JP2001517946A

JP2001517946A - 抗真菌活性物質のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2001517946A
Application number: JP54116598A
Authority: JP
Inventors: アルベルト、ヒネン; ヨハネス、ヘゲマン; トーマス、ムンダー; チルマー、シュースター; ホルスト、フェルトマン; ビルフリート、クラーマー; フリートリッヒ、カール、ツィマーマン; カール−ディーター、エンツィアン; マチアス、ローゼ; ペーター、ケッター
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1997-04-02
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 2001-10-09
Also published as: AU7213898A; DE59813664D1; US6537767B1; WO1998044135A2; EP0972057B1; EP0972057A2; WO1998044135A3; DE19713572A1; ATE334211T1

Abstract

(57)【要約】本発明は抗真菌活性物質をスクリーニングし、それにより真菌類、特にサッカロミセス・セレビシエ由来の必須遺伝子および機能的類似体および／または一連の相同性を有する真菌類遺伝子を標的として使用する方法に関する。このように該方法は真菌類由来の必須遺伝子を標的として使用することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】抗真菌活性物質のスクリーニング方法本発明は、抗真菌活性物質をスクリーニングする方法であって、菌類、特にサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の必須遺伝子、ならびに機能に関して相同な菌遺伝子および／または配列を標的として使用する方法に関する。公知の真菌感染のスペクトルは、皮膚表面または爪の真菌感染から生命を脅かす可能性のある内部器官の真菌症感染へとさまざまに拡大する。この性質の感染症およびそれらに付随する後遺症は真菌症と呼ばれている。真菌症の治療には抗真菌（静真菌または殺菌）活性物質が用いられる。しかしながらこれまでは、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、ピマリシン、グリセオフルビン、クロトリマゾール、５−フルオロシトシンおよびバトラフェンなど比較的少ない薬理学的に活性な物質が利用できるに過ぎなかった。特に真菌類および宿主細胞はいずれも真核細胞であるので、真菌感染症を医薬で治療することは非常に困難である。このため、公知の抗真菌活性物質を含んでなる薬剤の服用にはしばしば望ましくない副作用が伴う。例えば、アンフォテリシンＢは腎毒性作用を有する。従って、免疫系が損なわれた場合の予防として、またすでに感染が存在する場合の双方において真菌症を治療するのに使用可能な医薬を製造するために使用できる薬理学的に活性な物質が大いに必要となる。同時に、この物質は付随して宿主生物を損なうことなく選択的に真菌類の増殖および複製を予防することができるような特異的な作用プロフィールを示すべきである。これまでには抗真菌活性物質を同定する矛盾のない、有益な試験方法がなかった。ＷＯ９５／１１９６９には、抗真菌物質をスクリーニングする方法であって、試験する物質の作用をタンパク質の翻訳に対するその作用により測定する方法が記載されている。本発明の目的は、抗真菌活性物質を同定する方法であって、できる限り普遍的に使用でき、かつ、大量の可能性ある活性化合物をできる限り効果的な方式で試験することが可能な方法を開発することにある。この方法の重要な特徴は、真菌の必須遺伝子をスクリーニングの標的として使用することである。この方法は、特に必須遺伝子がコードするタンパク質の生化学的作用のいずれの詳細な知識も必要としないということにより、公知の方法とは異なる。本発明は、抗真菌活性物質を発見する方法であって、真菌の必須遺伝子および／または標的としてのこれら必須遺伝子の産物を使用する方法に関する。特に抗真菌活性物質は、それが真菌の必須遺伝子の機能的発現（転写および翻訳）またはコードされているタンパク質の機能的活性を完全にもしくは部分的に阻害することの結果として発児される。本発明は、抗真菌活性物質を発見する方法であって、ａ）サッカロミセス・セレビシエの必須タンパク質の発現を制御し、かつ／またはサッカロミセス・セレビシエの必須タンパク質もしくはその一部をコードする核酸、またはコードされている必須タンパク質自身、あるいはｂ）別の真菌種に由来し、かつａ）に記載のタンパク質と機能的に類似であるタンパク質の発現を制御し、かつ／もしくは別の真菌種に由来し、かつａ）に記載のタンパク質と機能的に類似のタンパク質をコードする別の核酸、またはコードされている機能的に類似のタンパク質自身を標的として用い、次いでａ）サッカロミセス・セレビシエの必須タンパク質の発現またはコードされている必須タンパク質自身の機能的活性に対する調べようとする物質の作用、またはｂ）別の真菌種に由来する機能的に類似のタンパク質の発現、もしくはコードされている機能的に類似のタンパク質自身の機能的活性に対する調べようとする物質の作用を決定することを含んでなる方法に関する。本方法の１つの具体例では、核酸は必須遺伝子またはその一部、例えば必須遺伝子のプロモーターもしくは必須遺伝子のエンハンサーである。本発明は真菌類において必須遺伝子を同定することを含み、次いでこの遺伝子をスクリーニング工程で使用できる。本発明はまず、サッカロミセス・セレビシエにおいて必須遺伝子を同定することを含む。本発明はまた、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）で同定した必須遺伝子を用いて、他の真菌類で機能的に類似の遺伝子を同定することを含む。適当であれば、これら機能的に類似の遺伝子は他の真菌類の必須遺伝子であってもよい。Ｓ．セレビシエで必須遺伝子を同定するためには、個々のＳ．セレビシエ遺伝子を相同組換えによりＳ．セレビシエケノムから除去する。除去されたＤＮＡセグメントが必須遺伝子であるならば、この欠失はＳ．セレビシエ細胞にとって致死的である。Ｓ．セレビシエゲノムに適当な欠失を作出し、その欠失を保持するＳ．セレビシエ細胞を選択できるようにするためには、調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子をマーカー遺伝子で置換する方法を使用する。このマーカー遺伝子（選択マーカーの遺伝子）を用いて、相同組換えが起こった細胞を選択することができる。なぜならば、これらの細胞では調べようとする遺伝子が選択マーカーの遺伝子で置換されているからである。使用可能な選択マーカーの例としては、優性選択マーカーまたは栄養要求性マーカーが挙げられる。使用される栄養要求性マーカーは、アミノ酸または核塩基合成経路の鍵酵素をコードする遺伝子である。例えば、ロイシン(例えば、ＬＥＵ２遺伝子)、ヒスチジン（例えば、ＨＩＳ３遺伝子）もしくはトリプトファン（例えば、ＴＲＰ１遺伝子）のアミノ酸代謝からの、または核塩基ウラシルの代謝からの（例えば、ＵＲＡ３遺伝子）酵素をコードするＳ．セレビシエ遺伝子がマーカーとして使用できる。本方法は、栄養要求性Ｓ．セレビシエ細胞または系統、すなわち各々の場合において用いるマーカーをコードする遺伝子が１以上の突然変異を有し、それにより機能的に活性な酵素が確実に発現しない細胞または系統を使用できることが必要である。これら栄養要求性細胞または系統は、それに対応するアミノ酸または核塩基を含む栄養培地でしか増殖できない。使用できる系統の例としては、栄養要求性および／または核塩基マーカーを有するＳ．セレビシエ実験系統の総てが挙げられる。二倍体Ｓ．セレビシエ細胞または系統を用いるならば、対応するマーカー遺伝子は相同突然変異型として存在していなければならない。特に、ＣＥＮ．ＰＫ２系統(Scientific Research & Development GmbH,Oberursel,Germany) またはその系統の同質遺伝子誘導体が使用される。本方法はまた、いずれの好適な栄養要求性マーカも持たないＳ．セレビシエ細胞または系統、例えば原栄養体Ｓ．セレビシエ細胞または系統の使用も含む。その場合には、優性選沢マーカー、例えばカナマイシン耐性遺伝子などの耐性遺伝子をマーカーとして使用できる。Ｓ．セレビシエ遺伝子内で調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子のＤＮＡ配列がマーカー遺伝子配列で全てまたは部分的に置換されている相同組換えを達成するためには、マーカー遺伝子が５’および３’末端で、調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子の５’および３’末端の配列セグメントと相同な配列でフランクされているＤＮＡ断片を使用する。適当なＤＮＡ断片を調製するためには、欠失している特異的なＳ．セレビシエ遺伝子に多少なりとも同程度によく適合した種々の方法が利用できる。好適なＳ．セレビシエ細胞または系統中への形質転換には直鎖ＤＮＡ断片を使用する。相同組換えにより、この断片はＳ．セレビシエのゲノムに組込まれる。これら種々の方法は以下の工程に使用できる：１．欠失カセットを作出する「従来法」(Rothstein，R.J．（1983）Methods in Enzymology Vol.101,202-211)。２．ＰＣＲ技術をを用いる「従来法」(「改良型従来法」)。３．ＳＦＨ（短いフランキング相同性）ＰＣＲ法(Wach,A et al.(1994)Yeast 10:1793-1808;Guldner,U.et al.(1996)Nucleic Acids Research 24:2519-2524) 。１．Ｓ．セレビシエゲノムに欠失カセットを作出する「従来法」では、調べようとする遺伝子は好適なベクター中にすでに存在しているか、またはかかるベクターに組込まれているのいずれかである。例えばｐＢＲ、ｐＵＣおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）誘導体は総て、本方法に使用できる。例えば、適当に選択される制限切断部位を用いて、これらのベクターの１つから調べようとする遺伝子配列の主要な部分を除去するが、これに関しては、調べようとする遺伝子の５’および３’領域はベクター内に留まる。