JPS63263083A - 新しい塩基配列のヒトプロテインｃ遺伝子 - Google Patents

新しい塩基配列のヒトプロテインｃ遺伝子

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JPS63263083A
JPS63263083A JP62096341A JP9634187A JPS63263083A JP S63263083 A JPS63263083 A JP S63263083A JP 62096341 A JP62096341 A JP 62096341A JP 9634187 A JP9634187 A JP 9634187A JP S63263083 A JPS63263083 A JP S63263083A
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Japan
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protein
gene
human protein
human
leu
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JP62096341A
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Inventor
Mikiko Takahashi
高橋　美樹子
Hidenori Motokawa
本川　英範
Wakako Iwasaki
岩崎　和佳子
Masahide Tone
刀禰　正英
Akiko Iwaki
岩城　明子
Atsushi Takeshita
淳 竹下
Masayuki Otsubo
大坪　正幸
Tamotsu Hashimoto
保 橋本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis KK
Original Assignee
Hoechst Japan Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、医療上有用なプロティンＣをコードする新
しい遺伝子配列およびその遺伝子を用いたプロティンＣ
の製造方法に関する。
従来の技術 プロティンＣ（ｐｒｏｔｃｌｎ　Ｃ）は、ビタミンに依
存性血漿蛋白質のひとつとして、１９７Ｂ年ウシから（
Ｓｔｃｎ　ｒｌｏ、　　、１．　　：　　Ｊ、　　Ｂｌ
ｏｔ、　　Ｃｈｃｓ、　　　２５１　　二　３５５−３
８３　（１９７６）］　、また１９７９年ヒトから（Ｋ
ｉｓｉａ！。
Ｗ、　：　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４　
：　７６１−７８９　（１９７９）　）単離された。分
子量は６２．０００で、２本鎖（低分子鎖、２１．００
０；高分子鎖、４１，０００）がＳ−８結合にて連結し
ている糖蛋白質である。また低分子鎖のアミノ末端近く
には、カルシウムイオン（Ｃａ””）結合性アミノ酸の
γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａと略す）が９個存
在している。プロティンＣはトロンボモジュリン（ｔｈ
ｒｏａ＋ｂｏＩｌｏｄｕ　ｌ　Ｉｎ）に結合したトロン
ビン（ｔｈｒｏｍｂｉｒりにより限定分解をうけ、活性
型プロティンＣ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｆｎ
　Ｃ：ＡＰＣと略す）となり、血液凝固系の■ａ因子お
よびＶａ因子をＣａ２＋ｆｆ在下に失活させ、血液凝固
を阻害することが知られている。このために、プロティ
ンＣの有する抗凝固作用は、種々の血管内での必要以上
の血液凝固（血栓）を伴う疾患の治療に有用であると考
えられている。
しかし、現在までのところ、ヒトプロティンＣの製法は
ヒト血漿からの精製しかなく、この血漿蛋白質の濃度は
約３μｚ　／　ｍｌと極微量なので、治療に用いる程多
量に得ることは困難であった。
本発明が解決しようとする問題点 本発明は従来の血漿からの単離精製よりなる製造方法に
よっては、極く微量にしか製造できなかったプロティン
Ｃを大量に生産す各ことができる遺伝子工学による製造
方法を提供するものである。
プロティンＣの生産をコードする遺伝子の塩基配列は、
既に１９８５年にＰｏ５ｔｅｒらにより決定され発表さ
れている（Ｐｏｓｔｅｒ、　Ｄ、　Ｃ，ａｔ　ａｌ　：
　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８２　
：　４８７３−４（ｆ７７（１９８５））。
本発明は、プロティンＣをコードする新しい塩基配列の
遺伝子を提供し、さらにこの遺伝子を用いてプロティン
Ｃを生産する方法を提供するものである。
発明の構成 本発明のプロティンＣをコードする遺伝子の塩基配列と
プロティンＣのアミノ酸配列は次のとおりである。
（以下余白） ＡＴＧ、ＴＧＧ、ＣＡＧ、ＣＴＣ，ＡＣＡ、ＡＧＣ，Ｃ
ＴＣ，ＣＴＧ、ＣＴＧ。
Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＧＣＴ、ＣＣＴ、ＣＴＴ、ＧＡ
