NO317661B1 - Trombinaktiverbare plasminogenanaloger, anvendelse av forbindelsene ved fremstilling av et farmasoytisk middel, preparater som omfatter forbindelsene, samt nukleinsyre - Google Patents
Trombinaktiverbare plasminogenanaloger, anvendelse av forbindelsene ved fremstilling av et farmasoytisk middel, preparater som omfatter forbindelsene, samt nukleinsyre Download PDFInfo
- Publication number
- NO317661B1 NO317661B1 NO19951648A NO951648A NO317661B1 NO 317661 B1 NO317661 B1 NO 317661B1 NO 19951648 A NO19951648 A NO 19951648A NO 951648 A NO951648 A NO 951648A NO 317661 B1 NO317661 B1 NO 317661B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- plasminogen
- sequence
- cleavage site
- amino acid
- cys
- Prior art date
Links
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 title claims abstract description 117
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 title claims abstract description 117
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 title 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 54
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 54
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 15
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 30
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 102000003801 alpha-2-Antiplasmin Human genes 0.000 description 7
- 108090000183 alpha-2-Antiplasmin Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 6
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 6
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 6
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 6
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- NYPJDWWKZLNGGM-RPWUZVMVSA-N esfenvalerate Chemical compound C=1C([C@@H](C#N)OC(=O)[C@@H](C(C)C)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 NYPJDWWKZLNGGM-RPWUZVMVSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- CAJXYXPLLJDEOB-SLFFLAALSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-n-(4-nitrophenyl)hexanamide Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 CAJXYXPLLJDEOB-SLFFLAALSA-N 0.000 description 1
- HYCKBFLTZGORKA-HNPMAXIBSA-N 3,7-dihydropurin-6-one;1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 HYCKBFLTZGORKA-HNPMAXIBSA-N 0.000 description 1
- 102100034614 Ankyrin repeat domain-containing protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010011091 Coronary artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010014513 Embolism arterial Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229940122791 Plasmin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 208000031737 Tissue Adhesions Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 208000002528 coronary thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 1
- 108010087750 lysyl-plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002806 plasmin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 201000005060 thrombophlebitis Diseases 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- -1 valine) Chemical class 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Denne oppfinnelse er en forbedring av oppfinnelsen beskrevet i vår tidligere innleverte patentsøknad WO-A-9109118 og vedrører plasminogenanaloger som aktiveres av trombin slik at de får fibrinolytisk aktivitet, eller for å inhibere blodlevringsdannelse. Den vedrører også nukleinsyre (DNA og RNA) som koder for hele eller en del av slike forbindelser. Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater som inneholder dem, og deres anvendelse ved fremstilling av et middel for behandling av trombosesykdom.
Plasminogen er en nøkkelkomponent i det fibrinolytiske system som er den naturlige motpart til blodlevringssys-temet i blodet. Ved blodkoagulasjonsprosessen er en kaskade av enzymaktiviteter involvert i frembringelse av et fibrinnett-verk som danner rammeverket i en blodlevring, eller trombe. Nedbrytning av fibrinnettverket (fibrinolyse) utføres av virk-ningen av enzymet plasmin. Plasminogen er den inaktive for-løper for plasmin, og omdannelse av plasminogen til plasmin utføres ved spalting av peptidbindingen mellom arginin 561 og valin 562 i plasminogen. Under fysiologiske betingelser katalyseres denne spaltingen ved hjelp av vevstypeplasminogen-aktivator (tPA) eller ved hjelp av urokinasetype plasminogen--aktivator (uPA).
Dersom likevekten mellom blodlevrings- og fibrino-lysesystemene forstyrres lokalt, kan det dannes intravaskulære blodpropper på passende steder, noe som fører til slike tilstander som koronar trombose og myokardialinfarkt, dyp venetrombose, slag, perifer, arteriell tilstopping og emboli. I slike tilfeller er administreringen av fibrinolytiske midler blitt påvist å være en gunstig terapi for fremme av blodpropp-oppløsning. Antitrombosemidler kan også anvendes til forhind-ring av blodlevringsdannelse.
Problemet med de fleste midlene som anvendes for fibrinolytisk behandling, er imidlertid at de ikke er trombespesifikke ved klinisk anvendbare doser ettersom de aktiverer plasminogen i det generelle blodomløp. En alternativ fremgangsmåte for å øke fibrinolyse er beskrevet i vår tidligere innleverte patentsøknad WO-A-9109118, og er basert på anvendelsen av molekyler som lar seg aktivere slik at vi får fibrinolytisk aktivitet, eller for å inhibere blodlevringsdannelse. Aktiveringen katalyseres ved hjelp av ett eller flere endogene enzymer involvert i blodlevring. En fordel ved denne fremgangsmåten er at trombefibrinolyseselektivitet eller inhibering av blodlevringsdannelsesaktivitet oppnås gjennom den trombespesifikke lokalisering av det aktiverende enzym. Nærmere bestemt beskrives i WO-A-9109118 blant annet plasminogenanaloger som er aktiverbare til plasmin ved spalting av trombin.
Trombin {E.C. 3.4.21.5) er en serinprotease som kata-lyserer proteolysen av et antall proteiner, inkludert fibrinogen (A-alfa- og B-beta-kjeder), faktor XIII, faktor V, faktor
VII, faktor VIII, protein C og antitrombin III. Den struktur som er påkrevet for gjenkjennelse ved hjelp av trombin, synes å være delvis bestemt av den lokale aminosyresekvensen rundt spaltingssetet, men bestemmes også av en variabel forlengelse ved hjelp av sekvens(er) langt borte fra spaltingssetet. For eksempel er restene P2 (Val), P9 (Phe) og P10 (Asp) av avgjør-ende betydning i fibrinogen A-alfa-kjeden for alfa-trombin-katalysert spalting i Arg(16)-Gly(17)-peptidbindingen (Ni, F.