その場合、選ばれた選択マーカーの遺伝子はこれらの残留した領域の問に組込まれている。２．この「従来法」の改良型ではＰＣＲ技術を用いる。この方法では、調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子領域は各々コーディング配列の３’および５’末端に位置し、これがＰＣＲ技術により増幅される。この方法では、増幅されるのは調べようとする遺伝子の２末端の端部領域だけであり、これにより調べようとする各遺伝子について、ある場合には遺伝子の５’を増幅し、また別の場合には３’末端を増幅するというような２種類のＰＣＲ反応を行うことが必要となる。増幅される末端領域のＤＮＡセグメントの長さは、例えばこの領域に存在する制限切断部位に依存する。概して、増幅される調べようとする遺伝子の末端領域は５０〜５０００塩基対の長さであり、５００〜１０００塩基対（ｂｐ）の間の長さが特に好ましい。Ｓ.セレビシエのゲノムＤＮＡは、例えばＰＣＲ反応の鋳型として使用できる。野生型遺伝子または改変野生型遺伝子もＰＣＲ反応の鋳型として使用できる。プライマー対(各々の場合でセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー)は、それらが調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子のそれぞれ３’および５’末端の配列セグメントと対応するように構築する。特に、プライマーは、ベクターへの組込みを達成するために好適な制限切断部位が使用できるように選択する。ｐＵＣベクター、ｐＢＰベクターおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクターの誘導体はベクターとして使用可能である。すでに選択マーカーをコードする遺伝子を含んでいるベクターが特に好適である。この目的のために、選択マーカーＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１またはＵＲＡ３の遺伝子を含むベクターが特に使用できる。この目的のため、例えば、プラスミドｐＰＫ５／６(配列番号１８)、ｐＰＫ７／８(配列番号１９)、ｐＰＫ９／１０（配列番号２０）およびｐＰＫ１３／１４（配列番号２１）を使用できる。プラスミドｐＰＫ５／６ｐＰＫ７／８、ｐＰＫ９／１０およびｐＰＫ１３／１４のヌクレオチド配列は配列一覧に示されている。これらのプラスミドの調製は実施例２〜６に記載されている。ＰＣＲにより生成された、調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子のＤＮＡセグメントは、選択マーカーをコードする遺伝子の２つの末端でベクターに組込まれており、「従来法」同様、使用する選択マーカーが２つに末端において調べようとする遺伝子の相同なＤＮＡ配列でフランクされ、すでにベクター中に存在している。３．Ｓ．セレビシエにおいて相同組換えは、驚くほど極めて効果的かつ正確に進行するので、調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子と相同であり、かつ、選択マーカーの遺伝子をフランクしているＤＮＡセグメントの長さは、適当であれば、「改良型従来法」の場合よりも実質的に短く作ることができる。調べようとする遺伝子と相同なフランキング領域の長さは約２０〜６０塩基対が必要であるに過ぎず、特に好ましくは３０〜４５塩基対である。ＳＦＨ−ＰＣＲ法の特に有利な点は精巧なクローニング工程が不要であるということである。ＰＣＲ反応は使用しようとする選択マーカーの遺伝子を含むＤＮＡ鋳型に対して行い、これに関しては、使用するプライマーを、センスプライマーのＤＮＡ配列が選択マーカー配列の５’末端と相同であり、さらにプライマーがその５’末端に、好ましくは４０ヌクレオチドの長さであり、かつ、調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子の５’末端の配列に対応する領域を有するように構築する。類似の方法では、アンチセンスプライマーを、選択マーカーの遺伝子配列の３ ’末端に相補的となるように構築し、このプライマーは同時に、５’末端で同様に好ましくは４０ヌクレオチドの長さであり、かつ調べようとする遺伝子の３’ 末端に配列に対応する領域を含有するものである。すでに栄養要求性または選択マーカーの遺伝子を含有しているベクターは、例えばＳＦＨ−ＰＣＲ法により、調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子を増幅するために使用される。プラスミドｐＵＧ６は特に鋳型として使用される。このプラスミドはｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセット(Guldener，U．et al．（199 6）Nucleic Acids Research 24:2519-2524)を含んでおり、すなわちカナマイシン耐性遺伝子が各末端でｌｏｘＰ配列によりフランクされている(ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセット)。このカセットの使用は、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ −ｌｏｘＰカセットを調べようとするＳ．セレビシエ遺伝子が位置していた遺伝子座に組込んだ後、適当であればカナマイシン耐性遺伝子をＳ．セレビシエのゲノムから再び除去できるという利点を有する。これはバクテリオファージＰ１Ｃｒｅ組換え酵素を用いて実施できる。Ｃｒｅ組換え酵素はｌｏｘＰ配列を認識し、２つのｌｏｘＰ配列の間にあるＤＮＡを相同組換え法により除去する。この結果、１つのｌｏｘＰ配列だけが残存するようになり、いわゆるマーカー回復が達成され、すなわちＳ．セレビシエ系統は再度ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットで形質転換される。特にこのことは、致死性の表現型を得るために２以上の機能的に相同な遺伝子を欠失させる場合に有利である。ＳＦＨ−ＰＣＲ法では、ＰＣＲ反応において、それらの３’末端に、好ましくは約２０ヌクレオチドの長さであり、かつ、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットのそれぞれ左側または右側の配列と相同な領域を有するプライマーを用い、各々の場合においてこれらプライマーはそれらの５’末端に、好ましくは４０ヌクレオチドの長さであり、かつ、調べようとする遺伝子の末端で配列セグメントと相同な領域を有する。３つの方法総てで、両末端を調べようとする遺伝子の相同配列でフランクされた選択された選択マーカーの遺伝子を含む直鎖欠失カセットが得られる。これらの欠失カセットは、二倍体Ｓ．セレビシエ系統の形質転換に使用される。この目的のためには、例えば二倍体Ｓ.セレビシエ系統ＣＥＮ.ＰＫ２(Scientific Rese arch & Development GmbH,Oberursel,Germany)が使用できる。 CEN.PK2 Mata/MAT α ura3-52/ura3-52 leu2-3，112/leu2-3，112his3△1/his 3△1trp1-289/trp1-289 MAL2-8^C/MAL2-8^C SUC2/SUC2 系統ＣＥＮ．ＰＫ２は公知の方法を用いて増殖、培養する(Gietz，R.D．et al ．（1992）Nucleic Acids Research 8:1425;Guldener，U．et al.（1996）Nucle ic Acids Research 24:2519-2524)。使用するＳ．セレビシエ系統の細胞を、公知の方法（例えば、Sambrook et al ．(1989)Molecular Cloning,A laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laborat ory Press）を用いて適当量の直鎖欠失カセットＤＮＡで形質転換する。その後細胞を培養している培地を新しい培地、対応するアミノ酸（例えば、ヒスチジン、ロイシンもしくはトリプトファン）または核塩基（例えば、ウラシル）を含まないいわゆる選択培地に交換するか、あるいはカナマイシン耐性遺伝子を含有する欠失カセットを用いる場合は、次いで細胞をゲンチシン（Ｇ４１８(登録商標)）を含有する培地で培養する。別法として、形質転換細胞は、適当な培地を用いて調製した寒天プレート上で平板培養できる。この結果、変更した条件下で増殖できるのは相同組換えが起こった形質転換体だけであるので、これらの細胞が選択されることになる。しかしながらほとんどの場合、二倍体Ｓ．セレビシエ細胞または系統を形質転換したときには、２セットの染色体として存在する調べようとする２コピーの遺伝子のうち１コピーがだけが欠失カセットのＤＮＡで置換される。このことは、調べようとする遺伝子の１コピーが選択マーカーの遺伝子で置換され、一方、調べようとする遺伝子の他方のコピーがゲノム中に保持されている異型接合性二倍体Ｓ．セレビシエ細胞または異型接合性二倍体Ｓ．セレビシエ変異系統が形成することを意味している。このことは、このようにして必須遺伝子が欠失していれば、異型接合性二倍体細胞またはＳ．セレビシエ変異系統は必須遺伝子の第２のコピーがなお存在している結果、生存力を維持し続けるという利点を有する。適当であれば、所定の染色体の遺伝子座（調べようとする遺伝子の遺伝子座）に欠失カセットのＤＮＡが正しく組込まれているかどうかは、サザンブロット解析(Southern,E.M.（1975）J.Mol.Biol.98:503-517)により、または特異的プライマーを用いる診断ＰＣＲ解析(Guldener，U et al.（1996）Nucleic Acids r esearch 24:2519-2524)により確認することができる。個々の二倍体細胞の遺伝的分離は四分子分析によって監視することができる。このために、公知の方法を用いて二倍体系統、特に異型接合性二倍体変異系統を刺激し、例えば酢酸カリウムプレート上の窒素欠乏によって還元分裂(減数分裂) を行わせる(Sherman，F．et al.（1986）Cold Spring Harbor Laboratory Press ，Cold Spring Harbor，N.Y.;Guthrie，C．und Fink，G.R.（1991）Methods in Enzymology． Volume 194.Academic Press,San Diego,3-21;Ausubel,F.M.et al.