NO317661B1 - Trombinaktiverbare plasminogenanaloger, anvendelse av forbindelsene ved fremstilling av et farmasoytisk middel, preparater som omfatter forbindelsene, samt nukleinsyre - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse er en forbedring av oppfinnelsen beskrevet i vår tidligere innleverte patentsøknad WO-A-9109118 og vedrører plasminogenanaloger som aktiveres av trombin slik at de får fibrinolytisk aktivitet, eller for å inhibere blodlevringsdannelse. Den vedrører også nukleinsyre (DNA og RNA) som koder for hele eller en del av slike forbindelser. Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater som inneholder dem, og deres anvendelse ved fremstilling av et middel for behandling av trombosesykdom.

Plasminogen er en nøkkelkomponent i det fibrinolytiske system som er den naturlige motpart til blodlevringssys-temet i blodet. Ved blodkoagulasjonsprosessen er en kaskade av enzymaktiviteter involvert i frembringelse av et fibrinnett-verk som danner rammeverket i en blodlevring, eller trombe. Nedbrytning av fibrinnettverket (fibrinolyse) utføres av virk-ningen av enzymet plasmin. Plasminogen er den inaktive for-løper for plasmin, og omdannelse av plasminogen til plasmin utføres ved spalting av peptidbindingen mellom arginin 561 og valin 562 i plasminogen. Under fysiologiske betingelser katalyseres denne spaltingen ved hjelp av vevstypeplasminogen-aktivator (tPA) eller ved hjelp av urokinasetype plasminogen--aktivator (uPA).

Dersom likevekten mellom blodlevrings- og fibrino-lysesystemene forstyrres lokalt, kan det dannes intravaskulære blodpropper på passende steder, noe som fører til slike tilstander som koronar trombose og myokardialinfarkt, dyp venetrombose, slag, perifer, arteriell tilstopping og emboli. I slike tilfeller er administreringen av fibrinolytiske midler blitt påvist å være en gunstig terapi for fremme av blodpropp-oppløsning. Antitrombosemidler kan også anvendes til forhind-ring av blodlevringsdannelse.

Problemet med de fleste midlene som anvendes for fibrinolytisk behandling, er imidlertid at de ikke er trombespesifikke ved klinisk anvendbare doser ettersom de aktiverer plasminogen i det generelle blodomløp. En alternativ fremgangsmåte for å øke fibrinolyse er beskrevet i vår tidligere innleverte patentsøknad WO-A-9109118, og er basert på anvendelsen av molekyler som lar seg aktivere slik at vi får fibrinolytisk aktivitet, eller for å inhibere blodlevringsdannelse. Aktiveringen katalyseres ved hjelp av ett eller flere endogene enzymer involvert i blodlevring. En fordel ved denne fremgangsmåten er at trombefibrinolyseselektivitet eller inhibering av blodlevringsdannelsesaktivitet oppnås gjennom den trombespesifikke lokalisering av det aktiverende enzym. Nærmere bestemt beskrives i WO-A-9109118 blant annet plasminogenanaloger som er aktiverbare til plasmin ved spalting av trombin.

Trombin {E.C. 3.4.21.5) er en serinprotease som kata-lyserer proteolysen av et antall proteiner, inkludert fibrinogen (A-alfa- og B-beta-kjeder), faktor XIII, faktor V, faktor

VII, faktor VIII, protein C og antitrombin III. Den struktur som er påkrevet for gjenkjennelse ved hjelp av trombin, synes å være delvis bestemt av den lokale aminosyresekvensen rundt spaltingssetet, men bestemmes også av en variabel forlengelse ved hjelp av sekvens(er) langt borte fra spaltingssetet. For eksempel er restene P2 (Val), P9 (Phe) og P10 (Asp) av avgjør-ende betydning i fibrinogen A-alfa-kjeden for alfa-trombin-katalysert spalting i Arg(16)-Gly(17)-peptidbindingen (Ni, F.

