HU209145B - Method for preparing medical preparatives containing fragment (1-387) of human serum albumine and for producing the active agent as well - Google Patents

Method for preparing medical preparatives containing fragment (1-387) of human serum albumine and for producing the active agent as well Download PDF

Info

Publication number
HU209145B
HU209145B HU885627A HU562788A HU209145B HU 209145 B HU209145 B HU 209145B HU 885627 A HU885627 A HU 885627A HU 562788 A HU562788 A HU 562788A HU 209145 B HU209145 B HU 209145B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hsa
human serum
amino acid
polypeptide
producing
Prior art date
Application number
HU885627A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT47977A (en
Inventor
David James Balance
Michael John Geisow
Edward Hinchlife
Jamessenior Peter
Original Assignee
Delta Biotechnology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Delta Biotechnology Ltd filed Critical Delta Biotechnology Ltd
Publication of HUT47977A publication Critical patent/HUT47977A/hu
Publication of HU209145B publication Critical patent/HU209145B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

A találmány tárgya eljárás új, a humán szérum albumin (HSA) hatású, hatóanyagként a humán szérum albumin minosav-szekvenciájának N-terminális 1-387 aminosav-egységének megfelelő polipeptidet vagy ennek a természetes szekvenciától az aminosavak legfeljebb 5 %-ában eltérő variánsát tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, valamint új eljárás az említett készítmények hatóanyagaként alkalmazott, önmagában ismert polipeptidnek, a humán szérum albumin N-terminális 1-387 aminosav egységet tartalmazó HSAfragmentumnak és az aminosavak legfeljebb 5%-ában eltérő variánsainak az előállítására.
A humán szérum albumin (HSA) a legnagyobb mennyiségben előforduló plazma-fehérje, amely a plazma összes fehérjéjének 60%-át (tömeg/tömeg) alkotja. A HSA molekula 66 500 molekulatömegű, 585 aminosavból álló, egyedi, nem glikozilezett polipeptid lánc. A HSA aminosavszekvenciáját fehérje szekvenciaelemzéssel állapították meg [Meloun és munkatársai: „Complete amino acid sequence of humán serum albumin”, FEBS Letters, 58 (1), 136-137 (1975); Behrens és munkatársai: „Structure of humán serum albumin”, Fed. Proc. 34,591(1975)], az utóbbi időben genetikai elemzéssel is [Lawn és munkatársai: Nucleic Acids Research 9, 6102-6114 (1981)]. Bár vannak bizonyos ellentmondások a buplikált aminosavszekvenciák között (amelyek közül néhány polimorfizmusnak tulajdonítható), az 1. ábra képviseli azt az aminosavszekvenciát, amelyről most úgy véljük, hogy az emberi populáción belül jelen levő HSA-t legjobban jellemzi.
Viszonylag kis molekulatömege és fiziológiás pHnál nettó negatív töltése miatt [Peters „Serum albumin”, Adv. Clin. Chem. 13, 37-111 (1970)], a HSA alkotja a normál plazma ozmotikus hatásának 85%-át. így a HSA a plazmatérfogat fő szabályozója. A HSAnak egy másodlagos szerepe az, hogy megköti a katabolikus folyamatok által termelt kis molekulákat (pl. zsírsavakat és bilirubint). Az albumin képezi a fő eszközt ezeknek a kulcs-metabolitoknak a szállításában, amelyek fiziológiás pH-nál gyengén oldódnak. A HSA fizikai, kémiai, immunológiai és korlátozott proteolitikus tanulmányai azt mutatják, hogy a molekula polipeptid láncok területeiből tevődik össze, amelyek megtartják konformációjukat a szülő molekulától enzimatikus úton való elkülönítésük után is. Ezek a polipeptid láncok megőrzik kötő kapacitásukat, ezáltal a kötőhelyek térképezését teszik lehetővé bilirubinhoz, zsírsavakhoz és más molekulákhoz a polipeptid lánc adott területénél [Kragh-Hansen: „Molecular aspects of ligand binding to serum albumin”, A. Soc. Pharm. Expt. Ther. 33(1), 17-53 (1981)]. Ezen a területen már sok információt adtak meg összefoglaló munkákban (pl. Brown és Shockley: „Serum albumin: structure and characterisation of its ligand binding sites” (1982)].
A HSA terápiás koncentrációjának klinikai alkalmazásánál az indikációk főleg ennek térfogat-szabályozó tevékenységére vonatkoznak, vagyis plazma-térfogat kiterjesztőként működhetnek. HSA koncentrátumokat az 1940-es évek óta alkalmaznak terápiásán, főleg sebek, égések, felnőttek légzési szorongási szindrómája és szív-tüdő keringési zavarok esetében. Albumint alkalmaznak akut máj-panaszok esetén, cirrhózisos betegekből aszcitesz folyadék eltávolítása után, műtét után, akut nephrózisban, vesedialízisben, valamint alkalmazzák szállító fehérjeként toxikus anyagok eltávolításában, pl. újszülöttek hemolitikus betegségében, a súlyos sárgaságban.
Terápiás szerként történő alkalmazásán kívül a HSA a fő komponense az emlős sejtek szövettenyészetben való tenyésztését lehetővé tevő tápközegeknek. A szérum és ezáltal az albumin fogyasztása nagymértékben megnövekedett az elmúlt években, mivel a biotechnológia és a gyógyszergyárak jelentősen kiterjesztették tevékenységüket a szövettenyésztésben, kísérleti és termelési célokra egyaránt. Ezért általános igény van arra, hogy kisebb költséggel és jobb szabályozhatósággal szérum álljon rendelkezésre.
Ismeretes, hogy már végeztek műveleteket HSA-t kódoló DNS szekvenciával, hogy rekombináns polipeptidet fejezzenek ki mikroorganizmusokban. Termeltek is már ilyen rekombináns HSA polipeptidet baktérium-fajokban, pl. Escherichia coliban (2147903B lajstromszámú nagy-britanniai szabadalmi leírás) és Bacillus subtilisben (86 304 656.1 számú európai szabadalmi bejelentés), valamint Saccharomyces cerevisiae élesztőben (201239 számú európai közzétételi irat, Delta Biotechnology Ltd.); így lényegében elfogadhatjuk, hogy a természetes HSA-val lényegében azonos rekombináns polipeptid termelhető egy sor mikrobiológiai gazdaszervezetben, ismert módszerek alkalmazásával. Minden esetben azonban, ahol rekombináns HSA-t termelnek, a tárgy az, hogy szerkezetében és biológiai funkciójában HSA-val „természetazonos” molekulát állítsanak elő.
A találmány alapját az a felismerésünk képezi, hogy a humán szérum albumin hatásával egyenértékű gyógyászati hatást érhetünk el, ha az eddig gyógyászatilag alkalmazott teljes szekvenciájú humán szérum : albumin helyett annak egy lényegében rövidebb, az N-terminális 1-387 aminosav-egységét tartalmazó fragmentumát alkalmazzuk.
