JP2622355B2 - 動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化 - Google Patents
動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リンパ系由来の哺乳動
物細胞においてタンパク質生産を増加させる方法および
産物に関する。より詳細には、本発明は、ｍＲＮＡの細
胞内分解速度を遅らせることにより翻訳能力をもつｍＲ
ＮＡの定常状態レベルを増加させてタンパク質生産を増
加させる方法および産物に関する。
物細胞においてタンパク質生産を増加させる方法および
産物に関する。より詳細には、本発明は、ｍＲＮＡの細
胞内分解速度を遅らせることにより翻訳能力をもつｍＲ
ＮＡの定常状態レベルを増加させてタンパク質生産を増
加させる方法および産物に関する。
【０００２】
【従来の技術】大部分の動物細胞によるタンパク質生産
は酵素、構造タンパク質、表面タンパク質、およびリン
フォカインやホルモンのような特殊な機能をもつ多数の
タンパク質の合成を包含する。一般に、これらのタンパ
ク質は比較的少ない量で生産される。しかしながら、動
物体内での全身的使用のために多量のタンパク質を生産
・分泌しうる動物細胞型が存在する。このような細胞型
の例にはグロブリンおよびフィブリノーゲンを生産する
循環系細胞、血清アルブミンを生産する肝細胞、ならび
にインシュリンを生産するランゲルハンス島のβ細胞が
含まれる。もしもこの種の高レベル発現に関与する遺伝
子機構をリンフォカイン、抗体または対象のタンパク質
系物質の生産に応用することができるならば、価値ある
タンパク質を多量に供給することができるであろう。
は酵素、構造タンパク質、表面タンパク質、およびリン
フォカインやホルモンのような特殊な機能をもつ多数の
タンパク質の合成を包含する。一般に、これらのタンパ
ク質は比較的少ない量で生産される。しかしながら、動
物体内での全身的使用のために多量のタンパク質を生産
・分泌しうる動物細胞型が存在する。このような細胞型
の例にはグロブリンおよびフィブリノーゲンを生産する
循環系細胞、血清アルブミンを生産する肝細胞、ならび
にインシュリンを生産するランゲルハンス島のβ細胞が
含まれる。もしもこの種の高レベル発現に関与する遺伝
子機構をリンフォカイン、抗体または対象のタンパク質
系物質の生産に応用することができるならば、価値ある
タンパク質を多量に供給することができるであろう。
【０００３】真核細胞による内因性ＤＮＡの発現は、そ
のＤＮＡのｍＲＮＡへの転写、次いでそのｍＲＮＡのリ
ボソームへの移動、そしてその後に開始シグナルコドン
と翻訳終止コドンとの間のｍＲＮＡによってコードされ
るアミノ酸配列から成るタンパク質へのｍＲＮＡのｔＲ
ＮＡ媒介翻訳を伴う。
のＤＮＡのｍＲＮＡへの転写、次いでそのｍＲＮＡのリ
ボソームへの移動、そしてその後に開始シグナルコドン
と翻訳終止コドンとの間のｍＲＮＡによってコードされ
るアミノ酸配列から成るタンパク質へのｍＲＮＡのｔＲ
ＮＡ媒介翻訳を伴う。
【０００４】ギリエス（Gillies）ら、Cell, Vol.33,
p.717〜728，１９８３年７月、および係属中の米国特許
出願第５９２２３１号（１９８４年３月２２日出願）に
開示されるように、細胞のエンハンサー因子は免疫グロ
ブリンを多量に生産する特殊な細胞によるタンパク質の
高レベル発現において重要な役割を演じている。エンハ
ンサーは内因性ｍＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのｍ
ＲＮＡへの転写率を高めることにより機能すると思われ
る。ｍＲＮＡの濃度が増すと、上記細胞による発現レベ
ルが有意に高まる。このようなエンハンサー因子の活性
は方向性によって大きな影響を受けず、そのエンハンサ
ー配列がタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター
から１０，０００塩基対またはそれ以上離れた位置に存
在していても観察できる。これらの細胞エンハンサーは
組織特異的であると考えられ、すなわちリンパ系細胞の
内因性ゲノム中で特定ｍＲＮＡの生産を増加させるよう
に機能する細胞エンハンサーの活性は、もしもそのエン
ハンサーが非リンパ系細胞を形質転換する、ベクター中
に組み込まれた場合、非常に低下するか又は失われるで
あろう。しかしながら、エンハンサー因子、プロモータ
ー、および目的タンパク質をコードする組換え遺伝子を
含むベクターは、そのエンハンサーが自然界でその転写
率を高める細胞型と同じ型の細胞へトランスフェクショ
ンされるならば、組換え遺伝子を高レベルで発現するよ
うにその細胞を首尾よく形質転換することができる。
p.717〜728，１９８３年７月、および係属中の米国特許
出願第５９２２３１号（１９８４年３月２２日出願）に
開示されるように、細胞のエンハンサー因子は免疫グロ
ブリンを多量に生産する特殊な細胞によるタンパク質の
高レベル発現において重要な役割を演じている。エンハ
ンサーは内因性ｍＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのｍ
ＲＮＡへの転写率を高めることにより機能すると思われ
る。ｍＲＮＡの濃度が増すと、上記細胞による発現レベ
ルが有意に高まる。このようなエンハンサー因子の活性
は方向性によって大きな影響を受けず、そのエンハンサ
ー配列がタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター
から１０，０００塩基対またはそれ以上離れた位置に存
在していても観察できる。これらの細胞エンハンサーは
組織特異的であると考えられ、すなわちリンパ系細胞の
内因性ゲノム中で特定ｍＲＮＡの生産を増加させるよう
に機能する細胞エンハンサーの活性は、もしもそのエン
ハンサーが非リンパ系細胞を形質転換する、ベクター中
に組み込まれた場合、非常に低下するか又は失われるで
あろう。しかしながら、エンハンサー因子、プロモータ
ー、および目的タンパク質をコードする組換え遺伝子を
含むベクターは、そのエンハンサーが自然界でその転写
率を高める細胞型と同じ型の細胞へトランスフェクショ
ンされるならば、組換え遺伝子を高レベルで発現するよ
うにその細胞を首尾よく形質転換することができる。
【０００５】真核細胞ＤＮＡは翻訳終止コドンのあとに
ある種の塩基配列を含み、その一部は転写されたｍＲＮ
Ａの翻訳終止コドンの３'側にアデニン残基（以後ポリ
Ａと記す）の付加を開始させるためのシグナルとして作
用する。ポリアデニル化は主として核内で起こり、１度
に１個のアデニル酸を付加するポリＡポリメラーゼによ
り媒介される。ポリＡは翻訳終止コドンが翻訳を終わら
せた後でアミノ酸配列をコードしないが、ｍＲＮＡの安
定化ならびにｍＲＮＡコード領域のアミノ酸への翻訳の
効率に寄与すると考えられる。
ある種の塩基配列を含み、その一部は転写されたｍＲＮ
Ａの翻訳終止コドンの３'側にアデニン残基（以後ポリ
Ａと記す）の付加を開始させるためのシグナルとして作
用する。ポリアデニル化は主として核内で起こり、１度
に１個のアデニル酸を付加するポリＡポリメラーゼによ