（1987）Curre nt Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,Chapter 13)。減数分裂の結果、４つの子嚢胞子（分離体）を含有する子嚢が形成され、これはザイモラーゼ(Ausubel et al．(1987))で子嚢胞子壁を部分的に酵素消化した後、マイクロマニピュレーター（例えばSINGER製）を用いて個々に単離することができる。例えば、２セットの染色体中の必須遺伝子が相同組換えにより置換されている異型接合性二倍体変異系統を四分子分析に付せば、２つの分離体だけが生き残り、すなわちこれらの分離体は必須遺伝子をなお保持している。他の２つの分離体は、これらの分離体が調べようとする、この場合には必須である遺伝子を欠くので生存力がない。このようにして調べられた遺伝子が本当に必須であるかどうか、または調べようとする遺伝子の遺伝子座に隣接し、かつ、必須であり得る遺伝子が相同組換えにより「損傷を受けている」かどうかを確認するために、異型接合性二倍体Ｓ．セレビシエ変異系統を、調べようとする遺伝子を含む動原体プラスミドで形質転換する。この形質転換体を四分子分析に付す。２つではなく４つの生存力ある分離体が再度得られれば、調べようとする、動原体プラスミドに存在する遺伝子は２つの生存力のない半数体Ｓ．セレビシエ細胞／変異系統における欠失を相補することができ、それにより検討下にあるＳ．セレビシエ遺伝子が必須であることがわかる。用いる動原体プラスミドは、少ないコピー数、例えば細胞当たり１または２コピーで存在するプラスミドであることが好ましい。この目的のためには、例えば、プラスミドｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５およびｐＲＳ３１６(S ikorski,R.S.and Hieter,P.(1989)Genctics 122:19-27)、または類似のプラスミドを用いることができる。次いで、調べようとする遺伝子、好ましくはそれらの５’および３’非コーディング領域をもこれらのプラスミドに組込む。記載の方法を用いて、そのＤＮＡ配列が完全に、または部分的に知られている個々のサッカロミセス・セレビシエ遺伝子を調べることができる。Ｓ．セレビシエゲノムの全ＤＮＡ配列は、１９９６年４月２４日にＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ（ＷＷＷ）に公開した。ＷＷＷを通じてＳ．セレビシエゲノムのＤＮＡ配列を入手するには以下の可能性がある。ＭＩＰＳ(Munich Information Centre of Protein Scquence) アドレス：http://speedy.mips.biochem.mpg.de/mips/yeast/yeast-genom.htm lx ＳＧＤ(Saccharomyces Genome Database,Stanford) アドレス：http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces ＹＰＤ(Yeast Protein Database,Cold Spring Harbor) アドレス：http://www.prteome.com/YPDhome.html また、Ｓ．セレビシエゲノムの全ＤＮＡ配列は欧州(例えばアドレス：ftp.mip s.embnet.org)、米国（アドレス：genome-ftp.stanford.edu）または日本（アドレス：ftp.nig.ac.jp）のＦＴＰ（ファイル変換プロトコール）を通じても利用できる。この配列情報により、個々のサッカロミセス・セレビシエ遺伝子の各々がＳ．セレビシエにとって必須であるかないかを決定するために記載の方法を使用することができる。このようにしてＳ．セレビシエのケノムにおいて以下の遺伝子、すなわちＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗが必須であると同定された。表６ではこれら必須遺伝子の概要およびそれに関する情報を提供する。第１列には作出した変異系統（必須遺伝子がマーカー遺伝子で置換されたＣＥＮ．ＰＫ２系統）の名称を挙げ、第２列には必須遺伝子の系統的遺伝子名（対応するＤＮＡ配列がその下にデータベースに保存されている名称）を挙げ、第３列にはこれらの系統を作出するために使用される選択マーカーを挙げ、第４および第５列には必須遺伝子の欠失したヌクレオチドおよびそれらに対応するアミノ酸（位置１は対照位置として供され；位置１はオープンリーディングフレームの可能性ある開始コドンＡＴＧのＡである）を挙げている。それらが利用可能な限り、遺伝子名称（第６列）およびデータベース（ＤＢ）における登録（第７列）についても挙げている。遺伝子の必須の性質に関するデータベース登録も特にこの列に記録されている。例えばＹＧＲ０６０ｗ遺伝子の場合、この遺伝子はこれまで必須ではないと分類されてきたことが記録されている。ＣＥＮ.ＰＫ２系統を用いると、いま、驚くべきことにＹＧＲ０６０ｗ遺伝子が結局必須であることがわかった。これに加え、第８列は、それが利用できる限り、例えば必須であると同定された遺伝子またはコードされるタンパク質の機能、および／または他の遺伝子もしくはタンパク質との相同性／同一性に関するさらなる情報を挙げている。表６に示された情報は、Ｓ．セレビシエ遺伝子のＤＮＡ配列（第２列）が知られているが、この遺伝子またはコードされるタンパク質の機能または特性についてはこれまでにはほとんど知られておらず、かつ、これらの遺伝子のまたはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の必須の機能がいずれもこれまで知られていなかったということを概説するものである。必須であると同定された遺伝子配列は遺伝子データベース、例えば系統的遺伝子名（表６の第２列）の下にある前記のデータベースで入手できる。本発明は必須遺伝子ＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗの使用に関する。表６の第１列に明示されたサッカロミセス・セレビシエ系統、すわなちＣＥＮ．ＥＮ２７、ＣＥＮ．ＥＮ２８、ＣＥＮ．ＥＮ８、ＣＥＮ．ＲＯ２３、ＣＥＮ．ＲＯ３０、ＣＥＮ．ＲＯ６、ＣＥＮ．ＲＯ８、ＣＥＮ．ＳＲ１４、ＣＥＮ．ＳＲ１５、ＣＥＮ．ＳＲ２、ＣＥＮ．ＳＲ２６、ＣＥＮ．ＳＲ４１、ＣＥＮ．ＳＲ５５、ＣＥＮ．ＳＲ６６、ＣＥＮ．ＳＲ８０、ＣＥＮ．ＳＲ８１、ＣＥＮ．ＨＥ１、ＣＥＮ．ＨＥ１７、ＣＥＮ．ＨＥ１８、ＣＥＮ．ＨＥ２、ＣＥＮ．ＨＥ４、ＣＥＮ．ＨＥ９、ＣＥＮ．ＨＩ１０、ＣＥＮ．ＨＩ２３、ＣＥＮ．ＨＩ２８、ＣＥＮ．ＨＩ３１、ＣＥＮ．ＨＩ５、ＣＥＮ．ＨＩ７、ＣＥＮ．ＦＥ８、ＣＥＮ．ＫＲ２８、ＣＥＮ．ＴＳ０２、ＣＥＮ．ＴＳ０４およびＣＥＮ．ＺＩ２６は、前記の３つの方法のうちの１つを用いてＣＥＮ．ＰＫ２系統(Scientific Research & Technologie GmbH，Oberursel，Germany)から作出した。これらの系統は表６の第４列に挙げられたヌクレオチド（または第５列に挙げられたアミノ酸）が表６の第３列に挙げられた選択マーカーで置換されていたことにより定義される。本発明は系統ＣＥＮ．ＥＮ２７、ＣＥＮ．ＥＮ２８、ＣＥＮ．ＥＮ８、ＣＥＮ．ＲＯ２３、ＣＥＮ．ＲＯ３０、ＣＥＮ．ＲＯ６、ＣＥＮ．ＲＯ８、ＣＥＮ．ＳＲ１４、ＣＥＮ．ＳＲ１５、ＣＥＮ．ＳＲ２、ＣＥＮ．ＳＲ２６、ＣＥＮ．ＳＲ４１、ＣＥＮ．ＳＲ５５、ＣＥＮ．ＳＲ６６、ＣＥＮ．ＳＲ８０、ＣＥＮ．ＳＲ８１、ＣＥＮ．ＨＥ１、ＣＥＮ．ＨＥ１７、ＣＥＮ．ＨＥ１８、ＣＥＮ．ＨＥ２、ＣＥＮ．ＨＥ４、ＣＥＮ．ＨＥ９、ＣＥＮ．ＨＩ１０、ＣＥＮ．ＨＩ２３、ＣＥＮ．ＨＩ２８、ＣＥＮ．ＨＩ３１、ＣＥＮ．ＨＩ５、ＣＥＮ．ＨＩ７、ＣＥＮ．ＦＥ８、ＣＥＮ．ＫＲ２８、ＣＥＮ．ＴＳ０２、ＣＥＮ．ＴＳ０４およびＣＥＮ．ＺＩ２６、ならびにこれらの系統を作出する方法およびこれらの系統の使用に関する。本方法の１つの具体例では、サッカロミセス・セレビシエの必須遺伝子、特にＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗまたはその一部を使用して、対応する遺伝子、特に他の真菌類において一連の類似かつ／または機能的に類似の遺伝子を同定する。公知の方法を用い、例えば相同性スクリーニング(Sambrook，J．et al.（1989 ）Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.)により、または特異的プライマーを用いるＰＣＲ技術により、対応する真菌類のゲノムライブラリーおよび／またはｃＤＮＡライブラリーから一連の相同性を有する遺伝子を単離することができる。他の真菌種の機能的に類似の遺伝子とは、他の真菌種においてＳ．セレビシエで同定された必須遺伝子のそれと類似または同一の機能を有する遺伝子である。この機能的に類似の遺伝子は、適当であれば、対応するＳ．セレビシエ遺伝子と機能的に相同であってよい。機能的に類似の遺伝子は、適当であれば、対応するＳ．セレビシエの必須遺伝子と実質的に相同であってよい。他の真菌類由来の機能的に類似のまたは機能的に相同な遺伝子は、好ましくはその機能が対応するＳ．セレビシエタンパク質のそれと類似のタンパク質(機能的に類似のタンパク質) 、またはその機能が対応するＳ．セレビシエタンパク質のそれと相同なタンパク質（機能的に相同なタンパク質）をコードする。他の真菌類由来の機能的に類似のもしくは機能的に相同な遺伝子、あるいはこれらの遺伝子がコードするタンパク質は、対応するＳ．セレビシエ必須遺伝子またはこの遺伝子がコードするタンパク質の機能を完全にもしくは部分的に相補することができる。従って本発明はまた、Ｓ．セレビシエにおける必須遺伝子と機能的に類似の遺伝子が他の真菌類で同定できる方法に関する。本発明は特に、サッカロミセス・セレビシエ由来の必須遺伝子を用いて、他の真菌類で機能的に類似の遺伝子を同定する方法に関する。他の真菌類で機能的に類似の遺伝子を同定するこれらの方法では、サッカロミセス・セレビシエ必須遺伝子が調節可能なプロモーターの制御下に置かれているサッカロミセス・セレビシエ細胞を作出することが好ましい。このようにして改変したサッカロミセス・セレビシエ細胞を好ましくは次いで、調節可能なプロモーターが活性化される増殖条件下で増殖させ、この改変Ｓ．セレビシエ細胞を、他の真菌種から調製し、発現ベクター中に存在しているｃＤＮＡで形質転換し、その後例えば培養条件を変更することによってこの調節可能なプロモーターのスイッチが切られ、このようにして他の真菌種由来の機能的に類似のタンパク質をコードするｃＤＮＡが発現するサッカロミセス・セレビシエ細胞が選択される。