A „humán szérum albumin” kifejezést úgy alkalmazzuk, hogy magában foglalja a HSA összes eddig felfedezett polimorf formáit, de nemcsak ezekre korlátozódik. így pl. Naskapi albuminja Lys-372-vel rendelkezik Glu-372 helyett, és Christchurch pro-albuminjának megváltozott pro-szekvenciája van. A „variáns” kifejezés jelentése a megadott polipeptid olyan változatait foglalja magában, amelyek aminosav-szekvenciája az aminosavak legfeljebb 5%-ában tér el az eredeti polipeptid szekvenciájától; „különbözés” egy vagy több aminosav hiányát vagy más aminosavval való helyettesítését jelenti. Az ilyen variánsok közül azok előnyösek, amelyek fiziológiailag ekvivalensek az eredeti polipeptiddel, vagyis amelyek azzal azonos farmakológiai és terápiás felhasználásra alkalmasak lehetnek. Ezen kívül bármely vélt variánsnak, amelyet farmakológiai célra kívánnak alkalmazni, nem-immu2
HU 209 145 Β nogénnek kell lennie a kezelendő állatban, de főleg emberben.
A konzervatív (hagyományos) helyettesítések azok, ahol egy vagy több aminosav olyan más aminosavval van helyettesítve, amelyek hasonló tulajdonságúak, úgyhogy azok, akik a polipeptidek-kémiában járatosak, azt várhatják, hogy a polipeptidnek legalább a szekunder szerkezete is lényegében változatlan marad. Ilyen tipikus helyettesítések magukban foglalják az alanin vagy valin helyettesítését glicinre, arginin vagy aszparagin helyettesítését glutaminra, szerin helyettesítését aszparaginra és hisztidin helyettesítését lizinre. Variánsok lehetnek pl. olyanok, amelyekből legfeljebb 10 (előnyösen 1 vagy 2) aminosavgyök hiányzik; előnyösen az ilyen kihagyások a molekula 100-369. közti részén fordulnak elő (az érett HSA számozásához viszonyítva). Hasonlóképpen legfeljebb 10, de előnyösen 1 vagy 2 aminosav lehet hozzátéve többletként a molekulához, előnyösen szintén a 100-369. közti területen belül.
A találmányunk szerint hatóanyagként alkalmazott HSA(l-387) polipeptid önmagában ismert vegyület, terápiás értékét azonban eddig nem ismerték fel. Gelsow és Beaven [(Biochem. J. 161, 619-624 (1977) és 163, 477-484 (1977)] leírtak egy általuk a természetes HSA-ból kiindulva, csekély termeléssel előállított fragmentumot, amelyet a szerzők eredetileg HSA(l-386)ként azonosítottak, de azóta kitűnt (lásd Lawn és munkatársai fentebb idézett munkáját), hogy a kapott termék valójában HSA(l-387); a szerzők tévedése annak tulajdonítható, hogy ők egy nem korrekt módon publikált szekvencia-információt használtak.
A HSA polipeptid és más fragmentumok előállítására eddig alkalmazott biokémiai módszerek (például a HSA enzimes lebontása) vagy az elvileg szintén lehetséges peptidkémiai szintézis eljárások az ilyen HSA fragmentumok gyakorlati termelésére kevéssé alkalmasak. Ismeretes például egy tripszinszerű enzim, amely a HSA-t a Lys(389) és Glu(390) között hasítja, de ezzel más helyeken történő hasítás is együtt jár. Gazdaságilag sem előnyös a korlátozott mértékben rendelkezésre álló HSA-ból kiindulni és az elérhető termelési hányadok sem kielégítóek. Ezért a találmány értelmében egy új, rekombins DNS-technikán alapuló eljárást dolgoztunk ki a HSA(l-387) előállítására, és azt találtuk, hogy ilyen módon a HSA 1-369 és 1-419 közötti framgentumai, különösen pedig a HSA(l-387) fragmentum igen előnyös módon és kedvező hozammal állíthatók elő.
így a találmány értelmében alkalmazott eljárás szerint valamely alkalmas gazdasejteket, előnyösen a Saccharomyces fajhoz tartozó, például Saccharomyces cerevisiae élesztősejteket önmagában ismert módon a HSA(l-387) fragmentumot kódoló plazmidot tartalmazó vektorral transzformálunk, a transzformált gazdasejteket alkalmas tápközegben tenyésztjük és a kifejezett HSA(l-387) polipeptidet a tápközegből elkülönítjük.
Tapasztalataink szerint ugyancsak a HSA(l-387) polipeptidet kapjuk, ha a gazdasejtet HSA(l-389)-et kódoló peptiddel transzformáljuk, mert a kifejezés során a C-terminális Ile-Lys-COOH csoport enzimes hatásra lehasad.
A HSA( 1-387) szekvenciájú polipeptidet a találmány szerint előnyösen alkalmazhatjuk a gyógyászatban a természetben előforduló HSA vagy az azzal egyező szekvenciájú, rekombináns technikával előállított HSA helyett a gyógyászatban plazmatérfogat-növelő szerként. Ez utóbbiakkal szemben a HSA(l-387) előnye különösen a vér kolloid ozmózisos nyomásának hatékonyabb növelésében mutatkozik meg. A HSA(1387) kisebb molekulatömege (mintegy 44 kilodalton) azt jelenti, hogy a természetes HSA-hoz vagy a természetessel azonos rekombináns HSA-hoz viszonyítva csak a fele-kétharmada mennyiségű egyedi fehérjedózis szükséges ekvivalens kolloid ozmotikus hatás elérésére. Következésképpen bármilyen eljárás ennek az új polipeptidnek az előállítására rekombináns DNS technológia segítségével jelentős gazdasági előnyökkel járhat az ismert eljárásokhoz viszonyítva a természetessel azonos rekombináns HSA előállításához, mivel lényegesen kevesebb fehérje-szerű anyag szükséges, hogy hatékony dózist állítsunk elő.
A találmány szerinti HSA(l-387) polipeptid további előnye a természetessel azonos rekombináns HSAval szemben az, hogy tapasztalatunk szerint kisebb molekulaméretük és így csökkent aminosavtartalmuk a kapott kitermelés (molekulák száma sejt szárazanyagra vonatkoztatva) növekedéséhez vezet a mikrobiológiai gazdaszervezetben, összehasonlítva azzal a kitermeléssel, amelyet jelenleg e természetessel azonos rekombináns HSA-nál elérnek. így nem csupán arra jöttünk rá, hogy a folyamat mérete csökkenhet, hanem arra is, hogy a termelékenység növekedhet a rekombináns gazda-organizmusban.
A találmány szerinti polipeptidet alkalmazhatjuk vértágító(plazmabővítő) szerként analóg módon és analóg kiszerelésekben, mint a HSA maga, azzal a feltétellel, hogy a HSA(l-387) polipeptid dózisa (tömegben kifejezve) általában kisebb, mint a HSA dózisa, mivel az előbbinek a térfogatnövelő hatása nagyobb. Az optimális adagolás rutin-módszerekkel könnyen megállapítható. Az adag általában 30-401%kal kisebb lehet a HSA szokásos adagjánál.