り媒介される。ポリＡは翻訳終止コドンが翻訳を終わら
せた後でアミノ酸配列をコードしないが、ｍＲＮＡの安
定化ならびにｍＲＮＡコード領域のアミノ酸への翻訳の
効率に寄与すると考えられる。
【０００６】哺乳動物細胞のｍＲＮＡ中のポリＡは、
３'非翻訳（３'untranslatable；以後３'ＵＴと略す）
末端部分として知られる配列中に存在する。３'ＵＴは
一般に翻訳産物のための翻訳終止コドンからポリＡの末
端までの範囲に及ぶ。哺乳動物ｍＲＮＡの３'ＵＴ領域
は通常ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として知ら
れる相同領域を有する。この配列はポリＡ付加シグナル
であると考えられる。それはしばしばポリＡ付加部位よ
りも１１〜３０個の塩基だけ上流に存在する。
３'非翻訳（３'untranslatable；以後３'ＵＴと略す）
末端部分として知られる配列中に存在する。３'ＵＴは
一般に翻訳産物のための翻訳終止コドンからポリＡの末
端までの範囲に及ぶ。哺乳動物ｍＲＮＡの３'ＵＴ領域
は通常ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として知ら
れる相同領域を有する。この配列はポリＡ付加シグナル
であると考えられる。それはしばしばポリＡ付加部位よ
りも１１〜３０個の塩基だけ上流に存在する。
【０００７】３'ＵＴおよびポリＡ領域の（存在する場
合の）機能は最近ソレク（Soreq）ら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A., Vol.78, No3, p.1741〜1745，１９８
１年３月；ザレット（Zaret）ら、J. Mol. Biol., 1984
Vol.176, p.107〜135；バレル（Baralle），Internati
onal Review of Cytology, Vol. 81, p71〜106；および
ロス（Ross）ら、J. Mol. Biol., 1983 Vol.167, p.607
〜617によって調査・研究された。
合の）機能は最近ソレク（Soreq）ら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A., Vol.78, No3, p.1741〜1745，１９８
１年３月；ザレット（Zaret）ら、J. Mol. Biol., 1984
Vol.176, p.107〜135；バレル（Baralle），Internati
onal Review of Cytology, Vol. 81, p71〜106；および
ロス（Ross）ら、J. Mol. Biol., 1983 Vol.167, p.607
〜617によって調査・研究された。
【０００８】ソレク（Soreq）らは、ヒト線維芽細胞の
第一βインターフェロンｍＲＮＡからのポリＡおよび約
１００個の隣接残基の除去が卵母細胞中でのこのｍＲＮ
Ａの翻訳活性または機能的安定性を変化させないが、ポ
リＡおよび約２００個の隣接残基の欠失がその翻訳効率
を低下させることを報告した。第二βインターフェロン
ｍＲＮＡからの約２００個のポリＡ残基および約２００
個の隣接残基の除去は、卵母細胞中でのこのｍＲＮＡの
翻訳活性または機能的安定性のいずれをも変化させなか
った。これらの著者は、ポリＡ残基も３'非コード領域
の大きいセグメントもこのような卵母細胞中でのヒトβ
インターフェロンｍＲＮＡの機能的安定性の維持のため
に必要でないと結論づけた。
第一βインターフェロンｍＲＮＡからのポリＡおよび約
１００個の隣接残基の除去が卵母細胞中でのこのｍＲＮ
Ａの翻訳活性または機能的安定性を変化させないが、ポ
リＡおよび約２００個の隣接残基の欠失がその翻訳効率
を低下させることを報告した。第二βインターフェロン
ｍＲＮＡからの約２００個のポリＡ残基および約２００
個の隣接残基の除去は、卵母細胞中でのこのｍＲＮＡの
翻訳活性または機能的安定性のいずれをも変化させなか
った。これらの著者は、ポリＡ残基も３'非コード領域
の大きいセグメントもこのような卵母細胞中でのヒトβ
インターフェロンｍＲＮＡの機能的安定性の維持のため
に必要でないと結論づけた。
【０００９】ザレット（Zaret）らは、イソ−１−シト
クロムｃをコードするＣＹＣ−１遺伝子の３'非コード
領域中に３８塩基対の欠失を含む酵母Ｓ．セレビシエ
（S.cerevisiae）のｃｙｃ１−５１２突然変異体につい
て研究した。彼等は染色体再配列により生ずる別の３'
非コード配列がＣＹＣ−１ ｍＲＮＡの安定性を高め且
つｍＲＮＡの翻訳効率に様々な影響を及ぼすことを報告
した。
クロムｃをコードするＣＹＣ−１遺伝子の３'非コード
領域中に３８塩基対の欠失を含む酵母Ｓ．セレビシエ
（S.cerevisiae）のｃｙｃ１−５１２突然変異体につい
て研究した。彼等は染色体再配列により生ずる別の３'
非コード配列がＣＹＣ−１ ｍＲＮＡの安定性を高め且
つｍＲＮＡの翻訳効率に様々な影響を及ぼすことを報告
した。
【００１０】バレル（Barelle）の文献：真核細胞ｍＲ
ＮＡ中のリーダーおよびトレーラー配列の機能的意義に
おいて、著者は３'非コード領域のための明らかな機能
は存在せず、これらの遺伝子の発生中に相当の大きさの
欠失または挿入が起こることは３'非コード領域から成
る特定配列がｍＲＮＡの機能にとって不可欠な配列でな
いことを示唆するものであると報告した。しかしなが
ら、バレルはポリＡがｍＲＮＡの安定性を促進する上で
ある種の役割を有すると報告した。例えば、グロビンｍ
ＲＮＡからのポリＡセグメントの除去は卵母細胞中での
そのｍＲＮＡの半減期をかなり短縮することが判明し
た。しかしながら、バレルは、ｍＲＮＡからポリＡを除
去した研究によって証明したように、ポリＡが効果的な
翻訳によって必ずしも必要でないことを示唆している。
ＮＡ中のリーダーおよびトレーラー配列の機能的意義に
おいて、著者は３'非コード領域のための明らかな機能
は存在せず、これらの遺伝子の発生中に相当の大きさの
欠失または挿入が起こることは３'非コード領域から成
る特定配列がｍＲＮＡの機能にとって不可欠な配列でな
いことを示唆するものであると報告した。しかしなが
ら、バレルはポリＡがｍＲＮＡの安定性を促進する上で
ある種の役割を有すると報告した。例えば、グロビンｍ
ＲＮＡからのポリＡセグメントの除去は卵母細胞中での
そのｍＲＮＡの半減期をかなり短縮することが判明し
た。しかしながら、バレルは、ｍＲＮＡからポリＡを除
去した研究によって証明したように、ポリＡが効果的な
翻訳によって必ずしも必要でないことを示唆している。
【００１１】ロス（Ross）およびピザロ（Pizarro）
は、ヒトβおよびδグロビンタンパク質の定常状態レベ
ルがそれらのそれぞれのメッセンジャーＲＮＡの細胞内
安定性により部分的に決定されるという仮説を研究し
た。彼等はｍＲＮＡにおけるδグロビンの急速な回転
（turnover）が少なくとも部分的に、核をもたない末梢
血網状赤血球中のδグロビンｍＲＮＡの低レベルに起因
していることを見出し、そしてｍＲＮＡの崩壊速度が
３'非翻訳領域に存在するヌクレオチド配列シグナルに
