KR20040083756A - 항진균제 표적 유전자 및 항진균제 스크리닝 키트 - Google Patents
항진균제 표적 유전자 및 항진균제 스크리닝 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유전자 결손 돌연변이 분열효모군을 이용하여 검색한 항진균제 표적유전자, 상기 항진균제 표적 유전자가 결손된 돌연변이 균주를 포함하여 제조한 항진균제 스크리닝 키트 및 신규 항진균제 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전자 결손 돌연변이 균주를 세포독성이 있는 항진균제와 함께 배양하여 세포성장이 저해되는 것으로 확인되는 특정 항진균제에 대한 표적 유전자, 상기 항진균제 표적 유전자가 결손된 돌연변이 분열효모군을 포함하여 제조한 항진균제 스크리닝 키트 및 상기 항진균제 스크리닝 키트를 이용하여 항진균제 또는 신규 항진균제 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 신규로 찾아낸 항진균제의 표적유전자가 결손된 돌연변이 균주는 신규 항진균제를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 유전자 결손 돌연변이 분열효모군을 이용하여 검색한 항진균제 표적 유전자, 상기 항진균제 표적 유전자가 결손된 돌연변이 분열효모군을 포함하여 제조한 항진균제 스크리닝 키트 및 상기 항진균제 스크리닝 키트를 이용하여 항진균제 또는 신규 항진균제 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
신약을 개발하는데 있어서, 지금까지는 약물에 대한 구체적 표적(target)을미리 알고 있어서 생체내에서(in vivo) 약물의 효과를 찾기보다는 직접 세포 내에 약물을 투여함으로써 이에 따라 나타나는 전반적인 현상을 관찰하여 새로운 약물을 개발하였다. 그러나, 상기와 같은 방법은 비용과 시간이 많이 걸리고 부작용이 발생되는 등의 단점이 있었다. 그러나, 최근 유전체학(genomics)이 많이 발달함에 따라 약물이 작용하는 정확한 표적 유전자를 찾고, 그 표적 유전자에만 특이적으로 작용하는 약물의 작용기작을 밝힘으로써 부작용이 적은 약물을 찾는 화학유전체학(chemogenomics)이 각광을 받고 있다.
특정 약물이 작용하는 표적 유전자를 탐색하는 대표적인 방법으로는 유전자의 발현현상을 이용하는 유전체 기능학(functional genomics)이 있다. 이는, 동물세포 또는 대상세포에 특정 약물을 처리한 후 DNA 칩(chip)을 이용하여 약물 미처리군과 비교했을 때 발현 양상이 다른 유전자군을 찾아내어 구체적인 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro) 실험을 수행함으로써 약물의 효과 및 질환과 관련된 표적 유전자를 검색하는 것이다. 유전체 기능학을 이용한 방법의 경우, 약물에 반응하는 작용기전 및 표적 유전자를 검색할 수 있으나, 비용이 많이 들고 정확한 표적 유전자를 찾기 위한 보완 연구도 함께 진행되어야 하기 때문에 약물에 작용하는 유전자를 탐색하는데 많은 시간이 요구되는 단점이 있다.
또한, 특정 약물이 작용하는 표적 유전자를 탐색하는 다른 방법으로 유전자 결손 이형접합체 돌연변이의 하프로인서피션시(haploinsufficiency)를 이용하고 분열효모의 생장에 영향을 미치는 약물을 이용함으로써 표적 유전자를 찾아내는 방법이 있는데, 이는 생체내 분석(in vivoassay)을 손쉽게 할 수 있어 값싸고 빠르며효율적으로 약물의 표적 유전자를 검색할 수 있는 방법이다. 후자의 방법은 특정 약물에 대한 이형접합체 돌연변이의 민감도 변화를 HTS(High Through-put Screening)를 활용하여 대량으로 측정함으로써 모든 가능한 표적 유전자를 쉽게 찾을 수 있기 때문에 특정 약물, 독소, 천연혼합물 등에 대한 표적 유전자 탐색에 유용하다. 또한, 특정 계열의 약물에 대해 표적 유전자가 결손된 돌연변이가 확인되면 유기합성된 화학 라이브러리(chemical library) 또는 천연물을 사용함으로써, 특정 표적 유전자가 결손된 돌연변이 세포에 특이적으로 세포독성을 보이는 약물을 탐색할 수 있어 특이성이 있고 부작용이 적은 신약을 개발하는데 활용될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주에 항진균제를 처리하였을 때 항진균제 특이적으로 세포 성장이 저해되는 균주를 탐색함으로써 이 균주의 결손된 유전자가 항진균제의 표적 유전자임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유전자 결손 돌연변이 분열효모군을 이용하여 검색한 항진균제 표적 유전자, 상기 항진균제 표적 유전자가 결손된 돌연변이 분열효모군을 포함하여 제조한 항진균제 스크리닝 키트 및 상기 항진균제 스크리닝 키트를 이용하여 항진균제 또는 신규 항진균제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 컴퓨터 알고리즘에 의해 21개의 공통 프라이머를 디자인한 후 염색체 DNA를 전사틀로 하여 각 조합의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 1b는 비특이적인 PCR 산물을 적게 만드는 프라이머를 선택하여 온도의 변화에 따른 PCR 산물의 생성을 조사한 결과이다.
도 2a는 PCR의 전사틀로 사용하는 플라즈미드 pFA6-kanMX4의 개략도이다.
도 2b는 본 발명의 유전자 결손카세트의 모식도이다.
도 2c는 유전자 결손 돌연변이 균주의 제조에 사용할 유전자 결손 카세트를 PCR 방법으로 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3a는 nda2 유전자의 결손을 확인한 콜로니 PCR 결과이다.
도 3b는 psp1 유전자의 결손을 확인한 콜로니 PCR 결과이다.
도 4a는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 액체배양하여 암포테리신 B(amphotericin B)에 대해 민감성을 나타내는 돌연변이 균주를 찾은 흡광도 결과이다.
도 4b는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 고체배양하여 암포테리신B에 대해 민감성을 나타내는 돌연변이 균주를 찾은 세포 배양 결과이다.
도 4c는 고체배양하여 암포테리신 B에 대해 민감성을 나타낸 돌연변이 균주의 암포테리신 B에 대한 민감성을 재확인한 세포 배양 결과이다.
도 5a는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 액체배양하여 케토코나졸(ketoconazole)에 대해 민감성을 나타내는 돌연변이 균주를 찾은 흡광도 결과이다.
도 5b는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 고체배양하여 케토코나졸에 대해 민감성을 나타내는 돌연변이 균주를 찾은 세포 배양 결과이다.
도 5c는 고체배양하여 케토코나졸에 대해 민감성을 나타낸 돌연변이 균주의 케토코나졸에 대한 민감성을 재확인한 세포 배양 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전자 결손 돌연변이 분열효모군을 이용하여 검색한 항진균제 표적 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항진균제 표적 유전자가 결손된 돌연변이 분열효모군을 포함하여 제조한 항진균제 스크리닝 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항진균제 스크리닝 키트를 이용하여 항진균제 또는 신규 항진균제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "표적 유전자(target gene)"라 함은 어떤 약물(항암제 또는 항진균제)에 대해 반응하는 유전자를 뜻한다. 구체적으로 표적 유전자는 유전자가 다이플로이드(diploid)로 존재하는 야생형일 때에는 상기 유전자 산물(주로 단백질)이 정상적으로 생성되어 이것이 약물과 반응함으로써 약물의 작용을 억제할 수 있어 세포가 정상적으로 성장할 수 있게 하지만, 유전자 한 개가 결손되어 하플로이드(haploid) 세포의 경우처럼 한 개의 유전자가 존재하게 될 경우 즉, 이형접합체 유전자 결손 돌연변이 상태일 때에는 세포에서 정상적으로 생성된 유전자 산물의 양이 적어 약물의 작용을 억제할 수 없어 세포의 성장이 저해되는 결과를 초래하는, 어떤 특정 약물에 대해 반응하는 유전자를 뜻한다.
