JPH06169770A - 新規なポリペプチド、これに関する暗号を有するプラスミド及びこれを製造する方法及びこれを使用する方法 - Google Patents
新規なポリペプチド、これに関する暗号を有するプラスミド及びこれを製造する方法及びこれを使用する方法Info
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- JPH06169770A JPH06169770A JP4008765A JP876592A JPH06169770A JP H06169770 A JPH06169770 A JP H06169770A JP 4008765 A JP4008765 A JP 4008765A JP 876592 A JP876592 A JP 876592A JP H06169770 A JPH06169770 A JP H06169770A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3153—Streptokinase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規ポリペプチド、これに関する暗号を有す
るプラスミド及びその製造方法及びその使用方法 【構成】 一般式Ｉ Ｓｅｒ−Ｘ1 −Ｘ2 −ｒｓｃｕＰＡ143-411 Ｉ （式中、Ｘ1 及びＸ2 は限定されたアミノ酸又は低級ペ
プチド架橋であり、Ｘ2は単一結合であってもよく、ｒ
ｓｃｕＰＡ143-411 はＳｃｕ- ＰＡ５４Ｋからのアミノ
酸１４３（Ｇｌｕ）ないし４１１（ＬｅｕＯＨ）の非グ
ルコシル化さされた配列領域を示す。）の、プラスミノ
ーゲンアクチベーターとして使用されうる新規ポリペプ
チドであり、この化合物を得るために、新規プラスミド
を産生し、その発現は適する細菌宿主中で夫々高収率で
プラスミノーゲンアクチベーターとして作用しない発現
生成物を生じ、次いでそのたん白質化学変化は、新規
の、プラスミノーゲンアクチベーターとして価値ある一
本鎖の式Ｉの化合物を導く。
るプラスミド及びその製造方法及びその使用方法 【構成】 一般式Ｉ Ｓｅｒ−Ｘ1 −Ｘ2 −ｒｓｃｕＰＡ143-411 Ｉ （式中、Ｘ1 及びＸ2 は限定されたアミノ酸又は低級ペ
プチド架橋であり、Ｘ2は単一結合であってもよく、ｒ
ｓｃｕＰＡ143-411 はＳｃｕ- ＰＡ５４Ｋからのアミノ
酸１４３（Ｇｌｕ）ないし４１１（ＬｅｕＯＨ）の非グ
ルコシル化さされた配列領域を示す。）の、プラスミノ
ーゲンアクチベーターとして使用されうる新規ポリペプ
チドであり、この化合物を得るために、新規プラスミド
を産生し、その発現は適する細菌宿主中で夫々高収率で
プラスミノーゲンアクチベーターとして作用しない発現
生成物を生じ、次いでそのたん白質化学変化は、新規
の、プラスミノーゲンアクチベーターとして価値ある一
本鎖の式Ｉの化合物を導く。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規ポリペプチド、こ
れに関する暗号を有するプラスミド及びこれを製造する
方法並びにこれを使用する方法に関する。
れに関する暗号を有するプラスミド及びこれを製造する
方法並びにこれを使用する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】本発明による新規ポリペプチドは、極め
て有効なプラスミノーゲンアクチベーターであり、した
がって血栓溶解剤として良好な成果をもって使用するこ
とができる。フィブリンが原因する血管閉塞、たとえば
心臓硬塞、肺塞栓、静脈四肢の動脈閉塞疾患等々の治療
に、プラスミノーゲンアクチベーターが重要な役割を果
している。１９５０年代の初めから、ヒトの尿中にタン
パク質分解酵素が含有され、この酵素はプラスミノーゲ
ンのプラスミンへの変換を生じさせる、すなわちこの変
換がフィブリンの可溶性ポリペプチド中での分解及びそ
れを同時にフィブリンに起因する閉塞の溶解を生じせし
める酵素中で行われることは公知である。このプラスミ
ノーゲンアクチベーターはウロキナーゼと呼ばれ、実際
に少なくとも１個の前駆分子を含む種々のウキロナーゼ
型が７０年代の半ばから公知の酵素原プロウロキナーゼ
を有するのが分った。このプロウロキナーゼは、１本鎖
構造を有し、したがってｓｃｕ- ＰＡ（single chain u
rinary Plasminogen activator) とも呼ばれる。このｓ
ｃｕ- ＰＡは４１１アミノ酸から成り、アミノ酸３０２
の天然に存在する形でグリコシリル化される。このｓｃ
ｕ- ＰＡの分子量（Ｍｒ）は、文献上約５４．０００ダ
ルトンと記載されている。
て有効なプラスミノーゲンアクチベーターであり、した
がって血栓溶解剤として良好な成果をもって使用するこ
とができる。フィブリンが原因する血管閉塞、たとえば
心臓硬塞、肺塞栓、静脈四肢の動脈閉塞疾患等々の治療
に、プラスミノーゲンアクチベーターが重要な役割を果
している。１９５０年代の初めから、ヒトの尿中にタン
パク質分解酵素が含有され、この酵素はプラスミノーゲ
ンのプラスミンへの変換を生じさせる、すなわちこの変
換がフィブリンの可溶性ポリペプチド中での分解及びそ
れを同時にフィブリンに起因する閉塞の溶解を生じせし
める酵素中で行われることは公知である。このプラスミ
ノーゲンアクチベーターはウロキナーゼと呼ばれ、実際
に少なくとも１個の前駆分子を含む種々のウキロナーゼ
型が７０年代の半ばから公知の酵素原プロウロキナーゼ
を有するのが分った。このプロウロキナーゼは、１本鎖
構造を有し、したがってｓｃｕ- ＰＡ（single chain u
rinary Plasminogen activator) とも呼ばれる。このｓ
ｃｕ- ＰＡは４１１アミノ酸から成り、アミノ酸３０２
の天然に存在する形でグリコシリル化される。このｓｃ
ｕ- ＰＡの分子量（Ｍｒ）は、文献上約５４．０００ダ
ルトンと記載されている。
【０００３】その後１９７７年にすでにノラン(Nolan)
等によって(Biochim. Biopluys.Acta４９６，第３８４
〜４００頁）、ヒト腎臓細胞培養で、特にウロキナーゼ
-プロ酵素の存在が認められ、その分子量は公知の低分
子ウロキナーゼ型（３１．５００ダルトン）の分子量に
相当する。１９８６年にはリジケン(Rijken)等(Thrombo
sis Res.４２（１９８６）、第７４９〜７６０頁）及び
リジケン等(Thrombsis Res. ４２（１９８６）、第７６
１〜７６８頁）によってサル腎臓細胞培養で３０ｋｄ
（３０キロ- ダルトン）の大きいプロウロキナーゼの存
在、この精製及び繊維素溶解性質について述べられてい
る。同様に、１９８６年にはスチュンプ(Stump) 等が
(J. Biol. Chem. ２６１，第１７１２０〜１７１２６
頁）、ヒト腫瘍細胞系ＣＡＬＵ- ３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ
５５）の上澄み中に、一本鎖プロウロキナーゼを含有
し、これは約３２．０００ダルトンの分子量（Ｍｒ）を
有し、より一層高い分子量のプロウロキナーゼ("ｓｃｕ
- ＰＡ５４Ｋ")と区別するために "ｓｃｕ- ＰＡ３２
Ｋ" として表示する。１４３Ｎ- 末端アミノ酸（Ｓｅｒ
1-Ｇｌｕ143)を有しないｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋに相当する
このｓｃｕ- ＰＡ３２Ｋは、したがって同様にアミノ酸
３０２（Ａｓｎ）でグリコシル化されている。
等によって(Biochim. Biopluys.Acta４９６，第３８４
〜４００頁）、ヒト腎臓細胞培養で、特にウロキナーゼ
-プロ酵素の存在が認められ、その分子量は公知の低分
子ウロキナーゼ型（３１．５００ダルトン）の分子量に
相当する。１９８６年にはリジケン(Rijken)等(Thrombo
sis Res.４２（１９８６）、第７４９〜７６０頁）及び
リジケン等(Thrombsis Res. ４２（１９８６）、第７６
１〜７６８頁）によってサル腎臓細胞培養で３０ｋｄ
（３０キロ- ダルトン）の大きいプロウロキナーゼの存
在、この精製及び繊維素溶解性質について述べられてい
る。同様に、１９８６年にはスチュンプ(Stump) 等が
(J. Biol. Chem. ２６１，第１７１２０〜１７１２６
頁）、ヒト腫瘍細胞系ＣＡＬＵ- ３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ
５５）の上澄み中に、一本鎖プロウロキナーゼを含有
し、これは約３２．０００ダルトンの分子量（Ｍｒ）を
有し、より一層高い分子量のプロウロキナーゼ("ｓｃｕ
- ＰＡ５４Ｋ")と区別するために "ｓｃｕ- ＰＡ３２
Ｋ" として表示する。１４３Ｎ- 末端アミノ酸（Ｓｅｒ
1-Ｇｌｕ143)を有しないｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋに相当する
このｓｃｕ- ＰＡ３２Ｋは、したがって同様にアミノ酸
３０２（Ａｓｎ）でグリコシル化されている。
【０００４】欧州特許公開第２４７６７４号公報中に、
ｓｃｕ- ＰＡ３２Ｋを細胞系ＣＡＬＵ- ３（ＡＴＣＣ，
ＨＴＢ５５）の培養培地から並びにプラスミドを用いて
ｐＳＶｓｃｕ- ＰＡ- ３２Ｋ及びｐＳＶ五ＤＨＦＲから
移入されたＣＨＯ- 細胞（中国のハムスターの卵巣細
胞）から収得することが記載されている。そこではｓｃ
ｕ- ＰＡ３２Ｋの製造に対する可能性として、遺伝子上
変化された微生物が考慮されているが、後述の記載又は
対応する実施例にはこのことについて全く提示されてい
ない。
ｓｃｕ- ＰＡ３２Ｋを細胞系ＣＡＬＵ- ３（ＡＴＣＣ，
ＨＴＢ５５）の培養培地から並びにプラスミドを用いて
ｐＳＶｓｃｕ- ＰＡ- ３２Ｋ及びｐＳＶ五ＤＨＦＲから
移入されたＣＨＯ- 細胞（中国のハムスターの卵巣細
胞）から収得することが記載されている。そこではｓｃ
ｕ- ＰＡ３２Ｋの製造に対する可能性として、遺伝子上
変化された微生物が考慮されているが、後述の記載又は
対応する実施例にはこのことについて全く提示されてい
ない。
【０００５】欧州特許出願第９２１８２Ａ２号明細書に
は、特に約３３．０００ダルトンの分子量を有する低分
子ウロキナーゼに関すく暗号を有するＤＮＡ及び対応す
るプラスミドの製造並びに大腸菌Ｋ１２ ２９４（ＡＴ
ＣＣ３１４４６）中で分子量３３．０００ダルトンの非
グリコシル化されたたん白質の形成下でのこの発現及び
ｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋからの位置１３３〜４１１の領域に
相当する、図２Ａ中に記載されたアミノ酸配列が、開示
されている。
は、特に約３３．０００ダルトンの分子量を有する低分
子ウロキナーゼに関すく暗号を有するＤＮＡ及び対応す
るプラスミドの製造並びに大腸菌Ｋ１２ ２９４（ＡＴ
ＣＣ３１４４６）中で分子量３３．０００ダルトンの非
グリコシル化されたたん白質の形成下でのこの発現及び
ｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋからの位置１３３〜４１１の領域に
相当する、図２Ａ中に記載されたアミノ酸配列が、開示
されている。
【０００６】アミノ酸１３６−４１１を含む非グリコシ
ル化された生成物のいくつかの性質が、ギュンツラー(G
unzler) 等によって１９８７年に報告されている（Thro
mbosis及びHaemostasis,５８（１９８７）第２１６）。
ル化された生成物のいくつかの性質が、ギュンツラー(G
unzler) 等によって１９８７年に報告されている（Thro
mbosis及びHaemostasis,５８（１９８７）第２１６）。
【０００７】ＳＣＵ- ＰＡ３２Ｋの構造のプロウロキナ
ーゼ−活性を有するポリペプチド─これは場合により付
加的に配列域１３６−１４３又はその部分域を有し、こ
れ中で場合により（Ｎ- 末端の性質に基づき）アミノ酸
１５６（Ａｒｇ）が変化する──並びに大腸菌Ｋ１２Ｊ
Ｍ１０５中で適するプラスミドの発現によって、第一に
細胞内に生じる封入体のたん白質化学変化を伴うこの製
造は、欧州特許公開第３１２９４１号公報に記載されて
いる。
ーゼ−活性を有するポリペプチド─これは場合により付
加的に配列域１３６−１４３又はその部分域を有し、こ
れ中で場合により（Ｎ- 末端の性質に基づき）アミノ酸
１５６（Ａｒｇ）が変化する──並びに大腸菌Ｋ１２Ｊ
Ｍ１０５中で適するプラスミドの発現によって、第一に
細胞内に生じる封入体のたん白質化学変化を伴うこの製
造は、欧州特許公開第３１２９４１号公報に記載されて
いる。
【０００８】本発明は、次の一般式Ｉ又は図１からの構
造図に相当する、プラスミノーゲンアクチベーターとし
て治療上使用可能な新規ポリペプチドに関する： Ｓｅｒ−Ｘ1 −Ｘ2 −ｒｓｃｕ−ＰＡ143-411 Ｉ 式中、ｒｓｃｕ- ＰＡ143-411 は、ｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋ
からのアミノ酸１４３（Ｇｌｕ）〜４１１（ＬｅｕＯ
Ｈ）の非グルコシル化配列領域を示し、Ｘ1 はアミノ酸
Ａｓｎ，Ｐｒｏ又はＳｅｒの１つを示し、Ｘ2 は単一結
合又はＧｌｕ，Ｐｒｏ- Ｇｌｕ，Ｐｒｏ- Ｐｒｐ- Ｇｌ
ｕ又はＧｌｕ- Ｌｅｕ- Ｈｉｓ- Ｌｅｕ- Ｌｅｕ- Ｇｌ
ｎ- Ｖａｌ- Ｐｒｏ- Ｓｅｒ- Ａｓｎである。
造図に相当する、プラスミノーゲンアクチベーターとし
て治療上使用可能な新規ポリペプチドに関する： Ｓｅｒ−Ｘ1 −Ｘ2 −ｒｓｃｕ−ＰＡ143-411 Ｉ 式中、ｒｓｃｕ- ＰＡ143-411 は、ｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋ
からのアミノ酸１４３（Ｇｌｕ）〜４１１（ＬｅｕＯ
Ｈ）の非グルコシル化配列領域を示し、Ｘ1 はアミノ酸
Ａｓｎ，Ｐｒｏ又はＳｅｒの１つを示し、Ｘ2 は単一結
合又はＧｌｕ，Ｐｒｏ- Ｇｌｕ，Ｐｒｏ- Ｐｒｐ- Ｇｌ
ｕ又はＧｌｕ- Ｌｅｕ- Ｈｉｓ- Ｌｅｕ- Ｌｅｕ- Ｇｌ
ｎ- Ｖａｌ- Ｐｒｏ- Ｓｅｒ- Ａｓｎである。
【０００９】Ｘ1 の好ましい意味は、Ａｓｎ又は特にＳ
ｅｒである。Ｘ2 は、単一結合又はＧｌｕ，Ｐｒｏ- Ｇ
ｌｕ又はＰｒｏ- Ｐｒｏ- Ｇｌｕを示すのが好ましい。
ｅｒである。Ｘ2 は、単一結合又はＧｌｕ，Ｐｒｏ- Ｇ
