＰ)。このカセットは、カナマイシン耐性遺伝子が、調べるべきＳ．セレビシ
エ遺伝子中へのｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットの組み込みの後に、最
後にはＳ．セレビシエゲノムから除去され得るという点において有利である。バ
クテリオファージＰ１のＣｒｅ−レコンビナーゼを、この目的のために利用する
ことができる。Ｃｒｅ−レコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列を認識して、２つのｌ
ｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡの相同組換え過程による除去を誘導する。結果
として、１つのｌｏｘＰ配列だけが残り、いわゆるマーカー再生が起きる(即ち
、このＳ．セレビシエ株は、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを用いて
再びトランスフォームされ得る)。これは、致死的表現型を得るために少なくと
も２つの機能的に類似する遺伝子を欠失させるべき場合に、特に有利である。
【００２９】 このＰＣＲ法を用いるならば、ＰＣＲ反応プライマーは、それらの３’末端に
おいて、好ましくは２０ヌクレオチド長の配列 (これは、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ
−ｌｏｘＰカセットの左及び／又は右に位置する配列に相同である) であり且つ
５’末端においては、好ましくは４０ヌクレオチド長の配列(これは、調べるべ
き遺伝子の両端に相同である)である。
おいて、好ましくは２０ヌクレオチド長の配列 (これは、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ
−ｌｏｘＰカセットの左及び／又は右に位置する配列に相同である) であり且つ
５’末端においては、好ましくは４０ヌクレオチド長の配列(これは、調べるべ
き遺伝子の両端に相同である)である。
【００３０】 これらの３つの方法を用いて、調べるべき遺伝子の相同配列が両側で隣接して
いる選択マーカーをコードする遺伝子を含む線状欠失カセットが得られる。これ
らの欠失カセットを、二倍体のＳ．セレビシエ株のトランスフォーメーションに
用いる。例えば、二倍体株のＳ．セレビシエＣＥＮ．ＰＫ２(Scientific Resear
ch & Development GmbH, Oberursel)を、この目的のために用いることができる
。[ＣＥＮ．ＰＫ２ Ｍａｔａ／ＭＡＴα ｕｒａ３−５２／ｕｒａ３−５２
ｌｅｕ２−３、１１２／ｌｅｕ２−３、１１２ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１ ｔ
ｒｐ１−２８９／ｔｒｐ１−２８９ ＭＡＬ２−８c／ＭＡＬ２−８c ＳＵＣ２
／ＳＵＣ２]
いる選択マーカーをコードする遺伝子を含む線状欠失カセットが得られる。これ
らの欠失カセットを、二倍体のＳ．セレビシエ株のトランスフォーメーションに
用いる。例えば、二倍体株のＳ．セレビシエＣＥＮ．ＰＫ２(Scientific Resear
ch & Development GmbH, Oberursel)を、この目的のために用いることができる
。[ＣＥＮ．ＰＫ２ Ｍａｔａ／ＭＡＴα ｕｒａ３−５２／ｕｒａ３−５２
ｌｅｕ２−３、１１２／ｌｅｕ２−３、１１２ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１ ｔ
ｒｐ１−２８９／ｔｒｐ１−２８９ ＭＡＬ２−８c／ＭＡＬ２−８c ＳＵＣ２
／ＳＵＣ２]
【００３１】 このＣＥＮ．ＰＫ２株を、公知の方法(Gietz, R.D.等(1992) Nucleic Acids R
esearch 8:1425；Guldener, U.等(1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2524
)を用いて調製して培養する。
esearch 8:1425；Guldener, U.等(1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2524
)を用いて調製して培養する。
【００３２】 用いるＳ．セレビシエ株の細胞を、公知の方法により、この線状欠失カセット
の適当なＤＮＡ量を用いてトランスフォームする(例えば、Sambrook等、1989)。
その後、これらの細胞を培養している培地を、新しい培地、いわゆる選択培地と
交換する{該培地は、対応するアミノ酸(例えば、ヒスチジン、ロイシン又はトリ
プトファン)又は核酸塩基(例えば、ウラシル)を含んでいない}か、又は、カナマ
イシン耐性遺伝子を含む欠失カセットを用いる場合には、ゲネチシン(Ｇ４１８
，登録商標)を含む培地(例えば、ゲネチシンを含有する完全培地(ＹＥＰＤ))と
交換する。或は、トランスフォームした細胞を、対応する培地を用いて調製した
寒天プレート上にプレートすることができる。それにより、相同組換えが起きた
トランスフォーム細胞が選択される(何故なら、これらの改変した条件下では、
それらの細胞しか生育できないから)。
の適当なＤＮＡ量を用いてトランスフォームする(例えば、Sambrook等、1989)。
その後、これらの細胞を培養している培地を、新しい培地、いわゆる選択培地と
交換する{該培地は、対応するアミノ酸(例えば、ヒスチジン、ロイシン又はトリ
プトファン)又は核酸塩基(例えば、ウラシル)を含んでいない}か、又は、カナマ
イシン耐性遺伝子を含む欠失カセットを用いる場合には、ゲネチシン(Ｇ４１８
，登録商標)を含む培地(例えば、ゲネチシンを含有する完全培地(ＹＥＰＤ))と
交換する。或は、トランスフォームした細胞を、対応する培地を用いて調製した
寒天プレート上にプレートすることができる。それにより、相同組換えが起きた
トランスフォーム細胞が選択される(何故なら、これらの改変した条件下では、
それらの細胞しか生育できないから)。
【００３３】 しかしながら、殆どの場合には、二倍体Ｓ．セレビシエ株の二重の染色体セッ
ト中の遺伝子の２つのコピーの内の一方のみがトランスフォーメーションにおい
て欠失カセットのＤＮＡによって置換され、これは、ヘテロ接合の二倍体のＳ．
セレビシエ変異株を生成する。該トランスフォーメーションにおいて、調べる遺
伝子の１コピーが選択マーカーにより置換されるが、この遺伝子の他方のコピー
はゲノム中に維持される。これは、必須遺伝子の欠失の場合には、必須遺伝子の
第２のコピーの存在のために、この変異型Ｓ．セレビシエ株が依然として生存可
能であるという利点を与える。
ト中の遺伝子の２つのコピーの内の一方のみがトランスフォーメーションにおい
て欠失カセットのＤＮＡによって置換され、これは、ヘテロ接合の二倍体のＳ．
セレビシエ変異株を生成する。該トランスフォーメーションにおいて、調べる遺
伝子の１コピーが選択マーカーにより置換されるが、この遺伝子の他方のコピー
はゲノム中に維持される。これは、必須遺伝子の欠失の場合には、必須遺伝子の
第２のコピーの存在のために、この変異型Ｓ．セレビシエ株が依然として生存可
能であるという利点を与える。
【００３４】 欠失カセットＤＮＡの予め決めた染色体遺伝子の遺伝子座(調べるべき遺伝子
の遺伝子座)における適当な組み込みを、サザーンブロット分析(Southern, E.M.
(1975) J.Mol.Biol. 98:503-517)により又は特異的プライマーを用いる診断用Ｐ
ＣＲ分析(Guldener, U.等(1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2524)により
チェックすることができる。
の遺伝子座)における適当な組み込みを、サザーンブロット分析(Southern, E.M.
(1975) J.Mol.Biol. 98:503-517)により又は特異的プライマーを用いる診断用Ｐ
ＣＲ分析(Guldener, U.等(1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2524)により
チェックすることができる。
【００３５】 個々の二倍体細胞の遺伝子分離を、四分子分析によりモニターすることができ
る。この目的のためには、二倍体細胞(特に、ヘテロ接合の変異株)において、公
知の方法例えば酢酸カリウムプレート上での窒素欠乏を用いて還元分裂(減数分
裂)を誘導する(Sherman, F.等(1986) Cold Spring Harbor Laboratory Press, C
old Spring Harbor, N.Y.；Guthrie, C.及びFink, G.R.(1991) Methods in Enzy
mology, 194巻、Academic Press, San Diego, 3-21；Ausubel, F.M.等(1987) Cu
rrent Protocol in Molecular Biology John Wiley and Sons, Inc.,第13章)。
減数分裂は、４つの子嚢胞子(分離されている)を有する子嚢のみを生じる。これ
らの子嚢胞子は、その壁のザイモリアーゼ(Ausubel等(1987))での部分的酵素消
化の後にマイクロマニピュレーター(例えば、SINGER)により分離することができ
る。例えば、四分子分析をヘテロ接合の二倍体変異株(該株では、二重の染色体
セット中に存在する必須遺伝子は、一方の染色体において、相同組換えされてい
る)について行った場合には、２つの分離された子嚢胞子(即ち、必須遺伝子を有
するもの)しか生存できない。残りの２つの分離された子嚢胞子は、必須遺伝子
を欠いているので生存できない。
る。この目的のためには、二倍体細胞(特に、ヘテロ接合の変異株)において、公
知の方法例えば酢酸カリウムプレート上での窒素欠乏を用いて還元分裂(減数分
裂)を誘導する(Sherman, F.等(1986) Cold Spring Harbor Laboratory Press, C
old Spring Harbor, N.Y.；Guthrie, C.及びFink, G.R.(1991) Methods in Enzy
mology, 194巻、Academic Press, San Diego, 3-21；Ausubel, F.M.等(1987) Cu
rrent Protocol in Molecular Biology John Wiley and Sons, Inc.,第13章)。
減数分裂は、４つの子嚢胞子(分離されている)を有する子嚢のみを生じる。これ
らの子嚢胞子は、その壁のザイモリアーゼ(Ausubel等(1987))での部分的酵素消
化の後にマイクロマニピュレーター(例えば、SINGER)により分離することができ
る。例えば、四分子分析をヘテロ接合の二倍体変異株(該株では、二重の染色体
セット中に存在する必須遺伝子は、一方の染色体において、相同組換えされてい
る)について行った場合には、２つの分離された子嚢胞子(即ち、必須遺伝子を有
するもの)しか生存できない。残りの２つの分離された子嚢胞子は、必須遺伝子
を欠いているので生存できない。
【００３６】 この方法で調べた遺伝子が本当に必須であるかどうか又は相同組換えが調べた
遺伝子の遺伝子座に隣接する必須遺伝子の変化を導くかどうかをチェックするた
めに、ヘテロ接合二倍体のＳ．セレビシエ変異株を、該調べた遺伝子を含む動原
体プラスミドでトランスフォームする。
遺伝子の遺伝子座に隣接する必須遺伝子の変化を導くかどうかをチェックするた
めに、ヘテロ接合二倍体のＳ．セレビシエ変異株を、該調べた遺伝子を含む動原
体プラスミドでトランスフォームする。
【００３７】 トランスフォーマントについて四分子分析を行う。２つでなくて４つの生存可
能な分離子嚢胞子が得られた場合には、動原体プラスミドに含まれる調べた遺伝
子は、２つの生存可能でない一倍体Ｓ．セレビシエ細胞／変異株の欠損を補完す
ることができ、これは、その調べたＳ．セレビシエ遺伝子が必須であることを示
している。
能な分離子嚢胞子が得られた場合には、動原体プラスミドに含まれる調べた遺伝
子は、２つの生存可能でない一倍体Ｓ．セレビシエ細胞／変異株の欠損を補完す
ることができ、これは、その調べたＳ．セレビシエ遺伝子が必須であることを示
している。
【００３８】 好ましくは、低コピー数(例えば、細胞当たり１個又は２個)で存在するプラス
ミドを、動原体プラスミドとして用いる。例えば、プラスミドｐＲＳ３１３、ｐ
ＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５及びｐＲＳ３１６(Sijkorski, R.S.及びHieter, P.(1
989) Genetics 122:19-27)又は類似のプラスミドをこの目的のために用いること
ができる。好ましくは、調べた遺伝子を、それらの３’及び５’末端非コード領
域を含めて該プラスミドに組み込む。
ミドを、動原体プラスミドとして用いる。例えば、プラスミドｐＲＳ３１３、ｐ
ＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５及びｐＲＳ３１６(Sijkorski, R.S.及びHieter, P.(1
989) Genetics 122:19-27)又は類似のプラスミドをこの目的のために用いること
ができる。好ましくは、調べた遺伝子を、それらの３’及び５’末端非コード領
域を含めて該プラスミドに組み込む。
【００３９】 個々のＳ．セレビシエ遺伝子は、上記の方法を用いて調べることができ、それ
らの配列は、全部又は部分的に公知である。Ｓ．セレビシエの完全なゲノム配列
は、１９９６年４月２４日に、ＷＷＷ(World Wide Web)により誰でもアクセスす
ることが可能となった。
らの配列は、全部又は部分的に公知である。Ｓ．セレビシエの完全なゲノム配列
は、１９９６年４月２４日に、ＷＷＷ(World Wide Web)により誰でもアクセスす
ることが可能となった。
【００４０】 ＷＷＷによってＳ．セレビシエのゲノムＤＮＡ配列にアクセスすることには、
種々の可能性がある。
種々の可能性がある。
【００４１】 ＭＩＰＳ(Munich information Centre of Protein Sequence) アドレス htt
p://speedy.mips.biochem.mpq.de/mips/yeast/
p://speedy.mips.biochem.mpq.de/mips/yeast/
【００４２】 ＳＧＤ(Saccharomyces Genome Database, Stanford) アドレス http://geno
me-www.stanford.edu/Saccharomyces
me-www.stanford.edu/Saccharomyces
【００４３】 ＹＰＤ(Yeast Protein Database, Cold Spring Harbor) アドレス http://w
ww.proteome.com/YPDhome.html
ww.proteome.com/YPDhome.html
【００４４】 完全なＳ．セレビシエＤＮＡ配列は又、欧州においては、ＦＴＰ(file transf
er protocol)によってもアクセスすることができ(例えば、アドレス：ftp.mips.
