KR0153516B1

KR0153516B1 - 폴리펩티드

Info

Publication number: KR0153516B1
Application number: KR1019880014255A
Authority: KR
Inventors: 제임스 발랑크 데이비드; 힌클리프 에드워드; 존 제이쇼우 마이클; 제임스 시니어 피터
Original assignee: 디. 히이드; 델타 바이오테크놀로지 리미티드
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-31
Publication date: 1998-10-15
Also published as: IE883280L; DE3876401T2; GR3007162T3; EP0322094B1; DE3876401D1; DK175046B1; HU209145B; FI101381B; IE61050B1; CA1341298C; ES2053758T3; US5380712A; FI884993A0; EP0322094A1; ATE82858T1; JPH02194A; AU619768B2; DK600688D0; IL88223A0; GB8725529D0

Abstract

내용 없음.

Description

폴리펩티드

제1도는 HSA(1-n)의 다른 C-말단을 갖는 (박스로 표시됨) 천연 HSA의 가장 대표적인 것으로 현재 생각되어지는 아미노산 서열을 도시한다.

제2도는 성숙 HSA를 코드하는 DNA 서열을 도시한다.

제3도는 mHOB31의 제조과정의 다이아그램 예시도이다.

제4도는 pHOB31의 제조과정의 다이아그램 예시도이다.

제5도는 완전한 HSA를 능가하는 HSA(1-389)의 증가된 수율을 보여주는 로케트 전기영동 사진이다.

제6도는 pDBD3의 제조과정을 도시한다.

제7도는 pDBD4의 제조과정을 도시한다.

제8도는 빌리루빈이 HSA(1-387)에 결합한 것을 나타내는 빌리루빈 형광의 증가를 나타내는 그래프를 도시한다.

제9도는 주어진 단백질 농도에서의 콜로이드 삼투압의 그래프를 도시한다.

본 발명은 재조함 DNA 기법에 의해 제조될 수 있고 그리고 인간 혈청 알부민의 많은 실재의 응용에 사용될 수 있는 신규한 폴리펩티드 분자에 관한 것이다.

인간 혈청 알부민(HSA)은 가장 풍부한 혈장 단백질로, 혈장의 총 단백질 함량의 60% 중량/중량(WDNAW)을 차지한다. HSA 분자는 공식 분자량 66,500인 585 아미노산의 단일 비-글리코실화 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있다. HSA의 아미노산 서열은 단백질서열 분석에 의해 정립되어 있고(Meloun et al, 1975, 인간 혈청 알부민의 완전 아미노산 서열 FEBS. Letters: 58:1, 136-317; Behrens et al, 1975, 인간 혈청 알부민의 구조 Fed. Proc. 34, 591) 보다 최근에는 유전학적 분석에 의해 정립이 되어 있다(Lawn et al, 1981, Nucleic Acids Research 9, 6102-6114). 공표된 바와같이 아미노산 서열 사이의 모순점이 있긴 하지만 (몇 가지는 다형현상에 기인하는 것이다). 제1도는 인간 집단내에 존재하는 HSA의 가장 대표적인 것이라고 현재 믿어지는 아미노산 서열을 나타낸다.

상대적으로 작은 분자량과 생리적 pH에서 순(net) 음성 전하로 인하여 (Peters, 1970, 혈청 알부민, Adv. Clin. Chem. 13, 37-111), HSA는 정상 혈장의 삼투 효과의 85%에 담당한다. 그러므로 HSA는 혈장 부피의 기본적인 조절자이다. HSA의 두 번째 역할은 이화과정에 의해 생성되는 작은 분자(예를 들어 지방산과 빌리루빈)에 결합하는 것이다. 알부민은 생리적 pH에서 잘 녹지않는 이들 주요(key) 대사물의 전달용 기본 수단을 대표한다.

HSA의 물리적, 화학적, 면역학적 및 제한 단백질분해 연구는 분자가 효소적 수단에 의하여 원래의 분자로부터 분리된 후 그들의 구조적 형태(conformation)를 보유하는 폴리펩티드 사슬 영역으로 구성됨을 보여주었다. 이들 폴리펩티드 사슬은 그들의 결합 능력을 보유함으로써 빌리루빈, 지방산 및 다른 작은 분자들에 대하여 폴리펩티드 사슬의 특정영역에 결합하는 부위의 지도화를 용이하게 한다(Kragh-Hausen, 1981, 혈청 알부민에의 리간드 결합의 분자적 측면, A. Soc. Pharm. Expt. Ther. 23, 1, 17-53). 이 분야에 있어서 많은 정보가 검토되어 왔다(Brown and Shockley, 1982, 혈청 알부민: 그의 리간드 결합부 위의 구조 및 특성확인).