' A HSA(l-387) polipeptid a már említett közvetlen gyógyászati alkalmazáson kívül más területeken is előnyösen használható a teljes szekvenciájú HSA helyett; így például (1) HSA vagy általánosabban szarvasmarha szérum albumin (BSA) helyettesítésére szövettenyésztő tápközegekben, ezáltal csökkentve a tápközeg fertőzésének kockázatát pl. vírusokkal és mikoplazmákkal;
(2) BSA helyettesítésére stacioner fázisban, folyadékkromatográfíában enantiomerek reszolválásánál stb.
A találmány tárgyát közelebbről az alábbi példákban és az ezekhez tartozó ábrákon szemléltetjük. Az ábrákat az alábbiakban ismertetjük:
Az 1. ábra a természetes HSA teljes aminosavszekvenciájának jelenlegi ismereteink szerint leghelye3
HU 209 145 Β sebbnek tekintett ábrázolása. A jelen találmány szerint előállított és gyógyászati készítmények hatóanyagaként alkalmazott HSA fragmentum ennek a szekvenciának az N-terminális 1-387. aminosavaiból áll.
A 2. ábra az érett HSA-t kódoló DNS szekvenciát mutatja be.
A 3. ábra folyamatábrában mutatja be az mHOBló megalkotását.
A 4. ábra folyamatábrában mutatja be a pHOB31 megalkotását.
Az 5. ábra egy gyors elektroforetogram másolata, amely a HSA( 1-387) megnövekedett termelését mutatja be a teljes HSA-hoz viszonyítva. Tenyészet felülúszó elemzése S. cerevisiae AH22 transzformánsokból történt, amelyeket a teljes HSA kódoló felületet tartalmazó poliamiddal kaptunk (1-4. minták) és olyan transzformánsokból, amelyek csonkított HSA(l-389)et kódoló ekvivalens poliamidot foglalnak magukba (5-8. minták).
A 6. ábra a HSA és a HSA(l-387) általi bilirubinmegkötésnek a fluoreszcencia megnövekedésének mérése alapján történő meghatározását szemlélteti.
A 7. ábra a fehérjetartalom és a kolloid ozmózisos nyomás összefüggését szemléltető grafikon.
A standart rekombináns DNS eljárások olyanok, amelyeket Maniatis és munkatársai leírtak (1982), hacsak másként nem jelezzük. Az Ml3 rekombináns kiónok megalkotását és elemzését úgy végezzük, amint ezt Messing (1983), valamint Sanger és munkatársai (1977) leírták.
1. kapcsoló
D P Η E C Y A 5’ GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC
3’ ACGT CTA GGA GTA CTT ACG ATA CGG
1100
F K P L V
TTT AAACCT CTT GTC 3’
AAA TTT GGA GAA CAG 5’
Az 1. kapcsolót az M13mpl9 vektorba [Norrander és munkatársai (1983)] ligáljuk, amely vektort előzőleg Pstl-gyel és HincII-vel emésztettünk, és a ligálási keveréket használjuk E. coli XLl-Blue törzs (Stratagene Cloning Systems, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) átfertőzésére. A rekombináns kiónokat annak alapján azonosítjuk, hogy ezek nem fejlesztenek ki kék színt olyan tápközegen, amely az X-gal kromogén indikátort (5-bróm-4-klór3-indolil-P-D-galaktozid) tartalmazza] IPTG (izoAz ezután leírt molekulák megalkotásában alkalmazott humán szérum albumin kódoló szekvencia az M13 mp 19.7 plazmidból származik (201239 számú európai szabadalmi bejelentés, Delta Biotecnology 5 Ltd.) vagy olyan oligonukleotidok szintéziséből, amelyek ekvivalensek ennek a szekvenciának a részeivel. Az oligonukleotidokat foszforamidit kémiai módszert alkalmazva szintetizáljuk Applied Biosystems 380B oligonukleotid szintetizáló berendezést alkalmazva, a gyártó útmutatása szerint (AB Inc., Warrington, Cheshire, Anglia).
I. példa
Olyan kifejező vektort alkotunk meg, amelyben a 15 HSA kiválasztó szignált és az érett HSA-t a 389. aminosavig, a lizinig (ezt is beleértve) kódoló DNS van behelyezve az S. cerevisiae foszfoglicerát kináz gén (PGK) promotortól lefelé, ezt egy stop kodon követi, majd az átírás PGK terminátora. Ezt a vektort azután transzformálással S. cerevisiae-ba vezetjük be és így egy olyan molekula kifejeződését és sejtekből való kiválasztódását irányítjuk, amely a HSA 389 N-terminális aminosavat képviseli.
Egy olyan oligonukleotidot szintetizálunk (1. kap25 csoló), amely az ismert HSA kódoló szekvencia (2. ábra) egyik részét képviseli a Pstl helytől (1092. a 2. ábrán) a 381. valinhoz tartozó kodonig, ahol ez a kodon GTG-ről GTC-re van változtatva.
K V F D E
AAAGTG.TTC GAT GAA TTT CÁC ÁAG CTA CTT
1120 propil-tio-É-galaktozid) jelenlétében, A rekombináns kiónok bakteriofág részecskéiből készített templát
DNS-szekvencia elemzése olyan molekulát azonosít, amely- az igényelt DNS szekvenciával rendelkezik; ezt mHOB 12-nek nevezzük (3. ábra).
Az M13mpl9.7 az érett HSA M13mpl9-ben lévő ; kódoló területét tartalmazza (Norrander és munkatár5Q sai, 1983) úgy, hogy a HSA elsőaminosavához tartozó kodon, a GAT, átfed egy egyedi Xhol helyet; ez tehát az alábbi képletű _Asp Alá
5’ |C + T C G A G|A T G C A
3’ ]G A G C TfC|T ACGT
Xhol (lásd a 210239 Al európai szabadalmi bejelentést). Az M13mpl9.7-et Xhol-gyel emésztjük, SÍ
3’
5’ nukleázos kezeléssel tompa végűvé tesszük, majd az 60 alábbi oligonukleotiddal ligáljuk (2. kapcsoló).
HU 209 145 Β
2. kapcsoló
5’TCTTTTATCC |A+A G C T T |G GAT A A A A G A 3’ 3’AGAAAATAGG |T T C G AtA|C CTATTTTCT5’
HindUI
A ligálási keveréket használjuk azután E. coli XL1Blue átfertőzésre és templát DNS-t készítünk több tarfoltból, majd elemezzük ezeket DNS szekvencia-elemzéssel, hogy egy kiónt, a pDBDl-et azonosítsunk (3. ábra), amely a korrekt szekvenciával rendelkezik.
Egy 1,1 kb-s HindlII-PstI fragmentumot, amely a HSA kódoló terület 5’ végét és a beiktatott oligonukleotid kapcsoló felét képviseli, izolálunk a pDBDl-ből agaróz gélelektroforézissel. Ezt a fragmentumot azután kettős szálú mHOB 12-vel ligáljuk, amelyet előzőleg HindlII-mal és Pstl-gyel emésztettünk, és ezt a ligálási keveréket használjuk ezután E. coli XLl-Blue átfertőzésére. Egyszálú templát DNS-t állítunk elő több tarfolt érett bakteriofág részecskéiből. A DNS-t in vitro kettős szálúvá tesszük az összeforrasztott szekvencia-képző primer kiterjesztése révén DNS polimeráz I Klenow fragmentummal dezoxinukleotid trifosz10 fátok jelenlétében. Ennek a DNS-nek a restrikciós enzimes elemzése lehetővé teszi egy olyan klón azonosítását, amely korrekt konfigurációval rendelkezik; ez az mHOB 15 (3. ábra).