embnet.org)、米国(アドレス：genome-ftp.stanford.edu)又は日本(アドレス：f tp.nig.ac.jp )においてもアクセスできる。
er protocol)によってもアクセスすることができ(例えば、アドレス：ftp.mips.
embnet.org)、米国(アドレス：genome-ftp.stanford.edu)又は日本(アドレス：f tp.nig.ac.jp )においてもアクセスできる。
【００４５】 完全なＳ．セレビシエのＤＮＡ配列は、Natureの臨時増刊号No 387(1997)に公
開された。
開された。
【００４６】 ９０個の必須のゲノムＳ．セレビシエ遺伝子が、この方法により同定された。
これらの必須遺伝子を表１に列記した。表１は、必須遺伝子の系統的遺伝子名(
データバンクで対応するＤＮＡ配列にアクセスできる名称に対応する)、必須遺
伝子の欠失ヌクレオチド及びこれらの対応アミノ酸(１位を基準とし、この最後
のものは、ＯＲＦの概然的開始コドンＡＴＧのＡに対応する)を含んでいる。欠
失ヌクレオチドは、遺伝子中で欠失したヌクレオチドに対応し、欠失アミノ酸は
、コードされる蛋白質中で失われたアミノ酸に対応する。更に、ａａは、コード
される蛋白質中に存在するアミノ酸の総数に対応する。欠失ヌクレオチドの数は
、必ずしも欠失アミノ酸の数の３倍に相当しない；これは、遺伝子が、コードさ
れるアミノ酸に対する読み枠より大きいという事実により説明される。例えば、
ＹＭＲ１３４ｗは、２３７ａａの蛋白質をコードし、欠失はヌクレオチド５から
始まって(ＡＴＧから数える)ヌクレオチド７４０まで続き、これは、ターミネー
ター領域の部分をも含み、該領域はアミノ酸をコードしていない(それ故、アミ
ノ酸の欠失は、ａａ２からこの２３７アミノ酸の蛋白質の最後までである)。更
に、個々の遺伝子若しくはコードされる蛋白質の機能及び／又は他の遺伝子若し
くは蛋白質に対する相同性／類似性に関する利用可能な情報を示してある。遺伝
子の欠失のために適したＤＮＡ断片の調製のためのＰＣＲ反応に用いたプライマ
ーを表２に示してあるが、Ｓ１及びＳ２は、それぞれ、順方向及び逆向きプライ
マーであり、肉太文字は、個々の遺伝子のヌクレオチドに対応する。
これらの必須遺伝子を表１に列記した。表１は、必須遺伝子の系統的遺伝子名(
データバンクで対応するＤＮＡ配列にアクセスできる名称に対応する)、必須遺
伝子の欠失ヌクレオチド及びこれらの対応アミノ酸(１位を基準とし、この最後
のものは、ＯＲＦの概然的開始コドンＡＴＧのＡに対応する)を含んでいる。欠
失ヌクレオチドは、遺伝子中で欠失したヌクレオチドに対応し、欠失アミノ酸は
、コードされる蛋白質中で失われたアミノ酸に対応する。更に、ａａは、コード
される蛋白質中に存在するアミノ酸の総数に対応する。欠失ヌクレオチドの数は
、必ずしも欠失アミノ酸の数の３倍に相当しない；これは、遺伝子が、コードさ
れるアミノ酸に対する読み枠より大きいという事実により説明される。例えば、
ＹＭＲ１３４ｗは、２３７ａａの蛋白質をコードし、欠失はヌクレオチド５から
始まって(ＡＴＧから数える)ヌクレオチド７４０まで続き、これは、ターミネー
ター領域の部分をも含み、該領域はアミノ酸をコードしていない(それ故、アミ
ノ酸の欠失は、ａａ２からこの２３７アミノ酸の蛋白質の最後までである)。更
に、個々の遺伝子若しくはコードされる蛋白質の機能及び／又は他の遺伝子若し
くは蛋白質に対する相同性／類似性に関する利用可能な情報を示してある。遺伝
子の欠失のために適したＤＮＡ断片の調製のためのＰＣＲ反応に用いたプライマ
ーを表２に示してあるが、Ｓ１及びＳ２は、それぞれ、順方向及び逆向きプライ
マーであり、肉太文字は、個々の遺伝子のヌクレオチドに対応する。
【００４７】 表１のデータは、Ｓ．レセビシエ遺伝子ＤＮＡ配列が公知であるという事実に
もかかわらず、今日、これらの遺伝子の機能、特性、これらの遺伝子若しくはそ
れらによりコードされる蛋白質の必須機能に関して非常に僅かのことしか知られ
ていないということをきわだたせている。
もかかわらず、今日、これらの遺伝子の機能、特性、これらの遺伝子若しくはそ
れらによりコードされる蛋白質の必須機能に関して非常に僅かのことしか知られ
ていないということをきわだたせている。
【００４８】 この方法の一具体例によれば、Ｓ．セレビシエの必須遺伝子を用いて、他の真
菌類の対応する機能的に類似の遺伝子を同定する。
菌類の対応する機能的に類似の遺伝子を同定する。
【００４９】 他の真菌種の機能的に類似する遺伝子とは、Ｓ．セレビシエの同定された必須
遺伝子の機能と類似した又は同じ機能を有する遺伝子を意味する。しかし、他の
真菌類の機能的に類似する遺伝子は、配列において、対応する必須Ｓ．セレビシ
エ遺伝子と相同である必要はない。他の真菌類の機能的に類似する遺伝子は、ヌ
クレオチドレベルにおいて、対応する必須Ｓ．セレビシエ遺伝子に対する中位の
配列相同性だけを示せばよい。中位の配列相同性とは、本発明においては、ヌク
レオチドレベルにおいて、少なくとも５０％の、一層好ましくは少なくとも６０
％の、最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する遺伝子を意味する
。
遺伝子の機能と類似した又は同じ機能を有する遺伝子を意味する。しかし、他の
真菌類の機能的に類似する遺伝子は、配列において、対応する必須Ｓ．セレビシ
エ遺伝子と相同である必要はない。他の真菌類の機能的に類似する遺伝子は、ヌ
クレオチドレベルにおいて、対応する必須Ｓ．セレビシエ遺伝子に対する中位の
配列相同性だけを示せばよい。中位の配列相同性とは、本発明においては、ヌク
レオチドレベルにおいて、少なくとも５０％の、一層好ましくは少なくとも６０
％の、最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する遺伝子を意味する
。
【００５０】 更には、他の真菌類の機能的に類似する遺伝子は、配列において、必須Ｓ．セ
レビシエ遺伝子によりコードされる蛋白質に相同な蛋白質をコードする必要はな
い。他の真菌類の機能的に類似する蛋白質は、必須Ｓ．セレビシエ遺伝子により
コードされる蛋白質に対して中位の蛋白質配列相同性を示せばよい。
レビシエ遺伝子によりコードされる蛋白質に相同な蛋白質をコードする必要はな
い。他の真菌類の機能的に類似する蛋白質は、必須Ｓ．セレビシエ遺伝子により
コードされる蛋白質に対して中位の蛋白質配列相同性を示せばよい。
【００５１】 中位の蛋白質配列相同性とは、本発明においては、アミノ酸レベルで、少なく
とも４０％の、好ましくは少なくとも５０％の、一層好ましくは少なくとも６０
％の、最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する蛋白質を意味する
。
とも４０％の、好ましくは少なくとも５０％の、一層好ましくは少なくとも６０
％の、最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する蛋白質を意味する
。
【００５２】 配列において相同な遺伝子を、公知の方法例えば相同スクリーニング(Sambroo
k, J.等(1989) Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y
.)又は対応する真菌類のゲノムライブラリー及び／又はｃＤＮＡライブラリー由
来の特異的プライマーを用いるＰＣＲ技術によって単離することができる。
k, J.等(1989) Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y
.)又は対応する真菌類のゲノムライブラリー及び／又はｃＤＮＡライブラリー由
来の特異的プライマーを用いるＰＣＲ技術によって単離することができる。
【００５３】 一具体例によれば、配列において相同な遺伝子を、ｃＤＮＡライブラリーから
単離する。他の真菌類の機能的に類似する遺伝子を見出すために、ｍＲＮＡを、
調べるべき真菌種から公知の方法(Sambrook等、1989)によって単離し、ｃＤＮＡ
を、公知の方法(Sambrook等、1989；又はｃＤＮＡ合成キット例えばSTRATAGENE)
によって合成する。
単離する。他の真菌類の機能的に類似する遺伝子を見出すために、ｍＲＮＡを、
調べるべき真菌種から公知の方法(Sambrook等、1989)によって単離し、ｃＤＮＡ
を、公知の方法(Sambrook等、1989；又はｃＤＮＡ合成キット例えばSTRATAGENE)
によって合成する。
【００５４】 調製したｃＤＮＡを、向きを定めて、適当な発現ベクター中に組み込む。
【００５５】 例えば、第１のｃＤＮＡ鎖の合成を、発現ベクターのプロモーターに関して適
当な向きでその後のクローニングを可能にする適当な制限部位を有するプライマ
ーの存在下で行うことができる。制限部位としては、任意の公知の制限部位を用
いることができる。プライマーとしては、例えば、下記の５０ヌクレオチド長の
プライマーを用いることができる：
当な向きでその後のクローニングを可能にする適当な制限部位を有するプライマ
ーの存在下で行うことができる。制限部位としては、任意の公知の制限部位を用
いることができる。プライマーとしては、例えば、下記の５０ヌクレオチド長の
プライマーを用いることができる：
【化１】 5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTXXXXXXTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
【００５６】 配列(Ｘ)6は、適当な制限部位(例えば、ＸｈｏＩ)を表す。
【００５７】 ２本鎖の合成の後に、この２本鎖ｃＤＮＡの粘着性末端を満たし(鈍端化)、次
いで、これらのｃＤＮＡ末端を、適当なＤＮＡアダプター配列を用いて連結する
。このＤＮＡアダプター配列は、第１のｃＤＮＡ鎖の合成のためのプライマー中
で用いた制限部位と異なる制限部位を含むべきである。このＤＮＡアダプターは
、例えば、相補的な９量体又は１３量体オリゴヌクレオチド(その末端は、制限
部位の粘着性末端を表す)を含んでよい。これらの末端は、例えば、ＥｃｏＲＩ
部位であってよい：
いで、これらのｃＤＮＡ末端を、適当なＤＮＡアダプター配列を用いて連結する
。このＤＮＡアダプター配列は、第１のｃＤＮＡ鎖の合成のためのプライマー中
で用いた制限部位と異なる制限部位を含むべきである。このＤＮＡアダプターは
、例えば、相補的な９量体又は１３量体オリゴヌクレオチド(その末端は、制限
部位の粘着性末端を表す)を含んでよい。これらの末端は、例えば、ＥｃｏＲＩ
部位であってよい：
【化２】 ５’ ＸＸＸＸＸＧＧＣＡＣＧＡＧ ３’ ３’ ＸＣＣＧＴＧＣＴＣ ５’