et al. 1989, Biochemistry 28 3082-3094). I WO-A-9109118 beskrives at optimale spaltingsseter for alfa-trombin kan ha strukturen (i) P4-P3-Pro-Arg-Pl<*->P2', hvor hver av P3 og P4 uavhengig av hverandre er en rest av en hydrofob aminosyre (slik som valin), og hver av Pl' og P2' uavhengig av hverandre er en ikke-sur aminosyrerest, eller (ii) P2-Arg-Pl', hvor P2 eller Pl' er en glysinrest. De trombinaktiverbare plasminogen-analogforbindelser beskrevet som foretrukne i WO-A-9109118, og alle de som er spesifikt eksemplifisert der, har følgelig spaltingsseter som passer til de ovenfor nevnte strukturer (i) eller (ii). Dataene rapportert i WO-A-9109118, tyder på at den av de spesifikt eksemplifiserte, trombinspaltbare plasminogenanaloger som er betegnet T19, er den mest effektive i analyse-systemene som er brukt. Den har et spaltingssete basert på faktor XIII, Pro (559) og Gly (560) av villtypeplasminogen som er blitt erstattet med Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Val-Val-Pro. Trom-binspaltingssetet i T19, den mest effektive av forbindelsene som er spesifikt eksemplifisert, oppfyller derfor kravene til ;struktur (i) ovenfor, foretrukket ifølge WO-A-9109118. ;I fravær av kofaktorer er faktor XI blitt rapportert ;å ikke bli spaltet av trombin (Naito, K. og Fujikawa, K. ;(1991), J. Biol. Chem. 266, 7353-7358), eller bare å bli sakte spaltet med et forhold kcat/K^l, 6xl05M-lmin-l (Gailani, D. og Broze, G.J. 1991, Science 253 909-912). Spaltingssetesekvensen til dette trombinsubstratet atskiller seg fra de foretrukne, generelle formlene i) og ii) i WO-A-9109118. I faktor XI er det en basisk aminosyre, Lys, i P3-stillingen. Selv om trom-binspaltingsaktivitet på dette sted i faktor XI er svært lav sammenlignet med den til faktor XIII (kCat/Km=l, 4xl05M-lsek-l; Naski et al., 1991, Biochemistry 30 934-941), er det imidlertid nå blitt funnet i overensstemmelse med denne oppfinnelse at plasminogenanaloger som har en trombinspaltingssekvens med en basisk aminosyrerest i P3-stillingen, har overraskende forøkt aktivitet sammenlignet med T19. Slike nye analoger spaltes hurtigere ved hjelp av trombin og oppviser forøkt aktivitet i en bundet kromogenanalyse. Nærmere bestemt er slike analoger aktive i en plasmalevringslyseanalyse som ligner mer på tilstander in vivo. ;Et ytterligere eksempel på et trombinspaltingssete hvor P3 er en basisk aminosyrerest, finnes i enkj edet uro-kinase hvor P3 er arginin. Spalting i dette setet gir inaktiv tokjedeurokinase (Ichinose et al., (1986) J. Biol. Chem. 261 3486-9). I fravær av kofaktorer er også spalting av enkjede-urokinase ved hjelp av trombin noe sakte, med et forhold kCat/K,n=3, 8xl04M-lsek-l; (de Munk et al., 1990 Fibrinolysis 4 161); plasminogenanaloger som bærer urokinasespaltingssetet, er imidlertid nå blitt påvist å ha forøkt aktivitet sammenlignet med Tl9. ;Foreliggende oppfinnelse er følgelig en forbedring av oppfinnelsen beskrevet i WO-A-9109118 ved at den tilveiebringer en plasminogenanalog som er aktiverbar ved hjelp av trombin slik at den får plasminaktivitet (som generelt beskrevet i WO-A-9109118) , men spesifikt karakterisert ved at den inneholder spaltingssetesekvensen P4-P3-Pro-Arg-Pl<1->P2', hvor P3 er en basisk aminosyrerest, P4 er en hydrofob aminosyrerest og hver av Pl' og P2' er uavhengig av hverandre en ikke-sur aminosyrerest, idet setet lar seg spalte mellom Arg og Pl<1> med trombin. ;Plasminogen er blitt nummerert i henhold til protein-sekvenseringsstudiene til Sottrup-Jensen et al. (i: Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff, M.O., red.) 5 suppl. 3, s. 95 (1978)) som indikerte at plasminogen var et 790 aminosyrers protein, og at spaltingssetet var Arg (560)-Val(561)-peptidbindingen. Et egnet plasminogen-cDNA som kan anvendes ved denne utførelsesformen av oppfinnelsen, og det som ble isolert av Forsgren et al. (FEBS Letters 213 254-260 ;(1987)), koder for et 791-resters protein med en ekstra Ile i 65-stilling. I denne beskrivelsen tilsvarer nummereringen av aminosyrene i plasminogen nummereringen i den anvendte cDNA. Det kan være polymorfisme i strukturen til plasminogen, og det kan være former av plasminogen hvor nummereringen av spaltingssetet atskiller seg, men det er ment at slike varianter skal være inkludert i utførelsesformen. ;Uttrykket "plasminogenanalog" betyr derfor, slik det er brukt i denne beskrivelsen, et molekyl som atskiller seg fra villtypeplasminogen, og som har evne til å bli spaltet eller påvirket på annen måte slik at det dannes et molekyl med plasminaktivitet. ;Plasminogenanaloger innenfor omfanget av denne utfør-elsesf ormen av oppfinnelsen bibeholder fibrinbindingsaktivi-teten til villtypeplasminogen i en passende grad, men kan ha endrede inhiberingskarakteristika; foretrukne plasminogenanaloger har en plasmahalveringstid som er sammenlignbar med den til villtypeplasminogen, men denne egenskapen er ikke av av-gjørende betydning. ;I den trombinspaltbare setesekvens som er til stede i plasminogenanaloger ifølge oppfinnelsen, kan den basiske aminosyrerest P3 være en lysin- eller argininrest; den hydrofobe aminosyrerest P4 kan være en valin-, isoleucin- eller leucinrest; og hver av de ikke-sure aminosyrerestene Pl' og P2<1 >kan uavhengig av hverandre være en valin-, isoleucinrest eller leucinrest. ;Bestemte plasminogenanaloger innenfor omfanget av oppfinnelsen inneholder spaltingssetet Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro-Arg- Pl'-P2', eller spaltingssetet Leu-Arg-Pro-Arg, hvor hver av Pl<1> og P2' uavhengig av hverandre er en ikke-sur aminosyrerest. Som nevnt, kan Pl' og P2<*> være isoleucin- eller valinrester.

Bestemte og foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen er plasminogenanalogene: a) hvor Pro(559), Gly(560) er erstattet med Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro; og Val(562) er erstattet med Ile. I denne analogen er aminosyren 563 valin, slik som i villtypen. Denne mutanten er blitt betegnet BB10151. b) hvor Cys(558), Pro(559), Gly(560) er erstattet med Ala, Gly, Gin, Lys, Thr, Leu, Arg, Pro; og Cys(566) er erstattet med Ala. I denne analogen er aminosyrene 562 og 563 valin som i villtypen. Denne mutanten er blitt betegnet BB10156. c) hvor Cys{558), Pro(559), Gly(560) er erstattet med Ala, Leu, Arg, Pro; og Cys(566) er erstattet med Ala. I denne

analogen er aminosyrene 562 og 563 valin som i villtypen. Denne mutanten er blitt betegnet BB10170.

d) hvor Pro(559), Gly(560) er erstattet med Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Leu, Arg, Pro. I denne analogen er aminosyrene

562 og 563 valin som i villtypen. Denne mutanten er blitt betegnet BB10171.

e) hvor Cys(558), Pro(559), Gly(560) er erstattet med Ala, Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro; Val(562) er erstattet med

Ile; og Cys(566) er erstattet med Ala. Denne mutanten er blitt betegnet BB10158.