et al. 1989, Biochemistry 28 3082-3094). I WO-A-9109118 beskrives at optimale spaltingsseter for alfa-trombin kan ha strukturen (i) P4-P3-Pro-Arg-Pl<*->P2', hvor hver av P3 og P4 uavhengig av hverandre er en rest av en hydrofob aminosyre (slik som valin), og hver av Pl' og P2' uavhengig av hverandre er en ikke-sur aminosyrerest, eller (ii) P2-Arg-Pl', hvor P2 eller Pl' er en glysinrest. De trombinaktiverbare plasminogen-analogforbindelser beskrevet som foretrukne i WO-A-9109118, og alle de som er spesifikt eksemplifisert der, har følgelig spaltingsseter som passer til de ovenfor nevnte strukturer (i) eller (ii). Dataene rapportert i WO-A-9109118, tyder på at den av de spesifikt eksemplifiserte, trombinspaltbare plasminogenanaloger som er betegnet T19, er den mest effektive i analyse-systemene som er brukt. Den har et spaltingssete basert på faktor XIII, Pro (559) og Gly (560) av villtypeplasminogen som er blitt erstattet med Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Val-Val-Pro. Trom-binspaltingssetet i T19, den mest effektive av forbindelsene som er spesifikt eksemplifisert, oppfyller derfor kravene til ;struktur (i) ovenfor, foretrukket ifølge WO-A-9109118. ;I fravær av kofaktorer er faktor XI blitt rapportert ;å ikke bli spaltet av trombin (Naito, K. og Fujikawa, K. ;(1991), J. Biol. Chem. 266, 7353-7358), eller bare å bli sakte spaltet med et forhold kcat/K^l, 6xl05M-lmin-l (Gailani, D. og Broze, G.J. 1991, Science 253 909-912). Spaltingssetesekvensen til dette trombinsubstratet atskiller seg fra de foretrukne, generelle formlene i) og ii) i WO-A-9109118. I faktor XI er det en basisk aminosyre, Lys, i P3-stillingen. Selv om trom-binspaltingsaktivitet på dette sted i faktor XI er svært lav sammenlignet med den til faktor XIII (kCat/Km=l, 4xl05M-lsek-l; Naski et al., 1991, Biochemistry 30 934-941), er det imidlertid nå blitt funnet i overensstemmelse med denne oppfinnelse at plasminogenanaloger som har en trombinspaltingssekvens med en basisk aminosyrerest i P3-stillingen, har overraskende forøkt aktivitet sammenlignet med T19. Slike nye analoger spaltes hurtigere ved hjelp av trombin og oppviser forøkt aktivitet i en bundet kromogenanalyse. Nærmere bestemt er slike analoger aktive i en plasmalevringslyseanalyse som ligner mer på tilstander in vivo. ;Et ytterligere eksempel på et trombinspaltingssete hvor P3 er en basisk aminosyrerest, finnes i enkj edet uro-kinase hvor P3 er arginin. Spalting i dette setet gir inaktiv tokjedeurokinase (Ichinose et al., (1986) J. Biol. Chem. 261 3486-9). I fravær av kofaktorer er også spalting av enkjede-urokinase ved hjelp av trombin noe sakte, med et forhold kCat/K,n=3, 8xl04M-lsek-l; (de Munk et al., 1990 Fibrinolysis 4 161); plasminogenanaloger som bærer urokinasespaltingssetet,
er imidlertid nå blitt påvist å ha forøkt aktivitet sammenlignet med Tl9. ;Foreliggende oppfinnelse er følgelig en forbedring av oppfinnelsen beskrevet i WO-A-9109118 ved at den tilveiebringer en plasminogenanalog som er aktiverbar ved hjelp av trombin slik at den får plasminaktivitet (som generelt beskrevet i WO-A-9109118) , men spesifikt karakterisert ved at den inneholder spaltingssetesekvensen P4-P3-Pro-Arg-Pl<1->P2', hvor P3 er en basisk aminosyrerest, P4 er en hydrofob aminosyrerest og hver av Pl' og P2' er uavhengig av hverandre en ikke-sur aminosyrerest, idet setet lar seg spalte mellom Arg og Pl<1> med trombin. ;Plasminogen er blitt nummerert i henhold til protein-sekvenseringsstudiene til Sottrup-Jensen et al. (i: Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff, M.O., red.) 5 suppl.
3, s. 95 (1978)) som indikerte at plasminogen var et 790 aminosyrers protein, og at spaltingssetet var Arg (560)-Val(561)-peptidbindingen. Et egnet plasminogen-cDNA som kan anvendes ved denne utførelsesformen av oppfinnelsen, og det som ble isolert av Forsgren et al. (FEBS Letters 213 254-260 ;(1987)), koder for et 791-resters protein med en ekstra Ile i 65-stilling. I denne beskrivelsen tilsvarer nummereringen av aminosyrene i plasminogen nummereringen i den anvendte cDNA. Det kan være polymorfisme i strukturen til plasminogen, og det kan være former av plasminogen hvor nummereringen av spaltingssetet atskiller seg, men det er ment at slike varianter skal være inkludert i utførelsesformen. ;Uttrykket "plasminogenanalog" betyr derfor, slik det er brukt i denne beskrivelsen, et molekyl som atskiller seg fra villtypeplasminogen, og som har evne til å bli spaltet eller påvirket på annen måte slik at det dannes et molekyl med plasminaktivitet. ;Plasminogenanaloger innenfor omfanget av denne utfør-elsesf ormen av oppfinnelsen bibeholder fibrinbindingsaktivi-teten til villtypeplasminogen i en passende grad, men kan ha endrede inhiberingskarakteristika; foretrukne plasminogenanaloger har en plasmahalveringstid som er sammenlignbar med den til villtypeplasminogen, men denne egenskapen er ikke av av-gjørende betydning. ;I den trombinspaltbare setesekvens som er til stede i plasminogenanaloger ifølge oppfinnelsen, kan den basiske aminosyrerest P3 være en lysin- eller argininrest; den hydrofobe aminosyrerest P4 kan være en valin-, isoleucin- eller leucinrest; og hver av de ikke-sure aminosyrerestene Pl' og P2<1 >kan uavhengig av hverandre være en valin-, isoleucinrest eller leucinrest. ;Bestemte plasminogenanaloger innenfor omfanget av oppfinnelsen inneholder spaltingssetet Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro-Arg- Pl'-P2', eller spaltingssetet Leu-Arg-Pro-Arg, hvor hver av Pl<1> og P2' uavhengig av hverandre er en ikke-sur aminosyrerest. Som nevnt, kan Pl' og P2<*> være isoleucin- eller valinrester.
Bestemte og foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen er plasminogenanalogene: a) hvor Pro(559), Gly(560) er erstattet med Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro; og Val(562) er erstattet med Ile. I denne analogen er aminosyren 563 valin, slik som i villtypen. Denne mutanten er blitt betegnet BB10151. b) hvor Cys(558), Pro(559), Gly(560) er erstattet med Ala, Gly, Gin, Lys, Thr, Leu, Arg, Pro; og Cys(566) er erstattet med Ala. I denne analogen er aminosyrene 562 og 563 valin som i villtypen. Denne mutanten er blitt betegnet BB10156. c) hvor Cys{558), Pro(559), Gly(560) er erstattet med Ala, Leu, Arg, Pro; og Cys(566) er erstattet med Ala. I denne
analogen er aminosyrene 562 og 563 valin som i villtypen. Denne mutanten er blitt betegnet BB10170.
d) hvor Pro(559), Gly(560) er erstattet med Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Leu, Arg, Pro. I denne analogen er aminosyrene
562 og 563 valin som i villtypen. Denne mutanten er blitt betegnet BB10171.
e) hvor Cys(558), Pro(559), Gly(560) er erstattet med Ala, Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro; Val(562) er erstattet med
Ile; og Cys(566) er erstattet med Ala. Denne mutanten er blitt betegnet BB10158.