サッカロミセス・セレビシエ必須遺伝子と機能的に類似であり、かつ、他の真菌種に由来する遺伝子に相当するｃＤＮＡを次いで、適当であれば、選択したＳ．セレビシエ細胞から単離し、解析することができる。このようにして別の真菌種由来の機能的に類似の遺伝子のコーディング配列を直接利用することができる。このｃＤＮＡを用い、公知の方法を適用することにより、例えば他の真菌種から調製したゲノムライブラリーを相同性に関してスクリーニングすることにより、他の真菌種において機能的に類似の遺伝子を同定することができる。またこれにより、次いで機能的に類似の遺伝子の調節配列、例えばプロモーターおよびエンハンサーが利用可能となる。かかる方法では、遺伝子ＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗの群より選択されるサツカロミセス・セレビシエ必須遺伝子の１つを調節可能なプロモーターの制御下に置くことが好ましい。例えば、他の真菌類で機能的に類似の遺伝子を発見するためには、公知の方法 (Sambrock et al.,1989)により、調べようとする真菌種からｍＲＮＡを単離することもできるし、同様に公知の方法(Sambrock et al.,1989;またはｃＤＮＡ合成キット、例えばStratagene製)により、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製することもできる。調製したｃＤＮＡは指定の方法で好適な発現ベクター中に組込むことができる。例えば、次いで発現ベクターの適したプロモーターの前に正しい方向でクローニングすることを可能にするのに好適な制限切断部位を有するプライマーの存在下でｃＤＮＡの第１鎖を合成することができる。使用する制限切断部位は、公知の制限切断部位のいずれであってもよい。使用するプライマーは例えば、以下に記載のおよそ５０ヌクレオチドの長さのプライマーであってよい：配列番号１：５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＴＸＸＸＸＸＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’ 配列（Ｘ）₆は例えばＸｈｏＩの好適な制限切断部位を表す。第２鎖の合成後に二本鎖ｃＤＮＡの付着端は埋めることができ(平滑末端の作製)、次いでこのｃＤＮＡの末端を好適なＤＮＡアダプター配列と連結させることができる。ＤＮＡアダプター配列は、ｃＤＮＡの第１鎖を合成するためのプライマーに使用した制限切断部位とは異なるべき制限切断部位を含んでいなければならない。ＤＮＡアダプターは例えば、互いに相補的であり、かつ、それらの末端に制限切断部位の付着端を呈するな９量体および１３量体オリゴヌクレオチドからなってよい。例えば、これらの末端はＥｃｏＲＩ切断部位であってもよい：配列番号２：５’ＸＸＸＸＸＧＧＣＡＣＧＡＧ３’ ３’ ＸＣＣＧＴＧＣＴＣ５’ 示されたアダプター配列のＸ列は制限切断部位の付着端である。次いで、適当なアダプター配列とともに提供されるｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ、例えばｃＤＮＡの第１鎖を合成するためのプライマーにその認識部位が使用されたＸｈｏＩで切断する。この例では、得られるｃＤＮＡは結果としてその３’末端にＸｈｏＩ突出末端を、またその５’末端にＥｃｏＲＩ突出末端を有し、その結果、制限酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断した発現ベクターに指定の様式で組込まれることが可能となる。好適な発現ベクターとしては特に、大腸菌(E.coli)／Ｓ．セレビシエシャトルベクター、すなわち大腸菌にもＳ．セレビシエにも使用可能なベクターがある。かかるベクターは次いで例えば大腸菌内で複製できる。使用する発現ベクターはＳ．セレビシエ細胞中に多数のコピーで存在するベクターであっても、これらの細胞に少数のコピーで存在するものであってもよい。例えばｐＲＳ４２３−ｐＲＳ４２６シリーズ（ｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、ｐＲＳ４２６）またはｐＲＳ３１３−ｐＲＳ３１６シリーズ（ｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５、ｐＲＳ３１６）由来のベクター(Sikorski,R.S.and Hieter P.,（19 89）Genetics 122:19-27;Christianson,T.W.et al.,（1992）Gene 110;119-122) がこの目的に好適である。この発現ベクターは好適なＳ．セレビシエプロモーターとターミネーターを有するべきである。使用する発現ベクターがこれらを有していなければ、適当なプロモーターおよびターミネーターを、それがなお、作出されるｃＤＮＡを次に組み込むことができるように挿入する。Ｓ．セレビシエ遺伝子ＭＥＴ２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩおよびＵＲＡ３のプロモーターが特に好適である。改変されていない形態の野生型遺伝子のプロモーターと特定のアクチベーター配列および／またはリプレッサー配列が除去されるよう改変したプロモーターの双方が使用できる。好適なターミネーターの例としてはＳ．セレビシエ遺伝子ＭＥＴ２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩおよびＵＲＡ３のターミネーターがある。他の真菌種において機能的に類似の遺伝子を発見する方法では、Ｓ．セレビシエの必須遺伝子を選択し、この遺伝子を統合的に(１)か、または染色体外に（２）かのいずれかで調節可能なプロモーターの制御下に置く。１．Ｓ．セレビシエゲノムに調節可能なプロモーターを組込むためには、このプロモーターを、例えばＰＣＲを介する相同組換え(Guldener et al.,1996)により、選択した必須遺伝子の天然プロモーターと交換する。ＰＣＲを介する相同組換えは、例えば二倍体Ｓ.セレビシエ系統ＣＥＮ.ＰＫ２において行うことができる。遺伝的分離は四分子分析により確認できる。四分子分析では、４つの生存力のある子嚢胞子が得られ、２つの半数性分離体では選択された必須遺伝子は天然プロモーターの制御下にあり、他の２つの分離体では調節可能なプロモーターの制御下にある。後者の半数性分離体を、発現ベクターに存在するｃＤＮＡでの形質転換に使用する。２．染色体外の変法では、発現ベクターに存在するｃＤＮＡを含有する、選択されたＳ．セレビシエの必須遺伝子をまず好適な発現ベクター、例えば大腸菌／Ｓ．セレビシエシャトルベクター中の調節可能なＳ．セレビシエプロモーターの下流に挿入する。例えばこの目的のため、Ｓ．セレビシエゲノムＤＮＡに対して行うＰＣＲにより、この必須遺伝子をＡＴＧ開始コドンから終結配列まで、およびそれを含んで増幅することができる。このために使用するプライマーは、それらが好適な制限酵素の認識部位を含むように構築することができ、この部位は次いで発現ベクターの調節可能なプロモーターの下流への挿入を助長する。この組換え発現ベクターは次いで、調節可能なプロモーターの制御下にプラスミドによりコードされる、選択されたＳ．セレビシエ必須遺伝子のコピーを含有し、対応する変異型対立遺伝子をトランス相補するのに使用する。対応する変異型対立遺伝子は、相同組換えにより作製し、表６（表６の第１列）に挙げた異型接合性二倍体変異系統から選択することができる。選択されたＳ．セレビシエ必須遺伝子を含有する発現ベクターは、選択されたＳ．セレビシエ必須遺伝子の代わりに選択マーカーの遺伝子を保持する、対応する異型接合性二倍体変異系統中へ形質転換する。形質転換体は、使用する発現ベクターに存在する栄養要求性または核塩基マーカーに関して選択することにより単離する。得られた形質転換異型接合性二倍体変異系統を四分子分析に付す。この分析により４つの生存力のある分離体が得られる。対応する変異型対立遺伝子のマーカーおよび発現ベクターをさかのぼって調べることにより、必須遺伝子のゲノムコピーが除去された分離体から形質転換した野生型分離体を識別することができる。選択された必須遺伝子のゲノムコピーが除去された分離体を、トランス相補型半数体変異系統と呼ぶ。それらを発現ベクターに存在し、調べようとする真菌種に由来するｃＤＮＡでの形質転換に使用する。特に、必須遺伝子の１つをマーカー遺伝子で置換した異型接合性二倍体サッカロミセス・セレビシエ細胞を、調節可能なプロモーターの制御下にサッカロミセス・セレビシエ必須遺伝子のコーディング部分を含む組換え発現ベクターで形質転換する。例えば、異型接合性二倍体サッカロミセス・セレビシエ細胞において、必須遺伝子を栄養要求性マーカーをコードする遺伝子か、または耐性遺伝子で置換する。本方法では、ＣＥＮ．ＰＫ２系統のサッカロミセス・セレビシエ細胞を用いることが好ましい。この系統を用いて、そのゲノムにおいて必須遺伝子の天然プロモーターを調節可能なプロモーターで置換したサッカロミセス・セレビシエ細胞、または染色体外で必須遺伝子の天然プロモーターを調節可能なプロモーターで置換したかかる細胞を作出することもまた好ましい。本発明は、他の真菌類において機能的に類似の遺伝子および／または機能的に類似のタンパク質を同定する、特にカンジダ・アルビカンス(Candida albicans) およびアスパルギルス・フミガタス(Aspargillus fumigatus)において機能的に類似の遺伝子を同定する方法での、ＣＥＮ．ＥＮ２７、ＣＥＮ．ＥＮ２８、ＣＥＮ．ＥＮ８、ＣＥＮ．ＲＯ２３、ＣＥＮ．ＲＯ３０、ＣＥＮ．ＲＯ６、ＣＥＮ．ＲＯ８、ＣＥＮ．ＳＲ１４、ＣＥＮ．ＳＲ１５、ＣＥＮ．ＳＲ２、ＣＥＮ．ＳＲ２６、ＣＥＮ．ＳＲ４１、ＣＥＮ．ＳＲ５５、ＣＥＮ．ＳＲ６６、ＣＥＮ．ＳＲ８０、ＣＥＮ．ＳＲ８１、ＣＥＮ．ＨＥ１、ＣＥＮ．ＨＥ１７、ＣＥＮ．ＨＥ１８、ＣＥＮ．ＨＥ２、ＣＥＮ．ＨＥ４、ＣＥＮ．ＨＥ９、ＣＥＮ．ＨＩ１０、ＣＥＮ．ＨＩ２３、ＣＥＮ．ＨＩ２８、ＣＥＮ．ＨＩ３１、ＣＥＮ．ＨＩ５、ＣＥＮ．ＨＩ７、ＣＥＮ．ＦＥ８、ＣＥＮ．ＫＲ２８、ＣＥＮ．ＴＳ０２、ＣＥＮ．ＴＳ０４およびＣＥＮ.ＺＩ２６系統のサッカロミセス・セレビシエ細胞の使用に関する。さらに本発明は、機能的に類似のヒト、動物もしくは植物遺伝子、またはそれらの遺伝子がコードするタンパク質を同定するための（あるいは機能的に類似のヒト、動物もしくは植物遺伝子、またはそれらの遺伝子がコードするタンパク質がいったい存在するかどうかを調べるための）サッカロミセス・セレビシエ細胞の使用に関する。