【００５８】 アダプター配列中の一本鎖のＸは、制限部位の粘着性末端を表す。
【００５９】 対応するアダプター配列と共に用意したｃＤＮＡを、次いで、制限エンドヌク
レアーゼ(その認識部位が、第１のｃＤＮＡ鎖の合成のためのプライマー中で用
いられたもの、例えばＸｈｏＩ)を用いて開裂させる。こうして得られたｃＤＮ
Ａは、この例によれば、３’−ＸｈｏＩ及び５’−ＥｃｏＲＩ突出末端を有し、
それ故、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで開裂させた発現ベクター中に向きを定めて組
み込むことができよう。
レアーゼ(その認識部位が、第１のｃＤＮＡ鎖の合成のためのプライマー中で用
いられたもの、例えばＸｈｏＩ)を用いて開裂させる。こうして得られたｃＤＮ
Ａは、この例によれば、３’−ＸｈｏＩ及び５’−ＥｃｏＲＩ突出末端を有し、
それ故、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで開裂させた発現ベクター中に向きを定めて組
み込むことができよう。
【００６０】 発現ベクターとしては、他のものの内で、大腸菌／Ｓ．セレビシエシャトルベ
クター(即ち、大腸菌並びにＳ．セレビシエ中で用い得るベクター)が、適してい
る。次いで、かかるベクターを、例えば大腸菌内で増幅することができる。発現
ベクターとしては、Ｓ．セレビシエ細胞中に高コピー数で存在するもの並びに低
コピー数で存在するものを用いることができる。この目的のためには、例えば、
ｐＲＳ４２３−ｐＲＳ４２６(ｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、ｐ
ＲＳ４２６)及び／又はｐＲＳ３１３−ｐＲＳ３１６(ｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１
４、ｐＲＳ３１５、ｐＲＳ３１６)(Sikorki, R.S.及びHieter, P.(1989) Geneti
cs 122:19-27；Christianson T.W.等(1992) Gene 110:119-122)よりなる群から
選択するベクターが適当である。
クター(即ち、大腸菌並びにＳ．セレビシエ中で用い得るベクター)が、適してい
る。次いで、かかるベクターを、例えば大腸菌内で増幅することができる。発現
ベクターとしては、Ｓ．セレビシエ細胞中に高コピー数で存在するもの並びに低
コピー数で存在するものを用いることができる。この目的のためには、例えば、
ｐＲＳ４２３−ｐＲＳ４２６(ｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、ｐ
ＲＳ４２６)及び／又はｐＲＳ３１３−ｐＲＳ３１６(ｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１
４、ｐＲＳ３１５、ｐＲＳ３１６)(Sikorki, R.S.及びHieter, P.(1989) Geneti
cs 122:19-27；Christianson T.W.等(1992) Gene 110:119-122)よりなる群から
選択するベクターが適当である。
【００６１】 発現ベクターは、適当なＳ．セレビシエプロモーター及びターミネーターを含
むべきである。それらがこれらのエレメントを有しない場合には、対応するプロ
モーター及びターミネーターを、生成したｃＤＮＡの引き続いての組み込みが可
能であり続けるような仕方で挿入する。特に好適なのは、Ｓ．セレビシエ遺伝子
ＭＥＴ２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３のプロモータ
ーである。未改変型の野生型遺伝子のプロモーター並びに、ある種のアクチベー
ター配列及び／又はリプレッサー配列が除去されるような仕方で改変したプロモ
ーターを利用することができる。ターミネーターとしては、例えば、Ｓ．セレビ
シエ遺伝子ＭＥＴ２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３の
ターミネーターが好適である。
むべきである。それらがこれらのエレメントを有しない場合には、対応するプロ
モーター及びターミネーターを、生成したｃＤＮＡの引き続いての組み込みが可
能であり続けるような仕方で挿入する。特に好適なのは、Ｓ．セレビシエ遺伝子
ＭＥＴ２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３のプロモータ
ーである。未改変型の野生型遺伝子のプロモーター並びに、ある種のアクチベー
ター配列及び／又はリプレッサー配列が除去されるような仕方で改変したプロモ
ーターを利用することができる。ターミネーターとしては、例えば、Ｓ．セレビ
シエ遺伝子ＭＥＴ２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３の
ターミネーターが好適である。
【００６２】 他の具体例によれば、配列において相同な遺伝子は、ゲノムライブラリーから
単離される。真菌類由来のゲノムＤＮＡライブラリーは、公知の手順に従って調
製することができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley and Sons, Incに記載のように)。例えば、真菌類由来のゲノムＤＮＡは、
酵母細胞溶解及びゲノムＤＮＡの単離についての公知の方法(例えば、Bio101, I
ncから市販されているキット)を用いて調製することができる。このゲノムＤＮ
Ａを、制限酵素例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分消化し、断片をアガロースゲル
電気泳動によりサイズで分離する。例えば５〜１０ｋｂのサイズを有するＤＮＡ
断片を、次いで、古典的方法により(例えば、Bio101から市販されているGene Cl
eanキットを用いて)精製し、適合性末端を与える制限酵素(例えば、Ｓａｕ３Ａ
Ｉで切ったゲノムＤＮＡに対するＢａｍＨＩ)により切断した大腸菌／酵母シャ
トルベクター例えばＹＥＰ２４に挿入する(例えば、Sanglard D.、Kuchler K.、
Ischer F.、Pagani J-L.、Monod M.及びBille J. Antimicrobial Agents and Ch
emotherapy, (1995) Vol.39 No11, p2378-2386に記載されている)。その結果生
成した発現ライブラリーを大腸菌中で増幅させることができる。しかしながら、
ゲノムライブラリーの調製に適した如何なる公知の方法も、本発明において使用
することができる。
単離される。真菌類由来のゲノムＤＮＡライブラリーは、公知の手順に従って調
製することができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley and Sons, Incに記載のように)。例えば、真菌類由来のゲノムＤＮＡは、
酵母細胞溶解及びゲノムＤＮＡの単離についての公知の方法(例えば、Bio101, I
ncから市販されているキット)を用いて調製することができる。このゲノムＤＮ
Ａを、制限酵素例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分消化し、断片をアガロースゲル
電気泳動によりサイズで分離する。例えば５〜１０ｋｂのサイズを有するＤＮＡ
断片を、次いで、古典的方法により(例えば、Bio101から市販されているGene Cl
eanキットを用いて)精製し、適合性末端を与える制限酵素(例えば、Ｓａｕ３Ａ
Ｉで切ったゲノムＤＮＡに対するＢａｍＨＩ)により切断した大腸菌／酵母シャ
トルベクター例えばＹＥＰ２４に挿入する(例えば、Sanglard D.、Kuchler K.、
Ischer F.、Pagani J-L.、Monod M.及びBille J. Antimicrobial Agents and Ch
emotherapy, (1995) Vol.39 No11, p2378-2386に記載されている)。その結果生
成した発現ライブラリーを大腸菌中で増幅させることができる。しかしながら、
ゲノムライブラリーの調製に適した如何なる公知の方法も、本発明において使用
することができる。
【００６３】 調べる真菌種において、Ｓ．セレビシエの必須遺伝子と機能的に類似する遺伝
子を見出すために、一のＳ．セレビシエ必須遺伝子を調節されたプロモーターの
制御下に置く(組み込まれた遺伝子(１)又は染色体外遺伝子(２)として)。
子を見出すために、一のＳ．セレビシエ必須遺伝子を調節されたプロモーターの
制御下に置く(組み込まれた遺伝子(１)又は染色体外遺伝子(２)として)。
【００６４】 １．Ｓ．セレビシエにおける調節されたプロモーターの組込みのためには、選
択した必須遺伝子の自然のプロモーターを、例えばＰＣＲによる相同組換えによ
って、調節されたプロモーターで置き換える(Guldener等(1996))。ＰＣＲによる
相同組換えは、例えば、二倍体のＳ．セレビシエ株ＣＥＮ．ＰＫ２において行う
ことができる。一染色体への上首尾の組込みは、一倍体細胞において、四分子分
析によりチェックすることができる。
択した必須遺伝子の自然のプロモーターを、例えばＰＣＲによる相同組換えによ
って、調節されたプロモーターで置き換える(Guldener等(1996))。ＰＣＲによる
相同組換えは、例えば、二倍体のＳ．セレビシエ株ＣＥＮ．ＰＫ２において行う
ことができる。一染色体への上首尾の組込みは、一倍体細胞において、四分子分
析によりチェックすることができる。
【００６５】 四分子分析を用いて、４つの生存可能な子嚢胞子を得る(２つの分離した一倍
体の子嚢胞子においては、選択した必須遺伝子が自然のプロモーターの制御下に
置かれており、他方、残りの２つの分離した子嚢胞子においては、必須遺伝子は
調節されたプロモーターの制御下に置かれている)。
体の子嚢胞子においては、選択した必須遺伝子が自然のプロモーターの制御下に
置かれており、他方、残りの２つの分離した子嚢胞子においては、必須遺伝子は
調節されたプロモーターの制御下に置かれている)。
【００６６】 最後に挙げた一倍体の分離した子嚢胞子は、組換えベクター中に存在するｃＤ
ＮＡ又はゲノムＤＮＡでのトランスフォーメーションに用いる。
ＮＡ又はゲノムＤＮＡでのトランスフォーメーションに用いる。
【００６７】 ２．染色体外変法を用いて、選択した必須Ｓ．セレビシエ遺伝子を先ず適当な
発現ベクター例えば大腸菌／Ｓ．セレビシエシャトルベクターに挿入する。この
目的のために、必須遺伝子を、ゲノムＳ．セレビシエＤＮＡからのＰＣＲにより
増幅することができる(ＡＴＧ開始コドン〜終止コドン)。この目的のために用い
るプライマーは、それらが、その後の発現ベクター中の調節されたプロモーター