HSA의 치료용 농축물의 임상적 사용에 대한 초지는 주로 혈장 부피 중량제로서의 그의 팽창(oncotic)작용에 관련된다. HSA의 농축물은 1940년대 이래로 특히, 쇼크, 화상, 성인 호흡기 질환, 및 심폐부작용의 경우에 치료용으로 사용되어 왔다. 알부민 또한 급성 간 부전증, 경변증 환자로부터 복수액을 제거한 이후, 수술후, 급성 신장증, 신장투석, 및 신생아의 용혈성 질병의 심각한 황달같은 경우에서 독성물질의 제거용 전달(transport) 단백질로서 사용되어 왔다.

치료제로서 사용에 더불어, HSA는 조직배양에서 포유류 세포의 성장을 원조하기 위해 사용되는 배지에 첨가되는 혈청의 주성분이다. 혈청 및 알부민의 소비는 생물공학 및 제약회사가 그들의 조직배양을 연구용 및 생산용으로 확장하였기 때문에 최근에 이르러 대단히 증가하였다. 이들 목적을 위하여 혈청의 보다 저렴한 가격과 보다 좋은 조절의 필요성이 전반적으로 대두되었다.

미생물에서 재조함 폴리펩티드를 발현하기 위하여 HSA-코드화 DNA 서열을 조작하는 것이 알려져 있다. 실제로 그러한 재조한 HSA 폴리펩티드가 대장균(Escherichia coli) (영국특허 제 2 147 903B 호) 및 고초균(Bacillus subtilis)(유럽특허 출원 제 86304656.1 호) 및 효모 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)(유럽 특허 공보 제 201 239 호, 델타 바이오테크놀로지 리미티드)과 같은 박테리아 종에서 생성되어 왔다; 그러므로 천연 HSA와 본질적으로 동일한 재조합 폴리펩티드가 공지 방법의 사용에 의하여 각종 미생물 숙주에서 생성될 수 있다는 것이 일반적이다. 그러나, 재조합 HSA가 생성되는 모든 경우에 있어서, 목적은 구조와 생물학적 기능에 있어서, HSA와 본성 동일인 분자를 생성하는 것이었다.

이제 보다 짧은 형태의 HSA를 제조하는 것이 유익하다는 것이 발견되었다.

본 발명의 한 측면에서는 아미노산 잔기가 n까지인(n은 369 내지 419이다) 인간 혈청 알부민의 N-말단 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그의 변이체가 제공된다.

본 발명의 신규한 폴리펩티드는 이하 HSA(1-n)으로 언급한다.

용어 인간 혈청 알부민은 공지된 또는 아직은 발견되지 않은 다형(pholymorphic) 형태의 HSA를 포함하는 것으로(그러나 필수적으로 거기에 제한되는 것은 아님) 의도된다. 예를 들면, 알부민 나스카피(Naskapi)는 Glu-372 대신에 Lys-372를 가지며, 프로-알부민 크리스트처치(Christchurch)는 변경된 프로-서열을 갖는다. 용어 변이체는 잔기 1 내지 n에서의 소수의 인공적인 변이(보존적 치환 또는 잔기의 소수 삽입을 가지는, 또는 아미노산 구조의 적은 변이를 가지는 한 또는 소수의 잔기가 없는 분자와 같은)를 포함하는 것으로(그러나 필수적으로 거기에 제한되는 것은 아님) 의도된다. 그러므로 어떠한 HSA(1-n) 화합물과 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동종성을 가지는 폴리펩티드도 변이체로 간주된다. 그러한 변이체는 바람직하게는 360 내지 430 아미노산 길이이며 보다 바람직하게는 369 내지 419 아미노산 길이이고 가장 바람직하게는 386 내지 388 아미노산 길이이다. 또한 그러한 변이체는 HSA(1-n) 화합물과 생리적으로 동등해야 하는 것이 바람직하다; 즉, 변이체는 HSA(1-n) 화합물과 최소한 하나의 약리적 활용성을 공유하는 것이 바람직하다. 나아가, 약리적으로 사용될 어떠한 잠재적인 변이체라도 치료될 동물(특히 인간)에서 비-면역원성이어야 한다.

