JPH02167096A - ヒトプロテインｃ変異体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血液凝固防止作用を有する新規な一本鎖のプ
ロティンＣ変異体に関する。

技術的背景 ヒトプロティンＣはヒト血漿中に存在するセリンプロテ
アーゼ前駆体である。

プロティンＣはトロンボモジュリンに結合したトロンビ
ンにより限定分解をうけ、活性型ブロティンＣとなり、
血液凝固系の第■ａ囚子及び第Ｖａ囚子をカルシウムイ
オンの存在下に失活させ血液凝固を阻害しまたテイッシ
ュプラスミノゲンアクティベーターインヒビター（以下
、ＦＡＩ）を阻害しその結果、線溶系を昂進することが
知られている。ヒトプロティンＣをコードするｃＤＮＡ
の塩基配列は１９８５年にＦＱＳｔＯｒらによって決定
され、報告されているＣＤ、　Ｃ，Ｐｏ５ｔｅｒ　ａｔ
ａｌ、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ
、　ＵＳＡ　８２．４８７３−４８７７（１９８５））
。

ヒトプロティンＣはアミノ末端から６．　７．１４゜１
Ｂ、　　１９．２０．２５．２８及び２９位にグルタミ
ン酸残基を白°する。これらは翻訳後ビタミンに依存性
の修飾によって、そのガンマ位の炭素がカルボキシル化
される。そのγ−力ルボキシグルタミン酸を含む領域（
以下本明細書で「グラドメインｊと称する）は、主とし
て、カルシウムイオン（Ｃａ＋＋）を介して、細胞膜上
の負に荷電したリン脂質と複合体を形成する際に働くと
されている。このグラドメインの働きについては文献「
代謝」第１９巻。

第９号（１９８２）に詳しい総説が述べられている。

本発明の課題 本発明の課題は、ヒトプロティンＣのアミノ酸配列の一
部を変異させトロンビン／トロンボモジュリンによる活
性化を遅らせひいてはその活性持続時間を遅効させるこ
とのできる新しいプロティンＣ変異体を提供することで
ある。

発明の背景及び構成 血液凝固の過程は、最終的にはフィブリン凝塊の形成に
至るまでの種々の血液成分、組織因子の複雑な連鎖相互
反応から構成される。一般に、血液凝固においては血液
中に存在する不活型の前駆体蛋白質即ちザイモゲンがそ
れ自体能の活性化血液凝固因子によって活性化を受は次
のザイモゲンを活性化するという一連のカスケードを経
て最終的にフィブリノゲンがフィブリンに変化しフィブ
リンによる血液凝塊が形成される。

フィブリン凝塊が形成される最終段階では、補助因子で
ある活性型Ｖａ因子存在下で、プロトロンビンが一種の
蛋白質分解酵素である活性型Ｘａ内因子よってトロンビ
ンへと活性化され、これがさらにフィブリノゲンをフィ
ブリンに変えるとともに、正のフィードバックとして不
活性型■因子と不活性型Ｖ因子を活性化して凝固反応を
加速させる。しかし一方で、負のフィードバックとして
も作用し、不活性型プロティンＣを活性型プロティンＣ
に変え、このものは更に活性型Ｖａ。

１３両因子を分解不活化し抗凝固因子として働く（Ｗ、
　Ｋ１５ｌｅｌ　ｅｔ　ａｔ、　１３ｉｏｅｈｅｍ、、
　１６．５８２４−５８３１゜（１９７７）　、　Ｒ，
＾、Ｍａｒｌａｒ、　Ａ、　Ｊ、　Ｋｌｅｉｓｓ　ａｎ
ｄＪ、　Ｉｆ、　ＧｒｌｆＴｌｎ、　Ｂｌｏｏｄ　　５
９．１ＯＧ７−１０７２　、（１９８２））。

さらに活性型プロティンＣはＦＡＩを不活化しプラスミ
ノゲンからのプラスミンの生成を結果的に促すことによ
り、ひいてはプラスミンによるフィブリンの凝塊の分解
を促進して抗凝固的のみならず線溶的にも働＜　　（Ｙ
、　５ａｋａｔａ　ａｔ　ａｔ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　８２
．１１２１−１１２５゜（１９８５））。

このプロティンＣの活性化は、プロティンＣがトロンビ
ン及び内皮細胞表面のトロンボモジュリンと結合すると
著しく促進される（Ｃ，Ｔ、　Ｅｓｍｏｎａｎｄ　Ｗ、
　Ｇ、　０ｖｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７８、２２４９〜２２５２　（
１９８１））。プロティンＣの血中濃度が低レベルであ
る患者は、血栓症を起こしやすい（Ｊ、　Ｈ，Ｇｒｌｒ
ｒｌｎ　ｅＬ　ａｔ、　Ｊ、　ＣｌＩｎ、　Ｉｎｖｅｓ
ｔ、　８８゜１３７（１−１３７３（１９８１）　；　
Ｊ、　Ｈ，Ｇｒｌｒｒｊｎ　ｅＬ　ａｔ。

Ｂｌｏｏｄ　８０．２６１−２８４　（１９ｇ２）　；
　Ｐ、　Ｃ，Ｃｏｌ１ｐ　ｅＬ　ａｔ。

Ｊ、　ＣｌＩｎ、　ＩｎｖｅｓＬ、　　７４．２０８２
−２０８８．　（１９８４））。

プロティンＣを完全に欠損するホモ型患者の場合、新生
児期に重篤な胎児性血栓症を発症することがある（Ｕ、
　Ｓｅｌｌｎｇｓｏｈｎ　ｅｔ　ａｔ、　Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１０．５５９−５６２　（１９８
４））。

プロティンＣは、２３％の糖を含有する、分子量６２に
ダルトンの、ビタミンに依存性の修飾、即ちアミノ末端
領域にあるグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化をう
ける抗血液凝固因子であり（讐、　Ｋ１５ｉｃ１．　Ｊ
、　ＣｌＩｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　０４．７８１−７ｔ
３９゜（１９７９））　、一種のセリンプロテアーゼの
前駆体蛋白質として血漿中に３〜４■／　ｍｌの濃度で
存在する。通常分子！４１にダルトンのＨ−鎖と分子量
２１にダルトンのＬ−鎖が一本のジスルフィド結合で架
橋された状態で存在するが、約１０％はＨ−鎖とＬ−鎖
が分離せずペプチド結合でつながった状態でも存在する
ことが知られている（Ｅ、　Ｋ１５ｌｃｌ。

