JPH05276952A - ヒトプロテインｃ発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の目的は、ヒトプロテインＣをコード
するＤＮＡ断片および該断片を用いたヒトプロテインＣ
発現ベクターを提供することにある。 【構成】 ヒトプロテインＣ遺伝子の有する８個のエキ
ソンの間に存在する７個のイントロンのうち、任意のＮ
個（Ｎ＝１〜６）のイントロン部分を除去し、その前後
の配列を接続してヒトプロテインＣをコードする新規な
ＤＮＡ断片、断片を含有する発現ベクターおよび該ベク
ターで形質転換した動物細胞を作成した。また、そのＤ
ＮＡ断片に残存するイントロン中に有用なＤＮＡ断片を
組み込むことで発現効率を向上させたヒトプロテインＣ
をコードするＤＮＡ断片も提供される。これらはヒトプ
ロテインＣ蛋白の産生に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトプロテインＣをコ
ードするＤＮＡ断片およびそれを用いたヒトプロテイン
Ｃ発現ベクターに関するものである。本発明の発現ベク
ターを用いて得たヒトプロテインＣまたはそれを活性化
して得られる活性化ヒトプロテインＣは、抗凝固剤また
は線溶促進剤として使用することができる。

【０００２】ここで、本明細書において、ＤＮＡの配列
はそれを構成する核デオキシリボヌクレオチドに含まれ
る塩基の種類で略記するものとし、たとえば下記の略号
を用いる。

【０００３】 Ａ アデニン（デオキシアデニル酸を示す。） Ｃ シトシン（デオキシシチジル酸を示す。） Ｇ グアニン（デオキシグアニル酸を示す。） Ｔ チミン（デオキシチミジル酸を示す。）

【０００４】

【従来の技術】プロテインＣは血漿セリンプロテアーゼ
前駆体の一種であって、血小板や血管内皮細胞の表面
で、トロンビンとそのレセプターであるトロンボモジュ
リンとの複合体による限定分解を受けて活性化され、セ
リンプロテアーゼである活性化プロテインＣ（以下ＡＰ
Ｃという）に変換される。

【０００５】ＡＰＣは血液凝固系の活性化第５因子およ
び活性化第８因子を選択的に分解することによって抗凝
固活性を発揮する。この活性はプロテインＳによって増
強されることが知られている。また、ＡＰＣは組織プラ
スミノーゲンアクチベータの阻害剤であるＰＡＩ―１を
切断することにより、線溶促進活性をもつと考えられて
いる。

【０００６】ヒトプロテインＣ遺伝子の塩基配列につい
ては、既にFosler DC Proc. Natl.Acad. Sci. USA, ８
２，４６７３―４６７７（１９８５）に、ヒトプロテイ
ンＣｃＤＮＡの塩基配列については、Nucleic Acids Re
s., １３，５２３３―５２４７（１９８５）に示されて
いる。

【０００７】ヒトプロテインＣのアミノ酸配列は既に、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA，８２，４６７３―４６７
７（１９８５）等で明らかなように、Ｇｌａドメインお
よびエピダーマルグロースファクター（ＥＧＦ）様ドメ
インをアミノ末端側に有する軽鎖（分子量約２１，００
０）と活性化ペプチドおよび触媒ドメインからなる重鎖
（分子量約４１，０００）とがジスルフィド結合したも
の（２本鎖型）である。

【０００８】ヒトプロテインＣの軽鎖は、アミノ末端Ａ
ｌａからカルボキシル末端のＬｅｕまで１５５個のアミ
ノ酸からなり、重鎖はアミノ末端のＡｓｐからカルボキ
シル末端のＰｒｏまで２６２個のアミノ酸からなってお
り、軽鎖と重鎖は細胞中で（Ｈ₂ Ｎ―）軽鎖―Ｌｙｓ―
Ａｒｇ―重鎖（―ＣＯＯＨ）の形で生合成され、細胞か
ら分泌される過程でＬｙｓ―Ａｒｇが切断され、２本鎖
化される。

【０００９】軽鎖と重鎖とは、軽鎖のアミノ末端から１
４１番目のＣｙｓと重鎖のアミノ末端から１２０番目の
Ｃｙｓとの間でジスルフィド結合で結合している。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明はヒトプロテイ
ンＣの発現に有用なＤＮＡ断片、該断片を用いた発現ベ
クター、該発現ベクターにより形質転換された動物細胞
および動物細胞を用いたヒトプロテインＣの製造方法を
提供することを目的とする。本発明はまた、効率的に発
現することのできるヒトプロテインＣをコードするＤＮ
Ａ断片の提供も目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明はヒトプロテイン
Ｃ遺伝子の有する８個のエキソンの間に存在する７個の
イントロンのうち、Ｎ個（Ｎ＝１〜６）のイントロン部
分を除去し、その前後の配列を接続してなるヒトプロテ
インＣをコードするＤＮＡ断片である。

【００１２】ヒトプロテインＣ遺伝子のエキソン６と
７、およびエキソン７と８との間に存在する２個のイン
トロンを除去してなる上記のＤＮＡ断片が好適である。
また、ヒトプロテインＣ遺伝子のエキソン３と４、エキ
ソン４と５、エキソン５と６、エキソン６と７およびエ
キソン７と８との間に存在する５個のイントロンを除去
してなる、上記のＤＮＡ断片が好適である。

【００１３】また本発明は、ヒトプロテインＣ遺伝子ま
たは上記のＤＮＡ断片が有するＮ個（Ｎ＝１〜７）のイ
ントロン部分のうち、いずれか一つまたは複数個のイン
トロン部分に、またはその一部を欠失させたイントロン
部分に、次に示すＤＮＡ断片； ａ．動物細胞において転写活性を促進するＤＮＡ断片、 ｂ．動物細胞においてＤＮＡの複製開始点となり得るＤ
ＮＡ断片、 ｃ．アデノウイルスのＶＡ遺伝子断片、 からなる群より選ばれた少なくとも一つを挿入したヒト
プロテインＣをコードするＤＮＡ断片を包含する。

【００１４】また本発明は、上記のＤＮＡ断片を動物細
胞中で発現させることを特徴とするヒトプロテインＣの
製造方法を包含する。

【００１５】また、本発明は、動物細胞へ導入し得る発
現ベクターであって、プロモーター、上記のＤＮＡ断
片、並びに必要に応じポリアデニレーションシグナルを
含有し、上記ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列の転写が前記プロ
モーターにより指令されるヒトプロテインＣ発現ベクタ
ーを包含する。

【００１６】本発明はさらに、上記の発現ベクターによ
り形質転換されているヒトプロテインＣ産生動物細胞を
包含する。細胞はＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細
胞、Ｃ１２７細胞および２９３細胞からなる群から選ば
れたものが好適である。

【００１７】形質転換される細胞は、本発明の発現ベク
ターによる形質転換の前後に他の発現ベクターにより、
他の形質転換がなされることもある。例えばヒトプロテ
インＣ発現ベクターを導入後、後述するｐＫＥＸ２―ｇ
ｐｔあるいはｐＶＡ―ｇｐｔを導入することができる。

【００１８】本発明の、ヒトプロテインＣ遺伝子は、特
開昭６２―１１１６９０号公報のＦｉｇ．４に記載され
た塩基配列（Proc. Natl. Acad. Sc; USA,８２，１９８
５の４６７４ページに示された塩基配列と同じ）の塩基
番号＋１番から８９７５番までの８９７５個塩基配列と
ほぼ同じものであるが、一部の塩基配列が異なってい
る。

【００１９】かかる遺伝子は８個のエキソン（エキソン
１〜８と呼ぶ）および７個のイントロン（イントロン１
〜７）とからなる。

【００２０】エキソン１は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基配
列において、１番のＡから７０番のＧまでの７０個の塩
基配列である。

【００２１】イントロン１は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基
配列において、７１番のＧから１３３３番のＧまでの１
２６３個の塩基配列において、次の点で異なるものであ
るが他の塩基は同じである。すなわち、 （１）１２７番のＧと１２８番のＣの間にＧがある。 （２）５３２番のＧと５３３番のＣの間にＡがある。 （３）７３３番のＣと７３４番のＡの間にＣがある。 （４）７６１番はＣではなくＧである。 （５）９８１番のＧと９８２番のＣの間にＧ，Ａがこの
順にある。 （６）１３００番のＴと１３０１番のＣの間にＣがあ
る。 （７）１３１８番のＣと１３１９番のＴの間にＣがあ
る。

【００２２】エキソン２は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基配
列において、１３３４番のＡから１５００番のＡまでの
１６７個の塩基配列である。

【００２３】イントロン２は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基
配列において、１５０１番のＧから２９６２番のＧまで
の１４６２個の塩基配列において、次の点で異なるもの
であるが他の塩基は同じである。すなわち、 （１）１７３９番のＣと１７４０番のＡの間にＣがあ
る。 （２）２１４１番のＧと２１４２番のＣの間にＧがあ
る。 （３）２３９８番のＧと２３９９番のＣの間にＧがあ
る。 （４）２６７２番のＧと２６７３番のＣの間にＣがあ
る。 （５）２９２７番のＧはない。

【００２４】エキソン３は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基配
列において、２９６３番のＣから２９８７番のＧまでの
２５個の塩基配列である。

【００２５】イントロン３は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基
配列において、２９８８番のＧから３０７９番のＧまで
の９２個の塩基配列である。

【００２６】エキソン４は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基配
列において、３０８０番のＡから３２１７番のＧまでの
１３８個の塩基配列である。

【００２７】イントロン４は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基
配列において、３２１８番のＧから３３１９番のＧまで
の１０２個の塩基配列である。

