JPH0671434B2 - ヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子操作により得られたヒト血清アルブミン
の精製方法に関する。

〔従来技術〕

アルブミン、特にヒト血清アルブミン（以下でHSAと呼
称する）は血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋白
は肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持す
る責を負う。

また種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持って
いる。

HSAは種々の臨床上の状況において投与される。例え
ば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻し、それに
より外傷に関連するいくつかの症状を改善させるため
に、通常はHSAの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や
胎児性赤芽球症に罹っている患者にもHSAによる治療を
必要とすることがある。

従って、HSAを投与する基本的な治療上の意義は、外科
手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低蛋白血症におけ
るごとく、血管からの液体の損失がある様な状態を治療
する点に存する。

現在、HSAは、主として採取した血液の分画からの産物
として製造されている。この製造法の欠点は不経済であ
ることと、血液の供給が困難であるということである。
また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物質を
含んでいることがある。従って、HSAの代替の原料を開
発することが有益となろう。

ところで、組換DNA技術の出現によって多種多様の有用
なポリペプチドの微生物による生産が可能となった。多
くの哺乳動物ポリペプチド類、例えばヒト成長ホルモ
ン、インターフェロンが既に種々の微生物により生産さ
れている。この技術によって種々の有用なポリペプチド
の微生物による生産が可能となり、種々のワクチン、ホ
ルモン、酵素、抗体を微生物に生産させることができる
ようになった。

前述したHSAの生産上の難点を克服するために、遺伝子
操作の技術によりHSAを大量に得、それを高度精製する
方法が確立されつつある。

ところが、遺伝子操作を経た菌よりHSAを精製製造する
際には、原料中に蛋白質を主とする菌体成分が夾雑して
くる。これらの夾雑物質は、従来の血漿由来HSAの精製
方法では充分に除去することができない。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明者らは、かかる技術的背景の下に鋭意研究
を重ねた結果、遺伝子操作を経た菌体内または菌体外に
産生されたHSAを効率よく精製する方法を見出し、本発
明を完成した。

〔問題点を解決するための手段及び作用〕

本発明において用いられるHSAは遺伝子操作に由来して
調製されたものであれば、特に限定されない。従って遺
伝子操作を経てHSAを発現する菌体（例えば、大腸菌、
酵母、枯草菌、動物細胞など）を、例えば菌体内発現で
あれば凍結融解法、ガラスビーズ法、高圧法、超音波処
理法、酵素処理法等の公知の方法で処理し菌体外発現
（分泌発現）であれば培養上清から得られるHSA抽出画
分、あるいはこの抽出画分を各種分画法、吸着クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾
過、密度勾配遠心分離法、透析等の公知の方法で部分精
製した画分などを用いることができる。

（ａ）具体的に宿主が酵母の場合に限って、HSA産生酵
母の調製方法を説明する。

（１）まず、特願昭63−33657で記載された手段が挙げ
られる。

本発明に関する組換えプラスミドは、シグナルペプチド
をコードするDNA配列、HSAをコードするDNA配列、プロ
モーター、ターミネーターおよびプラスミドDNAからな
る。

上記（１）でいう特定構造のシグナルペプチドは、以下
のアミノ酸配列（Ｉ）で示される。

Met-A₁-A₂-X-B-C-D-E-F （Ｉ） （式中、A₁は１〜３個のArg,Ser、LysまたはHisから選
ばれたアミノ酸からなるペプチド鎖を、A₂は１〜３個の
任意のアミノ酸からなるペプチド鎖を、Ｘは８〜10個の
疎水性アミノ酸からなるペプチド鎖を、ＢはProまたはS
erを、ＣはGlyまたはProを、ＤはCys,Ala,Leu,Ser,Thr
またはValから選ばれたアミノ酸を、ＥはTrpまたはGln
を、ＦはAlaまたはGlyを各々表わす） A₂中で表わされる任意のアミノ酸としては、Gly,Ala,Le
u,Ile,Ser,Thr,Cys,Met,Asp,Asn,Glu,Gln,Lys,Arg,Phe,
Tyr,His,Trp,Pro,Valが挙げられる。Ｘ中で表わされる
疎水性アミノ酸としては、Leu,Phe,Ala,Ile,Val,Cys,Me
tなどが例示される。好ましくは、A₁は−Arg−Ser−
を、A₂は−Leu−Leu−を、Ｘは−（Leu）_８−を表わ
す。