또한, 본 발명에서 "돌연변이 분열효모군"이라 함은 각각 특정 유전자가 결손된, 다수의 분열효모 균주를 모두 포함하는 집합체를 뜻한다.
또한, 본 발명에서 "케미컬 라이브러리"라 함은 유기합성된 모든 화합물을 뜻한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 유전자 결손 돌연변이 분열효모군을 이용하여 검색한 항진균제 표적 유전자를 제공한다.
본 발명에서 항진균제 표적 유전자를 검색하기 위해 사용한 유전자 결손 돌연변이 분열효모균주는 유전자 결손 카세트를 제조한 후 이를 분열효모에 형질 도입함으로써 제조된다. 보다 상세하게는, 본 발명에서 이용한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모균주는 마커로는 분열효모에서 저항성을 나타내는 항생마커를 사용하고, 결손시키는 유전자에 따라 다른 유전자 결손 돌연변이와 구별될 수 있도록 특정한 표식염기를 붙이며, 유전자 결손을 간단하게 확인하기 위해 공통프라이머 서열을 사용하여 유전자 결손 카세트를 만든 후 상기 유전자 결손 카세트를 분열효모에 형질전환시켜 제조된다.
본 발명에서 사용한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 제조하는 방법은,
(1) 결손시킬 유전자 특이적 염기서열, 공통 프라이머, 제한효소 인식부위, 표식염기, 마커 유전자를 포함하는 유전자 결손 카세트(도 2b참조)를 제조하는 단계;
(2) 단계 1의 유전자 결손 카세트를 분열효모에 형질전환시키는 단계; 및
(3) 단계 2에서 형질전환시킨 분열효모의 유전자 결손을 확인하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1에 있어서, 유전자 결손 카세트를 제조하는 것은 PCR 방법에 의해 수행하는 것을 특징으로 하며, 유전자 결손 카세트는 마커 유전자를 중앙에 두고, 표식염기, 공통 프라이머, 제한효소 인식부위 및 표적 유전자 특이적 염기서열 좌우에 위치하는 것을 특징으로 한다. 유전자 결손 카세트를 제조하는 방법은 마커 유전자의 일부 서열, 제한효소 인식부위, 표식염기, 제한효소 인식부위, 공통 프라이머 및 특정 유전자 특이적 염기서열을 포함하도록 프라이머를 제작한후 마커 유전자를 전사틀로 하여 PCR 반응을 수행해 제조하는 것이다. PCR 반응을 수행하는데 있어서, 반응의 횟수는 1회로 수행할 수도 있고, 수회를 거쳐 특정 유전자 특이적 염기서열의 갯수를 점차 늘여가며 수행해도 무방하다. 바람직하게는, 상기 유전자 결손 카세트는도 2b의 구조를 가진다.
상기에서, 유전자 결손 카세트에 포함된 마커 유전자는 항생마커 또는 영양요구마커 유전자인 것이 바람직하며, 항생마커 유전자인 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 항생마커 유전자로 G418에 저항성을 나타내는 kanr유전자를 사용하였다.
상기에서, 공통 프라이머는 분열효모의 유전자와 상동성이 없는 서열로 표식염기를 증폭시킬 때 비특이적인 DNA를 증폭시키지 않게 하기 위해 이용하며, 서열번호 1로 기재된 C10 및 서열번호 2로 기재된 C11인 것이 바람직하다.
상기에서, 표식염기의 염기서열은 20-30개의 DNA 염기로 구성된 한 쌍으로 유전자 결손 돌연변이 균주의 표식을 목적으로 한다. 표식염기가 표식할 결손 돌연변이 균주의 유전자는 모든 유전자가 될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 (a)nda2(GeneBank #K02841) , (b)psp1(GeneBank #L36906), (c)pak1(GeneBank #L41552), (d)crm1(GeneBank #AF208056), (e)ste7(GeneBank #AB036789), (f)ste11(GeneBank #AB025942), (g)dis3(GeneBank #M74094), (h)dis2(GeneBank #M27068), (i)rad16(GeneBank #X71595), (j)rad24(GeneBank #X79206), (k)chk1(GeneBank #NM001274), (l)cds1(GeneBank #AJ222869), (m)cdr1(GeneBank #X57549) 및 (n)cdc25(GeneBank #M13158) 유전자, 그리고 여기에 추가로 약 2000여개의 유전자를 이용하였다. 구체적으로, 상기 각각 유전자에 대한 표식염기는 각각 (a)서열번호 3 및 서열번호 4, (b)서열번호 5 및 서열번호 6, (c)서열번호 7 및 서열번호 8, (d)서열번호 9 및 서열번호 10, (e)서열번호 11 및 서열번호 12, (f)서열번호 13 및 서열번호 14, (g)서열번호 15 및 서열번호 16, (h)서열번호 17 및 서열번호 18, (i)서열번호 19 및 서열번호 20, (j)서열번호 21 및 서열번호 22, (k)서열번호 23 및 서열번호 24, (l)서열번호 25 및 서열번호 26, (m)서열번호 27 및 서열번호 28 및 (n)서열번호 29 및 서열번호 30으로 기재된 한 쌍을 사용하였다. 또한, 나머지 약 2000여개의 유전자를 결손시키기 위한 유전자 결손 카세트의 표식염기도 제조할 수 있는데, 표식염기는 결손시킬 유전자를 표식하는 것이기 때문에 각 유전자 결손 카세트마다 모두 다르도록(중복되지 않게) 임의로 제작한다.따라서, 표식염기의 서열은 특별히 정해진 것은 아니고 유전자간에 중복되지 않게만 제조하면 어떤 서열을 사용하여도 무방하다.
상기에서, 결손시킬 유전자 특이적 서열은 특정 유전자의 ORF(open reading frame)의 아미노기 말단과 카복실기 말단의 염기서열로 구성된 한 쌍이며, 염기서열의 길이는 60 내지 150 bp인 것이 바람직하다. 상기 결손시킬 유전자 특이적 서열이 너무 짧을 경우 상동성 재조합(homologous recombination)이 일어나기 힘들다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 결손시킬 유전자 특이적 서열로 표적 유전자 ORF의 아미노기 말단과 카복실기 말단의 80bp 길이의 염기서열로 구성된 한 쌍의 염기 서열을 제조하였다. 상기 결손시킬 유전자 특이적 서열은 공지된 유전자의 ORF 서열(예를 들어 GenBank에 공개된 서열) 중 아미노미 말단 및 카복실기 말단의 서열을 이용하여 제조할 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서 용이하게 할 수 있다.
상기 단계 2에 있어서, 분열효모는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것이 아니고, 상기 분열효모 이외에도 다른 분열효모를 사용하여도 무방하다. 상기 형질전환 단계를 통해 제조된 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모균주는 유전자 결손 카세트내에 존재하는 결손시킬 유전자 특이적 염기서열이 분열효모의 염색체 상에 존재하는 유전자의 염기서열과 세포내 상동성 재조합에 의해 치환됨으로써 특정 유전자가 염색체 상에서 결손되도록 한 분열효모균주이다.