【００２８】エキソン５は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基配
列において、３３２０番のＡから３４５４番のＧまでの
１３５個の塩基配列において、３３４２番のＴがＧとな
ったものである。

【００２９】イントロン５は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基
配列において、３４５５番のＧから６１２２番のＧまで
の２６６８個の塩基配列である。

【００３０】エキソン６は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基配
列において、６１２３番のＴから６２６５番のＧまでの
１４３個の塩基配列である。

【００３１】イントロン６は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基
配列において、６２６６番のＧから７１３８番のＧまで
の８７３個の塩基配列である。

【００３２】エキソン７は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基配
列において、７１３９番のＧから７２５６番のＧまでの
１１８個の塩基配列である。

【００３３】イントロン７は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基
配列において、７２５７番のＧから８３８５番のＧまで
の１１２９個の塩基配列である。

【００３４】エキソン８は上記公報Ｆｉｇ．４の塩基配
列において、８３８６番のＧから８９７５番のＧまでの
５９０個の塩基配列である。

【００３５】本発明のＤＮＡ配列はヒトプロテインＣ遺
伝子から組み立てることができる。任意のイントロンを
除去することはサイトディレクテッド・ミュータジェネ
シス（site-directed mulagenesis ）法またはいわゆる
カセット変異法を用いて該イントロン部分に対する欠失
改変を行なうことで達成される。

【００３６】さらには実施例において示すように、ゲノ
ム型ヒトプロテインＣ遺伝子と、ヒトプロテインＣ ｃ
ＤＮＡの対応する部分に存在する、共通の制限酵素サイ
トを利用して、ゲノム型ヒトプロテインＣ遺伝子の一部
をヒトプロテインＣ ｃＤＮＡの一部と入れ替えること
によっても達成される。

【００３７】本発明のＤＮＡ配列の具体例としては、実
施例において示すように、エキソン６と７および７と８
の間にある２個のイントロンを除去したＤＮＡ配列、あ
るいはエキソン３と４、４と５、５と６、６と７および
７と８の間にある計５個のイントロンを除去したＤＮＡ
配列が挙げられる。

【００３８】なお一般に、イントロンの塩基配列は、そ
の一部分の変異がタンパクレベルでの変異につながらな
いため、タンパクをコードする領域の変異に比べてそう
した変異を有する固体が排除される可能性が少ない。従
ってイントロンの配列中には、人種、個体などの間で若
干の相違があることが考えられる。本発明のＤＮＡ断片
は、こうしたイントロンの配列の一部の相違を許容する
ものであり、前述のイントロンの配列に限定されると考
えてはならない。

【００３９】本発明のヒトプロテインＣをコードするＤ
ＮＡ断片には少なくとも一つのイントロンが存在する。
このイントロンの中には動物細胞の核内で何らかの作用
・効果を有するＤＮＡ断片を組み込むことができる。本
発明はかかる組換えを行なったＤＮＡ断片も包含する。

【００４０】動物細胞の核内で何らかの作用・効果を有
するＤＮＡ断片とは、例えばエンハンサー等の転写活性
を促進するＤＮＡ断片、動物ウイルス由来の複製開始
点、アデノウイルスＶＡ遺伝子が挙げられる。

【００４１】しかしながら、こうした組み込みにより、
イントロン中に存在するスプライシングのシグナルとな
るＤＮＡ配列に影響を与えてはならない。従って、こう
した組み込みは、イントロン中のスプライシングのシグ
ナルとなる配列以外の部分に対して行なわなければなら
ない。また、組み込むＤＮＡ断片は、スプライスアクセ
プタとなる配列を有していてはならない。

【００４２】この一方で、イントロン中のスプライシン
グのシグナルとなる配列以外の部分であれば、この組み
込みの前に、組換えの便宜などのため、一部の配列を除
去しておくことは許容する。また、特に機能を持たない
ＤＮＡ断片を同時に組み込むことも許容する。

【００４３】この組み込みは、イントロン中にある適当
な制限酵素サイトを利用して行われるほか、必要に応じ
てサイトディレクテッド ミュータジェネシス（site-d
irected mutagenesis ）法により適当な制限酵素サイト
を作り出してから行なうこともできる。その他合成ＤＮ
Ａをアダプタとして利用するなど一般的な遺伝子組換え
技術により達成される。

【００４４】動物細胞において転写活性を促進するＤＮ
Ａ断片とは例えばＳＶ４０、ヒトサイトメガロウイル
ス、ＢＫウイルス、ＥＢウイルス、単純ヘルペスウイル
ス、ＨＩＶなどの動物ウイルスが有するエンハンサー、
抗体の遺伝子が有するエンハンサーなど動物遺伝子由来
のエンハンサーが挙げられるが、必ずしも「エンハンサ
ー」の語に拘泥することはなく、こうした活性を有する
ＤＮＡ断片は全て含まれる。例えば、ＨＴＬＶ―１のＰ
４０Ｘに応答して転写活性を促進するＨＴＬＶ―１ Ｌ
ＴＲ中のＤＮＡ断片、メタロチオネイン―１遺伝子のプ
ロモーター領域に存在する、重金属イオンやグルココル
チコイドホルモンに応答して転写活性を促進するＤＮＡ
断片なども含まれる。

【００４５】動物細胞においてＤＮＡの複製開始点とな
り得るＤＮＡ断片としては、例えばＳＶ４０、ＢＫウイ
ルスといった動物ウイルスＤＮＡ中の複製開始点が挙げ
られる。

【００４６】アデノウイルスＶＡ遺伝子は、ＶＡＩ、Ｖ
ＡIIの２種類があり、このいずれかまたは両方を用いる
ことができる。ＶＡ遺伝子は転写されてＶＡ ＲＮＡと
なり、それが発現効率向上に資すると考えられている。

【００４７】本発明のＤＮＡ断片を用いてヒトプロテイ
ンＣ蛋白を得るために、上記のＤＮＡ断片は、宿主ベク
ター系に応じて適当に選ばれた発現用ベクターに組み込
まれる。そのような発現ベクターの具体例としては、バ
クテリア由来のプラスミド、バクテリオファージ由来の
ＤＮＡ、動物ウイルスのＤＮＡ等に適当な制御領域を組
み込んだベクター、たとえばアデノウイルス主要後期プ
ロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期
プロモーター、マウスメタオロチオネイン―１プロモー
ター、ＭＭＴＶ（マウス乳頭腫ウイルス）のプロモータ
ー、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）のプロモーター、ヒ
トβ―アクチンプロモーター、チキンβ―アクチンプロ
モーター等を組み込んだプラスミドベクターあるいはウ
シパピローマウイルス等のウイルス由来のベクター等が
用いられる。

【００４８】本発明のポリアデニレーションシグナルと
しては動物細胞中で機能するものであればよい。したが
って動物ウイルス由来のもの、動物の（ｃｌａｓｓ２）
遺伝子由来のポリアデニレーションシグナルであればよ
い。たとえばＳＶ４０の初期遺伝子領域に存在するポリ
アデニレーションシグナルが挙げられる。またヒトプロ
テインＣ遺伝子自体に存在するものを用いてもよい。

【００４９】前記ＤＮＡ断片のかかるベクターへの組み
込みはそれ自体既知の方法で行なうことができ、たとえ
ばMiura O. et al., J. Clin. Invest. 83, 1958-1604
(1989)等の文献に記載の方法によって行なうことができ
る。

【００５０】一方、宿主用の動物細胞としてはヒトまた
はヒト以外の動物細胞のいずれであってもよく、例えば
ＣＨＯ，Ｃ１２７，ＢＨＫ，Ｃｏｓ１，Ｃｏｓ７，Ｌ
Ｍ，ＮＩＨ３Ｔ３，２９３，ＨｅＬａ等があげられ、中
でもＣＨＯ，ＢＨＫ，２９３が好ましい。

【００５１】上記発現型ベクターのこれら細胞へのトラ
ンスフェクションも、また当該分野でよく知られたそれ
自体公知の方法によって行なうことができ、例えばSpan
didos D.A. and Wilkie N.M., Expression of Exogenou
s DNA in Mammalian Cells,Ed. Hames B.D. and Higgin
s S.J. Transcription and Translation, IRL Press, O
xford, ppl-48等の文献記載の方法によって行なうこと
ができる。

【００５２】かくして得られる形質転換細胞を、それぞ
れの細胞に適合した条件下に常法で培養することにより
その培養液から目的とする蛋白を回収することができ
る。

【００５３】本発明によって得られるヒトプロテインＣ
の定量法は特開昭６１―２８３８６８号公報によって示
された方法を用いることができる。この方法によれば、
ＧｌａをもつヒトプロテインＣのみを測定することもで
きる。

【００５４】本発明によって得られるヒトプロテインＣ
の精製には、バリウム吸着法、イオン交換クロマトグラ
フィー法を利用することができるが、カルシウムイオン
によるＧｌａドメインのコンホメーション変化を認識す
る抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体を使用したア
フィニティカラムクロマトグラフィーを用いるのが特に
好ましい（特開昭６４―８５０９１号公報参照）。

【００５５】この方法は、Ｇｌａを有するヒトプロテイ
ンＣのみを精製できる点と、ＥＤＴＡという温和な溶離
剤が使える点で優れた方法である。

【００５６】ヒトプロテインＣからＡＰＣへの変換は、
プロテインＣ活性化酵素によりヒトプロテインＣの重鎖
のアミノ末端（以下Ｎ末という）から１２番目のアミノ
酸から重鎖のＮ末のアミノ酸までの活性化ペプチドが除
去されることによっておこなわれる。