の制御下への挿入を容易にする適当な制限酵素の認識部位を含むような仕方で構
築することができる。
発現ベクター例えば大腸菌／Ｓ．セレビシエシャトルベクターに挿入する。この
目的のために、必須遺伝子を、ゲノムＳ．セレビシエＤＮＡからのＰＣＲにより
増幅することができる(ＡＴＧ開始コドン〜終止コドン)。この目的のために用い
るプライマーは、それらが、その後の発現ベクター中の調節されたプロモーター
の制御下への挿入を容易にする適当な制限酵素の認識部位を含むような仕方で構
築することができる。
【００６８】 続いて、この組換え発現ベクターを、調節されたプロモーターの制御下の必須
Ｓ．セレビシエ遺伝子のプラスミドコピーと共に、対応する変異対立遺伝子のト
ランス相補に用いる。対応する変異対立遺伝子は、表１に列記した必須真菌類遺
伝子(表１の第１欄)を上記のように相同組換えにより部分的に又は全体的に除去
して調製したヘテロ接合の二倍体変異株から選択することができる。
Ｓ．セレビシエ遺伝子のプラスミドコピーと共に、対応する変異対立遺伝子のト
ランス相補に用いる。対応する変異対立遺伝子は、表１に列記した必須真菌類遺
伝子(表１の第１欄)を上記のように相同組換えにより部分的に又は全体的に除去
して調製したヘテロ接合の二倍体変異株から選択することができる。
【００６９】 選択した必須Ｓ．セレビシエ遺伝子を有する発現ベクターを、その選択した必
須Ｓ．セレビシエ遺伝子の代わりに選択マーカー遺伝子を有する対応するヘテロ
接合の二倍体変異株にトランスフォームする。これらのトランスフォーマントを
、用いた発現ベクター中に含まれる栄養要求マーカーに基づく選択により単離す
る。こうしてトランスフォームされたヘテロ接合の二倍体変異株を、四分子分析
にかける。４つの生存可能な分離した子嚢胞子が得られる。変異対立遺伝子及び
発現ベクターの対応するマーカーをさかのぼって調べることにより、トランスフ
ォームされた野生型の分離子嚢胞子を、必須遺伝子のゲノムコピーを含まない分
離子嚢胞子から識別することができる。選択した必須遺伝子のゲノムコピーを含
まない分離子嚢胞子は、トランス相補される一倍体変異株として示される。続い
て、それらを、適当なベクター中に存在する他の真菌種に由来するｃＤＮＡ又は
ゲノムＤＮＡライブラリーによるトランスフォーメーションに用いる。
須Ｓ．セレビシエ遺伝子の代わりに選択マーカー遺伝子を有する対応するヘテロ
接合の二倍体変異株にトランスフォームする。これらのトランスフォーマントを
、用いた発現ベクター中に含まれる栄養要求マーカーに基づく選択により単離す
る。こうしてトランスフォームされたヘテロ接合の二倍体変異株を、四分子分析
にかける。４つの生存可能な分離した子嚢胞子が得られる。変異対立遺伝子及び
発現ベクターの対応するマーカーをさかのぼって調べることにより、トランスフ
ォームされた野生型の分離子嚢胞子を、必須遺伝子のゲノムコピーを含まない分
離子嚢胞子から識別することができる。選択した必須遺伝子のゲノムコピーを含
まない分離子嚢胞子は、トランス相補される一倍体変異株として示される。続い
て、それらを、適当なベクター中に存在する他の真菌種に由来するｃＤＮＡ又は
ゲノムＤＮＡライブラリーによるトランスフォーメーションに用いる。
【００７０】 調節されるプロモーターとしては、誘導可能プロモーター又は抑制可能プロモ
ーターを用いることができる。これらのプロモーターは、自然に及び／又は人為
的に配置されたプロモーター配列よりなるものであってよい。
ーターを用いることができる。これらのプロモーターは、自然に及び／又は人為
的に配置されたプロモーター配列よりなるものであってよい。
【００７１】 調節されるプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１遺伝子のプロモーター及
び対応するプロモーター誘導体例えば、それらの異なるＵＡＳ(上流活性化配列)
が除去されたプロモーター(ＧＡＬＳ、ＧＡＬＬ；Mumberg, J.等(1994) Nucleic
Acids Research 22:5767-5768)を用いることができる。調節されるプロモータ
ーとしては、ＦＢＰ１、ＰＣＫ１、ＩＣＬ１等の糖新生遺伝子のプロモーター又
はそれらの部分、例えばそれらの活性化配列(ＵＡＳ１及び／又はＵＡＳ２)又は
抑制配列(ＵＲＳ、上流抑制配列)も又、用いることができる(Niederacher等(199
2),Curr.Genet.22:636-670；Proft等(1995) Mol.Gen.Gent.246:367-373；Schull
er等(1992) EMBO J;11:107-114；Guarente等(1984) Cell 36:503-511)。
び対応するプロモーター誘導体例えば、それらの異なるＵＡＳ(上流活性化配列)
が除去されたプロモーター(ＧＡＬＳ、ＧＡＬＬ；Mumberg, J.等(1994) Nucleic
Acids Research 22:5767-5768)を用いることができる。調節されるプロモータ
ーとしては、ＦＢＰ１、ＰＣＫ１、ＩＣＬ１等の糖新生遺伝子のプロモーター又
はそれらの部分、例えばそれらの活性化配列(ＵＡＳ１及び／又はＵＡＳ２)又は
抑制配列(ＵＲＳ、上流抑制配列)も又、用いることができる(Niederacher等(199
2),Curr.Genet.22:636-670；Proft等(1995) Mol.Gen.Gent.246:367-373；Schull
er等(1992) EMBO J;11:107-114；Guarente等(1984) Cell 36:503-511)。
【００７２】 この仕方で改変されたＳ．セレビシエ変異株は、必須Ｓ．セレビシエ遺伝子が
発現されるように調節されるプロモーターが活性である生育条件下で培養するこ
とができる。これらのＳ．セレビシエ細胞を、次いで、典型的な量の調べる真菌
種のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含むライブラリーによってトランスフォームす
る。トランスフォーマントは、コード配列が組換えベクター中に存在する蛋白質
を付加的に発現する。
発現されるように調節されるプロモーターが活性である生育条件下で培養するこ
とができる。これらのＳ．セレビシエ細胞を、次いで、典型的な量の調べる真菌
種のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含むライブラリーによってトランスフォームす
る。トランスフォーマントは、コード配列が組換えベクター中に存在する蛋白質
を付加的に発現する。
【００７３】 この方法は、生育条件を変化させて、調節されるプロモーターを阻止すること
ができる(選択した必須遺伝子は、このプロモーターの制御下にある)ということ
を企図している。特に、生育条件を、生育培地を交換することにより変更するこ
とができる。例えば、ＧＡＬ１プロモーター又はその誘導体を用いる場合には、
ガラクトース含有培地(誘導状態)をグルコース含有培地(抑制状態)で置き換える
ことができる。
ができる(選択した必須遺伝子は、このプロモーターの制御下にある)ということ
を企図している。特に、生育条件を、生育培地を交換することにより変更するこ
とができる。例えば、ＧＡＬ１プロモーター又はその誘導体を用いる場合には、
ガラクトース含有培地(誘導状態)をグルコース含有培地(抑制状態)で置き換える
ことができる。
【００７４】 これらの変化させた条件は、組換えベクターが、調べる真菌種の機能的に類似
するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを有しないＳ．セレビシエ細胞にとって致死的で
ある。対照的に、組換えベクターが、調べる真菌種の機能的に類似するコード配
列を発現するＳ．セレビシエ細胞は、これらの細胞においては、致死的な代謝欠
損が機能的に類似する遺伝子によりコードされた蛋白質により相補されるので生
存可能である。
するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを有しないＳ．セレビシエ細胞にとって致死的で
ある。対照的に、組換えベクターが、調べる真菌種の機能的に類似するコード配
列を発現するＳ．セレビシエ細胞は、これらの細胞においては、致死的な代謝欠
損が機能的に類似する遺伝子によりコードされた蛋白質により相補されるので生
存可能である。
【００７５】 この方法は、組換えベクター(プラスミド)を、生存しているトランスフォーマ
ントから公知の方法(Strathern, J.N.及びHiggins, D.R.(1991))によって単離す
ることを企図している。プラスミドを、酵母から、大腸菌シャトルベクター中に
回収し(Guthrie, C.及び Fink, G.R. Methods in Enzymology,194巻 Guide to y
east genetic and molecular Biology. Academic Press, San Diego, 319-329頁
)、そのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ分析法例えばＤＮＡ配列決定法(Sa
nger等(1977) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74:5463-5467)を用いて分析する。
ントから公知の方法(Strathern, J.N.及びHiggins, D.R.(1991))によって単離す
ることを企図している。プラスミドを、酵母から、大腸菌シャトルベクター中に
回収し(Guthrie, C.及び Fink, G.R. Methods in Enzymology,194巻 Guide to y
east genetic and molecular Biology. Academic Press, San Diego, 319-329頁
)、そのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ分析法例えばＤＮＡ配列決定法(Sa
nger等(1977) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74:5463-5467)を用いて分析する。
【００７６】 この方法は、必須Ｓ．セレビシエ遺伝子が、他の真菌類の機能的に類似する遺
伝子及び／又は配列において相同な遺伝子(特に、ヒト、動物及び植物に対して
病原性の真菌類の機能的に類似している及び／又は配列において相同な必須遺伝
子)の同定に利用できることを企図している。この目的のために、例えば、藻菌
若しくは真正菌類綱の真菌類、詳細には、サブクラスの担子菌類、子嚢菌類、特