ｌｕ又はＰｒｏ- Ｐｒｏ- Ｇｌｕを示すのが好ましい。
【００１０】好ましい式Ｉの化合物は、式 Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ｒｓｃｕ−ＰＡ143-411 Ｉａ （式中ｒｓｃｕ−ＰＡ143-411 は、上述の意味を有す
る。）に相当する。
る。）に相当する。
【００１１】式Ｉの新規化合物は、繊維素凝塊の溶解現
象の点で著しい特異性を示す。すなわちこの化合物は、
フィブリンの存在下で活性化されたプラスミノーゲンで
あり、一方これは循環するプラスミノ−ゲンを、プラス
ミンに変えないか又はほんの僅かしか変えない。これに
よって、繊維素凝塊を溶解し、一方で血液凝固因子及び
他のたん白質の治療上望まれない破壊を、非特異性プラ
スミノーゲンアクチベーターと同一尺度で生じるという
ことが得られる。式Ｉの新規化合物は、ｓｃｕ- ＰＡ５
４Ｋ又はその非グリコシル化されたたん白質部分("サプ
ラーゼ")に比して約１．７倍高い比アミド分解活性の点
で優れている（プラスミンによって二本鎖プラスミノー
ゲンアクチベーターに変えた後発色基質ｐｙｒｏＧｌｙ
- Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドを用いて測定）。繊維素
溶解活性をフィブリン- 寒天- プレート上で直接測定す
る場合、式Ｉの新規化合物はｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋに比し
てフアクター２．５〜３ほど高い有効性（ｍｍ2 ／ｍｇ
でリゼホフ- 平面(Lysehof-Flache)) を示す。更に式Ｉ
の新規化合物を、ｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋ又はサプラーゼに
反して、特異的に結合する細胞質のウロキナーゼレセプ
ターによって結合及び不活性化することができない。し
たがってこれは、その治療作用を発揮するためにより一
層長く循環中に有効利用できる。市販の繊維素溶解剤と
比較してより強い特異的繊維素溶解作用及び作用点で改
良された生物学的利用可能性によって、より一層低い投
薬量及びより一層小さい副作用が、有する安全な溶菌治
療を、出血の形で得られる。
象の点で著しい特異性を示す。すなわちこの化合物は、
フィブリンの存在下で活性化されたプラスミノーゲンで
あり、一方これは循環するプラスミノ−ゲンを、プラス
ミンに変えないか又はほんの僅かしか変えない。これに
よって、繊維素凝塊を溶解し、一方で血液凝固因子及び
他のたん白質の治療上望まれない破壊を、非特異性プラ
スミノーゲンアクチベーターと同一尺度で生じるという
ことが得られる。式Ｉの新規化合物は、ｓｃｕ- ＰＡ５
４Ｋ又はその非グリコシル化されたたん白質部分("サプ
ラーゼ")に比して約１．７倍高い比アミド分解活性の点
で優れている（プラスミンによって二本鎖プラスミノー
ゲンアクチベーターに変えた後発色基質ｐｙｒｏＧｌｙ
- Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドを用いて測定）。繊維素
溶解活性をフィブリン- 寒天- プレート上で直接測定す
る場合、式Ｉの新規化合物はｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋに比し
てフアクター２．５〜３ほど高い有効性（ｍｍ2 ／ｍｇ
でリゼホフ- 平面(Lysehof-Flache)) を示す。更に式Ｉ
の新規化合物を、ｓｃｕ- ＰＡ５４Ｋ又はサプラーゼに
反して、特異的に結合する細胞質のウロキナーゼレセプ
ターによって結合及び不活性化することができない。し
たがってこれは、その治療作用を発揮するためにより一
層長く循環中に有効利用できる。市販の繊維素溶解剤と
比較してより強い特異的繊維素溶解作用及び作用点で改
良された生物学的利用可能性によって、より一層低い投
薬量及びより一層小さい副作用が、有する安全な溶菌治
療を、出血の形で得られる。
【００１２】特に動脈閉塞で、殊に心筋梗塞で有効かつ
安全な血栓溶解に関して、成人患者に対する治療に有効
な単一投薬量は、式Ｉの化合物約１５ｍｇまでであるに
すぎない。たとえばボーデ(Bode)等(Am. J. Cardiol.６
１（１９８８）９７１〜９７３）からの知見に比して、
グリコシル化されたＳｃｕ- ＰＡ５４Ｋ７４ｍｇを用い
て硬化のある血栓溶解は次の場合５５％でしかうまくゆ
かないことが分る。その場合ボーデ等（循環８１（１９
９０）９０７，９１０）によれば、この公知生成物に関
して作用に必要な高い投薬量で繊維素凝塊に対してほぼ
非特異的であり、更に多くの試験者の記載によればきわ
だった、害する作用を止血系に有することに注意しなけ
ればならない。
安全な血栓溶解に関して、成人患者に対する治療に有効
な単一投薬量は、式Ｉの化合物約１５ｍｇまでであるに
すぎない。たとえばボーデ(Bode)等(Am. J. Cardiol.６
１（１９８８）９７１〜９７３）からの知見に比して、
グリコシル化されたＳｃｕ- ＰＡ５４Ｋ７４ｍｇを用い
て硬化のある血栓溶解は次の場合５５％でしかうまくゆ
かないことが分る。その場合ボーデ等（循環８１（１９
９０）９０７，９１０）によれば、この公知生成物に関
して作用に必要な高い投薬量で繊維素凝塊に対してほぼ
非特異的であり、更に多くの試験者の記載によればきわ
だった、害する作用を止血系に有することに注意しなけ
ればならない。
【００１３】式Ｉの新規価値ある化合物を、組換えＤＮ
Ａ- 技術によって製造する。更に、本発明による新規プ
ラスミドが適する細菌宿主中で生じるその発現及びつい
で夫々高い収量で得られ、プラスミノーゲンアクチベー
ターとして作用しない生成物のたん白質化学変化は、式
Ｉの新規化合物を、提供する。
Ａ- 技術によって製造する。更に、本発明による新規プ
ラスミドが適する細菌宿主中で生じるその発現及びつい
で夫々高い収量で得られ、プラスミノーゲンアクチベー
ターとして作用しない生成物のたん白質化学変化は、式
Ｉの新規化合物を、提供する。
【００１４】細菌中真核たん白質の発現のほとんどの場
合と同様に、細胞中式Ｉの化合物のたん白質- 鎖も変性
封入体──以下これを "初期たん白質" と呼ぶ──とし
て存在し、これは中間単離の後にたん白質化学で所望の
生成物の正確な三次構造に逆もどりしなければならな
い。次いでこの様にして得られた式Ｉの化合物を、形成
されたプラスミノーゲンアクチベーターの量の測定のた
めに、たとえばプラスミンの添加によって２本鎖の非グ
リコシル化ウロキナーゼ誘導体に変えることができ、そ
の酵素活性を測定し、式Ｉの化合物の形成量に関する尺
度として使用することができる。しかし当然初期たん白
質又は式Ｉの化合物の収量及び同時にまた発現率を、た
とえば全たん白質のゲル電気泳動分離のデンストメトリ
ー評価で検出することができる。
合と同様に、細胞中式Ｉの化合物のたん白質- 鎖も変性
封入体──以下これを "初期たん白質" と呼ぶ──とし
て存在し、これは中間単離の後にたん白質化学で所望の
生成物の正確な三次構造に逆もどりしなければならな
い。次いでこの様にして得られた式Ｉの化合物を、形成
されたプラスミノーゲンアクチベーターの量の測定のた
めに、たとえばプラスミンの添加によって２本鎖の非グ
リコシル化ウロキナーゼ誘導体に変えることができ、そ
の酵素活性を測定し、式Ｉの化合物の形成量に関する尺
度として使用することができる。しかし当然初期たん白
質又は式Ｉの化合物の収量及び同時にまた発現率を、た
とえば全たん白質のゲル電気泳動分離のデンストメトリ
ー評価で検出することができる。
【００１５】更に本発明によるプラスミドは、そのオペ
ロンが調節可能な、場合により合成のプロモーター、リ
ボソーム結合部位として有効なＳＤ配列、開始コドン、
式Ｉの化合物に関する合成構造遺伝子及び構造遺伝子の
下流に少なくとも１個のターミネーターを有する点で優
れている。２個の連続ターミネーターが存在するのが好
ましく、これは特にＴｎ１０からｔｒｐ Ａターミネー
ター及び（又は）ｔｅｔ Ａ／ｏｒｆ Ｌターミネータ
ー〔シヨルマイヤー(Schollmeier) 等、Nucl.Acids Re
s.１３（１９８５）４２２７〜４２３７参照〕である。
ロンが調節可能な、場合により合成のプロモーター、リ
ボソーム結合部位として有効なＳＤ配列、開始コドン、
式Ｉの化合物に関する合成構造遺伝子及び構造遺伝子の
下流に少なくとも１個のターミネーターを有する点で優
れている。２個の連続ターミネーターが存在するのが好
ましく、これは特にＴｎ１０からｔｒｐ Ａターミネー
ター及び（又は）ｔｅｔ Ａ／ｏｒｆ Ｌターミネータ
ー〔シヨルマイヤー(Schollmeier) 等、Nucl.Acids Re
s.１３（１９８５）４２２７〜４２３７参照〕である。
【００１６】調節可能なプロモーターは、特にＴｒｐ-
プロモーター又はＴａｃ- プロモーターである。
プロモーター又はＴａｃ- プロモーターである。
【００１７】本発明によるプラスミド中に挿入された構
造遺伝子の構成に於て、夫々のアミノ酸に関する暗号を
有する、次表に記載された塩基配列を組み込むのが好ま
しい。その際構造遺伝子中ですべてがこの要件を同時に
満たす必要はない。
造遺伝子の構成に於て、夫々のアミノ酸に関する暗号を
有する、次表に記載された塩基配列を組み込むのが好ま
しい。その際構造遺伝子中ですべてがこの要件を同時に
満たす必要はない。
【００１８】アミノ酸 トリプレット アルギニン ＣＧＴ ロイシン ＣＴＧ バリン ＧＴＴ プロリン ＣＣＧ グリシン ＧＣＴ 他方で構造遺伝子の構成に於て、次のコドンの使用を夫
々記載のアミノ酸に関してできる限り回避するのが好都
合である（この際またこの要件をすべてのアミノ酸に関
して同時に満たす必要はない）：回避すべきコドン アミノ酸 ＡＴＡ イソロイシン ＧＴＣ バリン ＣＣＣ プロリン ＡＡＧ リジン ＡＧＧ，ＡＧＡ，ＣＧＧ，ＣＧＡ アルギニン ＧＧＡ，ＧＧＧ グリシン 構造遺伝子中で個々のアミノ酸に関するコドンの本発明
による選択並びに制御要件によって、構造遺伝子と制御
域との間の安定な二次構造の形成を著しく阻害する。
々記載のアミノ酸に関してできる限り回避するのが好都
合である（この際またこの要件をすべてのアミノ酸に関
して同時に満たす必要はない）：回避すべきコドン アミノ酸 ＡＴＡ イソロイシン ＧＴＣ バリン ＣＣＣ プロリン ＡＡＧ リジン ＡＧＧ，ＡＧＡ，ＣＧＧ，ＣＧＡ アルギニン ＧＧＡ，ＧＧＧ グリシン 構造遺伝子中で個々のアミノ酸に関するコドンの本発明
による選択並びに制御要件によって、構造遺伝子と制御
域との間の安定な二次構造の形成を著しく阻害する。
【００１９】式Ｉの化合物に関する暗号を有する合成構
造遺伝子の収得に、先ずオリゴヌクレオチドを４０−８
０塩基の断片で１本の鎖状に合成する。これを１μＭｏ
ｌ-尺度でアダムス(Adams) 等、J. Am. Chem. Soc. １
０５（１９８３）６６１〜６６３の固相法に従ってＤＮ
Ａ- シンセサイザー(New Brunswick Scientific Co.社
のモデルバイオサーチ８６００）を用いて製造するのが
好ましい。その際モノマーサイソン(Synthone)として、
夫々必要なデスオキシヌクレオシドの市販のβ- シアノ
エチル- 保護されたジイソプロピルアミノ- ホスホルア
ミジトを使用する。担体の離脱後、末端でまだトリチル
保護された鎖を無菌条件下ゲル濾過によって脱塩し、前
もって精製し、次いで２回流出で最初の分離を "逆相"-
ＨＰＬＣによって行う。夫々の主精製物を脱トリチル化
し、２回別の "逆相"-ＨＰＬＣ-精製工程の後、所望の
オリゴヌクレオチドがゲル電気泳動分析（ＰＡＧＥ）に
示した様な高純度で得られる。
造遺伝子の収得に、先ずオリゴヌクレオチドを４０−８
０塩基の断片で１本の鎖状に合成する。これを１μＭｏ
ｌ-尺度でアダムス(Adams) 等、J. Am. Chem. Soc. １
０５（１９８３）６６１〜６６３の固相法に従ってＤＮ
Ａ- シンセサイザー(New Brunswick Scientific Co.社
のモデルバイオサーチ８６００）を用いて製造するのが
好ましい。その際モノマーサイソン(Synthone)として、
夫々必要なデスオキシヌクレオシドの市販のβ- シアノ
エチル- 保護されたジイソプロピルアミノ- ホスホルア
ミジトを使用する。担体の離脱後、末端でまだトリチル
保護された鎖を無菌条件下ゲル濾過によって脱塩し、前
もって精製し、次いで２回流出で最初の分離を "逆相"-
ＨＰＬＣによって行う。夫々の主精製物を脱トリチル化
し、２回別の "逆相"-ＨＰＬＣ-精製工程の後、所望の
オリゴヌクレオチドがゲル電気泳動分析（ＰＡＧＥ）に
示した様な高純度で得られる。
【００２０】次いでこの１本鎖の４〜９のグループか
ら、長さ約２００ヌクレオチドの２本鎖断片を次の様に
して得る：非末端１本鎖のオリゴヌクレオチドを５'-末
端でホスホリル化し、夫々の補体鎖を末端オリゴヌクレ
オチドと共にやきもどし、連結する。次いで連結後、形
成されたクローン化しうる２本鎖断片を適する線状化さ
れたベクター中に挿入する。他の処理法は、下記の例か
ら明らかである。
ら、長さ約２００ヌクレオチドの２本鎖断片を次の様に
して得る：非末端１本鎖のオリゴヌクレオチドを５'-末
端でホスホリル化し、夫々の補体鎖を末端オリゴヌクレ
オチドと共にやきもどし、連結する。次いで連結後、形
成されたクローン化しうる２本鎖断片を適する線状化さ
れたベクター中に挿入する。他の処理法は、下記の例か
ら明らかである。
【００２１】本発明中で使用される略号は、次の意味を
有する： ｂｐ： 塩基対 ＤＥ５２： ワットマン社のアニオン交換体 ＥＤＴＡ： エチレンジアミンテトラ酢酸 ＩＰＴＧ： イソプロピル- β- Ｄ- チオガラクト
ピラノシド ＰＡ： プラスミノーゲン−アクチベーター ＰＡＧＥ： ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＵ： プラーク単位 ＳＤＳ： ナトリウムドデシルスルフアート Ｓ．Ｄ．- 配列：Shine-Dalgarno- 配列 トリス- ＨＣｌ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン
- ヒドロクロリド トウーン- ８０：ポリエチレンオキシド（２０）ソルビ