【００５７】ここでプロテインＣ活性化酵素としては、
トロンビン、トロンビン―トロンボモジュリン複合体、
蛇毒等が挙げられる。

【００５８】

【発明の効果】本発明のヒトプロテインＣ発現ベクター
を用いることにより、血漿由来のヒトプロテインＣでは
問題となり得るウイルス混入の問題が解消される。また
原料を人血に求める必要がなくなり、安定的な供給を達
成することができる。

【００５９】一般に、ｃＤＮＡを動物細胞において発現
させる際には、その５′側または３′側の非コード領域
にスプライスドナー（splice doner）およびアクセプタ
（acceptor）を人工的に付加することが行なわれるが、
本発明のＤＮＡ断片を用いる場合にはその必要がない。

【００６０】これまで、ヒトプロテインＣのｃＤＮＡを
動物細胞で発現させる系においてｃＤＮＡの配列の一部
を改変することにより、種々の改変ヒトプロテインＣタ
ンパクを製造することが行なわれている。

【００６１】例えば、２本鎖化率を向上させる目的で、
コネクティングペプチド（Ｌｙｓ（１５６）Ａｒｇ（１
５７））の部分を改変したもの（特開昭６４―８５０８
４号公報）、活性化プロテインＣを直接発現させるため
に、活性化ペプチド部分を欠失させたもの、またはさら
にその近傍を改変したもの（特開平２―２３３８号公
報、特開平２―２３７２号公報）が挙げられる。

【００６２】これらのものは、エキソン６の配列の一部
を改変したものに相当することから、本発明のＤＮＡ断
片において、エキソン６の部分を天然型のＤＮＡ断片に
かえて、上記の改変に対応する改変を行なったＤＮＡ断
片とすることで、これらのものと同一の改変ヒトプロテ
インＣを得ることができる。すなわち、２本鎖化率の向
上したヒトプロテインＣや、活性化ヒトプロテインＣの
直接発現が可能である。

【００６３】このほか、ヒトプロテインＣ ｃＤＮＡに
おいて上記の例以外の改変を行なって得られる改変ヒト
プロテインＣも、本発明のＤＮＡ断片において、対応す
る改変を行なったものを用いることで製造することがで
きる。

【００６４】動物細胞の各遺伝子は、常に一定のレベル
で発現しているわけではない。ある特定の組織に分化し
た細胞においてのみ発現する遺伝子もあれば、特定の分
化段階でのみ、あるいは分化開始前においてのみ発現す
るものもある。

【００６５】また細胞の外部の環境によりその発現が変
化する遺伝子もある。例えば、グルコース濃度などの栄
養状態、温度、金属イオンの濃度、あるいはホルモン、
サイトカインといった生体内の情報伝達物質によって、
その発現量が増大または減少するものがある。生体は生
命活動の維持のため、こうした遺伝子発現の調節を通じ
て自己の置かれた環境に対応しているのである。

【００６６】このような、動物細胞における遺伝子発現
の制御には、多段階の精緻なメカニズムが関与してい
る。そのひとつは転写段階での調節である。その遺伝子
のプロモーター／エンハンサー領域と核内のＤＮＡ結合
タンパクとの相互作用を通じて、転写が制御されるので
ある。

【００６７】この場合、こうしたＤＮＡ結合タンパクの
種類や量が、細胞の外部環境、分化の方向や程度を反映
して変化するのである。あるいはまた、ｍＲＮＡの半減
期を変化させることによっても発現量が調節されてい
る。例えば、エストロジェンの存在で半減期が大きく延
びるｍＲＮＡが知られている。

【００６８】そのほか、ｍＲＮＡの核内から細胞質への
移行、翻訳、生成したタンパクの細胞内輸送の段階など
でも制御を受けていると考えられる。

【００６９】ところで、動物細胞の遺伝子のほとんどは
イントロンを有している。この配列は転写後核内におい
て除去されるのであるが、この段階はまた、動物細胞に
対し、その遺伝子発現を制御しうる機会を与えていると
考えられる。

【００７０】こうしたことから、動物細胞における物質
生産において、genomic ＤＮＡを用いることは、スプラ
イシングの効率あるいはそれに関係するｍＲＮＡの核内
から細胞質中への移行の効率の調節を通じて発現量を制
御できるという意味で、ｃＤＮＡを用いた発現に比べて
有利である。

【００７１】ここで、発現量を制御できることは、例え
ば細胞の数を増やす段階など目的のタンパクを合成する
ことが不要なときは、その生産を抑制することでタンパ
ク合成のメカニズムを細胞分裂など他の方に向けてお
き、必要となったら目的のタンパクの合成に向わせるこ
となどに応用できる。しかしながら一般にgenomic ＤＮ
Ａの発現効率はｃＤＮＡのそれに比べて低いことが多
い。本発明のＤＮＡ断片は実用レベルの発現量を確保し
つつ、発現量を細胞外からコントロールできるようにし
たものである。

【００７２】本発明のＤＮＡ断片はまた、転写制御に関
係する配列の「置き場所」を提供するものである。エン
ハンサー等の転写を調節するＤＮＡ配列は、それをプロ
モーターの近辺に置くことにより、効果を発揮するので
あるが、その位置はプロモーターの上流側のほか、転写
開始点の下流側でも効果のあるものが知られている。抗
体のエンハンサーが一例として挙げられる。

【００７３】ここで、ｃＤＮＡを用いた発現の場合に
は、タンパクの一次構造を変えないため、こうしたＤＮ
Ａ配列は、転写開始点から翻訳開始点までの間に置く必
要がある。しかしながら、この場合には、転写開始点か
ら翻訳開始点までの距離が長くなるため、翻訳の効率が
低下する恐れがある。

【００７４】これに対して本発明のＤＮＡ断片において
は、そのイントロン中の配列であれば一部を置換、挿入
により改変してもタンパクの一次構造を変化させないこ
とから、こうしたエンハンサー等の転写を調節する配列
を組み込んでも問題がない。

【００７５】この場合には、転写開始点から翻訳開始点
までの配列は、翻訳効率にとって最も好ましい長さ、配
列とすることができる。

【００７６】一方、genomic ＤＮＡを用いる場合にも同
様なことが可能であるが、前述のように発現効率がもと
もと低いという問題がある。本発明のＤＮＡ断片を用い
た場合には実用的な発現レベルを確保しつつ、エンハン
サー等の配列を組み込むことが可能である。

【００７７】同様な「ＤＮＡ配列の置き場所」という考
え方は例えばアデノウイルスのＶＡ遺伝子、ＳＶ４０な
どのポリオーマウイルス等の複製開始点を組み込む場合
にも適用できる。ＶＡ遺伝子は、プロモーターとしてア
デノウイルスの主要後期プロモーターを用いる場合に産
生量を上昇させ得る配列である。

【００７８】本発明のＤＮＡ断片のイントロン中にこの
配列を組み込んだ発現ベクターを動物細胞にトランスフ
ェクトし、目的のタンパクの発現を指標としてスクリー
ニングした場合、目的のタンパクを発現している細胞の
染色体ＤＮＡには事実上必ずＶＡ遺伝子が含まれている
と考えてよい。

【００７９】これに対し、あるタンパクの転写ユニット
の外部にＶＡ遺伝子を挿入した発現ベクターを用いた場
合には、ＶＡ遺伝子が同一ベクター上にあった場合で
も、目的のタンパクを産生している細胞がＶＡ遺伝子を
含んでいるとは限らない。発現ベクターが染色体ＤＮＡ
に組み込まれる過程で複雑な組み換えが起こる場合があ
るからである。

【００８０】当然のことながら、目的のタンパクの転写
ユニットを有する発現ベクターと、ＶＡ遺伝子を有する
プラスミドとをコトランスフェクション（cotransfecti
on）する場合にも、目的のタンパクが発現しているから
といって、ＶＡ遺伝子がそのタンパクを発現している細
胞の染色体に組み込まれているとはいえない。

【００８１】なお、ある細胞にＶＡ遺伝子が組み込まれ
ているか否かの判定は、サザンハイブリダイゼーション
法などによってすることができる。しかし、本発明のＤ
ＮＡ断片のイントロン中にＶＡ遺伝子を挿入した発現ベ
クターを用いる場合には、目的のタンパクの発現の有無
を指標として調べることができるため、ＥＬＩＳＡ等
の、より簡便で同時に多検体が調べられる方法が使える
ので有利である。

【００８２】特に目的のタンパクが分泌タンパクである
場合には、サザンハイブリダイゼーション法では必ず細
胞を破壊してそのＤＮＡを抽出しなければならないのに
対し、その細胞の培養上清を採取するだけで足りるので
有利である。

【００８３】なお、イントロン中に挿入したＶＡ遺伝子
が細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた場合でも、それが
転写されてＶＡ ＲＮＡを生ずるのは当然であって、目
的のタンパクをコードするｍＲＮＡがスプライシングを
受けることとは関係しない。

【００８４】同様なことは、複製開始点を本発明のＤＮ
Ａ断片のイントロン中に組み込む場合にもあてはまる。
例えばＳＶ４０の複製開始点をなすＤＮＡ断片を組み込
んだ発現ベクターを、動物細胞の染色体ＤＮＡにインテ
グレーションさせたうえで、その細胞中でＳＶ４０のＴ
抗原を発現させると、その複製開始点からＤＮＡの複製
を起こさせることができ、近傍においた目的のタンパク
の転写ユニットのコピー数を増大せしめ、その結果発現
量を増すことができる。

【００８５】この場合において、本発明のＤＮＡ断片の
イントロン中にこうした複製開始点をなすＤＮＡ断片を
挿入した発現ベクターを用いる場合には、目的のタンパ
クが発現していることをもって、複製開始点も動物細胞
の染色体ＤＮＡに組み込まれていると考えてよいこと
は、ＶＡ遺伝子の場合と同様である。