に、半子嚢菌類(酵母)及び不整子嚢菌目(糸状菌)及び裸胞子菌類(gymnascales)(
皮膚及び毛の真菌)、又は糸状不完全菌類のクラス、詳細には、サブクラスの分
生子菌類(conidiosporales)(皮膚の真菌)及び葉状体胞子菌目(出芽又は芽体形成
真菌)を用いることができる(これらの内では、特に、ケカビ、クモノスカビ、コ
クシジオイデス、パラコクシジオイデス(ブラストミセス ブラジリエンシス)、
エンドミセス(ブラストミセス)、アスペルギルス、ペニシリウム(スコプラリオ
プシス)、白癬菌(クテノミセス)、表皮糸状菌、小胞子菌、ピエドライア、ルモ
デンドラム、フィアロフォラ、スポロトリクム、クリプトコッカス、カンジダ、
ゲオトリクム及びトリコスポロン種)。
伝子及び／又は配列において相同な遺伝子(特に、ヒト、動物及び植物に対して
病原性の真菌類の機能的に類似している及び／又は配列において相同な必須遺伝
子)の同定に利用できることを企図している。この目的のために、例えば、藻菌
若しくは真正菌類綱の真菌類、詳細には、サブクラスの担子菌類、子嚢菌類、特
に、半子嚢菌類(酵母)及び不整子嚢菌目(糸状菌)及び裸胞子菌類(gymnascales)(
皮膚及び毛の真菌)、又は糸状不完全菌類のクラス、詳細には、サブクラスの分
生子菌類(conidiosporales)(皮膚の真菌)及び葉状体胞子菌目(出芽又は芽体形成
真菌)を用いることができる(これらの内では、特に、ケカビ、クモノスカビ、コ
クシジオイデス、パラコクシジオイデス(ブラストミセス ブラジリエンシス)、
エンドミセス(ブラストミセス)、アスペルギルス、ペニシリウム(スコプラリオ
プシス)、白癬菌(クテノミセス)、表皮糸状菌、小胞子菌、ピエドライア、ルモ
デンドラム、フィアロフォラ、スポロトリクム、クリプトコッカス、カンジダ、
ゲオトリクム及びトリコスポロン種)。
【００７７】 特に興味深いのは、カンジダ種(特に、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・
グラブラタ)、アスペルギルス種(特に、アスペルギルス・フミガーツス)、コク
シジオイデス・イミチス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラス
マ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマティティディス、パラコクシジオ
イデス・ブラジリエンス及びスポロトリックス・シェンキイの利用である。
グラブラタ)、アスペルギルス種(特に、アスペルギルス・フミガーツス)、コク
シジオイデス・イミチス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラス
マ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマティティディス、パラコクシジオ
イデス・ブラジリエンス及びスポロトリックス・シェンキイの利用である。
【００７８】 この方法は、必須真菌類遺伝子を用いて、これらの必須遺伝子の機能的発現及
び／又はコードされる蛋白質の機能的活性を部分的に又は全面的に阻害する物質
を同定することを企図している。真菌類の生育を阻害し、そして抗真菌薬として
(例えば、薬物の製造において)利用することのできる物質を、この様式で同定す
ることができる。
び／又はコードされる蛋白質の機能的活性を部分的に又は全面的に阻害する物質
を同定することを企図している。真菌類の生育を阻害し、そして抗真菌薬として
(例えば、薬物の製造において)利用することのできる物質を、この様式で同定す
ることができる。
【００７９】 この方法の特別の特徴は、必須真菌類遺伝子又は対応するコードされる蛋白質
が、物質のスクリーニングのための標的として利用されるということである。こ
の方法は、必須Ｓ．セレビシエ遺伝子並びに他の真菌類の機能的に類似する遺伝
子及び／又は配列において相同な遺伝子又は対応するコードされる蛋白質を標的
として利用することができることを企図している。
が、物質のスクリーニングのための標的として利用されるということである。こ
の方法は、必須Ｓ．セレビシエ遺伝子並びに他の真菌類の機能的に類似する遺伝
子及び／又は配列において相同な遺伝子又は対応するコードされる蛋白質を標的
として利用することができることを企図している。
【００８０】 この発明のスクリーニング方法の一具体例によれば、標的として用いる必須遺
伝子を含む真菌細胞を用意し、これらの細胞を試験すべき物質と共にインキュベ
ートする。この方法により、この必須標的遺伝子に関するのこの物質の生育阻害
効果を測定する。
伝子を含む真菌細胞を用意し、これらの細胞を試験すべき物質と共にインキュベ
ートする。この方法により、この必須標的遺伝子に関するのこの物質の生育阻害
効果を測定する。
【００８１】 必須標的遺伝子を異なる程度に発現する真菌細胞を使用し、次いで、これらの
細胞を試験すべき物質とインキュベートして、この物質の生育阻害効果を測定す
る。
細胞を試験すべき物質とインキュベートして、この物質の生育阻害効果を測定す
る。
【００８２】 この方法は、２以上の真菌細胞の利用、又はそれらから誘導した株であって必
須標的遺伝子を異なる程度に発現する点において異なる株の利用を包含する。
須標的遺伝子を異なる程度に発現する点において異なる株の利用を包含する。
【００８３】 例えば、２、３、４、５、１０以上の真菌細胞又は対応する真菌類株を、限定
した濃度で用いた物質の生育阻害効果に関して、比較して分析することができる
。かかる濃度のシリーズを通して、抗真菌性物質を細胞毒性物質又は不活性物質
から識別することができる。
した濃度で用いた物質の生育阻害効果に関して、比較して分析することができる
。かかる濃度のシリーズを通して、抗真菌性物質を細胞毒性物質又は不活性物質
から識別することができる。
【００８４】 この方法の特別の具体例は、スクリーニングのための一倍体真菌細胞／株の、
特に、一倍体Ｓ．セレビシエ細胞／株の利用を包含する。
特に、一倍体Ｓ．セレビシエ細胞／株の利用を包含する。
【００８５】 この方法は、標的として選択した必須遺伝子の適当な発現ベクターへの組込み
を企図している。
を企図している。
【００８６】 発現ベクターとしては、例えば、大腸菌／Ｓ．セレビシエシャトルベクターが
好適である。特に、細胞当たりのコピー数の異なるベクターを用いることができ
る。それ故、トランスフォームされたＳ．セレビシエ細胞中に高コピー数で存在
するベクターを利用することもできるし、低コピー数のものを利用することもで
きる。一具体例は、標的遺伝子のＳ．セレビシエゲノムへの組込みを可能にする
発現ベクターの利用を包含する。
好適である。特に、細胞当たりのコピー数の異なるベクターを用いることができ
る。それ故、トランスフォームされたＳ．セレビシエ細胞中に高コピー数で存在
するベクターを利用することもできるし、低コピー数のものを利用することもで
きる。一具体例は、標的遺伝子のＳ．セレビシエゲノムへの組込みを可能にする
発現ベクターの利用を包含する。
【００８７】 例えば、ベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、ｐＲＳ４２６
、ｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５、ｐＲＳ３１６、ｐＲＳ３０３、
ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６(Sikorki及びHieter, 1989；Christ
ianson等、1992)は、発現ベクターとして好適である。
、ｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５、ｐＲＳ３１６、ｐＲＳ３０３、
ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６(Sikorki及びHieter, 1989；Christ
ianson等、1992)は、発現ベクターとして好適である。
【００８８】 シリーズｐＲＳ４２３〜ｐＲＳ４２６のベクターは、細胞当たり約５０〜１０
０コピーの高コピー数で存在する。対照的に、シリーズｐＲＳ３１３〜３１６の
ベクターは、低コピー数(細胞当たり１〜２コピー)で存在する。これらの２シリ
ーズからの発現ベクターを用いる場合には、標的遺伝子は、染色体外のコピーと
して存在する。シリーズｐＲＳ３０３〜ｐＲＳ３０６のベクターは、標的遺伝子
のゲノムへの組込みを与える。これらの３つの異なる発現ベクター型を用いるこ
とにより、調べる機能的に類似した必須遺伝子を徐々に発現させることができる
。
０コピーの高コピー数で存在する。対照的に、シリーズｐＲＳ３１３〜３１６の
ベクターは、低コピー数(細胞当たり１〜２コピー)で存在する。これらの２シリ
ーズからの発現ベクターを用いる場合には、標的遺伝子は、染色体外のコピーと
して存在する。シリーズｐＲＳ３０３〜ｐＲＳ３０６のベクターは、標的遺伝子
のゲノムへの組込みを与える。これらの３つの異なる発現ベクター型を用いるこ
とにより、調べる機能的に類似した必須遺伝子を徐々に発現させることができる
。
【００８９】 この方法は、真菌細胞／株に関しての物質の生育阻止効果を、例えば細胞当た
りのベクターのコピー数の異なるベクターを用いて、比較して測定することを含
む。
りのベクターのコピー数の異なるベクターを用いて、比較して測定することを含
む。
【００９０】 かかる細胞は、必須標的遺伝子を異なる程度に発現することができ、この物質
に関して累進的反応を示すことができる。
に関して累進的反応を示すことができる。
【００９１】 この方法は又、標的遺伝子の発現ベクター中の特異的な選択したＳ．セレビシ
エプロモーターとターミネーターの間への挿入によって、異なる真菌細胞におい
て、異なる強度の標的遺伝子発現(調節された過剰発現)を得ることをも包含する
。構成的に(但し、異なる強度で)発現されるＳ．セレビシエプロモーターが、適
当である。かかるプロモーターの例は、Ｓ．セレビシエ遺伝子ＭＥＴ２５、ＰＧ
Ｋ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１の自然のプロモータ
ー並びにそれらの対応する誘導体(例えば、特異的アクチベーター及び／又はリ
プレッサー配列を有しないプロモーター誘導体)である。
エプロモーターとターミネーターの間への挿入によって、異なる真菌細胞におい
て、異なる強度の標的遺伝子発現(調節された過剰発現)を得ることをも包含する
。構成的に(但し、異なる強度で)発現されるＳ．セレビシエプロモーターが、適
当である。かかるプロモーターの例は、Ｓ．セレビシエ遺伝子ＭＥＴ２５、ＰＧ