Plasminogenanaloger i overensstemmelse med oppfinnelsen er blitt definert ved hjelp av særskilt henvisning til egenskapene til deres trombinspaltbare setesekvens ettersom det er den overraskende spaltingshurtighet i dette setet som ligger under den forbedrede trombolytiske aktivitet til forbindelsene. Det er imidlertid sannsynlig at plasminogenanaloger i overensstemmelse med oppfinnelsen (dvs. som inneholder de nå identifiserte, nye spaltingssetesekvensene) kan inne-holde andre modifikasjoner (sammenlignet med villtypeplasminogen) som kan være én eller flere addisjoner, delesjoner eller substitusjoner i seter som er mer eller mindre fjerne fra spaltingssetet, uten at fordelen ved hurtig spalting tapes. Et eksempel på en slik modifikasjon ville være addisjonen, fjerningen, substitusjonen eller endringen av ett eller flere kringledomener for å forandre fibrinbindingsaktivitet eller redusere a2-antiplasminbinding. Et bestemt eksempel ville være mutasjon av det lysinbindende sete lokalisert på Kringle 1 for å virke inn på bindingen av oc2-antiplasmin til dette setet.

Slike varianter kan være resistente overfor inhibering ved hjelp av a2-antiplasmin. Foretrukne utførelsesformer omfatter BB10189, BB10190 og BB10192 som er plasminogenanalogene BB10153, BB10170 og BB10171, hver med de ytterligere mutasjonene Asp 137>Ser og Asp 139>Ser.

Et annet eksempel ville være mutasjon for å forhindre disulfidbindingsdannelse mellom Cys(558) og Cys(566), f.eks. ved å erstatte én av eller begge cysteinrestene med alanin-rester, for å fjerne den hindringen som er pålagt spaltingssetet ved disulfidbindingen dannet mellom cysteinrester. Av de foretrukne utførelsesformer beskrevet ovenfor, har variantene BB10156, BB10158 og BB10170 slike åpenløkkemodifikasjoner.

Et eksempel på en modifikasjon som omfatter delesjon, ville være lys-plasminogenvarianter av en plasminogenanalog hvor de aminoterminale 68-, 77- eller 78-aminosyrer er blitt delert. Slike varianter har forøkt fibrinbindingsaktivitet, slik det er blitt observert for lys-plasminogen, sammenlignet med villtype-glu-plasminogen {Bok, R.A. og Mangel, W.F. 1985, Biochemistry 24 3279-3286). Et ytterligere eksempel som omfatter delesjon, ville være varianter av en plasminogenanalog hvor kringle 1- eller kringle 1-4-domenene er blitt delert for å forstyrre <x2-antiplasminbinding. Slike varianter kan være resistente overfor inhibering ved hjelp av a2-antiplasmin. Delesjon av kringlene 1-4 ville også endre fibrinbindingen og de farmakokinetiske egenskapene til molekylet.

For den svært blodlevringsselektive analog av plasminogen ifølge foreliggende oppfinnelse kan det være foretrukket å innføre en mutasjon i serinproteasedomenet som virker inn på plasmininhibitorbinding (sekvensidentitet nr. 2 viser serinproteasedomenet til villtypeplasmin, og henvisninger til det domenet gjør, der de er nummerert, bruk av nummereringen til sekvensidentitet nr. 2). Denne mutasjonen kunne være i en analog posisjon til den som er vist for å forhindre inhibitorbinding til vevsplasminogenaktivator (Madison, E.L. et al.

1989, Nature 339 721-724) eller kunne være i en annen stilling som forhindrer inhibitorbinding til plasminogen; slike modifi-

kasjoner er beskrevet i patentsøknad PCT/GB 9301632 som be-skriver endopeptidaser av chymotrypsinsuperfamilien som viser resistens mot serinproteaseinhibitorer. Slik resistens til-veiebringes ved hjelp av en modifikasjon i endopeptidasen eller dens forløper som induserer én av de følgende: a) en konformasjonsendring i proteasens lokale folding; b) en endring i de relative orienteringene til proteasen og inhibitoren etter dannelse av et kompleks; c) en endring i proteasens steriske fyldighet i inhibi-torens område; d) en endring i det elektrostatiske spenningsfelt i om-rådet til inhibitorbindingssetet; eller

e) enhver kombinasjon av det ovenfor nevnte.

En foretrukket utførelsesform er BB10158 med A4-mutasjonen (Glu606-Lys) beskrevet i PCT/GB 9301632 (BB10199).

Denne mutasjonen er utformet for å avbryte ioneinteraksjoner på overflaten av plasminogen som virker inn på binding til antiplasmin. Mutagenese ble utført under anvendelse av et oligonukleotid med 24 baser, 5' CTT GGG GAC TTC TTC AAG CAG

TGG 3', utformet for å omdanne Glu606 til Lys. Andre foretrukne utførelsesformer har, enten alene eller i kombinasjon, mutasjoner i Glu606, Glu623, Phe583, Met585 eller Lys 607. Glu606- og Glu623-mutasjonene ble eksemplifisert i PCT/GB 9301632. Et eksempel på denne utførelsesformen er BB10153 som er plasminogenanalogen BB10151 med tilleggsmutasjonene Glu606 til Lys og Glu623 til Lys.

Andre mange ganger modifiserte plasminogenanaloger i overensstemmelse med oppfinnelsen kan omfatte én eller flere modifikasjoner for å forhindre, redusere eller endre glykosyl-eringsmønstre. Plasminogenanaloger som omfatter slike modifikasjoner, kan ha en lengre halveringstid, redusert fjerning fra plasma og/eller høyere spesifikk aktivitet.