【００８６】なお、ＶＡ遺伝子の場合には、動物細胞の
染色体のどこかに組み込まれれば機能すると考えてよい
が、この複製開始点の場合には、それが機能するには、
目的のタンパクの転写ユニット（プロモーター領域、タ
ンパクのコード領域、ポリＡ付加シグナルなどの一連の
ＤＮＡ配列のセット）の近傍に位置している必要があ
る。

【００８７】しかしながら、サザンハイブリダイゼーシ
ョン法などの方法では、複製開始点が動物細胞の染色体
のどこかにあるという情報しか得られない。これに対
し、本発明のＤＮＡ断片を用いた場合には、目的のタン
パクの発現をもって、複製開始点が事実上必ず、目的の
タンパクの転写ユニットの中にあるといえるのである。

【００８８】本発明のＤＮＡ断片を用いる場合にはさら
に、複製開始点の位置を目的のタンパクの転写ユニット
の中央付近にもってくることができるため、より効率的
に遺伝子増幅が行なえることが期待できる。なお、イン
トロン中に挿入した複製開始点が細胞の染色体ＤＮＡに
組み込まれた場合でも、その染色体中で複製開始点とし
て機能するのは当然であって、目的のタンパクをコード
するｍＲＮＡがスプライシングを受けることとは関係し
ない。

【００８９】これらアデノウイルスのＶＡ遺伝子、ポリ
オーマウイルス等の複製開始点をgenomic ＤＮＡのイン
トロン中に組み込んだ場合でも上述の効果は期待できる
のであるが、その場合には目的のタンパクの発現効率が
低くなるという問題点を有する。しかし、本発明のＤＮ
Ａ断片を用いた場合には、実用的な発現レベルを確保し
たうえで、上述のことが可能なのである。

【００９０】次に実施例を掲げて本発明を詳述するが、
本発明はそれらに何等限定されない。

【００９１】

【実施例】本発明の実施例では、次の方法を用いた。

【００９２】ＤＮＡの切断 １μｇのプラスミドＤＮＡまたはＭ１３ファージのレプ
リカティブ・フォーム（ＲＦ）ＤＮＡまたはＤＮＡ断片
の切断は、１０μｌの緩衝液中、４〜１０単位の制限酵
素を用い、メーカーにより指定された温度で２時間保つ
ことにより行なった。緩衝液は、制限酵素に付属のもの
を用いた。

【００９３】ＤＮＡ断片の分離および回収 制限酵素で切断したＤＮＡ断片は、サブマリン型電気泳
動槽を用いたアガロースゲル電気泳動で分離した。目的
のＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを切り出し、GENECL
EAN II（商標登録）（Ｂｉｏ １０１社）を用いて回収
した。方法は添付の説明書に従った。なお、特にことわ
らない限り、アガロースゲルは０．８％のものを用い
た。

【００９４】ＤＮＡ断片の結合 ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用いて行なっ
た。方法は、添付の説明書に従った。

【００９５】ＤＮＡ断片の平滑末端化 ＤＮＡブランティング（Blunting）キット（宝酒造）を
用いて行なった。方法は添付の説明書に従った。

【００９６】大腸菌の形質転換 大腸菌ＨＢ１０１株のコンピテントセル（宝酒造）に、
２０μｌ以下のＤＮＡ溶液を加え、１時間氷上に置い
た。次に４２℃の水浴に１分間つけたあと、再び氷上に
５分間置いた。これを１mlのＬ―ブロスに加え、１時間
振盪培養した後、その一部（５０〜３００μｌ）を、ア
ンピシリンプレート（Ｌ―ブロス、寒天１５ｇ／リット
ル、アンピシリン５０μｇ／ml）にまいて一晩３７℃で
培養し、コロニーを作らせた。

【００９７】プラスミドＤＮＡの小スケール調製 アルカリ溶菌法（『Molecular Cloning 』（T. Maniati
s, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982）Ｐ３６８参
照）による調製を行った。必要に応じて前述の『GENECL
EAN II（商標登録）』による精製を行った。

【００９８】プラスミドＤＮＡの大スケール調製 アルカリ溶菌法（『Transcription and Translation 』
（B.D. Hames, IRL press, 1984 ）Ｐ８参照）およびＣ
ｓＣｌ平衡密度勾配遠心法によって行った。ここで、超
遠心用ローターは日立製ＲＰ―６７ＶＦバーチカルロー
ターを用いた。またＣｓＣｌの除去は透析によらず、Ｔ
Ｅ（１０mM Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ pH８．０，１mM ＥＤ
ＴＡ）で４倍に希釈後、エタノール沈澱を２回すること
で代えた。

【００９９】ＤＮＡの塩基配列の決定 塩基配列決定をすべきＤＮＡ断片をバクテリオファージ
Ｍ１３に組み込むことにより、一本鎖ＤＮＡを得た。

【０１００】この方法はアマシャム社「Ｍ１３クローニ
ングキット」に添付の説明書に記されている。また一本
鎖ＤＮＡの大量調製法は同社「Oligonucleotide-direct
ed in vitro mutagenesis system）に添付の説明書に記
載の方法によった。こうして得た一本鎖ＤＮＡをテンペ
レートとし、後述の方法で調製した調べたい領域の近傍
の合成ＤＮＡ２０ｍｅｒをプライマーとして、アプライ
ド バイオシステムズ社「Dye Deoxy ^TM Terminator Ta
q Sequencing kit」を用い、シークエンシング反応を行
った。

【０１０１】この反応で得られたサンプルを、アプライ
ド バイオシステムズ社３７３Ａ型ＤＮＡシーケンサー
を用いて解析することにより、塩基配列を決定した。

【０１０２】ＤＮＡ断片の化学合成およびその精製 アプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ型ＤＮＡ合成
装置で『Ｔｒ ＯＮ，ＡＵＴＯ』の条件で合成した。そ
の精製には同社製『オリゴヌクレオチド精製カートリッ
ジ』を添付の説明書に従って使用した。

【０１０３】本発明のＤＮＡ断片、発現ベクターを作製
するにあたり、以下のプラスミドまたはＤＮＡ断片を用
いた。

【０１０４】ｐＤＸ／ＰＣ Foster, D.C. et al., Biochemistry 26, 7003-7011 (1
987)あるいは特開昭６２―１１１６９０号公報に記載さ
れているもので、アデノウイルス２型主要後期プロモー
ターおよびその下流に完全長ヒトプロテインＣ ｃＤＮ
Ａを有するヒトプロテインＣ発現ベクターである。

【０１０５】なお、この発現ベクターを構成する機能部
分については、Busby, S. et al.,Nature, 316, 271-27
3 (1985) およびBerkner, K.L. et al., Nuc. Acids Re
s.,13, 841-857 (1985) において述べられている。

【０１０６】ヒトプロテインＣ genomicＤＮＡ ヒトプロテインＣ genomicＤＮＡは特開昭６２―１１１
６９０号公報において示されている。

【０１０７】このうち、以下の実施例においては、エキ
ソン２とエキソン３との間にあるイントロン中のＥｃｏ
ＲＩサイトから、その上流側約４．４ｋｂｐの所に位置
するＥｃｏＲＩサイトまでのＤＮＡ断片（以下Ｒ４．４
―１と称する）、およびエキソン２とエキソン３との間
のイントロン中のＥｃｏＲＩサイトから、エキソン７と
エキソン８との間のイントロン中にあるＥｃｏＲＩサイ
トまでの約６．２ｄｂｐのＤＮＡ断片（以下Ｒ２―１４
と称する）を、ＰＵＣ９のＥｃｏＲＩサイトにサブクロ
ーニングしたうえで用いている。

【０１０８】Ｚｅｍ２２８，Ｚｅｍ２２９ これらの発現ベクターは、特開平２―２３３８号公報に
おいて示されているもので、マウスメタロチオネインＩ
遺伝子のプロモーターを用いている。さらに、これらの
発現ベクターはそれぞれネオマイシン耐性遺伝子、ジヒ
ドロ葉酸リダクターゼ遺伝子を選択マーカーとして有し
ている。

【０１０９】ｐＳＶ２―ｄｈｆｒ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）にＮｏ．３７１４６で登録されているものであ
る。

【０１１０】２２８／ＰＣ５９４ 前述のＺｅｍ２２８のＢａｍＨＩサイトにヒトプロテイ
ンＣ ｃＤＮＡを挿入したヒトプロテインＣ発現ベクタ
ーである。このヒトプロテインＣ ｃＤＮＡは前述のＰ
ＤＸ／ＰＣの中のものと同一である。

【０１１１】２２９／ＰＣ９６２ 前述のＺｅｍ２２９のＢａｍＨＩサイトに、改変ヒトプ
ロテインＣ ｃＤＮＡＰＣ９６２を挿入した、改変ヒト
プロテインＣ発現ベクターである。ＰＣ９６２は、特開
昭６４―８５０８４号公報において示されている。

【０１１２】Ｒｃ／ＣＭＶ インビトロジエン（Invitrogen）社から購入したもので
ある。

【０１１３】ＫＥＸ２ ＫＥＸ２遺伝子は特開平２―２３３８号公報においてＫ
ＥＸ２／Ｚｅｍ２２８として示されているプラスミド
中、ＫＥＸ２と表示されている部分である。

【０１１４】ｐＳＶ２―ｇｐｔ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）にＮｏ．３７１４５で登録されているものであ
る。

【０１１５】

【実施例１】 ヒトプロテインＣ発現ベクターの作製（１）２２８／ＡＣ―ＰＣ９００１の作製 ２２８／ＰＣ５９４のネオマイシン耐性遺伝子の中にあ
るＢａｌＩサイトを除去するために、２２８／ＰＣ５９
４をＡａｔＩおよびＣｌａＩで消化し、生じたＤＮＡ断
片の末端を平滑末端化した。