タンモノオレアート ＴＭＡＣ： テトラメチルアンモニウムクロリド 本発明によるプラスミドの構成のために、市販のプラス
ミドｐＢＲ３２２（４３６３ｂｐ）から出発するのが好
ましい。これからｎｉｃ／ｂｏｍ- 域及び（又は）テト
ラサイクリン耐性遺伝子を脱離するのが有利である。そ
の際テトラサイクリン耐性遺伝子を完全に除去する必要
はない。むしろこれは、プラスミドがこれを用いて形質
転換された細菌株にテトラサイクリン- 耐性をもはや付
与しないことで十分である。この操作（ｎｉｃ／ｂｏｍ
- 域及び少なくとも一部のテトラサイクリン耐性遺伝子
の除去）によって、いわゆる "高度に安全なプラスミ
ド"が得られる。
有する： ｂｐ： 塩基対 ＤＥ５２： ワットマン社のアニオン交換体 ＥＤＴＡ： エチレンジアミンテトラ酢酸 ＩＰＴＧ： イソプロピル- β- Ｄ- チオガラクト
ピラノシド ＰＡ： プラスミノーゲン−アクチベーター ＰＡＧＥ： ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＵ： プラーク単位 ＳＤＳ： ナトリウムドデシルスルフアート Ｓ．Ｄ．- 配列：Shine-Dalgarno- 配列 トリス- ＨＣｌ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン
- ヒドロクロリド トウーン- ８０：ポリエチレンオキシド（２０）ソルビ
タンモノオレアート ＴＭＡＣ： テトラメチルアンモニウムクロリド 本発明によるプラスミドの構成のために、市販のプラス
ミドｐＢＲ３２２（４３６３ｂｐ）から出発するのが好
ましい。これからｎｉｃ／ｂｏｍ- 域及び（又は）テト
ラサイクリン耐性遺伝子を脱離するのが有利である。そ
の際テトラサイクリン耐性遺伝子を完全に除去する必要
はない。むしろこれは、プラスミドがこれを用いて形質
転換された細菌株にテトラサイクリン- 耐性をもはや付
与しないことで十分である。この操作（ｎｉｃ／ｂｏｍ
- 域及び少なくとも一部のテトラサイクリン耐性遺伝子
の除去）によって、いわゆる "高度に安全なプラスミ
ド"が得られる。
【００２２】本発明によるプラスミドの構成に好ましい
スターター──これは前記修飾されたプラスミドｐＢＲ
３２２（又は他の、ここで挙げたすでに知られているプ
ラスミド）から出発する──は、最も近い間隔として合
成 "マルチ クローニングサイト" の組み入れを切断部
位Ｅｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩとの間に定める。
このマルチ クローニング サイト（図４参照）は、切
断部位の固定された配列順序を有し、その間に存在する
塩基はＸｂａ Ｉ及びＮｄｅ Ｉの間の配列を除いて任
意に選択され、この配列はB. subtilis Xyl オペロン
５'-ＡＡＧＧＡＧ- ３'(４）（ウィルヘルム等、Nucl.
Acids Res.１３（１９８５）５７１７−５７２２）から
及びＳ．Ｄ．- 配列と開始コドンの間の固定された距離
から成るリボソーム結合部位（Ｓ．Ｄ．配列）を含有す
る。Ｓ．Ｄ．- 配列に続く塩基ＧＡＡＡＴはウィルヘル
ム等、上記参照から引用され、ＣＡＴＡＧ、すなわちＮ
ｄｅ Ｉ切断部位と結合する。したがってＳ．Ｄ．- 配
列はＡＴＧの間の距離は８塩基対である。マルチ クロ
ーニング サイトの個々の切断部位の間の距離は、クロ
ーン化技術の理由から長さ少なくとも約２０のヌクレオ
チドでなければならず、それによって介在断片の除去を
促進する。
スターター──これは前記修飾されたプラスミドｐＢＲ
３２２（又は他の、ここで挙げたすでに知られているプ
ラスミド）から出発する──は、最も近い間隔として合
成 "マルチ クローニングサイト" の組み入れを切断部
位Ｅｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩとの間に定める。
このマルチ クローニング サイト（図４参照）は、切
断部位の固定された配列順序を有し、その間に存在する
塩基はＸｂａ Ｉ及びＮｄｅ Ｉの間の配列を除いて任
意に選択され、この配列はB. subtilis Xyl オペロン
５'-ＡＡＧＧＡＧ- ３'(４）（ウィルヘルム等、Nucl.
Acids Res.１３（１９８５）５７１７−５７２２）から
及びＳ．Ｄ．- 配列と開始コドンの間の固定された距離
から成るリボソーム結合部位（Ｓ．Ｄ．配列）を含有す
る。Ｓ．Ｄ．- 配列に続く塩基ＧＡＡＡＴはウィルヘル
ム等、上記参照から引用され、ＣＡＴＡＧ、すなわちＮ
ｄｅ Ｉ切断部位と結合する。したがってＳ．Ｄ．- 配
列はＡＴＧの間の距離は８塩基対である。マルチ クロ
ーニング サイトの個々の切断部位の間の距離は、クロ
ーン化技術の理由から長さ少なくとも約２０のヌクレオ
チドでなければならず、それによって介在断片の除去を
促進する。
【００２３】このマルチ クローニング サイトを用い
て、プラスミド中に切断部位を挿入する。この切断部位
は、──好ましくは転写ターミネーターの組み込みの後
──式Ｉの化合物に関する構造遺伝子の部分配列の連続
して行われる組み込みを、目的たん白質のＣ- 末端か
ら、したがって製造すべき構造遺伝子のＤＮＡ- 鎖３'-
末端から開始し、並びにたとえば合成又は他のプラスミ
ドから単離された又は市販のＴｒｐ- プロモーターの組
み込みも可能にする。
て、プラスミド中に切断部位を挿入する。この切断部位
は、──好ましくは転写ターミネーターの組み込みの後
──式Ｉの化合物に関する構造遺伝子の部分配列の連続
して行われる組み込みを、目的たん白質のＣ- 末端か
ら、したがって製造すべき構造遺伝子のＤＮＡ- 鎖３'-
末端から開始し、並びにたとえば合成又は他のプラスミ
ドから単離された又は市販のＴｒｐ- プロモーターの組
み込みも可能にする。
【００２４】同様な方法で他の公知のプラスミド──こ
れは単一のＥｃｏ ＲＩ- 及びＨｉｎｄ ＩＩＩ- 切断
部位を有する──、たとえばｐＵＣ ９、ｐＵＣ １
２、ｐＵＣ １３、ｐＵＣ １８、ｐＵＣ １９等から
も出発することができる。
れは単一のＥｃｏ ＲＩ- 及びＨｉｎｄ ＩＩＩ- 切断
部位を有する──、たとえばｐＵＣ ９、ｐＵＣ １
２、ｐＵＣ １３、ｐＵＣ １８、ｐＵＣ １９等から
も出発することができる。
【００２５】たとえばプラスミドｐＧＲ Ｔａｃ ０６
（例１及び図１５）が得られる。このプラスミドは式Ｉ
の化合物（式中Ｘ1 はＡｓｎ、Ｘ2 は配列Ｇｌｕ- Ｌｅ
ｕ-Ｈｉｓ- Ｌｅｕ- Ｌｅｕ- Ｇｌｎ- Ｖａｌ- Ｐｒｏ-
Ｓｅｒ- Ａｓｎを示す）に関する暗号を有する（図１
６参照）。この化合物を、 "ＰＡ／０６" として以下に
示す。
（例１及び図１５）が得られる。このプラスミドは式Ｉ
の化合物（式中Ｘ1 はＡｓｎ、Ｘ2 は配列Ｇｌｕ- Ｌｅ
ｕ-Ｈｉｓ- Ｌｅｕ- Ｌｅｕ- Ｇｌｎ- Ｖａｌ- Ｐｒｏ-
Ｓｅｒ- Ａｓｎを示す）に関する暗号を有する（図１
６参照）。この化合物を、 "ＰＡ／０６" として以下に
示す。
【００２６】この配列を、ヌクレオチドによってＮｄｅ
ＩとＸｂａＩの間に暗号付与し、これに関してはｓｃｕ
- ＰＡ５４ＫのＮ- 末端アミノ酸に対するコドンを任意
に選択する。アミノ酸のこの配列を、ＰｓｔＩ切断部位
に関するＬｅｕ- Ｌｅｕによて中断する。
ＩとＸｂａＩの間に暗号付与し、これに関してはｓｃｕ
- ＰＡ５４ＫのＮ- 末端アミノ酸に対するコドンを任意
に選択する。アミノ酸のこの配列を、ＰｓｔＩ切断部位
に関するＬｅｕ- Ｌｅｕによて中断する。
【００２７】この、たとえば大腸菌- 細胞中に駆出され
たたん白質ＰＡ／０６は、巻戻しの後にフィブリン- 寒
天- プレートテストで驚くべきことにフィブリン溶解活
性を示す。
たたん白質ＰＡ／０６は、巻戻しの後にフィブリン- 寒
天- プレートテストで驚くべきことにフィブリン溶解活
性を示す。
【００２８】プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６中でＥｃｏ
ＲＩ及びＸｂａＩとの間のＴａｃプロモーターを、合成
Ｔｒｐ- プロモーターに代えた場合（図１７参照）、プ
ラスミドｐＧＲ Ｔｒｐ０６が得られる。
ＲＩ及びＸｂａＩとの間のＴａｃプロモーターを、合成
Ｔｒｐ- プロモーターに代えた場合（図１７参照）、プ
ラスミドｐＧＲ Ｔｒｐ０６が得られる。
【００２９】ｐＧＲ Ｔｒｐ０６で形質転換された、大
腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９４０３）の細胞
は、インドールアクリル酸で誘導後同様にたん白質を産
生し、封入体の細胞分解（Zellyse)及び巻戻しの後に、
フィブリン- 寒天- プレートテストでフィブリン溶解性
を有する。
腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９４０３）の細胞
は、インドールアクリル酸で誘導後同様にたん白質を産
生し、封入体の細胞分解（Zellyse)及び巻戻しの後に、
フィブリン- 寒天- プレートテストでフィブリン溶解性
を有する。
【００３０】本発明によるプラスミドの他のもは、前記
の様に構成されたプラスミドから、たとえば次の様にし
た得ることができる：ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで
切断してすべての調節単位を有する合成ｓｃｕＰＡ- 構
造が得られ、次いで他の、腸内細菌中で自律的増殖可能
なプラスミド中に組み込む。このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して線状化し、短縮する。
原則的に同一方法で、しかし切断部位ＥｃｏＲＩ及びＸ
ｂａＩの利用下に、たとえばＴｒｐ- プロモーターをＴ
ａｃ- プロモーターと（逆もまた同じ）本発明によるプ
ラスミド中で交換することもできる。
の様に構成されたプラスミドから、たとえば次の様にし
た得ることができる：ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで
切断してすべての調節単位を有する合成ｓｃｕＰＡ- 構
造が得られ、次いで他の、腸内細菌中で自律的増殖可能
なプラスミド中に組み込む。このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して線状化し、短縮する。
原則的に同一方法で、しかし切断部位ＥｃｏＲＩ及びＸ
ｂａＩの利用下に、たとえばＴｒｐ- プロモーターをＴ
ａｃ- プロモーターと（逆もまた同じ）本発明によるプ
ラスミド中で交換することもできる。
【００３１】Ｓ．Ｄ．- 配列と開始コドンＡＴＧとの間
の伸長された距離を有する本発明によるプラスミドを、
次の様に得ることができる：上記の様に構成されたプラ
スミド──これ中で上記距離、たとえば８ヌクレオチド
を有する──をＮｄｅＩで切断し、生じる切断部位を補
充し、次いで生じる平滑- 末端を連結する。それによっ
てＳ．Ｄ．- 配列と開始コドンとの間の距離がたとえば
１０ヌクレオチドである本発明によるプラスミドを形成
する。
の伸長された距離を有する本発明によるプラスミドを、
次の様に得ることができる：上記の様に構成されたプラ
スミド──これ中で上記距離、たとえば８ヌクレオチド
を有する──をＮｄｅＩで切断し、生じる切断部位を補
充し、次いで生じる平滑- 末端を連結する。それによっ
てＳ．Ｄ．- 配列と開始コドンとの間の距離がたとえば
１０ヌクレオチドである本発明によるプラスミドを形成
する。
【００３２】式Ｉの化合物に関する暗号を有する構造遺
伝子の構成に於て、セリンに関するコドンに続いて５'-
位にメチオニンに関するコドンを有するヌクレオチド配
列が好ましい。この構造遺伝子の発現に於て、Ｍｅｔ-
Ｓｅｒ- 結合の不安定性に基づき、Ｎ- 末端アミノ酸と
してセリンを有する式Ｉの夫々の化合物が得られる。式
Ｉの化合物に関する、構造遺伝子の適する５'-末端は、
次のものである（式Ｉの化合物のＮ- 末端基に関して夫
々Ｓｅｒ- Ｘ1-Ｘ2-領域及びカッコ内に暗号づけされ
た、しかしたん白質中にもはや含有されないメチオニン
基を記載する： Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ- ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ- ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ- ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ- ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ Ｃ
ＴＧ ＣＡＧ ＣＡＡ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｎ- ＧＴＴ ＣＣＡ ＴＧＣ ＡＡＣ 上述の様に、本発明によるプラスミドで形質転換された
細菌を用いて、極めて高い発現率がもたらされる。適当
な受容宿主微生物の形質転換は、公知方法で行われる。
本発明によるプラスミドの発現に関して、特に適する宿
主生物は大腸菌- 及び使用される腸内細菌- 種の株、た
とえばシュードモナス、サルモネラ、エンテロバクタ
ー、クレブシエラ又はセレイシアの菌株である。
伝子の構成に於て、セリンに関するコドンに続いて５'-
位にメチオニンに関するコドンを有するヌクレオチド配
列が好ましい。この構造遺伝子の発現に於て、Ｍｅｔ-
Ｓｅｒ- 結合の不安定性に基づき、Ｎ- 末端アミノ酸と
してセリンを有する式Ｉの夫々の化合物が得られる。式
Ｉの化合物に関する、構造遺伝子の適する５'-末端は、
次のものである（式Ｉの化合物のＮ- 末端基に関して夫
々Ｓｅｒ- Ｘ1-Ｘ2-領域及びカッコ内に暗号づけされ
た、しかしたん白質中にもはや含有されないメチオニン
基を記載する： Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ- ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ- ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ- ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ- ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ Ｃ