より決定されると推量した。彼等はβおよびδグロビン
ｍＲＮＡの５'非翻訳領域は類似しているが、それらの
３'非翻訳領域が相当に異なっていることを観察し、そ
してβまたはδ３'末端を含むキメラｍＲＮＡのトラン
スフェクションした細胞中での半減期を比較することに
より、ｍＲＮＡの安定性を決定する際の３'非翻訳領域
の役割を調べることができるであろうと提案した。
は、ヒトβおよびδグロビンタンパク質の定常状態レベ
ルがそれらのそれぞれのメッセンジャーＲＮＡの細胞内
安定性により部分的に決定されるという仮説を研究し
た。彼等はｍＲＮＡにおけるδグロビンの急速な回転
（turnover）が少なくとも部分的に、核をもたない末梢
血網状赤血球中のδグロビンｍＲＮＡの低レベルに起因
していることを見出し、そしてｍＲＮＡの崩壊速度が
３'非翻訳領域に存在するヌクレオチド配列シグナルに
より決定されると推量した。彼等はβおよびδグロビン
ｍＲＮＡの５'非翻訳領域は類似しているが、それらの
３'非翻訳領域が相当に異なっていることを観察し、そ
してβまたはδ３'末端を含むキメラｍＲＮＡのトラン
スフェクションした細胞中での半減期を比較することに
より、ｍＲＮＡの安定性を決定する際の３'非翻訳領域
の役割を調べることができるであろうと提案した。
【００１２】欧州特許第００７７６８９号は、外因性遺
伝子の下流に構造遺伝子の３'ＵＴが付加された遺伝子
を用いて酵母を形質転換する遺伝子操作法を開示してい
る。その形質転換細胞は、外因性遺伝子が３'ＵＴを含
む場合に、高レベルの発現を示す。実際に３'ＵＴに相
当する領域が付加されたプラスミドを保有する酵母での
発現は、このような領域を含まないプラスミドを保有す
る酵母と比較したとき、約１０倍であることが実証され
た。
伝子の下流に構造遺伝子の３'ＵＴが付加された遺伝子
を用いて酵母を形質転換する遺伝子操作法を開示してい
る。その形質転換細胞は、外因性遺伝子が３'ＵＴを含
む場合に、高レベルの発現を示す。実際に３'ＵＴに相
当する領域が付加されたプラスミドを保有する酵母での
発現は、このような領域を含まないプラスミドを保有す
る酵母と比較したとき、約１０倍であることが実証され
た。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ある
種の型の動物細胞によるヒトｔＰＡを含む所望タンパク
質の効率のよい生産方法ならびに産物を提供することで
ある。他の目的は、所望タンパク質をコードする遺伝子
の高レベル発現を誘導すべく動物細胞をトランスフェク
ションするためのベクターを提供することである。他の
目的は、培養したとき治療、診断および関連用途のため
のタンパク質を多量に生産する形質転換細胞を提供する
ことである。本発明のさらに他の目的は、細胞内ｍＲＮ
Ａの崩壊速度を遅らせることによりトランスフェクショ
ンした細胞株中でのｍＲＮＡの安定性を促進し、その結
果として発現レベルを高める方法ならびに組換えＤＮＡ
を提供することである。
種の型の動物細胞によるヒトｔＰＡを含む所望タンパク
質の効率のよい生産方法ならびに産物を提供することで
ある。他の目的は、所望タンパク質をコードする遺伝子
の高レベル発現を誘導すべく動物細胞をトランスフェク
ションするためのベクターを提供することである。他の
目的は、培養したとき治療、診断および関連用途のため
のタンパク質を多量に生産する形質転換細胞を提供する
ことである。本発明のさらに他の目的は、細胞内ｍＲＮ
Ａの崩壊速度を遅らせることによりトランスフェクショ
ンした細胞株中でのｍＲＮＡの安定性を促進し、その結
果として発現レベルを高める方法ならびに組換えＤＮＡ
を提供することである。
【００１４】本発明のこれらの目的および他の目的は以
下の説明および請求の範囲から当業者には明らかである
だろう。
下の説明および請求の範囲から当業者には明らかである
だろう。
【００１５】
【課題を解決するための手段】通常免疫グロブリンを分
泌する哺乳動物細胞株において所定のタンパク質の生産
を増大させる方法が今や発見された。３'ＵＴ領域の短
いセグメントおよびポリアデニル化領域は、それらが対
象のタンパク質をコードするＤＮＡ中の翻訳終止コドン
の３'側に結合された場合、対象のタンパク質の生産増
加を促進するのに有力であることが分かった。３'ＵＴ
の小さいセグメントおよびポリアデニル化部位から成る
配列は、翻訳領域に相当するｍＲＮＡを安定化して翻訳
レベルを高めると思われる。対象のタンパク質をコード
するｍＲＮＡの定常状態レベルは、より長い非翻訳領域
をもつｍＲＮＡに比べて増加する。本発明は、免疫グロ
ブリンを分泌するかまたは免疫グロブリンを分泌する細
胞株に由来する哺乳動物細胞株においてタンパク質を生
産する方法を提供する。この方法は、 （ａ） 該タンパク質を自然界で生産する細胞に由来
し、順次コード領域、翻訳終止コドン、およびポリアデ
ニル化シグナルを含む非翻訳領域からなるＤＮＡを用意
し； （ｂ） 該ＤＮＡの非翻訳領域のヌクレオチド配列を改
変し、それにより翻訳終止コドンとポリアデニル化シグ
ナルとの間の距離が３００塩基対以下である改変された
非翻訳領域を有する、完全な、転写能力をもつ、より短
い組換えＤＮＡを作製し； （ｃ） 該哺乳動物細胞株において該組換えＤＮＡの転
写について作用可能なプロモーターを用意し； （ｄ） 該プロモーターと作用可能なように関連してい
る該組換えＤＮＡを用いて上記哺乳動物細胞株をトラン
スフェクションし；そして （ｅ） トランスフェクションした細胞株を培養して上
記タンパク質を生産させる； 各工程から成り、上記のトランスフェクションした細胞
株が生産するタンパク質の量は工程（ａ）に記載のＤＮ
Ａを含むがその他の点では同一である細胞株が生産する
タンパク質の量よりも多量であることを特徴とする。
泌する哺乳動物細胞株において所定のタンパク質の生産
を増大させる方法が今や発見された。３'ＵＴ領域の短
いセグメントおよびポリアデニル化領域は、それらが対
象のタンパク質をコードするＤＮＡ中の翻訳終止コドン
の３'側に結合された場合、対象のタンパク質の生産増
加を促進するのに有力であることが分かった。３'ＵＴ
の小さいセグメントおよびポリアデニル化部位から成る
配列は、翻訳領域に相当するｍＲＮＡを安定化して翻訳
レベルを高めると思われる。対象のタンパク質をコード
するｍＲＮＡの定常状態レベルは、より長い非翻訳領域
をもつｍＲＮＡに比べて増加する。本発明は、免疫グロ
ブリンを分泌するかまたは免疫グロブリンを分泌する細
胞株に由来する哺乳動物細胞株においてタンパク質を生
産する方法を提供する。この方法は、 （ａ） 該タンパク質を自然界で生産する細胞に由来
し、順次コード領域、翻訳終止コドン、およびポリアデ
ニル化シグナルを含む非翻訳領域からなるＤＮＡを用意
し； （ｂ） 該ＤＮＡの非翻訳領域のヌクレオチド配列を改
変し、それにより翻訳終止コドンとポリアデニル化シグ
ナルとの間の距離が３００塩基対以下である改変された
非翻訳領域を有する、完全な、転写能力をもつ、より短
い組換えＤＮＡを作製し； （ｃ） 該哺乳動物細胞株において該組換えＤＮＡの転
写について作用可能なプロモーターを用意し； （ｄ） 該プロモーターと作用可能なように関連してい