Ｊ、　ＣｌＩｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　　８４．７８１−
７６９　（１９７９））　、　Ｌ　−鎖はヒトの場合、
９個のγ−力ルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基と１
個のβ−ヒドロキシアスパラギン酸（ＨＯ−Ａｓｐ）残
基を含有する。この９個のＧｌａ残基を有する部分は同
蛋白質のアミノ末端に局在し、′グラドメイン領域と呼
ばれ、同蛋白質の活性化及び活性それ自身に必要である
。

ヒトプロティンＣの全アミノ酸配列はそのｃＤＮＡ及び
ゲノムＤＮＡの配列よりすでに知られており本発明者達
もすでにヒトプロティンＣをコードする遺伝子のＤＮＡ
配列をその発現のために種々のプロモーターに接続し動
物細胞において生産することに成功し、これを特願昭０
２−９０３４１号として特許出願している。遺伝子のコ
ードするアミノ酸配列によれば、プレプロプロティンＣ
は４２個のアミノ酸残基からなるプレプロリーダー配列
、　１５５門のアミノ酸残基からなるＬ−鎖、Ｌｙｓ−
Ａｒｇからなる接続ジペプチド（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ
ｄ　Ｉ　ｐｅｐ［１ｄｅ）、さらに活性化において除去
される１２個のアミノ酸残基、そして最後に２５０個の
アミノ、酸残基からなるＨ−鎖からなることが知られる
。

このプレプロプロティンＣは、遺伝子より翻訳生産後、
まず−１０位のＡｌａ後方で開裂され塩基性の極めて高
い９個のアミノ酸残基よりなるプロペプチドを有するザ
イモゲンの状態となる。細胞中に分泌されるときさらに
一１位のＡｒｇの後方で開裂をうけアミノ末端がＡｌａ
−Ａｓｎ−５ｅｔ−となる。

血液中を循環するときは、さらに＋１５Ｇ位のＬｙｓと
＋１５７位のＡｒｇからなる接続ペプチドがある種のプ
ロテアーゼによって除去され、最終的にトロンビンとト
ロンボモジュリンによって１８９位のＡｒｇの後方で開
裂を受は活性型プロティンＣとなる。しかし、生体内で
は一本鎖型前駆体から二本鎖型への移行は何等かの理由
で不完全でありマイナー成分として、ヒトの場合、約５
〜１５％のプロティンＣは一本鎖型として存在する（Ｊ
、　Ｐ。

Ｍｉｌｅｔｌｅｈ、ｅｔ　　ａｔ、Ｂｌｏｏｄ、８２，
５ｕｐｐ１．ｌ、３０Ｂａ（１９８３））。これが、単
に不完全なプロセッシングの結果なのか、血液凝固線溶
機構の調節に何等かの特別な役割を果たしているのか詳
細な解析はまだなされていない。しかし我々は、−水路
型プロチインＣは二本鎖型プロティンＣよりも活性化を
受ける速度が遅く、従ってその効果が遅効的で延長する
可能性に看目し本発明を完成した。

本発明のヒトプロティンＣ変異体は、天然のヒトプロテ
ィンＣの１５６及び１５７番目のアミノ酸配列Ｌｙｅ−
Ａｒｇと異なるアミノ酸配列を有することを特徴として
いる。すなわち、該配列の一方又は両方のアミノ酸残基
が欠失しているもの、該配列の一方又は両方のアミノ酸
残基が他のアミノ酸残基で置換されているもの及び該配
列の一方のアミノ酸残基が欠失し他方が他のアミノ酸残
基で置換されているものである。このアミノ酸配列の一
方又は両方のアミノ酸残基を他のアミノ酸で置換するに
当っては、リジン、アルギニン以外のアミノ酸で置換す
ることが望ましいい。１個のアミノ酸残基を他の１個の
アミノ酸残基で置換することが望ましいが、２個又はそ
れ以上のアミノ酸残基で置換することも可能である。接
続ジペプチドＬｙｓ−Ａｒｇを置換するアミノ酸として
は、リジン及びアルギニン以外のあらゆるアミノ酸を用
いることができるが、リジン及びアルギニンにできるだ
け類似のアミノ酸を用いることが望ましいと考えられる
。水溶性及び酸゛−塩基性の点を考慮すると、セリン、
アスパラギン、グルタミン等を用いることが好適である
。Ａｓｎ−Ｓｅｒ、　　５ｅｒ−Ａｓｎ。

Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、　　５ｃｒ−Ｇｌｎ、　　Ａｓｎ−Ｇ
ｌｎ、　　Ｇｌｎ−ＡＳｎ等でＬｙｓ−Ａｒｇを置換す
ることが適当である。

本発明のプロティンＣ変異体は、それをコードするＤＮ
Ａを用いて遺伝子工学的に製造される。

そのＤＮＡは、既に知られているプロティンＣをコード
するＤＮＡの一部を合成りＮＡ断片で置換して作成する
ことができる。

このようにして得られた遺伝子は、発現のためのプロモ
ーター等を絹み込んで発現ベクターとし常法によって宿
主中で発現させられる。宿主としては、蛋白質のグリコ
ジル化、γ−カルボキシル化あるいはβ−ヒドロキシ化
等の翻訳後修飾が可能である真核細胞を用いることが望
ましい。

発現のための好ましい宿主細胞はＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細
胞のような動物細胞が挙げられる。遺伝子の組み換え、
発現のために必要とされる機能領域の結合、宿主細胞へ
の形質転換、発現、生成物の分離精製方法はいかなる方
法によっても行うことができる。

発明の効果 本発明で得られる一水路型ヒドブロチインＣ変異体は第
Ｖａ因子及び第■ａ因子の失活及びＰＡＩの中和作用を
有し、かっ血液中での活性化が正常の二本鎖型プロティ
ンＣより遅くその効果が遅効的で延長される。

以ドに本発明を実施例によって説明する。本発明の実施
例においては、本発明者等が特願昭８２−９８３４１号
特許出願において作成したヒトプロティンＣをコードす
る遺伝子及び特願昭８２−９（！３４０号特許出願にお
いて作成した該遺伝子を組み込んた発現ベクター並びに
蛋白質の遺伝子工学的な、新しい製造方法を用いた。そ
れらについては、参考例として説明されている。なお以
下の実施例及び参考例は、本発明を限定するものではな
い。