Ｋ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１の自然のプロモータ
ー並びにそれらの対応する誘導体(例えば、特異的アクチベーター及び／又はリ
プレッサー配列を有しないプロモーター誘導体)である。
【００９２】 調節されるプロモーターは又、標的遺伝子の累進的な過剰発現にも適している
。ＧＡＬ１遺伝子の自然のプロモーター及び／又はそれらの対応する誘導体、例
えば、異なるＵＡＳエレメントが除去されたプロモーター(ＧＡＬＳ、ＧＡＬＬ
；Mumberg等(1994) Nucleic Acids Research 22:5767-5768)並びに糖新生遺伝子
のプロモーター例えばプロモーターＦＢＰ１、ＰＣＫ１、ＩＣＬ１又はこれらの
部分、例えば、それらのアクチベーター配列(ＵＡＳ１又はＵＡＳ２)又はリプレ
ッサー配列(ＵＲＳ)を、対応する活性化可能でない及び／又は抑制可能でない試
験プロモーターにおいて利用する(Schuller等(1992) EMBO J.11:107-114)Guaren
te等(1984) Cell 36:503-511；Niederacher等(1992) Curr.Genet.22:363-370；P
rof等(1995) Mol.Gen.Genet.246:367-373)。
。ＧＡＬ１遺伝子の自然のプロモーター及び／又はそれらの対応する誘導体、例
えば、異なるＵＡＳエレメントが除去されたプロモーター(ＧＡＬＳ、ＧＡＬＬ
；Mumberg等(1994) Nucleic Acids Research 22:5767-5768)並びに糖新生遺伝子
のプロモーター例えばプロモーターＦＢＰ１、ＰＣＫ１、ＩＣＬ１又はこれらの
部分、例えば、それらのアクチベーター配列(ＵＡＳ１又はＵＡＳ２)又はリプレ
ッサー配列(ＵＲＳ)を、対応する活性化可能でない及び／又は抑制可能でない試
験プロモーターにおいて利用する(Schuller等(1992) EMBO J.11:107-114)Guaren
te等(1984) Cell 36:503-511；Niederacher等(1992) Curr.Genet.22:363-370；P
rof等(1995) Mol.Gen.Genet.246:367-373)。
【００９３】 発現ベクターにおいては、ターミネーター例えばＳ．セレビシエ遺伝子ＭＥＴ
２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３のターミネーター配
列を利用することができる。
２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３のターミネーター配
列を利用することができる。
【００９４】 この方法は、巧妙に選択した発現ベクター型の利用及び／又は適当な発現ベク
ターの調製(結局、異なる強度のプロモーター及び異なって調節されるプロモー
ターを利用)により、一連の発現ベクターを構築することができ、すべては、同
じ標的遺伝子を含むが、異なる程度に標的遺伝子を発現する点において異なって
いるということを含む。
ターの調製(結局、異なる強度のプロモーター及び異なって調節されるプロモー
ターを利用)により、一連の発現ベクターを構築することができ、すべては、同
じ標的遺伝子を含むが、異なる程度に標的遺伝子を発現する点において異なって
いるということを含む。
【００９５】 この方法は、Ｓ．セレビシエの一倍体の野生型細胞における発現ベクターのト
ランスフォーメーションを含む。こうして得られたＳ．セレビシエ細胞／株を液
体培地中で培養し、異なる濃度の被試験物質の存在下でインキュベートして、こ
の物質の、これらの標的遺伝子を異なる程度に発現する細胞／株の生育具合に対
する効果を比較分析する。この方法は又、標的遺伝子を有しない個々の発現ベク
ター型を用いてトランスフォームした一倍体Ｓ．セレビシエ細胞／株を対照用に
利用することをも包含する。
ランスフォーメーションを含む。こうして得られたＳ．セレビシエ細胞／株を液
体培地中で培養し、異なる濃度の被試験物質の存在下でインキュベートして、こ
の物質の、これらの標的遺伝子を異なる程度に発現する細胞／株の生育具合に対
する効果を比較分析する。この方法は又、標的遺伝子を有しない個々の発現ベク
ター型を用いてトランスフォームした一倍体Ｓ．セレビシエ細胞／株を対照用に
利用することをも包含する。
【００９６】 この方法は、発現の程度が個々の培地の選択により大いに影響され得るので、
これらの物質のスクリーニングを、調節されるプロモーター特にＧＡＬ１プロモ
ーター及びその誘導体(ＧＡＬＳ及びＧＡＬＬ)を用いて、異なる培地において行
えるということを包含する。従って、ＧＡＬ１プロモーターの発現の程度は、次
の様式で増大する：２％ガラクトース＞１％ガラクトース＋１％グルコース＞２
％グルコース。
これらの物質のスクリーニングを、調節されるプロモーター特にＧＡＬ１プロモ
ーター及びその誘導体(ＧＡＬＳ及びＧＡＬＬ)を用いて、異なる培地において行
えるということを包含する。従って、ＧＡＬ１プロモーターの発現の程度は、次
の様式で増大する：２％ガラクトース＞１％ガラクトース＋１％グルコース＞２
％グルコース。
【００９７】 Ｓ．セレビシエの野生型細胞の生育を阻害する物質の効果は、他の真菌種の機
能的に類似する遺伝子の過剰発現により、部分的に又は全面的に補われ得る。
能的に類似する遺伝子の過剰発現により、部分的に又は全面的に補われ得る。
【００９８】 一具体例によれば、この抗真菌性物質をスクリーニングする方法は、イン・ビ
トロで、必須遺伝子若しくは機能的に類似する遺伝子又は対応するコードされる
蛋白質を試験すべき物質と接触させて、その物質の標的に対する効果を測定する
ことにより実施する。２つの分子の相互作用の測定に適した任意のイン・ビトロ
試験例えばハイブリダイゼーション試験又は機能試験を利用することができる(
例えば、Bergmeyer H.U., Methods of Enzymatic Analysis, VCH Publishersに
詳細に記載されている酵素試験)。もしこのスクリーニングを、コードされた蛋
白質を標的として用いて行うならば、対応する必須遺伝子は、当分野で公知の任
意の適当な方法例えば適当な制限部位を含むプライマーのセットを用いるＰＣＲ
増幅(Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc)に
より大腸菌、バキュロウイルス又は酵母等の発現システムに挿入され、次いで、
発現された蛋白質を当分野で公知の方法により完全に又は部分的に精製する。発
現された蛋白質の精製に適した任意の精製法例えばアフィニティークロマトグラ
フィーを用いることができる。もしこの標的蛋白質の機能が公知であるならば、
抗真菌性物質のこの蛋白質機能に対する効果を測定する機能試験を行うことがで
きる。もしこの蛋白質機能が未知であるならば、標的蛋白質と相互作用し得る物
質(例えば、コードされる蛋白質に結合するもの)を試験することができる。かか
る場合には、標的蛋白質の適当な酵素による酵素消化からの保護等の試験を利用
することができる。
トロで、必須遺伝子若しくは機能的に類似する遺伝子又は対応するコードされる
蛋白質を試験すべき物質と接触させて、その物質の標的に対する効果を測定する
ことにより実施する。２つの分子の相互作用の測定に適した任意のイン・ビトロ
試験例えばハイブリダイゼーション試験又は機能試験を利用することができる(
例えば、Bergmeyer H.U., Methods of Enzymatic Analysis, VCH Publishersに
詳細に記載されている酵素試験)。もしこのスクリーニングを、コードされた蛋
白質を標的として用いて行うならば、対応する必須遺伝子は、当分野で公知の任
意の適当な方法例えば適当な制限部位を含むプライマーのセットを用いるＰＣＲ
増幅(Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc)に
より大腸菌、バキュロウイルス又は酵母等の発現システムに挿入され、次いで、
発現された蛋白質を当分野で公知の方法により完全に又は部分的に精製する。発
現された蛋白質の精製に適した任意の精製法例えばアフィニティークロマトグラ
フィーを用いることができる。もしこの標的蛋白質の機能が公知であるならば、
抗真菌性物質のこの蛋白質機能に対する効果を測定する機能試験を行うことがで
きる。もしこの蛋白質機能が未知であるならば、標的蛋白質と相互作用し得る物
質(例えば、コードされる蛋白質に結合するもの)を試験することができる。かか
る場合には、標的蛋白質の適当な酵素による酵素消化からの保護等の試験を利用
することができる。
【００９９】 この方法は又、必須Ｓ．セレビシエ遺伝子に機能的に類似の及び／又は配列に
おいて相同なヒト、動物又は植物に由来する遺伝子の同定をも包含する。この対
応するヒト、動物又は植物遺伝子は、抗真菌性物質がこれらの遺伝子に対する効
果を示すかどうかを試験するための方法において、随意に、標的遺伝子として利
用することができる。
おいて相同なヒト、動物又は植物に由来する遺伝子の同定をも包含する。この対
応するヒト、動物又は植物遺伝子は、抗真菌性物質がこれらの遺伝子に対する効
果を示すかどうかを試験するための方法において、随意に、標的遺伝子として利
用することができる。
【０１００】 この方法の特別の利点は、この方法においては、真菌類の生育を効率的に阻止
する物質が同定され得、又必須Ｓ．セレビシエ遺伝子に対応する機能的に類似す
る遺伝子及び／又は配列において相同なヒト、動物又は植物に由来する遺伝子に
対するこれらの物質の影響も測定できるということである。
する物質が同定され得、又必須Ｓ．セレビシエ遺伝子に対応する機能的に類似す
る遺伝子及び／又は配列において相同なヒト、動物又は植物に由来する遺伝子に
対するこれらの物質の影響も測定できるということである。
【０１０１】 この方法は又、対応する必須真菌類遺伝子に機能的に類似する遺伝子及び／又
は配列において相同なヒト、動物若しくは植物の遺伝子の存在を、例えば、同定
された必須真菌類遺伝子又はその部分のヒト、動物若しくは植物の配列遺伝子(
データバンクで入手可能)との相同性をチェックすることによりチェックする可
能性をも包含する。この方法においては、例えば、目的に応じて、機能的に類似
する遺伝子及び／又は配列において相同なヒト遺伝子の存在しないものを、同定
された必須真菌類遺伝子から、初期ステージにおいて、選択することができる。
は配列において相同なヒト、動物若しくは植物の遺伝子の存在を、例えば、同定
された必須真菌類遺伝子又はその部分のヒト、動物若しくは植物の配列遺伝子(
データバンクで入手可能)との相同性をチェックすることによりチェックする可