Plasminogenanaloger i overensstemmelse med oppfinnelsen er blitt definert ved hjelp av særskilt henvisning til egenskapene til deres trombinspaltbare setesekvens ettersom det er den overraskende spaltingshurtighet i dette setet som ligger under den forbedrede trombolytiske aktivitet til forbindelsene. Det er imidlertid sannsynlig at plasminogenanaloger i overensstemmelse med oppfinnelsen (dvs. som inneholder de nå identifiserte, nye spaltingssetesekvensene) kan inne-holde andre modifikasjoner (sammenlignet med villtypeplasminogen) som kan være én eller flere addisjoner, delesjoner eller substitusjoner i seter som er mer eller mindre fjerne fra spaltingssetet, uten at fordelen ved hurtig spalting tapes. Et eksempel på en slik modifikasjon ville være addisjonen, fjerningen, substitusjonen eller endringen av ett eller flere kringledomener for å forandre fibrinbindingsaktivitet eller redusere a2-antiplasminbinding. Et bestemt eksempel ville være mutasjon av det lysinbindende sete lokalisert på Kringle 1 for å virke inn på bindingen av oc2-antiplasmin til dette setet.
Slike varianter kan være resistente overfor inhibering ved hjelp av a2-antiplasmin. Foretrukne utførelsesformer omfatter BB10189, BB10190 og BB10192 som er plasminogenanalogene BB10153, BB10170 og BB10171, hver med de ytterligere mutasjonene Asp 137>Ser og Asp 139>Ser.
Et annet eksempel ville være mutasjon for å forhindre disulfidbindingsdannelse mellom Cys(558) og Cys(566), f.eks. ved å erstatte én av eller begge cysteinrestene med alanin-rester, for å fjerne den hindringen som er pålagt spaltingssetet ved disulfidbindingen dannet mellom cysteinrester. Av de foretrukne utførelsesformer beskrevet ovenfor, har variantene BB10156, BB10158 og BB10170 slike åpenløkkemodifikasjoner.
Et eksempel på en modifikasjon som omfatter delesjon, ville være lys-plasminogenvarianter av en plasminogenanalog hvor de aminoterminale 68-, 77- eller 78-aminosyrer er blitt delert. Slike varianter har forøkt fibrinbindingsaktivitet, slik det er blitt observert for lys-plasminogen, sammenlignet med villtype-glu-plasminogen {Bok, R.A. og Mangel, W.F. 1985, Biochemistry 24 3279-3286). Et ytterligere eksempel som omfatter delesjon, ville være varianter av en plasminogenanalog hvor kringle 1- eller kringle 1-4-domenene er blitt delert for å forstyrre <x2-antiplasminbinding. Slike varianter kan være resistente overfor inhibering ved hjelp av a2-antiplasmin. Delesjon av kringlene 1-4 ville også endre fibrinbindingen og de farmakokinetiske egenskapene til molekylet.
For den svært blodlevringsselektive analog av plasminogen ifølge foreliggende oppfinnelse kan det være foretrukket å innføre en mutasjon i serinproteasedomenet som virker inn på plasmininhibitorbinding (sekvensidentitet nr. 2 viser serinproteasedomenet til villtypeplasmin, og henvisninger til det domenet gjør, der de er nummerert, bruk av nummereringen til sekvensidentitet nr. 2). Denne mutasjonen kunne være i en analog posisjon til den som er vist for å forhindre inhibitorbinding til vevsplasminogenaktivator (Madison, E.L. et al.
1989, Nature 339 721-724) eller kunne være i en annen stilling som forhindrer inhibitorbinding til plasminogen; slike modifi-
kasjoner er beskrevet i patentsøknad PCT/GB 9301632 som be-skriver endopeptidaser av chymotrypsinsuperfamilien som viser resistens mot serinproteaseinhibitorer. Slik resistens til-veiebringes ved hjelp av en modifikasjon i endopeptidasen eller dens forløper som induserer én av de følgende: a) en konformasjonsendring i proteasens lokale folding; b) en endring i de relative orienteringene til proteasen og inhibitoren etter dannelse av et kompleks; c) en endring i proteasens steriske fyldighet i inhibi-torens område; d) en endring i det elektrostatiske spenningsfelt i om-rådet til inhibitorbindingssetet; eller
e) enhver kombinasjon av det ovenfor nevnte.
En foretrukket utførelsesform er BB10158 med A4-mutasjonen (Glu606-Lys) beskrevet i PCT/GB 9301632 (BB10199).
Denne mutasjonen er utformet for å avbryte ioneinteraksjoner på overflaten av plasminogen som virker inn på binding til antiplasmin. Mutagenese ble utført under anvendelse av et oligonukleotid med 24 baser, 5' CTT GGG GAC TTC TTC AAG CAG
TGG 3', utformet for å omdanne Glu606 til Lys. Andre foretrukne utførelsesformer har, enten alene eller i kombinasjon, mutasjoner i Glu606, Glu623, Phe583, Met585 eller Lys 607. Glu606- og Glu623-mutasjonene ble eksemplifisert i PCT/GB 9301632. Et eksempel på denne utførelsesformen er BB10153 som er plasminogenanalogen BB10151 med tilleggsmutasjonene Glu606 til Lys og Glu623 til Lys.
Andre mange ganger modifiserte plasminogenanaloger i overensstemmelse med oppfinnelsen kan omfatte én eller flere modifikasjoner for å forhindre, redusere eller endre glykosyl-eringsmønstre. Plasminogenanaloger som omfatter slike modifikasjoner, kan ha en lengre halveringstid, redusert fjerning fra plasma og/eller høyere spesifikk aktivitet.
Ved et annet aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt forbindelser som er definert som plasminogenanaloger ifølge det første aspektet av oppfinnelsen ovenfor, som er kjennetegnet ved at de er ment for anvendelse ved profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse.
Plasminogenanalogene ifølge det første aspektet av oppfinnelsen kan syntetiseres ved hjelp av hvilken som helst vanlig reaksjonsvei, som for eksempel ved en fremgangsmåte som omfatter suksessiv sammenkobling av aminosyrerester og/eller ligering av oligopeptider. Selv om proteiner i prinsippet kan syntetiseres fullstendig eller delvis ved hjelp av kjemiske midler, er det foretrukket å fremstille dem ved hjelp av ribosomal translasjon, fortrinnsvis in vivo, av en tilsvarende nukleinsyresekvens. Proteinet kan være passende glykosylert.
Det er foretrukket å produsere proteiner ifølge oppfinnelsen ved å anvende teknikk med rekombinant DNA. DNA som koder for et naturlig forekommende plasminogen, kan fås fra en cDNA eller genomklon, eller kan syntetiseres. Aminosyresubsti-tusjoner, -addisjoner eller -delesjoner innføres fortrinnsvis ved hjelp av setespesifikk mutagenese. DNA-sekvenser som koder for plasminogenanaloger, kan fås ved fremgangsmåter som er godt kjent for fagfolk innen fagområdet genteknikk.