参考例　１　　（ｐｃｓｌの構築） 本発明者等は特願昭８２−９８３４１号においてヒトプ
ロティンＣをコードするｌ１８９ｂｐの遺伝子の両端に
、ＥｅｏＲＩ部位とＳ　ｎａ　Ｔ及びＨＩｎｄＩ［１部
位が付加された遺伝子を得た。

この遺伝子は、Ｆｏｓ　ｔ　ｅ　ｒ等がＰｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｅａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８２．４６７３−４０７７　（１９
８５）において発表したヒトプロティンＣの遺伝子配列
をもとにして、コードされるアミノ酸を変更しない範囲
で塩基配列の一部を変更したものである。

この遺伝子をｐＵＣ９（ファルマシア社等より市販）よ
り本発明者等が改良した、ｐＵ　Ｃ９と１、ｉＪじポリ
リンカ一部位と、Ｐ　ｖｕ　Ｉを消失せしめたアンピシ
リン耐性遺伝子を持つプラスミドベクターの、ＥｃｏＲ
ＩとＨｌｎｄｍの間に組み込んでプラスミドｐＰｃ１を
作成した。このプラスミドは大腸菌Ｋ　１２／　Ｏｓ　
２２５に形質転換し、工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研条寄第１８５８号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１８５
８）として寄託された。

更に特願昭６２−９６３４１号において、このヒトプロ
ティンＣをコードする遺伝子から、発現ベクターｐＣｓ
　１が構築された。すなわち、プラスミドｐＢＲ３２２
の２Ｊ　ＫｂｐのＰｖｕＩｒ　−ＥｃｏＲＩ断片（これ
はアンピシリン耐性遺伝子及び復製開始部位を含む）に
、ＳＶ４０アーリープロモーターを含む断片、遺伝子を
挿入するためのポリリンカー及びＳＶ４０アーリーｍＲ
ＮＡボリアデニレーンヨンサイトを含む断片を結合させ
たプラスミドｐ　Ｓ　ＶＡｓｔｏｐｌをポリリンカー内
にあるＸｂａｌサイトで切断しＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
により’Ｆ？ｆｔ末端とした。次にｐＰｃｌをＥｃｏＲ
Ｉ及び５ＩＩｌａ■で消化し、プロティンＣ遺伝子を含
む１．４　ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動により１１１離晴製しＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより
毛屑末端にした後、先に述べたプラスミドｐＳＶＡ　５
ｔｏｐ　１の平滑末端にＴ４ＤＮＡリガーゼによりライ
ゲートした。

組み換えＤＮＡプラスミドを調べてプロティンＣ遺伝子
がＳＶ４０アーリープロモーターに対して発現可能な方
向に組み込まれたクローンを選択しｐｃｓｌとした。こ
れは大腸菌Ｋ　−１２／　０１１２２５に形質転換し微
生物工業技術研究所に微工研条寄第１４７３号（１’Ｅ
ＲＭ　ＢＰ−１４７３）として寄託されており、その制
限酵素地図は第２図に示されている。

参考例　２　　（ｐＣｓ４の構築） 特願昭８２−９８３４０号においては、このｐＣｓ　１
からｐＣｓ４が構築されている。このｐＣｓ４はＳＶ４
０アーリープロモーターの上流及びポリＡシグナルの下
流にＢ　５ＬＸＩサイトが導入されている。

このＢ　５ｔＸＩサイトは、ＢｓｔＸＩで切断されて、
その両端に なる非対称的な粘着性末端を生ずるよう工夫されている
。そして、このような末端を有する遺伝子を結合させる
ときは必ず同じ方向に結合する。この性質を利用し、プ
ロティンＣの発現に必要な単位（プロモーター＋プロテ
ィンＣ遺伝子士ポリＡシグナル）を多数個同一方向に結
合させたうえ動物細胞に導入して発現させることによっ
てプロティンＣを高収率で生産することができる。

ｐＣｓ４の製法を以下に略述する。

ｐｃｓｌをＥｃｏＲＩで消化した断片に、化学的に合成
された下記の二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲートし
た。

〔ｐはライゲーションのために５′末端に結合したリン
酸基、口はＢ　５ＬＸＩの認識部位、↓は同酵素の切断
部位を示す。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたｐｃｓｌのＥ
ｃｏＲＩによる切断面と結合するが、ＥｅｏＲＩサイト
が再生しない塩基配列としである。

これは次の工程で生ずるＥｅｏＲＩサイトがユニフサイ
トとなるようにするためである。右側はＸｈｏｌによる
断面と結合する部分である。

ライゲーション産物をＸｈｏｌで消化した後再びライゲ
ートした。ＥｃｏＲＩで切断されたｐＣｓ　１の両端に
各１個の合成オリゴヌクレオチドが結合し、その両端で
ライゲートされて（この際Ｘｈｏｌサイトが生成する）
環状のプラスミドとなる。

つぎに、生じたプラスミドをＰｖｕＩＩで部分消化する
。ｐＣｓ　ｌ中には２つのＰｖｕＩＩサイトがあるので
、両方で切断されたもの、どちらか一方において切断さ
れたもの、及び全く切断されなかったものの混合物が得
られるので、アガロースゲルを用いた電気泳動法により
サイズフラクショネーションして、ＳＶ４０アーリープ
ロモーターの上流に位置するＰｖｕＩＩのみが切断され
たものを単離する。単離されたＤＮＡ鎖に、化学的に合
成された下記の化学構造を有する二本鎖オリゴヌクレオ
チドをライゲートした。

！ ↑ 〔記号は上記に同じ。右側はＥｃｏＲＩによる切断面と
結合する部分である。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたプラスミドＤ
ＮＡ鎖のＰｖｕＩＩサイトと結合し、ＰＶＩＪＩＩサイ
トは再生しない塩基配列としである。

ライゲーション産物をＥｃｏＲＩで消化した後、再びラ
イゲートした。ＰｖｕｌＩで切断されたプラスミドＤＮ
Ａ鎖の両端に各１個の合成オリゴヌクレオチドが結合し
、この両端でライゲートして（このｐ５　Ｅ　ｃｏ　Ｒ
Ｉサイトが生成する）環状のプラスミドとなる。得られ
たプラスミドをＸ　ｈｏ　Ｉ及びＥｃｏＲＩで切断し、
その断片をｌ）ＨＳ　Ｇ　３９Ｇ（宝酒造■から購入。