使用できる調節可能なプロモーターは活性化可能なプロモーターおよび／または活性化できないプロモーター、または抑制可能なプロモーターである。これらのプロモーターは自然におよび／または人工的に配列したプロモーター配列からなってよい。使用できる調節可能なプロモーターの例としては、ＧＡＬ１遺伝子のプロモーターおよび対応するプロモーター誘導体、例えば様々なＵＡＳ(上流活性化配列) エレメントが除去されたプロモーター誘導体がある(GALS,GALL;Mumberg,J.et al .,(1994)Nucleic Acids Research 22:5767-5768)。使用できる他の調節可能なプロモーターとしては、ＦＢＰ１、ＰＣＫ１およびＩＣＬ１などの糖新生遺伝子のプロモーター、またはその一部分、例えばそれらのアクチベーター（ＵＡＳ１もしくはＵＡＳ２）またはリプレッサー（ＵＲＳ、上流リプレッション配列）配列 (Niederacher et al.(1992)Curr.Genet.22:363-370;Proft et al.(1995)Mol.Gen .Genet.246:367-373;Schuller et al.,(1992)EMBO J.11:107-114;Guarente et a l.,(1984)Cell 36:503-511)がある。本方法は、このようにして改変した(すなわち調節可能なプロモーターを含む) Ｓ．セレビシエを、調節可能なプロモーターが活性となり、その結果Ｓ．セレビシエ必須遺伝子が発現する増殖条件下で増殖させることを含む。次いでこのＳ．セレビシエ細胞を調べようとする真菌種のｃＤＮＡを含む典型量の組換え発現ベクターで形質転換する。その後さらにこの形質転換体は、そのｃＤＮＡが組換え発現ベクターに存在するタンパク質を発現する。本方法は、増殖条件を、その制御下で選択されたＳ．セレビシエ必須遺伝子が発現する調節可能なプロモーターのスイッチが切られるよう変更することを含む。例えば、増殖条件は培地を変更することにより改変できる。例えば、ＧＡＬ１プロモーター、またはこのプロモーターの誘導体を使用するのであれば、ガラクトースを含有する培地(誘導状態)からグルコースを含有する培地(抑制状態)へ変更できる。このように変更された条件は、組換え発現ベクターが他の真菌種の機能的に類似の遺伝子のｃＤＮＡを持たない（すなわち、その必須遺伝子の機能が機能的に類似の遺伝子で補うことができない）Ｓ．セレビシエ細胞に対しては致死的である。これに対し、他の真菌種の機能的に類似の遺伝子が発現するＳ．セレビシエ細胞は、機能的に類似の遺伝子がコードするタンパク質で致死的な代謝欠陥を補うことができるため、これらの細胞は生存できる。本方法は、公知の方法(Strathern，J.N．and Higgins，D.R.(1991)Recovery o f Plasmids from Yeast into Escherichia coli:Shuttle Vectors in:Guthrie,C .and Fink,G.R.Methods in Enzymology.Volume 194.Guide to yeast genetics a nd molecular biology.Academic Press,San Diego,319-329)を用いる生存している形質転換細胞から発現ベクター（プラスミド）を単離し、次いでＤＮＡ解析法を用い、例えばＤＮＡ配列決定法(Sanger et al.,(1977)Proc.Natl Acad.Sci.US A 74;5463-5467)によりｃＤＮＡを解析することを含む。本方法は、Ｓ．セレビシエ遺伝子を、他の真菌種における機能的に類似のかつ／または一連の相同遺伝子、特にヒト、動物および植物に対して病原性のある機能的に類似のかつ／または一連の相同な真菌類の遺伝子の同定に使用することを含む。例えばこの目的に、藻菌綱または真菌綱、特に担子菌亜綱および子嚢菌亜綱の菌類、特にヘミアスコミケタレス(Hemiascomycetales)(酵母)およびプレクタスカレス(Plectascales)(カビ)およびギムナスカレス(Gymnascales)(皮膚および毛髪菌類)、または線菌鋼、特にコニジオスポラレス(Conidiosporales)(皮膚菌)亜鋼およびタロスポラレス(Thallosporales)(出芽菌)亜鋼の菌類を使用することができ、特にムコール(Mucor)、リゾプス(Rhizopus)、コッキジオイデス(Co ccidioides)、パラコッキジオイデス(Paracoccidioides)(ブラシリエンシス(bra siliensis))(ブラソミケス・ブラシリエンシス(Blasomyces brasiliensis))、エンドミケス(Endomyces)(ブラソミケス(Blastomyces))、アスペルギルス(Asper gillus)、ペニシリウム(Penicillium)(スコプラリオプシス(Scopulariopsis))トリコフィトン(Trichophyton)(クテノミケス(Ctenomyces))、エピデルモフィトン (Epidermophyton)、ミクロスポロン(Microsporon)、ピエドライア(Piedraia)、ホルモデンドロン(Hormodendron)、フィアロフォラ(Phialophora)、スポロトリコン(Sporotrichon)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、カンジダ(Camdida)、ケオトリクム(Geotrichum)およびトリコスポロン(Trichosporon)属が使用される。特に、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)、コッキジオイデス・イミチス(Coccidioides imm itis)、クリプトコッカス・ネオホルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラタム(Histoplasma capsulatum)、ブラソミケス・デルマチチジス(Blasomyces dermatitidis)、パラコッキジオイデス・ブラシリエンス (Paracoccidioides brasiliens)およびスポロスリックス・スケンキー(Sporoth rix schenckii)の使用が強調される。本方法は、サッカロミセス・セレビシエ由来の必須遺伝子および他の真菌類由来の機能的に類似の遺伝子を使用して、これらのＳ．セレビシエ必須遺伝子もしくは機能的に類似の遺伝子の機能的発現、および／またはコードされているタンパク質の機能的活性を完全にまたは部分的に阻害することができる物質を同定することを含む。好ましくは、他の真菌類の機能的に類似の遺伝子またはこれらの遺伝子によりコードされているタンパク質もまた必須である。本方法は、例えば医薬を製造するため、真菌類の増殖を阻害し、さらに抗菌剤として使用できる物質を同定するのに使用できる。本方法の特有の特徴は、サッカロミセス・セレビシエ由来の必須遺伝子または他の真菌類由来の機能的に類似の遺伝子、特に他の真菌種に必須である遺伝子を、物質をスクリーニングするための標的として使用するということである。本方法は、Ｓ．セレビシエ由来の必須遺伝子および他の真菌類由来の機能的に類似の、かつ／または一連の相同性を有するＳ．セレビシエ必須遺伝子を標的として使用可能であることを含む。本方法の１つの具体例は、細胞、特に標的として使用する必須遺伝子を過剰発現する真菌細胞を作出し、次いでこれらの細胞を試験物質とともにインキュベートすることである。このように、この物質の増殖阻害作用は必須標的遺伝子に関して決定可能である。また本方法で調べる個々の遺伝子は、標的遺伝子または調べようとする遺伝子ともいう。標的遺伝子は、Ｓ．セレビシエ必須遺伝子、特に遺伝子ＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗもしくはＹＬＬ００３ｗの１つ、または別の真菌種由来の機能的に類似の遺伝子であってよい。本方法では、標的遺伝子を過剰発現する細胞に対する物質の増殖阻害作用が決定される。これに関連して、その物質は必須遺伝子または機能的に類似の遺伝子の発現の阻害か、かつ／またはコードされているタンパク質の機能的活性の阻害のいずれかが可能である。もう１つの具体例は、細胞、特に異なる程度で標的遺伝子を発現する真菌細胞を作出し、次いでこれらの細胞を試験物質とともにインキュベートし、この物質の細胞に対する増殖阻害作用を比較により決定することである。本方法は、２以上の細胞、特にそれらが異なる程度で標的遺伝子を発現するという事実により互いに異なる真菌細胞またはそれらに由来する系統の使用を含む。例えば、２、３、４、５、１０もしくはそれ以上の細胞またはそれらに対応する系統は、所定の濃度で使用される物質の増殖阻害作用に関しては比較により分析できる。かかる濃度系により、例えば抗真菌活性物質を細胞傷害性または不活性物質から識別できる。本方法の特殊な１つの具体例は、スクリーニングに半数体真菌細胞／系統を使用することであり；この目的のために、特に半数体Ｓ．セレビシエ細胞／系統を使用することができる。本方法は、標的として選択される必須遺伝子を、好適な発現ベクターへの組込むことを含む。大腸菌／Ｓ．セレビシエシャトルベクターは、好適な発現ベクターの例である。特に細胞当りのコピー数の異なるベクターが使用できる。例えば、一方では形質転換Ｓ．セレビシエ細胞にできる限り大きなコピー数で存在するベクターが、他方では小さなコピー数で存在するベクターが使用できる。１つの具体例では、Ｓ．セレビシエゲノムへ標的遺伝子を組込むことを可能にする発現ベクターを使用する。好適な発現ベクターの例としては、ベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、ｐＲＳ４２６、ｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５、ｐＲＳ３１６、ｐＲＳ３０３、ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６がある(S ikorski and Hieter,1989;Christianson,et al.,1992)。ｐＲＳ４２３−ｐＲＳ４２６系のベクターは大きなコピー数（約５０〜１００コピー／細胞）で存在している。これに対し、ｐＲＳ３１３−ｐＲＳ３１６系のベクターは小さなコピー数（約１〜２コピー／細胞）で存在している。これら２種の系に由来するベクターを使用すれば、標的遺伝子は染色体外コピーとして存在する。このｐＲＳ３０３−ｐＲＳ３０６系のベクターを使用して、標的遺伝子をゲノムへ組込むことができる。Ｓ．