より好ましくはシグナルペプチドは、一例として以下の
アミノ酸配列で示される。

MetArgSer（Leu）₁₀ProGlyCysTrpAla シグナルペプチド遺伝子は上述したアミノ酸配列で表現
できるDNA配列を有していればよいが、各アミノ酸のコ
ドンとしては以下のものが例示される。AlaはGCTまたは
GCC、CysはTGT、AspはGAC、GluはGAA、PheはTTC、Glyは
GGT、HisはGAC、IleはATTまたはATC、LysはAAG、LeuはT
TG、MetはATG、AsnはAAC、ProはCCA、GlnはCAA、ArgはA
GA、SerはTCTまたはTCC、ThrはACTまたはACC、ValはGTT
またはGTC、TrpはTGG、TyrはTAC、好ましくは以下のよ
うなDNA配列を有するものが用いられる。

HSA遺伝子は、特開昭62−29985号公報などに記載されて
いる。

上述の文献中では、HSA遺伝子を含むプラスミドとして
開示されている。

本発明に用いられる酵母を形質転換するための組換えプ
ラスミドは、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子の
下流にHSA遺伝子を自体既知の手段で連結し、これらを
含むプラスミドとして自体既知の手段にて調製される。

プロモーターおよびターミネーターは酵母で機能するも
のであれば特に限定されない。

プロモーターとしては、PGKプロモーター、ADHプロモー
ター、phoE（５）プロモーター、GAL1プロモーター、GA
L10プロモーター、GAP−DHプロモーターなどが好適に使
用される。

プロモーターは設計アルブミンシグナルペプチド遺伝子
の上流に位置する。

ターミネーターとしてはphoE（５）ターミネーター、GA
PDHターミネーターなどが好適に使用される。

ターミネーターはHSA遺伝子の下流に位置する。

プロモーター、ターミネーターは各々プラスミドに組み
込まれた形で入手される。

プラスミドDNAは酵母中で自律複製可能なものであれば
特に限定されない。具体的には、pJDB207、pJDB219など
が例示される。

本発明に用いられる組換えプラスミドは、上述したプラ
スミド群から各々、血清アルブミンシグナルペプチド遺
伝子−HSA遺伝子からなるDNA配列、プロモーターを含む
DNA配列およびターミネーターを含むDNA配列を制限酵素
により切り出した後に連結（接続）して適当なプラスミ
ドに組み込むか、または、一方のDNA配列を切り出した
後に他方のプラスミド中に組み込むかのいずれかの方法
により得られる。

その際、配列の順序は上流から下流に向かって、プロモ
ーター、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、HSA
遺伝子、ターミネーターとなるように調製する。

また、選別時のマーカーとして、抗生物質（テトラサイ
クリン、アンピシリン、カナマイシン）耐性遺伝子ある
いは宿主の栄養要求性を補う遺伝子を組み込むことも可
能である。

HSAをコードするDNA配列を用いて形質転換体を調製する
方法としては、当該DNA配列を組み込んだ上述の組換え
プラスミドを用いる方法、あるいは当該DNA配列を宿主
（酵母）の染色体上に挿入する方法などが挙げられる。

この組換えプラスミドを用いて形質転換体を製作する方
法ひいてはHSAを製造する方法は以下の通りである。

組換えプラスミドを宿主細胞に導入する。宿主細胞とし
ては酵母が用いられる。具体的には挿入されるプラスミ
ドが担持する選択マーカー遺伝子によって相補する変異
をもった変異株、たとえばロイシン要求性変異株である
サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisi
ae）AH22（a,his 4,leu 2,can 1）等に好適に用いられ
る。

宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の方法、たとえば、
リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチレン
グリコール融合法、エレクトロボレーション法などによ
り行う。