상기 단계 3에 있어서, 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모균주의 유전자 결손을 확인하는 방법으로는 표식염기를 탐침자(probe)로 하여 혼성반응(hybridization)으로 수행하거나, 콜로니 PCR 등의 공지의 방법으로 확인할 수 있으며, 바람직하게는 콜로니 PCR 방법으로 수행할 수 있다. 상기 콜로니 PCR은 콜로니의 건조 단계 및 표적 유전자 결손 카세트 내의 염기서열을 사용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함한다. 콜로니 PCR을 이용하여 유전자 결손을 확인하는 방법은 기존의 방법보다 간단하고 빨리 효율적으로 유전자 결손을 확인할 수 있는 장점이 있다.
본 발명자들은 특정 유전자를 결손시킨 이형접합체 돌연변이 균주를 제조하고, 이중에서 nda2 유전자를 결손시킨 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 '스키조사카로마이세스 폼베 NY_BG2662_0'이라 명명하고 2002년 4월 3일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였으며(수탁번호: KCTC 10220BP), psp1 유전자를 결손시킨 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 '스키조사카로마이세스 폼베 NY_BG3847_0'이라 명명하고 2002년 4월 3일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10221BP). 또한, 상기 분열효모균주 이외에도 나머지 약 2,000 여개의 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모균주를 제조하였다.
본 발명의 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모군을 이용하여 항진균제에 반응하는 표적 유전자를 검색하는 원리는 특정 유전자가 결손된 이형접합체 돌연변이 균주가 항진균제에 민감한 해플로인서피션시(haplo-insufficeincy) 현상을 보이는 것을 이용하는 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 항진균제가 존재하는 배지에서 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모균을 배양하여 생장이 저해되는 돌연변이 균주를 관찰함으로써 항진균제에 대한 표적 유전자를 검색 및 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제조한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모군은 항진균제에 대한 표적 유전자를 검색하는데 유용하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 항진균제로 암포테리신 B(amphotericin B) 및 케토코나졸(ketoconazole)이 선택되었지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 폴리엔 마크로리드 계열 항진균제 및 아졸 계열 항진균제도 적용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
암포테리신 B(amphotericin B)는 스트렙토마이세스 노도서스(Steptomyces nodosus)에 의해 생산되는 천연에 존재하는 폴리엔 마크로리드(polyene marcrolide) 계열 항생물질이다(약리학, 임동윤, 신일상사, 2000). 암포테리신 B는 독성의 가능성이 있음에도 불구하고, 전신 진균증을 치료하는데 사용되고 있는 약물로서, 때때로 플루사이토신(flucytosine)과 함께 사용함으로써 암포테리신에 의한 독성을 낮출 수 있다. 수개의 폴리엔(polyene) 분자는 스테롤(sterol)과 폴리엔(polyene) 계열 항생제의 친지성(lipophilic) 분절사이에서 소수성 결합과 관련된 구멍(pore) 또는 통로(channel)를 형성하기 위해 감수성 진균세포의 세포막에 존재하는 에르고스테롤(ergosterol)과 결합한다. 이렇게 암포테리신의 폴리엔 분자가 에르고스테롤과 결합되게 되면 세포에서 막의 기능을 방해하고, 전해질 특히, 칼륨과 작은 분자들을 세포에서 누출되게 함으로서 결과적으로 세포독성을 일으킨다. 폴리엔(polyene) 항생제는 포유동물의 세포막 스테롤(sterol)인 콜레스테롤보다 에르고스테롤에 더 잘 결합하기 때문에 상대적인 특이성을 나타내어 진균에 대해 광범위하게 효과를 볼 수 있다.
케토코나졸(Ketoconazole)은 치환된 이미다졸(imidazole)로서 전신진균증을 치료하는데 유용한 아졸(azole)류의 약물이다. 케토코나졸은 C-14a-디메틸레이즈(C-14a-demethylase, cytochrome P-450 효소)와 상호 작용하여 라노스테롤(lanosterol)에서 진균막의 주요한 스테롤(sterol)인 에르고스테롤으로의 탈메칠화를 차단한다. 케토코나졸에 의한 에르고스테롤으로의 탈메틸화의 차단은 세포막의 기능을 방해하여 전해질의 투과성을 증대시킨다. 그 외에도 케토코나졸은 C17-20 라이에이즈(C17-20 lyase), 11B-하이드록시레이즈(11B-hydroxylase) 및 콜레스테롤(cholesterol)의 측쇄분열을 차단함으로써 인간의 생식선 및 부신의 스테로이드 합성을 억제한다(약리학, 임동윤, 신일상사, 2000).
본 발명자들은 항진균제에 대한 표적 유전자를 탐색하기 위해 유전자 결손 돌연변이 분열효모군을 항진균제가 포함된 액체배양 배지 및 고체배양 배지에서 배양하면서 항진균제 각각에 대해 세포의 성장이 저해되는 균주를 탐색하였다. 액체배양은 96-웰 플레이트를 이용하여 수행하고, 약물을 넣은 배지에서 세포를 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하여 약물에 의한 성장저해를 야생형 균주와 비교하게된다. 액체배지에서의 약물에 의한 성장저해 실험은 HTS(High Through-put Screening) 기계를 사용하여 대량으로 수행하였고, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 야생형 균주와 돌연변이 균주가 약물에 의해 성장의 영향을 받는 정도를 비교하였다. 또한, 고체배양은 차례로 희석된 약물을 함유하는 고체배지에서 세포가 자라는 정도를 직접 시각적으로 관찰하는 것으로 고체배양을 하면 손쉽게 세포의 성장 저해 정도를 확인할 수 있었다.
즉, 항진균제 처리 후 야생 분열효모균주 또는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모 균주를 포함하는 배양배지의 상대적 흡광도를 측정하였을때 흡광도의 값을 이용한 생장 저해의 값이 - 0.2 이하의 값을 보이는 균주를 항진균제에 대해 민감하게 반응하는 균주로 판단한다. 또한, 항진균제를 처리한 고체배양에서는 세포의 밀도가 야생 균주에 비해 급격히 감소하는 경향을 보이는 균주를 항진균제에 대해 민감하게 반응하는 균주로 판단한다. 상기 액체배양 및 고체배양 결과를 종합한 후 항진균제 각각에 대해 반응하여 세포 성장이 저해된 유전자 결손 돌연변이 균주를 탐색함으로써 이 균주의 결손된 유전자를 각 항진균제에 대한 표적 유전자(target gene)로 판단할 수 있으며, 이러한 결과를 종합하면 "항진균제-항진균제 표적 유전자"와 같은 방식으로 대응시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에서 각각의 항진균제에 반응하는 표적 유전자로 검색된 유전자는 하기와 같다.
폴리엔 마크로리드(polyene marcrolide) 계열 항진균제인 암포테리신 B에 반응하는 표적 유전자는 GenBank #AL672257(Expasy #Q9P6R0), GenBank#AL391604(Expasy #CAC05249), GenBank #AL672256(Expasy #Q09869), GenBank #AL672256(Expasy #P56286), GenBank #O59679(Expasy #O59679), GenBank #Z99164(Expasy #Q10279) 및 GenBank #AL033127(Expasy #CAA21865) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
아졸(azole) 계열 항진균제인 케토코나졸에 반응하는 표적 유전자는 GenBank #AL672256, GenBank # 021046(Expasy #P56286), GenBank #AL034352(Expasy #O94321), GenBank #U24279, GenBank #AL096876, GenBank #Z50112(Expasy # Q9UT95), GenBank #AL353866(Expasy #Q9P6S3), GenBank #Z69726(Expasy #Q02953), GenBank #AL138854(Expasy #Q9P7T1), GenBank #AL031825(Expasy #O74919), GenBank #AL023777(Expasy #O74978), GenBank #AL031535(Expasy #O74452), GenBank #AL031535(Expasy #Q10425), GenBank #Z68197(Expasy #Q10099), GenBank #AL034381(Expasy #O94349) 및 GenBank #AL022304(Expasy #P78795) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 항진균제 표적 유전자가 결손된 돌연변이 분열효모군을 포함하여 제조한 항진균제 스크리닝 키트 및 이를 이용하여 항진균제 또는 신규 항진균제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항진균제 스크리닝 키트는 항진균제 표적 유전자가 결손된 이형접합체 돌연변이 분열효모군을 포함한다. 또한, 추가로 상기 분열효모군 이외에도균주를 배양할 수 있는 세포 배양 플레이트 또는 항진균제를 스크리닝할 수 있는 지표가 되는 항진균제와 항진균제 표적 유전자의 관계가 정립되어 있는 본원 명세서 및 기타 공지의 자료를 포함할 수 있다.