セレビシエ細胞に存在するコピー数に関してのみ異なる、これら３種の異なるタイプの発現ベクターを使用することにより、それぞれＳ．セレビシエ必須遺伝子または機能的に類似の遺伝子の発現の識別または等級付けを達成することができる。本方法は、例えば、ベクターのコピー数／細胞が異なる種々の発現ベクターで形質転換した細胞（例えば、真菌細胞）／系統に関する物質の増殖阻害作用を比較により決定することを含む。かかる細胞は必須標的遺伝子を異なる程度で発現でき、物質に対して段階的な反応を示す。本方法はまた、発現ベクター内の特に選択されたプロモーターおよびターミネーター、例えば、Ｓ．セレビシエプロモーターおよびターミネーターの間に挿入されている標的遺伝子により、種々の細胞、特に真菌細胞(制御された過剰発現) 中の標的遺伝子の発現レベルの変更を達成することを含む。この目的のためには例えば、様々なレベルではあるが構成的に発現するＳ．セレビシエ遺伝子のプロモーターが好適である。かかるプロモーターの例としては、Ｓ．セレビシエ遺伝子ＭＥＴ２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３およびＴＲＰ１の天然のプロモーター、またこれらのプロモーターの適当な誘導体、例えば、あるアクチベーター配列および／またはリプレッサー配列を含まないプロモーター誘導体がある。また調節可能なプロモーターは、標的遺伝子の過剰発現の制御を達成するにも好適である。例えば、ＧＡＬ１遺伝子の天然プロモーターまたはこのプロモーターの適当な誘導体、例えば、種々のＵＡＳエレメントが除去された誘導体(GALS, GALL;Mumberg et al.,（1994）Nucleic Acids Research 22:5767-5768)、また糖新生遺伝子のプロモーター、例えばプロモーターＦＢＰ１、ＰＣＫ１およびＩＣＬ１、またはこれらプロモーターの一部、例えば適当な活性化できない、または抑制試験プロモーターのアクチベーター（ＵＡＳ１またはＵＡＳ２）またはリプレッサー（ＵＲＳ）配列(Schuller et al.,(1992)EMBO J.11:107-114;Guarente et al.,(1984)Cell 36:503-511;Niederacher et al.(1992)Curr.Genet.22:363-3 70;Proft et al.(1995)Mol.Gen.Genet.246:367-373))を使用できる。発現ベクターのターミネーターは、例えば、Ｓ.セレビシエ遺伝子ＭＥＴ２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩおよびＵＲＡ３のターミネーター配列であってもよい。本方法は、一連の発現ベクターを作出可能であることを含み、その総てが、適当であれば種々の強度のプロモーターおよび／または種々の方法で調節されるプロモーターを用い、適切に選択した種の発現ベクターを使用すること、および／または好適な発現ベクターを作出することにより、それらが標的遺伝子を異なる程度で（様々なレベルで）発現するという点で互いに異なってはいるが、同一の標的遺伝子を含む。かかる一連の発現ベクターを使用すると、その長さで細かく等級付けされる標的遺伝子の発現が達成できる。かかる一連の発現ベクターを使用して、標的遺伝子を異なる程度で発現する真菌細胞／真菌系統を作出できる。本方法は、発現ベクターを半数体野生型Ｓ．セレビシエ細胞へ形質転換することを含む。得られた細胞／系統を液体培地で増殖させ、種々の濃度の調べようとする物質とともにインキュベートし、標的遺伝子を異なる程度で発現する細胞／系統の増殖挙動に対するこの物質の作用を比較により分析する。本方法はまた、参照として、いずれの標的遺伝子も含まない適切な発現ベクター種で形質転換した半数体Ｓ．セレビシエ細胞／系統を使用することも含む。本方法は、これらの条件下、発現強度は特定の培地の選択により著しく影響を受け得るので、調節可能なプロモーターを使用する場合、特にＧＡＬ１プロモーターおよびその誘導体（ＧＡＬＳおよびＧＡＬＬ）を使用する場合、種々の培地で物質をスクリーニング可能であることを含む。例えば、ＧＡＬ１プロモーターの発現強度は下記のように低下する：２％ガラクトース＞１％ガラクトース＋１％グルコース＞２％グリセロール＞２％グルコース。Ｓ．セレビシエ野生型細胞の増殖を阻害する物質の増殖阻害作用は、Ｓ．セレビシエ必須遺伝子または別の真菌種由来の機能的に類似の遺伝子の過剰発現により、完全にまたは部分的に無効にすることができる。本方法はまた、ヒト、動物または植物において、Ｓ．セレビシエ遺必須伝子の機能的に類似のかつ／または一連の相同性を有する対応物を同定することを含む。同様に、対応するヒト、動物または植物遺伝子を本方法で標的遺伝子として使用して、抗真菌活性物質がこれらの標的遺伝子にも作用するかどうかを確認することもできる。このように真菌類（または特定の真菌種）の増殖を特異的に阻害する物質を同定することが可能であるので、これは本方法の特に有利な点である。特異的な抗真菌活性物質は、対応する、機能的に類似のかつ／または一連の相同性を有するヒト、動物もしくは植物遺伝子、またはこれらの遺伝子がコードするタンパク質に、比較的作用が低いか、あるいは全く作用しないかのいずれかであるはずである。本方法はまた、対応する必須真菌遺伝子に機能的に類似のかつ／または一連の相同性を有するヒト、動物または植物遺伝子がいったい存在するのかどうかを確認できることを含む。これは、同定された真菌の必須遺伝子、またはこれらの遺伝子の一部の、例えばデータベースで入手可能なヒト、動物または植物配列／遺伝子との相同性を確認することにより行うことができる。このように予め、研究の性質によって同定された真菌必須遺伝子からの選択が可能であり、これに関して、例えば、一連の相同性を有する、かつ／または機能的に類似の遺伝子はヒトには存在しない。このように、本方法は例えば、次いでヒトの身体に損なわない抗真菌活性物質を特に同定する多くの可能性を提供する。例えば、免疫系が損なわれる真菌症の治療または予防用医薬を製造するために使用できる物質を同定することが可能である。例えばこれらの物質は、例えばＨＩＶ感染すなわちエイズ、または糖尿病などの疾患の経過で起こる真菌感染症の治療に使用する医薬を製造するために使用できる。本方法はまた、殺真菌剤を製造するために、特にヒトおよび動物に無害な殺真菌剤を製造するために使用できる物質の同定に用いることができる。本方法はまた、例えば、食料品およびボディケア物質を保存するために使用できる特異的な抗真菌活性物質の同定にも使用できる。さらに本方法はまた、第１工程で、機能的に類似の遺伝子が別の真菌種にいったい存在するかどうかを確認する工程を使用することが可能であるため、極めて特異的な方法で特定の真菌種の増殖だけを阻害する抗真菌活性物質を同定する可能性も提供する。他方、本方法はまた、第１工程で、Ｓ．セレビシエにおいて必須である遺伝子と機能的に類似の遺伝子が可能な限り多くの他の真菌種(例えば、ヒトに対して病原性のある真菌種)に存在するかどうかを立証する工程を使用することができるので、多数の真菌種（広いスペクトルの抗真菌物質）に対して同時に活性がある物質を同定するのに使用することができる。このスクリーニング法の特に有利な点は、使用する遺伝子が必須であることが十分に知られていることであり、すなわち必須遺伝子の機能、またはコードされているタンパク質の機能についてのさらなる情報は必要ではない。これらの遺伝子の多くのＤＮＡ配列は入手できないため、これは、他の真菌種の機能的に類似の遺伝子を同定するためのＳ.セレビシエの必須遺伝子の使用に特に有利である。下記は本方法の特に有利な点である：Ｓ．セレビシエ必須遺伝子の生化学的機能についてのいずれの知識も必要ではない。その配列が総てまたは部分的に知られているあらゆる遺伝子を試験し、それらが必須であるかどうかを決定することができる。Ｓ．セレビシエ必須遺伝子を使用して、他の真菌種由来の機能的に類似の遺伝子を同定することができ、ここで再びこれらの遺伝子の生化学的機能について知られている必要は全くなく。これに加え、他の真菌種由来の機能的に類似の可能性のある遺伝子の配列が知られている必要はない。それは同定される機能的に類似のｃＤＮＡまたは解明される遺伝子の配列だけである。抗真菌活性物質を発見する方法において、その物質が必須または機能的に類似の遺伝子の機能的発現を阻害するかどうか、またはそれがコードされているタンパク質の機能的活性を阻害するかどうかについては区別がない。同時に、物質の作用を機能的に類似のヒト、動物および植物遺伝子またはコードされているタンパク質対して試験することもできるし、あるいは機能的に類似のまたは一連の相同性を有する遺伝子がいったい存在するのかどうかについて確認することもできる。このように個々の物質をそれらの特異的活性について効率的に試験することができる。実施例：実施例１：ＹＪＲ１４１ｗについて記載した(表６)欠失カセットを作出する「従来法」Ｓ．セレビシエＨＩＳ３遺伝子を用いるＳ．セレビシエＯＲＦＹＪＲ１４１ｗ遺伝子の欠失：１）１．７ｋｂのＸｂａＩ断片（Ｓ．セレビシエのケノムＤＮＡまたはＹＪＲ１４１ｗ遺伝子を含む、相当するコスミドクローンのいずれかから得た）を制限酵素ＸｂａＩで線状化したｐｕＣ１８ベクターにクローン化した。２）次いで、１）で得たプラスミドを制限酵素ＢｓｔＥIIで切断し、ＤＮＡの突出末端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ酵素(Sambrook et al.,1989)で埋めた後、得られた直鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩで切断した。これにより３．５２ｋｂ（キロ塩基対）のサイズのＤＮＡ断片と０．８７ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を得た。３）Ｓ．セレビシエＨＩＳ３遺伝子をゲノムの１．６ｋｂＢａｍＨＩ断片として、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ＋ベクター（ stratagene製）に挿入し、これによりプラスミドｐＭＲ２４０を作出した。４）次いで、プラスミドｐＭＲ２４０を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、さらにＤＮＡの突出末端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いて埋めた。この直鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩで切断した。