クロラムフェニコール耐性のマーカーを持つ）をＸｈｏ
ｌ及びＥｃｏＲｌで切断したしのにクローニングする。

このようにして得られたクロラムフェニコール耐性のプ
ロティンＣ発現ベクタープラスミドをｐＣｓ４と命名し
た。その制限酵素地図は、第１図のｐｃｓｌＯと実質上
同一である。

実施例　１（ｐｃｓｌＯの構築） ヒトプロティンＣの１５６番目のリジンと１５７番目の
アルギニンは、ｐｃｓｌ及びｐＣｓ４のプロティンＣ遺
伝子の後方のＢｇｌＩＩサイトと５ａｃＩＩサイトの間
に位置している。そのＬｙｓ−ＡｒｇをＡ　ｓｎ　−Ｓ
　ｅｒに置換するため、５′−末端がＢｇｌＩ［制限酵
素粘着末端、３′−末端が５ａｃｌｌ制限酵素粘着末端
である次の合成りＮＡ断ハを作成した。

〔下線の部分が接続ペプチドＬ　ｙｓ　−Ａ　ｒｇ　（
ＡＡＡＣＧ＾〕に変わって導入されたＡｓｎ−Ｓｅｒ　
（＾ＡＣＴＣＣＩにχ・Ｉ応する。他のアミノ酸配列は
元のものと変イ〕らない。〕 ＰＣＮＳ−α鎖とＰＣＮＳ−β鎖は、アプライドバイオ
システム社製のＤＮＡ合成機で合成した。

ＰＣＮＳ　−ａ鎖とＰＣＮＳ−β鎖を４０ｎＩＩｌｏｌ
ｅずつ凍結乾燥し、１６０μＱのＨ２Ｏに溶かし、おの
おの１８μｌｌをとりｌＯ倍濃度のＰＮＫバッファー　
（５００ｍ　ＭＴｒｉｓ　−Ｃｌ）　、　ｐＨ７，６、
１００ｍＭ　　Ｍｇ　Ｃ１）　２゜１０ｍ　Ｍ　　２−
　ａｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、　２５ｍ　Ｍ　　
Ａ　Ｔ　Ｐ　）２μｇ１続いて２μＱのＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ５ユニットを加え３７℃１時間反応させ
た。両反応液からｌＯμすとり混合し６５℃１０分間放
置後４５分かけて徐々に室温に戻しアニーリングさせた
。

一方ｐＣｓ４をＣ１ａＩ及びＸｂａＩで消化して得られ
た３５６ｂｐの断片（上記のＢｇｌ！Ｉサイト、５ａｃ
ＩＩサイトを含む）をｐＨＳ　０３９Ｂ　（Ｔａｋｅｓ
ｈｌＬａｅｔ　ａｔ、　Ｇｅｎｅ、　　０１．　Ｂ５−
７４　（１９８７））にサブクローニングし、ｐ３９６
ｐｃｃ１−Ｘｂ１５と名付けた。

これをＢｇｌｌ？及び５ａｃｌｌで消化し、上記で合成
したＤＮＡ断片をライゲートした。ついでこのようにし
て得られたプラスミドからＣ１ａｌ−Ｘｂａｌ断片を切
り出し、もとのｐＣｓ４の同断片を置換してプラスミド
ｐｃｓｌＯを作成した。

ｐｃｓｌＯは、接続ジペプチドＬｙｓ−ＡｒｇがＡｓｎ
−５ｅｔに転換したプロティンＣ変異体をコードし発現
するプラスミドである。その制限酵素地図は第１図に示
されている。

ｐｃｓｌＯに含まれている、プロティンＣ変異体をコー
ドするＤＮＡ配列とそのアミノ酸配列は表１に示されて
いる。

参考例　３　　（ｐＨＳ０２９３の構築）特願昭８２−
９６３４０号においては、選択マーカーとしてのネオ遺
伝子を自゛し、ｐＣｓ　１０と同じ非対称性粘着性末端
を生ずるＢ　５ＬＸＩの認識部位を有するｐＨＳ　Ｇ　
２９３が構築されている。これは先に説明したｐＣｓ　
１０より得られるプロティンＣの変異体の発現に必要な
単位と両者の転写方向が同一方向に結合させることによ
って、意図する遺伝子が導入された形質転換株を選択す
ることを可能にするものである。以下にｐＨＳ　Ｇ　２
９３の製法を以下に略述する。

大腸菌の中ではカナマイシン耐性を示し、真核細胞中で
はＧ　４１ｇ（ジエネテイシン）耐性を示すネオ遺伝子
が組み込まれているコスミドベクターであって、ＡＴＣ
Ｃに３７３０１として寄託されているｐＨＳ　Ｇ　２７
４をＢｓｔＸＩで消化すると次のフローシートに示した
ように切断される。

（以下余白） ｐＨ５Ｇ２フ４ ｐＨＳＧ２９３ Ｉ　　ＢｓｔＸＪ ３．６ｋｂ断片 ついで、その切断された断片をフローシートに示した合
成オリゴヌクレオチドとライゲートする。その結果Ｂ　
５ｔＸＩは消滅する。ついでＨｌｎｄＩＩＩで消化する
と、コスミドベクターに含まれているＨｉｎｄ　ｍ　−
ＢｓｔＸ１部分及び反復結合した余分の合成フラグメン
トが除去される。このようにして得られたものをライゲ
ートした。合成オリゴヌクレオチドの左側がコスミドベ
クター中のＨｌｎｄｍで切断された切断面と結合した環
状プラスミドが得られる。

なお、合成オリゴヌクレオチド中のＸｂａｌはｐ　ＨＳ
　Ｇ　２７４とｐ　ＨＳ　Ｇ　２９３を分別するために
導入されたものである。合成オリゴヌクレオチド中の４
７ａｃオペレーターは、ニスミドパッケージング後にカ
ナマイシンによる選択と同時に、Ｘ−ｇａΩ存在下にブ
ルーコロニーとなる形質転換株を識別することを可能と
する。

このプラスミドをｐ　ＨＳ　Ｇ　２９３と命名した。そ
の制限酵素地図は第３図に示されている。

以下の実施例においては、ｐｃｓｌＯより得られるプロ
ティンＣ変異体の発現用遺伝子とｐＨ３Ｇ２９３から得
られるネオ遺伝子とをＢ　５ｔ）Ｇの非対称性の粘着性
末端を利用して同一方向に多数個結合させた。