【０１１６】大きい方の断片を分離し、分子内でライゲ
ーション後、大腸菌ＨＢ１０１に導入することによりこ
のプラスミドを増やした。次にこのプラスミドをＢａｌ
ＩおよびＳａｃII（いずれの切断部位もプロテインＣ
ｃＤＮＡの中にのみ存在する。）で消化し、大きい方の
ＢａｌＩ―ＳａｃII断片を回収した。

【０１１７】一方、前述のＲ４．４―１，Ｒ２―１４を
ＰＵＣ９にサブクローニングしたプラスミドをそれぞ
れ、ＢａｌＩとＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ，ＳａｃIIとＥｃ
ｏＲＩで消化したものから、それぞれ約１．６５ｋｂｐ
のＢａｌＩ―ＥｃｏＲＩ断片、約４．５ｋｂｐのＥｃｏ
ＲＩ―ＳａｃII断片を回収した。

【０１１８】これらのＤＮＡ断片と、前述のＢａｌＩ―
ＳａｃII断片とを３分子ライゲーションすることで、２
２８／ＡＣ―ＰＣ９００１を得た。従って、この発現ベ
クターは、ヒトプロテインＣ遺伝子のうち、エキソン６
とエキソン７およびエキソン７とエキソン８との間の２
つのイントロンを除いたものを有する。なお、この発現
ベクターはネオマイシン耐性遺伝子の大部分を失ってい
る。

【０１１９】（２）２２９―ＰＣ９００２の作製 前述のＲ４．４―１をＰＵＣ９にサブクローニングした
プラスミドをＢａｌＩとＥｃｏＲＩとＰｓｔＩとで消化
し、約１．６５ｋｂｐのＢａｌＩ―ＥｃｏＲＩＤＮＡ断
片を回収した（これをＡ断片とする）。

【０１２０】一方、前述のＲ２―１４をＰＵＣ９にサブ
クローニングしたプラスミドをＸｃｙＩで消化後、アル
カリ性ホスファターゼで脱リン酸化し、さらにＥｃｏＲ
Ｉで消化後、約１．２２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ―ＸｃｙＩ
ＤＮＡ断片を回収した（これをＢ断片とする）。

【０１２１】次に、Ａ断片とＢ断片とをライゲーション
したものをＢａｌＩで消化し、約２．８７ｋｂｐのＢａ
ｌＩ―ＸｃｙＩ ＤＮＡ断片を回収後、それをＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）でリン酸化した（これ
をＣ断片とする）。また、前述の特開昭６２―１１１６
９０号公報（あるいはProc. Natl. Acad.Sci, USA, 82,
1985の４６７４ページ）に示されたヒトプロテインＣ
遺伝子の配列のうち、ＸｃｙＩ（２９０２残基目）から
ＢｓｔＥII（３０８２残基目）までの配列であって、エ
キソン３とエキソン４との間のイントロンを除去した形
のものを化学合成した。

【０１２２】正、逆両ストランドのうち、逆ストランド
のＤＮＡ断片のみをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリ
ン酸化した後、両ストランドをアニーリングした（これ
をＤ断片とする）。一方、前述の２２８／ＰＣ５９４
を、ＳａｃIIとＢｓｔＥIIとで消化したものから、２％
アガロースゲル電気泳動法で、約０．３６ｋｂｐのＢｓ
ｔＥII―ＳａｃII ＤＮＡ断片を分離した（これをＥ断
片とする）。

【０１２３】Ｄ断片とＥ断片とをライゲーションしたも
のをＳａｃIIで消化し、２％アガロースゲル電気泳動法
で、約０．４５ｋｂｐのＸｃｙＩ―ＳａｃII ＤＮＡ断
片を回収した後、それをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸化した（これをＦ断片とする）。

【０１２４】さらに、前述の２２９／ＰＣ９６２をＢａ
ｌＩとＳａｃIIとで消化したものから、大きい方の断片
を回収した（これをＧ断片とする）。最後に、Ｃ断片、
Ｆ断片およびＧ断片を３分子ライゲーションすることに
より２２９―ＰＣ９００２を得た。この発現ベクター
は、ヒトプロテインＣ遺伝子のうち、エキソン１とエキ
ソン２、エキソン２とエキソン３との間の２つのイント
ロン以外のイントロンを除去したものを、マウスメタロ
チオネインＩプロモーターによって発現させるもので、
ｄｈｆｒの転写ユニットを同一プラスミド上に有するも
のである。

【０１２５】（３）ＴＺｍ１―９００２の作製 前述のＺｅｍ２２８は２ケ所のＥｃｏＲＩサイトを有す
るが、ＥｃｏＲＩでの部分消化により、そのうちの１ケ
所のみ切断を受けたものをアガロースゲル電気泳動法に
より回収した。

【０１２６】このＤＮＡ断片を平滑末端化したのち、セ
ルフライゲーションさせた。これを大腸菌に導入して増
殖させた後回収し、ＥｃｏＲＩで完全消化後、再び平滑
末端化し、さらにセルフライゲーションさせ、大腸菌に
導入することでこのプラスミドを増やした。こうして２
ケ所のＥｃｏＲＩサイトを消失させた。

【０１２７】次に、このプラスミドの中の１ケ所のＢａ
ｍＨＩサイトに、ＢａｍＨＩ切断末端を両端に有し、内
部にＥｃｏＲＩサイトを有する短い２本鎖合成ＤＮＡ
（アダプター）を挿入することにより、ＥｃｏＲＩ切断
部位をマウスメタロチネインＩプロモーターの直下流側
に有する発現ベクターＺｅｍ２２８Ｒを作製した。

【０１２８】次に、このＺｅｍ２２８ＲをＥｃｏＲＩと
ＨｉｎｄIII とで消化し、アガロースゲル電気泳動法に
より大きい方の断片を回収した。また前述のｐＤＸ／Ｐ
Ｃの中の１．０３ｋｂｐのＨｉｎｄIII ―ＥｃｏＲＩ断
片を回収し、両断片をライゲーションすることでＺｍＢ
３を得た。この発現ベクターは、ネオマイシン耐性遺伝
子の転写ユニットと共に、アデノウイルス主要後期プロ
モーターを有する。このＺｍＢ３をＥｃｏＲＩ及びＣｌ
ａＩで消化し、ネオマイシン耐性遺伝子を有する大きい
方の断片を分離した（これをＨ断片とする）。また、２
２９―ＰＣ９００２をＢａｌＩ及びＣｌａＩで消化し、
大きい方の断片を回収した（これをＩ断片とする）。

【０１２９】さらに、前述の２２９／ＰＣ９６２をＥｃ
ｏＲＩ及びＢａｌＩで消化し、２％アガロースゲル電気
泳動法により小断片を回収した（これをＪ断片とす
る）。Ｈ断片とＩ断片とＪ断片とを３分子ライゲーショ
ンすることでＴＺｍ１―９００２を得た。

【０１３０】この発現ベクターは、ヒトプロテインＣ遺
伝子のうち、エキソン１とエキソン２、エキソン２とエ
キソン３との間の２つのイントロン以外のイントロンを
除去したものを、アデノウイルス主要後期プロモーター
によって発現させるもので、ネオマイシン耐性遺伝子の
転写ユニットを同一プラスミド上に有するものである。

【０１３１】（４）２２８―ＰＣ９００１の作製 ２２８／ＡＣ―ＰＣ９００１をＫｐｎＩとＳａｃIIで消
化して得た小断片、２２９―ＰＣ９００２をＳｆｉＩと
ＫｐｎＩで消化して得た小断片、および２２８／ＰＣ５
９４をＳｆｉＩとＳａｃIIで消化して得た大断片とを３
分子ライゲーションすることで２２８―ＰＣ９００１を
得た。

【０１３２】この発現ベクターは、ヒトプロテインＣ遺
伝子のうち、エキソン６とエキソン７およびエキソン７
とエキソン８の間にある２つのイントロンを除去したも
のを、マウスメタロチオネインＩプロモーターによって
発現させるもので、ネオマイシン耐性遺伝子の転写ユニ
ットを同一プラスミド上に有するものである。

【０１３３】（５）２２８―ＰＣ９００２の作製 ２２９―ＰＣ９００２をＳｆｉＩとＳａｃIIで消化して
得た小断片と、２２８／ＰＣ５９４をＳｆｉＩとＳａｃ
IIで消化して得た大断片とをライゲーションすること
で、２２８―ＰＣ９００２を得た。

【０１３４】この発現ベクターは、ヒトプロテインＣ遺
伝子のうち、エキソン１とエキソン２、エキソン２とエ
キソン３との間の２つのイントロン以外のイントロンを
除去したものを、マウスメタロチオネイン１プロモータ
ーによって発現させるもので、ネオマイシン耐性遺伝子
の転写ユニットを同一プラスミド上に有するものであ
る。

【０１３５】（６）ＴＺｍ４―ＰＣ９００２の作製 ＴＺｍ４―ＰＣ９００２は、前記のＴＺｍ１―ＰＣ９０
０２の配列中、アデノウイルス由来の三分節リーダー配
列のうち、第２番目の分節の初めから、ヒトプロテイン
Ｃの翻訳開始点の上流側３７残基目までの配列を欠失さ
せたものである。ここで、ヒトプロテインＣの翻訳開始
点の上流側の配列は、Beckmann等、Nuc.Acids Res., 1
3, 5233 (1985)に示されたものである。