상기에서 항진균제 스크리닝 키트에 포함되는 세포 배양 플레이트는 96웰 또는 384웰 배양 플레이트인 것이 바람직하며, 세포를 배양할 수 있는 모든 배양 플레이트를 사용할 수 있다. 세포 배양 플레이트의 웰수는 스크리닝을 손쉽게 하기 위해 일정수의 세포를 포함하도록 배양하기 위해서는 96웰 또는 384 웰인 것이 바람직하다.
상기에서 항진균제 스크리닝 키트에 포함되는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모군은 폴리엔 마크로리드(polyene marcrolide) 계열 항진균제인 암포테리신 B에 대한 표적 유전자인 GenBank #AL672257(Expasy #Q9P6R0), GenBank #AL391604(Expasy #CAC05249), GenBank #AL672256(Expasy #Q09869), GenBank #AL672256(Expasy #P56286), GenBank #O59679(Expasy #O59679), GenBank #Z99164(Expasy #Q10279) 및 GenBank #AL033127(Expasy #CAA21865) 결손된 돌연변이 균주, 아졸(azole) 계열 항진균제인 케토코나졸에 대한 표적 유전자인 GenBank #AL672256, GenBank # 021046(Expasy #P56286), GenBank #AL034352(Expasy #O94321), GenBank #U24279, GenBank #AL096876, GenBank #Z50112(Expasy #Q9UT95), GenBank #AL353866(Expasy #Q9P6S3), GenBank #Z69726(Expasy #Q02953), GenBank #AL138854(Expasy #Q9P7T1), GenBank #AL031825(Expasy #O74919), GenBank #AL023777(Expasy #O74978), GenBank #AL031535(Expasy #O74452), GenBank#AL031535(Expasy #Q10425), GenBank #Z68197(Expasy #Q10099), GenBank #AL034381(Expasy #O94349) 및 GenBank #AL022304(Expasy #P78795)가 결손된 돌연변이 균주를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이외에도, 본 발명의 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모군을 이용하여 다른 항진균제에 반응하는 것으로 확인되어 공지된 유전자가 결손된 이형접합체 돌연변이 분열효모군을 추가로 포함하는 것도 가능하다.
본 발명의 스크리닝 키트에 포함되는 균주는 배양 웰당 0.5 ×105세포수/㎖ 내지 3.0 ×105세포수/㎖인 것이 바람직하다. 또한, 항진균제를 스크리닝할 수 있는 지표가 되는 항진균제와 항진균제 표적 유전자의 관계가 정립되어 있는 자료라 함은 본원 명세서 및 기타 공지된 항진균제 표적 유전자로 검색된 자료를 뜻한다. 예를들어 "암포테리신 B 또는 이와 유사한 폴리엔 마크로리드 계열 항진균제-GenBank #AL672257(Expasy #Q9P6R0), GenBank #AL391604(Expasy #CAC05249), GenBank #AL672256(Expasy #Q09869), GenBank #AL672256(Expasy #P56286), GenBank #O59679(Expasy #O59679), GenBank #Z99164(Expasy #Q10279) 및 GenBank #AL033127(Expasy #CAA21865)로 기재되는 유전자를 포함하는 유전자"라고 표현될 수 있는 자료이다.
본 발명의 항진균제 스크리닝 키트를 이용하여 스크리닝할 수 있는 항진균제로는 폴리엔 마크로리드 계열 또는 아졸 계열의 항진균제이며, 상기 이외의 다른 종류의 항진균제도 스크리닝할 수 있다. 상기 폴리엔 마크로리드 계열 항진균제는암포테리신 B이고, 아졸 계열 항진균제는 케토코나졸인 것이 바람직하다.
본 발명의 스크리닝 키트를 이용하여 항진균제 또는 신규 항진균제 후보물질을 스크리닝하는 방법은
1) 유전자 결손 돌연변이 분열효모군을 포함하는 스크리닝 키트에 스크리닝하고자 하는 항진균제 또는 신규 항진균제 후보 물질을 포함하는 배양배지를 넣어 균주를 배양하는 단계; 및
2) 단계 1에서 배양한 돌연변이 분열효모 균주의 성장 정도 및 야생형 균주의 성장 정도를 측정 및 비교하여 야생형 균주에 비해 성장이 저해된 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 확인하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1에 있어서, 스크리닝 키트에 포함되는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 분열효모군은 웰당 0.5 ×105세포수/㎖ 내지 3.0 ×105세포수/㎖를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 항진균제 또는 신규 항진균제 후보 물질을 포함하는 배양배지를 넣어 균주를 배양하는 것은 약물의 농도를 단계별로 희석하여 야생형 균주의 세포 성장이 저해되지 않는 범위로 약물 농도를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 배양배지는 액체배양 배지 또는 고체배양배지를 사용하며, 어느 것을 사용하여도 무방하다.
상기 단계 2에 있어서, 균주의 생장저해 정도를 측정하는 것은 액체 배양시 세포를 포함하는 배양액을 이용하여 흡광도를 측정하는 것이며, 고체 배양시에는성장한 세포의 밀도를 육안으로 확인하는 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 액체 배양시 흡광도 범위 600 nm에서 측정하였다.
또한, 측정한 균주의 성장 정도를 야생형 균주의 성장과 비교하는 것은 액체 배양시 측정된 흡광도를 컴퓨터 프로그램으로 분석하여 야생균주가 약물에 영향받는 정도를 기준점인 0으로 정하고, 여기에 비혀 상대적으로 더 생장 저해받은 정도를 마이너스(-) 값이 나오도록 하여 흡광도 값을 수치화함으로써 그 값이 -0.2 이하의 값이 나온 경우의 균주를 성장이 저해된 균주로 선별하는 것이 바람직하다. 또한, 고체 배양시에는 세포의 밀도가 야생형 균주의 세포 밀도에 비해 급격히 감소한 균주를 선별하는 것이 바람직하다.
또한, 상기에서 항진균제 또는 신규 항진균제 후보물질은 천연물 또는 케미컬 라이브러리를 이용하여 선택될 수 있다.
본 발명의 항진균제 또는 신규 항진균제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 이용하면, 항진균제 또는 신규 항진균제 후보물질을 투여하여 배양한 후 유전자 결손 돌연변이 균주의 성장이 야생형 균주에 비해 저해된 균주의 결손된 유전자를 "항진균제-항진균제 표적 유전자"로 관계지어진 자료로부터 확인함으로써 본 발명에서 투여한 약물이 어떤 항진균제인지 또는 기존에 존재하는 항진균제와 유사한 신규 항진균제 후보물질인지를 확인할 수 있다. 예를 들어, 항진균제가 아닌 다른 약물 또는 신규한 물질을 본 발명의 스크리닝 키트에 포함된 균주에 넣어 배양하여 흡광도를 측정한 결과 GenBank # AL672257, AL391604, AL672256, #AL672256(Expasy#P56286), O59679, Z99164 및 AL033127 유전자가 결손된 균주가 야생균주보다 생장 저해를 받았다고 가정하면, 상기 유전자들이 암포테리신 B의 표적 유전자임을 알 수 있으므로, 항진균제가 아닌 다른 약물 또는 신규한 물질이 항진균제인 암포테리신 B와 비슷한 작용을 한다는 것임을 확인할 수 있어 이를 신규 항진균제라고 결론지을 수 있다.