Ｃ，ＴＣＡ、ＧＴＧ、ＴＴＣ，ＴＣＣ，ＡＧＣ。
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ｐ
ｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＡＡＡ、ＣＧＴ、ＧＣＣ，ＡＡ
Ｃ，ＴＣＣ，ＴＴＣ，ＣＴＧ、ＧＡＧ、ＧＡＧ。
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＧＡＧ、ＧＡＧ、ＡＴＣ，ＴＧ
Ｔ、ＧＡＣ，ＴＴＣ，ＧＡＧ、ＧＡＧ、ＧＣＣ。
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＧＣＣ，ＴＴＣ，ＴＧＧ、ＴＣ
Ｃ，ＡＡＧ、ＣＡＣ，ＧＴＣ，ＧＡＣ，ＧＧＴ。
Ａｌａ−Ｐｈａ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＴＧＣ，ＧＣＣ，ＡＧＣ，ＣＴ
Ｇ、ＴＧＣ，ＴＧＣ，ＧＧＧ、ＣＡＣ，ＧＧＣ。
Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−ＧＡＣ，ＴＧＣ，ＣＧＣ，ＡＧ
Ｃ，ＧＧＣ，ＴＧＧ、ＧＡＧ、ＧＧＣ，ＣＧＣ。
Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＴＣＴ、ＣＴＧ、ＧＡＣ，ＡＡ
Ｃ，ＧＧＣ，ＧＧＣ，ＴＧＣ，ＡＣＧ、ＣＡＴ。
５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ　−ＡＧＣ，ＴＧＴ、Ｃ；ＣＧ、
ＣＣＴ、ＧＧＣ，ＴＡＣ，ＡＡＧ、ＣＴＧ、ＧＧＧ、・
５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＴＴＣ，ＣＣＴ、ＴＧＴ、ＧＧ
Ｇ、ＡＧＧ、ＣＣＣ，ＴＧＧ、ＡＡＧ、ＣＧＧ。
Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ｌＡＣＡ、ＧＡＡ、ＧＡＣ，Ｃ
ＡＡ、ＧＡＡ、ＧＡＣ，ＣＡＡ、ＧＴＡ、ＧＡＴ。
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｔｕ−Ａｓｐ−Ｇ
ｉｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＧＧＡ、ＧＡＣ，ＡＧＣ，ＣＣ
Ｃ，ＴＧＧ、ＣＡＧ、ＧＴＧ、ＧＴＣ，ＣＴＴ、　　１
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＴＴＣ，Ｇ“ Ｐｈｅ−Ｖ ＡＧＣ，Ｇ□ Ｓｅｒ−Ｇ ＣＴＣ，Ｃ［ Ｌｅｕ−Ａ ＡＡＧ、　　Ｇ） Ｃｙｓ−Ｇ ＣＡＣ，Ｃｚ Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ
　−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ　−Ｐｒ。
へＣＧ、ＴＧＣ，ＡＴＣ，ＧＡ、Ｔ、ＧＧＣ，ＡＴＣ，
ＧＧＣ，ＡＧＣｏＴＴＣ，ＡＧＣ，ＴＧＣｒｈｒ−Ｃｙ
ｓ　−＋　１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｓ
ｅｒ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−ＣｙｓｒＴＣ，ＴＧＣ，ＣＡＧ
、ＣＧＣ，ＧＡＧ、ＧＴＡ、ＡＧＣ，ＴＴＣ，ＣＴＣ，
ＡＡＴ、ＴＧＣＰｈｅ−Ｃｙｓ　−Ｇｉｎ　　Ａｒｇ−
Ｇｌ　ｕ−Ｖａ　１−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−ＣｙｓｒＡＣ，ＴＧＣ，ＣＴＡ、ＧＡＧ、ＧＡＧ、Ｇ
ＴＧ、ＧＧＣ，ＴＧＧ、ＣＧＧ、ＣＧＣ，ＴＧＴｒｙｒ
−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ　ｌ−Ｇｌｙ
−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＣｙｓコＡＣ，ＧＡＣ，Ｃ
ＴＣ，ＣＴＧ、ＣＡＧ、ＴＧＴ、ＣＡＣ，ＣＣＣ，ＧＣ
Ａ、ＧＴＧ、ＡＡＧ〜５ｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌ
ｙｓ％ＴＧ、ＧＡＧ、ＡＡＧ、ＡＡＧ、ＡＧＡ、ＴＣＴ
、ＣＡＣ，ＣＴＧ、ＡＡＡ、ＣＧＡ、ＧＡＣＪｅｔ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉ　５−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ　　Ａｒｇ−Ａｓｐ：ＣＧ、ＣＧＧ、ＣＴ
Ｃ，ＡＴＴ、ＧＡＴ、ＧＧＧ、ＡＡＧ、ＡＴＧ、ＡＣＣ
，ＡＧＧ、ＣＧＧ）ｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｍｅ　ｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
ＡｒｇＥＴＡ、ＧＡＣ，ＴＣＡ、ＡＡＧ、ＡＡ、Ｇ、Ａ
ＡＧ、ＣＴＧ、ＧＣＣ，ＴＧＣ，ＧＧＧ、ＧＣＡＬｅｕ