【０１３６】すなわち、ＴＺｍ４―ＰＣ９００２は、こ
の三分節リーダー配列のうち第一分節のみを有し、第
二、第三分節の配列、およびその下流にあるスプライス
ドナー（splice doner）を含む配列、およびスプライス
アクセプター（splice acceptor ）を含む配列、さらに
はヒトプロテインＣ ｃＤＮＡの５′側非翻訳領域の一
部の配列が除かれたものである。

【０１３７】この欠失改変は、転写開始点から翻訳開始
点までの距離を短くすることで、翻訳効率を上昇させる
こと、およびイントロンを除去することで、スプライシ
ングの負荷を減少させることにより、ヒトプロテインＣ
の発現効率を上昇させることを企図したものである。

【０１３８】ここで、本発明のヒトプロテインＣをコー
ドするＤＮＡ配列には、イントロンが含まれているた
め、非翻訳領域に新たにイントロンを挿入する必要がな
いことに留意すべきである。この欠失改変は以下に述べ
るいわゆるカセット変異法によって行った。

【０１３９】ＴＺｍ１―ＰＣ９００２をＳａｃII、続い
てＰｍａＣＩで消化し、大きいＤＮＡ断片を分離した
（これをＫ断片とする）。一方、ＴＺｍ１―ＰＣ９００
２の有するアデノウイルス主要後期プロモーター配列中
のＰｍａＣＩサイトからヒトプロテインＣをコードする
ＤＮＡ配列の中のＢａｌＩサイトまでの配列から、欠失
させるべき部分を除いた配列である２本鎖ＤＮＡ断片を
化学合成した。

【０１４０】この合成は３つの部分に分けて行ない、
５′側末端のリン酸化、アニーリング、ライゲーション
を常法により行なうことで、一本のＤＮＡ断片とした。

【０１４１】なお、上流側の末端は、ＰｍａＣＩで切断
を受けた形で作製したのであるが、下流側はＢａｌＩで
切断を受けた形ではなく、ＢａｌＩの認識部位の６残
基、およびその下流に２残基のスペーサー配列（Ｇ，
Ｃ）を介してＳａｌIIで切断を受けた形の配列を有する
形で作製した。

【０１４２】この合成したＰｍａＣＩ―ＳａｃII断片
と、Ｋ断片とをライゲーション後、大腸菌ＨＢ１０１に
導入した。こうして得られたプラスミドを、ＢａｌＩで
消化し、生成した小さい方の断片を回収した（これをＬ
断片とする）。

【０１４３】なお、このプラスミドの有する２つのＢａ
ｌＩサイトは、ネオマイシン耐性遺伝子中、および前述
の合成ＤＮＡ中のものである。次にＴＺｍ１―ＰＣ９０
０２をＢａｌＩで消化し、続いてアルカリ性ホスファタ
ーゼで脱リン酸化後、大きい方のＤＮＡ断片を回収し
た。このＤＮＡ断片とＬ断片とをライゲーションするこ
とによりＴＺｍ４―ＰＣ９００２を得た。

【０１４４】（７）ＴＺｍ５―ＰＣ９００２の作製 ＴＺｍ１―ＰＣ９００２をＢａｌＩとＸｂａＩとＣｌａ
Ｉとで消化し、４．６６ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離した
（これをＭ断片とする）。一方ＴＺｍ１―ＰＣ９００２
に置けるヒトプロテインＣの開始コドンの下流約３０ｂ
ｐの所のＢａｌＩ切断部位から上流側１０３ｂｐの部分
を有し、かつその上流側末端にＨｉｎｄＩＩＩで切断さ
れた形のＤＮＡ部分を有する形のＤＮＡ断片を２つの部
分に分けて合成した。４本の合成ＤＮＡは５′末端をリ
ン酸化後、アニーリングし続いてライゲーションを行な
った。ＢａｌＩおよびＨｉｎｄIII で消化後、２％アガ
ロースゲル電気泳動法で０．１１ｋｂｐのＤＮＡ断片を
回収した（これをＮ断片とする）。

【０１４５】Ｒｃ／ＣＭＶをＨｉｎｄIII とＸｂａＩと
で消化し、得られた大断片と、Ｍ断片、Ｎ断片とを３分
子ライゲーションすることでＴＺｍ５―ＰＣ９００２を
得た。これはヒトサイトメガロウイルスのＩＥエンハン
サー、プロモーターにより転写が指令される発現ベクタ
ーである。

【０１４６】（８）ＴＺｍ９―ＰＣ９００２の作製 ＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＨｉｎｄIII とＭｌｕＩとで
消化し、アルカリ性ホスファターゼで末端を脱リン酸化
後、大断片を回収し、さらにこれを平滑末端化した（こ
れをＯ断片とする）。

【０１４７】ＴＺｍ１―ＰＣ９００２をＫｐｎＩとＸｈ
ｏＩで消化後、２％アガロースゲル電気泳動法で０．４
２ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し平滑末端化した。これと
Ｏ断片とをライゲーションし、アデノウイルス主要後期
プロモーターがヒトプロテインＣの発現を指令する向き
に挿入されたものを制限酵素切断による解析で選別する
ことでＴＺｍ９―ＰＣ９００２を得た。

【０１４８】（９）ＴＺｍ１６―ＰＣ９００２の作製 ＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＡｓｐ７００とＨｉｎｄIII
とで消化し、大断片を回収した（これをＰ断片とす
る）。また、ＴＺｍ９―ＰＣ９００２をＮｒｕＩとＨｉ
ｎｄIII とで消化し、小断片を回収した（これをＱ断片
とする）。

【０１４９】さらに、Ｒｃ／ＣＭＶをＢａｎＩで消化
し、１．６９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収後、Ａｓｐ７０
０で消化し、大断片を回収した。

【０１５０】このＤＮＡ断片と、Ｐ断片、Ｑ断片とを３
分子ライゲーションすることで、ヒトサイトメガロウイ
ルスＩＥエンハンサーおよびアデノウイルス主要後期プ
ロモーターを有する発現ベクターＴＺｍ１６―ＰＣ９０
０２を得た。

【０１５１】（１０）ＴＺｍ２０―ＰＣ９００２の作製 ＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＳｆｕＩで消化後平滑末端化
し、さらにＳｆｉＩで消化後大断片を回収した。このＤ
ＮＡ断片と、ｐＳＶ２―ｇｐｔをＢａｍＨＩで消化後平
滑末端化し、さらにＳｆｉＩで消化して得られる小断片
とをライゲーションすることでＴＺｍ２０―ＰＣ９００
２を得た。

【０１５２】これは、転写ユニット部分はＴＺｍ５―Ｐ
Ｃ９００２と同一であるが、Ｅｃｏ―ｇｐｔ遺伝子を選
択マーカーとして有するものである。

【０１５３】（１１）ＴＺｍ３１―ＰＣ９００２の作製 ＴＺｍ１―ＰＣ９００２におけるアデノウイルス３分節
リーダー配列部分から、ヒトプロテインＣ遺伝子の開始
コドンの下流約３０ｂｐの所にあるＢａｌＩ切断部位ま
でに相当するＤＮＡ断片を４つの部分に分けて化学合成
した。ただし上流側の末端は、ＨｉｎｄIII で切断され
た形のＤＮＡ部分を付加した形とした。その５′側末端
がこのＤＮＡ部分の両末端となる２本の合成ＤＮＡ以外
の６本の合成ＤＮＡにつき、末端をリン酸化した。相補
鎖をアニーリング後ライゲーションし、２％アガロース
ゲル電気泳動法で０．５３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し
た。このＨｉｎｄIII 〜ＢａｌＩ断片をＲ断片とする。

【０１５４】ＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＢａｌＩとＳｆ
ｉＩとで消化し、小断片を回収した（これをＳ断片とす
る）。またＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＨｉｎｄIII とＳ
ｆｉＩとで消化し、小断片を回収した。このＤＮＡ断片
とＲ断片、Ｓ断片とを３分子ライゲーションすることで
ＴＺｍ３１―ＰＣ９００２を得た。これは、基本的な構
成はＴＺｍ５―ＰＣ９００２と同一であるが、その５′
側非翻訳領域にアデノウイルス３分節リーダーを有する
ものである。

【０１５５】（１２）ＴＺｍ５―ＰＣ９００４の作製 ヒトアデノウイルス２型ＤＮＡ（約３６ｋｂｐ）をＨｉ
ｎｄIII で消化し、５．３２ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収
し、ＨｐａＩで消化後、１．３３ｋｂｐのＤＮＡ断片を
回収した。このＤＮＡ断片をＰＵＣ８のＨｉｎｄIII 〜
ＨｉｎｃIIサイトにサブクローニングすることでＰＵＣ
―ＶＡを得た。ＰＵＣ―ＶＡをＥｃｏＲＩとＮｒｕＩと
で消化し、小断片を回収した（これをＴ断片とする）。

【０１５６】また、ＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＮｒｕＩ
とＳｆｉＩとで消化し、小断片を回収した（これをＵ断
片とする）。

【０１５７】さらに、ＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＳｆｉ
ＩとＥｃｏＲＩとで消化し、大断片を回収した。このＤ
ＮＡ断片と、Ｔ断片、Ｕ断片とを３分子ライゲーション
することで、ＴＺｍ５―ＰＣ９００４を得た。

【０１５８】これは、基本的な構成はＴＺｍ５―ＰＣ９
００２と同一であるが、そのヒトプロテインＣの第二イ
ントロン（イントロン２）中にアデノウイルスのＶＡＩ
およびＶＡII遺伝子を有するものである。

【０１５９】（１３）ＴＺｍ３１―ＰＣ９００４の作製 ＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＨｉｎｄIII とＳｆｉＩとで
消化して得られる小断片と、ＴＺｍ５―ＰＣ９００４を
ＳｆｉＩとＢｇｌIIとで消化して得られる大断片と、Ｔ
Ｚｍ３１―ＰＣ９００２をＨｉｎｄIII とＢｇｌIIとで
消化して得られる中断片とを３分子ライゲーションする
ことでＴＺｍ３１―ＰＣ９００４を得た。