必要な形質転換体を選択する。

形質転換株は、宿主細胞の自体公知の培地で培養する。
培地としてはYNB液体培地〔0.7％Yeast Nitrogen Base
（Difco社）、２％グルコース〕、およびYPD液体培地
〔１％イーストエキストラクト（Difco社）、２％ポリ
ペプトン（大五栄養社）２％グルコース〕などが例示さ
れる。

培養は、通常15〜43℃（好適には30℃程度）で20〜100
時間程度行い、必要により通気や攪拌を加えることもで
きる。

（２）また、特開昭62−306674で記載された手段も挙げ
られる。

本発明に関する組換えDNAは、血清アルブミンシグナル
ペプチド遺伝子、HSA遺伝子、プロモーター、ターミネ
ーターおよびプラスミドDNA又は染色体DNAからなる。

血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は、例えば哺乳
動物に由来するものが好適に使用される。具体的にはヒ
ト由来、ラット由来、ウシ由来のものなどが用いられ
る。また、その遺伝子は主要部を残して変異させたもの
であってもよい。

ヒト由来のものとしては、 MetLysTrpValThrPheIleSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAlaTy
sSer ラット由来のものとしては、 MetLysTrpValThrPheLeuLeuLeuLeuPheIleSerGlySerAlaPh
eSer ウシ由来のものとしては、 MetLysTrpValThrPheIleSerLeuLeuLeuLeuPheSerSerAlaTy
sSer などのアミノ酸配列で表わされるDNAが例示される。

当該血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は好ましく
は、ヒト由来のものが使用される。

さらに、本シグナルペプチド遺伝子は、一部変更するこ
とによって、より効率的な効果を得ることができ、それ
は次の一般式で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝
子からなる。

好ましい組合わせとしては第２表のごときものが例示さ
れる。

血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は上述したアミ
ノ酸配列で表現できるDNA配列を有していればよいが、
各アミノ酸のコドンとして好ましいものは次の通りであ
る。

Ala:GCT又はGCC,Cys:TGT,Asp:GAC,Glu:GAA,Phe:TTC,Gl
y:GGT,His:GAC,Ile:ATT又はATC,Lys:AAG,Leu:TTG,Met:A
TG,Asn:AAC,Pro:CCA,Gln:CAA,Arg:AGA,Ser:TCT又はTCC,
Th:ACT又はACC,Val:GTT又はGTC,Trp:TGG,Tyr:TAC シグナルペプチド遺伝子以外は全て（１）と同様であ
る。

より具体的にプラスミドを酵母染色体に組込んでHSA産
生酵母を調製する方法を説明する。

本発明に関するプラスミドは、宿主酵母染色体中に存在
する遺伝子の一部のDNA配列（例えば、LEU2、HIS4、TRP
1、URA3、ribosomeDNA遺伝子等）を含有する。相同な配
列により、全プラスミドまたはその線状断片は組換によ
り宿主染色体に安定に導入することができる。即ち、増
殖中、子孫細胞は選択圧は存在しない場合でも導入され
た遺伝物質を安定に保持する。

例えば、酵母染色体遺伝子中の天然に存在する配列およ
びHSA遺伝子を含むプラスミドは、前記染色体遺伝子の
座に安定に組み込まれ得る。

本発明に関する宿主酵母染色体配列に相同な配列は、特
にアミノ酸または核酸合成系遺伝子、ribosomeDNA、Ty
因子等が使用できる。特に、アミノ酸または核酸合成系
遺伝子は、宿主酵母がアミノ酸または核酸栄養要求性株
である時、すなわち、該アミノ酸または核酸合成系遺伝
子が欠損している株においては、宿主の変異を補完する
遺伝子であるので、形質転換体の選択マーカーとして使
用することができる。この際、宿主酵母の栄養要求性に
原栄養性をもたらすアミノ酸または核酸合成系遺伝子と
しては例えばLEU2、HIS4、TRP1またはURA3がある。