ついで、この直鎖状の遺伝子を、ファージ粒子でインビ
トロパッケージングし、大腸菌に感染させた。これをネ
オ遺伝子に由来するカナマイシン耐性の選択マーカーを
利用して選択し、得られたコロニーから目的の組み換え
体コスミドＤＮＡをもったものを選択した。このように
して得られた組み換え体コスミドＤＮＡを常法に従って
ＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞に導入し、ネオ遺伝子に由来
する０４１８耐性を利用して選択する。このようにして
得られる上記細胞はその培養プロティンＣ変異体を効率
良く生産した。

実施例　２ 一水路変異型プロチインＣ発現単位断片の試験管内での
タンデム増幅及び大腸菌細胞内での大量調製 実施例１で述べられた、ｐｃｓｌＯＤＮＡをＢ　５ｔＸ
ｌで消化すると、２．２にｂの大きさのＤＮＡ断片と２
．ＩＫｂ大きさのベクタ一部分の断片が生じるので、両
断片を分離精製することは実際上不可能である。そのた
め、ｐＣｓ　ｌ０ＤＮＡを一度ＥｃｏＲＩ制限酵素で消
化開裂し４．３Ｋｂの線状ＤＮＡにした後、このＥｃｏ
ＲＩサイトにＥｃｏＲＩで同様に開裂した約９．ＩＫｂ
のｐＨＳ　Ｇ　１１を挿入した（ｐＨ５ＧｌｌはｐＨ８
Ｇ１の派生体でその単一のＢＳＬＸＩサイトがＤＮＡポ
リメレースで破壊されている。ｐＨＳ　Ｇ　１はｐｓ　
Ｃ１０１の温度感受性変異体でＴ、　ｔｌａｓｈｌｍｏ
ｔｏ−ＧｏＬｏｌ＋　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓｅｋｌｇｕｃｈ
ｌ。

Ｊ、　ＢａｅＬｅｒｌｏｌｏｇｙ、　　Ｈｌ、　４０５
−４１２．　（１９７７）に記載されている。）。この
結果できたプラスミドは３．４Ｋｂのサイズでｌ＋、２
Ｋｂのベクター断片と２．２ＫｂのプロティンＣの発現
断片を含み、前者のＤＮＡ断片はρＣｓ１Ｏ由来のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子とｐＨＳ　Ｇ　１１由来の
テトラサイクリン耐性遺伝子をコードする。これを、ｐ
Ｃｓ　１１と名付けた。ｐＣｓｌｌ　Ｄ　Ｎ　ＡをＢ　
５ｔＸＩ消化し０．７％アガロースゲル電気泳動で分離
し、目的とする２、２にｂ断片を切り出し精製した。こ
のＤＮＡ断片２．０μｇを、同じ＜ＢｓｔＸＩ消化しカ
ーフインチスティンアルカリフォスファターゼ（ｃａＨ
Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｌｋａｌｌｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａ
ｔａｓｅ）処理した０、１■のｐＨＳ　Ｇ　２９３コス
ミドＤＮＡ断片と混合し５ユニツトの７４ＤＮＡリガー
ゼを含む！ＯμＱの反応溶液中で１２℃にて一夜連結反
応を行った。

このようにしてできたライゲーションプロダクツ５μＱ
をとり、Ｓｔｒａｔｃｇｃｎａ社製のインビトロパッケ
ージングキツトを用いてラムダファージ粒子の中にパッ
ケージした。反応は、同社のマニュアルにある指示に従
って行った。このファージ粒子を大腸菌に一１２株のＤ
Ｈ−１細胞に感染させ、２５４／ｍｌのカナマイシンを
含む寒天培地上で成育させた。生じたコロニーをカナマ
イシンを含む１００　ｍｌ液体培地にうつし一夜３７℃
で更に成育させ菌細胞を回収しプラスミドＤＮＡを標準
的な方法で大量精製し約１０４の環状ＤＮＡを得た。こ
の環状ＤＮＡは分子の大きさが約４５ＫｂありこれをＢ
　５ｔ）Ｑで消化しアガロースゲル電気泳動上で発現断
１゛１とコスミノド断ｌｔに分離しそれぞれのＤＮＡ断
ｊ１の大きさとバンドの濃さの比から計算して８コピー
の発現断片が含まれていたものを選びｐｃ　Ｎ　Ｓ　７
０１　と名付けた。ｐｃ　Ｎ　Ｓ　７０１は一本鎖変異
型のプロティンＣを動物細胞で発現する遺伝子のほかに
コスミドベクターｐＨＳ　Ｇ　２９３由来の抗生物質Ｇ
４１８耐性の遺伝子を何する。

実施例　３ 疫異体蛋白質の動物細胞における生産とそのプロティン
Ｃ様ｌ＾性の確認 試験管内でタンデム増幅された遺伝子発現単位断片ＤＮ
Ａを分子あたり８コピー含むｐＣＮ　Ｓ　７０１コスミ
ドＤＮＡを新生仔ハムスター腎細胞（−ＢＨＫ）及びチ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ｄｈｒｒ−）
へ以ドのように導入した。即ち、上記細胞ｌＸｌ０６個
を１００關の直径の組織培養皿（ファルコン社製、　３
００１）にＢＨＫ細胞の場合はダルベツコ−修正培養液
（ＤＭＥＳ１０％非働化処理牛脂児血清及び４０ｘ／ｍ
ｌプロリンを含ｆｒ）またはＣＨＯ細胞の場合はヌクレ
オシド類を含む最少必須培養液（ＭＥＭ＋α、１０％非
働化処理牛脂児血清を含有）８ｍｌ中において、３７℃
、５％ＣＯ２／９５％空気の気相下において２０時間程
加温し、２０％程度のコンフルエンス密度となるまで増
殖させた。この培養皿１枚分を形質転換するため、７■
のｐｃ　Ｎ　Ｓ　７０１を９００μｌ！の１４０ｍ　Ｍ
ＮａＣｌ、０．７５ｍＭ　　ＮａＨＰＯ４，２５ｍＭＨ
Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（ｐ）１７．１）に溶かし、６０μρ
の２ＭＣａ　Ｃｆｌ　２を加え撹拌し室温に３０分間放
置した。