ＴＧ ＣＡＧ ＣＡＡ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｎ- ＧＴＴ ＣＣＡ ＴＧＣ ＡＡＣ 上述の様に、本発明によるプラスミドで形質転換された
細菌を用いて、極めて高い発現率がもたらされる。適当
な受容宿主微生物の形質転換は、公知方法で行われる。
本発明によるプラスミドの発現に関して、特に適する宿
主生物は大腸菌- 及び使用される腸内細菌- 種の株、た
とえばシュードモナス、サルモネラ、エンテロバクタ
ー、クレブシエラ又はセレイシアの菌株である。
【００３３】好ましい宿主生物は、大腸菌- 種、たとえ
ば大腸菌ＧＲＴ- １及び特に下部群Ｋ１２の大腸菌-
株、たとえば大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３８
７６）、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９４０
３）、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０５（ＤＳＭ４１６２）、大
腸菌- Ｋ１２- 株（ＡＴＣＣ３１４４６）又はまた大腸
菌Ｋ１２ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）である。
ば大腸菌ＧＲＴ- １及び特に下部群Ｋ１２の大腸菌-
株、たとえば大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３８
７６）、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９４０
３）、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０５（ＤＳＭ４１６２）、大
腸菌- Ｋ１２- 株（ＡＴＣＣ３１４４６）又はまた大腸
菌Ｋ１２ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）である。
【００３４】Ｔａｃ- プロモーターを含有する大腸菌-
発現系での発現開始を、たとえば乳糖添加又はブドウ糖
添加によって、好ましくはイソプロピル- β- Ｄ- チオ
ガラクトピラノシドの添加によって生じさせる。しかし
プラスミド中にＴｒｐ- プロモーターが存在する場合、
誘導をインドールアクリル- 、 -酢酸- 又は -プロピオ
ン酸で行うのが好ましい。他の公知の誘導は、当然同一
方法で利用することができる。
発現系での発現開始を、たとえば乳糖添加又はブドウ糖
添加によって、好ましくはイソプロピル- β- Ｄ- チオ
ガラクトピラノシドの添加によって生じさせる。しかし
プラスミド中にＴｒｐ- プロモーターが存在する場合、
誘導をインドールアクリル- 、 -酢酸- 又は -プロピオ
ン酸で行うのが好ましい。他の公知の誘導は、当然同一
方法で利用することができる。
【００３５】誘導及び一定の、前もって与えられた細胞
密度の達成の後に、細胞を遠心分離残渣を水性塩溶液中
に懸濁後たとえば均一機中に移し、それ中で細胞を圧力
差によって裂開する。新たな遠心分離の後、残渣中に式
Ｉの化合物の初期たん白質が水不溶性細胞破片等々と共
に得られる。グアニジンヒドロクロリド溶液で処理し
て、初期たん白質を溶解し、次いで新たに遠心分離の
後、上澄液をレドックス系（たとえば還元及び酸化グル
タチオンを含有する。）で処理する。それによって天然
構造の形成、すなわち目的の式Ｉの化合物の形成を生じ
させる。その時これは反応混合物中に溶解された形で存
在し、通常の精製工程（たとえばクロマトグラフィー分
離、次いで凍結乾燥）によって純粋な形で単離すること
ができる。
密度の達成の後に、細胞を遠心分離残渣を水性塩溶液中
に懸濁後たとえば均一機中に移し、それ中で細胞を圧力
差によって裂開する。新たな遠心分離の後、残渣中に式
Ｉの化合物の初期たん白質が水不溶性細胞破片等々と共
に得られる。グアニジンヒドロクロリド溶液で処理し
て、初期たん白質を溶解し、次いで新たに遠心分離の
後、上澄液をレドックス系（たとえば還元及び酸化グル
タチオンを含有する。）で処理する。それによって天然
構造の形成、すなわち目的の式Ｉの化合物の形成を生じ
させる。その時これは反応混合物中に溶解された形で存
在し、通常の精製工程（たとえばクロマトグラフィー分
離、次いで凍結乾燥）によって純粋な形で単離すること
ができる。
【００３６】分析目的で、試験すべきプラスミドを用い
て形質転換された大腸菌- 株を発酵し、前もって付与さ
れた、細胞懸濁液の光学密度を適する誘導剤で達成した
後、生じる初期たん白質の発現を誘導する様にして行う
のが有利である。適当な発酵期間の後、一部を取り出
し、次いでこれから遠心分離された細胞を、リゾチーム
（ｐＨ８．０の５０ｍＭトリスヒドロクロリド緩衝液、
５０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５％サッカロースｍｌあたり
１ｍｇリゾチーム）で溶解する。溶解された細胞の均一
物を、４−５Ｍグアニジニウムヒドロクロリド溶液中に
溶解し、１．２Ｍグアニジニウムヒドロクロリドで希釈
後、還元剤（グルタチオン、メルカプトエタノール又は
システイン）の添加下に２−五時間逆戻り反応を行う
（たとえばヴィンクラー(Winkler) 等、Biochim.２５
（１９８６）４０４１〜４０４５１参照）。得られた１
本鎖式Ｉの化合物を、プラスミンの添加によって２本鎖
ｒｔｃｕ- ＰＡに変え、次いでその活性を基質Ｓ２４４
４ｐｙｒｏＧｌｙ- Ａｒｇ- ｐ-ニトロアニリド──こ
れは２本鎖の活性ウロキナーゼによってしか分離されな
い──で測定する。プラスミンでの式Ｉの化合物のこの
活性化は、５０ｍＭトリス- 緩衝液、１２ｍＭ塩化ナト
リウム、０．０２％トウィーン８０中でｐＨ７．４及び
３７℃で行われる。試験物質とプラスミンの割合は、モ
ル濃度あたり約１００〜１５００：１、あるいは酵素単
位あたり約８．０００〜３６．０００：１である。テス
ト培養は、５０ｍＭトリス- 緩衝液、３８ｍＭ塩化ナト
リウム中でＰＨ８．８で０．３６μＭアプロチニン（プ
ラスミン阻止のために）及び０．２７ｍＭ基質の存在下
に３７℃で行われる。試料の式Ｉの化合物含有量に応じ
て反応を、５〜６０分の培養後５０％酢酸の添加によっ
て停止し、吸光を４０５ｎｍで測定する。基質(Kabi Vi
trum, スウエーデン）の生産者の指令に従って、この処
理法で４０５ｎｍで分あたり０．０５の吸光変化は、２
５プラーク- 単位／ｍｌテスト溶液の活性を意味する。
て形質転換された大腸菌- 株を発酵し、前もって付与さ
れた、細胞懸濁液の光学密度を適する誘導剤で達成した
後、生じる初期たん白質の発現を誘導する様にして行う
のが有利である。適当な発酵期間の後、一部を取り出
し、次いでこれから遠心分離された細胞を、リゾチーム
（ｐＨ８．０の５０ｍＭトリスヒドロクロリド緩衝液、
５０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５％サッカロースｍｌあたり
１ｍｇリゾチーム）で溶解する。溶解された細胞の均一
物を、４−５Ｍグアニジニウムヒドロクロリド溶液中に
溶解し、１．２Ｍグアニジニウムヒドロクロリドで希釈
後、還元剤（グルタチオン、メルカプトエタノール又は
システイン）の添加下に２−五時間逆戻り反応を行う
（たとえばヴィンクラー(Winkler) 等、Biochim.２５
（１９８６）４０４１〜４０４５１参照）。得られた１
本鎖式Ｉの化合物を、プラスミンの添加によって２本鎖
ｒｔｃｕ- ＰＡに変え、次いでその活性を基質Ｓ２４４
４ｐｙｒｏＧｌｙ- Ａｒｇ- ｐ-ニトロアニリド──こ
れは２本鎖の活性ウロキナーゼによってしか分離されな
い──で測定する。プラスミンでの式Ｉの化合物のこの
活性化は、５０ｍＭトリス- 緩衝液、１２ｍＭ塩化ナト
リウム、０．０２％トウィーン８０中でｐＨ７．４及び
３７℃で行われる。試験物質とプラスミンの割合は、モ
ル濃度あたり約１００〜１５００：１、あるいは酵素単
位あたり約８．０００〜３６．０００：１である。テス
ト培養は、５０ｍＭトリス- 緩衝液、３８ｍＭ塩化ナト
リウム中でＰＨ８．８で０．３６μＭアプロチニン（プ
ラスミン阻止のために）及び０．２７ｍＭ基質の存在下
に３７℃で行われる。試料の式Ｉの化合物含有量に応じ
て反応を、５〜６０分の培養後５０％酢酸の添加によっ
て停止し、吸光を４０５ｎｍで測定する。基質(Kabi Vi
trum, スウエーデン）の生産者の指令に従って、この処
理法で４０５ｎｍで分あたり０．０５の吸光変化は、２
５プラーク- 単位／ｍｌテスト溶液の活性を意味する。
【００３７】
【実施例】例中に使用される制限酵素は市販されている
（たとえばNachr. Chem. Techn.Lab.３５，９３９，１
９８７）。
（たとえばNachr. Chem. Techn.Lab.３５，９３９，１
９８７）。
【００３８】例中で使用される培養培地も、市販されて
いる。
いる。
【００３９】〔例１〕Ｔａｃ- プロモーターの調節下で
合成遺伝子を有する図９による式Ｉの化合物に関する発
現プラスミドＰＧＲ Ｔａｃ０６の構成。 ａ）プラスミドｐＢＦ １５８の構成 ｉ）プラスミドｐＢＦ ３２２（Pharmacia, No.２７−
４９０２，４３６３ｂｐ）から、塩基２２０７と２２６
３の間に存在するｎｉｃ／ｂｏｍ域を次の様に除去する
（ヴィナカー(Winnacker) 、 "遺伝子とクローン" 、Ｖ
ＣＨ出版社、ヴァインハイム１９８５、第２９８頁参
照）（図２も参照）：ｐＢＲ３２２を、塩基２２９８で
ＮｄｅＩにより切断し、それによって線状となる。上方
の末端を "fill in"反応を介して補充し、それによって
平滑- 末端が得られる (マニアチス(Maniatis)等、 "分
子クローニング" 、コールドスプリングハーバー研究
所、１９８２参照）。その後塩基２０６８でＰｖｕＩＩ
を用いて切断し、ｐＢＲ３２２の残った部分の２つの平
滑末端を常法に従ってＴ４- リガーゼで再び連結する。
次いで連結混合物をコムピテント大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０
３細胞（ＡＴＣＣ３９４０３）中で形質転換する。（ハ
ナハン(Hanahan) 、 "ＤＮＡクローニング" 第Ｉ巻、Ｉ
ＲＬプレスオックスフォード１９８５、第１０９−１３
５頁参照）。形質転換された細胞を、培地上で１５０μ
ｇアンピシリン／ｍｌの添加下に培養する。得られたク
ローンから、プラスミドｐＢＦ１５７を含有するクロー
ンを選択する。このプラスミドは、出発プラスミドｐＢ
Ｒ３２２と２３０ヌクレオチドだけ小さいａ）ＰｓｔＩ
×ＢｓｐＭ ＩＩ- 、ｂ）ＰｓｔＩ×ＢａｌｖＩ- 、
ｃ）ＰｓｔＩ×ＡｖａＩ- 断片の点で異なる。ｐＢＲ３
２２の２つの単一切断部位ＰｖｕＩＩ及びＮｄｅＩは、
プラスミドｐＢＦ１５７中にもはや在しない。 ｉｉ）ｐＢＦ１５７から、テトラサイクリン耐性遺伝子
の大部分をＥｃｏＲＶ×ＮｒｕＩでの切断、次いで生じ
る平滑末端の連結によって除去する。大腸菌Ｋ１２、Ｊ
Ｍ１０３中で形質転換し、１５０μｇアンピシリン／ｍ
ｌを含有する培地上で培養した後、クローンが得られ、
このクローンからプラスミドｐＢＦ１５８を含有するプ
ラスミドを選択する。これらはＰＢＦ１５７より７８７
ヌクレオチド小さく、その上Ｂａｍ ＨＩ- 切断部位の
欠落の点で異なる。細菌株のｐＢＦ１５８での形質転換
は、細菌にテストサイクリン耐性を付与しない。 ｂ）ｐＢＦ１５８- ０１の構成、合成マルチクローニン
グサイトの組み込み。
合成遺伝子を有する図９による式Ｉの化合物に関する発
現プラスミドＰＧＲ Ｔａｃ０６の構成。 ａ）プラスミドｐＢＦ １５８の構成 ｉ）プラスミドｐＢＦ ３２２（Pharmacia, No.２７−
４９０２，４３６３ｂｐ）から、塩基２２０７と２２６
３の間に存在するｎｉｃ／ｂｏｍ域を次の様に除去する
（ヴィナカー(Winnacker) 、 "遺伝子とクローン" 、Ｖ
ＣＨ出版社、ヴァインハイム１９８５、第２９８頁参
照）（図２も参照）：ｐＢＲ３２２を、塩基２２９８で
ＮｄｅＩにより切断し、それによって線状となる。上方
の末端を "fill in"反応を介して補充し、それによって
平滑- 末端が得られる (マニアチス(Maniatis)等、 "分
子クローニング" 、コールドスプリングハーバー研究
所、１９８２参照）。その後塩基２０６８でＰｖｕＩＩ
を用いて切断し、ｐＢＲ３２２の残った部分の２つの平
滑末端を常法に従ってＴ４- リガーゼで再び連結する。
次いで連結混合物をコムピテント大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０
３細胞（ＡＴＣＣ３９４０３）中で形質転換する。（ハ
ナハン(Hanahan) 、 "ＤＮＡクローニング" 第Ｉ巻、Ｉ
ＲＬプレスオックスフォード１９８５、第１０９−１３
５頁参照）。形質転換された細胞を、培地上で１５０μ
ｇアンピシリン／ｍｌの添加下に培養する。得られたク
ローンから、プラスミドｐＢＦ１５７を含有するクロー
ンを選択する。このプラスミドは、出発プラスミドｐＢ
Ｒ３２２と２３０ヌクレオチドだけ小さいａ）ＰｓｔＩ
×ＢｓｐＭ ＩＩ- 、ｂ）ＰｓｔＩ×ＢａｌｖＩ- 、
ｃ）ＰｓｔＩ×ＡｖａＩ- 断片の点で異なる。ｐＢＲ３
２２の２つの単一切断部位ＰｖｕＩＩ及びＮｄｅＩは、
プラスミドｐＢＦ１５７中にもはや在しない。 ｉｉ）ｐＢＦ１５７から、テトラサイクリン耐性遺伝子
の大部分をＥｃｏＲＶ×ＮｒｕＩでの切断、次いで生じ
る平滑末端の連結によって除去する。大腸菌Ｋ１２、Ｊ
Ｍ１０３中で形質転換し、１５０μｇアンピシリン／ｍ
ｌを含有する培地上で培養した後、クローンが得られ、
このクローンからプラスミドｐＢＦ１５８を含有するプ
ラスミドを選択する。これらはＰＢＦ１５７より７８７
ヌクレオチド小さく、その上Ｂａｍ ＨＩ- 切断部位の
欠落の点で異なる。細菌株のｐＢＦ１５８での形質転換
は、細菌にテストサイクリン耐性を付与しない。 ｂ）ｐＢＦ１５８- ０１の構成、合成マルチクローニン
グサイトの組み込み。
【００４０】ｐＢＦ１５８から、Ｅｃｏ ＲＩ×Ｈｉｎ
ｄＩＩＩでの切断によって大きさ３１ヌクレオチドの断