−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ　・Ｃｙｓ　−Ｇｌ　ｙ−Ａｌ　ａＧＴＧ
、ＣＴＣ，ＡＴＣ，ＣＡＣ，ＣＣＣ，ＴＣＣ，ＴＧＧ、
ＧＴＧ、ＣＴＧ、ＡＣＴ。
Ｖａｌ−Ｌｅｕｉｌｅ−）ｉｉｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔ
ｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＣＴＣ，ＣＴＴ、ＧＴ
Ｃ，Ａ、ＧＧ、ＣＴＴ、にＧＣＡ、ＧＡＧ、ＴＡＴ、Ｇ
ＡＣ，ＣＴＧ。
Ｌｅｕ・Ｌｅｕ・Ｖａｌ−Ａｒ４−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−ＧＡＣ，ＡＴＣ，ＡＡ
Ｇ、ＧＡＧ、ＧＴＣ，ＴＴＣ，ＧＴＣ，ＣＡ、Ｃ，ＣＣ
Ｃ，ＡＡＣ。
Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｖ
ａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−ＧＣＡ、ＣＴＧ、ＣＴ
Ｇ、ＣＡＣ，ＣＴＧ、ＧＣＣ，ＣＡＧ、ＣＣＣ，ＧＣＣ
，ＡＣＣ。
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＣＣＧ、ＧＡＣ，ＡＧ
Ｃ，ＧＧＣ，ＣＴＴ、ＧＣＡ、ＧＡＧ、ＣＧＣ，ＧＡＧ
、ＣＴＣ。
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−９ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ＧＧＣ，ＴＧＧ、ＧＧ
Ｃ，ＴＡＣ，ＣＡＣ，ＡＧＣ，ＡＧＣ，ＣＧＡ、ＧＡＧ
、ＡＡＧ。
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−５
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａ、ＡＣ，ＴＴＣ，Ａ
ＴＣ，ＡＡＧ、ＡＴＴ、ＣＣＣ，ＧＴＧ、ＧＴＣ，ＣＣ
Ｇ、ＣＡＣ。
Ａｓｎ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＧＴＧ、ＴＣＴ、ＧＡ
Ｇ、ＡＡＣ，ＡＴＧ、ＣＴＧ、ＴＧＴ、ＧＣＧ、ＧＧＣ
，ＡＴＣ。
Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｃ
ｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−１１ｅ−ＧＡＣ，ＡＧＴ、ＧＧ
Ｇ、ＧＧＧ、ＣＣＣ，ＡＴＧ、ＧＴＣ，ＧＣＣ，ＴＣＣ
，ＴＴＣ。
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−ＡＧＣ，ＴＧＧ、ＧＧ
Ｔ、ＧＡＧ、ＧＧＣ，ＴＧＴ、ＧＧＧ、ＣＴＣ，ＣＴＴ
、ＣＡＣ。
５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−ＴＡＣ，ＣＴＣ，ＧＡ
Ｃ，ＴＧＧ、ＡＴＣ，ＣＡＴ、ＧＧＧ、ＣＡＣ，ＡＴＣ
，ＡＧＡ。
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｈｉｓｌｌｅ−Ａｒｇ−ＣＣＴ、ＴＡＧ。
Ｐｒｏ−Ｔｅｒ　　　但しＴｅｒは終結コード（Ｔｅｒ
ｍｌｎａｔｌｏｎ　ｃｏｄｏｎ）ＧＣＡ、ＧＣＣ，ＣＡ
Ｃ，ＴＧＣ，ＡＴＧ、ＧＡＴ、ＧＡＧ、ＴＣＣ，ＡＡＧ
、Ａ、ＡＧＡｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＣＧＧ、ＣＧ
Ｃ，ＴＧＧ、ＧＡ、Ｇ、ＡＡＧ、ＴＧＧ、ＧＡＧ、ＣＴ
Ｇ、ＧＡＣ，ＣＴＧＡｒｇ・Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕＴＡ
Ｃ，ＡＧＣ，ＡＡＧ、ＡＧＣ，ＡＣＣ，ＡＣＣ，ＧＡ、
Ｃ，ＡＡ、Ｔ、ＧＡＣ，ＡＴＣＴｙｒ−５ｅｒ−Ｌｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ・Ａｓｐ−
１１ｅＣＴＣ，ＴＣＧ、ＣＡＧ、ＡＣＣ，ＡＴＡ、ＧＴ
Ｇ、ＣＣＣ，ＡＴＣ，ＴＧＣ，ＣＴＣＬｅｕ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｃ
ｙｓ−ＬｅｕＡＡＴ、ＣＡＧ、ＧＣＣ，ＧＧＣ，ＣＡＧ
、ＧＡＧ、ＡＣＣ，ＣＴＣ，ＧＴＧ、ＡＣＧＡｓｎ−Ｇ
ｉｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｖａｔ　−ＴｈｒＧＡＧ、ＧＣＣ，ＡＡＧ、ＡＧＡ
、ＡＡＣ，ＣＧＣ，ＡＣＣ，ＴＴＣ，ＧＴＣ，ＣＴＣＧ
ｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＬｅｕＡＡＴ、ＧＡＧ、ＴＧＣ，
ＡＧＣ，ＧＡＧ、ＧＴＣ，ＡＴＣ，ＡＧＣ，ＡＡＣ，Ａ
ＴＧＡｓｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ａｓｎ−ＭｅｔＣＴＣ，ＧＧＧ、Ｇ
ＡＣ，ＣＧＧ、ＣＡＧ、ＧＡＴ、ＧＣＣ，ＴＧＣ，ＧＡ