る該組換えＤＮＡを用いて上記哺乳動物細胞株をトラン
スフェクションし；そして （ｅ） トランスフェクションした細胞株を培養して上
記タンパク質を生産させる； 各工程から成り、上記のトランスフェクションした細胞
株が生産するタンパク質の量は工程（ａ）に記載のＤＮ
Ａを含むがその他の点では同一である細胞株が生産する
タンパク質の量よりも多量であることを特徴とする。
【００１６】本発明によれば、この発見は対象のタンパ
ク質を生産するベクターおよび方法を提供するために、
又はこのような物質を改良された発現レベルで生産すべ
く培養しうる形質転換細胞をもたらすために利用され
る。外因性または内因性のタンパク質が本発明に従って
生産され、すなわち宿主細胞の天然ゲノム中にコードさ
れていないタンパク質、コードされてはいるが通常宿主
細胞により発現されないタンパク質、または通常低レベ
ルしか発現されないタンパク質が生産される。
ク質を生産するベクターおよび方法を提供するために、
又はこのような物質を改良された発現レベルで生産すべ
く培養しうる形質転換細胞をもたらすために利用され
る。外因性または内因性のタンパク質が本発明に従って
生産され、すなわち宿主細胞の天然ゲノム中にコードさ
れていないタンパク質、コードされてはいるが通常宿主
細胞により発現されないタンパク質、または通常低レベ
ルしか発現されないタンパク質が生産される。
【００１７】本発明によれば、コード領域、翻訳終止コ
ドン、および対象のタンパク質のためのポリアデニル化
シグナルを含む天然３'ＵＴを含有するＤＮＡが対象の
タンパク質を自然界で生産する細胞から誘導される。こ
のＤＮＡの３'ＵＴ領域のヌクレオチド配列を改変する
ことにより、翻訳終止コドンとＡＡＴＡＡＡポリアデニ
ル化シグナルとの間に約３００ヌクレオチド塩基よりも
短い改変３'ＵＴを含む、完全な、転写能力をもつ、比
較的短い組換えＤＮＡが作製される。この組換えＤＮＡ
は通常免疫グロブリンを分泌する所定の哺乳動物細胞株
中にトランスフェクションされる。トランスフェクショ
ンされた細胞株を培養して対象のタンパク質を生産させ
る。タンパク質の生産量は比較的長い天然３'ＵＴを含
む対象のタンパク質の未改変ＤＮＡを保有する同一細胞
株のそれよりも多量である。
ドン、および対象のタンパク質のためのポリアデニル化
シグナルを含む天然３'ＵＴを含有するＤＮＡが対象の
タンパク質を自然界で生産する細胞から誘導される。こ
のＤＮＡの３'ＵＴ領域のヌクレオチド配列を改変する
ことにより、翻訳終止コドンとＡＡＴＡＡＡポリアデニ
ル化シグナルとの間に約３００ヌクレオチド塩基よりも
短い改変３'ＵＴを含む、完全な、転写能力をもつ、比
較的短い組換えＤＮＡが作製される。この組換えＤＮＡ
は通常免疫グロブリンを分泌する所定の哺乳動物細胞株
中にトランスフェクションされる。トランスフェクショ
ンされた細胞株を培養して対象のタンパク質を生産させ
る。タンパク質の生産量は比較的長い天然３'ＵＴを含
む対象のタンパク質の未改変ＤＮＡを保有する同一細胞
株のそれよりも多量である。
【００１８】１つの態様において、その短い組換えＤＮ
Ａは対象のタンパク質のＤＮＡの３'ＵＴの一部を含む
が、他のＤＮＡからの３'ＵＴを使用することもでき
る。他の態様において、改変３'ＵＴの少なくとも一部
は非細胞性ＤＮＡ（例えばウイルスＤＮＡ）から得られ
るが、とりわけそれは哺乳動物ＤＮＡから得られる。対
象のタンパク質は免疫グロブリンまたはその分画、ホル
モン、ワクチン、リンフォカイン、サイトカイン、酵素
またはプロ酵素でありうる。例えば、所望のタンパク質
はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のようなプラス
ミノーゲン活性化因子であり得、その生産は本明細書中
で実験モデルとして使用され、詳細に説明される。哺乳
動物細胞株はミエローマ細胞株のような培養可能な細胞
株であるが、通常免疫グロブリンを分泌する他の哺乳動
物細胞も使用することができる。
Ａは対象のタンパク質のＤＮＡの３'ＵＴの一部を含む
が、他のＤＮＡからの３'ＵＴを使用することもでき
る。他の態様において、改変３'ＵＴの少なくとも一部
は非細胞性ＤＮＡ（例えばウイルスＤＮＡ）から得られ
るが、とりわけそれは哺乳動物ＤＮＡから得られる。対
象のタンパク質は免疫グロブリンまたはその分画、ホル
モン、ワクチン、リンフォカイン、サイトカイン、酵素
またはプロ酵素でありうる。例えば、所望のタンパク質
はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のようなプラス
ミノーゲン活性化因子であり得、その生産は本明細書中
で実験モデルとして使用され、詳細に説明される。哺乳
動物細胞株はミエローマ細胞株のような培養可能な細胞
株であるが、通常免疫グロブリンを分泌する他の哺乳動
物細胞も使用することができる。
【００１９】本発明によれば、その方法は対象のタンパ
ク質をコードするＤＮＡに近接して、細胞エンハンサー
因子から成るＤＮＡを結合させて組換えＤＮＡの転写を
高める追加工程を含みうる。本発明はさらに係属中の米
国特許出願第８３７５９５号（１９８６年３月７日出
願）に記載されるような遮断因子を特徴としている。こ
のような遮断因子は所望タンパク質を高レベルで生産す
るがマーカータンパク質を選択に必要なレベルでしか生
産しない形質転換体の作製を可能にする。
ク質をコードするＤＮＡに近接して、細胞エンハンサー
因子から成るＤＮＡを結合させて組換えＤＮＡの転写を
高める追加工程を含みうる。本発明はさらに係属中の米
国特許出願第８３７５９５号（１９８６年３月７日出
願）に記載されるような遮断因子を特徴としている。こ
のような遮断因子は所望タンパク質を高レベルで生産す
るがマーカータンパク質を選択に必要なレベルでしか生
産しない形質転換体の作製を可能にする。
【００２０】本発明はさらに、通常免疫グロブリンを分
泌する哺乳動物細胞株にトランスフェクションした場合
に、タンパク質を生産しうるベクターを提供する。この
ベクターは先に概略した方法に従って作製された転写能
力をもつＤＮＡを含む。このベクターは対象のタンパク
質をコードする遺伝子に対して固有の天然３'ＵＴ領域
をもつベクター（その他の点では同一）と比べて、所望
タンパク質の生産量を高めるように働く。
泌する哺乳動物細胞株にトランスフェクションした場合
に、タンパク質を生産しうるベクターを提供する。この
ベクターは先に概略した方法に従って作製された転写能
力をもつＤＮＡを含む。このベクターは対象のタンパク
質をコードする遺伝子に対して固有の天然３'ＵＴ領域
をもつベクター（その他の点では同一）と比べて、所望
タンパク質の生産量を高めるように働く。
【００２１】本発明はさらに対象のタンパク質を生産す
る形質転換体を提供する。この形質転換体は好ましくは
ミエローマ細胞のような通常免疫グロブリンを生産する
哺乳動物細胞から成り、先に概略可能なＤＮＡを含むベ
クターを保有している。この形質転換体は対象のタンパ
ク質をコードする遺伝子に対して固有の天然３'非翻訳
領域を含む組換えＤＮＡを保有する形質転換体（その他
の点では同一）と比べて、増大した量の対象タンパク質
を生産することができる。