Az alábbi oligonukleotid (3. kapcsoló) képviseli az érett HSA-t a 382. aminosavjához tartozó kodontól (glutamát, GAA) a 389. lizinhez tartozó kodonig, amelyet egy stop kodon (TAA), egy HindUI hely, és végül egy BamHI kohezív vég követ.
3. kapcsoló
E E P Q N L I KJ 5’ GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA TAA GCTTG 3’
3’ CTT CTC GGA GTC TTA AAT TAG TTT ATT CGAACCTAG 5’
Ezt kettős szálú mHOB 15-be ligáljuk, amelyet előzőleg Hindi-vei és BamHI-gyel emésztettünk. Ligálás után a DNS-t HincII-vel emésztjük, hogy elroncsoljunk minden nemrekombináns molekulát, majd ezt E. coli XLl-Blue átfertőzésére használjuk. Egy sor klón bakteriofág részecskéiből egyszálú DNS-t készítünk, és DNS szekvenciaelemzésnek vetjük alá. Az egyik kiónt, amely a korrekt DNS szekvenciával bír, mHOB16-nak nevezzük el. (3. ábra).
Egy molekulát alkotunk meg, amelyben az érett
4. kapcsoló M κ W V S F I S
5GATCC ATG AAG TGG GTA AGC TTT ATT TCC
G TAC TCC ACC CAT TCG AAA TAA AGG
F S S A Y S R G V
TTT AGC TCG GCT TAT TCC AGG GGT GTG
AAA GCG AGC CGA ATA AGG TCC CCA CAC
HSA kódoló terület fuzionálva van a HSA kiválasztó szignálhoz, ezt úgy végezzük el, hogy az alábbi 4. kapcsolót beiktatjuk a BamHI-gyel és Xhol-gyel emésztett M13mpl9.7-be, így képezve a pDBD2-t. Ebben a kapcsolóban az induló aminosav, a metionin utáni negyedik aminosavhoz tartozó kodon, amely a HSA pre-pro vezető szekvenciában a treoninhez tartozó ACC (Lawn és munkatársai, 1981), a szerinhez tartozó AGC-re változik, hogy HindUI hely jöjjön létre.
L L F L
CTT CTT TTT CTC GAA GAA AAA GAG
F R R
TTT CG 3’
AAA GCAGCT 5’
A fenti konstrukciónak az 5’ végét BamHI-PvuII fragmentumként eltávolítjuk és ligáljuk a kettős szálú mHOB 16 PvuII-BamHI fragmentumával (amely a megcsonkított HSA gén 3’ végét képviseli) együtt pMA91-be (Mellor és munkatársai, 1983) a BglII helynél, hogy a pHOB31-et alakítsuk ki (4. ábra). Ez 50 a molekula tartalmazza a megcsonkított HSA kódoló területet a S. cerevisiae PGK gén promoter és terminátor közti HSA kiválasztó szignállal együtt úgy, hogy a gén 5’ vége illeszkedik a promotorhoz. A molekula tartalmaz egy szelektálható markert, a LEU2-t 55 is az élesztő transzformációhoz, valamint tartalmazza az élesztő 2 gm plazmid egy részét is, hogy lehetséges legyen az autonóm replikáció élesztőben.
A pHOB31 plazmidot S. cerevisiae AH22-be vezetjük be (Hinnen és munkatársai, 1978) transzfor- 60 mációval, standard eljárásokat alkalmazva (Beggs, 1978). A tisztított transzformánsokat YEPD tápközegen (1% élesztőkivonat, 2% pepton, 2% glükóz) növesztjük 3 napon át 30 °C hőmérsékleten, és ezután a tenyészet felülúszót elemezzük, sikeresen HSA-val rokon anyag jelenlétére, gyors („rakéta”) gélelektroforézissel. Az 5. ábra mutatja be az elektroforetogramot: a HSA-val rokon anyag kitermelése azokból a transzformánsokból, amelyek HSA (1389)-et kódoló plazmidot foglalnak magukban, kimutathatóan nagyobb, mint a kitermelés azokból a transzformánsokból, amelyek érett, természetes HSA-t választanak ki.
Annak ellenére, hogy ebben a példában a gazdasejtet HSA(389)-et kódoló plazmiddal transzformáltuk, a kapott termék nem ez, hanem HSA( 1-387) polipeptid.
HU 209 145 Β
Ez az eredmény annak tulajdonítható, hogy a kifejezett polipeptid karboxil-terminális Ile-Lys-COOH végcsoportja a kifejezés során enzimes lehasítást szenved.
2. példa
A HSA(l-387)-et kódoló plazmid megalkotása azonos a HSA( 1-389) plazmidnak, a pHOB31-nek a megalkotásához alkalmazott eljárással, azzal a kivétellel, hogy a 3. kapcsolót az 5. kapcsolóval (lásd alább) helyettesítjük, amely kapcsoló az érett HSA egyik területét kódoló szekvenciát a 382. aminosavat kódoló ko5 dontól (glutamát, GAA) a 387. leucint kódoló kodonig, tartalmazza, ezt követi egy stop kodon, egy Hindlll hely, végül egy BamHI kohezív vég.
5. kapcsoló
Ε Ε P Q N L Stop 5’ GAA GAG CCT CAG AAT TTA TAA GCTTG 3’
3’ CTT CTC GGA GTC TTA AAT ATT CGAACCTAG 5’
A konstrukció további része az, amelyet fentebb, a pHOB31-nél már részleteztünk, és amely a pDBD5 plazmidot eredményezi.
3. példa
A termelő törzs fermentációja
Laboratóriumi fermentort névleges térfogatának feléig töltünk fel induló „szakaszos” tápközeggel, amely 50 ml/1 sókeveréket (114 g/1 KH2PO4; 12 g/1 MgSO4; 3,0 g/1 CaCl2xCH2O; 2,0 g/1 NA2 EDTA), 10 ml/1 nyomelemoldatot (3 g/1 ZnSO4x7 H2O; 10 g/1 FeSO4x7 H2O; 3,2 g/1 MnSO4x4 H2O; 79 mg/1 CuSO4x5 H2O; 1,5 g/1 H3BO3; 0,2 g/1 KI; 0,5 g/1 Na2MoO4x2 H2O; 0,56 g/1 COCl2x6 H2O és 75 ml/1 H3PO4), 20 g/1 szacharózt és 50 ml/1 vitamin-keveréket (1,6 g/1 Ca-pantotenát; 1,2 g/1 nikotinsav; 12,8 g/1 mozit; 0,32 g/1 tiaminxHCl; 8 mg/1 piridoxinxHCl és 8 mg/1 biotin) tartalmaz.
Egy külön tartályban, amely adagoló szivattyú segítségével összeköttetésben van a fermentorral, azonos térfogatú „tápláló” tápközeget tartunk, amely 100 ml/1 sókeveréket, 20 ml/1 nyomelemoldatot, 500 g/1 szacharózt és 100 ml/1 vitaminoldatot tartalmaz.