Fremgangsmåten for fremstilling av proteiner under anvendelse av teknikk med rekombinant DNA, vil vanligvis omfatte trinnene med innføyelse av en egnet, kodende sekvens i en ekspresjonsvektor og overføring av vektoren til en verts-celle. Ifølge et tredje aspekt av oppfinnelsen er det derfor tilveiebrakt syntetisk eller rekombinant nukleinsyre som koder for en proteinforbindelse som beskrevet ovenfor. Nukleinsyren kan være RNA eller DNA og kan være i form av en vektor, slik som et plasmid, kosmid eller en fag. Vektoren kan tilpasses for å transfektere eller transformere prokaryote celler (f.eks. bakterieceller) og/eller eukaryote celler (f.eks. gjær- eller pattedyrceller). En vektor vil omfatte et kloningssete og vanligvis minst ett markørgen. En ekspresjonsvektor vil ha en promoter operativt bundet til sekvensen som skal innføyes i kloningssetet, og fortrinnsvis en sekvens som gjør det mulig for proteinproduktet å bli utskilt.
Plasminogenanalogene ifølge oppfinnelsen kan uttryk-kes ved å bruke en vektor av den typen som er beskrevet i WO-A-9109118 som omfatter en første nukleinsyresekvens som koder for et protein, eller som omfatter et kloningssete, operativt bundet til en andre nukleinsyresekvens som inneholder en sterk promoter og enhancersekvens avledet fra humant cytomegalovirus, en tredje nukleinsyresekvens som koder for en polyadenyleringssekvens avledet fra SV4 0, og en fjerde nukleinsyresekvens som koder for en selekterbar markør uttrykt fra en SV40-promoter og som har et ytterligere SV40-polyadenyleringssignal i 3-enden til den selekterbare markørsekvens.
Det skal forstås at uttrykket "vektor" anvendes i denne beskrivelsen i en funksjonell betydning og ikke skal forstås som nødvendigvis å være begrenset til et enkelt nukleinsyremolekyl. Således kan f.eks. den første, andre og tredje sekvensen i vektoren definert ovenfor, befinne seg i et første nukleinsyremolekyl, og den fjerde sekvensen kan befinne seg i et andre nukleinsyremolekyl.
Denne vektoren gjør det mulig for plasminogenanalogene å bli uttrykt og utskilt i celledyrkningsmediet i en biologisk aktiv form uten behov for noen ytterligere biolog-iske eller kjemiske fremgangsmåter.
Ifølge et tredje aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en nukleinsyre som er kjennetegnet ved at den koder for plasminogenanalogene beskrevet ovenfor, som kan fremstilles ved suksessiv sammenkobling av nukleotider og/eller ligering av oligo- og/eller polynukleotider.
Ved fremstillingen av plasminogenanalogene kan det anvendes en celle eller cellelinje transformert med nukleinsyre og/eller en vektor som beskrevet ovenfor. Egnede celler eller cellelinjer som skal transformeres, omfatter både prokaryote {f.eks. Escherichia coli) og eukaryote celler, slik som gjærceller (inkludert Saccharomyces cerevisiae og Pichia pastoris) og pattedyrceller. Pattedyrceller som vokser i kon-tinuerlig kultur, og som kan transfekteres eller transformeres på annen måte ved hjelp av standardteknikker, er foretrukket. Eksempler på egnede celler omfatter ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO), musemyelomcellelinjer, slik som NSO og P3X63-Ag8.653, COS-celler, HeLa-celler, BHK-celler, melanomcellelin-jer, slik som Bowes cellelinje, muse-L-celler, humane hepatom-cellelinjer, slik som Hep G2, musefibroblaster og muse-NIH-3T3-celler. CHO-celler er særlig foretrukket som verter for ekspresjonen av plasminogen og plasminogenanaloger.
Transformasjon kan oppnås ved hjelp av hvilken som helst passende metode; elektroporasjon er særlig egnet.
Plasminogenanaloger ifølge foreliggende oppfinnelse kan som nevnt anvendes til profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til en pasient av en effektiv mengde av plasminogenanalogen. Det er derfor tilveiebrakt en plasminogenanalog som her beskrevet, for anvendelse innen medisin, særlig ved profylaksen og/eller behandlingen av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse, hvor det er ønsket å fremstille lokal, fibrinolytisk og/eller antikoagulantaktivitet. Slike tilstander omfatter hjerte- og hjerneinfarkt, arterie- og venetrombose, tromboemboli, postkirurgiske adhesjoner, tromboflebitt og diabetiske vaskulopatier, og koagulasjons-ubalanse forbundet med kreft.
Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelsen av en plasminogenanalog som her beskrevet, ved fremstillingen av et middel for profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse.
Dessuten er det også tilveiebrakt et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk preparat som omfatter én eller flere plasminogenanaloger som her beskrevet, og en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabel bærer. Et slikt preparat kan være tilpasset for administrering oralt, ved intravenøs eller intramuskulær injeksjon eller ved infusjon. Egnede, in-jiserbare preparater omfatter preparater av én eller flere sterile plasminogenanaloger i isoton, fysiologisk saltoppløs-ning og/eller buffer, og kan også omfatte et lokalanestetikum for å lindre injeksjonssmerten. Lignende preparater kan anvendes til infusjon. Når forbindelsen skal administreres som en topisk behandling, kan den være formulert som en krem, salve eller lotion i en egnet base.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan leveres i en-hetsdoseringsform, f.eks. som et tørt pulver eller vannfritt konsentrat i en hermetisk lukket beholder, slik som en ampulle eller liten pose.
Mengden av materiale som skal administreres, vil av-henge av mengden av fibrinolyse eller inhibering av blodlevring som er påkrevet, den påkrevde virkningshastighet, alvor-ligheten av den tromboembolske posisjon og størrelsen på blod-proppen. Den nøyaktige dose som skal administreres, vil, på grunn av den bestemte type av tilstand som forbindelser ifølge oppfinnelsen er ment å behandle, bli bestemt av legen. Som en rettledning vil imidlertid en pasient som behandles for en fullt utviklet trombe, generelt motta en daglig dose av en plasminogenanalog fra 0,01 til 10 mg/kg kroppsvekt, enten ved injeksjon i f.eks. opptil 5 doser, eller ved infusjon.
De følgende figurer og eksempler ifølge oppfinnelsen er gitt som illustrasjon, og ikke som begrensning. I tegnin-gene henvist til i eksemplene: figur 1 viser spaltingshastigheten for BB10151 ved hjelp av trombin;
figur 2 viser resultatene av en kromogenanalyse som sammenligner aktivering av BB10151 og T19 ved hjelp av trombin;
figur 3 viser blodlevringslyseaktiviteten til BB10151.