Ｇ、ＧＧＣＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ＧｌｙＣＡＣ，ＧＧ
Ｃ，ＡＣＣ，ＴＧＧ、ＴＴＣ，ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＧＧＣ
，ＣＴＧ、ＧＴＧＨｉｓ−Ｇ［ｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＶａｌＡＡＣ
，ＴＡＣ，ＧＧＣ，ＧＴＴ、ＴＡＣ，ＡＣＣ，ＡＡＡ、
ＧＴＣ，ＡＧＣ，ＣＧＣＡｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｔ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｒｇ
ＣＡＣ，ＡＡＧ、ＧＡＡ、ＧＣＣ，ＣＣＣ，ＣＡＧ、Ａ
ＡＧ、ＡＧＣ，ＴＧＧ、ＧＣＡＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−
Ａｌａこの遺伝子がコードするヒトプロティンＣのアミ
ノ酸配列はＦｏｓｔｅｒ等（前出）によって決定された
ものと同じである。
この遺伝子の塩基配列は、特許出願公開昭８１２０５４
８７におけるヒト肝臓ｍＲＮＡから調製されたヒトプロ
ティンＣのｃＤＮＡの塩基配列とは相違していて合成の
際に新たに多数の制限酵素認識部位を導入しているので
、これらの制限酵素認識部位を利用して将来、本遺伝子
と合成りＮＡ断片との部分的置換より成る蛋白工学的操
作がしやすくなっているという利点を有している。
本発明は、動物細胞もしくは原核細胞に組み込まれたと
き、ヒトプロティンＣを発現させる組み換えＤＮＡベク
ター及びそのベクターを導入した動物細胞もしくは原核
細胞を培養するヒトプロティンＣの製造方法をも提供す
る。
動物細胞に導入した時、ヒトプロティンＣを発現させる
組み換えＤＮＡベクターには、プロティンＣをコードす
る遺伝子の他に、転写開始を指示する真核生物のプロモ
ーター、転写終結を指示するポリアゾニレ−ジョンサイ
トおよびこのＤＮＡベクターをＥ、ｃｏｌｌを用いて調
製する時に必要な適当な選択マーカーをコードする遺伝
子を含む。
この真核生物のプロモーターの例としてはＳＶ４０初期
プロモーター、マウスマンマリイ腫瘍ウィルス（Ｍｏｕ
ｓｅ　Ｍａｍａ＋ａｒｙ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓ　：
略してＭＭＴＶ）のプロモーターおよびショウジヨウバ
エ熱シヨツク性蛋白−７０（Ｄｒｏｓｏｐｈｌｌａ　１
ｌｅａＬ　５ｈｏｃｋ　Ｐｒｏｔｏｌｎ７０：略してＨ
Ｓ　Ｐ　７０）のプロモーター等があげられる。また転
写終結のシグナルの例としてはＳＶ４０初期ｍＲＮＡポ
リアゾニレ−ジョンサイト等があげられ、またＥ、　ｃ
ｏｌｌ内での選択的増幅に必要な選択マーカーとしては
アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｌｃｉｌｉｎ　Ｒｅ５
ｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　：　Ａ　ｐ　Ｉ？と略す）、
クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｈｒｏｒａｍｐｈ
ｅｎｌｃｏｌ　ＲｏｓｉｓＬａｎｔ　ｇａｎａ　：　Ｃ
ｍＲと略す）やカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎａＩ！
１ｙｃｌｎＲｅｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ：　ＫｍＲと略す
）があげラレル。
この組み換えＤＮＡベクターを動物宿主細胞に導入する
方法は、例えばＫａｕｌ’ｍａｎ等（Ｊ、　Ｍｏｌ。
Ｂｌｏｔ、　　（１９８２）　　１５９　６０１−Ｊ２
１）のリン酸カルシウムとの共沈法によっておこなうこ
とができる。この時、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｌ
ｈｙｄｒｏｆ’ｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　：　
ｄｈｆｒと略す）を含むプラスミドベクターを共存させ
てコトランスフエクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｒｅｃｔ
ｌｏｎ）をおこなうことにより、ｄｈｌ’ｒ＋株を選択
し、この組み換えＤＮＡベクターによる形質転換細胞を
得ることができる。
このようにして得られた形質転換細胞を培養することに
よってヒトプロティンＣを生産させる。
ここで用いられる動物宿主細胞としては、チャイニーズ
　ハムスター　オバリイｔｆｆｌ胞（Ｃｈｉｎｅｓｅｌ
ｌａｍｓｔｏｒ　０ｖａｒｙ　Ｃｅｌ　Ｉ　：　Ｃｌｌ
０　ｅｅｌ　ｌと略す）のｄｈｒｒ−株があげられる。
原核細胞に導入した時、ヒトプロティンＣを発現させる
組み換えＤＮＡベクターには、プロティンＣをコードす
る遺伝子の他に、転写開始を指示する原核生物のプロモ
ーター、転写の終結を指示する原核生物のターミネータ