る形質転換体を提供する。この形質転換体は好ましくは
ミエローマ細胞のような通常免疫グロブリンを生産する
哺乳動物細胞から成り、先に概略可能なＤＮＡを含むベ
クターを保有している。この形質転換体は対象のタンパ
ク質をコードする遺伝子に対して固有の天然３'非翻訳
領域を含む組換えＤＮＡを保有する形質転換体（その他
の点では同一）と比べて、増大した量の対象タンパク質
を生産することができる。
【００２２】本発明に従ってもたらされる発現レベルの
増加は、明らかにトランスフェクションした細胞内での
対応ｍＲＮＡの定常状態レベルの増加によって引き起こ
される。融合ｍＲＮＡの３'ＵＴ領域が短いことは、細
胞内でのｍＲＮＡの分解を低下させるのに役立ち、それ
によりｍＲＮＡの細胞内半減期を増加させて発現レベル
を高めると考えられる。
増加は、明らかにトランスフェクションした細胞内での
対応ｍＲＮＡの定常状態レベルの増加によって引き起こ
される。融合ｍＲＮＡの３'ＵＴ領域が短いことは、細
胞内でのｍＲＮＡの分解を低下させるのに役立ち、それ
によりｍＲＮＡの細胞内半減期を増加させて発現レベル
を高めると考えられる。
【００２３】ＤＮＡおよびＲＮＡのホスホジエステル結
合はその分子の３'末端または５'末端に作用するエキソ
ヌクレアーゼによって攻撃されることが知られている。
３'末端に作用する酵素は３'炭素とリン酸基との間のエ
ステル結合を加水分解し、一方５'酵素はリン酸基とホ
スホジエステル結合の５'炭素との間のエステル結合を
加水分解する。エンドヌクレアーゼは遊離末端３'また
は５'−ヒドロキシル基を必要とせず、３'または５'結
合がポリヌクレオチド鎖中に存在するところはどこまで
も攻撃する。長い３'ＵＴを含む組換えＤＮＡは、リボ
ソームに結合していない３'ＵＴのｍＲＮＡの一部がエ
ンドヌクレアーゼにより切断され、続いてエキソヌクレ
アーゼにより消化されると仮定できる。ｍＲＮＡの３'
ＵＴ領域が短いと、それがリボソームと結合するとき、
未結合状態のｍＲＮＡがより少なくなり、エンドヌクレ
アーゼの攻撃を受ける部位の数が減少する。ポリＡ部位
の存在は３'末端をエキソヌクレアーゼから保護する。
こうして、ｍＲＮＡの分解速度は３'ＵＴ領域の短縮化
ゆえに低下する。従って、本発明の手法により、ｍＲＮ
Ａは安定化され、その生物学的機能は所望タンパク質の
発現増加をもたらすように高められる。
合はその分子の３'末端または５'末端に作用するエキソ
ヌクレアーゼによって攻撃されることが知られている。
３'末端に作用する酵素は３'炭素とリン酸基との間のエ
ステル結合を加水分解し、一方５'酵素はリン酸基とホ
スホジエステル結合の５'炭素との間のエステル結合を
加水分解する。エンドヌクレアーゼは遊離末端３'また
は５'−ヒドロキシル基を必要とせず、３'または５'結
合がポリヌクレオチド鎖中に存在するところはどこまで
も攻撃する。長い３'ＵＴを含む組換えＤＮＡは、リボ
ソームに結合していない３'ＵＴのｍＲＮＡの一部がエ
ンドヌクレアーゼにより切断され、続いてエキソヌクレ
アーゼにより消化されると仮定できる。ｍＲＮＡの３'
ＵＴ領域が短いと、それがリボソームと結合するとき、
未結合状態のｍＲＮＡがより少なくなり、エンドヌクレ
アーゼの攻撃を受ける部位の数が減少する。ポリＡ部位
の存在は３'末端をエキソヌクレアーゼから保護する。
こうして、ｍＲＮＡの分解速度は３'ＵＴ領域の短縮化
ゆえに低下する。従って、本発明の手法により、ｍＲＮ
Ａは安定化され、その生物学的機能は所望タンパク質の
発現増加をもたらすように高められる。
【００２４】本発明は、哺乳動物細胞において所定のタ
ンパク質の生産を増大させるための方法、ベクターおよ
び形質転換細胞を提供する。対象のタンパク質をコード
するＤＮＡの３'ＵＴ領域は、一般に約３００個以下の
ヌクレオチド塩基から成る３'ＵＴ領域をもつ比較的短
い組換えＤＮＡを生ずるように改変され、そしてその遺
伝子の翻訳終止コドンとＡＡＴＡＡポリＡシグナルとの
間に２００個以下の塩基を含みうる。通常免疫グロブリ
ンを生産・分泌する哺乳動物細胞株が得られた組換えＤ
ＮＡでトランスフェクションされる。この形質転換細胞
を培養することにより、末改変３'ＵＴ領域を含む同一
の形質転換細胞株と比較して、増大した量の対象タンパ
ク質が生産される。
ンパク質の生産を増大させるための方法、ベクターおよ
び形質転換細胞を提供する。対象のタンパク質をコード
するＤＮＡの３'ＵＴ領域は、一般に約３００個以下の
ヌクレオチド塩基から成る３'ＵＴ領域をもつ比較的短
い組換えＤＮＡを生ずるように改変され、そしてその遺
伝子の翻訳終止コドンとＡＡＴＡＡポリＡシグナルとの
間に２００個以下の塩基を含みうる。通常免疫グロブリ
ンを生産・分泌する哺乳動物細胞株が得られた組換えＤ
ＮＡでトランスフェクションされる。この形質転換細胞
を培養することにより、末改変３'ＵＴ領域を含む同一
の形質転換細胞株と比較して、増大した量の対象タンパ
ク質が生産される。
【００２５】本発明方法を第１図に示す。ＤＮＡ２は対
象のタンパク質をコードするコード領域６を含む。それ
はそのタンパク質を自然界で生産する細胞から誘導さ
れ、例えばＤＮＡ配列の知識から慣用技術を用いて合成
される。例えば、そのＤＮＡは自然界に存在するＤＮＡ
または化学的に合成されたＤＮＡでありうる。また、そ
のＤＮＡは慣用のｃＤＮＡ技術により誘導された逆転写
ｃＤＮＡでありうる。このＤＮＡ２の非翻訳領域４の一
般に長いヌクレオチド配列は、対象のタンパク質をコー
ドする領域６と、翻訳終止コドンのあとの、ポリＡ付加
シグナル８に結合された約３００ヌクレオチド塩基長以
下の３'ＵＴ（７）とを含む、完全な、転写能力をも
つ、比較的短い組換えＤＮＡ５を生ずるように改変され
る。従って、組換えＤＮＡ５は対象のタンパク質のコー
ド領域６、翻訳終止コドン１２、および翻訳終止コドン
１２とポリＡ付加シグナル８の間に挿入された比較的短
い３'ＵＴ（７と記す）から成る。組換えＤＮＡのポリ
Ａ部位を含む３'ＵＴは、３'ＵＴのセグメントをスプラ
イシングすることにより対象のタンパク質をコードする
ＤＮＡ２から、または他のＤＮＡから得ることができ
る。組換えＤＮＡ５はプラスミド１０に挿入して発現ベ
クター１４を作製する。このプラスミドはプロモーター
配列１６および発現可能なマーカー遺伝子１８を含む。
この組換えＤＮＡを用いて哺乳動物細胞株をトランスフ
ェクションし、クローニングし、そして遺伝子６を首尾
よく取り込んでそれを発現できる細胞のサブ集団につい
てスクリーニングする。トランスフェクションされた細
胞株は培養して所望タンパク質を生産させ、その後その
タンパク質を分離・精製する。
象のタンパク質をコードするコード領域６を含む。それ
はそのタンパク質を自然界で生産する細胞から誘導さ
れ、例えばＤＮＡ配列の知識から慣用技術を用いて合成
される。例えば、そのＤＮＡは自然界に存在するＤＮＡ
または化学的に合成されたＤＮＡでありうる。また、そ
のＤＮＡは慣用のｃＤＮＡ技術により誘導された逆転写
ｃＤＮＡでありうる。このＤＮＡ２の非翻訳領域４の一
般に長いヌクレオチド配列は、対象のタンパク質をコー
ドする領域６と、翻訳終止コドンのあとの、ポリＡ付加
シグナル８に結合された約３００ヌクレオチド塩基長以