【０１６０】これは、基本的な構成はＴＺｍ３１―ＰＣ
９００２と同一であるが、そのヒトプロテインＣの第二
イントロン中にアデノウイルスのＶＡＩおよびＶＡII遺
伝子を有するものである。

【０１６１】（１４）ＴＺｍ５―ＰＣ９００５の作製 ＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＢｓｔＸＩで消化し、大断片
を回収後、ヒトプロテインＣ遺伝子の第一イントロン中
最上流側にあるＢｓｔＸＩサイトの上流側の末端をＭｌ
ｕＩの対合末端に変換する一本鎖の合成アダプターＤＮ
Ａをライゲーションし、その末端をＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いてリン酸化した。次にこれをＳｆｉＩ
で消化し、大断片を回収した（これをＶ断片とする）。
またＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＳｆｉＩとＳｃａＩとで
消化し、大断片を回収した（これをＷ断片とする）。一
方Ｒｃ／ＣＭＶをＢａｎＩで消化し、１．６９ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を回収し、さらにＭｌｕＩで消化し、０．４
９ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【０１６２】このＤＮＡ断片と、Ｖ断片、Ｗ断片とを３
分子ライゲーションすることで、ヒトプロテインＣ遺伝
子の第一イントロン（イントロン１）中にヒトサイトメ
ガロウイルスのＩＥエンハンサーを有する発現ベクター
ＴＺｍ５―ＰＣ９００５を得た。

【０１６３】（１５）ＴＺｍ５―ＰＣ９００６の作製 Ｒｃ／ＣＭＶをＢａｎＩで消化し、１．６９ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収後、ＮｒｕＩで消化し、０．５１ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を回収した（これをＸ断片とする）。

【０１６４】またＴＺｍ５―ＰＣ９００２をＢｓｔＸＩ
で消化し、大断片を回収後、ヒトプロテインＣ遺伝子の
第一イントロン中最上流側にあるＢｓｔＸＩサイトの上
流側の末端をＸ断片のＢａｎＩ末端との対合末端に変換
する一本鎖の合成アダプターＤＮＡをライゲーション
し、その末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
リン酸化した。

【０１６５】次にこれをＳｆｉＩで消化し、大断片を回
収した（これをＹ断片とする）。一方、ＴＺｍ５―ＰＣ
９００２をＳｃａＩとＳｆｉＩとで消化し、大断片を回
収した。

【０１６６】このＤＮＡ断片と、Ｘ断片、Ｙ断片とを３
分子ライゲーションすることで、ヒトプロテインＣ遺伝
子の第一イントロン中にヒトサイトメガロウイルスのＩ
Ｅエンハンサーを有する発現ベクターＴＺｍ５―ＰＣ９
００６を得た。ＴＺｍ５―ＰＣ９００５とは、ヒトサイ
トメガロウイルスＩＥエンハンサーの向きが異なる。

【０１６７】（１６）ＴＺｍ１―ＰＣ９００５，ＴＺｍ
１―ＰＣ９００６の作製 ＴＺｍ５―ＰＣ９００５をＴｔｈIII Ｉで消化して得ら
れる大断片をＡｐａＩで消化し、小断片を回収した。こ
のＤＮＡ断片と、ＴＺｍ１―ＰＣ９００２をＣｌａＩと
ＡｐａＩとで消化して得られる小断片、およびＴＺｍ１
―ＰＣ９００２をＴｔｈIII ＩとＣｌａＩとで消化して
得られる大断片とを３分子ライゲーションすることで、
ＴＺｍ１―ＰＣ９００５を得た。

【０１６８】これは、基本的な構成はＴＺｍ１―ＰＣ９
００２と同一であるが、そのヒトプロテインＣ遺伝子の
第一イントロン中にヒトサイトメガロウイルスのＩＥエ
ンハンサーを有するものである。ＴＺｍ５―ＰＣ９００
５に代えてＴＺｍ５―ＰＣ９００６を用いることで、同
様な方法によりＴＺｍ５―ＰＣ９００６を得た。

【０１６９】（１７）ＴＺｍ９―ＰＣ９００５，ＴＺｍ
９―ＰＣ９００６の作製 ＴＺｍ５―ＰＣ９００５またはＴＺｍ５―ＰＣ９００６
をＨｉｎｄIII とＳｆｉＩとで消化して得られる大断片
と、ＴＺｍ９―ＰＣ９００２をＨｉｎｄIII とＳｆｉＩ
とで消化して得られる小断片とをライゲーションするこ
とでそれぞれＴＺｍ９―ＰＣ９００５、ＴＺｍ９―ＰＣ
９００６を得た。

【０１７０】これらは、基本的な構成はＴＺｍ９―ＰＣ
９００２と同一であるが、そのヒトプロテインＣ遺伝子
の第一イントロン中に、ヒトサイトメガロウイルスのＩ
Ｅエンハンサーを有するものである。

【０１７１】（１８）２２８―ＰＣ９００５、２２８―
ＰＣ９００６の作製 ＴＺｍ５―ＰＣ９００５またはＴＺｍ５―ＰＣ９００６
をＢａｌＩとＳａｃIIとで消化して得られる中断片と、
２２８―ＰＣ９００２をＳａｃIIとＳｆｉＩとで消化し
て得られる大断片、および２２８―ＰＣ９００２をＢａ
ｌＩとＳｆｉＩとで消化して得られる小断片とを３分子
ライゲーションすることでそれぞれ２２８―ＰＣ９００
５、２２８―ＰＣ９００６を得た。

【０１７２】これらは、基本的な構成は２２８―ＰＣ９
００２と同一であるが、そのヒトプロテインＣ遺伝子の
第一イントロン中に、ヒトサイトメガロウイルスのＩＥ
エンハンサーを有するものである。

【０１７３】（１９）ｐＫＥＸ２―ｇｐｔの作製 ＫＥＸ２／Ｚｅｍ２２８をＢａｍＨＩで消化することで
ＫＥＸ２遺伝子部分を切り出し、前述のＺｍＢ３のＢａ
ｍＨＩサイトにクローニングした。ＫＥＸ２遺伝子の転
写がアデノウイルスのプロモーターにより指令される向
きに挿入されたものを選択し、これをＺｍＢ３―ＫＥＸ
２とした。

【０１７４】ＺｍＢ３―ＫＥＸ２をＫｐｎＩとＡａｔII
とで消化して得られる小断片を平滑末端化した（これを
Ｚ断片とする）。またｐＳＶ２―ｇｐｔをＥｃｏＲＩで
消化後、脱リン酸化し、さらに平滑末端化した。これと
Ｚ断片とをライゲーションし、ｐＫＥＸ２―ｇｐｔを得
た。

【０１７５】（２０）ｐＶＡ―ｇｐｔの作製 前述のＰＵＣ―ＶＡをＳｍａＩとＮｒｕＩとで消化して
得られる小断片を、ｐＳＶ２―ｇｐｔをＥｃｏＲＩ消化
後、脱リン酸化し、平滑末端化したものとライゲーショ
ンすることでｐＶＡ―ｇｐｔを得た。

【０１７６】

【実施例２】ヒトプロテインＣの動物細胞における発現 ＢＨＫ―２１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ―１０）、または
２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）は、ファルコン
社３００３シャーレを用い、非働化した１０％ＦＣＳ―
ｅＲＤＦ（極東製薬）−５μｇ／mlビタミンＫ１にスト
レプトマイシンおよびペニシリンＧをそれぞれ１００μ
ｇ／ml、１００単位／mlとなるように加えた培地１０ml
中で培養した。

【０１７７】発現ベクターはシャーレ１枚あたり１０μ
ｇ用いた。ただし２２８／ＡＣ―ＰＣ９００１について
は、この発現ベクター８μｇにｐＳＶ２―ｄｈｆｒ２μ
ｇを混合したものを用いた。この発現ベクターに、１０
μｇのサケ精子ＤＮＡ、２５μリットルの２ＭＣａＣｌ
₂ を加え、さらにＴＥ（１mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．
０５mM ＥＤＴＡ、pH７．５）を加えて全容を２００μ
リットルとした。

【０１７８】この溶液に、攪拌をしながら２００μリッ
トルの２ｘＨＢＳ（２８０mMＮａＣｌ、５０mMＨｅｐｅ
ｓ，１．５mMＮａＨ₂ ＰＯ₄ 、pH７．１２）を滴下して
加えたのち、室温で３０分間放置した。細胞のコンフル
エンシーが６０％ないし８０％になったシャーレから培
地を除き、１００μＭのクロロキンを含む３mlの上記培
地を加えた。

【０１７９】これに上記のＤＮＡを含む混合液を滴下
し、５％ＣＯ₂ インキューベーター中３７℃で４時間保
った。次に培地を除き、１mlのグリセロール溶液（ｅＲ
ＤＦ培地にグリセロールを１５％加えたもの）を加え、
１分間室温で放置したのち、グリセロール溶液を除き、
３mlのＰＢＳ（−）（日水製薬）で２回洗浄し、１０ml
の上記培地を加えて５％ＣＯ₂ インキュベーター中３７
℃で培養を続けた。