A fermentort olyan Saccharomyces cerevisiaevel inokuláljuk, amelyet a fentiek szerint transzformáltunk a 2. példában kapott pDBD3 plazmiddal.A pH-t 5,7±0,2-n tartjuk ammóniaoldat vagy kénsav automatikus adagolásával; a hőmérsékletet 30 °C-on tartjuk, és a keverési sebességet úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén tenzió (DÓT) nagyobb legyen, mint 20% levegő telítettség 1 térfogat/térfogat/perc levegő átáramlási sebességnél. Amikor a kiindulási szubsztrátum elfogyott, az adagoló szivattyút bekapcsoljuk, mintegy 0,15 óra-1 növekedési sebességet tartva fenn. A szivattyú sebességét növeljük, hogy ezt a növekedési sebességet fenntartsuk, egészen addig, amíg a keverő sebessége eléri maximális értékét, ekkor már nem lehetséges tovább növelni a szivattyú sebességét anélkül, hogy ne idéznénk elő a levegőtelítettség leesését 15% alá, amely a minimális érték, amelyet még megengedhetünk, hogy előforduljon. A habérzékelő jelzésére PPG 2000 habgátlót adunk. Nem adunk habgátlót addig, amíg a tápláló oldat 50%-át be nem adtuk. Az adagolás végső szintje 0,2 g/1.
A HSA( 1-387) kiválasztódik a tápközegbe.
4. példa
Bitirubin kötődése HSA(I-387)-hez
A hem metabolitjának, a bilirubinnak a kötését HSA(l-387)-hez fluoreszcenciás fokozási módszerrel hajtjuk végre (Beaven and Gratzen: Eur. J. Biochem. 33,500-510(1973).
A 6. ábra azt mutatja, hogy a bilirubin fluoreszcencia, mint a fehérje/bilirubin hányados függvénye, megkülönböztethetetlen a HSA(l-387)-nél és a klinikai minőségű HSA-nál.
A kölcsönhatás a HSA és a bilirubin között nagyon érzékeny a fehérje konformációjára (Beaven és Gratzen idézett munkája), és ezek az eredmények azt jelzik, hogy nem fordul elő nagy változás a HSA( 1-387) által képviselt HSA terület konformációjában egy rövidebb molekula kifejezése során.
5. példa
HSA(l-387) térfogat-növelő (onkotikus) viselkedése
HSA(l-387)-et koncentrálunk 0,9 tömeg/térfogat%-os konyhasóoldatban 54 mg/ml végső koncentrációra. Ennek a koncentrációnak a hígításait ozmotikus hatás szempontjából összehasonlítjuk klinikai minőségű HSA (100 mg/ml) hígításaival, kolloid ozmométerben. A 9. ábra azt jelzi, hogy a HSA(l-387) olyan kolloid ozmotikus nyomást ad, amely mintegy 1/3-dal nagyobb, mint a teljes hosszúságú HSA-é egy adott fehérje-koncentrációnál. Nagyon fontos az a tény, hogy a növekedés a kolloid ozmotikus nyomásban a fehérje koncentráció függvényében mintegy lineáris az 5% (tömeg/térfogat) arányig terjedő tartományban, amely a plazmában lévő koncentrációt képviseli.
Ez azt jelzi, hogy a HSA(l-387) nem asszociál önmagával méltányolható mennyiségben egy alkalmasan működő klinikai koncentrációtartományban.
x
6. példa
Kiszerelés injekcióhoz
A találmány szerinti HSA(l-387)-et tartály-méretekben lehet kiszerelni a 20 ml és 500 ml közti tartományban, ennek koncentrációja (tipikusan) 2% és 17% között van, pl. 3%, 13% vagy 17%.
A beadáshoz alkalmazható oldat steril és pirogénmentes. A 3%-os oldat ozmotikusán hasonló a humán plazmához. A teljes fehérjének előnyösen legalább
HU 209 145 Β
96%-a albumin. A nátrium-ion tartalom általában 130-160 mmól/liter és a kálium-ion tartalom általában nem több, mint 2 mmól/liter. A pH-t 6,9 + 0,5-re állítjuk be.
A citrát koncentrációja általában nem több, mint 20 mmól/liter és teljesen távol is maradhat.
Stabilizálókat is lehet alkalmazni, pl. 0,16 millimól nátrium-acetil-triptofanátot, vagy 0,08 millimól nátrium-acetil-triptofanátot, vagy 0,08 millimól nátrium kaprilátot 1 gramm HSA(l-n) pluszra számítva.
Az alábbiakban pontosítjuk a szöveg közi referenciák irodalmi helyeit.
Beggs J. D. Natúré, 275, 104-109 (1978).
Brown J. R. és Shockley P.: a „Lipid-Protein Interactions” című kiadványban, 1, 25-68; (1982) szerkesztők. Hayes O. és Jóst P. C.
Hinnen A. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,1929-1933 (1978).
Lawn R. M. és munkatársai: Nucl. Acid. Rés. 9, 6103-6114(1981).
Maniatis T. és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, New York (1982).
Mellor J. és munkatársai: Gene, 24,1-14 (1983).
Messing J.: Methods Enzymol. 101, 20-78 (1983).
Norrander J. és munkatársai: Gene, 26, 101-106 (1983).
Sanger F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,5463-5467 (1977).
Sleep D., Belfield G. P. és Goodey A. R.: Yeast, 4, S168 (1988).

Claims (3)

1. Eljárás az érett humán szérum almubin 1. ábra szerinti aminosav-szekvenciája N-terminális 1-387 fragmentumával egyező polipeptid vagy az aminosavak legfeljebb 5%-ában eltérő variánsai előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely élesztő gazdaszervezet, előnyösen Saccharomyces nemzetségbeli gazdasejteket az érett humán szérum albumin aminosavszekvenciájának N-terminális 1-387 vagy 1-389 fragmentumát vagy ezeknek az aminosavak legfeljebb 5%-ában eltérő variánsait kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó vektorral transzformálunk, és a transzformáit gazdasejteket alkalmas tápközegben tenyésztjük, majd a kifejezett polipeptidet elkülönítjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Saccharomyces cerevisiae sejteket alkalmazunk.