これを、９８０μｐ取り、直接上記培養皿内の培養液中
に滴下し３７℃、２４時間加ｌ！！シてＤＮＡを細胞内
に導入した。次に、培養液を新鮮な培養液８ｍｌと交換
し更に１８時間培養した。導入後月４２時間後に細胞を
トリプシン／ＥＤＴＡ処理によって回収し、これを１０
枚の培養皿に均等に分配し４００４／ｍｌのＧ　４１ｇ
（Ｇｌｂｅｏ社製）を含む８ｍｌの同様の培養液中で７
〜１４０間培養した。ここで、ｐｃＮｓ７０１　ＤＮＡ
１ｘあたりＢＨＫ細胞では８５個、ＣＨＯ細胞では５７
個の０４１１１耐性のコロニーを得た。各コロニーは単
離してクローン化した後、ｌＸｌ０６個の細胞を０．１
μｇ／ｍｌのビタミンＫを含む培養液を含む、ＧＯ鰭の
直径の組織培養凹（ファルコン辻製、　３００２）に移
し、２４時間インキュベーンヨシン後細胞がコンフルエ
ントになった時新鮮なＯ９ｌμｇ／ｍｌのビタミンＫを
含む培養液と交換し、史に２４時間培養後培養液上請を
回収し組供え蛋白質の生産量を羊の抗ヒトプロティンＣ
抗体を使ったＥＬＩＳＡ法で以下のように測定した。

アフィニティ精製したヒトプロティンＣに対する羊のポ
リクローナル抗体（５■蛋白質／ｍｌ）を９６穴マイク
ロタイタープレート（Ｐｅｔｒａ　Ｈ製）の３穴に５０
μＱづつ入れ、室温で１時間放置した。次に、Ｐ　Ｂ　
Ｓ　　（ｐｈｏｓｐｌ＋ａＬｅ　ｂｕｆｒｅｒｅｄ　５
ａｌｌｎｓ、　　ｐＨ７，２）中に１％牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を含む２５０μＱの溶液を３穴に加え更に
室温、３０分間放置後、各人の溶液を吸引除去し次いで
ＰＢＳで４回洗浄したのち空気乾燥後４℃に保（ｊした
。この抗体でコートされた上記テストプレートの３穴に
上記上清サンプル液４０μＱを投じ、室温、１時間放置
した。

次いでサンプル液を吸引除去し２００μ０ＰＢＳで４回
洗浄後西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）積置の羊
抗ヒトプロティンＣ抗体４０μｑを３穴に投じ室温１時
間放置した。抗体を除去しＰＢＳで４回洗浄後１　ｍｇ
／　０１１　ｏｒｔｈｏｐｈｃｎｙｌｄｌａ＊Ｉｎｃ（
ＯＰ　Ｄ　）、０．０００％Ｈ２Ｏ２を含む、クエン酸
緩衝ン練５０μＱを３穴に投じ室温１０−１５分間放置
後、赤褐色の生成をＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートリーダー装
置（ダイナチック社製）で測定した。第２表に示された
０　４１８形質転換体のうち約４７％が０．５ｑ／ｍ１
以上のプロティンＣ産生量を示した。特に、ＢＨＫ細胞
由来のＢ〜７クローンとＣＨＯ細胞由来のＣ−’５クロ
ーンではそれぞれ０．７４ｇｇ／ｍｌと０．９４Ｉｚ／
ｍｌの産生を示した。

次に、プロティンＣの生理学的活性を調べるため、ヒト
プロティンＣ抗血液凝固活性定量キット（ベーリングベ
ルケ社製、　　Ｃａｔ、　Ｎａ２５７Ｇ、　２５７７゜
０ＴＸＡＩＩ）を用いて、上記培養液上清のプロティン
Ｃ様活性を調べた。その結果、クローンＢ−７とＣ−５
では、対照に用いたヒト血漿の２．７％及び１１０％の
活性がμられた。

実施例　４ 変異型組換え体ヒトプロティンＣの一本鎖状態の確認 クローンＢ−７とＣ−５の形質転換細胞をＧＯＩＩｍの
直径の組織培養皿（ファルコン社製、　３００２）　１
枚あたり１×１０６細胞となるように播き前記のウシ血
清を含む培養液中でコンフルエント密度になるまで３〜
４日間培養した後、培養皿を血清のない培養液にて２回
洗い、さらに同培養液の中で２４時間培養した。この培
養上清１ｍｌを取り３３３μりの１００％トリクロロ酢
酸を加え撹拌後０℃で３０分間放置しエッペンドルフ巾
上遠心機で室温で１５分間遠心沈澱させる。この沈澱物
を２０μりのサンプルバッフｙ　−（８５ｍＭ　　Ｔｒ
ｌｓ−ＨＣＮ　。

ｐｌｌ６．８　、　３％　ＳＤＳ、１０％　（ｉｌｙｃ
ｅｒｏｌ、　２％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅＬｂａｎｏｌ
　、　０．００４％ｎｒｏ＊ｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ
）に溶かし約１μ９の飽和したトリズマベース液を加え
てｐｌｌを７．０〜７５に調整する。この２０μＱの懸
濁液は０．５〜１■の蛋白質を８１’ｆする。これを１
０％５ＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動にかけ、２５ｍＭ
トリス−１９２ｍＭグリシン（ｐｌｌｌｌ、３）−２０
％エタノール中で電気泳動的にナイロンフィルターに吸
着させ、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　
ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。フィルターは、その後３
％ゼラチンを含む２０ｍＭ　　Ｔｒｌｓ　−ＨＣＪ）　
　（ｐＨ７，５）−５００ｍＭＮａＣｐ中で、室温、６
０分間固定した後、−次抗体としてヤギ抗ヒトプロティ
ンＣ抗体、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）標識したウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体を用いた間
接法により、ヒトプロティンＣを特異的に染色した。

２−　ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌによる還元処理
を施した試料の場合、ヒト血漿由来のプロティンＣでは
、Ｈ−鎖のα鎖、β鎖に対応する分子！４０にダルトン
付近の２本のバンドとＬ−鎖に対応する分子１１２１に
ダルトンのバンドが主に認められ、Ｈ−鎖とＬ−鎖がつ
ながった６２にダルトンの一水路プロチインＣのバンド
は僅かにみとめられるにすぎない。この発明で得られた
、Ｂ−７，Ｃ−’５株では、いずれの場合も、分子Ｅ１
８２にダルトンのバンドのみか認められ、Ｈ−鎖、Ｌ−
鎖に相当するバンドは認められなかった（第４図レーン
１と２参照）。