−および適当な選択マーカーをコードする遺伝子を含む
。原核生物宿主細胞の例としては大腸菌（１’Ｅｓｃｈ
ｅｒｌｅｌａ　ｃｏｌｔ　　：Ｅ、　ｃｏｌｌと略す）
があげられる。またプロモーターの例としてはＥ、　ｃ
ｏｌｌの中で転写効率のいい、Ｌｒｐプロモーターやｔ
ａＣプロモーターがあげられ、ターミネータ−の例とし
ては、強い終結シグナルであるｒｒｎ　ＢリボゾームＲ
ＮＡターミネータ−があげられ、さらに選択マーカーと
しては前ｌｆＩのＡｐＲ，ＣｍＲ，ＫｍＲ等があげられ
る。
この組み換えＤＮＡベクターを大腸菌の宿主に導入する
方法は、Ｍａｎｉａｔｌｓ等によるｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　　（，１９８２年　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
出版）等の成書に詳説され−Ｃいる、カルシウムイオン
存在下での形質転換法（ｔｒａｎｓｆ’ｏｒ厘ａｔｌａ
ｎ）を用いた。こうして得られた形質転換細胞を培養す
ることによって、ヒトプロティンＣを生産させる。
以下に本発明の構成を詳細に説明する。
（１）　　ヒトプロティンＣをコードする遺伝子の作成 ヒトの染色体遺伝子ライブラリィから、ヒトプロティン
Ｃをコードしている領域をクローニングし、その塩基配
列を決定する仕事は、Ｆｏｓｔｅｒ　（文献前出、１９
８５年）等によって、すでになされている。即ち、ヒト
プロティンＣの染色体」二の遺伝子は８個のコーディン
グ領域（ｅｘｏｎ）が７個のノンコーディング領域（Ｉ
ｎｔｒｏｎ）によって分断され全長が約ｌＩＫ塩基対（
ｂａｓｅ　ｐａｌｒ　％以下ｂｐと略す）であることが
明らかにされている。しかし、この染色体上の遺伝子は
このままの大きさでは、動物宿主細胞における発現を増
加させる際に遺伝子重複させる単位としては大きすぎる
し、また原核宿主細胞における発現を可能にするために
はＩｎｔｒＯｎ部分は不要であり除去する必要がある。
さらに、ヒトプロティンＣの一部のポリヌクレオチド鎖
部分を、合成りＮＡや他の遺伝子由来のＤＮＡ部片と置
換させるという、蛋白質工学的な操作を容易にするため
には、適当な間隔で制限酵素認識部位が遺伝子上に存在
していたほうが便利である。
これらの理由により、本発明ではプロティンＣをコード
する遺伝子のうち、合成後の分泌に関与するプレペプチ
ド（１）ｒｏｐｅｐｔｆｄｃ）　、７−カルボキシル化
反応のシグナルとなるプロペプチド（ｐｒｏｐｅｐｔ　
１ｄｅ）および、リン脂質膜にカルシウムイオンを介し
て結合する部位であるＧｌａｌミドメイン分子全路（Ｈ
ｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）と低分子二鎖（Ｌｌｇｈｉ　ｃ
ｈａｉｎ）の開裂時やプロティンＣの活性化の際に除去
されるペプチド領域等、本タンパク質の発現や機能に重
要と考えられるＮ−末端側の約３分の２（および、ごく
短いＣ−末端側も含む）は、合成りＮＡで置き換えるこ
ととし、のこりの約３分の１は染色体遺伝子の一部をそ
のまま利用することにした。約３分の２の合成りＮＡ部
分は、Ｆｏｓｔｅｒ　（前出）等の発表した塩基配列を
ベースにして、コードされるアミノ酸を変えないで、塩
基を変えることにより、両端が制限酵素認識部位になる
ように設計された長さが３８から８０ヌクレオチドの３
０個のＤＮＡ小断片に分割した。これらの合成りＮＡ小
断片は、各々個別に合成され、順次連結されクローニン
グされた。なお、このＤＮＡ合成は、米国アプライド・
バイオシステム社ＣＡｐｐＨｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｃｍ
社）のｍｏｄｅｌ　３８０Ａ　　ＤＮＡ合成機を用いた
。
残りの約３分の１の染色体遺伝子由来の部分にに関して
は、ヒト遺伝子のライブラリィを作成し、合成プローブ
により、プロティンＣの染色体遺伝子を釣りあげ、その
中の最長ｅｘｏｎである第８　ｅｘｏｎからＢａｆｆ１
Ｈ１とＨａｅＩＩで切り出した遺伝子断片をこれらの合
成部分と、染色体遺伝子部分を連結させて最終的に１３
８９ｂｐのヒトプロティンＣをコードする！　ｎ　ｔ　
ｒｏｎを含まない遺伝子を作成した。このヒトプロティ
ンＣの遺伝子を含むプラスミドベクターをｐＰｃｌと名
づけ微生物工学技術研究所にＦＥＲＭ　　Ｐ−９２９７
号として寄託した。
本発明で作成されたヒトプロティンＣ遺伝子を、動物宿
主細胞にて発現させるために発現プラスミドベクター、
ｐＣｓ　１．　　ｐＣｓ　２．　　ｐｃｔｎ　１および
ｐＣｄ　１を作成した。
ｐｃｓｌは、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０初期
ｍＲＮＡポリアゾニレ−ジョンサイト【これらはいずれ
も、米国ベセスダリサーチラボ（ＢｅＬｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ　；　Ｂ　ＲＬと略す）より
市販されているＳＶ４０　　ＤＮＡより単離作成できる
。〕およびｐＢＲ３２２由来のＥ、　ｃｏｌｔでの複製
開始部位とアンピシリン耐性遺伝子を含み、ＳＶ４０初