따라서, 스크리닝 하고자 하는 약물을 넣어 배양하였을때 세포의 성장이 급감하는 것을 확인한 균주가 GenBank #AL672257(Expasy #Q9P6R0), GenBank # AL391604(Expasy #CAC05249), GenBank #AL672256, GenBank #AL672256(Expasy #P56286), GenBank #O59679(Expasy #O59679), GenBank #Z99164(Expasy #Q10279) 및 GenBank #AL033127(Expasy #CAA21865)로 기재되는 유전자가 결손된 돌연변이 균주일때에는 스크리닝하고자 하는 약물이 암포테리신 B 또는 이와 유사한 암포테리신 계열 항진균제라고 판단할 수 있고, GenBank #AL672256, GenBank #AL672256(Expasy #P56286), GenBank #021046(Expasy #P56286), GenBank #AL034352(Expasy #O94321), GenBank #U24279, GenBank #AL096876, GenBank #Z50112(Expasy #Q9UT95), GenBank #AL353866(Expasy #Q9P6S3), GenBank #Z69726(Expasy #Q02953), GenBank #AL138854(Expasy #Q9P7T1), GenBank #AL031825(Expasy #O74919), GenBank #AL023777(Expasy #O74978), GenBank #AL031535(Expasy #O74452), GenBank #AL031535(Expasy #Q10425), GenBank #Z68197(Expasy #Q10099), GenBank #AL034381(Expasy #O94349) 및 GenBank #AL022304(Expasy #P78795)로 기재되는 유전자가 결손된 돌연변이 균주일때에는 스크리닝하고자 하는 약물이 케토코나졸 또는 이와 유사한 아졸 계열 항진균제라고 판단할 수 있다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 스크리닝 할 수 있는 항진균제 또는 신규 항진균제 후보 물질은 암포테리신 B 또는 그와 유사한 유도체, 케토코나졸 또는 그와 유사한 유도체가 될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 공통 프라이머(universal primer)의 결정
표식 DNA를 증폭하기 위해 사용되는 공통 프라이머는 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 분열효모 유전체의 염기서열과 공통되지 않고 GC 함량이 40-60% 되는 20개의 염기로 구성된 올리고뉴클레로타이드 21 종을 제작하였으며, 'C1 내지 C21'로 명명하였다. 상기 제조된 공통 프라이머를 다양한 조합으로 사용하여 분열효모의 염색체 DNA를 전사틀로 PCR을 수행한 후 PCR 산물의 생성 여부를 조사하였다. 비특이적인 DNA를 증폭시키지 않는 올리고뉴클레로타이드를 선택한 후 온도의 변화에 따라 PCR 산물을 조사하여 비특이적인 DNA가 증폭되지 않는 올리고뉴클레로타이드인 서열번호 1로 기재된 C10과 서열번호 2로 기재된 C11을 최적의 공통 프라이머로 결정하여 유전자 결손카세트를 제조시에 양쪽 표식염기 다음에 공통 프라이머가 위치하도록 하였다.
<실시예 2> 표식염기의 결정
특정 유전자가 결손된 돌연변이 균주를 표식하기 위한 표식 염기서열을 결정하기 위해, 프라이머간 2차 구조를 형성하지 않고 Tm 값이 유사하며 분열효모 염색체 DNA와 상동성이 없는 20개 염기로 구성된 올리고뉴클레오타이드 풀(pool)을 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 제작하였다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 'BC0000'의 형식으로 명명하였으며 하기표 1에 기재되는 유전자 결손 돌연변이 균주('BG0000' 형식으로 명명함) 및 추가로 약 2000개의 유전자 결손 돌연변이를 표식하기 위해 각각 2개씩 사용하였다. nda2(GenBank # KO2841) 결손 돌연변이 균주의 표식염기는 서열번호 3으로 기재된 BC504와 서열번호 4로 기재된 BC505이며, psp1(GenBank # L36906) 결손 돌연변이 균주의 표식염기는 서열번호 5로 기재된 BC506와 서열번호 6으로 기재된 BC507이다. 또한, 나머지 유전자 결손 돌연변이 균주의 표식염기 및 제조할 형질전환체명과 각 유전자의 GenBank acession No.는 하기표 1에 나타낸 바와 같다. 이하 나머지 유전자에 대해서도 본 명세서에서는 생략하기로 한다.
| 결손유전자 | 형질전환체명 | 표식염기(uptag) | 표식염기(downtag) | GenBank # |
| nda2 | NY_BG2662_0 | 서열번호 3(BC504) | 서열번호 4(BC505) | K02841 |
| psp1 | NY_BG3847_0 | 서열번호 5(BC506) | 서열번호 6(BC507) | L36906 |
| pak1 | NY_BG2610_0 | 서열번호 7(BC717) | 서열번호 8(BC718) | L41552 |
| crm1 | NY_BG0591_0 | 서열번호 9(BC774) | 서열번호 10(BC775) | AF208056 |
| ste7 | NY_BG1059_0 | 서열번호 11(BC3202) | 서열번호 12(BC3203) | AB036789 |
| ste11 | NY_BG3447_0 | 서열번호 13(BC3212) | 서열번호 14(BC3213) | AB025942 |
| dis3 | NY_BG3231_0 | 서열번호 15(BC3233) | 서열번호 16(BC3234) | M74094 |
| dis2 | NY_BG3931_0 | 서열번호 17(BC3235) | 서열번호 18(BC3236) | M27068 |
| rad16 | NY_BG4705_0 | 서열번호 19(BC843) | 서열번호 20(BC844) | X71595 |
| rad24 | NY_BG2157_0 | 서열번호 21(BC3278) | 서열번호 22(BC3279) | X79206 |
| chk1 | NY_BG4263_0 | 서열번호 23(BC3294) | 서열번호 24(BC3295) | NM001274 |
| cds1 | NY_BG4573_0 | 서열번호 25(BC3298) | 서열번호 26(BC3299) | AJ222869 |
| cdr1 | NY_BG1898_0 | 서열번호 27(BC3300) | 서열번호 28(BC3301) | X57549 |
| cdc25 | NY_BG1145_0 | 서열번호 29(BC3303) | 서열번호 30(BC3304) | M13158 |
또한, 상기와 같은 방법으로 약 2000여개의 유전자를 결손시키기 위해 각 유전자에 대한 표식염기를 제조하였다.