能性をも包含する。この方法においては、例えば、目的に応じて、機能的に類似
する遺伝子及び／又は配列において相同なヒト遺伝子の存在しないものを、同定
された必須真菌類遺伝子から、初期ステージにおいて、選択することができる。
【０１０２】 それにより、この方法は、抗真菌性効果を有するがヒトに対する有害な影響を
有しない物質を選択的に同定する多くの可能性を提供する。
有しない物質を選択的に同定する多くの可能性を提供する。
【０１０３】 例えば、真菌症の治療又は免疫抑制状態における病気予防のための薬物の製造
に用いることのできる物質を同定することができる。これらの物質は、例えば、
エイズや糖尿病等の病気において起きる真菌感染症の治療に用いることのできる
薬物の製造に利用することができる。殺真菌薬の製造、特にヒト及び動物に無害
な殺真菌薬に利用することのできる物質を同定することもできる。
に用いることのできる物質を同定することができる。これらの物質は、例えば、
エイズや糖尿病等の病気において起きる真菌感染症の治療に用いることのできる
薬物の製造に利用することができる。殺真菌薬の製造、特にヒト及び動物に無害
な殺真菌薬に利用することのできる物質を同定することもできる。
【０１０４】 その上、この方法は、特異的真菌種の生育のみを選択的に阻止する抗真菌性物
質を同定する可能性を提供する。
質を同定する可能性を提供する。
【０１０５】 このスクリーニング方法は、これらの遺伝子が必須であるかどうかを知るのに
十分である(必須遺伝子の機能又はコードされる蛋白質の機能に関する更なる情
報を必要としない)限り、特に有利でありる。更に、それは、多くの遺伝子につ
いてのＤＮＡ配列が入手できない他の真菌類中の必須Ｓ．セレビシエ遺伝子に機
能的に類似する遺伝子の同定のために特に有利である。
十分である(必須遺伝子の機能又はコードされる蛋白質の機能に関する更なる情
報を必要としない)限り、特に有利でありる。更に、それは、多くの遺伝子につ
いてのＤＮＡ配列が入手できない他の真菌類中の必須Ｓ．セレビシエ遺伝子に機
能的に類似する遺伝子の同定のために特に有利である。
【０１０６】 実施例 実施例１： ＰＣＲを利用する古典的方法(改変した古典的方法)によるＯＲＦ ＹＭＬ１１
４ｃに対する欠失カセットの調製 １）プラスミドの構築 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商標)ＫＳ＋ベクター(Stratagene；この配列は、
Ｇｅｎｂａｎｋ(登録商標)Ｘ５２３２７にて入手可能)を、他のプラスミドの調
製のための出発ベクターとして利用する。
４ｃに対する欠失カセットの調製 １）プラスミドの構築 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商標)ＫＳ＋ベクター(Stratagene；この配列は、
Ｇｅｎｂａｎｋ(登録商標)Ｘ５２３２７にて入手可能)を、他のプラスミドの調
製のための出発ベクターとして利用する。
【０１０７】 このベクターを、ＮｏｔＩで開裂させ、次いで、その一本鎖の両端をムングビ
ーンエキソヌクレアーゼとインキュベートすることにより除去する。ＤＮＡ断片
の再連結により、ｐＫＳ＋ΔＮｏｔＩベクターを、こうして得る(ＮｏｔＩ制限
部位を有しないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商標)ＫＳ＋に相当する)。
ーンエキソヌクレアーゼとインキュベートすることにより除去する。ＤＮＡ断片
の再連結により、ｐＫＳ＋ΔＮｏｔＩベクターを、こうして得る(ＮｏｔＩ制限
部位を有しないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商標)ＫＳ＋に相当する)。
【０１０８】 ｐＫＳ＋ΔＮｏｔＩをＰｓｔＩとＢａｍＨＩで開裂させ、後述のｐＫ３／ｐＫ
４プライマー対から合成したＤＮＡオリゴヌクレオチドをこの開いたプラスミド
中に連結する。こうして調製したｐＫＳ＋ｎｅｕプラスミドは、ＰｓｔＩとＢａ
ｍＨＩ制限部位の間に、下記の新規な制限部位ＮｏｔＩ、ＳｔｕＩ、ＳｆｉＩ及
びＮｃｏＩを含む(即ち、ＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ−ＳｔｕＩ−ＳｆｉＩ−ＮｃｏＩ
−ＢａｍＨＩ)
４プライマー対から合成したＤＮＡオリゴヌクレオチドをこの開いたプラスミド
中に連結する。こうして調製したｐＫＳ＋ｎｅｕプラスミドは、ＰｓｔＩとＢａ
ｍＨＩ制限部位の間に、下記の新規な制限部位ＮｏｔＩ、ＳｔｕＩ、ＳｆｉＩ及
びＮｃｏＩを含む(即ち、ＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ−ＳｔｕＩ−ＳｆｉＩ−ＮｃｏＩ
−ＢａｍＨＩ)
【化３】 5'-GCGGCCGCAAGGCCTCCATGGCCG-3' PK3
【化４】 5'-GATCCGGCCATGGAGGCCTTGCGGCCGCTGCA-3' PK4
【０１０９】 Ｓ．セレビシエのＵＲＡ３遺伝子を、下記のように、プライマー対ＰＫ９及び
ＰＫ１０の利用により、Ｙｃｐｌａｃ３３ベクターＤＮＡ(Gietz, R.D.及びSugi
no, A.(1988) Gene 74:527-534)をマトリクスとして、ＰＣＲにより増幅する。
増幅したＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで開裂させ、続いて、ＢａｍＨＩとＮ
ｏｔＩで開裂させたｐＫＳ＋ｎｅｕ中に挿入する。こうして得られたプラスミド
をｐＰＫ９／１０と命名する。
ＰＫ１０の利用により、Ｙｃｐｌａｃ３３ベクターＤＮＡ(Gietz, R.D.及びSugi
no, A.(1988) Gene 74:527-534)をマトリクスとして、ＰＣＲにより増幅する。
増幅したＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで開裂させ、続いて、ＢａｍＨＩとＮ
ｏｔＩで開裂させたｐＫＳ＋ｎｅｕ中に挿入する。こうして得られたプラスミド
をｐＰＫ９／１０と命名する。
【化５】
【化６】
【０１１０】 ２）欠失カセットの調製 ＯＲＦ ＹＭＬ１１４ｃの５’領域を、下記のように、Ｓ．セレビシエのゲノ
ムＤＮＡ(テンプレート)及び両プライマーＹＭＬ１１４ｃ−Ａｓｐ７１８及びＹ
ＬＭ１１４ｃ−ＥｃｏＲＩを用いるＰＣＲにより増幅した。
ムＤＮＡ(テンプレート)及び両プライマーＹＭＬ１１４ｃ−Ａｓｐ７１８及びＹ
ＬＭ１１４ｃ−ＥｃｏＲＩを用いるＰＣＲにより増幅した。
【化７】 ＹＭＬ１１４ｃ−Ａｓｐ７１８：5'-GCTGGTACCCGTCGGTCTCTTTACC-3'
【化８】 ＹＬＭ１１４ｃ−ＥｃｏＲＩ： 5'-TTGGAATTCATTGCCCTTTATGAGTCC-3'
【０１１１】 続いて、ＰＣＲ断片を、制限酵素Ａｓｐ７１８及びＥｃｏＲＩで切断した。そ
の結果生成した６１３ＢＰ断片を、Ａｓｐ７１８とＥｃｏＲＩで線状化したｐＰ
Ｋ９／１０中に挿入して、プラスミドｐＹＭＬ１１４ｃ−Ａを生成した。
の結果生成した６１３ＢＰ断片を、Ａｓｐ７１８とＥｃｏＲＩで線状化したｐＰ
Ｋ９／１０中に挿入して、プラスミドｐＹＭＬ１１４ｃ−Ａを生成した。
【０１１２】 ＯＲＦ ＹＭＬ１１４ｃの３’領域を、Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡ(テン
プレート)及び両プライマーＹＭＬ１１４ｃ−ＢａｍＨＩ及びＹＬＭ１１４ｃ−
ＳａｃＩを用いるＰＣＲにより増幅した(後述)。 ＹＭＬ１１４ｃ−ＢａｍＨＩ：5'-ATCGGATCCGCCAACAATGACAGCG-3' ＹＬＭ１１４ｃ−ＳａｃＩ： 5'-GTTGAGCTCTGAGCGTTTGTCCTTG-3' そのＰＣＲ断片を、続いて、ＢａｍＨＩとＳａｃＩにより切断した。その結果生
成した５３５ｂｐの断片を、により線状化したプラスミドｐＹＭＬ１１４ｃ−Ａ
に挿入して、ｐＹＭＬ１１４ｃ−Ｂを生成した。
プレート)及び両プライマーＹＭＬ１１４ｃ−ＢａｍＨＩ及びＹＬＭ１１４ｃ−
ＳａｃＩを用いるＰＣＲにより増幅した(後述)。 ＹＭＬ１１４ｃ−ＢａｍＨＩ：5'-ATCGGATCCGCCAACAATGACAGCG-3' ＹＬＭ１１４ｃ−ＳａｃＩ： 5'-GTTGAGCTCTGAGCGTTTGTCCTTG-3' そのＰＣＲ断片を、続いて、ＢａｍＨＩとＳａｃＩにより切断した。その結果生
成した５３５ｂｐの断片を、により線状化したプラスミドｐＹＭＬ１１４ｃ−Ａ
に挿入して、ｐＹＭＬ１１４ｃ−Ｂを生成した。
【０１１３】 この後者のプラスミドを、Ａｓｐ１７８とＳａｃＩにより線状化した後に、Ｓ
．セレビシエのトランスフォーメーションに用いた。
．セレビシエのトランスフォーメーションに用いた。
【０１１４】 実施例２〜９０： 表１に列記した残存遺伝子のための欠失カセットの構築 実施例１に開示した方法を用いて、これらの必須遺伝子の各々の欠失カセット
を、表２に開示したプライマーを用いて構築することができる。
を、表２に開示したプライマーを用いて構築することができる。
【０１１５】 実施例９１： ＳＥＮ．ＰＫ２株由来のＳ．セレビシエ細胞を、公知の方法(Gietz等、1992；
Guldener等、1996)に従って、実施例１〜９０の線状欠失カセットの各５μｇの
ＤＮＡを用いてトランスフォームする。このトランスフォーメーション反応培地
を、対応する選択培地上のプレートにプレートする。この方法において、相同組
換えが起きているトランスフォーマントが、それらの細胞しかそれらの改変した
条件下で生育できないので選択される。
Guldener等、1996)に従って、実施例１〜９０の線状欠失カセットの各５μｇの
ＤＮＡを用いてトランスフォームする。このトランスフォーメーション反応培地
を、対応する選択培地上のプレートにプレートする。この方法において、相同組
換えが起きているトランスフォーマントが、それらの細胞しかそれらの改変した
条件下で生育できないので選択される。
【０１１６】 これらの組換え細胞を、次の条件下で、四分子分析にかけた：還元分裂(減数
分裂)が、公知の方法(Guthrie C.及びFink,G.R.(1991) Methods in Enzymology,
194巻、Academic Press, San Diego)を用いて、ヘテロ接合の変異株において誘
導された。その結果生じた子嚢を、子嚢胞子壁を消化するザイモリアーゼを用い
る部分酵素消化にかけ、マイクロマニピュレーター(SINGER Instruments)を用い
て分離した。この分析は、上述の９０遺伝子すべてがＳ．セレビシエの生育にひ
っすであることを示した。
分裂)が、公知の方法(Guthrie C.及びFink,G.R.(1991) Methods in Enzymology,