Ved et annet aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt forbindelser som er definert som plasminogenanaloger ifølge det første aspektet av oppfinnelsen ovenfor, som er kjennetegnet ved at de er ment for anvendelse ved profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse.

Plasminogenanalogene ifølge det første aspektet av oppfinnelsen kan syntetiseres ved hjelp av hvilken som helst vanlig reaksjonsvei, som for eksempel ved en fremgangsmåte som omfatter suksessiv sammenkobling av aminosyrerester og/eller ligering av oligopeptider. Selv om proteiner i prinsippet kan syntetiseres fullstendig eller delvis ved hjelp av kjemiske midler, er det foretrukket å fremstille dem ved hjelp av ribosomal translasjon, fortrinnsvis in vivo, av en tilsvarende nukleinsyresekvens. Proteinet kan være passende glykosylert.

Det er foretrukket å produsere proteiner ifølge oppfinnelsen ved å anvende teknikk med rekombinant DNA. DNA som koder for et naturlig forekommende plasminogen, kan fås fra en cDNA eller genomklon, eller kan syntetiseres. Aminosyresubsti-tusjoner, -addisjoner eller -delesjoner innføres fortrinnsvis ved hjelp av setespesifikk mutagenese. DNA-sekvenser som koder for plasminogenanaloger, kan fås ved fremgangsmåter som er godt kjent for fagfolk innen fagområdet genteknikk.

Fremgangsmåten for fremstilling av proteiner under anvendelse av teknikk med rekombinant DNA, vil vanligvis omfatte trinnene med innføyelse av en egnet, kodende sekvens i en ekspresjonsvektor og overføring av vektoren til en verts-celle. Ifølge et tredje aspekt av oppfinnelsen er det derfor tilveiebrakt syntetisk eller rekombinant nukleinsyre som koder for en proteinforbindelse som beskrevet ovenfor. Nukleinsyren kan være RNA eller DNA og kan være i form av en vektor, slik som et plasmid, kosmid eller en fag. Vektoren kan tilpasses for å transfektere eller transformere prokaryote celler (f.eks. bakterieceller) og/eller eukaryote celler (f.eks. gjær- eller pattedyrceller). En vektor vil omfatte et kloningssete og vanligvis minst ett markørgen. En ekspresjonsvektor vil ha en promoter operativt bundet til sekvensen som skal innføyes i kloningssetet, og fortrinnsvis en sekvens som gjør det mulig for proteinproduktet å bli utskilt.

Plasminogenanalogene ifølge oppfinnelsen kan uttryk-kes ved å bruke en vektor av den typen som er beskrevet i WO-A-9109118 som omfatter en første nukleinsyresekvens som koder for et protein, eller som omfatter et kloningssete, operativt bundet til en andre nukleinsyresekvens som inneholder en sterk promoter og enhancersekvens avledet fra humant cytomegalovirus, en tredje nukleinsyresekvens som koder for en polyadenyleringssekvens avledet fra SV4 0, og en fjerde nukleinsyresekvens som koder for en selekterbar markør uttrykt fra en SV40-promoter og som har et ytterligere SV40-polyadenyleringssignal i 3-enden til den selekterbare markørsekvens.

Det skal forstås at uttrykket "vektor" anvendes i denne beskrivelsen i en funksjonell betydning og ikke skal forstås som nødvendigvis å være begrenset til et enkelt nukleinsyremolekyl. Således kan f.eks. den første, andre og tredje sekvensen i vektoren definert ovenfor, befinne seg i et første nukleinsyremolekyl, og den fjerde sekvensen kan befinne seg i et andre nukleinsyremolekyl.

Denne vektoren gjør det mulig for plasminogenanalogene å bli uttrykt og utskilt i celledyrkningsmediet i en biologisk aktiv form uten behov for noen ytterligere biolog-iske eller kjemiske fremgangsmåter.

Ifølge et tredje aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en nukleinsyre som er kjennetegnet ved at den koder for plasminogenanalogene beskrevet ovenfor, som kan fremstilles ved suksessiv sammenkobling av nukleotider og/eller ligering av oligo- og/eller polynukleotider.

Ved fremstillingen av plasminogenanalogene kan det anvendes en celle eller cellelinje transformert med nukleinsyre og/eller en vektor som beskrevet ovenfor. Egnede celler eller cellelinjer som skal transformeres, omfatter både prokaryote {f.eks. Escherichia coli) og eukaryote celler, slik som gjærceller (inkludert Saccharomyces cerevisiae og Pichia pastoris) og pattedyrceller. Pattedyrceller som vokser i kon-tinuerlig kultur, og som kan transfekteres eller transformeres på annen måte ved hjelp av standardteknikker, er foretrukket. Eksempler på egnede celler omfatter ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO), musemyelomcellelinjer, slik som NSO og P3X63-Ag8.653, COS-celler, HeLa-celler, BHK-celler, melanomcellelin-jer, slik som Bowes cellelinje, muse-L-celler, humane hepatom-cellelinjer, slik som Hep G2, musefibroblaster og muse-NIH-3T3-celler. CHO-celler er særlig foretrukket som verter for ekspresjonen av plasminogen og plasminogenanaloger.

Transformasjon kan oppnås ved hjelp av hvilken som helst passende metode; elektroporasjon er særlig egnet.

Plasminogenanaloger ifølge foreliggende oppfinnelse kan som nevnt anvendes til profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til en pasient av en effektiv mengde av plasminogenanalogen. Det er derfor tilveiebrakt en plasminogenanalog som her beskrevet, for anvendelse innen medisin, særlig ved profylaksen og/eller behandlingen av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse, hvor det er ønsket å fremstille lokal, fibrinolytisk og/eller antikoagulantaktivitet. Slike tilstander omfatter hjerte- og hjerneinfarkt, arterie- og venetrombose, tromboemboli, postkirurgiske adhesjoner, tromboflebitt og diabetiske vaskulopatier, og koagulasjons-ubalanse forbundet med kreft.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelsen av en plasminogenanalog som her beskrevet, ved fremstillingen av et middel for profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse.