보존적 치환은 폴리펩티드 화학분야에 숙련된 인간이라면 실질적으로 변화되지 않은 폴리펩티드의 최소한 2차구조, 및 바람직하게는 3차구조를 예견할 수 있을 정도로 하나 또는 그 이상의 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 것으로 치환된 것을 말한다. 예를 들어, 전형적인 그러한 치환은 글리신에 대해서는 알라닌 또는 발린을, 글루타민에 대해서는 아르기닌 또는 아스파라긴을, 아스파라긴에 대해서는 세린을 그리고 라이신에 대해서는 히스티딘을 포함한다. 또한, 변이체는 10개까지의 (바람직하게는 단지 하나 또는 둘) 아미노산 잔기가 어느 주어진 HSA(1-n)과 비교하여 없을 수도 있다; 그러한 생략은 분자의 100 내지 369 부위(성숙 HSA 자체와 비교하여)에서 일어나는 것이 바람직하다. 유사하게 10개까지의, 그러나 바람직하게는 단지 하나 또는 둘의 아미노산이 친화성(preference)을 위해 100 내지 369 부위에 다시 첨가될 수 있다. 용어 생리적으로 기능적인 동등물은 또한 상기 1 내지 n서열에 N-말단에 추가의 잔기(예를 들면, 반드시 HSA에 천연적인 것은 아닌 적당한 리더 서열을 가지는 pro-HSA(1-n), pre-pro-HSA(1-n), metHSA(1-n), 및 HSA(1-n))가 더해진 보다 큰 분자를 포함한다.

HSA(1-n)이 이하에서 보다 상세히 기술되는 바와 같이, 형질전환된 효모(맥주 효모균)를 배양함으로써 제조되어야 한다면, 리더 서열은 예를들어 천연적으로 효모 알파-인자 단백질을 갖는 것으로 밝혀질 수 있다. 관심의 다른 폴리펩티드와의 C-말단 융합 생성물도 제조될 수 있다. HSA의 공지된 형태와 단편, 예를 들어 저(低)수율로 생성되는 펩신 분해단편인 HSA(1-387) (Geisow and Beaven, Biochem. J. 161. 619-624, 1977과 ibid. 163. 477-484, 1977 이들 선행 문헌은 1-386으로서의 단편을 확인하였지만, 이것이 부정확한 공개 서열 정보의 작자의 사용에 기인하고 단편은 실제로 1-387이었음이 드러나게 되었기 때문에 Lawn et al, op-cit 참조)은 분명히 상기 정의에서 제외되는 것으로서 간주되어야 한다. 유사하게, HSA(1-n) 및 잔존하는 HSA 잔기(n+1 내지 585)를 포함하는 C-말단 융합 단백질은 본 발명의 일부로서 청구되지 않는다.

특히 바람직한 신규의 HSA(1-n) 화합물로는 HSA(1-373)(즉 C-말단 Val), HSA(1-388)(즉, C-말단 Ile)), HSA(1-389)(즉, C-말단 Lys), HSA(1-390)(즉, C-말단 Gln) 및 HSA(1-407)(즉, C-말단 Leu)이 있다.

HSA(1-n)분자들은 천연 HSA의 화학적 또는 효소적분해, 또는 펩티드 합성에 의해서라기보다는 재조합 DNA 기법(임의로는 단백질분해 소화가 이어진다)에 의하여 제조되는 것이 바람직하다. 효소분해의 경우에 있어서는, 예를들어 트립신-형 효소는 Lys(389)와 Glu(390) 사이에서 HSA를 절단하겠지만 또한 동시에 다른 절단 부위도 절단할 것이다. 장래에는, 419 아미노산만큼 긴 분자에 대해서도 펩티드 합성이 보다 용이해지겠지만 현재로서는 실제적인 계획은 아니다. 효모에서의 발현이 특히 바람직하다.

최소한 HSA(1-n) 화합물이 형질전환된 숙주를 배양함으로써 제조되는 어떤 상황에서는, HSA(1-387)보다 긴 HSA(1-n)화합물의 일부가 시스템에서 자연적으로 존재하는 효소에 의하여 HSA(1-387)로 단백질분해 소화된다는 것이 발견되었다. 그러므로, 원한다면 누구든지 다른 HSA(1-n) 화합물을 준비하기 위하여 주어진 HSA(1-n) 화합물에 상당하는 뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다.