これらの結果は、血漿由来のヒトプロティンＣ及びＣＨ
Ｏ細胞で生産された組換えヒトプロティンＣではＨ−鎖
とＬ−鎖の接続ペプチドがＬｙｓＡｒｇであるのに対し
、Ｂ　ＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞で生産された該組換え体皮
異型ヒトプロティンＣは接続ペプチドがＡｓｎ−５ｅｒ
に置換されたためプロテアーゼによって消化されな（な
ったと解釈される。

（以下余白） ＡＴＧ、ＴＧＧ。

Ｍｅｔ−Ｔｒｐ− ＣＡＧ、ＣＴＣ，ＡＣＡ、ＡＧＣ，ＣＴＣ，ＣＴＧ、Ｃ
ＴＧ、ＴＴＣ，ＧＴＧ、ＧＣＣ，ＡＣＣ，ＴＧＧ、ＧＧ
Ａ、ＡＴＴ、ＴＣＣ。

Ｇｌｎ・Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−
Ｌｅｕ−ＰｈｅＶａ　Ｉ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌｙ　：Ｉ　Ｉｅ−３ｅｒＧＧＴ、ＡＣＣ，ＣＣＡ、Ｇ
ＣＴ、ＣＣＴ。

Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒ。

ＣＴＴ、ＧＡＣ，ＴＣＡ、ＧＴＧ、ＴＴＣ，ＴＣＣ，Ａ
ＧＣ，ＡＧＣ，ＧＡＧ、ＣＧＴ、Ｃ，ＣＣ。

Ｌｅｕ−Ａｓｐ−９ｅｒ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｓｅ
　ｒ　−５ｅｒ−８ｅ　ｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ・ＡｌａＣ
ＡＣ，ＣＡＧ、ＧＴＧ、ＣＴＧ、ＣＧＧ、ＡＴＣ，ＣＧ
Ｃ，ＡＡＡ、ＣＧＴ。

Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−＋１ｅ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＧＣＣＡＡＣ，ＴＣＣ，ＴＴＣ
，ＣＴＧ、ＧＡＧ、ＧＡＧ、ＣＴＣ，ＣＧＴ、ＣＡＣ，
ＡＧＣ，ＡＧＣ，ＣＴＧ、ＧＡＧ、ＣＧＧ、ＧＡＧＡｌ
　ａ−Ａｓｎ　−Ｓｅ　ｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−１（ｉ　ｓ　ｉｅｒ　−Ｓｅ
ｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ＧｌｕＴＧＣ，ＡＴＡ
、ＧＡＧ、ＧＡＧ。

Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ ＡＴＣ，ＴＧＴ、ＧＡＣ，ＴＴＣ，ＧＡＧ、ＧＡＧ、Ｇ
ＣＣ，ＡＡＧ、ＧＡＡ、ＡＴＴ、ＴＴＣ，ＣＡＡ、ＡＡ
Ｔ、ＧＴＧ、ＧＡＴ、ＧＡＣ，ＡＣＡ、ＣＴＧ、ＧＣＣ
，ＴＴＣ。

Ｉ　Ｉｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ　−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−
ＡｓｎＶａ　ｌ　−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＴＧＧ、ＴＣＣ，ＡＡＧ Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ｌｙｓ ＣＡＣ，ＧＴＣ，ＧＡＣ，ＧＧＴ、ＧＡＣ，ＣＡＧ、Ｔ
ＧＣ，ＴＴＧ、ＧＴＣ，ＴＴＧ、ＣＣＣ，ＴＴＧ、ＧＡ
Ｇ、ＣＡＣ，ＣＣＧ、ＴＧＣ，ＧＣＣ。

Ｈｌ　５−Ｖａ　ｌ　−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ　−Ｖａ　Ｉ　−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｌｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＡｌａＡ
ＧＣ，ＣＴＧ、ＴＧＣ，ＴＧＣ，ＧＧＧ、ＣＡＣ，ＧＧ
Ｃ，ＡＣＧ、ＴＧＣＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−■ｌ５−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＡＴＣ，ＧＡ
Ｔ、ＧＧＣ，ＡＴＣ，ＧＧＣ，ＡＧＣ，ＴＴＣ，ＡＧＣ
，ＴＧＣ，ＧＡＣ，ＴＧＣ。

Ｉ　Ｉｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−
Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙ−ａ　−ＣＣ，
Ｃ，ＡＧＣ，ＧＧＣ，ＴＧＧ、ＧＡＧ、ＧＧＣ，ＣＧＣ
，ＴＴＣ，ＴＧＣ，ＣＡＧ、ＣＧＣ，ＧＡＧ、ＧＴＡ、
ＡＧＣ，ＴＴＣ，ＣＴＣ，ＡＡＴ、ＴＧＣ，ＴＣＴ、Ｃ
ＴＧ。

Ａｒｇ−５ｅ　ｒ・Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ・Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
−Ｖａ　ｌ　−Ｓｅ　ｒ　−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ｃｙｓ−３ｅ　ｒ−Ｌｅｕｌｌｏ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１２０ＧＡＣ，ＡＡＣ，ＧＧＣ，Ｇ
ＧＣ，ＴＧＣ，ＡＣＧ、ＣＡＴ、ＴＡＣ，ＴＧＣ，ＣＴ
Ａ、ＧＡＧ、ＧＡＧ、ＧＴＧ、ＧＧＣ，ＴＧＧ、ＣＧＧ
、ＣＧＣ，ＴＧＴ、ＡＧＣ，ＴＧＴ。

Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇ１　ｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｈｉｓ　−Ｔｙ　ｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
　ｌｅａ　ｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙ
ｓ−３ｅ　ｒ−ＣｙａＧＣＧ、ＣＣＴ、ＧＧＣ Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ ＴＡＣ，ＡＡＧ、ＣＴＧ、ＧＧＧ、ＧＡＣ，ＧＡＣ，Ｃ
ＴＣ，ＣＴＧ、ＣＡＧ、ＴＧＴ、ＣＡＣ，ＣＣＣ，ＧＣ
Ａ、ＧＴＧ、ＡＡＧ、ＴＴＣ，ＣＣＴ。

Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ・Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｌｓ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒ。

ＴＧＴ、ＧＧＧ、ＡＧＧ、ＣＣＣ，ＴＧＧ、ＡＡＧ、Ｃ
ＧＧ、ＡＴＧ、ＧＡＧ、ＡＡＧＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−
ＬｙｓＡＡＧ、ＡＧＡ、ＴＣＴ、ＣＡＣ，ＣＴＧ、ＡＡ
ＣＬｙｓ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＡａｎＴ
ＣＣ，ＧＡＣ，ＡＣＡ、ＧＡＡ。

５ｓｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ− ＧＡＣ，ＣＡＡ、ＧＡＡ、ＧＡＣ，ＣＡＡ、ＧＴＡ、Ｇ
ＡＴ、ＣＣＧ、ＣＧＧ、ＣＴＣ，ＡＴＴ、ＧＡＴ、ＧＧ
Ｇ、ＡＡＧ、ＡＴＧ、ＡＣＣ，ＡＧＧ、ＣＯＧ、ＧＧＡ
、ＧＡＣＡｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ・Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ・ｌ　ｌｅ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＡＧＣ，ＣＣＣ，ＴＧＧ、ＣＡＧ
、ＧＴＧ、ＧＴＣ，ＣＴＴ、ＣＴＡ、ＧＡＣ，ＴＣＡ、
ＡＡＧ、ＡＡＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ、ＧＣＣ，ＴＧＣ，Ｇ
ＧＧ、ＧＣＡ、ＧＴＧ、ＣＴＣ５ｅ　ｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒ
ｐ−Ｇｌｎ−Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　ｌ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
Ａｓｐ　−Ｓｅ　ｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　　Ｖａ　ｌ　−Ｌ
ｅｕ　−ＡＴＣ，ＣＡＣ，ＣＣＣ，ＴＣＣ，ＴＧＧ、Ｇ
ＴＧ、ＣＴＧ、ＡＣＴ、ＧＣＡ、ＧＣＣ，ＣＡＣ，ＴＧ
Ｃ，ＡＴＧ、ＧＡＴ、ＧＡＧ、ＴＣＣ，ＡＡＧ、ＡＡＧ
、ＣＴＣ，ＣＴＴ。

１１ｅ−Ｈｉ　５−Ｐｒｏ　−Ｓｅ　ｒ−Ｔｒｐ−Ｖａ
　ｌ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ　・Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−
Ｃｙｓ　・Ｍｅ　ｔ−Ａｓｐ・Ｇｌｕ−９ｅ　ｒ　−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＬｅｕＧＧＧ、ＧＧＧ、ＣＣＣ
，ＡＴＧ、ＧＴＣ，ＧＣＣ，ＴＣＣ，ＴＴＣ，ＣＡＣ。

Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｌａ・５
ｅｒ−Ｐｈｅ・Ｈｉｓｙｒ １ｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ ５６　ｒ　−Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ　゛ ＧＡＣＴＧＧ　　ＡＴＣ，ＣＡＴ、ＧＧＧ、ＣＡＣ，Ａ
ＴＣ，ＡＧＡ、ＧＡＣＡｓｐ−Ｔｒｐ−＋　１ｅ−Ｈｉ
　５−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ　−＋　１ｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−ＬｙＩＩ−
３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌｔ−Ｐｒｏ−Ｔｅｒ　−ＡＡ Ｔｅｒ 但しＴｅｒは終結コ ド（Ｔｅｍｎａｔｌｏｎ　ｃｏｄｏｎ）Ｂ−１ Ｂ−２ ＣＨＯ由来細胞 Ｃ〜５ −　Ｈ 表 ０、３９ ０、３９５ ０、５２ ０、４７ ０、５５５ ０、７４ ０、４０５ ０、５３５ ０、５５５ ０、３７５ ０、６５ ０、１２　　　　　　　　ＮＤ ０、１５　　　　　　　　Ｂ．０ ０、９４　　　　　　　　１１．０ ０、３３５　　　　　　　　ＮＤ Ｏ．２８５　　　　　　　４．５

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＣｓ　１０の制限酵素地図である。 第２図はｐＣｓ　１の制限酵素地図である。 第３図はｐＨ　Ｓ　０　２９３の制限酵素地図である。 第４図は動物細胞の培養上清中に生産されたヒトプロテ
ィンＣ変異体のウェスタンブロッティングのパターンで
ある。 レーン１：Ｂ−７株の培養液上清 レーン２７Ｃ−５株の培養液上清 レーン３：ヒト血漿から精製したプロティンＣレーンＭ
：蛋自分子量マーカー （上から９７Ｋｄ，　（ｉ８Ｋｄ，　４３Ｋｄ及び２５
Ｋｄと１８Ｋｄの融合したバンド） 水 ＊　＊ 抗血液凝固活性は、対照として用いたヒト血漿に含まれ
るプロティンＣの抗血液凝固活性に対する割合（％）と
して表示される。 ＮＤ−未測定 特許出願人　　へキストジャパン株式会社（外２名） 第 図 第２図 第 図 第 図

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）天然のヒトプロテインＣの１５６および１５７番
   目のアミノ酸配列リジン−アルギニンと異なるアミノ酸
   配列を有することを特徴とするヒトプロテインＣ変異体
   。
2. （２）該アミノ酸配列リジン−アルギニンの一方又は両
   方のアミノ酸残基が、欠失している請求項１記載のヒト
   プロテインＣ変異体。
3. （３）該アミノ酸配列リジン−アルギニンの一方又は両
   方のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている
   請求項１記載のヒトプロテインＣ変異体。
4. （４）該アミノ酸配列リジン−アルギニンの一方のアミ
   ノ酸残基が欠失し他方が他のアミノ酸残基で置換されて
   いる請求項１記載のヒトプロテインＣ変異体。
5. （５）セリン、アスパラギン及びグルタミンより成る群
   から選ばれるアミノ酸残基で置換されている請求項３又
   は４のいずかに記載のヒトプロテインＣ変異体。
6. （６）該アミノ酸配列リジン−アルギニンがアスパラギ
   ン−セリンで置換されている請求項５記載のヒトプロテ
   インＣ変異体。
7. （７）請求項１記載のヒトプロテインＣ変異体をコード
   するＤＮＡ。
8. （８）請求項７記載のＤＮＡを用いるヒトプロテインＣ
   変異体の遺伝子工学的製造方法。