Dessuten er det også tilveiebrakt et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk preparat som omfatter én eller flere plasminogenanaloger som her beskrevet, og en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabel bærer. Et slikt preparat kan være tilpasset for administrering oralt, ved intravenøs eller intramuskulær injeksjon eller ved infusjon. Egnede, in-jiserbare preparater omfatter preparater av én eller flere sterile plasminogenanaloger i isoton, fysiologisk saltoppløs-ning og/eller buffer, og kan også omfatte et lokalanestetikum for å lindre injeksjonssmerten. Lignende preparater kan anvendes til infusjon. Når forbindelsen skal administreres som en topisk behandling, kan den være formulert som en krem, salve eller lotion i en egnet base.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan leveres i en-hetsdoseringsform, f.eks. som et tørt pulver eller vannfritt konsentrat i en hermetisk lukket beholder, slik som en ampulle eller liten pose.

Mengden av materiale som skal administreres, vil av-henge av mengden av fibrinolyse eller inhibering av blodlevring som er påkrevet, den påkrevde virkningshastighet, alvor-ligheten av den tromboembolske posisjon og størrelsen på blod-proppen. Den nøyaktige dose som skal administreres, vil, på grunn av den bestemte type av tilstand som forbindelser ifølge oppfinnelsen er ment å behandle, bli bestemt av legen. Som en rettledning vil imidlertid en pasient som behandles for en fullt utviklet trombe, generelt motta en daglig dose av en plasminogenanalog fra 0,01 til 10 mg/kg kroppsvekt, enten ved injeksjon i f.eks. opptil 5 doser, eller ved infusjon.

De følgende figurer og eksempler ifølge oppfinnelsen er gitt som illustrasjon, og ikke som begrensning. I tegnin-gene henvist til i eksemplene: figur 1 viser spaltingshastigheten for BB10151 ved hjelp av trombin;

figur 2 viser resultatene av en kromogenanalyse som sammenligner aktivering av BB10151 og T19 ved hjelp av trombin;

figur 3 viser blodlevringslyseaktiviteten til BB10151.

Eksempel 1 - Konstruksjon, ekspresjon og rensing av BB10151

Isoleringen av plasminogen-cDNA og konstruksjon av vektorene pGWH og pGWHgP er blitt beskrevet i WO-A-91/09118. i pGWHgP kan transkripsjon gjennom plasminogen-cDNA initiere i HCMV-promoteren/enhanceren, og den selekterbare markør gpt anvendes.

Teknikkene med genetisk manipulasjon, ekspresjon og proteinrensing brukt ved fremstillingen av det modifiserte plasminogeneksempel som følger, er velkjente for fagfolk innen fagområdet genteknikk. En beskrivelse av mesteparten av teknikkene kan finnes i én av de følgende laboratoriehåndbøker: "Molecular Cloning" av T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sam-brook utgitt av Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, New York, eller "Basic Methods in Molecular Biology" av L.G. Davis, M.D. Dibner og J.F. Battey publisert av Elsevier Science Publishing Co. Inc., New York.

Ytterligere og modifiserte metoder er nærmere omtalt i metodeavsnittet nedenunder.

BB10151 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro, og Val(562) er erstattet med Ile, hvorved det fremstilles en spaltingssløyfe som lar seg spalte ved hjelp av trombin (sekvensidentitet nr. 1). Dette setet er basert på et poten-sielt trombinspaltingssete i faktor XI. Fremgangsmåtene som er anvendt i dette eksemplet, er hovedsakelig som beskrevet i WO-A-9109118, eksemplene 2 og 3, idet mutagenesereaksjonen ut-føres på det 1,87 kb store Kpnl-HincII-plasminogenfragment klonet inn i bakteriofagen M13mpl8. Enkelttrådet templat ble fremstilt og mutasjonen gjort ved hjelp av oligonukleotidstyrt mutagenese. I dette tilfellet ble det anvendt et 48 baser langt oligonukleotid

(5' CACCCCCCTACGATTCTAGGTTTAATTTTAGTTGTACATTTCTTCGGC 3')

(sekvensidentitet nr. 4) til å styre mutagenesen.

Plasmid-DNA ble innført i CHO-celler ved elektroporasjon under anvendelse av 800 V og 25 fiF. Selektivt medium inneholdende 250 fil/ ml xantin, 5 ig/ml mykofenolsyre, lx hypoxantin-tymidin (HT), ble tilsatt til cellene 24 timer etter transfeksjon, og mediet ble byttet hver andre til tredje dag. Plater som ga gpt-resistente kolonier, ble screenet med hensyn på plasminogenproduksjon under anvendelse av en ELISA-analyse. Celler som produserte de høyeste nivåene av antigen, ble reklonet og de beste produsentene oppskalert i kolber, idet produksjon ble nøye overvåket. Nedfryste forråd av alle disse cellelinjene ble lagt ned. Produsentceller ble oppskalert i rulleflasker, hvorved man fikk kondisjonert medium hvorfra plasminogenprotein ble renset under anvendelse av lysin-"Sepharose" 4B. (Ordet Sepharose er et varemerke). Cel-lelinjen anvendt til å produsere dette mutantproteinet, var 123.C6.