片を除去し、裂け目に合成マルチクローニングサイトを
連結する。その配列を、図３中に描写する。大腸菌Ｋ１
２ＪＭ１０３中で連結混合物を形質転換し、１５０μｇ
アンピシリン／ｍｌを有する培地上で培養した後、プラ
スミドｐＢＦ１５８- ０１を含有するクローンを選択す
る。このクローンはｐＢＦ１５８と付加的な単一切断部
位ＸｂａＩ、ＮｄｅＩ、ＳａｃＩ、ＥａｇＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＳｐｅＩ並びに第二ＰｓｔＩ- 切断部位の点で異な
る（図５）。ＸｂａＩとＸｄｅＩとの間には、B. subti
lis のＸｙｌオペロンからのＳ．Ｄ．配列が存在する
（ウィルヘルム等、上記参照）。 ｃ）ｐＢＦ１５８- ０１Ｔの構成、転写ターミネーター
の組み込み。
ｄＩＩＩでの切断によって大きさ３１ヌクレオチドの断
片を除去し、裂け目に合成マルチクローニングサイトを
連結する。その配列を、図３中に描写する。大腸菌Ｋ１
２ＪＭ１０３中で連結混合物を形質転換し、１５０μｇ
アンピシリン／ｍｌを有する培地上で培養した後、プラ
スミドｐＢＦ１５８- ０１を含有するクローンを選択す
る。このクローンはｐＢＦ１５８と付加的な単一切断部
位ＸｂａＩ、ＮｄｅＩ、ＳａｃＩ、ＥａｇＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＳｐｅＩ並びに第二ＰｓｔＩ- 切断部位の点で異な
る（図５）。ＸｂａＩとＸｄｅＩとの間には、B. subti
lis のＸｙｌオペロンからのＳ．Ｄ．配列が存在する
（ウィルヘルム等、上記参照）。 ｃ）ｐＢＦ１５８- ０１Ｔの構成、転写ターミネーター
の組み込み。
【００４１】ｐＮＥ１５８- ０１ＷＹ：マルチクローニ
ングサイトのＣｌａＩ×ＨｉｎｄＩＩＩ断片を除去し、
Ｔｎ１０からのｔｅｔ Ａ／ｏｒｆ Ｌターミネーター
（ショルマイヤー等々、上記参照）が存在するｐＲＴ６
１からのＣｌａＩ×ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ヨルゲンセン
等、上記参照）に替える。
ングサイトのＣｌａＩ×ＨｉｎｄＩＩＩ断片を除去し、
Ｔｎ１０からのｔｅｔ Ａ／ｏｒｆ Ｌターミネーター
（ショルマイヤー等々、上記参照）が存在するｐＲＴ６
１からのＣｌａＩ×ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ヨルゲンセン
等、上記参照）に替える。
【００４２】菌株大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３中で形質転換
し、１５０μｇアンピリシン／ｍｌを有する培地上で培
養した後、プラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔを含有する
クローンを選択する。このクローンはｐＢＦ１５８- ０
１と２９７ヌクレオチドだけ大きいＣｌａＩ×Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片の点で異なる（図６）。 ｄ）暗号を有する遺伝子に関する合成断片Ｍ４- Ｍ８の
組み込み、プラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ- ｐＢＦ１
５８- ０６Ｔの構成。
し、１５０μｇアンピリシン／ｍｌを有する培地上で培
養した後、プラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔを含有する
クローンを選択する。このクローンはｐＢＦ１５８- ０
１と２９７ヌクレオチドだけ大きいＣｌａＩ×Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片の点で異なる（図６）。 ｄ）暗号を有する遺伝子に関する合成断片Ｍ４- Ｍ８の
組み込み、プラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ- ｐＢＦ１
５８- ０６Ｔの構成。
【００４３】すべての合成断片を、図７−１１中に記載
する。これらを長さ約２００ヌクレオチドの２本鎖断片
として当該ベクター中に使用する。更にベクターを、そ
の都度挙げた切断部位に相当する制限酵素で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動、電気溶離及び精製によってＤＥ
５２に経て除去すべき断片を分離する。その後付随する
２本鎖合成断片との連結は、Ｔ４- リガーゼを用いて行
われ、形質転換は大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３中で行われ
（図１２−１４）及び選択はアンピシリン- 含有培地上
で行われる。 ｉ）プラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔ中のＢａｍ ＨＩ
とＣｌａＩとの間の断片Ｍ８の連結反応。
する。これらを長さ約２００ヌクレオチドの２本鎖断片
として当該ベクター中に使用する。更にベクターを、そ
の都度挙げた切断部位に相当する制限酵素で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動、電気溶離及び精製によってＤＥ
５２に経て除去すべき断片を分離する。その後付随する
２本鎖合成断片との連結は、Ｔ４- リガーゼを用いて行
われ、形質転換は大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３中で行われ
（図１２−１４）及び選択はアンピシリン- 含有培地上
で行われる。 ｉ）プラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔ中のＢａｍ ＨＩ
とＣｌａＩとの間の断片Ｍ８の連結反応。
【００４４】プラスミド１５８- ０２Ｔが生じる。オリ
ゴヌクレオチド０１９は、式Ｉの化合物のＣ- 末端配列
を有する。停止- コドンＴＡＡの後にＮｈｅＩ切断部位
が存在し、これは付加的な、ＴｒｐＡターミネーター
（クリスティー(Christie)等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７８
（１９８１）４１８０−４１８４参照）の転写ターミネ
ーターないしＣｌａＩを有する。 ｉｉ）プラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ中でのＳｐｅＩ
とＢａｍ ＨＩとの間の断片Ｍ７の連結反応。
ゴヌクレオチド０１９は、式Ｉの化合物のＣ- 末端配列
を有する。停止- コドンＴＡＡの後にＮｈｅＩ切断部位
が存在し、これは付加的な、ＴｒｐＡターミネーター
（クリスティー(Christie)等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７８
（１９８１）４１８０−４１８４参照）の転写ターミネ
ーターないしＣｌａＩを有する。 ｉｉ）プラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ中でのＳｐｅＩ
とＢａｍ ＨＩとの間の断片Ｍ７の連結反応。
【００４５】プラスミド１５８- ０３Ｔが生じる。 ｉｉｉ）プラスミドＰＢＦ１５８- ０３Ｔ中でのＫｐｎ
ＩとＳｐｅＩとの間の断片Ｍ６の連結反応。
ＩとＳｐｅＩとの間の断片Ｍ６の連結反応。
【００４６】プラスミドｐＢＦ１５８- ０４Ｔが生じ
る。 ｉｖ）プラスミドｐＢＦ１５８- ０４Ｔ中でのＥａｇＩ
及びＫｐｎＩとの間の断片Ｍ５の連結反応。
る。 ｉｖ）プラスミドｐＢＦ１５８- ０４Ｔ中でのＥａｇＩ
及びＫｐｎＩとの間の断片Ｍ５の連結反応。
【００４７】プラスミドｐＢＦ１５８- ０５Ｔが生じ
る。 ｖ）プラスミドｐＢＦ１５８- ０５Ｔ中でのＳａｃＩと
ＥａｇＩとの断片Ｍ４の連結反応。
る。 ｖ）プラスミドｐＢＦ１５８- ０５Ｔ中でのＳａｃＩと
ＥａｇＩとの断片Ｍ４の連結反応。
【００４８】プラスミドｐＢＦ１５８- ０６Ｔが生じ
る。
る。
【００４９】得られたクローンｉ−ｖから夫々次の様な
クローンを選択する。それは夫々調べられた正しい配列
中に組み込まれた新規断片が存在する点で夫々の前駆体
と異なっている。 ｅ）プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６の構成、Ｔａｃプロ
モーターの組み込み。
クローンを選択する。それは夫々調べられた正しい配列
中に組み込まれた新規断片が存在する点で夫々の前駆体
と異なっている。 ｅ）プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６の構成、Ｔａｃプロ
モーターの組み込み。
【００５０】プラスミドｐＢＦ１５８- ０６Ｔを、Ｅｃ
ｏＲＩとＸｂａＩで切断する。生じる長さ２６ヌクレオ
チドの断片を、分取アガロース電気泳動によって分離
し、プラスミドの残部を電気溶離によって溶離し、次い
でＤＥ５２を介して精製する。
ｏＲＩとＸｂａＩで切断する。生じる長さ２６ヌクレオ
チドの断片を、分取アガロース電気泳動によって分離
し、プラスミドの残部を電気溶離によって溶離し、次い
でＤＥ５２を介して精製する。
【００５１】プラスミドｐｔａｃ ＳＤＴ（ＤＳＭ５０
１８）から、Ｔａｃプロモーターを有するＥｃｏＲＩ×
ＸｂａＩ断片を単離する。更にｐｔａｃ ＳＤＴをＥｃ
ｏＲＩ×ＸｂａＩで切断し、断片を分取ＰＡＧＥによっ
て分離する。断片を、酢酸アンモニウム／ＳＤＳ- 緩衝
液、ｐＨ８．０に加熱して、機械で細片化されたプラス
ミドを溶離し、１Ｍトリス、ｐＨ８で飽和されたフエノ
ールで数回抽出して精製する。
１８）から、Ｔａｃプロモーターを有するＥｃｏＲＩ×
ＸｂａＩ断片を単離する。更にｐｔａｃ ＳＤＴをＥｃ
ｏＲＩ×ＸｂａＩで切断し、断片を分取ＰＡＧＥによっ
て分離する。断片を、酢酸アンモニウム／ＳＤＳ- 緩衝
液、ｐＨ８．０に加熱して、機械で細片化されたプラス
ミドを溶離し、１Ｍトリス、ｐＨ８で飽和されたフエノ
ールで数回抽出して精製する。
【００５２】２つの得られた断片を、常法でＴ４- リガ
ーゼで連結し、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３中に形質転換す
る。１５０μｇアンピシリン／ｍｌを有する培地上で培
養した後に、図９による式Ｉの化合物 "ＰＡ／０６" に
関する初期たん白質を産生するクローンを選択する。こ
のクローンは、プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６を含有す
る。 ｆ）発現テスト ｉ）発酵 種々のプラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６で形質転換された
大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３を、３８ｍＭ硫酸アンモニウ
ム、５６ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ硫酸マ
グソシウム、１％酵母抽出物、１％ブドウ糖から成る培
地──これは１ｌあたり１５０ｍｇアンピシリンを含有
する──中で発酵し、０．５ｍＭＩＰＴＧを用いて化合
物ＰＡ／０６の初期たん白質の発現を誘導する。
ーゼで連結し、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３中に形質転換す
る。１５０μｇアンピシリン／ｍｌを有する培地上で培
養した後に、図９による式Ｉの化合物 "ＰＡ／０６" に
関する初期たん白質を産生するクローンを選択する。こ
のクローンは、プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６を含有す
る。 ｆ）発現テスト ｉ）発酵 種々のプラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６で形質転換された
大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３を、３８ｍＭ硫酸アンモニウ
ム、５６ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ硫酸マ
グソシウム、１％酵母抽出物、１％ブドウ糖から成る培
地──これは１ｌあたり１５０ｍｇアンピシリンを含有
する──中で発酵し、０．５ｍＭＩＰＴＧを用いて化合
物ＰＡ／０６の初期たん白質の発現を誘導する。
【００５３】誘導前及び全体で６時間の誘導後の毎時
間、５７８ｎｍで光学密度（ＯＤ）１を有する細胞懸濁
液１ｍｌに相当する細胞を遠心分離し、発現率のテスト
に使用する。 ｉｉ）化合物ＰＡ／０６への初期たん白質の逆戻り、対
応する２本鎖化合物へのその分解及びそのＰＡ- 活性測
定。
間、５７８ｎｍで光学密度（ＯＤ）１を有する細胞懸濁
液１ｍｌに相当する細胞を遠心分離し、発現率のテスト
に使用する。 ｉｉ）化合物ＰＡ／０６への初期たん白質の逆戻り、対
応する２本鎖化合物へのその分解及びそのＰＡ- 活性測
定。
【００５４】遠心分離された細胞を、上述した様に、リ
ゾチームで溶解し、次いで溶解された細胞の均一物を活
性測定のために上述の様に使用する。
ゾチームで溶解し、次いで溶解された細胞の均一物を活
性測定のために上述の様に使用する。
【００５５】（初期たん白質によって得られる）化合物
ＰＡ／０６から形成された２本鎖プラスミノーゲンアク
チベーターの活性測定によって検出された化合物ＰＡ／
０６又はその初期たん白質に関する発現率を、図１８に
示す。この活性は、プラスミンで分解した後にしか得ら
れず（図１８参照）、それ故に化合物ＰＡ／０６（又は
初期たん白質）を１本鎖で駆出する。
ＰＡ／０６から形成された２本鎖プラスミノーゲンアク
チベーターの活性測定によって検出された化合物ＰＡ／
０６又はその初期たん白質に関する発現率を、図１８に
示す。この活性は、プラスミンで分解した後にしか得ら
れず（図１８参照）、それ故に化合物ＰＡ／０６（又は
初期たん白質）を１本鎖で駆出する。
【００５６】〔例２〕 発現プラスミドｐＧＲ Ｔｒｐ０６の構成 デヴエール(DeBoer)糖によってＰＮＡＳ８０（１９８
３）２１−２５中に記載されたＴｒｐ- プロモーターの
配列を、ＸｂａＩ- 切断部位まで受け継ぎ、５'-末端が
配列５'-ＡＡＴＴＣＴ ＣＡＡＡＴ- ３' によって伸び