본원에 기재된 새로운 분자는 혈장 부피 증량제로서 천연 HSA 또는 본성-동일 재조합 HSA의 어느 하나에 대하여 효과적인 대용물로서 사용될 수 있다. 천연 HSA와 재조합 본성-동일 HSA를 능가하는 HSA(1-n)의 잇점은 혈액의 콜로이드 삼투압을 일으키는 효력에 관한 것이다. 본 발명 단백질의 보다 작은 분자량(대략 44 킬로-달톤)은 천연-HSA 또는 본성-동일 재조합 HSA의 단백질량의 단지 1/2 내지 2/3의 단백질량이 동등한 콜로이드 삼투 효과를 달성하는데 필요할 것이라는 것을 의미한다. 따라서, 재조합 DNA 기법에 의한 이 신규 폴리펩티드의 제조방법은 실질적으로 보다 적은 단백성 물질이 유효량의 제조에 필요하기 때문에 공지의 본성-동일 재조합 HSA의 제조방법을 능가하는 상당한 경제적인 장점을 제공할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 두 번째 측면은 상기 정의된 바와 같은 HSA(1-n) 또는 그 자체 공지되었지만 약제용으로는 제안되지 않았던 어떠한 HSA(1-n) 분자인 HSA(1-n) 플러스를 포함하는 의약조성물을 제공한다.

상기 논의된 바와 같이, HSA의 선행 기술인 펩신 소화에서 우연히 제조된 단편이었던 HSA(1-387)은 특히 의약 조성물에서와 같이 HSA(1-n) 플러스로서 바람직하다. 조성물은 상기 정의된 바와 같이 HSA(1-387)의 변이체를 포함할 수 있다.

본 발명의 세 번째 측면은 HSA(1-n) 플러스를 포함하는 폴리펩티드의 멸균 비-발열 용액의 혈액-증량(bulking) 또는 혈액-세정(cleaning) 유효 비-독성량을 정맥내로 투여하는 것을 포함하는, 알부민이 조치되는 쇼크, 화상 또는 다른 상태에 대해 인간을 치료하는 방법을 제공한다.

발명의 또다른 측면은 (a)셀라인을 포함하여, HSA(1-n) 플러스 발현을 코드화하는 벡터, 플라스미드 및 형질전환된 미생물; (b) 형질전환된 미생물(셀라인을 포함하여) 이 HSA(1-n) 플러스를 발현하기에 적당한 조건하에 발효시키는 것을 포함하는 HSA(1-n) 플러스의 제조방법; 및 (c) HSA(1-n) 플러스를 포함하는 실험 배지를 포함한다.

본성-동일 재조합 HSA를 능가하는 HSA(1-n) 플러스 분자의 일부의 또다른 장점은 그들의 보다 작은 크기와 그로써 감소된 아미노산 함량이 일반적으로 본성-동일 재조합 HSA에 대해 얻어진 것과 비교하여 미생물 숙주에서 얻어진 수율(세포 건조 중량당 분자)의 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 과정(process)의 규모가 감소될 수 있을 뿐만 아니라 재조합 숙주 유기체에서의 생산성이 증가될 수 있다.

발명의 화합물은 HSA(1-n) 플러스 화합물의 양(중량의 견지에서)이 전자의 팽창효과가 더 크기 때문에 HSA의 양보다 일반적으로 적게 사용되는 것만 제외하고는 HSA 자체와 같이 유사한 방법 및 유사한 형태로 형액 증량(혈장-증량)제로서 사용될 수 있다. 기술분야에서 숙련된 약사 또는 임상의학자는 기본적이고 비-창작성의 실험에 의하여 HSA(1-n) 플러스 화합물의 최적량을 쉽게 측정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 투여되는 HSA(1-n) 플러스의 양은 투여하고자 하는 HSA의 양의 약 2/3일 것이다.

HSA(1-n) 플러스 화합물은 또한:

(1) 조직 배양 배지중의 HSA 또는, 보다 통상적으로는 소(牛)혈청 알부민(BSA)에 대한 대용물로서 사용될 수 있어서, 예를들어 바이러스와 마이코플라스마(Mycoplasma)로 배지가 오염될 위험이 감소한다; (2) 경상이성체(enantiomers)등의 분리에 대한 액체 크로마토그래피의 고정상중에서 BSA에 대한 대용물로서 사용될 수 있다.

[실시예]

본 발명을 도면을 참조하 하여 실시예에 의해서 예시하기로 한다.