酵母用の選択遺伝子マーカーとしては、上記のように、
宿主酵母が栄養要求性株である時、アミノ酸または核酸
合成系遺伝子のようなものが使用できるほか、宿主が抗
生物質感受性株である時は、該抗生物質耐性を発現する
遺伝子が使用できる。例えばシクロヘキシド、G418、ク
ロラムフェニコール、プレオマイシンまたはハイグロマ
イシン等の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子があ
げられる。

本発明に関するプラスミドが含有するアルブミンコード
領域は、特にヒト血清由来のアルブミン（HSA）と同一
または相同なDNA配列であり、例えばHSAを生産すること
ができる任意のヒト細胞から得られる。該DNAは染色体D
NAまたはcDNAである。染色体DNAはHSA遺伝子を含有する
遺伝子ライブラリーから分離することができ、そしてHS
A cDNAは公知の方法を用いてmRNA経路を介して調製す
ることができる。

本発明に関するプロモーターは酵母、好適にはサッカロ
マイセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）
のゲノムDNAに由来する。好ましくは、高発現酵母遺伝
子のプロモーターをHSAの発現のために使用する。即
ち、TRPI遺伝子、ADHIもしくはADHII遺伝子、酸性ホス
ファターゼ（PHO3もしくはPHO5）遺伝子、またはイソチ
トクロームＣ遺伝子のプロモーター、ガラクトース代謝
系のプロモーター（GAL1、GAL10もしくはGAL7）、イン
ベルターゼのプロモーター（SUC2）あるいは解糖系酵素
をコードする遺伝子のプロモーター、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ（GAPDH）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（P
GK）、ヘキソキナーゼ、ビルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェートイソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナー
ゼの遺伝子のプロモーター、あるいはａ−ファクターま
たはα−ファクターをコードする酵母接合フェロモン遺
伝子のプロモーターを使用することができる。

また、プラスミドは、宿主酵母内で自律的に複製できな
い。すなわち、宿主酵母内での自律複製開始領域、例え
ば２μｍ DNAの複製開始領域やARS領域（Autonomous r
eplicating sequence）を実質的に含まない。

本発明における遺伝子操作の他の好ましい態様において
は、構成物プラスミド中にシグナル配列を導入すること
もできる。シグナル配列は、酵母イルベルターゼ、α−
ファクター遺伝子のような酵母由来のシグナル配列を使
用することができる。また、HSAのシグナル配列は好適
であり、好ましくは酵母での分泌発現のために特に合成
されたシグナル配列（特願昭62−306674号または特願昭
63−33657号）を用いることもできる。

このシグナル配列の導入により、HSA遺伝子の発現の
後、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラズム
空間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中への
分泌を達成することができる。これはより収量の相対な
増加が可能となる。さらに、細胞を破壊する必要がない
ので回収工程を単純化することが可能である。

また、本発明に関するプラスミドは転写停止のための適
当なターミネーター、例えばPHO5もしくはGAP−DHター
ミネーターを含有する。

このプラスミドはプロモーター、HSAコード領域および
宿主染色体相同領域とは別に、細菌宿主、特に大腸菌の
ための複製開始点および遺伝的選択マーカーを含有する
こともできる。大腸菌複製開始点および大腸菌のための
選択マーカーを酵母ハイブリドベクター中に使用するこ
とに関して有用な特徴が存在する。まず、大腸菌におけ
る増殖および複製により大量のハイブリドベクターDNA
を得ることができ、そして第２に、大腸菌に基礎を置く
クローニング技法のすべてを用いてハイブリドベクター
の構築を容易に行うことができる。大腸菌プラスミド、
例えばpBR322等は大腸菌複製開始点、および抗生物質、
例えばテトラサイクリンおよびアンビシリンに対する耐
性をもたらす大腸菌遺伝マーカーを含有し、そして酵母
ハイブリドベクターの部分として有利に使用される。

従って、該プラスミドは、プロモーター、該プロモータ
ーに制御されるHSAコード領域、それに続く転写停止の
ためのターミネーターを含み、かつ宿主酵母染色体配列
に相同な配列を含むものである。また、該プラスミド
は、所望により、分泌生産のためのシグナル配列、酵母
用の選択遺伝子マーカー、大腸菌の複製開始領域、大腸
菌用選択遺伝子マーカーを含有することができる。そし
て、酵母の複製開始領域は実質的に含まないものであ
る。