長される。それによってＥｃｏ ＲＩ- 切断部位を構成
する（図１７、断片Ｍ１）。１本鎖０２１及び０２１Ａ
を、やきもどし、ＥｃｏＲＩ×ＸｂａＩ中に切断された
プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６を連結する。大腸菌Ｋ１
２ＪＭ１０３中で形質転換し、１５０μｇアンピシリン
／ｍｌを有する培地上で培養した後に、ｐＧＲ Ｔｒｐ
０６を含有するクローンを選択する。Ｖｙｃ ｈｊ ｐ
ＧＲ Ｔｒｐ０６は、前記のすべての前駆体と、これを
用いて形質転換された大腸菌株がインドールアクリル酸
の添加で化合物ＰＡ／０６の初期たん白質を駆出する点
で異なる。
３）２１−２５中に記載されたＴｒｐ- プロモーターの
配列を、ＸｂａＩ- 切断部位まで受け継ぎ、５'-末端が
配列５'-ＡＡＴＴＣＴ ＣＡＡＡＴ- ３' によって伸び
長される。それによってＥｃｏ ＲＩ- 切断部位を構成
する（図１７、断片Ｍ１）。１本鎖０２１及び０２１Ａ
を、やきもどし、ＥｃｏＲＩ×ＸｂａＩ中に切断された
プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６を連結する。大腸菌Ｋ１
２ＪＭ１０３中で形質転換し、１５０μｇアンピシリン
／ｍｌを有する培地上で培養した後に、ｐＧＲ Ｔｒｐ
０６を含有するクローンを選択する。Ｖｙｃ ｈｊ ｐ
ＧＲ Ｔｒｐ０６は、前記のすべての前駆体と、これを
用いて形質転換された大腸菌株がインドールアクリル酸
の添加で化合物ＰＡ／０６の初期たん白質を駆出する点
で異なる。
【００５７】〔例３〕 ａ）発現プラスミドｐＧＲ３１８の構成 プラスミドｐＧＲ Ｔｒｐ０６を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断する。マルチクローニングサイトに属す
る生じる長さ５８ヌクレオチドの断片を、分取アガロー
スゲル電気泳動によって分離する。ｐＢＲ３２２の残存
する部分を電気溶離によってゲルから溶し、ＤＥ５２を
介して精製する。
ｄＩＩＩで切断する。マルチクローニングサイトに属す
る生じる長さ５８ヌクレオチドの断片を、分取アガロー
スゲル電気泳動によって分離する。ｐＢＲ３２２の残存
する部分を電気溶離によってゲルから溶し、ＤＥ５２を
介して精製する。
【００５８】この断片を、合成オリゴヌクレオチド１８ ５'-ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＴ- ３' ＡＣ ＴＣＧ ＴＴＡ Ｃ と常法でＴ４- リガーゼで連結し、大腸菌Ｋ１２中で転
質転換し、アンピシリン- 含有培地上で培養する。この
プラスミドはインドールアクリル酸の添加後化合物 "Ｐ
Ａ３１８" に関する、図１９に記載したアミノ酸配列の
暗号を有する。 ｂ）発現テスト 大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３を、プラスミドｐＧＲ３１８で
形質転換し、例１に記載した様に発酵する。誘導は、５
７８ｎｍで光学密度２−３で１発酵培地につき６２ｍｇ
インドールアクリル酸を用いて行われる。
質転換し、アンピシリン- 含有培地上で培養する。この
プラスミドはインドールアクリル酸の添加後化合物 "Ｐ
Ａ３１８" に関する、図１９に記載したアミノ酸配列の
暗号を有する。 ｂ）発現テスト 大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３を、プラスミドｐＧＲ３１８で
形質転換し、例１に記載した様に発酵する。誘導は、５
７８ｎｍで光学密度２−３で１発酵培地につき６２ｍｇ
インドールアクリル酸を用いて行われる。
【００５９】誘導前及び全体で５時間の誘導後の毎時
間、５７８ｎｍで光学密度１を有する細胞懸濁液１ｍｌ
に相当する細胞を遠心分離し、発現率のテストに使用す
る。
間、５７８ｎｍで光学密度１を有する細胞懸濁液１ｍｌ
に相当する細胞を遠心分離し、発現率のテストに使用す
る。
【００６０】初期たん白質（例１参照）の化合物ＰＡ３
１８への逆戻りの後、アミド分解活性を誘導前及び誘導
に１〜５時間後に集められた試料中で、プラスミンでの
処理前及び処理後に測定する。その結果を、図２０に示
す。これから、プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６による発
現率（２〜３の他の初期たん白質の発現に対して）と同
等の発現率が生じ、アミド分解活性がプラスミンでの分
解後しか得ることができないことが明らかである。それ
故に式ＩのＰＡ３１８の化合物を、ｐＧＲ３１８を有す
る大腸菌Ｋ１２（初期たん白質として）から一本鎖で駆
出する。 ｃ）単離、精製及びたん白化学による確認 単離、精製及びたん白化学による確認のために、１ｌ発
酵を調節されたｐＨ-及び温度条件下で実施する（ｐＨ
７．０、３７℃）。この条件は（５７８ｍｍで測定され
た）２０までの光学密度の達成を可能にする。発現の終
了後（約５〜６時間）、細胞懸濁液５０ｍｌを遠心分離
し、細胞沈殿をＨ2 Ｏ４０ｍｌ中に再懸濁し、高圧均一
器中で枠開する。遠心分離後、不活性な初期たん白質を
含有する沈殿を５Ｍグアニジンヒドロクロリド１００ｍ
ｌ、４０ｍＭシステイン、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０
に調整）中に溶解し、２５ｍＭトリス- 緩衝液、ｐＨ
９．０、４００ｍｌで希釈する。空気酸素の侵入又は作
用下で、逆戻りを１２時間後に終了する。
１８への逆戻りの後、アミド分解活性を誘導前及び誘導
に１〜５時間後に集められた試料中で、プラスミンでの
処理前及び処理後に測定する。その結果を、図２０に示
す。これから、プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６による発
現率（２〜３の他の初期たん白質の発現に対して）と同
等の発現率が生じ、アミド分解活性がプラスミンでの分
解後しか得ることができないことが明らかである。それ
故に式ＩのＰＡ３１８の化合物を、ｐＧＲ３１８を有す
る大腸菌Ｋ１２（初期たん白質として）から一本鎖で駆
出する。 ｃ）単離、精製及びたん白化学による確認 単離、精製及びたん白化学による確認のために、１ｌ発
酵を調節されたｐＨ-及び温度条件下で実施する（ｐＨ
７．０、３７℃）。この条件は（５７８ｍｍで測定され
た）２０までの光学密度の達成を可能にする。発現の終
了後（約５〜６時間）、細胞懸濁液５０ｍｌを遠心分離
し、細胞沈殿をＨ2 Ｏ４０ｍｌ中に再懸濁し、高圧均一
器中で枠開する。遠心分離後、不活性な初期たん白質を
含有する沈殿を５Ｍグアニジンヒドロクロリド１００ｍ
ｌ、４０ｍＭシステイン、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０
に調整）中に溶解し、２５ｍＭトリス- 緩衝液、ｐＨ
９．０、４００ｍｌで希釈する。空気酸素の侵入又は作
用下で、逆戻りを１２時間後に終了する。
【００６１】化合物ＰＡ３１８を、クロマトグラフィー
で単離し、精製する。Ｎ- 末端配列分析によって、一方
で一本鎖性、他方で所望のＮ- 末端配列を確認する。
で単離し、精製する。Ｎ- 末端配列分析によって、一方
で一本鎖性、他方で所望のＮ- 末端配列を確認する。
【００６２】〔例４〕 ａ）発現プラスミドｐＧＲ３１９の構成 プラスミトｐＧＲ Ｔｒｐ０６を、例３ａに記載した様
にＮｄｅＩ及びＳａｃＩで切断し、大きい断片を単離す
る。
にＮｄｅＩ及びＳａｃＩで切断し、大きい断片を単離す
る。
【００６３】この断片を、合成オリゴヌクレオチド１９ ５'-ＴＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＴ- ３' ＡＣ ＴＣＧ ＴＴＡ ＣＴＴ Ｃ と常法でＴ４- リガーゼで連結し、大腸菌Ｋ１２中で転
質転換し、アンピシリン- 含有培地上で培養する。この
クローンは、インドールアクリル酸の添加後化合物Ｉ
"ＰＡ３１９" に関する、初期たん白質を産生する。こ
のクローンは図１９に記載したアミノ酸配列の暗号を有
するプラスミドｐＧＲ３１９を含有する。 ｂ）発現テスト プラスミドｐＧＲ３１９で形質転換された大腸菌Ｋ１２
ＪＭ１０３を誘導し、次いで例３ｂに記載した様に試料
をテストのために集める。
質転換し、アンピシリン- 含有培地上で培養する。この
クローンは、インドールアクリル酸の添加後化合物Ｉ
"ＰＡ３１９" に関する、初期たん白質を産生する。こ
のクローンは図１９に記載したアミノ酸配列の暗号を有
するプラスミドｐＧＲ３１９を含有する。 ｂ）発現テスト プラスミドｐＧＲ３１９で形質転換された大腸菌Ｋ１２
ＪＭ１０３を誘導し、次いで例３ｂに記載した様に試料
をテストのために集める。
【００６４】単離、精製及びたん白質化学による確認
は、例３ｃに記載した様に行われる。
は、例３ｃに記載した様に行われる。
【００６５】初期たん白質の化合物 "ＰＡ３１９" への
逆戻り及び発現率の測定は、例３ｂ中に記載された様に
行われる。その結果を図２０中に示す。これから、プラ
スミドｐＧＲ Ｔａｃ０６を用いて他の初期単白質を発
現した場合の発現率と同等の発現率が生じ、アミド分解
活性がプラスミンでの分解後しか得ることができないこ
とが明らかである。それ故にＰＡ３１９を、ｐＧＲ３１
８を有する大腸菌Ｋ１２（初期たん白質として）から一
本鎖で駆出する。
逆戻り及び発現率の測定は、例３ｂ中に記載された様に
行われる。その結果を図２０中に示す。これから、プラ
スミドｐＧＲ Ｔａｃ０６を用いて他の初期単白質を発
現した場合の発現率と同等の発現率が生じ、アミド分解
活性がプラスミンでの分解後しか得ることができないこ
とが明らかである。それ故にＰＡ３１９を、ｐＧＲ３１
８を有する大腸菌Ｋ１２（初期たん白質として）から一
本鎖で駆出する。
【００６６】〔例５〕 ａ）発現プラスミドｐＧＲ３２７の構成 プラスミドｐＧＲ Ｔｒｐ６０を例３ａに記載した様に
ＮｄｅＩ及びＳａｃＩで切断し、大きい断片を単離す
る。
ＮｄｅＩ及びＳａｃＩで切断し、大きい断片を単離す
る。
【００６７】この断片を、合成オリゴヌクレオチド２７ ５'-ＴＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＴ- ３' ＡＣ ＴＣＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＣＴＴ Ｃ と、常法でＴ４- リガーゼで連結し、大腸菌Ｋ１２中で
形質転換する。クローンの選択及び選抜は、例３ａに記
載した様に行われる。選択されたクローンは、プラスミ
ドｐＧＲ３２７を含有し、このプラスミドは、図１６に
記載されたアミノ酸配列を有する式Ｉの化合物 "ＰＡ３
２７" に関すく暗号を有する。 ｂ）発現テスト プラスミドｐＧＲ３２７を有する大腸菌Ｋ１２を、発酵
し、発現率を例３ｂに記載した様にテストする。これか
ら、プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６での発現率と同等の
発現率（しかし他の初期たん白質の発現で）を生じ、プ
ラスミンによる分解後でしかこの活性を得ることができ
ないことが明らかである。それ故に、化合物 "ＰＡ３２
７" を、プラスミドｐＧＲ３２７を有する大腸菌Ｋ１２
（初期たん白質として）によって一本鎖で駆出する。
形質転換する。クローンの選択及び選抜は、例３ａに記
載した様に行われる。選択されたクローンは、プラスミ
ドｐＧＲ３２７を含有し、このプラスミドは、図１６に
記載されたアミノ酸配列を有する式Ｉの化合物 "ＰＡ３
２７" に関すく暗号を有する。 ｂ）発現テスト プラスミドｐＧＲ３２７を有する大腸菌Ｋ１２を、発酵
し、発現率を例３ｂに記載した様にテストする。これか
ら、プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６での発現率と同等の
発現率（しかし他の初期たん白質の発現で）を生じ、プ
ラスミンによる分解後でしかこの活性を得ることができ
ないことが明らかである。それ故に、化合物 "ＰＡ３２
７" を、プラスミドｐＧＲ３２７を有する大腸菌Ｋ１２
（初期たん白質として）によって一本鎖で駆出する。
【００６８】単離、精製及び単白質化学による確認は、
例３ａに記載した様に行われる。
例３ａに記載した様に行われる。
【００６９】〔例６〕プラスミドｐＧＲ Ｔｒｐ０６
を、例３ａに記載した様にＮｄｅＩ及びＳａｃＩで切断
し、大きい断片を単離する。
を、例３ａに記載した様にＮｄｅＩ及びＳａｃＩで切断
し、大きい断片を単離する。
【００７０】この断片を、合成オリゴヌクレオチド３６ ５'-ＴＡＴＧ ＡＧＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＴ- ３' ＡＣ ＴＣＧ ＧＧＴ ＧＧＴ ＣＴＴ Ｃ と、常法でＴ４- リガーゼで連結し、大腸菌Ｋ１２ＪＭ
１０５中で形質転換する。クローンの選択及び選抜は、
例３ａに記載した様に行われる。選択されたクローン
は、図１９に記載されたアミノ酸配列を有する式Ｉの化
合物 "ＰＡ３３６"に関して暗号づけるプラスミドｐＧ
Ｒ３３６を含有する。
１０５中で形質転換する。クローンの選択及び選抜は、
例３ａに記載した様に行われる。選択されたクローン
は、図１９に記載されたアミノ酸配列を有する式Ｉの化
合物 "ＰＡ３３６"に関して暗号づけるプラスミドｐＧ
Ｒ３３６を含有する。
【００７１】大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０５を、プラスミドｐ
ＧＲ３３６で形質転換し、次いで発酵し、誘導後発現率
を例３ｂに記載した様にテストする。第一に生じる初期
たん白質から、化合物ＰＡ３３６（そのアミノ酸列は図
１９に記載されている）を一本鎖たん白質として得られ
る。発現率は、プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６を有する
他の初期たん白質の発現での発現率と同等で得られる。
ＧＲ３３６で形質転換し、次いで発酵し、誘導後発現率
を例３ｂに記載した様にテストする。第一に生じる初期
たん白質から、化合物ＰＡ３３６（そのアミノ酸列は図
１９に記載されている）を一本鎖たん白質として得られ
る。発現率は、プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６を有する