Eksempel 1 - Konstruksjon, ekspresjon og rensing av BB10151
Isoleringen av plasminogen-cDNA og konstruksjon av vektorene pGWH og pGWHgP er blitt beskrevet i WO-A-91/09118. i pGWHgP kan transkripsjon gjennom plasminogen-cDNA initiere i HCMV-promoteren/enhanceren, og den selekterbare markør gpt anvendes.
Teknikkene med genetisk manipulasjon, ekspresjon og proteinrensing brukt ved fremstillingen av det modifiserte plasminogeneksempel som følger, er velkjente for fagfolk innen fagområdet genteknikk. En beskrivelse av mesteparten av teknikkene kan finnes i én av de følgende laboratoriehåndbøker: "Molecular Cloning" av T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sam-brook utgitt av Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, New York, eller "Basic Methods in Molecular Biology" av L.G. Davis, M.D. Dibner og J.F. Battey publisert av Elsevier Science Publishing Co. Inc., New York.
Ytterligere og modifiserte metoder er nærmere omtalt i metodeavsnittet nedenunder.
BB10151 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro, og Val(562) er erstattet med Ile, hvorved det fremstilles en spaltingssløyfe som lar seg spalte ved hjelp av trombin (sekvensidentitet nr. 1). Dette setet er basert på et poten-sielt trombinspaltingssete i faktor XI. Fremgangsmåtene som er anvendt i dette eksemplet, er hovedsakelig som beskrevet i WO-A-9109118, eksemplene 2 og 3, idet mutagenesereaksjonen ut-føres på det 1,87 kb store Kpnl-HincII-plasminogenfragment klonet inn i bakteriofagen M13mpl8. Enkelttrådet templat ble fremstilt og mutasjonen gjort ved hjelp av oligonukleotidstyrt mutagenese. I dette tilfellet ble det anvendt et 48 baser langt oligonukleotid
(5' CACCCCCCTACGATTCTAGGTTTAATTTTAGTTGTACATTTCTTCGGC 3')
(sekvensidentitet nr. 4) til å styre mutagenesen.
Plasmid-DNA ble innført i CHO-celler ved elektroporasjon under anvendelse av 800 V og 25 fiF. Selektivt medium inneholdende 250 fil/ ml xantin, 5 ig/ml mykofenolsyre, lx hypoxantin-tymidin (HT), ble tilsatt til cellene 24 timer etter transfeksjon, og mediet ble byttet hver andre til tredje dag. Plater som ga gpt-resistente kolonier, ble screenet med hensyn på plasminogenproduksjon under anvendelse av en ELISA-analyse. Celler som produserte de høyeste nivåene av antigen, ble reklonet og de beste produsentene oppskalert i kolber, idet produksjon ble nøye overvåket. Nedfryste forråd av alle disse cellelinjene ble lagt ned. Produsentceller ble oppskalert i rulleflasker, hvorved man fikk kondisjonert medium hvorfra plasminogenprotein ble renset under anvendelse av lysin-"Sepharose" 4B. (Ordet Sepharose er et varemerke). Cel-lelinjen anvendt til å produsere dette mutantproteinet, var 123.C6.
Eksempel 2 - Konstruksjon av BB10153
BB10153 er et derivat av BB10151 inneholdende to ytterligere mutasjoner (Glu606 til Lys og Glu623 til Lys) for å svekke binding av a2-antiplasmin. Det 663 bp store ScoRV til Sphl-fragment i BB10151 (klonet i pUC, se eksempel 1) ble fjernet og erstattet med det ekvivalente 663 bp store fragment fra den antiplasminresistente mutant A3A4. Konstruksjon av denne er beskrevet i eksempel 5 i PCT/GB9301632. Oligonukleotidet med 24 baser 5' CTT GGG GAC TTC TTC AAG CAG TGG 3' (sekvensidentitet nr. 3) ble brukt til å omdanne Glu-606 til Lys, og oligonukleotidet med 27 baser 5' GTTCGAGATTCACTTTTTGGTGTG-CAC 3' (sekvensidentitet nr. 5) ble brukt til å omdanne Glu623 til Lys. Fullengdeplasminogenet ble så klonet inn i ekspresjonsvektoren pGWIH før innføyelsen av gpt-seleksjonsmarkøren som beskrevet i WO-A-9109118, eksempel 2.
Eksempel 3 - Konstruksjon av BB10156, BB10158 & BB10170
Den DNA som koder for plasminogenmutant BB10150, ble brukt som templat for produksjon av BB10156, BB10158 Sc BB10170. BB10150 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Val, Val, Pro og har de ytterligere mutasjonene Cys{558) til Ala og Cys(566) til Ala for å forhindre disulfidbindingsdanneIse. Den åpnede spalt-ingssløyfesekvens til BB10150 er vist i sekvensidentitet nr. 6. BB10150 ble laget ved mutagenese ved anvendelse av to oligonukleotidprimere (5' CTAGGTACAACCGCTTTCTTCGGCT 3' (sekvensidentitet nr. 7) og 5' GGTGGGCCACCGCCCCCCCCAC 3' (sekvensidentitet nr. 8), og det 1,87 kb store Jfpnl-HincII-f rag-ment fra mutant T13 (se patentsøknad WO-A-9109118, eksempel 13 og sekvensidentitet nr. 9) ble klonet inn i M13.
Plasminogenanalogene BB10156, BB10158 og BB10170 ble alle konstruert ved hjelp av setespesifikk mutagenese under anvendelse av den tidligere beskrevne mutant BB10150 i M13 som templatet, slik at de alle har de samme mutasjoner av Cys til Ala i restene 558 og 566. BB10156 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly{560) er erstattet med Gly, Gin, Lys, Thr, Leu, Arg, Pro (sekvensidentitet nr. 10). BB10158 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro, og Val(562) er erstattet med Ile (sekvensidentitet nr. 11). BB10170 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro{559), Gly(560) er erstattet med Leu, Arg, Pro (sekvensidentitet nr. 12). Oligo-nukleotidene som ble anvendt til priming av hver mutagenese, er vist nedenunder:
I hvert tilfelle ble mutasjonen, etter DNA-sekvensering, klonet direkte inn i pGWIHg.plasminogenekspresjonsvektor under anvendelse av restriksjonsenzymene Hindlll og Spil. Disse setene var på forhånd blitt innført i den ytterste 5'-ende i plasminogen og ved 1850 respektivt via mutagenese; den plasminogenaminosyrekodende sekvens ble ikke påvirket av denne fremgangsmåten.