【０１８０】ここで述べた方法はリン酸カルシウム共沈
法として知られるもので、基本的には、Wigler等、Cel
l., 14, 725 (1978) 、およびVan der Eb等、Virology,
52,456 (1973)において示されたものである。翌日、こ
の細胞をトリプシンを用いてはがし、３０倍ないし９０
倍に希釈し、ファルコン３０２５ディッシュを用いて上
記培地中で培養を続けた。その際、ネオマイシン耐性遺
伝子をマーカーとして用いたものは、１mg／mlのＧ４１
８（ギブコ）を、ｄｈｆｒ遺伝子をマーカーとして用い
たものは１μｇ／mlのメトトレキセート（シグマ）を、
Ｅｃｏ―ｇｐｔ遺伝子をマーカーとして用いたものは、
６μｇ／mlのミコフェノール酸、１５μｇ／mlのヒポキ
サンチン、１０μｇ／mlのチミジン、および２５０μｇ
／mlのキサンチンを加えた。以後は、この選択培地を用
いて培養を行なった。

【０１８１】１２日（ＢＨＫ細胞）、または１８日（２
９３細胞）ほどでコロニーを生じるので、これをクロー
ニングシリンダーを用いて、コースター３４２４ディッ
シュに移した。さらにファルコン３００３ディッシュに
移し、コンフルエントになった所で液換えし、２４時間
培養後、その培養上清を回収した。

【０１８２】また、必要に応じ限界希釈法による細胞株
のクローニングを行なった。すなわち、コースター３５
９９ディッシュ（９６ウエル）を用い、１ウエル当り２
００μｌの選択培地を加え、１ウエル当り１個の細胞の
割合で播き込み、４日に一度液換えをしつつ培養を続け
た。１個のコロニーを生じたウエルにつき、細胞をコー
スター３４２４ディッシュに移して培養を続け、さらに
ファルコン３００３ディッシュに移し、コンフルエント
になった所で液換えし、２４時間培養後、その培養上清
を回収した。

【０１８３】さらに、このクローニングされた細胞株に
ｐＶＡ―ｇｐｔを導入した。方法は、ヒトプロテインＣ
発現ベクターの導入方法と同一であるが、選択培地とし
て、５００μｇ／mlＧ４１８、６μｇ／mlミコフェノー
ル酸、１５μｇ／mlヒポキサンチン、１０μｇ／mlチミ
ジン、２５０μｇ／mlキサンチン、５μｇ／mlビタミン
Ｋ１、１００μｇ／mlストレプトマイシン、１００単位
／mlペニシリンＧ、１０％ＦＣＳを含むｅＲＤＦ培地を
用いた点のみ異なる。また同じ方法でｐＫＥＸ２―ｇｐ
ｔの導入も行なった。

【０１８４】次いで、この中に含まれる、全ヒトプロテ
インＣ濃度およびＧｌａを正常に有するヒトプロテイン
Ｃ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。このＥＬＩＳＡ
系においては、プレート側に重鎖認識の抗ヒトプロテイ
ンＣモノクローナル抗体ＪＴＣ―４を、西洋わさびペル
オキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識抗体として、ＪＴＣ―５
（活性化ペプチド認識、全ヒトプロテインＣ測定用）ま
たはＪＴＣ―１（Ｃａ ²⁺に依存してＧｌａドメインを認
識、Ｇｌａを正常に有するヒトプロテインＣ測定用）を
用いた。

【０１８５】これらのモノクローナル抗体はWakabayash
i 等、J. Biol. Chem., 261, 11097(1986) に記載のも
のである。この結果のうち最も高値を示したものを次の
表１に示す。

【０１８６】

【表１】

【０１８７】さらに、別のシリーズの発現実験で表２の
結果を得た。

【０１８８】

【表２】

【０１８９】

【実施例３】ヒトプロテインＣの２本鎖化率の向上 ２９３細胞にＴＺｍ５―ＰＣ９００２を導入して得られ
た株を前述の方法でクローニングし、それに前述の方法
でｐＫＥＸ２―ｇｐｔを導入した。

【０１９０】ｐＫＥＸ２―ｇｐｔを導入する前後の細胞
をファルコン３００３ディッシュで培養し、コンフルエ
ントになった後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、無血清培
地（５μｇ／mlビタミンＫ１―ｅＲＤＦ）を１０ml加え
た。２日後培養上清を回収し、メンブレンフィルター
（ミリポア社、ポアサイズ０．２２μｍ）を通した後、
セントリコン１０（アミコン社、登録商標）で約２０倍
に濃縮した。

【０１９１】このサンプルを還元条件でＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動（１０〜２０％）し、抗ヒトプ
ロテインＣ抗血清（アメリカンダイアグノスチカ社）を
用いたイムノブロッティング法で２本鎖化率を調べた。

【０１９２】ｐＫＥＸ２―ｇｐｔ導入前には約８０％の
２本鎖化率であったが、導入後では大部分のクローンで
ほぼ１００％の２本鎖化率であった。なおｐＫＥＸ２―
ｇｐｔの導入によるヒトプロテインＣの発現効率の低下
は認められなかった。

【０１９３】

【実施例４】ヒトプロテインＣの精製およびその活性測定 ＴＺｍ１―ＰＣ９００２を用いて作製したヒトプロテイ
ンＣ産生株を、実施例２で述べた選択培地中、ファルコ
ン３０２５シャーレを用いて培養し、約６００mlの培養
上清を得た。

【０１９４】これをポアサイズ０．４５μｍのフィルタ
ーを用いて濾過後、終濃度５mMとなるようにＣａＣｌ₂
を添加し、抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体を固
定化したカラムを用いて、ヒトプロテインＣの精製を行
なった。

【０１９５】ここで用いた抗体は、特開昭６１―１３４
３９９号公報に６Ｈ２として記載されているものであ
る。またこの精製法は、特開平２―１６３０８５号公報
において示されているものである。ヒトプロテインＣ
は、シングルピークとして溶出され、吸光度から求めた
蛋白量は約３００μｇであった。

【０１９６】この精製ヒトプロテインＣは非還元のＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動上単一バンドであっ
た。また還元下のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動では、重鎖のバンド、軽鎖のバンドのほか、一本鎖の
バンドが認められた。デンシトメーターにより測定した
一本鎖のヒトプロテインＣの割合は約２０％であった。

【０１９７】精製したヒトプロテインＣ３μｇを、０．
３μｇのウシトロンビン（持田製薬）を用いて３７℃で
活性化し、５、１５、３０、６０分後に９倍容のアンチ
トロンビンIII （１５０μｇ／ml）―ヘパリン（２ｕｎ
ｉｔ／ml）を加えて反応を停止した。

【０１９８】この反応液５０μリットルと２ｍＭ Ｓ―
２３６６（カビ社）５０μリットルを９６ｗｅｌｌのマ
イクロプレートのウエルに加え、波長４０５ｎｍにおけ
る吸光度変化を東洋測器社製ＥＴＹ―９６アナライザー
を用いて測定した。

【０１９９】表３に示したごとく、経時的に合成基質Ｓ
―２３６６の分解活性の増加が認められた。

【０２００】

【表３】

【０２０１】また、前述の活性化したヒトプロテインＣ
を希釈して１０〜２００ｎｇサンプル／５０μｌ ０．
１％ＢＳＡ―ＴＢＳ（ｐＨ７．４）とした。３７℃に２
分間保った１００μｌのシスメックス・コントロール血
漿Ｉにこのサンプルと、５０μｌのシスメックスＡＰＴ
Ｔ試薬とを加えて攪拌し、３７℃に２分間保ったのち、
１００μｌの２５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を加えて攪拌し、シ
スメックスＣＡ―１００型血液凝固分析器でＡＰＴＴを
測定した。

【０２０２】ヒト血漿から前述のアフィニティカラムを
用いて精製したヒトプロテインＣを同様な方法で活性化
して得られるヒト活性化プロテインＣと比較して、同等
以上の比活性を有することがわかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高沢 美治 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトプロテインＣ遺伝子の有する８個の
   エキソンの間に存在する７個のイントロンのうち、Ｎ個
   （Ｎ＝１〜６）のイントロン部分を除去し、その前後の
   配列を接続してなるヒトプロテインＣをコードするＤＮ
   Ａ断片。
2. 【請求項２】 ヒトプロテインＣ遺伝子のエキソン６と
   ７、およびエキソン７と８との間の存在する２個のイン
   トロンを除去してなる請求項１に記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 ヒトプロテインＣ遺伝子のエキソン３と
   ４、エキソン４と５、エキソン５と６、エキソン６と７
   およびエキソン７と８との間に存在する５個のイントロ
   ンを除去してなる請求項１に記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 ヒトプロテインＣ遺伝子または請求項
   １，２または３に記載のＤＮＡ断片が有するＮ個（Ｎ＝
   １〜７）のイントロン部分のうち、いずれかひとつまた
   は複数個のイントロン部分に、またはその一部を欠失さ
   せたイントロン部分に、次に示すＤＮＡ断片； ａ．動物細胞において転写活性を促進するＤＮＡ断片、 ｂ．動物細胞においてＤＮＡの複製開始点となり得るＤ
   ＮＡ断片、 ｃ．アデノウイルスのＶＡ遺伝子断片、 からなる群より選ばれた少なくとも一つを挿入したヒト
   プロテインＣをコードするＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 請求項１，２，３または４に記載のＤＮ
   Ａ断片を動物細胞中で発現させることを特徴とするヒト
   プロテインＣの製造方法。
6. 【請求項６】 動物細胞へ導入し得る発現ベクターであ
   って、プロモーター、請求項１，２，３または４に記載
   のＤＮＡ断片、並びに必要に応じポリアデニレーション
   シグナルを含有し、該ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列の転写が
   該プロモーターによる指令されるヒトプロテインＣ発現
   ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６の発現ベクターにより形質転換
   されているヒトプロテインＣ産生動物細胞。
8. 【請求項８】 細胞がＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬ
   ａ細胞、Ｃ１２７細胞および２９３細胞からなる群から
   選ばれたものである請求項７に記載の動物細胞。