これによりＳ．セレビシエＨＩＳ３遺伝子を含む１．３６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。５）２）で得た３．５２ｋｂのＤＮＡ断片を４）で得た１．３６ｋｂのＤＮＡ断片に連結し、これによりプラスミドｐＲＯ６を作出した。ＹＪＲ１４１ｗのコーディング領域の８７０ＢｐＤＮＡセグメントを、プラスミドｐＲＯ６から欠失させ、ＨＩＳ３選択マーカーで置換した。６）プラスミドｐＲＯ６を制限エンドヌクレアーゼＰｖｕIIで線状化し、Ｓ．セレビシエを形質転換するのに用いた。実施例２：ＳＦＨ法のためのプラスミドの構築１）ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）IIＫＳ＋（stratagene；配列入手先：Genebank（登録商標）Ｘ５２３２７）を開始ベクターとして用いた。２）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）IIＫＳ＋ベクターを制限酵素ＮｏｔＩで線状化し、次いで緑豆５’−３’エキソヌクレアーゼとともにインキュベートすることにより突出末端を取り除いた。ベクターｐＫＳ＋ΔＮｏｔＩ（ＮｏｔＩ制限切断部位を持たないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商標)IIＫＳベクター）を末端切断型ＤＮＡ断片を再連結することにより作製した。３）プラスミドｐＫＳ＋ΔＮｏｔＩを制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、プライマー対ＰＫ３／ＰＫ４から作出したＤＮＡオリゴヌクレオチドを開環プラスミドに連結した。このようにして作出したプラスミドｐＫＳ＋ｎｅｗ( 配列番号１７)はＰＳｔＩとＢａｍＨＩ制限切断部位の間に新しい制限切断部位ＮｏｔＩ、ＳｔｕＩ、ＳｆｉＩおよびＮｃｏＩを含んでいる。：ｐｓｔＩ−ＮｏｔＩ−ＳｔｕＩ−ＳｆｉＩ−ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ４）プラスミドｐＫＳ＋ｎｅｗ(配列番号１７)をプラスミドｐＰＫ５／６(配列番号１８)、ｐＰＫ７／８(配列番号１９)、ｐＰＫ９／１０（配列番号２０）およびｐＰＫ１３／１４（配列番号２１）を作製するための開始ベクターとして用いた。適当なアミノ酸／核塩基／栄養要求性マーカーの遺伝子を、好適なプライマーを用いるＰＣＲにより、野生型または改変野生型遺伝子から増幅した(実施例４および実施例５)。実施例３：プラスミドｐＰＫ５／６（ｐＫＳ＋ｎｅｗ−ＨＩＳ３）(配列番号１８)の構築：ＨＩＳ３遺伝子をプライマーＰＫ５およびＰＫ６を用いたＰＣＲにより、Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡから増幅させ、次いで制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＫＳ＋ｎｅｗに挿入した。下線を引いたプライマーのＤＮＡセグメントはＳ．セレビシエ遺伝子の各相同配列に相当するセグメントに対応する。実施例４：プラスミドｐＫ７／８（ｐＫＳ＋ｎｅｗ−ＬＥＵ２）(配列番号１９) の構築：Ｓ．セレビシエＬＥＵ２遺伝子をプライマーＰＫ７およびＰＫ８を用いて、ＰＣＲにより鋳型（改変野生型遺伝子）として機能するＹｃｐｌａｃ１１１ベクターＤＮＡ(Gietz,R.D.and Sugino,A.(1988)Gene 74:527-534)から増幅し、次いで、増幅したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＫＳ＋ｎｅｗに挿入した。実施例５：プラスミドｐＰＫ９／１０（ｐＫＳ＋ｎｅｗ−ＵＲＡ３）(配列番号２０)の構築：Ｓ．セレビシエＵＲＡ３遺伝子をプライマーＰＫ９およびＰＫ１０を用いて、ＰＣＲにより鋳型（改変野生型遺伝子）として機能するＹｃｐｌａｃ３３ベクターＤＮＡ(Gietz,R.D.and Sugino,A.(1988)Gene 74:527-534)から増幅し、次いで、増幅したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＫＳ＋ｎｅｗに挿入した。実施例６：プラスミドｐＰＫ１３／１４（ｐＫＳ＋ｎｅｗ−ＴＲＰ１）(配列番号２１)の構築：ＴＲＰ１遺伝子をプライマーＰＫ１３およびＰＫ１４を用いて、ＰＣＲによりＳ．セレビシエケノムＤＮＡから増幅し、次いで、増幅したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断し、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＫＳ＋ｎｅｗに挿入した。実施例７：ＹＧＲ０４６ｗについて記載したＰＣＲ技術を用いる「従来法」(「改良型従来法」) １）ＹＧＲ０４６ｗの３’領域をプライマーＸＳＬ−２Ｎ２およびＧ３８５− １（項目４参照）を用いて、鋳型として機能するＳ．セレビシエのゲノムＤＮＡから増幅した。次いで、増幅したＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、得られた５０８ＢｐのＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＰＫ９／１０に連結した。得られたプラスミドをｐ１１９−５８とした。２）ＹＧＲ０４６ｗの５’領域をプライマーＧ３８５−３およびＸ９Ｒ２（項目４参照）を用いて、鋳型として機能するＳ．セレビシエのゲノムＤＮＡから増幅した。次いで、増幅したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、得られた１３３６Ｂｐの断片を、予めＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐ１１９−５８に挿入した。得られたプラスミドをｐＥＮ２７とした。３）プラスミドｐＥＮ２７を制限酵素ＳａｃＩおよびＡｓｐ７１８で線状化した後、Ｓ．セレビシエを形質転換するのに用いた。４）使用したプライマー：実施例８：Ｓ．セレビシエ系統ＣＥＮ．ＰＫ２細胞を公知の方法に従って、各場合において約５μｇの直鎖欠失カセットＤＮＡ(Gietz et al.,1992;Guldener et al.,199 6)で形質転換した。この形質転換混合物を適当な選択培地上で平板培養した。カナマイシン耐性遺伝子を含有する欠失カセットを用いた場合には、形質転換細胞をゲンチシン（Ｇ４１８(登録商標)）を含有する完全培地（ＹＥＰＤ）上で平板培養した。いわゆる栄養要求性マーカーを含有する欠失カセットを用いた場合には、形質転換細胞を適当なアミノ酸（ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン）または核塩基（ウラシル）を含まない合成最小培地（ＳＣＤ）上で平板培養した。これにより変更した条件下で増殖できるのは相同組換えが起こった形質転換体だけであるので、これらの細胞を選択した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者トーマス、ムンダードイツ連邦共和国イェーナ、エンゲルプラッツ、３ (72)発明者チルマー、シュースタードイツ連邦共和国ベルネック、アイヒェンウェーク、40 (72)発明者ホルスト、フェルトマンドイツ連邦共和国ミュンヘンパージンガー、ホイウェーク、86 (72)発明者ビルフリート、クラーマードイツ連邦共和国ゲッティンゲン、シュトラーセ、アン、デル、ザンクト、ビンツェンツ、キルヒェ、10 (72)発明者フリートリッヒ、カール、ツィマーマンドイツ連邦共和国オーベル―ラムシュタット、ゲーテシュトラーセ、12 (72)発明者カール−ディーター、エンツィアンドイツ連邦共和国オーベルウルゼル、オーベルウルゼラー、シュトラーセ、43 (72)発明者マチアス、ローゼドイツ連邦共和国ノイ―アンシュパッハ、テオドール―ホイス―シュトラーセ、４ (72)発明者ペーター、ケッタードイツ連邦共和国オーベルウルゼル、インドゥストリーシュトラーセ、３アー

Claims

【特許請求の範囲】１．抗真菌活性物質を発見する方法であって、ａ）サッカロミセス・セレビシエの必須タンパク質の発現を制御し、かつ／またはサッカロミセス・セレビシエの必須タンパク質もしくはその一部をコードする核酸、またはコードされている必須タンパク質自身、あるいはｂ）別の真菌種に由来し、かつａ）に記載のタンパク質と機能的に類似であるタンパク質の発現を制御し、かつ／もしくは別の真菌種に由来し、かつａ）に記載のタンパク質と機能的に類似のタンパク質をコードする別の核酸、またはコードされている機能的に類似のタンパク質自身を標的として用い、次いでａ）サッカロミセス・セレビシエの必須タンパク質の発現またはコードされている必須タンパク質自身の機能的活性に対する調べようとする物質の効果、またはｂ）別の真菌種に由来する機能的に類似のタンパク質自身の発現、もしくはコードされている機能的に類似のタンパク質の機能的活性に対する調べようとする物質の効果を決定することを含んでなる方法。２．核酸が必須遺伝子である、請求項１記載の方法。３．遺伝子が、遺伝子ＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲＩ０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗの群より選択される、請求項１および２いずれか１項に記載の方法。４．他の核酸が、遺伝子ＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲＩ００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗのうちの１つと機能的に類似である、別の真菌種由来の遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．核酸が必須遺伝子のプロモーターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。６．プロモーターが、遺伝子ＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗのプロモーターシリーズから選択される、請求項５記載の方法。７．必須タンパク質が、ＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗから選択される遺伝子の１つによってコードされている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．