<실시예 3> 유전자 결손 카세트 프라이머 제작
유전자 결손 카세트는도 2b에 나타낸 모식도와 같이 항생재 마커 유전자인 Kanr유전자를 중앙으로 하고, 양쪽으로 대칭되게 제한효소EcoRⅠ 인식서열, 표식염기서열(20mer),DraⅠ 인식서열, 공통 프라이머(20mer) 및 유전자 특이적 염기서열(80mer)의 순으로 위치하도록 제조하였다. 구체적으로, 상기 유전자 결손 카세트를 제조하기 위해 Kanr유전자로는 kanMX4(GenBank # S78175)를 전사체로 하고, PCR 과정을 용이하게 하기 위해도 2c에 나타낸 바와 같이 4단계로 PCR을 수행하였다. 유전자 결손 카세트를 제조하기 위한 1차 PCR 프라이머는 상기 실시예 1에서 제조한 공통 프라이머 20 mer,DraI 인식부위 6 mer, 상기 실시예 2에서 제조한 표식염기 20 mer,EcoRⅠ 인식부위 6 mer, 마커인 kanMX4(GenBank # S78175)를 증폭시키기 위한 18 mer의 순으로 제작하였다. nda2 유전자 결손 돌연변이를 제조하기 위한 1차 프라이머의 염기서열은 서열번호 31로 기재된 nda2N1 및 서열번호 32로 기재된 nda2C1의 한 쌍, psp1 유전자 결손 돌연변이를 제조하기 위한 1차 프라이머의 염기서열은 서열번호 33으로 기재된 psp1N1 및 서열번호 34으로 기재된 psp1C1의 한 쌍이며, 나머지 약 2000여개의 유전자 결손 돌연변이를 제조하기 위한 1차 프라이머의 염기서열은 상기 nda2 및 psp1 유전자 결손 돌연변이를 제조하는 1차 프라이머의 염기서열과 동일한 방법으로 표식염기만 다르게 하여 제조하였다.
또한, 2-4 단계 PCR에서는 결손시키고자 하는 1 내지 14로 기재되는 표적 유전자에 존재하는 ORF(open reading frame)의 아미노기 말단과 카복실기 말단의 80 bp를 추가로 포함하도록 프라이머를 제조하였다.도 2c에서 보는 바와 같이 2차 PCR에서는 상기 1차 프라이머 서열의 마지막에 존재하는 공통 프라이머 서열에 각 유전자의 아미노기 말단 또는 카복실기 말단의 80mer 내에 있는 염기서열 30mer를 추가로 첨가하여 2차 PCR 프라이머를 제작하며, 3차 PCR 및 4차 PCR을 수행하기 위한 프라이머에는 추가로 각 유전자의 아미노기 말단 또는 카복실기 말단의 80mer를 추가로 포함하기 위해 상기 2차 PCR에서 사용한 30mer 이외에 50mer를 추가로 포함하도록 제작하였다. 상기 2차 내지 4차 PCR에 사용한 PCR 프라이머는 유전자의 ORF 서열만 있으면 당업자가 용이하게 수행할 수 있어 프라이머의 서열은 생략하기로 한다.
<실시예 4> 유전자 결손 카세트 제조
유전자 결손카세트는 실시예 3에서 제조한 1차 내지 4차 프라이머를 이용하여도 2c에 나타난 모식도의 과정으로 연속적인 4단계 PCR을 수행하여 각 표적 유전자의 ORF가 kanMx4 DNA의 양끝에 붙도록 증폭시켜 유전자 결손 카세트를 제조하였다. 구체적으로, 플라즈미드 pFA6-kanMX4(GenBank #AJ002680,도 2a)를 전사틀로 하여 1차 프라이머로 1 단계 PCR을 수행한 후 kanr마커와 표식염기, 공통 프라이머가 포함된 1.5 kb의 PCR 산물을 얻었다. 상기 1단계 PCR 산물을 정제한 후, 정제된 1 단계 PCR 산물을 전사틀로 하여 유전자 특이적인 염기서열이 포함된 2차 프라이머로 2단계 PCR 산물을 얻고, 정제된 2 단계 PCR 산물을 전사틀로 하여 유전자 특이적인 염기서열이 포함된 3차 프라이머로 3 단계 PCR을 수행하며, 정제된 3단계 PCR 산물을 전사틀로 하여 4차 프라이머로 4 단계 PCR을 수행함으로써 유전자 특이적인 염기서열이 5' 말단과 3' 말단에 각각 80 bp가 포함된 1.6 kb의 유전자 결손 카세트를 제조하였다. 각 단계에서 사용한 PCR 조건은 하기표 2에 기재한 바와 같으며, 제조된 유전자 결손 카세트의 구성요소는도 2b에 나타내었다.
| 변성 | 어닐링 | 연장 | 사이클 | |
| 1차 PCR | 94℃, 5분 | 54℃, 1분 | 72℃, 2분 | 1회 |
| 94℃, 1분 | 54℃, 1분 | 72℃, 2분 | 2회 | |
| 94℃, 1분 | 60℃, 30초 | 72℃, 2분 | 6회 | |
| 94℃, 30초 | 60℃, 30초 | 72℃, 5분 | 1회 | |
| 2차 PCR | 94℃, 4분 | 48℃, 1분 | 72℃, 2분 | 1회 |
| 94℃, 1분 | 48℃, 1분 | 72℃, 2분 | 2회 | |
| 94℃, 1분 | 68℃, 1분 | 72℃, 2분 | 6회 | |
| 94℃, 1분 | 68℃, 1분 | 72℃, 7분 | 1회 | |
| 3차 PCR | 94℃, 5분 | 48℃, 1분 | 72℃, 2분 | 1회 |
| 94℃, 1분 | 48℃, 1분 | 72℃, 2분 | 4회 | |
| 94℃, 1분 | 68℃, 1분 | 72℃, 2분 | 14회 | |
| 94℃, 1분 | 68℃, 1분 | 72℃, 7분 | 1회 | |
| 4차 PCR | 94℃, 5분 | 48℃, 1분 | 72℃, 2분 | 1회 |
| 94℃, 1분 | 48℃, 1분 | 72℃, 2분 | 4회 | |
| 94℃, 1분 | 68℃, 1분 | 72℃, 2분 | 20회 | |
| 94℃, 1분 | 68℃, 1분 | 72℃, 7분 | 1회 |
<실시예 5> 스키조사카로마이세스 폼베(
Schizosaccharomyces pombe
) 형질전환과 결손 돌연변이의 확인
리튬아세테이트(Li-acetate) 방법을 사용하여 분열효모 SP286 균주(ade 6-210/ade 6-216 ura 4-D18/ura 4-D18 leu 1-32/leu 1-32)에 상기 실시예 1 내지 실시예 4를 통해 제조한 유전자 결손 카세트를 세포 내로 도입하였다(Moreno, S.et al.,Methods Enzymol., 1991, 194, 795-823). 선택 마커인 kanr유전자가 G418 저항성을 나타내므로 열충격을 가한 후 YEPD(0.5% 펩톤, 0.5% 효모추출물, 3% 글루코스) 액체 배지에서 12 시간동안 배양한 후 G418을 함유하는 YEPD 고체배지에 도말한 후 3-4일 동안 배양하였다. 형질전환 돌연변이의 유전자가 결손되고 상기 실시예 4에서 제조한 유전자 결손 카세트가 삽입되었는지 확인하기 위해 콜로니 PCR을 수행하였다. 콜로니 PCR은 돌연변이 균주를 소량 튜브에 찍어 약 10분간 말려 물에 현탁한 후 직접 PCR 믹스와 혼합하여 PCR을 수행하는 것으로 기존의 방법보다간단하고 빨리 효율적으로 유전자 결손을 확인할 수 있는 방법이다. nda2 유전자 결손을 확인하기 위한 콜로니 PCR은 서열번호 35(nda2 upN) 및 서열번호 36(nda2 downC)의 한쌍, 서열번호 35(nda2 upN) 및 서열번호 37(CPN1)의 한쌍, 서열번호 38(kanC) 및 서열번호 36(nda2 downC)의 한쌍 및 서열번호 39(CPC3) 또는 서열번호 36(nda2 downC)의 한쌍으로 각각 수행하였으며, psp1 결손 돌연변이의 경우 서열번호 40(psp1 upN) 및 서열번호 41(psp1 downC)의 한쌍, 서열번호 41(psp1 downC) 및 서열번호 38(kanC)의 한쌍, 서열번호 1(C10) 및 서열번호 42(kanB)의 한쌍 또는 서열번호 2(C11) 및 서열번호 38(kanC)의 한쌍을 콜로니 PCR을 수행하기 위한 프라이머로 사용하여 하기표 3의 조건으로 각각 수행하였다. 또한, 나머지 약 2000여개의 유전자 결손 돌연변이 균주도 상기와 동일한 방법으로 유전자의 결손여부를 확인하였다.