표준 재조합 HSA 과정은 다른 언급이 없는 한 마니아티스등(1982)에 의해 기재된 바와 같다. M13 재조합체 클론의 제조 및 분석은 메싱(1983)과 상거 등(1977)에 의해 기재된 것과 같았다. 다음의 분자의 제조에 사용한 인간 혈청 알부민 코딩 서열은 플라스미드 M13mp19.7(유럽특허출원 제 201 239호, 델타 바이오테크놀로지 리미티드)로부터 얻거나 또는 이 서열부분에 동등한 올리고뉴클레오티드의 합성에 의하여 얻는다. 올리고뉴클레오티드를 제조업자의 지시(AB Inc. Warrington, Cheshire, England)에 따라 어플라이드 바이오시스템스 380B 올리고뉴클레오티드 합성기 상에서 포스포르아미다이트 약품을 사용하여 합성하였다.

[실시예 1]

HSA(1-389)를 코우드화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의한 HSA(1-387)의 생성

HSA 분비신호 및 389 번째 아미노산인 라이신을 포함하는 성숙 HSA까지를 코드화하는 DNA가 맥주효모균(S.cerevisiae) 포스포글리세레이트 키나제 유전자(PGK) 촉진유전자(promoter)의 아래쪽에 놓여 있으며 이어서 전사의 중지 코돈과 PGK 종결유전자(terminator)가 놓여 있는 발현 벡터를 제조하였다. 그리고 나서 이 벡터를 형질전환에 의하여 맥주 효모균(S. cerevisiae)안에 도입하고 HSA의 N-말단 389 아미노산을 나타내는 분자를 세포로부터 발현 및 분비되도록 지시하였다.

올리고뉴클레오티드를 합성하였다 (링커 1). 그것은 PstI 부위(1092, 제2도)로부터 발린 831에 대한 코돈(그 코돈은 GTG에서 GTC로 변화되었다)까지의 공지된 HSA 코딩 서열의 부분을 나타냈다 :

[링커 1]

링커 1을 PstI과 HincII로 소화시킨 벡터 M13mp19(Norrander et al, 1983)에 연결하고 연결 혼합물을 대장균(E. coli) 균주 XL1-블루(Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 재조합체 클론을 그것들이 IPTG(이소프로필티오-β-갈락토시드)의 존재하에 발색 지시가 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인　돌릴-β-D-갈락토시드)함유 배지상에서 푸른색을 전개시키지 못한다는 것으로써 확인하였다. 재조합체 클로의 박테리오파지 입자로부터 제조된 주형 DNA의 DNA 서열 분석은 mHOB12(제3도)로 명명된, 소정의 DNA서열이 있는 분자를 확인하였다.

MBmp19.7은 M13mp19(Norrander et al, 1983)안에 성숙 HSA의 코딩영역으로 구성되며 따라서 HSA의 첫 번째 아미노산에 대한 코돈인 GAT는 유일한 XhoI 부위와 중첩한다:

(EPA No. 210239 Al). M13mp19.7을 XhoI으로 소화하여 S1-뉴클레아제 처리에 의해 플러쉬-말단(flush-ended)으로 만든후 다음의 올리고뉴클레오티드 (링커 2)와 연결시켰다:

[링커 2]

그리고 나서 연결 혼합물을 대장균(E. coli) XL1-블루를 형질전환하기 위해 사용하고 여러 가지 플라크로부터 주형 DNA를 제조한 후 DNA 서열분석에 의하여 분석하여 정확한 서열의 클론, pDBD1(제4도)을 확인하였다.

HSA 코딩영역의 5' 말단과 삽입된 올리고뉴클레오티드 링커의 ½을 나타내는 HindIII에서 PstI까지의 1.1kb 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의하여 pDBD1으로부터 단리하였다. 그리고나서 단편을 HindIII와 PstI으로 앞서 소화하여 놓은 이중 스트란드의 mHOB12와 연결하고 연결 혼합물을 대장균(E. coli) XL1-블루를 형질전환하기 위하여 사용하였다. 단일 스트란드의 주형 DNA를 여러개의 플라크의 성숙 박테리오파지 입자로부터 제조하였다. DNA를 삼인산 데옥시뉴클레오시드의 존재하에 DNA 중합효소I의 클레노우 단편으로 아닐된(annealed) 서열화 프라이머로부터 확장함으로써 시험관내에서 이중 스트란드로 만들었다. 이 DNA의 제한효소 분석은 정확한 입체배치(configuration)를 가지는 클론, mHOB15(제4도)의 확인케 하였다.