3. Eljárás HSA-hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárással előállított N-terminális 1387 fragmentumát vagy ennek valamely, az aminosavak legfeljebb 5%-ában eltérő variánsát gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal és/vagy más gyógyszerészeti segédanyaggal összekeverve HSA-hatású gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
HU885627A 1987-10-30 1988-10-28 Method for preparing medical preparatives containing fragment (1-387) of human serum albumine and for producing the active agent as well HU209145B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB878725529A GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-10-30 Polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT47977A HUT47977A (en) 1989-04-28
HU209145B true HU209145B (en) 1994-03-28

Family

ID=10626211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU885627A HU209145B (en) 1987-10-30 1988-10-28 Method for preparing medical preparatives containing fragment (1-387) of human serum albumine and for producing the active agent as well

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5380712A (hu)
EP (1) EP0322094B1 (hu)
JP (1) JPH02194A (hu)
KR (1) KR0153516B1 (hu)
AT (1) ATE82858T1 (hu)
AU (1) AU619768B2 (hu)
CA (1) CA1341298C (hu)
DE (1) DE3876401T2 (hu)
DK (1) DK175046B1 (hu)
ES (1) ES2053758T3 (hu)
FI (1) FI101381B1 (hu)
GB (1) GB8725529D0 (hu)
GR (1) GR3007162T3 (hu)
HU (1) HU209145B (hu)
IE (1) IE61050B1 (hu)
IL (1) IL88223A (hu)
ZA (1) ZA888118B (hu)

Families Citing this family (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US6406697B1 (en) 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
GB8909916D0 (en) * 1989-04-29 1989-06-14 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US5766883A (en) * 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
ATE92107T1 (de) * 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
GB8927480D0 (en) * 1989-12-05 1990-02-07 Delta Biotechnology Ltd Mutant fungal strain detection and new promoter
US5993805A (en) * 1991-04-10 1999-11-30 Quadrant Healthcare (Uk) Limited Spray-dried microparticles and their use as therapeutic vehicles
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5698517A (en) * 1994-03-21 1997-12-16 University Of Hawaii, Office Of Technology Transfer And Economic Development Thyroxin-binding HSA fragments
US5674842A (en) * 1994-10-26 1997-10-07 Health Research, Incorporated Growth inhibitory peptide
US7820798B2 (en) 1994-11-07 2010-10-26 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US7888466B2 (en) 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
EP0947581A4 (en) * 1996-08-08 2004-07-28 Mitsubishi Pharma Corp CULTURAL MEDIUM AND ITS USE.
US6274305B1 (en) 1996-12-19 2001-08-14 Tufts University Inhibiting proliferation of cancer cells
GB9815909D0 (en) 1998-07-21 1998-09-16 Btg Int Ltd Antibody preparation
EP1121425B1 (en) * 1998-10-13 2005-06-29 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis and use
US20030190740A1 (en) * 1998-10-13 2003-10-09 The University Of Georgia Research Foundation, Inc Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1276849A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
PT2275449T (pt) 2000-06-16 2016-12-27 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
KR20030068536A (ko) * 2000-09-11 2003-08-21 다나-파버 캔서 인스티튜트 Ｍｕｃ1 세포외 도메인 및 이로부터 유래된 암 치료조성물과 방법
SI1724284T1 (sl) 2000-12-07 2009-12-31 Lilly Co Eli Glp-1 fuzijski proteini
US20020110841A1 (en) * 2000-12-22 2002-08-15 KUFE Donald W. Regulation of cell growth by MUC1
US7507413B2 (en) 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050054051A1 (en) * 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20060084794A1 (en) * 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050244931A1 (en) * 2001-04-12 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
DE60236646D1 (de) 2001-04-13 2010-07-22 Human Genome Sciences Inc Anti-VEGF-2 Antikörper
WO2002097033A2 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
WO2003030821A2 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CN105131104B (zh) 2001-10-10 2018-11-16 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合
NZ532027A (en) 2001-10-10 2008-09-26 Neose Technologies Inc Remodeling and glycoconjugation of peptides
EP1463752A4 (en) * 2001-12-21 2005-07-13 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
EP2277889B1 (en) 2001-12-21 2014-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Fusion proteins of albumin and interferon beta
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
KR20040089608A (ko) 2002-02-07 2004-10-21 델타 바이오테크놀로지 리미티드 Ｈｉｖ 억제 단백질
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
GB0217033D0 (en) 2002-07-23 2002-08-28 Delta Biotechnology Ltd Gene and polypeptide sequences
JP2006524036A (ja) 2002-11-08 2006-10-26 アブリンクス エン．ヴェー． 腫瘍壊死因子αを標的とする単一ドメイン抗体およびその使用
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2004092339A2 (en) * 2003-04-11 2004-10-28 Ilex Products, Inc. Modulation of muc1 mediated signal transduction
WO2005042573A1 (en) * 2003-10-24 2005-05-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulation of the interaction of muc1 with muc1 ligands
BRPI0507026A (pt) 2004-02-09 2007-04-17 Human Genome Sciences Inc proteìnas de fusão de albumina
US20070202134A1 (en) * 2004-02-23 2007-08-30 Kufe Donald W Muc1 Antagonist Enhancement of Death Receptor Ligand-Induced Apoptosis
US7973139B2 (en) 2004-03-26 2011-07-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against nogo receptor
US20060204512A1 (en) 2004-09-23 2006-09-14 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
CN101724071A (zh) 2004-10-08 2010-06-09 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
KR20140077946A (ko) 2005-10-13 2014-06-24 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 자가항체 양성 질환 환자의 치료에 유용한 방법 및 조성물
EP2054437A2 (en) 2006-08-07 2009-05-06 Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. Albumin-insulin fusion proteins
EP2615108B1 (en) 2006-09-08 2016-10-26 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and thier uses
US7884184B2 (en) 2007-01-30 2011-02-08 Epivax, Inc. Regulatory T cell epitopes, compositions and uses thereof
US7871784B2 (en) * 2007-02-02 2011-01-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of apoptosis by MUC1 and BH3-containing proapoptotic proteins
US7972870B2 (en) 2007-02-02 2011-07-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of MUC1 by HSF1 and STAT3
US20100183596A1 (en) 2007-04-12 2010-07-22 Hester Jeanette Bootsma Virulence Factors of Streptoccus Pnuemoniae
MX2009011109A (es) 2007-04-17 2009-12-01 Plant Res Int Bv Glicosilación tipo mamífera en plantas para la expresión de glicosil-transferasas no mamíferas.
WO2008137471A2 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
KR20100018040A (ko) 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법
AR068767A1 (es) 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina
EP2930182A1 (en) 2007-11-20 2015-10-14 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
EP2174664A1 (en) 2008-10-07 2010-04-14 Stichting Katholieke Universiteit, more particularly the Radboud University Nijmegen Medical Centre New virulence factors of Streptococcus pneumoniae
IT1392551B1 (it) * 2008-11-25 2012-03-09 Bioindustry Park Del Canavese S P A Biomarcatori per la diagnosi e per rilevare la progressione di malattie neurodegenerative, in particolare della sclerosi laterale amiotrofica
AU2009324037B2 (en) 2008-12-05 2015-07-30 Glaxo Group Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
JP5936112B2 (ja) 2009-02-11 2016-06-15 アルブミディクス アクティーゼルスカブ アルブミン変異体及び複合体
WO2010094720A2 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Glaxo Group Limited Improved anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains & antagonists
JP5766179B2 (ja) 2009-04-27 2015-08-19 ノバルティス アーゲー 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
MX2011011338A (es) 2009-04-27 2012-04-19 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos terapeuticos especificos para la subunidad beta1 del receptor de il-12.