本発明において、宿主としては酵母、特にサッカロマイ
セス属もしくはピキア属が使用される。好ましくは、栄
養要求性株や、抗生物質感受性株が使用できる。

この組換えプラスミドを用いて形質転換体を作製する方
法、ひいてはアルブミンを製造する方法は以下の通りで
ある。

組換えプラスミドを宿主酵母細胞の染色体上に導入す
る。具体的には、挿入するプラスミドの有する、宿主酵
母細胞の染色体に相同な配列中の任意の部位を制限酵素
処理により切断し、直線化したプラスミドを宿主に導入
することが望ましい。直線化されたプラスミドは、宿主
酵母細胞染色体上のプラスミドに組み込まれた領域と相
同な領域に組み込まれる。直線化されたプラスミドは環
状プラスミドより、宿主染色体上に組み込まれる頻度が
上昇する。この時使用する宿主酵母は、挿入されるプラ
スミドが担持する酵母用選択マーカー遺伝子によって相
補する変異を持った変異株、例えば、ロイシンおよびヒ
スチジン要求性変異株でかつG418感受性株であるサッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
AH22株（a,his 4,leu 2,can 1）等が好適に用いられ
る。

宿主酵母細胞の形質転換は公知の方法、例えばプロトプ
ラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーシ
ョン法などにより行う。

次に期待した部位へプラスミドが導入されているか否
か、および導入した遺伝子が安定であるか否かを調べ
る。具体的には、サザンプロッティング法により、形質
転換に利用した宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列
をプローブとして、期待通りの部位へプラスミドが導入
されていることを確認する。またアルブミンをコードす
る遺伝子の安定性を、アルブミン産生量および栄養要求
性の回復維持を指標に調べ、形質転換体を非選択培地で
数十代培養した後でも、変化しないことを確認する。

以上、確認試験を行った株は、確かにHSAコード領域を
含むプラスミドが、宿主酵母細胞染色体の所望の部位に
組み込まれた形質転換体である。この形質転換体を宿主
として使用し、再度、HSAコード領域を含むプラスミド
で形質転換させることができる。この場合、酵母細胞染
色体相同領域としては、初めの形質転換で使用した領域
以外の相同領域も使用できる。

この他、宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列とし
て、ribosome DNAやTy因子（Transposon of Yeast elem
ent）も挙げられる。これらの遺伝子は細胞当り、複数
個存在するので、１回の形質転換で、複数個の目的遺伝
子を宿主染色体に組み込むことができる。

以下、具体的に組み込み方法を例示するが本例示は好適
な一手段を示すものであり、この手法に限定されるもの
ではない。相同配列部位は、選択的繰り返しにより代替
え可能である。

宿主としては、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株
でかつG418感受性株であるサッカロマイセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）AH22株（ロイシン合成
系遺伝子のLEU2およびヒスチジン合成系遺伝子のHIS4に
変異を持つ株）を用いる。

まず、ロイシン非要求性とするための遺伝子、LEU2を宿
主酵母細胞の染色体配列と相同の配列として持つプラス
ミドで形質転換する。得られた形質転換体は、染色体上
のLEU2遺伝子部位にアルブミンコード領域を含むプラス
ミドが挿入されたものであり、ロイシン非要求性、すな
わちロイシン不含培地でも増殖できる株である。

次に、この形質転換体を宿主とし、ヒスチジン非要求性
とするための遺伝子、HIS4を宿主酵母細胞の染色体配列
と相同の配列として持つプラスミド（もちろん、アルブ
ミンコード領域も含有する）で形質転換する。得られた
形質転換体は染色体上のHIS4遺伝子部位にアルブミンコ
ード領域を含むプラスミドが挿入されたものであり、ヒ
スチジン非要求性、すなわちヒスチジン不含培地でも増
殖できる株である。この時点で、発現のための目的遺伝
子であるアルブミン遺伝子は、LEU2およびHIS4の２箇所
に導入されている。