Eksempel 4 - Konstruksjon av BB10169 og BB10171
BB10169 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Ile, Lys, Pro, og Val{562) er erstattet med Ile (sekvensidentitet nr. 16). BB10169 ble laget ved oligonukleotidstyrt mutagenese av BB10151 i M13 under anvendelse av oligonukleotidet med 42 baser
5' GATTCTAGGTTTAATGCCCTGCAGTTCCACACATTTCTTCGG 3'
{sekvensidentitet nr. 17) etterfulgt av kloning inn i pGWlHg-plasminogen under anvendelse av Hindlll og Spil. BB10171 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Leu, Arg, Pro (sekvensidentitet nr. 18). Det enkelttrådede M13 fra BB10169 ble brukt som templat for konstruksjonen av BB10171. Mutagenese ble primet under anvendelse av oligonukleotidet med 39 baser
5' CACCCCCCTACCACTCTGGGTCTCAGGCCCTGCAGTTCC 3'
(sekvensidentitet nr. 19) og ble, etter DNA-sekvensering, klonet inn i ekspresjonsvektoren under anvendelse av Hindlll og Spil.
Eksempel 5 - Konstruksjon og ekspresjon av BB10189, BB10190 og BB10191
Plasminogenanalogene BB10189, BB10190 og BB10191 har kringle 1-dobbeltmutasjonen Asp(137) til Ser, Asp(139) til Ser for å gjøre lysinbindingssetet ubrukbart. Mutasjonen ble ut-ført i bakgrunnene til BB10153, BB10170 og BB10171 (se eksemplene 2, 3 og 4) under anvendelse av oligonukleotidet med
28 baser
5' CCCTGCGGAGAGTTGGATGGATTCCTGC 3' (sekvensidentitet nr. 20). Mutasjonen ble så klonet inn i pGWIHg.plasminogen under anvendelse av restriksjonsenzymene Hindlll og Spil.
Eksempel 6 - Konstruksjon av BB10181
BB10181 har spaltingssetesekvensen til BB10170 og en ytterligere mutasjon av Phe(583) til Arg for å virke inn på bindingen av å2-antiplasmin. BB10181 ble konstruert via et mellomprodukt, BB10150-basekonstruksjon under anvendelse av M13 inneholdende fullengde-BBlOISO som templat, og oligonukleotidet 5' GAAGTGCATTCCTCTCCTCGTACGAAG 3' (sekvensidentitet nr. 21) som primer. Det muterte BB10150-gen ble så klonet inn i pGWIHg under anvendelse av restriksjonsenzymene Hindlll og Smal. BB10181-ekspresjonsvektoren ble så laget fra dette mellomprod-uktet ved å erstatte HindiII-Spil-fragmentet fra dette plas-midet med den tilsvarende del fra BB10170 (se eksempel 3).
Eksempel 7 - Konstruksjon av BB10186
BB10186 har spaltingssetesekvensen til BB10171 og en ytterligere mutasjon av Met(585) til Arg for å virke inn på bindingen av a2-antiplasmin. BB10186 ble laget på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 6 ovenfor for BB10181. Den intermediære BB10150-konstruksjon ble laget under anvendelse av det 25 baser lange oligonukleotid 5' CCACAGAAGTGTCTTCCAAACCTCG 3' (sekvensidentitet nr. 22) etterfulgt av kloning inn i pGWIHg. BB10186 ble så laget ved hjelp av en fragmentomstilling under anvendelse av Hindlll-Spll-fragmentet fra BB10171 (se eksempel 4).
Eksempel 8 - Konstruksjon av BB10199
BB10199 har spaltingssetesekvensen til BB10158 og en ytterligere mutasjon av Glu(606) til Lys for å virke inn på bindingen av å2-antiplasmin. BB10199 ble laget hovedsakelig som beskrevet i PCTGB 9301632, eksemplene 2 og 3. Kpnl- EcoRV-fragmentet fra BB10158 (se eksempel 3 ovenfor) ble brukt til å erstatte det tilsvarende fragment i en BB10151-konstruksjon med Glu(606) til Lys klonet inn i pUC, og ble så klonet inn i sluttekspresjonsvektoren som beskrevet i PCTGB 9301632.
Eksempel 9 - Spalting av BB10151
Plasminogenmutanter (12,5 fig) ble inkubert med 2,8 /zg trombin som beskrevet i metode 1. Tidsforløpet for spalting av plasminogenmutantene ble bestemt ved hjelp av kvantitativ gel-skanning; 50% spaltingstider for T19 og BB10151 var henholds-vis 9 og 3 minutter. Gelskanningsdata for spalting av BB10151 er vist i figur 1.
Eksempel 10 - Aktivering av BB10151
Renset BB10153-protein ble analysert med hensyn på aktivering under anvendelse av den bundne kromogenanalyse (se metode 2.1). Resultater av denne analysen er vist i figur 2 hvor økningen i absorbans ved 405 nm med tiden viser at plasminaktivitet frembringes etter inkubasjon av BB10151 med trombin. T19 er vist for sammenligning og ble funnet å være omtrent to ganger svakere enn BB10151 i denne analysen.
Eksempel 11 - Plasmalevringslyse
Evnen til BB10153 og T19 når det gjelder å lysere en plasmalevring, ble bestemt som beskrevet i metode 2.2, og resultatene av en slik analyse er vist i figur 3. BB10151
(20 ug/ ml) var i stand til å forårsake fullstendig lyse av levringen, mens Tl9 ikke lyserte levringen ved konsentrasjoner opptil 150 //g/ml. BB10153 ble således funnet å være minst 7 ganger mer aktiv enn T19 ved induksjon av lyse av en plasmalevring.
Representative eksempler på andre plasminogenanaloger ifølge oppfinnelsen ble sammenlignet med hensyn på plasmalev-ringslyseaktivitet ved en konsentrasjon på 40 /xg/ml, og resultatene i tabell 1 viser at de har lik aktivitet med BB10151.
Metoder
1. Spaltingsanalyse
Plasminogenanaloger bestemmes med hensyn på mottake-lighet for spalting ved hjelp av trombin under anvendelse av SDS PAGE under reduserende betingelser. Typiske inkubasjons-volumer på 0,125 ml i 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, består av plasminogenanalog ved den konsentrasjon som er vist i eksemplene,
og trombin ved den konsentrasjon som er vist i eksemplene. Inkubasjoner utføres ved 37°C. Kontrollinkubasjoner utføres under de samme betingelser i fravær av trombin. Aktiverings-reaksjonene ble stanset ved å utfelle proteinet ved hjelp av tilsetning av trikloreddiksyre inntil en sluttkonsentrasjon på 20%, og ved å la de stå ved 4°C i mer enn 4 timer. Utfellin-gene ble så pelletert, vasket med aceton og på nytt oppslemmet i SDS PAGE-prøvebuffer (0,1 mM Tris, pH 6,8, 10% glyserol, 1% SDS, 0,5% merkaptoetanol og 0,05% bromfenolblått). Prøvene ble analysert enten på 8-25% gradientgeler eller 12% geler. De resulterende geler ble analysert under anvendelse av "Shimadzu" Gel Scanner som skanner gelen og beregner konsentra-sjonen av protein i bånd ved å bestemme arealet under toppene.