194巻、Academic Press, San Diego)を用いて、ヘテロ接合の変異株において誘
導された。その結果生じた子嚢を、子嚢胞子壁を消化するザイモリアーゼを用い
る部分酵素消化にかけ、マイクロマニピュレーター(SINGER Instruments)を用い
て分離した。この分析は、上述の９０遺伝子すべてがＳ．セレビシエの生育にひ
っすであることを示した。
【０１１７】 本発明は又、一層特に、下記の遺伝子にも適用される：ＹＭＬ１１４ｃ、ＹＬ
Ｒ１８６ｗ、ＹＬＲ２１５ｃ、ＹＬＲ２２２ｃ、ＹＬＲ２４３ｗ、ＹＬＲ２７２
ｃ、ＹＬＲ２７５ｗ、ＹＬＲ２７６ｃ、ＹＬＲ３１７ｗ、ＹＬＲ３５９ｗ、ＹＬ
Ｒ３７３ｃ、ＹＬＲ４２４ｗ、ＹＬＲ４３７ｃ、ＹＬＲ４４０ｃ、ＹＭＬ０２３
ｃ、ＹＭＬ０４９ｃ、ＹＭＬ０７７ｗ、ＹＭＬ０９３ｗ、ＹＭＬ１２７ｗ、ＹＭ
Ｒ０３２ｗ、ＹＭＲ０９３ｗ、ＹＭＲ１３１ｃ、ＹＭＲ１８５ｗ、ＹＭＲ２１２
ｃ、ＹＭＲ２１３ｗ、ＹＭＲ２１８ｃ、ＹＭＲ２８１ｗ、ＹＭＲ２８８ｗ、ＹＭ
Ｒ２９０ｃ、ＹＭＲ２１１ｗ、ＹＭＲ０４９ｃ、ＹＭＲ１３４ｗ、ＹＤＲ１９６
ｃ、ＹＤＲ２９９ｗ、ＹＤＲ３６５ｃ、ＹＤＲ３９６ｗ、ＹＤＲ４０７ｃ、ＹＤ
Ｒ４１６ｗ、ＹＤＲ４４９ｃ、ＹＤＲ４７２ｗ、ＹＤＲ４９９ｗ、ＹＤＲ１４１
ｃ、ＹＤＲ３２４ｃ、ＹＤＲ３２５ｗ、ＹＤＲ３９８ｗ、ＹＤＲ２４６ｗ、ＹＤ
Ｒ２３６ｃ、ＹＤＲ３６１ｃ、ＹＤＲ３６７ｗ、ＹＤＲ３３９ｃ、ＹＤＲ４１３
ｃ、ＹＤＲ４２９ｃ、ＹＤＲ４６８ｃ、ＹＤＲ４８９ｗ、ＹＤＲ５２７ｗ、ＹＤ
Ｒ２８８ｗ、ＹＤＲ２０１ｗ、ＹＤＲ４３４ｗ、ＹＤＲ１８１ｃ、ＹＤＲ５３１
ｗ、ＹＰＬ１２６ｗ、ＹＰＬ０９３ｗ、ＹＰＬ０６３ｗ、ＹＰＬ０２４ｗ、ＹＰ
Ｌ０２０ｃ、ＹＰＬ０１２ｗ、ＹＰＬ００７ｃ、ＹＰＬ２３３ｗ、ＹＰＬ１４６
ｃ、ＹＩＬ０９１ｃ、ＹＩＬ０８３ｃ、ＹＩＬ０１９ｗ、ＹＩＬ１０４ｃ、ＹＦ
Ｌ０２４ｃ、ＹＦＲ００３ｃ、ＹＦＲ０２７ｗ、ＹＦＲ０４２ｗ、ＹＩＲ０１０
ｗ、ＹＰＲ０４８ｗ、ＹＰＲ０７２ｗ、ＹＰＲ０８２ｃ、ＹＰＲ０８５ｃ、ＹＰ
Ｒ１０５ｃ、ＹＰＲ１１２ｃ、ＹＰＲ１３７ｗ、ＹＰＲ１４３ｗ、ＹＰＲ１４４
ｃ及びＹＰＲ１６９ｗ。
Ｒ１８６ｗ、ＹＬＲ２１５ｃ、ＹＬＲ２２２ｃ、ＹＬＲ２４３ｗ、ＹＬＲ２７２
ｃ、ＹＬＲ２７５ｗ、ＹＬＲ２７６ｃ、ＹＬＲ３１７ｗ、ＹＬＲ３５９ｗ、ＹＬ
Ｒ３７３ｃ、ＹＬＲ４２４ｗ、ＹＬＲ４３７ｃ、ＹＬＲ４４０ｃ、ＹＭＬ０２３
ｃ、ＹＭＬ０４９ｃ、ＹＭＬ０７７ｗ、ＹＭＬ０９３ｗ、ＹＭＬ１２７ｗ、ＹＭ
Ｒ０３２ｗ、ＹＭＲ０９３ｗ、ＹＭＲ１３１ｃ、ＹＭＲ１８５ｗ、ＹＭＲ２１２
ｃ、ＹＭＲ２１３ｗ、ＹＭＲ２１８ｃ、ＹＭＲ２８１ｗ、ＹＭＲ２８８ｗ、ＹＭ
Ｒ２９０ｃ、ＹＭＲ２１１ｗ、ＹＭＲ０４９ｃ、ＹＭＲ１３４ｗ、ＹＤＲ１９６
ｃ、ＹＤＲ２９９ｗ、ＹＤＲ３６５ｃ、ＹＤＲ３９６ｗ、ＹＤＲ４０７ｃ、ＹＤ
Ｒ４１６ｗ、ＹＤＲ４４９ｃ、ＹＤＲ４７２ｗ、ＹＤＲ４９９ｗ、ＹＤＲ１４１
ｃ、ＹＤＲ３２４ｃ、ＹＤＲ３２５ｗ、ＹＤＲ３９８ｗ、ＹＤＲ２４６ｗ、ＹＤ
Ｒ２３６ｃ、ＹＤＲ３６１ｃ、ＹＤＲ３６７ｗ、ＹＤＲ３３９ｃ、ＹＤＲ４１３
ｃ、ＹＤＲ４２９ｃ、ＹＤＲ４６８ｃ、ＹＤＲ４８９ｗ、ＹＤＲ５２７ｗ、ＹＤ
Ｒ２８８ｗ、ＹＤＲ２０１ｗ、ＹＤＲ４３４ｗ、ＹＤＲ１８１ｃ、ＹＤＲ５３１
ｗ、ＹＰＬ１２６ｗ、ＹＰＬ０９３ｗ、ＹＰＬ０６３ｗ、ＹＰＬ０２４ｗ、ＹＰ
Ｌ０２０ｃ、ＹＰＬ０１２ｗ、ＹＰＬ００７ｃ、ＹＰＬ２３３ｗ、ＹＰＬ１４６
ｃ、ＹＩＬ０９１ｃ、ＹＩＬ０８３ｃ、ＹＩＬ０１９ｗ、ＹＩＬ１０４ｃ、ＹＦ
Ｌ０２４ｃ、ＹＦＲ００３ｃ、ＹＦＲ０２７ｗ、ＹＦＲ０４２ｗ、ＹＩＲ０１０
ｗ、ＹＰＲ０４８ｗ、ＹＰＲ０７２ｗ、ＹＰＲ０８２ｃ、ＹＰＲ０８５ｃ、ＹＰ
Ｒ１０５ｃ、ＹＰＲ１１２ｃ、ＹＰＲ１３７ｗ、ＹＰＲ１４３ｗ、ＹＰＲ１４４
ｃ及びＹＰＲ１６９ｗ。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
【表２】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ペーター コエッター ドイツ連邦共和国 デー61440 オベルル ゼル、インデュストリシュトラーセ ３ア ー Ｆターム(参考） 4B063 QA06 QA18 QQ07 QQ42 QQ98 QR32 QR48 QR59 QR62 QR76 QS25 QS38
Claims (12)
- 【請求項１】 抗真菌性物質をスクリーニングする方法であって、真菌類由
来の必須遺伝子若しくは機能的に類似する真菌遺伝子又は対応するコードされる
蛋白質を標的として用い、必須遺伝子を下記よりなる群から選択する当該方法： ＹＭＬ１１４ｃ、ＹＬＲ１８６ｗ、ＹＬＲ２１５ｃ、ＹＬＲ２２２ｃ、ＹＬＲ２
４３ｗ、ＹＬＲ２７２ｃ、ＹＬＲ２７５ｗ、ＹＬＲ２７６ｃ、ＹＬＲ３１７ｗ、
ＹＬＲ３５９ｗ、ＹＬＲ３７３ｃ、ＹＬＲ４２４ｗ、ＹＬＲ４３７ｃ、ＹＬＲ４
４０ｃ、ＹＭＬ０２３ｃ、ＹＭＬ０４９ｃ、ＹＭＬ０７７ｗ、ＹＭＬ０９３ｗ、
ＹＭＬ１２７ｗ、ＹＭＲ０３２ｗ、ＹＭＲ０９３ｗ、ＹＭＲ１３１ｃ、ＹＭＲ１
８５ｗ、ＹＭＲ２１２ｃ、ＹＭＲ２１３ｗ、ＹＭＲ２１８ｃ、ＹＭＲ２８１ｗ、
ＹＭＲ２８８ｗ、ＹＭＲ２９０ｃ、ＹＭＲ２１１ｗ、ＹＭＲ０４９ｃ、ＹＭＲ１
３４ｗ、ＹＤＲ１９６ｃ、ＹＤＲ２９９ｗ、ＹＤＲ３６５ｃ、ＹＤＲ３９６ｗ、
ＹＤＲ４０７ｃ、ＹＤＲ４１６ｗ、ＹＤＲ４４９ｃ、ＹＤＲ４７２ｗ、ＹＤＲ４
９９ｗ、ＹＤＲ１４１ｃ、ＹＤＲ３２４ｃ、ＹＤＲ３２５ｗ、ＹＤＲ３９８ｗ、
ＹＤＲ２４６ｗ、ＹＤＲ２３６ｃ、ＹＤＲ３６１ｃ、ＹＤＲ３６７ｗ、ＹＤＲ３
３９ｃ、ＹＤＲ４１３ｃ、ＹＤＲ４２９ｃ、ＹＤＲ４６８ｃ、ＹＤＲ４８９ｗ、
ＹＤＲ５２７ｗ、ＹＤＲ２８８ｗ、ＹＤＲ２０１ｗ、ＹＤＲ４３４ｗ、ＹＤＲ１
８１ｃ、ＹＤＲ５３１ｗ、ＹＰＬ１２６ｗ、ＹＰＬ０９３ｗ、ＹＰＬ０６３ｗ、
ＹＰＬ０２４ｗ、ＹＰＬ０２０ｃ、ＹＰＬ０１２ｗ、ＹＰＬ００７ｃ、ＹＰＬ２
３３ｗ、ＹＰＬ１４６ｃ、ＹＩＬ０９１ｃ、ＹＩＬ０８３ｃ、ＹＩＬ０１９ｗ、
ＹＩＬ１０９ｃ、ＹＩＬ１０４ｃ、ＹＦＬ０２４ｃ、ＹＦＲ００３ｃ、ＹＦＲ０
２７ｗ、ＹＦＲ０４２ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＲ０１５ｗ、ＹＰＲ０４８ｗ、
ＹＰＲ０７２ｗ、ＹＰＲ０８２ｃ、ＹＰＲ０８５ｃ、ＹＰＲ１０５ｃ、ＹＰＲ１
１２ｃ、ＹＰＲ１３７ｗ、ＹＰＲ１４３ｗ、ＹＰＲ１４４ｃ及びＹＰＲ１６９ｗ
。 - 【請求項２】 必須遺伝子又は機能的に類似する真菌遺伝子を異なるレベル
に発現する真菌細胞を試験すべき物質と共にインキュベートし、その物質の生育
阻害効果を測定する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記の標的遺伝子又は対応するコードされる標的の蛋白質を
試験すべき物質とイン・ビトロで接触させ、その物質の標的に対する効果を測定
する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 スクリーニングされた物質が、必須遺伝子の機能的発現又は
コードされる蛋白質の機能的活性を部分的又は全面的に阻害する、請求項１〜３
の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項５】 真菌種を担子菌類、子嚢菌類及び線菌類よりなる群から選択
する、請求項１〜４の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項６】 前記の機能的に類似する遺伝子が、カンジダ種又はアスペル
ギルス種由来の必須遺伝子である、請求項１〜５の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項７】 前記の機能的に類似する遺伝子が、カンジダ・アルビカンス
又はアスペルギルス・フミガーツス由来の必須遺伝子である、請求項６に記載の
方法。 - 【請求項８】 請求項１〜７の何れか１つに記載の方法であって、機能的に
類似する遺伝子を下記により同定する当該方法： ａ）調べるべきＳ．セレビシエの遺伝子が、調節されるプロモーターの制御下
で染色体に組み込まれ又は染色体外に存在するＳ．セレビシエ変異株を用意し、 ｂ）該変異株を、調節されるプロモーターが活性である生育条件下で培養し、 ｃ）この変異株を、調べるために真菌種から調製して適当なベクターに挿入し
たｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡによりトランスフォームし、 ｄ）培養条件を、調節されるプロモーターがスイッチ・オフされて、機能的に
類似の遺伝子を含むＳ．セレビシエ細胞のみが生存し得るように変化させ、 ｅ）このｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを単離して分析する。 - 【請求項９】 機能的に類似する遺伝子が、ヌクレオチドレベルにおいて、
対応するＳ．セレビシエ必須遺伝子と少なくとも５０％の、好ましくは少なくと
も６０％の、最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項８
に記載の方法。 - 【請求項１０】 機能的に類似する遺伝子が、アミノ酸レベルにおいて、対
応するＳ．セレビシエ必須遺伝子にコードされる蛋白質と少なくとも４０％の、
好ましくは少なくとも５０％の、一層好ましくは少なくとも６０％の、最も好ま
しくは少なくとも７０％の配列同一性を有する蛋白質をコードする、請求項８に
記載の方法。 - 【請求項１１】 前記の真菌細胞が、一倍体のＳ．セレビシエ細胞である、
請求項１〜１０の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項１２】 Ｓ．セレビシエの必須遺伝子が、調べるべき遺伝子座にお
ける相同組換えによる選択マーカーの組込みにより同定される、請求項１〜４の
何れか１つ又は請求項１１に記載の方法。
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| EP98402254.1 | 1998-09-11 | ||
| EP98402254 | 1998-09-11 | ||
| PCT/EP1999/002722 WO1999055907A2 (en) | 1998-04-24 | 1999-04-22 | Method for screening antimycotic substances using essential genes from s. cerevisiae |
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|---|---|---|---|
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