次に、上記ロイシンおよびヒスチジン非要求性になった
形質転換体を宿主として、TRP1を宿主酵母細胞の染色体
配列と相同の配列として持つプラスミドで形質転換す
る。このプラスミドは、アルブミンコード領域はもちろ
ん、G418耐性遺伝子も含有するものである。得られた形
質転換体は染色体上のTRP1遺伝子部位にアルブミンコー
ド領域およびG418耐性遺伝子を含むプラスミドを挿入さ
れたものであり、抗生物質G418に対し耐性を示す。従っ
て、この形質転換体は、アルブミン遺伝子を染色体上の
LEU2、HIS4およびTRP1遺伝子部位の計３箇所に含有する
ものである。この時、挿入の順序は特に問題ではない。

宿主として、何種類もの栄養要求変異株が取得できれ
ば、または何種類もの抗生物質に対して感受性を示す株
が取得できれば、それに応じた領域に有用遺伝子を複数
導入することができる。

このように、宿主染色体上の複数領域に目的遺伝子を挿
入することができる。これら染色体に組み込まれた遺伝
子は、脱落することなく、安定に維持され、かつ複数の
遺伝子を組み込むことにより、目的生産物を多量に取得
することが可能となる。

形質転換株は、公知の培地で培養する。YPD液体培地
〔１％イーストエキストラクト（Difco社）、２％バク
トポリペプトン（Difco社）、２％グルコース〕などが
例示される。培養は通常15〜43％（好適には30℃程度）
で20〜100時間程度行い、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。

（ｂ）加熱処理 本工程は夾雑するプロテアーゼを不活化するために行
う。

添加剤としてはアセチルトリプトファンおよび／または
炭素数６〜12の有機カルボン酸またはその塩が挙げられ
る。

アセチルトリプトファンの添加量としては１〜100mM程
度が例示される。

炭素数６〜12の有機カルボン酸としてはカプロン酸（炭
素数６）、カプリル酸（炭素数８）、カプリン酸（炭素
数10）、ラウリン酸（炭素数12）等が例示される。

また、その塩としてはアルカリ金属塩（例えば、ナトリ
ウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例え
ば、カルシウム塩等）が例示される。

炭素数６〜12の有機カルボン酸またはその塩の添加量と
しては１〜100mM程度が例示される。

加熱処理の条件としては50〜70℃、１〜５時間程度が例
示される。

（ｂ）後処理 当該HSAは公知の手法によりさらに精製を行うことがで
きる。例えば、分画処理、限外濾過、ゲル濾過、イオン
交換クロマト、アフィニティクロマト等が挙げられる。

また、公知の製剤化技術を施すことによりHSA製剤を調
製することもできる。

（発明の効果） 本発明は夾雑したproteaseを不活化する事によりHSAの
低分子化を防ぐ事にある。

（実施例） HSAを産生するSaccharomyces cerevisiae（pYNO26/AH22
＃６）を培養し、培養上清液に5mMアセチルトリプト
ファン、5mMカプリル酸ナトリウムを添加し、60℃３時
間加熱する。60℃３時間加熱後培養上清濃縮液と非加熱
培養上清液をpH4.0に調整し室温で一昼夜放置後、ゲル
ろ過分析を行った。

参考例 HSA産生酵母の調製 1.プラスミド 成熟ヒト血清アルブミン（HSA）分泌発現用プラスミド
ベクター、pYNO26を用いた。本プラスミドは、GAL1プロ
モーター、HSA改変シグナル配列、HSAのcDNA及びPHO5タ
ーミネーターの順に連結された塩基配列を含む大腸菌で
Amp耐性、Km耐性酵母でＧ−418耐性を示す遺伝子とLEU2
^-を補う遺伝子を有する、全長約11.2kbの大腸菌／酵母
シャトルベクターである。

（１）シグナルペプチド HSAシグナルペプチドの−５〜−１のアミノ酸配列をSUC
2シグナルペプチドの−５〜−１と置換し、更に−３位
をValに置換したHSA/SUC2ハイプリドシグナルペプチド 2.プラスミドの酵母への導入 ヒト血清アルブミン分泌発現用プラスミドを酵母サッカ
ロミセスセレビシエAH22（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75,
1929−1933（1978））に以下の方法により導入した。