他の初期たん白質の発現での発現率と同等で得られる。
【００７２】
【発明の効果】本発明によるポリペプチドは、ブラスミ
ンアクチベーターとして使用でき、このポリペプチドを
得るためのプラスミドは、高収率で適する細菌宿主中で
プラスミノーゲンアクチベーターとして作用しない発現
生成物を生じ、これをたん白質化学変化によって一本鎖
の上記ポリペプチドとなすことができる。
ンアクチベーターとして使用でき、このポリペプチドを
得るためのプラスミドは、高収率で適する細菌宿主中で
プラスミノーゲンアクチベーターとして作用しない発現
生成物を生じ、これをたん白質化学変化によって一本鎖
の上記ポリペプチドとなすことができる。
【図１】：コンホメーションが決定されるジスルフィド
架橋の表示を有する式Ｉの化合物の構造図。
架橋の表示を有する式Ｉの化合物の構造図。
【図２】：市販のプラスミドｐＢＲ３２２からのプラス
ミドｐＢＦ１５８の構造。その際連続してｎｉｃ／ｂｏ
ｍ- 域及びテトラサイクリン耐性遺伝子の大部分を除去
する。
ミドｐＢＦ１５８の構造。その際連続してｎｉｃ／ｂｏ
ｍ- 域及びテトラサイクリン耐性遺伝子の大部分を除去
する。
【図３】：市販のプラスミドｐＢＲ３２２からのプラス
ミドｐＢＦ１５８の構造。その際連続してｎｉｃ／ｂｏ
ｍ- 域及びテトラサイクリン耐性遺伝子の大部分を除去
する。
ミドｐＢＦ１５８の構造。その際連続してｎｉｃ／ｂｏ
ｍ- 域及びテトラサイクリン耐性遺伝子の大部分を除去
する。
【図４】：合成 "マルチチローニングサイト" のヌクレ
オチド配列。
オチド配列。
【図５】：プラスミドｐＢＦ１５８- ０１の構造。プラ
スミドｐＢＥ１５８中の切断部位Ｅｃｏ ＲＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩとの間に合成マルチクローニングサイトの組み
込みを描く。
スミドｐＢＥ１５８中の切断部位Ｅｃｏ ＲＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩとの間に合成マルチクローニングサイトの組み
込みを描く。
【図６】：プラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔの構造。断
片ＣｌａＩ×ＨｉｎｄＩＩＩを、Ｔｎ１０（ショルマイ
ヤー(Schollmeier) 等、Nucl. Acids Res.１３（１９８
５）４２２７−４２３７参照）からのｔｅｔＡ／ｏｒｆ
Ｌターミネーターが存在するプラスミドｐＲＴ６１（ヨ
ルゲンセン(Jorgensen) 等、J. Bacteriol. １３８，１
９７８，７０５−７１４参照）からの対応する断片
"Ｔ" に替える。
片ＣｌａＩ×ＨｉｎｄＩＩＩを、Ｔｎ１０（ショルマイ
ヤー(Schollmeier) 等、Nucl. Acids Res.１３（１９８
５）４２２７−４２３７参照）からのｔｅｔＡ／ｏｒｆ
Ｌターミネーターが存在するプラスミドｐＲＴ６１（ヨ
ルゲンセン(Jorgensen) 等、J. Bacteriol. １３８，１
９７８，７０５−７１４参照）からの対応する断片
"Ｔ" に替える。
【図７】：暗号づけする遺伝子に対する合成断片のヌク
レオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４中
に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出発
して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対す
る構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
レオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４中
に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出発
して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対す
る構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
【図８】：暗号づけする遺伝子に対する合成断片のヌク
レオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４中
に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出発
して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対す
る構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
レオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４中
に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出発
して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対す
る構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
【図９】：暗号づけする遺伝子に対する合成断片のヌク
レオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４中
に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出発
して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対す
る構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
レオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４中
に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出発
して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対す
る構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
【図１０】：暗号づけする遺伝子に対する合成断片のヌ
クレオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４
中に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出
発して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対
する構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
クレオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４
中に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出
発して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対
する構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
【図１１】：暗号づけする遺伝子に対する合成断片のヌ
クレオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４
中に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出
発して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対
する構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
クレオチド配列（例１ｄ中に記載されかつ図１２〜１４
中に図示されたプラスミドｐＢＦ１５８- ０１Ｔから出
発して、本発明によるプラスミド中に式Ｉの化合物に対
する構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む。）
【図１２】：オリゴヌクレオチド断片Ｍ４〜Ｍ８を、プ
ラスミドＰＢＦ１５８- ０１Ｔで開始してＣ- 末端から
組み込むことによるプラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ〜
ｐＢＦ１５８- ０６の構成。
ラスミドＰＢＦ１５８- ０１Ｔで開始してＣ- 末端から
組み込むことによるプラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ〜
ｐＢＦ１５８- ０６の構成。
【図１３】：オリゴヌクレオチド断片Ｍ４〜Ｍ８を、プ
ラスミドＰＢＦ１５８- ０１Ｔで開始してＣ- 末端から
組み込むことによるプラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ〜
ｐＢＦ１５８- ０６の構成。
ラスミドＰＢＦ１５８- ０１Ｔで開始してＣ- 末端から
組み込むことによるプラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ〜
ｐＢＦ１５８- ０６の構成。
【図１４】：オリゴヌクレオチド断片Ｍ４〜Ｍ８を、プ
ラスミドＰＢＦ１５８- ０１Ｔで開始してＣ- 末端から
組み込むことによるプラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ〜
ｐＢＦ１５８- ０６の構成。
ラスミドＰＢＦ１５８- ０１Ｔで開始してＣ- 末端から
組み込むことによるプラスミドｐＢＦ１５８- ０２Ｔ〜
ｐＢＦ１５８- ０６の構成。
【図１５】：切断部位ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩの間にＴ
ａｃ- プロモーターを組み込むことによってｐＢＦ１５
８- ０６Ｔから生じるプラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６
（例１参照）。
ａｃ- プロモーターを組み込むことによってｐＢＦ１５
８- ０６Ｔから生じるプラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６
（例１参照）。
【図１６】：ｐＧＲ Ｔａｃ０６中で切断部位ＮｄｅＩ
とＳａｃＩの間のヌクレオチド配列及びこれから導かれ
るアミノ酸配列。アミノ酸の番号づけは、図１に対応す
る。
とＳａｃＩの間のヌクレオチド配列及びこれから導かれ
るアミノ酸配列。アミノ酸の番号づけは、図１に対応す
る。
【図１７】：合成Ｔｒｐ- プロモーターのヌクレオチド
配列。
配列。
【図１８】：プラスミドｐＧＲ Ｔａｃ０６で形質転換
された大腸菌ＪＭ１０３に於て、０時点を基準にしてＩ
ＰＴＧでの誘導後の時間に基づいてＴａｃ- プロモータ
ーの調節下に、図１６による式Ｉの化合物又はその初期
たん白質に関する発現率は、発色性性質により決定され
たＰＡ- 活性であり、これはテスト前にプラスミンによ
る分解後（△−△）及び分解せず（×----×）に、５７
８ｎｍで光学密度１を有する発酵培地ｍｌあたりのプラ
ーク- 単位で記載される。
された大腸菌ＪＭ１０３に於て、０時点を基準にしてＩ
ＰＴＧでの誘導後の時間に基づいてＴａｃ- プロモータ
ーの調節下に、図１６による式Ｉの化合物又はその初期
たん白質に関する発現率は、発色性性質により決定され
たＰＡ- 活性であり、これはテスト前にプラスミンによ
る分解後（△−△）及び分解せず（×----×）に、５７
８ｎｍで光学密度１を有する発酵培地ｍｌあたりのプラ
ーク- 単位で記載される。
【図１９】：ヌクレオチド配列及びこれから由来する式
（Ｍｅｔ)-Ｓｅｒ- Ｘ1-Ｘ2-ｒｓｃｕＰＡ143-411 の化
合物。カッコ内のメチオニンを、大腸菌の圧搾で離脱す
る。
（Ｍｅｔ)-Ｓｅｒ- Ｘ1-Ｘ2-ｒｓｃｕＰＡ143-411 の化
合物。カッコ内のメチオニンを、大腸菌の圧搾で離脱す
る。
【図２０】：すなわちＴｒｐ- プロモーターの調節下に
ｐＧＲ３１８，ｐＧＲ３１９又はｐＧＲ３２７で形質転
換された大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３中での式Ｉの化合物又
はその初期たん白質に関する発現率。誘導は、０時点直
後にインドールアクリル酸で行われる。発色性基質で決
定されたＰＡ- 活性をテスト前にプラスミンによる分解
後（△−△）及び分解せず（×----×）に５７８ｎｍで
光学密度１の発酵培地ｍｌあたりのプラーク- 単位で記
載する。
ｐＧＲ３１８，ｐＧＲ３１９又はｐＧＲ３２７で形質転
換された大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３中での式Ｉの化合物又
はその初期たん白質に関する発現率。誘導は、０時点直
後にインドールアクリル酸で行われる。発色性基質で決
定されたＰＡ- 活性をテスト前にプラスミンによる分解
後（△−△）及び分解せず（×----×）に５７８ｎｍで
光学密度１の発酵培地ｍｌあたりのプラーク- 単位で記
載する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年３月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】本発明は、次の一般式Ｉ又は図１からの構
造図に相当する、プラスミノーゲンアクチベーターとし
て治療上使用可能な新規ポリペプチドに関する： Ｓｅｒ−Ｘ１−Ｘ２−ｒｓｃｕ−ＰＡ１４３−４１１ Ｉ 式中、ｒｓｃｕ−ＰＡ１４３−４１１は、ｓｃｕ−ＰＡ
５４Ｋからのアミノ酸１４３（Ｇｌｕ）〜４１１（Ｌｅ
ｕＯＨ）の非グルコシル化配列領域をを示し、Ｘ１はア
ミノ酸Ａｓｎ，Ｐｒｏ又はＳｅｒの１つを示し、Ｘ２は
単一結合又はＧｌｕ，Ｐｒｏ−Ｇｌｕ，Ｐｒｏ−Ｐｒｐ
−Ｇ１ｕ又はＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎである。