다음의 올리고뉴클레오티드(링커 3)는 성숙 HSA의 382번째 아미노산에 대한 코돈(글루탐산염, GAA)으로부터 라이신 389에 대한 코돈까지와 이어서 중지 코돈(TAA)과 HindIII 부위 및 BamHI 코헤시브(cohesive) 말단을 나타낸다 :

[링커 3]

이것을 앞서 HincII와 BamHI으로 소화하여 놓은 이중 스트란드 mHOB15에 연결하였다. 연결 후에 DNA를 HincII로 소화하여 모든 비-재조합 분자를 파괴한 후 대장균(E. coli) XL1-블루를 형질전환하기 위해 사용하였다. 단일 스트란드 DNA를 많은 클론의 박테리오파지 입자로부터 제조하고 그것에 대해 DNA 서열 분석을 행하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 하나의 클론을 mHOB16으로 명명하였다(제4도).

성숙 HSA 코딩영역이 HSA 분비신호에 융합되어 있는 분자를 BamHI과 XhoI으로 소화된 M13mp19.7에 링커 4의 삽입에 의해 만들어 pDBD2를 형성하였다(제5도):

[링커 4]

이 링커에서 개시(initial) 메티오닌 다음의 4번째 아미노산에 대한 코돈인, HSA pre-pro 리더 서열(Lawa et al, 1981)에서는 트레오닌에 대한 ACC는 세린에 대한 AGC로 바뀌어져 HindIII 부위를 만들었다.

이 구조의 5' 말단을 BamHI에서 PvuII까지의 단편으로 제거하고 이중 스트란드 mHOB16의 PvuII에서 BamHI단편(끝을 자른 HSA 유전자의 3' 끝을 나타냄)과 함께 pMA91(Mellor et al, 1983)의 BglII 부위에 연결하여 pHOB31을 형성하였다(제4도). 이 분자는 맥주효모균(S. cereavisiae) PGK 유전자 촉진유전자와 종결유전자 사이에 HSA 분비 신호를 가지므로 유전자의 5' 끝이 촉진유전자에 인접한 끝이 잘려진(truncated) HSA 코딩영역을 함유한다. 분자는 또한 효모 형질전환에 대한 선택가능 마커, LEU2 및 효모에서 자치 복제를 허용하는 효모 2㎛ 플라스미드의 일부를 함유한다.

플라스미드 pHOB31을 표준 과정(Beggs, 1978)을 사용하여 형질전환함으로써 맥주효모균 AH22(Hinnen et al, 1978)에 도입하였다. 정제된 형질전환체를 YEPD 브로스(1% 효모 추출물, 3%펩톤, 2%글루코스)에서 3일동안 30℃에서 성장시킨 후 배양 상징액을 계속해서 로케트 겔 전기영동에 의하여 HSA-관련물질의 존재에 대하여 분석하였다. 제5도는 전기영동사진을 도시한다 : HSA(1-389)를 코드화하는 플라스미드를 은닉하고 있는 형질전환체로부터의 HSA-관련물질의 수율은 성숙, 천연 HSA를 분비하는 형질전환체로부터의 수율보다 높은 것이 증명된다.

그러나, HSA(1-389)의 생성은 아미노-말단과 카르복시-말단 서열분석 두 가지에 의하여 HSA(1-387)(실시예 2 참조)과는 구별할 수 없는 생성물을 제공하였다. 이것은 아마도 COOH-말단 서열 Ile-Lys의 효과적인 제거에 의하여 설명될 것이다.

[실시예 2]

HSA(1-387

HSA(1-387)을 코드화하는 플라스미드의 제조는 HSA(1-389) 플라스미드, pHOB31의 제조과정과 동일하였다. 단, 링커 3을 성숙 HSA의 382번째 아미노산에 대한 코돈(글루탐산염, GAA)에서 중지코돈 및 HindIII 부위와 BamHI 코헤시브 말단이 이어져있는 로이신 387에 대한 코돈까지의 영역을 나타내는 링커 5(아래, 제시함)로 치환하였다:

[링커 5]

제조과정의 나머지는 pHOB31에 대해 상술한 것과 같으며, 그 결과 플라스미드 pDBD5가 형성되었다.