YPDメディウム（イーストエキストラクト10g、バクトペ
プトン20gを水に溶解し900mlとした後オートクレーブ滅
菌し、別にオートクレーブ滅菌した20％グルコース100m
lと混合した。）50ml中30℃、一夜振盪培養したサッカ
ロミセスセレビシエAH22を遠心し、得られた細胞を水20
mlに懸濁後、再度遠心して細胞を得た。これを10mlの50
mMジチオスレイトール、1.2Mソルビトール、25mMEDTA、
pH8.5に懸濁し、30℃で10分間穏やかに振盪した。遠心
により細胞を集め、1.2Mソルビトール10mlに懸濁し、再
度遠心により細胞を集めた。細胞を10mlの1.2Mソルビト
ールに懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞を10mlの
0.2mg/mlザイモリアーゼ100T、1.2Mソルビトール、10mM
EDTA、0.1Mクエン酸ナトリウム、pH5.8に懸濁後、30℃
で１時間穏やかに振盪した。遠心で細胞を集め、1.2Mソ
ルビトール、次いで10mM塩化カルシウム、1.2Mソルビト
ール各10mlで洗浄し、遠心で細胞を集めた。細胞を1ml
の10mM塩化カルシウム、1.2Mソルビトールに懸濁した。
懸濁液100μｌを滅菌試験管にとり、５μｌ（５μｇ）
のプラスミドと混合し、室温に15分間静置した。更に、
1.2mlの20％ポリエチレングリコール4000、10mM塩化カ
ルシウム、10mMトリス−塩酸、pH7.5を加え穏やかに混
合後、室温で20分間静置した。遠心で細胞を集め、0.1m
lの1.2Mソルビトール、10mM塩化カルシウム含有YPDメデ
ィウムに懸濁し、30℃で30分間穏やかに振盪した。懸濁
液1.5,10,20,及び50μｌをそれぞれ45℃に保温した10ml
の1.2Mソルビトール、３％ノーブルアガー、２％グルコ
ース、0.7％イーストナイトロジェンベースに懸濁し、
1.2Mソルビトール、３％バクトアガー、２％グルコー
ス、0.7％イーストナイトロジェンベースから成るプレ
ートに拡げた。プレートが固化したら、30℃で３日間静
置培養した。形成したコロニーを爪楊枝で採取し、3ml
の0.7％イーストナイトロジェンベース、２％グルコー
スに懸濁後、30℃で２日間振盪培養した。そのうちの1.
5mlを遠心し、細胞を集め3mlのYPGメディウム（イース
トエキストラクト10g、バクトペプトン20gを水に溶解し
900mlとした後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレ
ーブ滅菌した20％ガラクトース100mlと混合した。）に
懸濁し、30℃で振盪培養した。

3.ヒト血清アルブミン分泌発現酵母の培養 形質転換されたヒト血清アルブミン蛋白質を分泌発現す
る酵母サッカロミセスセレビシエAH22を以下のように培
養した。0.7％イーストナイトロジェンベース、２％グ
ルコース、３％バクトアガーから成るプレートで生育し
た上記組み換え酵母を白金耳で採取し、50mlの0.7％イ
ーストナイトロジェンベース、２％グルコースから成る
YNBデディウムに接種し、30℃で２日間培養した。これ
を、更に500mlのYNBメディウムに全量接種し、30℃で２
日間培養した。遠心により細胞を集め、500mlのYPGメデ
ィウムに懸濁し、30℃で振盪培養した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 上村 八尋 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (56)参考文献 特開 平１−117790（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−224284（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−95997（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−25019（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】遺伝子操作により調製されたヒト血清アル
   ブミン産生宿主を培養して得られたヒト血清アルブミン
   を含む培養上清を、アセチルトリプトファンあるいは炭
   素数６〜12の有機カルボン酸またはその塩の存在下に50
   〜70℃で１〜５時間加熱処理することを特徴とするヒト
   血清アルブミンの製造方法。