下の３'ＵＴ（７）とを含む、完全な、転写能力をも
つ、比較的短い組換えＤＮＡ５を生ずるように改変され
る。従って、組換えＤＮＡ５は対象のタンパク質のコー
ド領域６、翻訳終止コドン１２、および翻訳終止コドン
１２とポリＡ付加シグナル８の間に挿入された比較的短
い３'ＵＴ（７と記す）から成る。組換えＤＮＡのポリ
Ａ部位を含む３'ＵＴは、３'ＵＴのセグメントをスプラ
イシングすることにより対象のタンパク質をコードする
ＤＮＡ２から、または他のＤＮＡから得ることができ
る。組換えＤＮＡ５はプラスミド１０に挿入して発現ベ
クター１４を作製する。このプラスミドはプロモーター
配列１６および発現可能なマーカー遺伝子１８を含む。
この組換えＤＮＡを用いて哺乳動物細胞株をトランスフ
ェクションし、クローニングし、そして遺伝子６を首尾
よく取り込んでそれを発現できる細胞のサブ集団につい
てスクリーニングする。トランスフェクションされた細
胞株は培養して所望タンパク質を生産させ、その後その
タンパク質を分離・精製する。
【００２６】免疫グロブリンを分泌するリンパ系細胞中
の非常に豊富な免疫グロブリンｍＲＮＡの３'ＵＴは比
較的短い（約３００ヌクレオチド以下）が、リンパ系細
胞中で発現されないいくつかの対象遺伝子の３'ＵＴは
比較的長いことが知られている。例えば、ｔＰＡのＵＴ
領域は約８００ヌクレオチド長であり〔ペニカ（Pennic
a）ら、Nature, V.301, 214〜231，１９８３年１月を参
照〕、第VIII因子のそれは約１８００ヌクレオチド長で
あり〔ウッド（Wood）ら、Nature, V.312, 330〜337，
１９８４年１１月を参照〕、そしてエリトロポエチンの
それは約５６０ヌクレオチド長である〔ジャコブ（Jaco
bs）ら、Nature, V.313, 816〜810，１９８５年２月を
参照〕。
の非常に豊富な免疫グロブリンｍＲＮＡの３'ＵＴは比
較的短い（約３００ヌクレオチド以下）が、リンパ系細
胞中で発現されないいくつかの対象遺伝子の３'ＵＴは
比較的長いことが知られている。例えば、ｔＰＡのＵＴ
領域は約８００ヌクレオチド長であり〔ペニカ（Pennic
a）ら、Nature, V.301, 214〜231，１９８３年１月を参
照〕、第VIII因子のそれは約１８００ヌクレオチド長で
あり〔ウッド（Wood）ら、Nature, V.312, 330〜337，
１９８４年１１月を参照〕、そしてエリトロポエチンの
それは約５６０ヌクレオチド長である〔ジャコブ（Jaco
bs）ら、Nature, V.313, 816〜810，１９８５年２月を
参照〕。
【００２７】本発明において有用な発現ベクターおよび
形質転換体を作製するための組換えＤＮＡ技術は開発さ
れており、公知である。それらはＤＮＡを配列特異的に
切断して平滑末端または接着末端を生ずる種々の制限酵
素、ＤＮＡリガーゼ、平滑末端をもつＤＮＡ分子への接
着末端の酵素的付加を可能にする技術、ｃＤＮＡ合成技
術、特定の機能をもつ遺伝子を単離するための合成プロ
ーブ、合成ＤＮＡを作るためのオリゴヌクレオチドの集
成、慣用のトランスフェクション技術、および同様に慣
用のＤＮＡクローニング／サブクローニング技術の使用
を伴う。
形質転換体を作製するための組換えＤＮＡ技術は開発さ
れており、公知である。それらはＤＮＡを配列特異的に
切断して平滑末端または接着末端を生ずる種々の制限酵
素、ＤＮＡリガーゼ、平滑末端をもつＤＮＡ分子への接
着末端の酵素的付加を可能にする技術、ｃＤＮＡ合成技
術、特定の機能をもつ遺伝子を単離するための合成プロ
ーブ、合成ＤＮＡを作るためのオリゴヌクレオチドの集
成、慣用のトランスフェクション技術、および同様に慣
用のＤＮＡクローニング／サブクローニング技術の使用
を伴う。
【００２８】いろいろな型のベクター、例えばプラスミ
ドやウイルス（動物ウイルスおよびファージを含む）が
使用される。ベクターは通常細胞集団のどの固体がベク
ター１４の組換えＤＮＡを首尾よく組み込んだかを同定
するために使用しうる、検出可能な表現型特性をトラン
スフェクションした細胞に付与するマーカー遺伝子１８
を含むであろう。ミエローマ細胞株において使用するの
に適したマーカーは、トキシン含有培地中でその細胞を
生存させうる酵素（通常その細胞によって発現されない
か、又は低レベルでしか発現されない酵素）をコードす
るＤＮＡから成る。このような酵素の例にはチミジンキ
ナーゼ（ＴＫ）、アデノシン・ホスホリボシルトランス
フェラーゼ（ＡＰＲＴ）、およびヒポキサンチン・ホス
ホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、これら
の酵素はＴＫ、ＡＰＲＴまたはＨＰＲＴ欠損細胞をそれ
ぞれヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン培地中
で生育させる；ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、こ
の酵素はＤＨＦＲ欠損細胞をメトトレキセートの存在下
で生育させる；大腸菌酵素キサンチン−グアノシン・ホ
スホリボシル・トランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ，ｇｐ
ｔ遺伝子の産物）、この酵素は正常細胞をミコフェノー
ル酸の存在下で生育させる；および原核生物酵素Ｔｎ５
ホスホトランスフェラーゼ、この酵素は正常細胞をネオ
マイシンの存在下で生育させる；が含まれる。その他の
適当なマーカー遺伝子も、本発明に従ってミエローマ細
胞を形質転換するために使用されるベクターにおいて有
用であるだろう。
ドやウイルス（動物ウイルスおよびファージを含む）が
使用される。ベクターは通常細胞集団のどの固体がベク
ター１４の組換えＤＮＡを首尾よく組み込んだかを同定
するために使用しうる、検出可能な表現型特性をトラン
スフェクションした細胞に付与するマーカー遺伝子１８
を含むであろう。ミエローマ細胞株において使用するの
に適したマーカーは、トキシン含有培地中でその細胞を
生存させうる酵素（通常その細胞によって発現されない
か、又は低レベルでしか発現されない酵素）をコードす
るＤＮＡから成る。このような酵素の例にはチミジンキ
ナーゼ（ＴＫ）、アデノシン・ホスホリボシルトランス
フェラーゼ（ＡＰＲＴ）、およびヒポキサンチン・ホス
ホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、これら
の酵素はＴＫ、ＡＰＲＴまたはＨＰＲＴ欠損細胞をそれ
ぞれヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン培地中
で生育させる；ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、こ
の酵素はＤＨＦＲ欠損細胞をメトトレキセートの存在下
で生育させる；大腸菌酵素キサンチン−グアノシン・ホ
スホリボシル・トランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ，ｇｐ
ｔ遺伝子の産物）、この酵素は正常細胞をミコフェノー
ル酸の存在下で生育させる；および原核生物酵素Ｔｎ５