別の真菌種由来のタンパク質が、ＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、Ｙ０Ｒ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗから選択される遺伝子の１つによってコードされている必須タンパク質と機能的に類似である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。９．他の真菌種が担子菌類、子嚢菌類、およびヒホミケス類から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。１０．他の真菌種が、ヘミアスコミケタレス(Hemiascomycetales)(酵母菌) 、プレクタスカレス(Plectascales)(カビ)、ギムナスカレス(Gymnascales)(皮膚および毛髪真菌)、コニジオスポラレス(Conidiosporales)(皮膚真菌)、タロスポラレス(Thallosporales)(出芽真菌)、ムコール(Mucor)、リゾプス(Rhizopus)、コッキジオイデス(Coccidioides)、パラコッキジオイデス(Paracoccidioides)( ブラシリエンシス(brasiliensis))(ブラソミケス・ブラシリエンシス(Blasomyce s brasiliensis))、エンドミケス(Endomyces)(ブラストミケス(Blastomyces)) 、アスペルギルス (Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)(スコプラリオプシス(Scopulariops is))、トリコフィトン(Trichophyton)(クテノミケス(Ctenomyces))、エピデルモフィトン(Epidermophyton)、ミクロスポロン(Microsporon)、ピエドライア(Pied raia)、ホルモデンドロン(Hormodendron)、フィアロフォラ(Phialophora)、スポロトリコン(Sporotrichon)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、カンジダ(Candi da)、ゲオトリクム(Geotrichum)およびトリコスポロン(Trichosporon)から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。１１．他の真菌種が、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)、コッキジオイデス・イミチス( Coccidioides immitis)、クリプトコッカス・ネオホルマンス(Cryptococcus neo formans)、ヒストプラズマ・カプスラータム(Histoplasma capsulatum)、ブラソミケス・デルマチチジス(Blasomyces dermatitidis)、パラコッキジオイデス・ブラシリエンス(Paracoccidioides brasiliens)およびスポロスリックス・スケンキー(Sporothrix schenckii)から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。１２．サッカロミセス・セレビシエ必須遺伝子または他の真菌種由来の機能的に類似の遺伝子を過剰発現する細胞を作出し、この細胞を調べようとする物質とともにインキュベートし、次いでこの物質の増殖抑制作用を測定する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。１３．サッカロミセス・セレビシエ必須遺伝子または別の真菌種由来の機能的に類似の遺伝子を種々の程度で発現する少なくとも２種の細胞を作出し、これらの細胞を調べようとする物質とともにインキュベートし、次いでこの物質の増殖抑制作用を比較する事によって決定する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。１４．細胞がＣＥＮ．ＰＫ２系統のサッカロミセス・セレビシエ細胞またはこの系統の誘導体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。１５．細胞が半数体サッカロミセス・セレビシエ細胞である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。１６．別の真菌種における機能的に類似の遺伝子を、ａ）サッカロミセス・セレビシエ必須遺伝子が調節可能なプロモーターの制御下に置かれているサッカロミセス・セレビシエ細胞を作出し、ｂ）このようにして改変したサッカロミセス・セレビシエ細胞を調節可能なプロモーターが活性化する増殖条件下で増殖させ、ｃ）この改変サッカロミセス・セレビシエ細胞を、他の真菌種から調製し、発現ベクターに存在するｃＤＮＡで形質転換し、ｄ）他の真菌種において機能的に類似のタンパク質をコードするｃＤＮＡを発現するサッカロミセス・セレビシエ細胞しか生存できないように培養条件を変更することにより、この調節可能なプロモーターのスイッチを切り、次いでｅ）適当であれば、、サッカロミセス・セレビシエ必須遺伝子と機能的に類似の他の真菌種の遺伝子に相当するｃＤＮＡを単離、分析することにより同定する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。１７．サッカロミセス・セレビシエ必須遺伝子が、遺伝子ＹＧＲ０４６ｗ、ＹＧＲ０４８ｗ、ＹＧＲ０６０ｗ、ＹＪＬ０７４ｃ、ＹＪＲ１３６ｃ、ＹＪＲ１４１ｗ、ＹＢＲ１６７ｃ、ＹＰＬ２５２ｃ、ＹＰＬ２４２ｃ、ＹＯＲ１１９ｃ、ＹＰＬ２３５ｗ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ１８２ｃ、ＹＯＲ２０６ｗ、ＹＪＬ０５４ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＮＬ２５８ｃ、ＹＮＬ２４５ｃ、ＹＮＬ０３８ｗ、ＹＮＬ２５１ｃ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＮＬ２６０ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ、ＹＬＲ０８６ｗ、ＹＬＲ０７６ｃ、ＹＬＲ１００ｗ、ＹＩＲ０１０ｗ、ＹＩＬ００３ｗ、ＹＢＲ１０２ｃ、ＹＯＬ０１０ｗ、ＹＫＬ０１３ｃ、ＹＫＬ０１８ｗ、およびＹＬＬ００３ｗの群より選択される、請求項１６記載の方法。１８．サッカロミセス・セレビシエ細胞がＣＥＮ.ＰＫ２系統の細胞である、請求項１６および１７のいずれか１項に記載の方法。１９．そのゲノム内で必須遺伝子の天然プロモーターが調節可能なプロモーターで置換されているサッカロミセス・セレビシエ細胞を作出する、請求項１６〜１８のいずれか１頃に記載の方法。２０．必須遺伝子の１つがマーカー遺伝子で置換されているサッカロミセス・セレビシエ細胞を、調節可能なプロモーターの制御下にサッカロミセス・セレビシエ必須遺伝子のコーディング部分を含む組換え発現ベクターで形質転換する、請求項１９記載の方法。２１．サッカロミセス・セレビシエが異型接合性二倍体である、請求項１９および２０のいずれか１項に記載の方法。２２．異型接合性二倍体サッカロミセス・セレビシエ細胞において、必須遺伝子が栄養要求性マーカーをコードする遺伝子で置換されている、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。２３．異型接合性二倍体サッカロミセス・セレビシエ細胞において、必須遺伝子が耐性遺伝子で置換されている、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。２４．染色体外において必須遺伝子の天然プロモーターが調節可能なプロモーターで置換されているサッカロミセス・セレビシエ細胞を作出する、請求項１９記載の方法。２５．サッカロミセス・セレビシエ細胞が、ＣＥＮ．ＥＮ２７、ＣＥＮ．ＥＮ２８、ＣＥＮ．ＥＮ８、ＣＥＮ．ＲＯ２３、ＣＥＮ．ＲＯ３０、ＣＥＮ．ＲＯ６、ＣＥＮ．ＲＯ８、ＣＥＮ．ＳＲ１４、ＣＥＮ．ＳＲ１５、ＣＥＮ．ＳＲ２、ＣＥＮ．ＳＲ２６、ＣＥＮ．ＳＲ４１、ＣＥＮ．ＳＲ５５、ＣＥＮ．ＳＲ６６、ＣＥＮ．ＳＲ８０、ＣＥＮ．ＳＲ８１、ＣＥＮ．ＨＥ１、ＣＥＮ．ＨＥ１７、ＣＥＮ．ＨＥ１８、ＣＥＮ．ＨＥ２、ＣＥＮ．ＨＥ４、ＣＥＮ．ＨＥ９、ＣＥＮ．ＨＩ１０、ＣＥＮ．ＨＩ２３、ＣＥＮ．ＨＩ２８、ＣＥＮ．ＨＩ３１、ＣＥＮ．ＨＩ５、ＣＥＮ．ＨＩ７、ＣＥＮ．ＦＥ８、ＣＥＮ．ＫＲ２８、ＣＥＮ．ＴＳ０２、ＣＥＮ．ＴＳ０４およびＣＥＮ．ＺＩ２６系統の細胞から選択される、請求項１２〜２４のいずれか１項に記載の方法。２６．請求項２５記載のＣＥＮ．ＥＮ２７、ＣＥＮ．ＥＮ２８、ＣＥＮ．ＥＮ８、ＣＥＮ．ＲＯ２３、ＣＥＮ．ＲＯ３０、ＣＥＮ．ＲＯ６、ＣＥＮ．ＲＯ８、ＣＥＮ．ＳＲ１４、ＣＥＮ．ＳＲ１５、ＣＥＮ．ＳＲ２、ＣＥＮ．ＳＲ２６、ＣＥＮ．ＳＲ４１、ＣＥＮ．ＳＲ５５、ＣＥＮ．ＳＲ６６、ＣＥＮ．ＳＲ８０、ＣＥＮ．ＳＲ８１、ＣＥＮ．ＨＥ１、ＣＥＮ．ＨＥ１７、ＣＥＮ．ＨＥ１８、ＣＥＮ．ＨＥ２、ＣＥＮ．ＨＥ４、ＣＥＮ．ＨＥ９、ＣＥＮ．ＨＩ１０、ＣＥＮ．Ｈ１２３、ＣＥＮ．ＨＩ２８、ＣＥＮ．ＨＩ３１、ＣＥＮ．ＨＩ５、ＣＥＮ．ＨＩ７、ＣＥＮ．ＦＥ８、ＣＥＮ．ＫＲ２８、ＣＥＮ．ＴＳ０２、ＣＥＮ．ＴＳ０４およびＣＥＮ．ＺＩ２６系統の１つのサッカロミセス・セレビシエ細胞。２７．他の真菌種において機能的に類似の遺伝子を同定する方法における、請求項２５記載の系統のサッカロミセス・セレビシエ細胞の使用。２８．カンジダ・アルビカンスおよびアスペルギルス・フミガタスにおいて機能的に類似の遺伝子を同定するための、請求項２６および２７のいずれか１項に記載のサッカロミセスセレビシエ細胞の使用。２９．機能的に類似のヒト、動物または植物遺伝子を同定するための、請求項２６記載のサッカロミセス・セレビシエ細胞の使用。３０．抗真菌活性物質を同定する方法における、請求項２６記載のサッカロミセス・セレビシエ細胞の使用。３１．プラスミドｐＰＫ５／６、ｐＰＫ７／８、ｐＰＫ９／１０またはｐＰＫ１３／１４を用いてＳ．セレビシエケノムにおける個々の遺伝子をマーカー遺伝子で置換することにより、Ｓ．セレビシエの必須遺伝子を同定する、請求項１〜１５のいずれか１頃に記載の方法。３２．配列番号１８のプラスミドｐＰＫ５／６。３３．配列番号１９のプラスミドｐＰＫ７／８。３４．配列番号２０のプラスミドｐＰＫ９／１０。３５．配列番号２１のプラスミドｐＰＫ１３／１４。