Eksempel 2 - Konstruksjon av BB10153

BB10153 er et derivat av BB10151 inneholdende to ytterligere mutasjoner (Glu606 til Lys og Glu623 til Lys) for å svekke binding av a2-antiplasmin. Det 663 bp store ScoRV til Sphl-fragment i BB10151 (klonet i pUC, se eksempel 1) ble fjernet og erstattet med det ekvivalente 663 bp store fragment fra den antiplasminresistente mutant A3A4. Konstruksjon av denne er beskrevet i eksempel 5 i PCT/GB9301632. Oligonukleotidet med 24 baser 5' CTT GGG GAC TTC TTC AAG CAG TGG 3' (sekvensidentitet nr. 3) ble brukt til å omdanne Glu-606 til Lys, og oligonukleotidet med 27 baser 5' GTTCGAGATTCACTTTTTGGTGTG-CAC 3' (sekvensidentitet nr. 5) ble brukt til å omdanne Glu623 til Lys. Fullengdeplasminogenet ble så klonet inn i ekspresjonsvektoren pGWIH før innføyelsen av gpt-seleksjonsmarkøren som beskrevet i WO-A-9109118, eksempel 2.

Eksempel 3 - Konstruksjon av BB10156, BB10158 & BB10170

Den DNA som koder for plasminogenmutant BB10150, ble brukt som templat for produksjon av BB10156, BB10158 Sc BB10170. BB10150 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Val, Val, Pro og har de ytterligere mutasjonene Cys{558) til Ala og Cys(566) til Ala for å forhindre disulfidbindingsdanneIse. Den åpnede spalt-ingssløyfesekvens til BB10150 er vist i sekvensidentitet nr. 6. BB10150 ble laget ved mutagenese ved anvendelse av to oligonukleotidprimere (5' CTAGGTACAACCGCTTTCTTCGGCT 3' (sekvensidentitet nr. 7) og 5' GGTGGGCCACCGCCCCCCCCAC 3' (sekvensidentitet nr. 8), og det 1,87 kb store Jfpnl-HincII-f rag-ment fra mutant T13 (se patentsøknad WO-A-9109118, eksempel 13 og sekvensidentitet nr. 9) ble klonet inn i M13.

Plasminogenanalogene BB10156, BB10158 og BB10170 ble alle konstruert ved hjelp av setespesifikk mutagenese under anvendelse av den tidligere beskrevne mutant BB10150 i M13 som templatet, slik at de alle har de samme mutasjoner av Cys til Ala i restene 558 og 566. BB10156 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly{560) er erstattet med Gly, Gin, Lys, Thr, Leu, Arg, Pro (sekvensidentitet nr. 10). BB10158 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro, og Val(562) er erstattet med Ile (sekvensidentitet nr. 11). BB10170 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro{559), Gly(560) er erstattet med Leu, Arg, Pro (sekvensidentitet nr. 12). Oligo-nukleotidene som ble anvendt til priming av hver mutagenese, er vist nedenunder:

I hvert tilfelle ble mutasjonen, etter DNA-sekvensering, klonet direkte inn i pGWIHg.plasminogenekspresjonsvektor under anvendelse av restriksjonsenzymene Hindlll og Spil. Disse setene var på forhånd blitt innført i den ytterste 5'-ende i plasminogen og ved 1850 respektivt via mutagenese; den plasminogenaminosyrekodende sekvens ble ikke påvirket av denne fremgangsmåten.

Eksempel 4 - Konstruksjon av BB10169 og BB10171

BB10169 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Ile, Lys, Pro, og Val{562) er erstattet med Ile (sekvensidentitet nr. 16). BB10169 ble laget ved oligonukleotidstyrt mutagenese av BB10151 i M13 under anvendelse av oligonukleotidet med 42 baser

5' GATTCTAGGTTTAATGCCCTGCAGTTCCACACATTTCTTCGG 3'

{sekvensidentitet nr. 17) etterfulgt av kloning inn i pGWlHg-plasminogen under anvendelse av Hindlll og Spil. BB10171 er en plasminogenanalog hvor aminosyrerestene Pro(559), Gly(560) er erstattet med Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Leu, Arg, Pro (sekvensidentitet nr. 18). Det enkelttrådede M13 fra BB10169 ble brukt som templat for konstruksjonen av BB10171. Mutagenese ble primet under anvendelse av oligonukleotidet med 39 baser

5' CACCCCCCTACCACTCTGGGTCTCAGGCCCTGCAGTTCC 3'

(sekvensidentitet nr. 19) og ble, etter DNA-sekvensering, klonet inn i ekspresjonsvektoren under anvendelse av Hindlll og Spil.

Eksempel 5 - Konstruksjon og ekspresjon av BB10189, BB10190 og BB10191

Plasminogenanalogene BB10189, BB10190 og BB10191 har kringle 1-dobbeltmutasjonen Asp(137) til Ser, Asp(139) til Ser for å gjøre lysinbindingssetet ubrukbart. Mutasjonen ble ut-ført i bakgrunnene til BB10153, BB10170 og BB10171 (se eksemplene 2, 3 og 4) under anvendelse av oligonukleotidet med

28 baser

5' CCCTGCGGAGAGTTGGATGGATTCCTGC 3' (sekvensidentitet nr. 20). Mutasjonen ble så klonet inn i pGWIHg.plasminogen under anvendelse av restriksjonsenzymene Hindlll og Spil.

Eksempel 6 - Konstruksjon av BB10181

BB10181 har spaltingssetesekvensen til BB10170 og en ytterligere mutasjon av Phe(583) til Arg for å virke inn på bindingen av å2-antiplasmin. BB10181 ble konstruert via et mellomprodukt, BB10150-basekonstruksjon under anvendelse av M13 inneholdende fullengde-BBlOISO som templat, og oligonukleotidet 5' GAAGTGCATTCCTCTCCTCGTACGAAG 3' (sekvensidentitet nr. 21) som primer. Det muterte BB10150-gen ble så klonet inn i pGWIHg under anvendelse av restriksjonsenzymene Hindlll og Smal. BB10181-ekspresjonsvektoren ble så laget fra dette mellomprod-uktet ved å erstatte HindiII-Spil-fragmentet fra dette plas-midet med den tilsvarende del fra BB10170 (se eksempel 3).

Eksempel 7 - Konstruksjon av BB10186

BB10186 har spaltingssetesekvensen til BB10171 og en ytterligere mutasjon av Met(585) til Arg for å virke inn på bindingen av a2-antiplasmin. BB10186 ble laget på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 6 ovenfor for BB10181. Den intermediære BB10150-konstruksjon ble laget under anvendelse av det 25 baser lange oligonukleotid 5' CCACAGAAGTGTCTTCCAAACCTCG 3' (sekvensidentitet nr. 22) etterfulgt av kloning inn i pGWIHg. BB10186 ble så laget ved hjelp av en fragmentomstilling under anvendelse av Hindlll-Spll-fragmentet fra BB10171 (se eksempel 4).

Eksempel 8 - Konstruksjon av BB10199

BB10199 har spaltingssetesekvensen til BB10158 og en ytterligere mutasjon av Glu(606) til Lys for å virke inn på bindingen av å2-antiplasmin. BB10199 ble laget hovedsakelig som beskrevet i PCTGB 9301632, eksemplene 2 og 3. Kpnl- EcoRV-fragmentet fra BB10158 (se eksempel 3 ovenfor) ble brukt til å erstatte det tilsvarende fragment i en BB10151-konstruksjon med Glu(606) til Lys klonet inn i pUC, og ble så klonet inn i sluttekspresjonsvektoren som beskrevet i PCTGB 9301632.

Eksempel 9 - Spalting av BB10151

Plasminogenmutanter (12,5 fig) ble inkubert med 2,8 /zg trombin som beskrevet i metode 1. Tidsforløpet for spalting av plasminogenmutantene ble bestemt ved hjelp av kvantitativ gel-skanning; 50% spaltingstider for T19 og BB10151 var henholds-vis 9 og 3 minutter. Gelskanningsdata for spalting av BB10151 er vist i figur 1.

Eksempel 10 - Aktivering av BB10151

Renset BB10153-protein ble analysert med hensyn på aktivering under anvendelse av den bundne kromogenanalyse (se metode 2.1). Resultater av denne analysen er vist i figur 2 hvor økningen i absorbans ved 405 nm med tiden viser at plasminaktivitet frembringes etter inkubasjon av BB10151 med trombin. T19 er vist for sammenligning og ble funnet å være omtrent to ganger svakere enn BB10151 i denne analysen.

Eksempel 11 - Plasmalevringslyse

Evnen til BB10153 og T19 når det gjelder å lysere en plasmalevring, ble bestemt som beskrevet i metode 2.2, og resultatene av en slik analyse er vist i figur 3. BB10151

(20 ug/ ml) var i stand til å forårsake fullstendig lyse av levringen, mens Tl9 ikke lyserte levringen ved konsentrasjoner opptil 150 //g/ml. BB10153 ble således funnet å være minst 7 ganger mer aktiv enn T19 ved induksjon av lyse av en plasmalevring.

Representative eksempler på andre plasminogenanaloger ifølge oppfinnelsen ble sammenlignet med hensyn på plasmalev-ringslyseaktivitet ved en konsentrasjon på 40 /xg/ml, og resultatene i tabell 1 viser at de har lik aktivitet med BB10151.

Metoder

1. Spaltingsanalyse

Plasminogenanaloger bestemmes med hensyn på mottake-lighet for spalting ved hjelp av trombin under anvendelse av SDS PAGE under reduserende betingelser. Typiske inkubasjons-volumer på 0,125 ml i 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, består av plasminogenanalog ved den konsentrasjon som er vist i eksemplene,

og trombin ved den konsentrasjon som er vist i eksemplene. Inkubasjoner utføres ved 37°C. Kontrollinkubasjoner utføres under de samme betingelser i fravær av trombin. Aktiverings-reaksjonene ble stanset ved å utfelle proteinet ved hjelp av tilsetning av trikloreddiksyre inntil en sluttkonsentrasjon på 20%, og ved å la de stå ved 4°C i mer enn 4 timer. Utfellin-gene ble så pelletert, vasket med aceton og på nytt oppslemmet i SDS PAGE-prøvebuffer (0,1 mM Tris, pH 6,8, 10% glyserol, 1% SDS, 0,5% merkaptoetanol og 0,05% bromfenolblått). Prøvene ble analysert enten på 8-25% gradientgeler eller 12% geler. De resulterende geler ble analysert under anvendelse av "Shimadzu" Gel Scanner som skanner gelen og beregner konsentra-sjonen av protein i bånd ved å bestemme arealet under toppene.

(Ordet Shimadzu er et varemerke). Spaltingshastigheten for

plasminogen ble så bestemt ved å måle fjerningen av plasmino-genbåndet ved omtrent 92 kDa og tilsynekomsten for båndet for plasmintungkjede ved omtrent 66 kDa.

2. Akt iveringsanalyse

2.I Bundet kromogenanalyse

Plasminogenanalog og trombin inkuberes sammen i nær-vær av kromogensubstratet S2251, og plasmin fremstilt ved hjelp av aktivering, spalter direkte S2251, noe som fører til en økning i absorbans ved 405 nm. Analysen utføres i et total-volum på 880 /il i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl,

0,1 mM EDTA, 0,005% "Triton" X100 og 0,1% HSA. S2251 tilsettes inntil en sluttkonsentrasjon på 0,35 mg/ml, og plasminogenana-logkonsentrasjonen som anvendes, er 3 /xg/ml. Trombinkonsentra-sjonen anvendt, er 4,55 NIHU/ml. Aliquoter på 100 fil av reak-sjonsblandingen fjernes under inkubasjon ved 37°C og tilsettes til 25 fil 4% eddiksyre i mikrotiterplater for å stanse reak-sjonen. Ved fullførelsen av tidsforløpet avleses platene på en mikroplateavleser ved en bølgelengde på 405 nm.

2.2 Plasmalevringslyseanalyse in vi tro

En blanding av 50 /il kaninplasma (antikoagulert med 3,8% trinatriumsitrat) , 50 /il APTT-reagens (Instrumentation Labs) og et passende volum plasminogenanalog i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, lages opp til 200 [ il med den samme buffer i en brønn i en 96-brønners mikrotiterplate. En separat brønn inneholder 4,4 ( il 500 mM CaCl2 blandet med 50,6 /il av den samme buffer. Platen inkuberes ved 37°C i 30 minutter, og blodlevring startes opp ved å overføre 50 fil av CaCl2 til brønnen inneholdende plasminogenanalog. Forløpet av levringsdannelse og oppløsning følges ved å måle absorbansen ved 405 nm (620 nm referanse) ved tidsin-tervaller i løpet av fortsatt inkubasjon ved 37°C i 1 time.

Sekvensidentiteter

Claims (18)

1. Plasminogenanalog som kan aktiveres av trombin slik at den får plasminaktivitet, karakterisert ved at den inneholder spaltingssetesekvensen P4-P3-Pro-Arg-Pl<1->P2<1>, hvor P3 er en basisk aminosyrerest, P4 er en hydrofob aminosyrerest og hver av Pl' og P2<1> er uavhengig av hverandre en ikke-sur aminosyrerest, idet setet lar seg spalte mellom Arg og Pl<1> med trombin.

2. Plasminogenanalog ifølge krav 1, karakterisert ved at den basiske aminosyrerest P3 er en lysin- eller argininrest, den hydrofobe aminosyrerest P4 er valin, isoleucin eller leucin, og de ikke-sure aminosyrerestene Pl<1> og P2<1> uavhengig av hverandre hver er valin, isoleucin eller leucin.

3. Plasminogenanalog ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at spaltingssetesekvensen er valgt fra gruppen bestående av: eller: eller: og er i en stilling som tilsvarer stillingen til spaltingssetesekvensen fra og med Cys(558) til og med Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen.

4. Plasminogenanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at én av eller begge aminosyrene som tilsvarer Cys{558) og Cys{566) i naturlig forekommende plasminogen, er erstattet eller delert i tillegg til spaltingsseteerstatningen.

5. Plasminogenanalog ifølge krav 4, karakterisert ved at én av eller begge aminosyrene som tilsvarer Cys(558) og Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen, er erstattet med en alanin- eller serinrest(er).

6. Plasminogenanalog ifølge krav 5, karakterisert ved at spaltingssetesekvensen er valgt fra gruppen bestående av: eller: eller: og er i en stilling som tilsvarer stillingen til spaltingssetesekvensen fra og med Cys(558) til og med Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen.

7. Plasminogenanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at én eller flere av de følgende erstatningsmutasjoner er til stede: Glu-62 til Lys eller Ala, Ser-17 til Leu, Arg 19 til Glu eller Ala, eller Glu-45 til Lys, Arg eller Ala, i serinproteasedomenet til naturlig forekommende plasminogen (sekvensidentitet nr. 2) i tillegg til spaltingssetesekvensen.

8. Plasminogenanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at den har én eller flere av de følgende erstatningsmutasjoner: Phe(583) til Arg, Met(585) til Arg, Glu(606) til Lys, Glu(623) til Lys, Asp(137) til Ser, eller Asp(139) til Ser i den naturlig forekommende plasminogensekvens i tillegg til spaltingssetesekvensen.

9. Plasminogenanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at den også har en N-ende-avkortning som tilsvarer lys-plasminogenformer.

10. Plasminogenanalog ifølge krav 9, karakterisert ved at aminosyrerestene som tilsvarer de aminoterminale 68-, 77- eller 78-aminosyrerester i naturlig forekommende plasminogen, er blitt delert.

11. Plasminogenanalog ifølge krav 8, karakterisert ved at spaltingssetesekvensen er: og er i en stilling som tilsvarer stillingen til spaltingssetesekvensen fra og med Cys(558) til og med Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen, og hvor Glu(606) og Glu(623) i naturlig forekommende plasminogen begge er blitt erstattet med lysinrester.

12. Plasminogenanalog ifølge krav 8, karakterisert ved at spaltingssetesekvensen er: og er i en stilling som tilsvarer stillingen til spaltingssetesekvensen fra og med Cys(558) til og med Cys(566) i naturlig forekommende plasminogen, og hvor Met(585) i naturlig forekommende plasminogen er blitt erstattet med en argininrest.

13. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, karakterisert ved at den er ment for anvendelse ved profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse.

14 . Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-12 ved fremstilling av et middel for profylakse og/eller behandling av tilstander forårsaket av en ubalanse mellom blodlevring og fibrinolyse.

15. Farmasøytisk eller veterinærmedisinsk preparat, karakterisert ved at det omfatter én eller flere modifiserte plasminogenanaloger ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, sammen med en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabel bærer.

16. Nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-12.

17. Nukleinsyre ifølge krav 16, karakterisert ved at den er en vektor, f.eks. et plasmid, kosmid eller en fag.

18. Nukleinsyre ifølge krav 17, karakterisert ved at den omfatter en første nukleinsyresekvens som koder for et protein, eller som omfatter et kloningssete, operativt bundet til en andre nukleinsyresekvens som inneholder en sterk promoter og enhancersekvens avledet fra humant cytomegalovirus, en tredje nukleinsyresekvens som koder for en polyadenyleringssekvens avledet fra SV4 0, og en fjerde nukleinsyresekvens som koder for en selekterbar markør uttrykt fra en SV40-promoter, og som har et ytterligere SV40-polyadenyleringssignal i 3<1->enden av den selekterbare markørsekvens.