ホスホトランスフェラーゼ、この酵素は正常細胞をネオ
マイシンの存在下で生育させる；が含まれる。その他の
適当なマーカー遺伝子も、本発明に従ってミエローマ細
胞を形質転換するために使用されるベクターにおいて有
用であるだろう。
【００２９】本発明のベクターは、エンハンサー因子の
５'末端と３'末端の両方に配置されたプロモーター、ま
たは両末端から離れて配置されたプロモーターに作用し
て、プロモーターの３'末端に存在する遺伝子の転写を
増強するタイプのエンハンサー因子を含むことができ
る。エンハンサー因子にはバナージ（Banerji）ら〔Cel
l, V.27, 299〜308，１９８１〕、デビリアー（deVilli
ers）およびシャフナー（Shaffner）〔Nucl. Acids Re
s., V.9, 6251〜6264, 1981〕またはレビンソン（Levin
son）ら〔Nature, V.295, 568〜572, 1982〕によって開
示されたようなウイルス由来のＤＮＡが含まれるが、好
ましくはギリエス（Gillies）およびトネガワ（Tonegaw
a）によって最近発見され、Cell, V.33, 717〜728, 198
3 に発表され、より詳細には係属中の米国特許出願第５
９２２３１号（１９８４年３月２２日出願）に開示され
たタイプの細胞エンハンサー因子である。本発明ベクタ
ーはさらに係属中の米国特許出願第８３７５９５号（１
９８６年３月７日出願）に記載されるような遮断因子を
含むことができ、この遮断因子はエンハンサーの影響下
に所望タンパク質を高レベルで生産するが、マーカータ
ンパク質を選択に必要な低レベルでしか生産しない形質
転換体の作製を可能にする。
５'末端と３'末端の両方に配置されたプロモーター、ま
たは両末端から離れて配置されたプロモーターに作用し
て、プロモーターの３'末端に存在する遺伝子の転写を
増強するタイプのエンハンサー因子を含むことができ
る。エンハンサー因子にはバナージ（Banerji）ら〔Cel
l, V.27, 299〜308，１９８１〕、デビリアー（deVilli
ers）およびシャフナー（Shaffner）〔Nucl. Acids Re
s., V.9, 6251〜6264, 1981〕またはレビンソン（Levin
son）ら〔Nature, V.295, 568〜572, 1982〕によって開
示されたようなウイルス由来のＤＮＡが含まれるが、好
ましくはギリエス（Gillies）およびトネガワ（Tonegaw
a）によって最近発見され、Cell, V.33, 717〜728, 198
3 に発表され、より詳細には係属中の米国特許出願第５
９２２３１号（１９８４年３月２２日出願）に開示され
たタイプの細胞エンハンサー因子である。本発明ベクタ
ーはさらに係属中の米国特許出願第８３７５９５号（１
９８６年３月７日出願）に記載されるような遮断因子を
含むことができ、この遮断因子はエンハンサーの影響下
に所望タンパク質を高レベルで生産するが、マーカータ
ンパク質を選択に必要な低レベルでしか生産しない形質
転換体の作製を可能にする。
【００３０】第３図は本発明に従ってｔＰＡを生産する
ために使用しうる好適なプラスミドベクターの制限地図
を表す。このベクターはｐＥＭｐ−ｔＰＡと呼ばれ、７
４９８塩基対から構成されている。それはタンパク質
（ここではヒトｔＰＡ）をコードする挿入ＤＮＡからの
ｍＲＮＡの転写を増強するミエローマ細胞由来のエンハ
ンサー因子を含み〔ギリエス（Gillies）ら、Cell, 198
3，同上を参照〕、そして係属中の米国特許出願第８３
７５９５号に記載の手法に従ってエンハンサー機能を選
択的に調節するベクター構築原理を利用している。ベク
ター構築の詳細を以下に述べる。
ために使用しうる好適なプラスミドベクターの制限地図
を表す。このベクターはｐＥＭｐ−ｔＰＡと呼ばれ、７
４９８塩基対から構成されている。それはタンパク質
（ここではヒトｔＰＡ）をコードする挿入ＤＮＡからの
ｍＲＮＡの転写を増強するミエローマ細胞由来のエンハ
ンサー因子を含み〔ギリエス（Gillies）ら、Cell, 198
3，同上を参照〕、そして係属中の米国特許出願第８３
７５９５号に記載の手法に従ってエンハンサー機能を選
択的に調節するベクター構築原理を利用している。ベク
ター構築の詳細を以下に述べる。
【００３１】好適な実施態様において、組換えＤＮＡで
トランスフェクションされるべき宿主細胞は、無限に増
殖できるように改変された継代細胞株または樹立細胞株
である。従って、これらの細胞は老化する前に限られた
世代数にわたって培養下で分裂する正常細胞と相違して
いる。無限に増殖する能力は対象タンパク質の生産をス
ケールアップするのに役立つ。
トランスフェクションされるべき宿主細胞は、無限に増
殖できるように改変された継代細胞株または樹立細胞株
である。従って、これらの細胞は老化する前に限られた
世代数にわたって培養下で分裂する正常細胞と相違して
いる。無限に増殖する能力は対象タンパク質の生産をス
ケールアップするのに役立つ。
【００３２】本発明の実施に際して使用される宿主細胞
は、通常免疫グロブリンを生産・分泌する哺乳動物細胞
である。これらの細胞は一般に循環系に存在する。実際
に使用される細胞は予め選択することにより免疫グロブ
リンを分泌する能力を失ったものである。
は、通常免疫グロブリンを生産・分泌する哺乳動物細胞
である。これらの細胞は一般に循環系に存在する。実際
に使用される細胞は予め選択することにより免疫グロブ
リンを分泌する能力を失ったものである。
【００３３】さらに、ヒトウイルスによるタンパク質産
物の汚染の可能性を減らすために、宿主系は（ヒト細胞
ではなく）ネズミまたはラット由来の細胞であることが
好ましい。好適な態様では、ミエローマ細胞が宿主培養
系を構成する。ミエローマ細胞は一般に培養が簡単であ
り、発現産物を細胞外培地中へ分泌する。
物の汚染の可能性を減らすために、宿主系は（ヒト細胞
ではなく）ネズミまたはラット由来の細胞であることが
好ましい。好適な態様では、ミエローマ細胞が宿主培養
系を構成する。ミエローマ細胞は一般に培養が簡単であ
り、発現産物を細胞外培地中へ分泌する。
【００３４】第３図に示したベクターおよび他の適当な
発現ベクターはミエローマ細胞、好ましくはネズミ由来
のもの、例えば細胞株Ｊ５５８（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ
６）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５
８１）およびＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５８０）をトランスフェクションするために
本発明に従って使用される。好適なミエローマ細胞株は
Ｊ５５８Ｌである（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９１３２，オイ
（0i）ら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, V.80, p.825
1983 を参照〕。これらの細胞はＢａｌｂ／Ｃマウスの