(Ordet Shimadzu er et varemerke). Spaltingshastigheten for
plasminogen ble så bestemt ved å måle fjerningen av plasmino-genbåndet ved omtrent 92 kDa og tilsynekomsten for båndet for plasmintungkjede ved omtrent 66 kDa.
2. Akt iveringsanalyse
2.I Bundet kromogenanalyse
Plasminogenanalog og trombin inkuberes sammen i nær-vær av kromogensubstratet S2251, og plasmin fremstilt ved hjelp av aktivering, spalter direkte S2251, noe som fører til en økning i absorbans ved 405 nm. Analysen utføres i et total-volum på 880 /il i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl,
0,1 mM EDTA, 0,005% "Triton" X100 og 0,1% HSA. S2251 tilsettes inntil en sluttkonsentrasjon på 0,35 mg/ml, og plasminogenana-logkonsentrasjonen som anvendes, er 3 /xg/ml. Trombinkonsentra-sjonen anvendt, er 4,55 NIHU/ml. Aliquoter på 100 fil av reak-sjonsblandingen fjernes under inkubasjon ved 37°C og tilsettes til 25 fil 4% eddiksyre i mikrotiterplater for å stanse reak-sjonen. Ved fullførelsen av tidsforløpet avleses platene på en mikroplateavleser ved en bølgelengde på 405 nm.
2.2 Plasmalevringslyseanalyse in vi tro
En blanding av 50 /il kaninplasma (antikoagulert med 3,8% trinatriumsitrat) , 50 /il APTT-reagens (Instrumentation Labs) og et passende volum plasminogenanalog i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, lages opp til 200 [ il med den samme buffer i en brønn i en 96-brønners mikrotiterplate. En separat brønn inneholder 4,4 ( il 500 mM CaCl2 blandet med 50,6 /il av den samme buffer. Platen inkuberes ved 37°C i 30 minutter, og blodlevring startes opp ved å overføre 50 fil av CaCl2 til brønnen inneholdende plasminogenanalog. Forløpet av levringsdannelse og oppløsning følges ved å måle absorbansen ved 405 nm (620 nm referanse) ved tidsin-tervaller i løpet av fortsatt inkubasjon ved 37°C i 1 time.
Sekvensidentiteter
Claims (18)
1. Plasminogenanalog som kan aktiveres av trombin slik at den får plasminaktivitet,
karakterisert ved at den inneholder spaltingssetesekvensen P4-P3-Pro-Arg-Pl<1->P2<1>, hvor P3 er en basisk aminosyrerest, P4 er en hydrofob aminosyrerest og hver av Pl' og P2<1> er uavhengig av hverandre en ikke-sur aminosyrerest, idet setet lar seg spalte mellom Arg og Pl<1> med trombin.
2. Plasminogenanalog ifølge krav 1, karakterisert ved at den basiske aminosyrerest P3 er en lysin- eller argininrest, den hydrofobe aminosyrerest P4 er valin, isoleucin eller leucin, og de ikke-sure aminosyrerestene Pl<1> og P2<1> uavhengig av hverandre hver er valin, isoleucin eller leucin.
3. Plasminogenanalog ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at spaltingssetesekvensen er valgt fra gruppen bestående av:
eller:
eller:
og er i en stilling som tilsvarer stillingen til spaltingssetesekvensen fra og med Cys(558) til og med Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen.
4. Plasminogenanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1-3,
karakterisert ved at én av eller begge aminosyrene som tilsvarer Cys{558) og Cys{566) i naturlig forekommende plasminogen, er erstattet eller delert i tillegg til spaltingsseteerstatningen.
5. Plasminogenanalog ifølge krav 4, karakterisert ved at én av eller begge aminosyrene som tilsvarer Cys(558) og Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen, er erstattet med en alanin- eller serinrest(er).
6. Plasminogenanalog ifølge krav 5, karakterisert ved at spaltingssetesekvensen er valgt fra gruppen bestående av:
eller:
eller:
og er i en stilling som tilsvarer stillingen til spaltingssetesekvensen fra og med Cys(558) til og med Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen.
7. Plasminogenanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1-6,
karakterisert ved at én eller flere av de følgende erstatningsmutasjoner er til stede: Glu-62 til Lys eller Ala, Ser-17 til Leu, Arg 19 til Glu eller Ala, eller Glu-45 til Lys, Arg eller Ala, i serinproteasedomenet til naturlig forekommende plasminogen (sekvensidentitet nr. 2) i tillegg til spaltingssetesekvensen.
8. Plasminogenanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1-7,
karakterisert ved at den har én eller flere av de følgende erstatningsmutasjoner: Phe(583) til Arg, Met(585) til Arg, Glu(606) til Lys, Glu(623) til Lys, Asp(137) til Ser, eller Asp(139) til Ser i den naturlig forekommende plasminogensekvens i tillegg til spaltingssetesekvensen.
9. Plasminogenanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1-8,
karakterisert ved at den også har en N-ende-avkortning som tilsvarer lys-plasminogenformer.
10. Plasminogenanalog ifølge krav 9, karakterisert ved at aminosyrerestene som tilsvarer de aminoterminale 68-, 77- eller 78-aminosyrerester i naturlig forekommende plasminogen, er blitt delert.
11. Plasminogenanalog ifølge krav 8, karakterisert ved at spaltingssetesekvensen er:
og er i en stilling som tilsvarer stillingen til spaltingssetesekvensen fra og med Cys(558) til og med Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen, og hvor Glu(606) og Glu(623) i naturlig forekommende plasminogen begge er blitt erstattet med lysinrester.
12. Plasminogenanalog ifølge krav 8, karakterisert ved at spaltingssetesekvensen er:
og er i en stilling som tilsvarer stillingen til spaltingssetesekvensen fra og med Cys(558) til og med Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen, og hvor Met(585) i naturlig forekommende plasminogen er blitt erstattet med en argininrest.
13. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, karakterisert ved at den er ment for anvendelse ved profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse.
14 . Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-12 ved fremstilling av et middel for profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse.
15. Farmasøytisk eller veterinærmedisinsk preparat, karakterisert ved at det omfatter én eller flere modifiserte plasminogenanaloger ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, sammen med en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabel bærer.
16. Nukleinsyre,
karakterisert ved at den koder for en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-12.