| 변성 | 어닐링 | 연장 | 사이클횟수 |
| 94℃ 5분 | 40℃ 2분 | 72℃ 2분 | 3회 |
| 94℃ 1분 | 42℃ 1분 | 72℃ 1분 | 7회 |
| 94℃ 30초 | 44℃ 30초 | 72℃ 1분 | 20회 |
| 94℃ 30초 | 46℃ 30초 | 72℃ 5분 | 3회 |
그 결과, 본 발명의 nda2 및 psp1 유전자 결손 돌연변이 균주는 nda2 및 psp1 유전자가 확실하게 결손되었음을 확인할 수 있었다(도 3a및도 3b). 이에, nda2 유전자 결손 형질전환체를 '스키조사카로마이세스 폼베 NY_BG2662_0'라 명명하고, psp1 유전자 결손 형질전환체를 '스키조사카로마이세스 폼베 NY_BG3847_0'라명명하였으며 각각 2002년 4월 3일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10220BP 및 수탁번호; KCTC 10221BP). 또한, 나머지 약 2000여개의 유전자 결손 돌연변이 균주의 콜로니 PCR도 동일하게 수행하여 본 결과, 결손시키고자 하는 유전자가 확실히 결손됨을 확인할 수 있었다.
<실시예 1> 항진균제인 암포테리신 B(amphotericin B)에 대한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주의 민감도 조사
암포테리신 B(amphotericin B)는 스트렙토마이세스 노도서스(Steptomyces nodosus)에 의해 생산되는 천연에 존재하는 폴리엔 마크로리드(polyene marcrolide) 계열 항생물질이다. 암포테리신 B는 독성의 가능성이 있음에도 불구하고, 전신 진균증을 치료하는데 사용되고 있는 약물로서, 때때로 플루사이토신(flucytosine)과 함께 사용함으로써 암포테리신에 의한 독성을 낮출 수 있다. 수개의 폴리엔(polyene) 분자는 스테롤(sterol)과 폴리엔(polyene) 계열 항생제의 친지성(liphophilic) 분절사이에서 소수성 결합과 관련된 구멍(pore) 또는 통로(channel)를 형성하기 위해 감수성 진균세포의 세포막에 존재하는 에르고스테롤(ergosterol)과 결합한다. 이렇게 암포테리신의 폴리엔 분자가 에르고스테롤과 결합되게 되면 세포에서 막의 기능을 방해하고, 전해질 특히, 칼륨과 작은 분자들을 세포에서 누출되게 함으로서 결과적으로 세포독성을 일으킨다. 폴리엔(polyene) 항생제는 포유동물의 세포막 스테롤(sterol)인 콜레스테롤보다 에르고스테롤에 더 잘 결합하기 때문에 상대적인 특이성을 나타내어 진균에 대해 광범위하게 효과를 볼 수 있다.
항진균제인 암포테리신 B에 대한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주의 민감도 조사를 위해 모균주인 분열효모 SP286 균주 또는 본 발명에서 제조한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주 2000여 개를 액체배양 및 고체배양하여 시스플라틴에 대한 민감도를 조사하였다. 구체적으로, 먼저 액체 배양을 하기 위해 모균주 및 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주 2000개를 96웰 배양기에 각각 1.5 ×105/㎖의 세포 농도로 135 ㎕ 분주하였다. 여기에 최종 농도가 0, 0.05, 0.1, 0.2 ㎍/㎖이 되도록 암포테리신 B(amphotericin B) 용액(시그마, 미국) 15 ㎕를 넣은 다음 30 ℃에서 18시간 동안 배양하였다. 상기 배양후 상기 배양후 세포 배양액의 흡광도를 600 nm에서 측정하여 암포테리신 B에 대한 민감도를 측정 및 비교하였다. 측정된 흡광도를 컴퓨터 프로그램으로 분석하여 야생균주가 약물에 영향받는 정도를 기준점인 0으로 정하고 야생균주에 비해 상대적으로 생장이 저해받은 정도를 마이너스(-) 값으로 결정하여 이 값이 -0.2 이하의 값이 나온 경우를 암포테리신 B에 대해 민감한 것으로 판단하였다.
그 결과, 암포테리신 B에 민감하거나 저항성을 보이는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 약 40가지 정도 선별할 수 있었다(도 4a).
다음으로 고체 배양을 하기 위해 세포배양액 1 ×107/㎖을 1:4의 비율로 순차적으로 희석한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 0.1 ㎍/㎖ 농도의 암포테리신 B를 함유하도록 제조한 고체배지(EMM)에 각각 5 ㎕씩 떨어뜨린 후 생장 정도를 관찰하였다. 세포의 성장이 감소하여 세포의 밀도가 모균주에 비해 급격히 감소한 균주를 암포테리신 B에 대해 민감한 균주로 판정하였다.
그 결과, 모균주인 SP286 균주에 비해 암포테리신 B에 의해 생장이 저해되거나 저항성을 보이는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 약 40개 정도 찾을 수 있었다(도 4b). 또한, 상기 과정으로 암포테리신 B에 대해 민감성을 보이를 균주를 대상으로 0, 0.05, 0.1, 0.2 ㎍/㎖ 농도의 암포테리신 B를 함유하는 고체배지에서의 약물 민감도 검사를 상기와 동일하게 다시 수행하여 각 돌연변이들의 생장 저해 여부를 측정하였다. 그 결과, 케토코나졸에 대해 민감하게 반응하는 16개의 유전자 결손 돌연변이 균주를 선별할 수 있었고, 이 돌연변이 균주의 결손된 유전자가 항진균제의 표적유전자임을 알 수 있었다(도 4c및표 4).
| code | 유전자명 | 유전자 설명 | GenBank #Expasy # |
| h227 | SPBC13E7.10C | putative transcription factor ⅢB subunit;B-related factor; BRF | AL672257Q9P6R0 |
| p17 | SKH1 | MAPK kinase SKH1 | AL391604CAC05249 |
| p256 | SPAC12G12.05c | putative component of TAF(Ⅱ) complex(TBP-associated protein complex) | AL672256Q09869 |
| y323 | TIF211 | eukaryotic translation initiationfactor 2 alpha subunit | AL672256P56286 |
| h172 | SPBC29A3.17 | Rhofef domain containing protein | O59679O59679 |
| w460 | HTB1 | Histone H2B-alpha | AL033127CAA21865 |
| w357 | FUR4 | Uracil permease | Z99164Q10279 |
<실시예 2> 항진균제인 케토코나졸(ketoconazole)에 대한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주의 민감도 조사
항진균제인 케토코나졸에 대한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주의 민감도 조사를 위해 모균주인 분열효모 SP286 균주 또는 본 발명에서 제조한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주 2,000여 개를 액체배양 및 고체배양하여 케토코나졸에 대한 민감도를 조사하였다. 구체적으로, 먼저 액체 배양을 하기 위해 모균주 및 2000개의 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 96웰 배양기에 각각 1.5 ×105/㎖의 세포 농도로 135 ㎕ 분주한 후 최종 농도가 0, 0.25, 0.5, 1.0 ㎍/㎖이 되도록 케토코나졸 용액(시그마, 미국) 15 ㎕를 넣은 다음 30℃에서 18시간 동안 배양하였다. 상기 배양후 세포 배양액의 흡광도를 600 nm에서 측정하여 케토코나졸에 대한 민감도를 측정 비교하였다. 측정된 흡광도를 컴퓨터 프로그램으로 분석하여 야생균주가 약물에 영향받는 정도를 기준점인 0으로 정하고, 야생균주에 비해 상대적으로 생장이 저해받은 정도를 마이너스(-) 값으로 결정하여 이 값이 -0.2 이하의 값이 나온 경우를 케토코나졸에 대해 민감하게 반응하는 것으로 판단하였다.