[실시예 3]

HSA(1-369)

HSA(1-369)를 코우드화하는 플라스미드를 제조하기 위하여, 성숙 HSA의 PstI 부위(위치 1092, 제3도)로부터 중지코돈(TAA), HindIII 부위 및 그뒤에 BamHI 코헤시브 말단이 이어지는 시스틴 369에 대한 코돈까지의 영역을 나타내는 링커를 합성하였다 :

[링커 6]

이 링커를 preproHSA의 5'부분을 나타내는 pDBD2의 BamHI PstI단편과 함께 pMA91의 BglII부위에 연결하였다. 정확한 입체배치의 플라스미드를 pDBD3(제6도)으로 명명하였다. pDBD3로 형질전환된 맥주효모균(S. cerevisiae)을 배양함에 의한 HSA(1-369)의 생성은 저수율로 나타났으며, 이것은 생성물이 사용한 효모 발현 시스템에서 불안정할 것이라는 것을 가리킨다.

[실시예 4]

HSA(1-419)

HSA(1-419)를 코드화하는 플라스미드의 제조를 위하여 pDBD2의 BamHI-HincII 단편을 아닐된 자체-상보 올리고뉴클레오티드(링커 7):

[링커 7]

와 연결한 후 연결 혼합물을 BanHI으로 소화하고 그 단편을 pMA91에 연결하여 pDBD4(제7도)를 얻었다. 이 구조에서 pDBD2의 HincII 부위(1256, 제3도)는 세린 419에 대한 코돈의 두 번째 염기 뒤에서 블런트 끝을 만들며 이 코돈은 링커 6에 의해 재형성되어 이 코돈뒤에 중지 코돈, HindIII 부위 및 BanHI 부위가 이어진다.

맥주효모균(S. cerevisiae)에서 플라스미드 pDBD5를 경유하는 HSA(1-419)의 발현은 정확한 아미노 말단 서열(Asp-Ala-His....)을 가지는 분자를 생성하였지만 로이신과 세린은 COOH-말단 잔기가 아니었다. 시스테인 392에 부착되어야 하는 공유 표지를 사용하여 COOH-말단 펩티드를 단리하기 위한 시도는 또한 성공적이지 못하였다. HSA(1-419)의 COOH-말단 부분의 단백질분해가 있어났다고 결론지었다. 이것은 유사한 방식으로 효모에서 생성된 전체-길이 HSA의 동일 위치에서의 작은 백분율(%)의 단백질분해의 관찰과 일치한다. (Sleep et al, 1988).

[실시예 5]

HSA(1-n) 플러스-생성 효모의 발효

실험실 발효기를 114g/ℓ의 KH₂PO₄, 12g/ℓ의 MgSO₄, 3.0g/ℓ의 CaCl₂·6H₂O, 2.0g/ℓ의 Na₂EDTA를 함유하는 염 혼합물 50㎖/ℓ; 3g/ℓ의 ZnSO₄·7H₂O, 10g/ℓ의 FeSO₄·7H₂O, 3.2g/ℓ의 MnSO₄·4H₂O, 79㎎/ℓ의 CuSO₄·5H₂O, 1.5g/ℓ의 H₃BO₃, 0.2g/ℓ의 KI, 0.5g/ℓ의 Na₂MoO₄·2H₂O, 0.56g/ℓ의 CoCl₂·6H₂O, 75㎖/ℓ의 H₃PO₄를 함유하는 미량원소 용액 10㎖/ℓ; 20g/ℓ의 슈크로스; 1.6g/ℓ의 Ca 판토테네이트, 1.2g/ℓ의 니코틴산, 12.8g/ℓ의 m-이노시톨, 0.32g/ℓ의 티아민 HCl 및 8㎎/ℓ의 피리독신 HCl을 함유하는 비타민 혼합물 50㎖/ℓ와 8㎎/ℓ의 비오틴을 함유하는 초기 배치(batch) 배지로 그의 액면 작동 부피의 ½까지 충전한다. 100㎖/ℓ의 염 혼합물, 20㎖/ℓ의 미량원소 용액, 500g/ℓ의 슈크로스 및 100㎖/ℓ의 비타민용액을 함유하는 같은 부피의 공급 배지를 계측 펌프에 의해 발효기에 연결된 분리 저장기에 넣어둔다. 발효기를 실시예 2로부터의 플라스미드 pDBD3로 상기와 같이 형질전환되어 있는 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)으로 접종시켰다. pH를 암모니아 또는 황산의 자동 첨가에 의하여 5.7±0.2에서 유지시키고, 온도를 30℃에서 유지하며 교반속도를 1 부피/부피/분(v/v/min) 공기 유속에서 20%이상 공기 포화의 용존산소 장력(DOT)을 제공하도록 조정한다. 초기 기질이 소모되면 성장률을 대략 0.15h^-1로 유지하면서 계측펌프를 작동시킨다. 펌프속도는 최소값이 일어날 수 있는 15% 공기 포화 이하로 DOT가 떨어지는 것을 유발하지 않으면서 더 이상의 펌프속도가 증가되지 못하는 그것의 최대값에 교반속도가 이를 때까지 이 성장속도를 유지하도록 증가시킨다. PPG 2000을 발포 센서(foam sensor)에 대응하여 첨가한다. 공급 용액의 50% 이상이 첨가될때까지 아무것도 첨가하지 않는다. 첨가의 최종 수준은 0.2g/ℓ이다.