17. Nukleinsyre ifølge krav 16, karakterisert ved at den er en vektor, f.eks. et plasmid, kosmid eller en fag.
18. Nukleinsyre ifølge krav 17, karakterisert ved at den omfatter en første nukleinsyresekvens som koder for et protein, eller som omfatter et kloningssete, operativt bundet til en andre nukleinsyresekvens som inneholder en sterk promoter og enhancersekvens avledet fra humant cytomegalovirus, en tredje nukleinsyresekvens som koder for en polyadenyleringssekvens avledet fra SV4 0, og en fjerde nukleinsyresekvens som koder for en selekterbar markør uttrykt fra en SV40-promoter, og som har et ytterligere SV40-polyadenyleringssignal i 3<1->enden av den selekterbare markørsekvens.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB929222758A GB9222758D0 (en) | 1992-10-29 | 1992-10-29 | Proteins and nucleic acids |
PCT/GB1993/002219 WO1994010318A1 (en) | 1992-10-29 | 1993-10-28 | Thrombin activatable plasminogen derivatives |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO951648L NO951648L (no) | 1995-04-28 |
NO951648D0 NO951648D0 (no) | 1995-04-28 |
NO317661B1 true NO317661B1 (no) | 2004-11-29 |
Family
ID=10724266
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19951648A NO317661B1 (no) | 1992-10-29 | 1995-04-28 | Trombinaktiverbare plasminogenanaloger, anvendelse av forbindelsene ved fremstilling av et farmasoytisk middel, preparater som omfatter forbindelsene, samt nukleinsyre |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0666920B1 (no) |
JP (1) | JP3329340B2 (no) |
AT (1) | ATE171213T1 (no) |
AU (1) | AU674180B2 (no) |
CA (1) | CA2145749C (no) |
DE (1) | DE69321134T2 (no) |
DK (1) | DK0666920T3 (no) |
ES (1) | ES2123669T3 (no) |
FI (1) | FI114102B (no) |
GB (1) | GB9222758D0 (no) |
HK (1) | HK1008047A1 (no) |
NO (1) | NO317661B1 (no) |
NZ (1) | NZ257175A (no) |
WO (1) | WO1994010318A1 (no) |
ZA (1) | ZA938120B (no) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9412131D0 (en) * | 1994-06-17 | 1994-08-10 | British Bio Technology | Thrombolytic composition |
EP0917567A1 (de) * | 1996-08-02 | 1999-05-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Thrombinaktivierbarer plasminogenaktivator |
WO2002050290A1 (en) * | 2000-12-21 | 2002-06-27 | Thromb-X Nv | A yeast expression vector and a method of making a recombinant protein by expression in a yeast cell |
WO2003066842A2 (de) * | 2002-02-06 | 2003-08-14 | Trommsdorff Gmbh & Co. Kg Arzneimittel | Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen in mikroorganismen |
FR2841904B1 (fr) * | 2002-07-03 | 2004-08-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Analogues de facteurs x clivables par la thrombine |
PL213309B1 (pl) | 2006-02-09 | 2013-02-28 | Polska Akademia Nauk Inst Biochemii I Biofizyki | Sposób hydrolizy wiazania peptydowego |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8927722D0 (en) * | 1989-12-07 | 1990-02-07 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
-
1992
- 1992-10-29 GB GB929222758A patent/GB9222758D0/en active Pending
-
1993
- 1993-10-28 WO PCT/GB1993/002219 patent/WO1994010318A1/en active IP Right Grant
- 1993-10-28 DK DK93923634T patent/DK0666920T3/da active
- 1993-10-28 AU AU53432/94A patent/AU674180B2/en not_active Ceased
- 1993-10-28 DE DE69321134T patent/DE69321134T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-28 NZ NZ257175A patent/NZ257175A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-10-28 JP JP51082894A patent/JP3329340B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-10-28 CA CA002145749A patent/CA2145749C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-10-28 AT AT93923634T patent/ATE171213T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-10-28 EP EP93923634A patent/EP0666920B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-28 ES ES93923634T patent/ES2123669T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 ZA ZA938120A patent/ZA938120B/xx unknown
-
1995
- 1995-04-28 NO NO19951648A patent/NO317661B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-04-28 FI FI952071A patent/FI114102B/fi active
-
1998
- 1998-06-26 HK HK98107088A patent/HK1008047A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69321134T2 (de) | 1999-02-25 |
FI952071A (fi) | 1995-04-28 |
WO1994010318A1 (en) | 1994-05-11 |
NO951648L (no) | 1995-04-28 |
GB9222758D0 (en) | 1992-12-09 |
CA2145749A1 (en) | 1994-05-11 |
NZ257175A (en) | 1996-07-26 |
FI952071A0 (fi) | 1995-04-28 |
AU5343294A (en) | 1994-05-24 |
HK1008047A1 (en) | 1999-04-30 |
EP0666920A1 (en) | 1995-08-16 |
CA2145749C (en) | 2005-06-21 |
JPH08504575A (ja) | 1996-05-21 |
FI114102B (fi) | 2004-08-13 |
ATE171213T1 (de) | 1998-10-15 |
DK0666920T3 (da) | 1999-06-14 |
DE69321134D1 (de) | 1998-10-22 |
EP0666920B1 (en) | 1998-09-16 |
AU674180B2 (en) | 1996-12-12 |
NO951648D0 (no) | 1995-04-28 |
ZA938120B (en) | 1994-08-01 |
JP3329340B2 (ja) | 2002-09-30 |
ES2123669T3 (es) | 1999-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0502968B1 (en) | Activatable fibrinolytic and anti-thrombotic proteins | |
US4753879A (en) | Modified tissue plasminogen activators | |
EP0370036B1 (en) | Modified factor vii/viia | |
JP2610783B2 (ja) | ポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそれを含有するベクター | |
BG60253B2 (bg) | Човешки тъканен плазминогенен активатор | |
HU213922B (en) | Process for producing new tissue plasminogen activator variants, pharmaceutical preparations containing them, and vectors capable of expressing them | |
NO893196L (no) | Hybrid-protein-c-sammensetninger og fremgangsmaater for deres fremstilling. | |
US7163817B2 (en) | Clot-specific streptokinase proteins possessing altered plasminogen activation characteristics and a process for their preparation | |
JP2928798B2 (ja) | プラスミノーゲンアクチベーターの変異体およびその製造方法 | |
US7070958B2 (en) | Methods of making pro-urokinase mutants | |
NO317661B1 (no) | Trombinaktiverbare plasminogenanaloger, anvendelse av forbindelsene ved fremstilling av et farmasoytisk middel, preparater som omfatter forbindelsene, samt nukleinsyre | |
US5688664A (en) | Thrombin activatable plasminogen analogues | |
EP0241210B1 (en) | Modified enzyme | |
CA2163925A1 (en) | Chimeric proteins having fibrinolytic and thrombin-inhibiting properties | |
WO1992004450A1 (en) | Hybrid plasminogen activators | |
AU735519B2 (en) | Tissue type plasminogen activator (t-PA) variants: compositions and methods of use | |
EP0400054A1 (en) | Modified gene sequences encoding modified tpa and products therefrom | |
JPH02295483A (ja) | Tpaのプロテアーゼ領域中に位置する修飾残基をコードする新しい遺伝子配列 | |
HU210541A9 (hu) | Zimogén- vagy fibrin-specifikus tulajdonságú, a 296-299 aminosav-tartományban helyettesített szöveti plazminogén aktivátor, ezt kódoló DNS-molekulák, vektorok és gazdasejtek |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |