NO893196L - Hybrid-protein-c-sammensetninger og fremgangsmaater for deres fremstilling. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye hybrid protein C-sammensetninger som har anti-blodkoaguleringsaktivitet.

Humant protein C er en forløper til en serinprotease påvist i humant plasma.

Det er kjent at humant protein C blir aktivert ved et trombin-trombomodulinkompleks. Aktivert protein C hemmer blodkoagulering gjennom inaktivering av faktor Villa og faktor Va i nærvær av kalsiumioner, eller akselererer blodfibrinolyse gjennom inaktivering av vevsplasminogen aktivatorhemmer (heretter referert til som "PAI").

Genene som koder humant og bovint protein C ble klonet og sekvensert ved henholdsvis Foster et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 82, 4673-4677, (1985) og ved Long et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 81, 5653-5656, (1984).

Humant protein C har 9 karakteristiske glutaminsyrere residier i 6., 7., 14., 16., 19., 20., 25., 26. og 29. posisjoner i det aminoterminale området og bovint protein C har 2 ytterligere karakteristiske glutaminsyreresidier i 23. og 35. posisjonene. Disse glutaminsyreresidiene er karbok-sylert i deres7-karbon gjennom vitamin K-avhengig etter-translasjonsmodifisering. Domenet omfattet disse"y-karboksyl-glutaminsyreresidiene (heretter referert til som "Gla-domenet"). som er nødvendig for kompleksdannelse i nærvær av kalsium med negativ ladede fosfolipider på cellemembranen. Funksjonen til Gla-domenen er redegjort for i Taisha ( Metabolisme. 19, NOo. 9 (1982) (i Japan).

Bovint protein C har tilsvarende aktiviteter som de i humant protein C og homologien mellom disse primære strukturene av disse proteinene er kjent å være meget høy.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å frembringe en ny hybrid protein C-sammensetning laget ved å erstatte Gla- domenen i humant protein C med et korresponderende segment av bovint protein C for å øke kalsiumbindingsaktiviteten til humant protein C ved å øke antallet -y-karboksylglutamin-syreresidier fra 9 til 11, deretter å forbedre dens aktiver-ing eller protein C-aktivitet i seg selv.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot hybridproteinsammen-setninger ved å erstatte Gla-domenen i humant protein C med Gla-domenen fra bovint protein C eller med dens ekvivalent.

Aminosyresekvensen er aminoterminalen til human protein C og bovin protein C er listet i tabell 1.

Aminosyreresidiene i tabell er forkortet som følger:

A, Ala; N, Asn; S, Ser; F, Phe; L, Leu; E, Glu;

R, Arg; H, His; C, Cys; I, Ile; D, Asp; K, Lys;

Q, Gin; V, Val; P, Pro; T, Thr; W, Trp; M, Met;

G, Gly; Y, Tyr

Glutaminsyreresidiene, betegnet som E i denne tabellen, er^-karboksylert.

I foreliggende oppfinnelse vil aminosyresekvensen som inkluderer Gla-domenen indikere aminosyresekvensen fra 1. til 43. residie. For å erstatte Gla-domenen i human protein C med Gla-domenen i bovint protein C, blir de korresponderende segmentene vist i oppstillingen i tabell 1 substituert.

Hybridproteinene i foreliggende oppfinnelse kan bli fremstilt med genetisk engineering-teknikker. Derfor vedrører foreliggende oppfinnelse også med DNA-koding for disse hybridproteinene og fremgangsmåter for å fremstille disse hybridproteinene gjennom genetisk engineering-teknikker.

Genkoding for hydbridproteinene i foreliggende oppfinnelse kan bli konstruert ved å erstatte nukleotidsekvensen som kode for Gla-domenen i human protein C med nukleotidsekvensen som kode for Gla-domenen 1 bovin protein C. Preprosekvensen i human protein C kan bli ytterligere erstattet med preprosekvensen i bovinprotein C. Preprosekvensen kan også bli erstattet med preprosekvensen til vitamin K-avhengig blodkoaguleringsproteiner, slik som faktor X.

Genene som blir konstruert ved de ovenfor nevnte metodene kan bli uttrykt i hensiktsmessige vertsceller som blir transformert ved hensiktsmessig ekspresjonsvektorer konstsruert ved ligering av den proteinkodende sekvensen med en promoter, en terminator, etc, med vanlige anvendte metoder i dette feltet. Foretrukne verter er eukaryotiske celler som kan modifisere de rekombinante proteinene på etter-translasjons-måter, f.eks. glykosylering,"y-karboksylering eller g-hydroksylering.

Eksempler på vertceller som er gunstig for fremstilling er dyrecceller slik som CHO eller BHK-celler. Konstrueringen av rekombinante gener, den ytterligere ligeringen av funksjo-nelle områder som er nødvendig for effektiv ekspresjon, overføring til vertceller, ekspresjon av rekombinante produkter i vertceller og isolering av rekombinante produkter, etc. kan bli gjennomført ved en hvilken som helst metode som vanligvis er tilgjengelig i dette feltet.

Hybridproteiner fra foreliggende oppfinnelse har et øket antall av glutaminresidier (fra 9 til 11) ved å endre Gla-domenen fra den humane typen til den bovine typen. Gjennom økningen i antallet •y-karboksyleringsseter, er de forbedrede effektene oppnådd.

Oppfinnelsen blir forklart med de følgende eksempler. I eksemplene ble genet anvendt som var konstsruert ved å erstattet Gla-domenen i preprosekvensen i human protein C med Gla-domenen i bovin protein C og preprosekvensen i human faktor X. DNA-sekvensen som koder faktor X er beskrevet i Blochemlstrv. 25, 5098 (1986).

I de følgende eksemplene ble genet som koder for human protein C beskrevet i japansk patentsøknad nr. 96341/87

(offentliggjort, ikke-gransket publikasjon nr. 263083/88)

anvendt, så vel som ekspresjonsvektoren, inkludert det ovenfor nevnte genet, og den nye fremstillingsprosessen gjennom gen-engineering-teknikker beskrevet i japansk patentsøknad nr. 93340/87 (offentliggjort, ikke-gransket publikasjon nr. 267288/88). Disse metodene blir forklart som referanseeksempler. Eksemplene og referanseeksemplene begrenser derimot ikke oppfinnelsen.

Referanseeksempel 1 ( konstruksjon av pCs4)

Plasmid pPCl som inkluderer genet som kode for protein C ble konstruert av forfatterne et al. beskrevet i japansk offentliggjort, ikke-gransket patentpublikasjon nr. 263083/- 88. Plasmidet ble transformert inn i E. coli K-12/0m225 som var deponert i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology som FERM BP-1858.

Videre ble en ekspresjonsvektor pCsl konstsruert fra genet som koder for human protein C og SV40 tidlig promoter. Plasmidet ble transformert inn i E. coli K-12/0m225 som var deponert i Fermentation Research Institute som FERM BP-1473. Restriksjonskartet er vist i fig. 2.

pCs4 ble konstruert fra pCsl som beskrevet i japansk offentliggjort, ikke-undersøkt . patentpublikasjon nr. 267288/88. pCs4 har 2 BstXI-seter oppstrøms fra SV40 tidlig promoter og nedstrøms fra poly A signalet. BstXI-setet er antatt å produsere følgende asymmetriske kohesive ender ved spalting med BstXI.

Fragmentene knytter seg til hverandre nødvendigvis i tandem. Dette gjør det mulig å fremstille DNA som består av mange tandem-gjentagelser av ekspresjonsenheten til protein C (en promoter pluss et protein C gen pluss et poly A-signal). Protein C blir fremstilt med høy effektivitet ved kultivering av vertdyreceller overført med den DNA-en som består av mange tandemgjentagelser.

Produksjonsprosessen for pCs4 er som følger; det oppnådde fragment ved spalting av pCsl med EcoRI ble ligert med det dobbelt-trådede oligonukleotidet som var syntetisert kjemisk som nevnt under.

der P representerer .fosfatgruppen koblet i 5'-ende for ligering, □ indikerer BstXI-gjenkjenningssete, og Tindikerer kløyvingssete ved nevnte enzym.

Den venstre siden ti oligonukleotidet blir arrangert slik at den er en 5'-fremstikkende sekvens som kan bli ligert til den kohesive enden til EcoRI-kløyvet pCsl, som ikke refenererer EcoRI-setet. Dette arrangementet er laget slik at EcoRI-setet produsert i det etterfølgende trinnet vil være et entydig sete. Den høyre siden er den delen som skal bli knyttet til den Xhol-kohesive enden.

Ligeringsproduktet ble spaltet med Xhol etterfulgt igjen ved ligering. Begge endene til pCsl kløyvet med EcoRI ble knyttet til et molekyl av syntetisk oligonukleotid. Begge endene av produktet var utsatt for ligering (der Xhol-setet blir dannet) for å danne et sirkulært plasmid.

Deretter ble det resulterende plasmidet delvis spaltet med PvuII. Ved at det var to PvuII-seter i pCsl, fant kløyvingen sted på begge, enten det ene eller ingen av setene og ga en blanding. Således ble blandingen utsatt for størrelsesfrak-sjonering ved hjelp av agarosegelelektroforese for å Isolere produktet der PvuII-setet lokalisert oppstrøms fra SV40 tidlig promoter bare hadde blitt kløyvet. Den isolerte DNA-kjedet ble ligert med et kjemisk syntetisert dobbelt-trådet oligonukleotid med den kjemiske strukturen vist under.

der symbolene er definert som ovenfor, og den høyre side er delen som skal bli knyttet med den seksjonen som er kløyvet av EcoRI.

Den venstre siden av oligonukleotidet ble knyttet til PvuII-setet av det kløuvede plasmid DNA, som ikke refenererte PvuII-setet. Ligeringsproduktet ble spaltet med EcoRI etterfulgt igjen av ligering. Begge endene til PvuII-kløyvd plasmid DNA ble henholdsvis knyttet med et molekyl av det syntetiske oligonukleotid. Begge endene til produktet ble utsatt for ligering (der et EcoRI-sete er lokalisert) for å danne et sirkulært plasmid. Det resulterende plasmid ble kløyvet med Xhol og EcoRI, og fragmentet ble klonet inn i pHSG396 som har en kloramfenikolresistensmarkør (tilgjengelig fra Takara Shuzo Co., Ltd.) kløyvet med Xhol og EcoRI. Kloramfenikol-resistant protein C ekspresjonsvektorplasmidet oppnådd på den måten fikk navnet pCs4.

Eksempel 1

Syntese av et DNA- fragment som kode for en amlnosyresekvens som Inkluderer Gla- domenen 1 bovin protein C og preprosekvensen og human faktor X

Et DNA-fragment, sekvensen er vist i tabell 2, ble syntetisert for å ha et Sall-sete til forenkling av ligering og et EcoRI-sete og å dekke (a) 40 aminosyreresidiene til preprosekvensen i faktor X, (b) de 1. til 43. aminosyreresidiene fra N-terminalen i bovin protein C etterfulgt av preprosekvensen, og (c) nukleotidsekvensen som kode for den 44. til 46. aminosyreresidien i humant protein C. Adeninet rett før start ATG ble valgt for å forvente en fordelaktig effekt på ekspresjon av hybridproteiner. Og nukleotidsekvensen som kode for den 44. til 46. aminosyreresidiet i protein C ble introdusert for å skape et nytt Sall-sete for å ligere DNA-fragmentet med det humane protein C-genet.

Åtte oligonukleotider for å gi fire DNA-fragmenter separert med Hindlll, Xbal og Bglll, vist i tabell 2, ble syntetisert med en DNA-syntetiserer, modell 380 A (Applied Biosystem Co., USA). Etter sammenkobling ble 4 dobbelt-trådede fragmenter ligert ved T4-DNA-ligase, henholdsvis ved Hindlll-, Xbal- og BglII-setene. Det ligerte DNA-fragmentet flankert av Sall-setene ble innført inn i pUC18, kommersielt tilgjengelig fra Takara Shuzo Co., Ltd., og amplifisert I E. coli K-12/HB101. Den amplifiserte vektoren ble spaltet med Sali og det syntetiske DNA-fragmentet ble oppnådd med ordinære rensnings-metoder.

Eksempel 2

Konstruering av ekspresjonsvektorer for hybridproteiner Genkoding for deler av protein C kan bli fjernet fra pCs4 med Sall-spalting i Sall-setet rett oppstrøms for ledersekvens-kodesekvens og i Sall-setet som korresponderer til det 45. vallnresidiet og 46. asparaginsyreresidiet til protein C. Det syntetiske DNA-fragmentet syntetisert i eksempel 1 ble innført inn i pCs4 mellom disse Sall-setene, og introdusert inn i E. coli K-12/HB101. Transformantene som innehar en plasmid i en passende orientering, kalt pCs8, ble screenet og kultivert. pCs8 hadde nukleotidsekvensen som vist i tabell 3, til hybridproteinet. Dens restriksjonskart er vist i fig. 1.

Referanseeksempel 2 ( konstruering avPHSG293)

pHSG293 ble også konstruert som hadde et neo-gen som en seleksjonsmarkør og BstXI-sete som tilveiebrakte de samme asymmetriske kohesive endene som pCs8 ved spalting som beskrevet i japansk offentlig, ikke-gransket patentpublikasjon nr. 267288/88. Fragmentet oppnådd ved spalting av pESG293 med BstXI ble ligert med fragmentet oppnådd ved spalting av pCs8 slik at seleksjon av transf ektanter var mulig. En fremstillingsprosess er som følger: når pHSG274 deponert som ATCC 37301, en kosmidvektor med neo-genet som tildeler kanamycin-resistens til E. coli-verten og G418 (geneticin) resistens i eukaryote celler, ble spaltet med BstXI, fant kløyvingen sted som vist i det følgende flyt-skj emaet.

Det spaltede fragmentet ble deretter ligert med det synteti-serte oligomikletidet som vist i flytskjemaet og BstXI-setet ble ødelagt. Etterfølgende spalting av kløyvingsproduktet med Hindlll resulterte i fjerning av Hindlll-BstXI-delen som var inneholdt i cosmidvektoren og den store mengden syntetiske fragmenter som gjentagende blir ligert. Det resulterende produkt var utsatt for ligering for å tilveiebringe et sirkulært plasmid der venstre side av det syntetiske oligonukleotid ble knyttet til Hindlll-setet i cosmidvektoren.

Xbal-setet i den syntetiske oligonukleotidsekvensen ble introdusert for å adskulle pHSG274 og pHSG293 fra hverandre. Lac-operatoren i det syntetiske oligonukleotidet ble introdusert for å velge ut transformanter med kanamycin-resistens etter cosmid-pakking og for å adskille transformanter som danner blå kolonier i nærvær av X-gal.

Plasmidet fikk navnet pHSG293. Dets restriksjonskart er vist i fig. 3.

I det følgende eksempel ble de konstruerte genenhetene avledet fra pCs8 for ekspresjon av hybridprotein og neo-genet fjernet fra pHSG293 og multiply-tilknyttet til den samme orienteringen ved å anvende ensrettede kohesive ender av BstXI.

Deretter ble disse multipleknyttede genene In vitro-pakket i fagpartikler og overført inn i E. coli-celler. Transfektantene ble screenet for å oppnå kloner som innehar ønsket rekombinant cosmid-DNA gjennom kanamycinresistens avledet fra neo-genet. Deretter ble rekombinant-cosmid-DNA oppnådd ved den ovenfor nevnte metoden introdusert inn i CHO-celler med en standard metode som er tilgjengelig i dette feltet. Igjen ble G418-resistente CHO-celler avledet fra neo-genet screenet, og dette produserte effektivt de ønskede hybridproteiner .

Eksempel 3

Fremstilling av hydrldprotelner 1 dvreceller og bekreftelse på deres protein C- aktivlteter

Etter spalting av pCs8ffremstilt i eksempel 2, med BstXI, ble et 2,0 Kbp DNA-fragment isolert ved agarosegelelektroforese. Dette 2,0 Kbp DNA og BstXI-spaltede pHSG293 ble ligert i et molart forhold på henholdsvis 20 og 1. Dette ligerte DNA ble pakket in vitro av lamdafag-pakkeblanding kommersielt tilgjengelig fra Takara Shuzo Co., Ltd. Deretter ble pakkede rekombinante lamdagenomer overført Inn i E. coli K-12/Om206, deponert som FERM BP-1472 i Fermentation Research Institute. Transfektantene ble dyrket under betingelser som selekterte kanamycinresistens. Koloniene som innehadde høyt kopitall av gener som kode for et hybridprotein ble valgt og dyrket for å isolere sirkulære cosmid-DNA.

Disse sirkulære cosmid-DNAene ble innført inn i CHO-celler med kalsiumfosfatmetoden. Deretter ble G418-resistente transfektanter avledet fra pHSG293 screenet og dyrket i MEMcx-medium, kommersielt tilgjengelig fra Gibco Laboratories Inc., inkludert 10$ FCS, forhandlet fra Gibco Laboratories Inc., og 0,1 jjg/ml vitamin K3. Ca. 1 x 10^ transf ektanter ble sådd ut på en 6 cm-0 petriskål og dyrket ved 37"C over natten. Etter å ha byttet medium 25 ganger med friskt medium i løpet av natten, ble cellene ytterligere dyrket i minst 24 timer. Etter å ha oppsamlet dyrkningssupernatanten, ble mengden av hybrid protein C i mediet analysert med ELISA ved å anvende en anti-human protein C antistoffremstilling.

Som følge av dette ble 2 av 24 kloner bekreftet å fremstille 432 ng/ml eller 274 ng/ml av immunoreaktivt hybrid protein C i mediet. Den beste kolonien ble ytterligere dyrket i større skala.