期プロモーターとＳＶ４０初期ｍＲＮＡポリアゾニレ−
ジョンサイトの間のポリリンカ一部位（合成できる）に
、ｐＰｃｌがらＥｃｏＲＩとＳｍａ？で切り出したヒト
プロティンＣ遺伝子を組み入れ作成した。ｐＣｓ２は、
ｐｃｓｌのポリリンカーとポリアゾニレ−ジョンサイト
の間にさらにＳ　Ｖ２Ｏｓ＋＋＋ａｌｌ　Ｌ　Ｉｎｔｒ
ｏｎを含むＤＮＡ　（前出のＢＲＬ社の５Ｖ４０ＤＮＡ
より単離できる）を挿入して作成した。ｐｃｌｌｌは、
ｐＣｓ　２（７）ＳＶ４０初期プロモーターをＭＭＴＶ
−ＬＴＲプロモーターと置換して作成した。
ｐｃｄｌは、ｐＣｓ２のＳＶ４０初期プロモーターをｄ
ＨＳＰプロモーターと置換して作成した。
ｐＣｓ　１．　　ｐＣｓ　２．　　ｐｃｉ　１及びｐＣ
ｄ　１はカルシウム法（前出）により大腸菌Ｋ　−１２
゜ＨＢ　１０１に形質転換した。
動物宿主細胞としては、前出のＣＨＯｄＭｒ″″細胞を
用い、Ｋａｕｌ’ｍａｎらの方法（Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂ
ｌｏｌ。
（１９８２）　　巨９　８０１−８２１）に従って、ヒ
トプロティンＣ発現プラスミドｐｃｓｌとマウスｄｈｒ
ｒ発現プラスミドを混合しリン酸カルシウムとの共沈を
形成させてＤＮＡ）ランスフェクションを行った。ここ
で用いたマウスｄｈｌ’ｒ発現プラスミドはｐｓＶ２ｄ
ｈｌ’ｒ　（ＡＴＣＣ３７ｆ４Ｂとして人手可能）のマ
ウスｄｈｆ’ｒ遺伝子およびＳＶ４０初明ｍ　ＲＮ　Ａ
ポリアゾニレ−ジョンサイトを含むＨｌｎｄｌｌｌｌ〜
Ｂｇｆ１ｍ断片をｐＢＲ３２２（例えば宝酒造■より市
販されている）に組み込んだプラスミドであるが、その
他のマウスｄｈｆ’ｒ発現用プラスミドも同様に用いる
ことができる。これらのプラスミドによって形質転換さ
れたＣ　Ｈ，，０細胞はヌクレオシドを含まない選択培
地上にて生育してくるｄｈｆｒ＋細胞として選択できる
。これらのｄｈｆｒ＋細胞のクローンを単離し、それぞ
れの培養上清中へのヒトプロティンＣの発現量をＥ　Ｌ
　Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）にて測定した。
こうして得られたヒトプロティンＣ産生株から、葉酸の
アナログであるメソトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘ
ａｔｃ）の培地中での濃度を段階的に増加させ生存して
くる細胞株を順次選択することによる遺伝子増幅法を用
いて、ヒトプロティンＣ高産生株を選択分離した。これ
らのヒトプロティンＣの高産生株の増幅されたヒトプロ
ティンＣ遺伝子のコピー数はサザンブロッティング法（
Ｔ。
Ｍａｎｉａｔｆｓら、　　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｌｎｇ　”　　−前出）により算出した。また、産
生されたヒトプロティンＣは、ウェスタンブロッティン
グ法によりその分子量が測定された。これらのヒトプロ
ティンＣのリン脂質膜上での活性発現に不可欠なＮ端側
のγ−カルボキシル化はクエン酸バリウム塩への吸着の
程度より算出された。産生されたヒトプロティンＣの生
化学的活性は、ベーリンガーマンハイム社より市販され
ている“Ｐｒｏｔｅｌｎ　ＣＡｃｔ　Ｉｖａｉ　ｔｏｎ
ｏ”により、プロティンＣを活性型プロティンＣに活性
化した後、そのセリンプロテアーゼ活性を合成基質のク
ロモザイムＰＣａ（ｃｈｒｏｍｏｚｙａ＋　ＰＣａ　；
ベーリンガーマンハイム社より市販されている）を用い
てａｌ定した。また、生理学的活性は“Ｐｒｏｔａｃ　
Ｃ［Ｆ］″　（スイス国、ペンタファーム社より市販）
によるプロティンＣの活性化の後にプロティンＣ欠損血
漿とＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ（ベーリングベルケ社より市
販されている）を加えて、５ｍＭ　　Ｃａ　Ｃｊｌ）　
２存在下での凝固時間の延長を７ＩＰ１定することによ
り、産生じたヒトプロティンＣの抗凝固作用を調べた。
以下に、具体的な実施例を示す。
実施例　１　　ヒトプロティンＣ遺伝子の作成第１図に
ヒトプロティンＣ遺伝子の作成に用いた１６の断片の制
限酵素部位を示す。図中の（）内の数値は、最初のＡＧ
ＴのＡを１として数えたときの塩基の番号であり、その
番号は切断部位の中心にある塩基のものである。ヒトプ
ロティンＣ遺伝子の上流末端にはＥｃｏＲ１部位が、下
流末端にはＳ　ｍａ　ＩおよびＨｌ、ｎｄＩ１１部位が
クローニングのために付加されている。
Ｈａｏｎ　〜Ｂ　ａａ＋ＨＩの断片Ｎｏ、　１５は、ヒ
ト遺伝子のライブラリーから次のようにして切り出され
た。
即ち、ヒト肝臓より抽出した核染色体ＤＮＡをＢａＩＩ
ＨＩで消化し、さらにショ糖密度勾配遠心法により、大
きさが６〜８ＫｂｐのＤＮＡ断片を集めて、アマジャム
ジャパン社より市販されている、λＬ　４７Ｄ　Ｎ　Ａ
およびインビトロパッケージングキットを用いて、ヒト
遺伝子ライブラリィ−を作成した。スクリーニングには
、Ｆｏｓｔｅｒ等（文献、前出）の塩基配列から、第５
　ａｘｏｎの一部分１２０　ｂ　Ｉ）の長さのＤＮＡ断