JP2012532619A (ja) 2009-07-16 2012-12-20 グラクソ グループ リミテッド Ｔｎｆｒ１を部分的に阻害するためのアンタゴニスト、用途および方法
WO2011029823A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Novartis Ag Monoclonal antibody reactive with cd63 when expressed at the surface of degranulated mast cells
ES2552177T3 (es) 2009-10-27 2015-11-26 Glaxo Group Limited Polipéptidos anti-TNFR1 estables, dominios variables de anticuerpos y antagonistas
GB0919054D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Treatment of obesity
CN105567699A (zh) 2009-10-30 2016-05-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体
GB0919837D0 (en) 2009-11-13 2009-12-30 Isis Innovation Method of treatment and screening method
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
WO2011105891A1 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Stichting Katholieke Universiteit, More Particularly The Radboud University Nijmegen Medical Centre Combination vaccine for streptococcus
CN106977608A (zh) 2010-04-09 2017-07-25 阿尔布麦狄克斯公司 白蛋白衍生物和变体
HUE045845T2 (hu) 2010-08-17 2021-12-28 Ambrx Inc Módosított relaxin polipeptidek és felhasználásuk
CN103154037A (zh) 2010-10-05 2013-06-12 诺瓦提斯公司 抗IL12Rβ1抗体及它们在治疗自身免疫病和炎性疾病中的用途
AU2011336470B8 (en) 2010-12-01 2017-09-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
AU2012222833B2 (en) 2011-03-03 2017-03-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
DK2707391T3 (en) 2011-05-13 2018-02-05 Gamamabs Pharma ANTIBODIES AGAINST HER3
CN108373502B (zh) 2011-05-20 2022-03-22 H.伦德贝克公司 抗cgrp组合物及其用途
CN103957935B (zh) 2011-05-20 2018-04-03 奥尔德生物控股有限责任公司 抗cgrp或抗cgrp‑r抗体或抗体片段用于治疗或预防慢性和急性形式的腹泻的用途
KR102098546B1 (ko) 2011-05-20 2020-04-07 앨더바이오 홀딩스 엘엘씨 필요한 대상체, 특히 편두통 환자의 광선공포증 또는 광선 혐오증을 예방 또는 억제하기 위한 항-cgrp 항체 및 항체 단편의 용도
CN103747803B (zh) 2011-06-22 2016-10-12 国家医疗保健研究所 抗axl抗体及其用途
EP2723376B1 (en) 2011-06-22 2018-12-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-axl antibodies and uses thereof
CA2840552A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
ES2692519T3 (es) 2011-07-01 2018-12-04 Novartis Ag Método para tratar trastornos metabólicos
US20140148390A1 (en) 2011-07-08 2014-05-29 Bayer Intellectual Property Gmbh Fusion proteins releasing relaxin and uses thereof
US20140187744A1 (en) * 2011-08-10 2014-07-03 Nipro Corporation Bilirubin Excretion Enhancer
WO2013075066A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
BR112014018679A2 (pt) 2012-03-16 2017-07-04 Novozymes Biopharma Dk As variantes de albumina
WO2013170636A1 (zh) 2012-05-18 2013-11-21 爱德迪安（北京）生物技术有限公司 用于糖尿病治疗的蛋白、蛋白缀合物及其应用
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
JOP20200308A1 (ar) 2012-09-07 2017-06-16 Novartis Ag جزيئات إرتباط il-18
MX2015005363A (es) 2012-11-08 2015-11-06 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
SI2953969T1 (sl) 2013-02-08 2020-01-31 Novartis Ag Protitelesa proti-IL-17A in njihova uporaba v zdravljenju avtoimunskih in vnetnih motenj
WO2014165093A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto
MX2016000220A (es) 2013-07-03 2016-08-18 Alder Biopharmaceuticals Inc Regulacion del metabolismo de glucosa usando anticuerpos anti-cgrp.
CN105960414A (zh) 2013-08-14 2016-09-21 诺华股份有限公司 治疗散发性包涵体肌炎的方法
CN105849125B (zh) 2013-11-07 2020-05-15 国家医疗保健研究所 神经调节蛋白变构抗her3抗体
CN112043835B (zh) 2013-12-06 2022-10-21 韩捷 用于含氮和羟基的药物的生物可逆引入基团
US11376333B2 (en) * 2013-12-23 2022-07-05 Covalab mTG substrates for covalent conjugation of compounds
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
US20170204149A1 (en) 2014-06-23 2017-07-20 Novartis Ag Hsa-gdf-15 fusion polypeptide and use thereof
EP3161001A2 (en) 2014-06-25 2017-05-03 Novartis AG Antibodies specific for il-17a fused to hyaluronan binding peptide tags
EP3786182A1 (en) 2014-11-19 2021-03-03 Axon Neuroscience SE Humanized tau antibodies in alzheimer's disease
ES2764299T3 (es) 2014-12-09 2020-06-02 Inst Nat Sante Rech Med Anticuerpos monoclonales humanos contra AXL
EP3835319A1 (en) 2014-12-19 2021-06-16 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Humanized anti-acth antibodies and use thereof
NL2014148B1 (en) 2015-01-16 2017-01-05 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Combination vaccine for camelids.
WO2016135041A1 (en) 2015-02-26 2016-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis
JP6995627B2 (ja) 2015-05-19 2022-02-04 イエール ユニバーシティ 病的石灰化状態を治療するための組成物およびそれを使用する方法
WO2016188911A1 (en) 2015-05-22 2016-12-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Human monoclonal antibodies fragments inhibiting both the cath-d catalytic activity and its binding to the lrp1 receptor
WO2017023863A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Peptides and antibodies for the removal of biofilms
WO2017029407A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
WO2017066719A2 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Hu specific interfering agents
LT3368571T (lt) 2015-10-30 2023-02-10 The Regents Of The University Of California Į transformuojantį augimo faktorių beta atsaką sukuriantys polipeptidai ir jų panaudojimo būdai
US20190000923A1 (en) 2015-12-22 2019-01-03 Novartis Ag Methods of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15)
KR102640157B1 (ko) 2016-03-22 2024-02-27 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) 인간화 항-클라우딘-1 항체 및 이의 용도
US10202435B2 (en) 2016-04-15 2019-02-12 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-PACAP antibodies and uses thereof
BR112019001693A2 (pt) 2016-07-29 2019-07-02 Ct Hospitalier Universitaire Toulouse anticorpos direcionados a macrófagos associados a tumores e seus usos
CA3049114A1 (en) 2017-01-04 2018-07-12 Lauren O. Bakaletz Antibody fragments for the treatment of biofilm-related disorders
CA3049105A1 (en) 2017-01-04 2018-07-12 Lauren O. Bakaletz Dnabii vaccines and antibodies with enhanced activity
WO2018158398A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies having specificity to nectin-4 and uses thereof
CA3056088A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Composition and methods for disruption of bacterial biofilms without accompanying inflammation
AU2018240117A1 (en) 2017-03-24 2019-09-19 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for preventing and treating heart disease
UY37758A (es) 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
CN110785433A (zh) 2017-06-28 2020-02-11 诺华股份有限公司 预防和治疗尿失禁的方法
WO2019102435A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 Euro-Celtique S.A. Humanized antibodies targeting human tissue factor
EP3552631A1 (en) 2018-04-10 2019-10-16 Inatherys Antibody-drug conjugates and their uses for the treatment of cancer