[실시예 6]

HSA(1-387)에의 빌리루빈의 결합

헴(haem) 대사물인 빌리루빈의 HSA(1-387)에의 결합을 형광 증강법(Beaven and Gratzen (1973) Eur. J. Biochem. 33, 500-510)에 의하여 수행하였다. 제8도는 단백질/빌리루빈 비율의 함수로서의 빌리루빈 형광의 증강이 HSA(1-387)과 임상(Clinical) 등급(grade) HSA에 대해 구별할 수 없는 것임을 나타낸다.

HSA와 빌리루빈의 상호작용은 단백질의 구조에 매우 민감하고(Beaven and Gratzen, loc. cit.) 이들 결과는 HSA(1-387)에 의해 표시되는 HSA의 영역의 구조에 있어서 전체(gross) 변경이 보다 짧은 분자의 발현을 통해 일어나지 않았음을 가리킨다.

[실시예 7]

HSA(1-387)의 팽창(oncotic) 행동

HSA(1-387을 0.9% 중량/부피 식염수중에서 최종 농도가 54㎎/㎖이 되도록 농축하였다. 이 농축물의 희석액을 임상 등급 HSA의 희석액(100㎎/㎖)과 함께 콜로이드 삼투압계에서 삼투 효과에 대해 비교하였다. 제9도는 HSA(1-387)이 주어진 단백질 농도에서 전체-길이 HSA의 삼투압보다 대략 더 높은 콜로이드 삼투압을 제공하는 것을 나타낸다. 단백질 농도에 따른 콜로이드 삼투압의 증가는 혈장에서의 농도를 나타내는 5% 중량/부피(w/v)까지의 범위에 걸쳐 대략 선형이라는 것이 중요하다.

이것은 HSA(1-387)이 유용한 작동 임상 농도 범위내에서 평가할 수 있을 정도로 자체 연합하지 않는 것을 가리킨다.

[실시예 8]

주사용 형상화

본 발명의 HSA(1-n) 플러스는 20㎖에서 500㎖까지 크기 범위의 용기에 있을 수 있고, 그의 농도는 전형적으로 2%에서 17%, 예를 들면, 3%, 13% 또는 17%로 변화한다.

투여용 용액은 멸균되고 발열물질이 없다.

3% 용액은 삼투적으로 인간 혈장과 유사하다. 총 단백질의 최소한 96%가 아마도 알부민일 것이다. 나트륨 이온 함량은 일반적으로 130-160 mmol/ℓ 사이이고 칼륨이온 함량은 일반적으로 2mmol/ℓ보다 많지 않다. pH는 6.9±0.5로 조정한다. 시트르산염의 농도는 일반적으로 2mmol/ℓ이하이며 전혀 없을 수도 있다.

안정화제, 예를 들어 0.16mmol의 나트륨 아세틸 트립토판 에이트, 또는 0.08mmol의 나트륨 아세틸 트립토판에이트의 어느 하나 및 HSA(1-n) 플러스의 그램당 0.08mmol의 나트륨 카프릴레이트가 사용될 수 있다.

[참고문헌]

Claims

포유동물의 혈류에 투여되었을 때 유용한 수준의 팽창잠재력을 갖는 인간 혈청 알부민의 N-말단에서 387번 아미노산 잔기까지의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드와 80% 이상 상동인 변이체 폴리펩티드.
제1항에 의한 폴리펩티드와, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것으로서 쇼크, 화상, 성인 호흡기질환 및 심폐부작용의 치료에 사용되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 플라스미드는 유전자 재조합 기법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.