片を化学的に合成してプローブとして用いた。このプロ
ーブにより、上記のヒト遺伝子ライブラリィ−から、ヒ
トプロティンＣ遺伝子の一部である、約７ＫｂｐのＤＮ
Ａ断片を含むクローンを得、このクローンから切り出し
たＢａｍＨＩ　−ＢａＩＩＨＩ断片をさらにＨａｃＩＩ
で切断して、Ｔｈ１５に相当するＨａｅＩＩ　〜Ｂ　ａ
ｍＨＩ断片を得た。
他の断片魔１〜１４及びＮａｌ［ｉは、ＤＮＡ合成機に
よって合成した。断片１〜１６を常法に従って順次ライ
ゲートとクローニングを繰り返して連結した。
ヒトプロティンＣをコードする１３８９ｂｐの遺伝子の
両端に、ＥｃｏＲＩ部位とＳｍａ！およびＨ１ｎｄＩＩ
Ｉ部位が付加された遺伝子を得た。
この遺伝子をｐＵＣ９（ファルマシア社等より市販）よ
り本発明者等が改良した、ｐＵＣ９と同じポリリンカ一
部位と、Ｐ　ｖｕ　Ｉを消失せしめたアンピシリン耐性
遺伝子を持つプラスミドベクターの、ＥｃｏＲＩとＨｌ
ｎｄＩＩＩの間に組み込んでプラスミドｐＰｃ１を作成
した。このプラスミドは大腸菌Ｋ　１．２／　Ｏｍ　２
２５に形質転換し、工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第９２９７号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９２９７）
として寄託された。
実施例　２　　発現プラスミドベクターの作成Ａ、プラ
スミドｐｃｓｌの構築 このプラスミドはＳＶ４０初期プロモーターの制御下で
プロティンＣ遺伝子の動物細胞における発現を可能にす
る。プラスミドｐＢＲ３２２の２．３ＫｂｐのＰｖｕｌ
ｌ　−ＥｃｏＲＩ断片（これはアンピシリン耐性遺伝子
および復製開始部位を含む）に、ＳＶ４０初期プロモー
ターを含む断片、遺伝子を挿入するためのポリリンカー
およびＳＶ４．０初期ｍＲＮＡポリアゾニレージョンサ
イトを含む断片を結合させたプラスミドｐＳＶＡ　５ｔ
ｏｐ　１をポリリンカー内にあるＸｂａｌサイトで切断
しＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした。
次にｐＰｃｌをＥｃｏＲＩおよびＳ　ｍａ　ｉで消化し
、プロティンＣ遺伝子を含む１．４　ＫｂｐのＤＮＡ断
片をポリアクリルアミドゲル電気泳動によりｆｉｔ離精
製しＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端にした後、
先に述べたプラスミドｐＳＶＡ　５ｔｏｐ　１の平滑末
端にＴ４ＤＮＡリガーゼによりライゲートした。
組み換えＤＮＡプラスミドを調べてプロティンＣ遺伝子
がＳＶ４０初期プロモーターに対して発現可能な方向に
組み込まれたクローンを選択しｐｃｓｌとした。これは
大腸菌Ｋ　−１２１１８１０１に形質転換し微生物工学
研究所にＦＥＲＭ　　Ｐ−９１１１として寄託されてい
る。
Ｂ、プラスミドｐＣｓ２の構築 このプラスミドもＳＶ４０初期プロモーターの制御下で
プロティンＣ遺伝子の動物細胞における発現を可能にす
る。
プラスミドｐＺＥＴ４はプラスミドｐＳＶＡｓｔｏｐｌ
のポリリンカーとポリアゾニレ−ジョンサイトの間にＳ
　Ｖ２ＯＳｍａｌｌ　ｔイントロンを含むＤＮＡ断片を
挿入したプラスミドである。
ｐｃｓｌを構築する時に用いたものと同様の１．４　Ｋ
ｂｐの平滑末端にしたプロティンＣ遺伝子を含むＤＮＡ
断片をプラスミドｐＺＥＴ４をＸｂａｌで消化後Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで平滑末端にしたものにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼでライゲートした。
組み換えプラスミドを調ベプロテインＣ遺伝子がＳＶ４
０’？７］期プロモーターに対して発現可能な方向に組
み込まれたクローンを選択しｐＣｓ　２とした。
（以下余白） 実施例　３　　動物細胞におけるヒＩ・プロティンＣの
発現 ＣＨＯｄｈｌ’ｒ−細胞へのｐｃｓｌのトランスフェク
ションによるプロティンＣの発現について Ａ、　ＣＨＯｄｈｆ’ｒ−細胞へのプラスミドｐＣｓ　
１の導入（トランスフェクション）及び発現ＣＨＯｄｈ
ｆ’ｒ−細胞へのＤＮＡ　トランスフェクションはＫａ
ｕｆｍａｎらの方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（
１，９８２）１．５９．１３０１−６２１）に従って行
なった。
３μｇのｐｃｓｌ及び２μｇのマウスｄｈｆｒ発現用プ
ラスミドを混合しリン酸カルシウムとの共沈を形成した
。ここに用いたマウスｄｈ「ｒ発現用プラスミドハルＳ
　Ｖ　２　ｄｈｌ’ｒ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３７１４Ｂ）よ
りＨｌｎｄＩ［［及びＢｇｇＩＩで切り出されるマウス
ｄｈｌ’ｒ遺伝子、ＳＶ４０初期ｍＲＮＡポリアゾニレ
−ジョンサイトを含むＤＮＡ断片を含み他の部分はｐＢ
Ｒ３２２由来の３．ＯＫｂｐのプラスミドである。形成
されたＤＮＡ沈澱をｌＸｌ０６個のＣＨ０ｄｈｆ’ｒ″
″細胞にさらすことにより遺伝子を導入しｄｈ「ｒ”に
なった形質転換体を選択した。クローンを単離し、それ