US20220047701A1 (en) 2018-09-10 2022-02-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combination of her2/neu antibody with heme for treating cancer
JP2022512580A (ja) 2018-10-05 2022-02-07 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 細菌バイオフィルムの酵素的破壊のための組成物および方法
EP3914282A1 (en) 2019-01-25 2021-12-01 Ospedale San Raffaele S.r.l. Inhibitor of dux4 and uses thereof
US20220177558A1 (en) 2019-03-25 2022-06-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Treatment of taupathy disorders by targeting new tau species
BR112021024938A2 (pt) 2019-06-12 2022-01-25 Novartis Ag Anticorpos de receptor 1 de peptídeo natriurético e métodos de uso
AU2020311897A1 (en) 2019-07-08 2022-02-03 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Antibody compositions for disrupting biofilms
US20220324962A1 (en) 2019-09-27 2022-10-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-müllerian inhibiting substance antibodies and uses thereof
WO2021058729A1 (en) 2019-09-27 2021-04-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-müllerian inhibiting substance type i receptor antibodies and uses thereof
US20210147525A1 (en) 2019-10-18 2021-05-20 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating pathogenic blood vessel disorders
WO2021116119A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies having specificity to her4 and uses thereof
BR112022013468A2 (pt) 2020-01-10 2022-09-13 Inst Nat Sante Rech Med Proteínas rspo1 e seu uso
AU2020202454A1 (en) 2020-04-06 2021-10-21 H. Lundbeck A/S Treatment of most bothersome symptom (MBS) associated with migraine using anti-CGRP antibodies
EP4149558A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to treat cutaneous t-cell lymphomas and tfh derived lymphomas
EP4153636A1 (en) 2020-06-29 2023-03-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-protein s single-domain antibodies and polypeptides comprising thereof
US11739166B2 (en) 2020-07-02 2023-08-29 Davol Inc. Reactive polysaccharide-based hemostatic agent
WO2022130182A1 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Novartis Ag Reversal binding agents for anti-natriuretic peptide receptor 1 (npr1) antibodies and uses thereof
JP2023535884A (ja) 2021-06-22 2023-08-22 ノバルティス アーゲー 化膿性汗腺炎の処置における使用のための二特異性抗体
IL310154A (en) 2021-07-15 2024-03-01 Diogenx Recombinant variants of R-SPONDIN proteins
WO2023026245A1 (en) 2021-08-27 2023-03-02 H. Lundbeck A/S Treatment of cluster headache using anti-cgrp antibodies
WO2023170247A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Mablink Bioscience Antibody-drug conjugates and their uses
WO2023187657A1 (en) 2022-03-30 2023-10-05 Novartis Ag Methods of treating disorders using anti-natriuretic peptide receptor 1 (npr1) antibodies
WO2024052503A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity to ltbp2 and uses thereof
WO2024056668A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale New anti-itgb8 antibodies and its uses thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL66614A (en) * 1981-08-28 1985-09-29 Genentech Inc Method of constructing a dna sequence encoding a polypeptide,microbial production of human serum albumin,and pharmaceutical compositions comprising it
EP0091527A3 (en) * 1981-12-14 1984-07-25 The President And Fellows Of Harvard College Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human serum albumin-like polypeptides
JPS6041487A (ja) * 1983-04-25 1985-03-05 ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用
JPS6087792A (ja) * 1983-09-23 1985-05-17 ジェネックス・コーポレイション 雑種制御領域
GB8510219D0 (en) * 1985-04-22 1985-05-30 Bass Plc Isolation of fermentation products
EP0206733A1 (en) * 1985-06-17 1986-12-30 Genex Corporation Cloned human serum albumin gene
GB8615701D0 (en) * 1986-06-27 1986-08-06 Delta Biotechnology Ltd Stable gene integration vector
GB8620926D0 (en) * 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter

Also Published As

Publication number Publication date
IE883280L (en) 1989-04-30
DE3876401T2 (de) 1993-04-22
GR3007162T3 (hu) 1993-07-30
EP0322094B1 (en) 1992-12-02
DE3876401D1 (de) 1993-01-14
DK175046B1 (da) 2004-05-10
FI101381B (fi) 1998-06-15
IE61050B1 (en) 1994-09-21
CA1341298C (en) 2001-09-25
ES2053758T3 (es) 1994-08-01
US5380712A (en) 1995-01-10
FI884993A0 (fi) 1988-10-28
EP0322094A1 (en) 1989-06-28
ATE82858T1 (de) 1992-12-15
JPH02194A (ja) 1990-01-05
AU619768B2 (en) 1992-02-06
DK600688D0 (da) 1988-10-28
KR0153516B1 (ko) 1998-10-15
IL88223A0 (en) 1989-06-30
GB8725529D0 (en) 1987-12-02
DK600688A (da) 1989-06-21
AU2404688A (en) 1989-05-18
FI101381B1 (fi) 1998-06-15
FI884993A (fi) 1989-05-01
KR890006668A (ko) 1989-06-15
IL88223A (en) 1994-10-07
HUT47977A (en) 1989-04-28
ZA888118B (en) 1989-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU209145B (en) Method for preparing medical preparatives containing fragment (1-387) of human serum albumine and for producing the active agent as well
JP3390990B2 (ja) 血清ヒトアルブミン，製剤及び利用
US4743679A (en) Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
JP2634193B2 (ja) ヒトプロアポリポタンパク質ａ−１の発現
JP3043764B2 (ja) ミニ‐プロインシュリン、その製造および使用
CN101166762A (zh) 白蛋白融合的Kunitz结构域肽
US5126322A (en) Pancreatic secretory tryspin inhibitor and variants thereof produced by a recombinant host therefore and pharmaceutical use thereof
JPH08228791A (ja) ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造
KR100199523B1 (ko) 사람 혈청 알부민의 정제방법
US5262309A (en) Terminal modifications of tumor necrosis factor
JP2916228B2 (ja) 遺伝子操作した組み換えアプロチニン変異型、均質に処理されたアプロチニン変異型の微生物調製の方法およびその治療学的使用
CA2092920A1 (en) Aprotinin analogues
US5316947A (en) Synthetic isohirudins with improved stability
JPH02439A (ja) ヒトアプロチニン相同体、宿主株およびそれらの発現ベクター、それらの分離および薬物としてのそれらの使用
FR2564106A1 (fr) Vecteurs d'expression du facteur ix, cellules transformees par ces vecteurs et procede de preparation du facteur ix.
JPH0646873A (ja) ヒト血清アルブミンの高度精製方法
JP2869417B2 (ja) 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン
JPH06169770A (ja) 新規なポリペプチド、これに関する暗号を有するプラスミド及びこれを製造する方法及びこれを使用する方法
US5316919A (en) Method of producing 2 KD to 10 KD peptides having no L-methionine residue
JPH09176195A (ja) 遺伝子操作由来のヒト血清アルブミンより得られる高純度ヒト血清アルブミン含有組成物
JPH05308988A (ja) 新規ポリペプチド、新規ｄｎａ、新規ベクター、新規形質転換体、新規医薬組成物、および新規ポリペプチドの製造方法
JPH0538287A (ja) ウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミドｄｎａ、該組換えプラスミドｄｎａで形質転換された微生物及び該微生物を用いたウサギ血清アルブミンの製造方法
JPH11191A (ja) 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン
JPH06321989A (ja) 新規ポリペプチド、新規ｄｎａおよび医薬組成物
JPH05328991A (ja) ヒト血清アルブミンの脱色方法