그 결과, 모균주인 SP286 균주에 비해 케토코나졸에 의해 생장이 민감하거나 저항성을 보이는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 약 50개 정도 선별할 수 있었다(도 5a).
다음으로 고체 배양을 하기 위해 세포배양액 1 ×107/㎖을 1:4의 비율로 순차적으로 희석한 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 0.7 ㎍/㎖ 농도의 케토코나졸을 함유하도록 제조한 고체배지(EMM)에 각각 5 ㎕씩 떨어뜨린 후 생장 정도를 관찰하였다. 케토코나졸의 처리에 의해 세포의 성장이 감소하여 세포의 밀도가 모균주에 비해 급격히 감소된 균주를 케토코나졸에 대해 민감한 균주로 판정하였다.
그 결과, 모균주인 SP286 균주에 비해 생장이 저해되거나 저항성을 보이는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 약 50개 정도 찾을 수 있었다(도 5b). 또한, 상기 과정으로 케토코나졸에 대해 민감성을 보이를 균주를 대상으로 0, 0.25, 0.5, 1.0 ㎍/㎖ 농도의 케토코나졸을 함유하는 고체배지에서의 약물 민감도 검사를 상기와 같이 다시 수행하여 각 돌연변이들의 생장 저해 여부를 측정하였다. 그 결과, 본 발명에서는 케토코나졸에 대해 민감하게 반응하는 16개의 유전자 결손 돌연변이 균주의 유전자를 항진균제 표적유전자로 선별하였다(도 5c및표 5).
| code | 유전자명 | 유전자 설명 | GenBank #Expasy # |
| y323 | TIF211 | eukaryotic translation initiationfactor 2 alpha subunit | AL21046P56286 |
| p116 | SPBC27.04 | coiled-coil protein similar to yeastRAD50 involved in recombinationalDNA repair | AL353866Q9P6S3 |
| p170 | MPR1, SPY1 | stress response regulatorphosphotransmitter | AL034352O94321 |
| p178 | HSF | heat shock factor protein | Z69726Q02953 |
| p182 | SPAC23G3.02c | putative peptide synthetase; with 3 phosphopantetheine attachment site | AL138854Q9P7T1 |
| p85 | SPAC1C5.0 | N-acetylglucosamine-phosphate mutase | Z50112Q9UT95 |
| w870 | SPAC13A1 | probable cytochrome p450 51 | AL672256 |
| w1013 | ARU1 | Arginase | U24279 |
| w1019 | SPBC887.20c | putativehistidine biosynthesisbifunctional amidotransferase | AL096876 |
| K76 | SPACC757.09c | RNA binding protein putativeregulator of polyadenylation bysimilarity to yeast PBP1 | AL031825O74919 |
| K81 | SPCC1827.05 | protein with RRM,RNA recognition motif | AL023777O74978 |
| K82 | SPCC16C4.07 | RNA binding protein | AL031535O74452 |
| K120 | SPAC25G10 | eukaryotic translation initiationfactor 3 beta subunit | AL031535Q10425 |
| K64 | SPAC15F9.02 | putative nuclear pore protein | Z68197Q10099 |
| K72 | SPCC61.05 | hytpthetical protein | AL034381O94349 |
| K74 | TIF35 | eukaryotic translation initiationfactor 2 RNA-binding subunit | AL022304P78795 |
상기에서 살펴본 바와 같이, 다양한 항진균제에 대해 민감하게 반응하는 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 이용하면 각 항진균제에 대한 표적유전자를 검색하는데 용이하며, 검색된 항진균제 표적 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 이용하면 신규 항진균제를 스크리닝하는데에도 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Target gene of anti-fungal drugs and screening kit for
anti-fungal drugs candidates
<130> 3p-03-20
<160> 42
<170> KopatentIn 1.71
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<223> psp1 upN
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ttgtatcact aggtacttcc gtcac 25
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<213> Artificial Sequence
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<223> kanB
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Claims (8)
- 폴리엔 마크로리드(polyene marcrolide) 계열 항진균제에 반응하는 GenBank #AL672257(Expasy #Q9P6R0), GenBank #AL391604(Expasy #CAC05249), GenBank #AL672256(Expasy #Q09869), GenBank #AL672256(Expasy #P56286), GenBank #O59679(Expasy #O59679), GenBank #Z99164(Expasy #Q10279) 및 GenBank #AL033127(Expasy #CAA21865) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 항진균제 표적 유전자.
- 제 1항에 있어서, 상기 폴리엔 마크로리드 계열 항진균제는 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 항진균제 표적 유전자.
- 아졸 계열 항진균제에 반응하는 GenBank #AL672256, GenBank #021046(Expasy #P56286), GenBank #AL034352(Expasy #O94321), GenBank #U24279, GenBank #AL096876, GenBank #Z50112(Expasy #Q9UT85), GenBank #AL353866(Expasy #Q9P6S3), GenBank #Z69726(Expasy #Q02953), GenBank #AL138854(Expasy #Q9UT85), GenBank #AL031825(Expasy #O74919), GenBank #AL023777(Expasy #O74978), GenBank #AL031535(Expasy #O74452), GenBank #AL031535(Expasy #Q10425), GenBank#Z68197(Expasy #Q10099), GenBank #AL034381(Expasy #O94349) 및 GenBank #AL022304(Expasy #P78795) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 항진균제 표적 유전자.
- 제 3항에 있어서, 상기 아졸 계열 항진균제는 케토코나졸(ketoconazole) 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 항진균제 표적 유전자.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 항진균제 표적 유전자가 결손된 이형접합체 돌연변이 분열효모군을 포함하여 제조한 항진균제 스크리닝 키트.
- 제 5항에 있어서, 상기 항진균제는 암포테리신 B, 케토코나졸 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항진균제 스크리닝 키트.
- 1) 제 5항의 스크리닝 키트에 스크리닝하고자 하는 항진균제 또는 신규 항진균제 후보 물질을 포함하는 배양배지를 넣어 균주를 배양하는 단계; 및2) 단계 1에서 배양한 돌연변이 분열효모 균주의 성장 정도 및 야생형 균주의 성장 정도를 측정 및 비교하여 야생형 균주에 비해 성장이 저해된 유전자 결손 이형접합체 돌연변이 균주를 확인하는 단계를 포함하는, 항진균제 또는 신규 항진균제 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 항진균제 또는 신규 항진균제 후보 물질은 천연물 또는 케미컬라이브러리를 이용하여 선택되는 것을 특징으로 하는, 항진균제 또는 신규 항진균제 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR10-2003-0018359A KR100485640B1 (ko) | 2003-03-25 | 2003-03-25 | 항진균제 표적 유전자 및 항진균제 스크리닝 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR10-2003-0018359A KR100485640B1 (ko) | 2003-03-25 | 2003-03-25 | 항진균제 표적 유전자 및 항진균제 스크리닝 키트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20040083756A true KR20040083756A (ko) | 2004-10-06 |
| KR100485640B1 KR100485640B1 (ko) | 2005-04-27 |
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ID=37367430
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| KR (1) | KR100485640B1 (ko) |
-
2003
- 2003-03-25 KR KR10-2003-0018359A patent/KR100485640B1/ko active IP Right Grant
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| KR100485640B1 (ko) | 2005-04-27 |
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