ぞれの培養−に請中へのヒトプロティンＣの発現量をＥ
ＬＩＳＡにより測定した。調べたクローンの約５６％は
ヒトプロティンＣを発現しており、その発現量は１〜ｌ
ｏＯｎｇ　／１０６ｅｅｌ　ｌ／　２４ｈｒであった。
Ｂ、メソトレキセート（ＭＴＸ）によるヒトプロティン
Ｃの発現の増幅 メソトレキセート（ＭＴＸ）は葉酸のアナログであり、
ｄｈｌ’ｒの阻害剤として働き、このｄｈｒｒをコード
する遺伝子と共に導入されたＤＮＡ断片、すなわちプロ
ティンＣ遺伝子は、しばしば細胞の染色体上でｄｈｆｒ
遺伝子の近傍に組み込まれることが知られＭＴＸ添加に
よるｄｈｆ’ｒ遺伝子の増幅がおこる際に同時にプロテ
ィンＣ遺伝子の増幅、それによるプロティンＣ産生の上
昇を期待することができる。
八で得られたプロティンＣを発現するクローンのうち発
現量の高いものを培養液中に加えた５ｎＭ、２５ｎＭ、
１００　ｎＭ、５００　ｎＭ、２ｔｔＭのＭＴＸで段階
的に選択することによりプロティンＣ産生が増幅したク
ローンを得た。ＭＴＸの濃度の上昇と共にプロティンＣ
産生の上ガがみられ５００　ｎＭ　　ＭＴＸ耐性株で約
１１μｇ／ｍｌの濃度で産生じ、もとの細胞の約５００
倍であった。
次に種々のクローン中に存在するプロティンＣ遺伝子の
コピー数をサザンブロツティング（Ｔ、　Ｍａｎｌａｔ
ｌｓら、　”Ｍｏ１Ｏｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ″　
−前出）の方法で解析した。プローブとして本発明のプ
ロティンＣ遺伝子の１．２　ＫｂｐのＢａｍＨＩ断片を
３２Ｐで標識して用いた。
細胞から抽出したＤＮＡをＢａｍＨＩで完全に消化し電
気泳動を行ないニトロセルロースフィルターにトランス
ファーしプローブとハイブリ、ダイゼーショ二ノを行な
った。ＭＴＸ耐性とプロティンＣ産生の上昇にともない
プロティンＣ遺伝子のコピー数の増加が観察され産生の
高いクローンでは３０−１００コピーが含まれていた。
ｄｈｒｒ遺伝子についても同様に解析し、やはりＭＴＸ
耐性の上昇にともなうそのコピー数の増加が観察された
。
Ｃ１産生されたヒトプロティンＣのウェスタンプロット
による解析 プロティンＣ産生細胞株より無血清培地を用いて培養上
清を調製し、ウェスタンプロットにより解析を行なった
。
還元条件下ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気電気泳動
後口トロセルロースフィルターランスファーし抗ヒトプ
ロティンＣ抗体を反応させた。
イムノリアクティブなヒトプロティンＣはそのうち約５
０〜６０％が４６〜Ｂ２Ｋｄを示す一本鎖ポリベブチド
であり、また約４０〜５０％がすでに４２ＫｄのＨ鎖お
よび２１ＫｄのＬ鎖からなる二本鎖へのプロセッシング
を受けていた。
一本鎖のポリペプチドの分子は、糖鎖付加による修飾の
程度が異なるため幅広いバンドとして検出されたと考え
られる。
Ｄ、産生されたヒトプロティンＣのγ〜カルボキシル化
と活性の測定 プロティンＣのγ−カルボキシル化は、とタミンＫに依
存した反応であること及びγ−カルボキシル化を受けた
タンパク質はクエン酸バリウム塩に吸着されることが知
られている。本発明によって得られたヒトプロティンＣ
産生株Ｂ３を、０．１μｇ　／　ｍ！ビタミンに３存在
下にて培養して得た培養上清とビタミンに３非存在下に
て培養して得た培養上清のイムノリアクティブ総プロテ
ィンＣそのクエン酸バリウム塩によって吸着される両分
、セリンプロテアーゼ活性および抗凝固活性を測定した
。正常ヒト血漿の値を基準にしてそれらの比活性を算出
した値は次の通りである。
（以下余白） ビタミンに３存在下に培養して得られるプロティンＣは
、γ−カルボキシル化される割合が高いこと、セリンプ
ロテアーゼ活性及び抗凝固活性の高いことが判明した。
４、図面のｆｆｆｌｆｌｉな説明 第１図はプロティンＣ遺伝子の構成断片を示す図である
。
第２図はｐＣｓ　１の制限酵素地図である。
第３図はｐＣｓ　２の制限酵素地図である。
特許出願人　　へキストジャバン株式会社ｐＣｓ　１　
（４，２ｋｂ　） 第２図 第３図

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）次の塩基配列を有するヒトプロテインＣをコード
    するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）。 【アミノ酸配列があります】
  2. （２）下記のＤＮＡが組み込まれたプラスミドベクター
    。 【アミノ酸配列があります】
  3. （３）下記のＤＮＡが組み込まれたプラスミドベクター
    により形質転換された宿主細胞。 【アミノ酸配列があります】
  4. （４）下記のＤＮＡが組み込まれたプラスミドベクター
    によりなるヒトプロテインＣの製造方法。 【アミノ酸配列があります】
JP62096341A 1987-04-21 1987-04-21 新しい塩基配列のヒトプロテインｃ遺伝子 Pending JPS63263083A (ja)

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