Eksempel 4

Rensing av et hybrid protein C

Hybridproteinet C ble renset fra 236 ml av dyrkningssupernatanten med høyt produserende celler oppnådd i eksempel 3.

Til supernatanten ble en tredjedels volum av kald sekundært destillert vann og en tyvendedels volum av IM imidazol-HCl-bufferoppløsning (pH 6,5) tilsatt. Blandingen ble applisert på en QAE-Sepharose hurtigstrømskolonne (ca. 10 ml volum), innkjøpt hos Pharmacia Co. Kolonnen ble vasket med. 0,11 M NaCl, 50 mM imidazol-ECl-bufferoppløsning (pH 6,5) inntil det ikke var noe protein som ble påvist i eluatet. Bundet hybridprotein C ble deretter eluert med 0,5 M NaCl, 50 mM imidazol-HCl-bufferoppløsning (pH 6,5). CaCl2ble tilsatt til eluatet til en sluttkonsentrasjon på 5 mM. Igjen ble eluatet applisert på en kalslum-avhenglg anti-human protein C antistoffkolonne, fremstilt fra en aktivert CH-Sepharose CL-4B, kjøpt fra Pharmacia Co. Det bundne hybridprotein C ble eluert med TBS-bufferoppløsning (0,15 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,2) inkludert 5 mM EDTA. Til slutt ble 134 pg av renset hybridprotein C oppnådd.

Eksempel 5

Aktivitet til renset hybridprotein C

Den kromogene aktiviteten til det rensede hybridprotein C oppnådd i eksempel 4 ble bestemt. 40 pl av eluatet (protein-konsentrasjon: 23 pg/ml) og 40 pl av reaksjonsbufferopp-løsning (2,5 pg/ml BSAA, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) ble blandet med 20 pl av Protac (lU/ml, kjøpt fra Pentafarm Co., Sveits) og inkubert i 10 min ved 37°C.

Kromozym PCa, et syntetisk substrat kjøpt fra Boehringer-Mannheim-Yamanouchi Co., ble tilsatt til reaksjonsblandingen og volumet av oppløsningen ble justert til 500 pl. Blandingen ble videre inkubert i 5 min ved 37"C. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 400 pl 50$ acetat og mengden av reaksjons-produkt ble bestemt ved absorbans av oppløsningen ved 405 nm. Når man sammenligner med renset protein C avledet fra humant blod, var den kromogene aktiviteten til hybridprotein C 172$.

Forklaring på tabeller

Tabell 1 viser rekken av aminosyresekvensen nær aminoterminalen til bovint protein C og human protein C.

Tabell 2 viser nikleotidsekvensen til syntetisk DNA som kode for aminosyresekvensen som inkluderer preprosekvensen til human faktor X og Gla-domenen til bovint protein C.

Tabell 3 viser nikleotidsekvensen som kode for hybridprotein C konstruert ved å erstatte Gla-domenen og preprosekvensen til human protein C med Gla-domenen til bovint protein C og preprosekvensen til human faktor X, henholdsvis, og aminosyresekvensen til hybridprotein C.

Kort beskrivelse av tegningene:

Fig. 1 er et restriksjonskart av pCs8. Fig. 2 er et restriksjonskart av pCsl. Fig. 3 er et restriksjonskart av pHSG293.

Claims (9)

1. Derivat av humant protein C, karakterisert ved at det i sitt aminoterminale område som har 7-karboksylerte glutaminsyreresidler (Gla-domenet) blir erstattet med Gla-domenen til bovinprotein C eller med en ekvivalent til denne bovine proteinsekvensen med hensyn på dens kalsiumbindende aktivitet og/eller dens økede protein C aktivitet.

2. Protein Ifølge krav 1, karakterisert ved at dets første 43 aminosyrer er de til bovint protein C.

3. DNA, karakterisert ved at det koder for et protein ifølge krav 1 eller 2.

4 . Genstruktur, karakterisert ved at den inneholder en DNA ifølge krav 3.

5 . Vertcelle, karakterisert ved at den inneholder en genstruktur ifølge krav 4.

6. Fremgangsmåte for å fremstille et protein ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved ekspresjon i en vertcelle av en genstruktur ifølge krav 4.

7. Medikament, karakterisert ved at det omfatter et protein ifølge krav 1 eller 2.

8. Protein ifølge krav 1 eller 2 eller et protein som er oppnåelig i en fremgangsmåte ifølge krav 6 for anvendelse i terapi.

9. Anvendelse av et protein ifølge krav 1 eller 2 for fremstilling av et medikament for behandling av blodkoagulerings-sykdommer.