造図に相当する、プラスミノーゲンアクチベーターとし
て治療上使用可能な新規ポリペプチドに関する： Ｓｅｒ−Ｘ１−Ｘ２−ｒｓｃｕ−ＰＡ１４３−４１１ Ｉ 式中、ｒｓｃｕ−ＰＡ１４３−４１１は、ｓｃｕ−ＰＡ
５４Ｋからのアミノ酸１４３（Ｇｌｕ）〜４１１（Ｌｅ
ｕＯＨ）の非グルコシル化配列領域をを示し、Ｘ１はア
ミノ酸Ａｓｎ，Ｐｒｏ又はＳｅｒの１つを示し、Ｘ２は
単一結合又はＧｌｕ，Ｐｒｏ−Ｇｌｕ，Ｐｒｏ−Ｐｒｐ
−Ｇ１ｕ又はＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】たとえばプラスミドｐＧＲ Ｔａｃ ０６
（例１及び図１５）が得られる。このプラスミドは式Ｉ
の化合物（式中Ｘ１はＡｓｎ、Ｘ２は配列Ｇｌｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ａｓｎを示す）に関する暗号を有する（図１
６参照）。この化合物を、“ＰＡ／０６”として以下に
示す。
（例１及び図１５）が得られる。このプラスミドは式Ｉ
の化合物（式中Ｘ１はＡｓｎ、Ｘ２は配列Ｇｌｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ａｓｎを示す）に関する暗号を有する（図１
６参照）。この化合物を、“ＰＡ／０６”として以下に
示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】この配列を、ヌクレオチドによってＮｄｅ
ＩとＸｂａＩの間に暗号付与し、これに関してはｓｃｕ
−ＰＡ５４ＫのＮ−末端アミノ酸に対するコドンを任意
に選択する。アミノ酸のこの配列を、ＰｓｔＩ切断部位
に関するＬｅｕ−Ｇｌｎによて中断する。
ＩとＸｂａＩの間に暗号付与し、これに関してはｓｃｕ
−ＰＡ５４ＫのＮ−末端アミノ酸に対するコドンを任意
に選択する。アミノ酸のこの配列を、ＰｓｔＩ切断部位
に関するＬｅｕ−Ｇｌｎによて中断する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】式Ｉの化合物に関する暗号を有する構造遺
伝子の構成に於て、セリンに関するコドンに続いて５’
−位にメチオニンに関するコドンを有するヌクレオチド
配列が好ましい。この構造遺伝子の発現に於て、Ｍｅｔ
−Ｓｅｒ−結合の不安定性に基づき、Ｎ−末端アミノ酸
としてセリンを有する式Ｉの夫々の化合物が得られる。
式Ｉの化合物に関する、構造遺伝子の適する５’−末端
は、次のものである（式Ｉの化合物のＮ−末端基に関し
て夫々Ｓｅｒ−Ｘ１−Ｘ２−領域及びカッコ内に暗号づ
けされた、しかしたん白質中にもはや含有されないメチ
オニン基を記載する： Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ− ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ− ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ− ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ− ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ Ｃ
ＴＧ ＣＡＧ ＣＡＡ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｎ− ＧＴＴ ＣＣＡ ＴＧＣ ＡＡＣ 上述の様に、本発明によるプラスミドで形質転換された
細菌を用いて、極めて高い発現率がもたらされる。適当
な受容宿主微生物の形質転換は、公知方法で行われる。
本発明によるプラスミドの発現に関して、特に適する宿
主生物は大腸菌−及び使用される腸内細菌−種の株、た
とえばシュードモナス、サルモネラ、エンテロバクタ
ー、クレブシエラ又はセレイシアの菌株である。
伝子の構成に於て、セリンに関するコドンに続いて５’
−位にメチオニンに関するコドンを有するヌクレオチド
配列が好ましい。この構造遺伝子の発現に於て、Ｍｅｔ
−Ｓｅｒ−結合の不安定性に基づき、Ｎ−末端アミノ酸
としてセリンを有する式Ｉの夫々の化合物が得られる。
式Ｉの化合物に関する、構造遺伝子の適する５’−末端
は、次のものである（式Ｉの化合物のＮ−末端基に関し
て夫々Ｓｅｒ−Ｘ１−Ｘ２−領域及びカッコ内に暗号づ
けされた、しかしたん白質中にもはや含有されないメチ
オニン基を記載する： Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ− ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ− ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ− ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ− ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ （Ｍｅｔ）Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ Ｃ
ＴＧ ＣＡＧ ＣＡＡ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｎ− ＧＴＴ ＣＣＡ ＴＧＣ ＡＡＣ 上述の様に、本発明によるプラスミドで形質転換された
細菌を用いて、極めて高い発現率がもたらされる。適当
な受容宿主微生物の形質転換は、公知方法で行われる。
本発明によるプラスミドの発現に関して、特に適する宿
主生物は大腸菌−及び使用される腸内細菌−種の株、た
とえばシュードモナス、サルモネラ、エンテロバクタ
ー、クレブシエラ又はセレイシアの菌株である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/71 //(Ｃ１２Ｎ 9/72 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 レオポルト・フローエ ドイツ連邦共和国、ウオルフエンビユッテ ル−ハルヒテル、イム・フオーゲルザン グ、５ (72)発明者 レジナ・エー・ブリゲリウス−フローエ ドイツ連邦共和国、ウオルフエンビユッテ ル−ハルヒテル、イム・フオーゲルザン グ、５ (72)発明者 ベルンハルト・ウオルフ ベルギー国、ハウゼット、ヘルゲンラーテ ル・ストラーセ、１
Claims (27)
- 【請求項１】 一般式Ｉ Ｓｅｒ−Ｘ1 −Ｘ2 −ｒｓｃｕＰＡ143-411 Ｉ （式中ｒｓｃｕ−ＰＡ143-411 はｓｃｕ−ＰＡ５４Ｋか
らのアミノ酸１４３（Ｇｌｕ）〜４１１（ＬｅｕＯＨ）
の非グルコシル化配列領域を示し、 Ｘ1 はアミノ酸Ａｓｎ，Ｐｒｏ又はＳｅｒの１つを示
し、 Ｘ2 は単一結合又はＧｌｕ，Ｐｒｏ- Ｇｌｕ，Ｐｒｏ-
Ｐｒｏ- Ｇｌｕ又はＧｌｕ- Ｌｅｕ- Ｈｉｓ- Ｌｅｕ-
Ｇｌｎ- Ｖａｌ- Ｐｒｏ- Ｓｅｒ-Ａｓｎである。）の
新規ポリペプチド。 - 【請求項２】 Ｘ1 はＡｓｎ又はＳｅｒを示す請求項１
記載の新規ポリペプチド。 - 【請求項３】 Ｘ1 はＳｅｒを示す請求項１又は２記載
の新規ポリペプチド。 - 【請求項４】 Ｘ2 は単一結合又はＧｌｕ，Ｐｒｏ- Ｇ
ｌｕ又はＰｒｏ-Ｐｒｏ- Ｇｌｕを示す請求項１ないし
３のいずれかに記載の新規ポリペプチド。 - 【請求項５】 Ｘ1 はＡｓｎ又はＳｅｒであり、Ｘ2 は
単一結合又はＧｌｕ，Ｐｒｏ- Ｇｌｕ又はＰｒｏ- Ｐｒ
ｏ- Ｇｌｕを示し、ｒｓｃｕＰＡ143-411 は請求項１と
同一の意味を有する請求項１記載の新規ポリペプチド。 - 【請求項６】 式 Ｓｅｒ- Ｓｅｒ- Ｐｒｏ- Ｐｒｏ- Ｇｌｕ- ｒｓｃｕＰＡ143-411 Ｉa （式中ｒｓｃｕＰＡ143-411 は、請求項１と同一の意味
を有する。）の新規ホリペプチド。 - 【請求項７】 オペロンは、調節可能なプロモター、リ
ボソーム結合部位として有効なＳＤ配列(Shine-Dalgarn
o-配列）、開始コドン、請求項１〜６によるポリペプチ
ドに関する合成構造遺伝子及び構造遺伝子から下流に１
又は２個のターミネーターを有し、そして腸内細菌、好
ましくは大腸菌株中でポリペプチドの初期たん白質の発
現に適することを特徴とする、請求項１ないし６のいず
れかに記載のポリペプチドの収得に使用するための新規
プラスミド。 - 【請求項８】 ＳＤ配列と開始コドン６−１２の間の距
離は、８−１０ヌクレオチドであるのが好ましい請求項
７記載のプラスミド。 - 【請求項９】 調節可能なプロモーターはＴｒｐ- 又は
Ｔａｃ- プロモーターである請求項７又は９記載のプラ
スミド。 - 【請求項１０】 調節可能なプロモーターは、図１７に
よるヌクレオチド配列を有する合成Ｔｒｐ- プロモータ
ーである請求項９記載のプラスミド。 - 【請求項１１】 調節可能なプロモーターは、プラスミ
ドｐｔａｃ ＳＤＴ（ＤＳＭ５０１８）からのＴａｃ-
プロモーターである請求項９記載のプラスミド。 - 【請求項１２】 オペロン中の連続ターミネーターとし
てＴｎ１０からのｔｒｐ Ａターミネーター及び（又
は）ｔｅｔ Ａ／ｏｒｆ Ｌターミネーターが存在する
請求項７ないし１１のいずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項１３】 構造遺伝子中でコドンとしてアルギニ
ンに関してはトリプレットＣＧＴ、ロイシンに関しては
トリプレットＣＴＧ、バリンに関してはトリプレットＧ
ＴＴ及び（又は）グリシンに関してはトリプレットＧＧ
Ｔを使用する請求項７ないし１２のいずれかに記載のプ
ラスミド。 - 【請求項１４】 構造遺伝子は、図７−１１によるヌク
レオチド配列及び特に図１２によるヌクレオチド配列の
１つを有する請求項７−１３のいずれかに記載のプラス
ミド。 - 【請求項１５】 構造遺伝子は、図１９によるヌクレオ
チド配列を有する請求項７−１４のいずれかに記載のプ
ラスミド。 - 【請求項１６】 ５'-位の構造遺伝子のヌクレオチド配
列は、セリンに関するコドンに続いてメチオニンに関す
るコドンを有する請求項７ないし１５のいずれかに記載
のプラスミド。 - 【請求項１７】 ｎｉｃ- ｂｏｍ- 領域が除かれたプラ
スミドｐＢＲ３２２中にオペロンを有する請求項７ない
し１６のいずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項１８】 オペロンをプラスミドｐＢＲ３２２中
に有し、このプラスミドからテトラサイクリン耐性遺伝
子の全部又は一部は、このプラスミドがテトラサイクリ
ン耐性を全く駆出しない程度に除かれている請求項７な
いし１６のいずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項１９】 オペロンをプラスミドｐＢＲ３２２中
に有し、このプラスミドからｎｉｃ／ｂｏｍ- 領域は除
かれ及びテトラサイクリン耐性遺伝子の少なくとも一部
は、プラスミドがテトラサイクリン耐性を全く駆出しな
い様に除かれている請求項７ないし１８のいずれかに記
載のプラスミド。 - 【請求項２０】 プラスミドは、合成Ｔｒｐ- プロモー
ターの調節下に合成構造遺伝子を有するプラスミドｐＧ
Ｒ Ｔｒｐ０６，ｐＧＲ３１８，ｐＧＲ３１９，ｐＧＲ
３２７及びｐＧＲ３３６である請求項７ないし１９のい
ずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項２１】 プラスミトｐＧＲ Ｔａｃ０６は図１
５に相当する請求項７ないし１９のいずれかに記載のプ
ラスミド。 - 【請求項２２】 ｎｉｃ／ｂｏｍ- 領域及び（又は）テ
トラサイクリン耐性遺伝子の少なくとも１部が除かれた
プラスミドｐＢＲ３２２中で、切断部位ＥｃｏＲＩ及び
ＨｉｎｄＩＩＩとの間に図４中に記載したヌクレオチド
配列を有する"マルチクローニングサイト”を使用し、
これを用いて公知方法で転写ターミネーター、式Ｉの化
合物、好ましくは構造遺伝子の３' ｃ- 末端から開始す
る化合物に対する構造遺伝子の合成部分配列並びに合成
Ｔｒｐ- プロモーターを組み込む、請求項７記載のプラ
スミドの製造方法。 - 【請求項２３】 請求項２２に従って得られたプラスミ
ドからのＥｃｏＲＩ×ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを発
現カセットとして腸内細菌、好ましくは大腸菌中で自律
的増殖する他のプラスミド中に公知方法に従って挿入す
る、請求項７記載のプラスミドの製造方法。 - 【請求項２４】 プラスミドを用いて腸内細菌- 株、好
ましくは大腸菌株を公知方法で形質転換し、構造遺伝子
の発現を誘導し、形成された式Ｉの化合物の初期たん白
質を培地及び溶解された細菌細胞から分離し、初期たん
白質を溶解し、次いでレトックス- 系の作用によって請
求項１ないし６のいずれかに記載のポリペプチドに逆戻
りする請求項７ないし２１のいずれかに記載のプラスミ
ドの使用方法。 - 【請求項２５】 プラスミドを用いて大腸菌- 種、好ま
しくは大腸菌- Ｋ１２- 株を形質転換し、次いで請求項
２４に従って処理する請求項７ないし２１のいずれかに
記載のプラスミドの使用方法。 - 【請求項２６】 請求項１ないし６による化合物の１つ
はプラスミノ−ゲンとして作用する有効物質を含有する
血栓溶解剤。 - 【請求項２７】 有効物質として請求項１記載の式Ｉの
プラスミノ- ゲンアクチベーターを有する、血栓溶解剤
として使用できる薬剤の製造に、請求項１ないし６のい
ずれかに記載の化合物を使用する方法。
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| DE4101736A DE4101736A1 (de) | 1991-01-22 | 1991-01-22 | Neue als plasminogenaktivatoren einsetzbare polypeptide, dafuer codierende plasmide und verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
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|---|---|
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