循環系からのＢ細胞の悪性形質転換体であり、骨髄腫組
織から誘導される。
発現ベクターはミエローマ細胞、好ましくはネズミ由来
のもの、例えば細胞株Ｊ５５８（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ
６）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５
８１）およびＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５８０）をトランスフェクションするために
本発明に従って使用される。好適なミエローマ細胞株は
Ｊ５５８Ｌである（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９１３２，オイ
（0i）ら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, V.80, p.825
1983 を参照〕。これらの細胞はＢａｌｂ／Ｃマウスの
循環系からのＢ細胞の悪性形質転換体であり、骨髄腫組
織から誘導される。
【００３５】上記の細胞型の形質転換体は、リム（F. L
im）の米国特許第４４０９３３１号に記載の方法に従っ
て、懸濁液中または好ましくはマイクロカプセル内で培
養される。タンパク質産物の精製を容易にし且つ分泌後
の安定性を高めるために、細胞は無血清培地で培養する
ことが好適である。細胞外タンパク質は培地を取り換え
るとき毎日回収する。この方法はウシまたはウマ血清中
にしばしば存在する汚染性のタンパク質分解酵素および
他の不活化因子の混入していない産物をもたらす利点を
有している。好適なＪ５５８Ｌ細胞は免疫グロブリンＡ
のラムダ軽鎖を有意量分泌するが、このタンパク質およ
び他の夾雑タンパク質はタンパク質産物から容易に分離
することができる。
im）の米国特許第４４０９３３１号に記載の方法に従っ
て、懸濁液中または好ましくはマイクロカプセル内で培
養される。タンパク質産物の精製を容易にし且つ分泌後
の安定性を高めるために、細胞は無血清培地で培養する
ことが好適である。細胞外タンパク質は培地を取り換え
るとき毎日回収する。この方法はウシまたはウマ血清中
にしばしば存在する汚染性のタンパク質分解酵素および
他の不活化因子の混入していない産物をもたらす利点を
有している。好適なＪ５５８Ｌ細胞は免疫グロブリンＡ
のラムダ軽鎖を有意量分泌するが、このタンパク質およ
び他の夾雑タンパク質はタンパク質産物から容易に分離
することができる。
【００３６】本発明はここに記載されるような遺伝子操
作された細胞を用いてｔＰＡおよび他の価値あるタンパ
ク質を多量に生産するために使用される。非限定的な例
として他のプラスミノーゲン活性化因子およびプロ活性
化因子、血液凝固因子、ホルモン、インターフェロン、
抗体、酵素およびプロ酵素、ワクチン、ならびに種々の
リンフォカインおよびサイトカインが含まれる。
作された細胞を用いてｔＰＡおよび他の価値あるタンパ
ク質を多量に生産するために使用される。非限定的な例
として他のプラスミノーゲン活性化因子およびプロ活性
化因子、血液凝固因子、ホルモン、インターフェロン、
抗体、酵素およびプロ酵素、ワクチン、ならびに種々の
リンフォカインおよびサイトカインが含まれる。
【００３７】以下の実施例はすべての点で例示的である
と理解されるべきであり、本発明の具体例であるｔＰＡ
の生産プロトコールの詳細な説明、ならびに現在知られ
た最良の本発明実施方法の開示を提供するものである。
と理解されるべきであり、本発明の具体例であるｔＰＡ
の生産プロトコールの詳細な説明、ならびに現在知られ
た最良の本発明実施方法の開示を提供するものである。
【００３８】
【実施例】ｔＰＡを生産するミエローマ形質転換細胞の形成 ｐＥＭｐ１と呼ばれる基本的な発現ベクターは以下のフ
ラグメントから構築した：（ａ） ＳＶ４０エンハンサ
ーおよび初期領域プロモーター、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、
ＳＶ４０小型腫瘍抗原介在配列、ならびにＳＶ４０転写
終結およびポリアデニル化シグナルを含むｐＳＶ２−ｇ
ｐｔ〔ミュリガン（Mulligan）およびバーグ（Berg），
Science, V.209, 1422〜1427, 1980 を参照〕由来の
２．２５ｋｂ ＰｖｕII−ＢａｍＨＩ フラグメント；
（ｂ）アンピシリナーゼ遺伝子および細菌複製起点を含
むｐＢＲ３２２由来の２．３ｋｂ ＰｖｕII−ＥｃｏＲ
Ｉフラグメント〔サトクリフ（Sutcliffe），Proc. Nat
l. Acad. Sci., USA, V.75,3737,1978 を参照〕；
（ｃ） 免疫グロブリン重鎖エンハンサーを含む０．３
ｋｂ ＰｖｕII−ＥｃｏＲＩフラグメント〔ギリエス
（Gillies）ら、Cell, V.33,p.717〜728, 1983 を参
照〕；（ｄ） メタロチオネインＩプロモーターを含む
０．２５ｋｂ Ｓａｃｌ−ＢｇｌII フラグメント〔ブ
リンスター（Brinster）ら、Nature, V.296, 39〜42, 1
982 を参照〕；および（ｅ） ポリアデニル化シグナル
を含むグロブリンカッパ軽鎖遺伝子の３'ＵＴ領域から
の０．４ｋｂ ＡｖａII−ＨａｅIII フラグメント
〔マックス（Max）ら、J. Biol. Chem., V.256, 5116〜
5120, 1981 を参照〕。これらのフラグメントは公知の
方法論に従って一連の反応により連結させた〔例えばマ
ニアチス（Maniatis）ら、Molecular Cloning:A Labora
tory Manual，コールド・スプリング・ハーバー，１９
８２ を参照されたい〕。
ラグメントから構築した：（ａ） ＳＶ４０エンハンサ
ーおよび初期領域プロモーター、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、
ＳＶ４０小型腫瘍抗原介在配列、ならびにＳＶ４０転写
終結およびポリアデニル化シグナルを含むｐＳＶ２−ｇ
ｐｔ〔ミュリガン（Mulligan）およびバーグ（Berg），
Science, V.209, 1422〜1427, 1980 を参照〕由来の
２．２５ｋｂ ＰｖｕII−ＢａｍＨＩ フラグメント；
（ｂ）アンピシリナーゼ遺伝子および細菌複製起点を含
むｐＢＲ３２２由来の２．３ｋｂ ＰｖｕII−ＥｃｏＲ
Ｉフラグメント〔サトクリフ（Sutcliffe），Proc. Nat
l. Acad. Sci., USA, V.75,3737,1978 を参照〕；
（ｃ） 免疫グロブリン重鎖エンハンサーを含む０．３
ｋｂ ＰｖｕII−ＥｃｏＲＩフラグメント〔ギリエス
（Gillies）ら、Cell, V.33,p.717〜728, 1983 を参
照〕；（ｄ） メタロチオネインＩプロモーターを含む
０．２５ｋｂ Ｓａｃｌ−ＢｇｌII フラグメント〔ブ
リンスター（Brinster）ら、Nature, V.296, 39〜42, 1
982 を参照〕；および（ｅ） ポリアデニル化シグナル
を含むグロブリンカッパ軽鎖遺伝子の３'ＵＴ領域から
の０．４ｋｂ ＡｖａII−ＨａｅIII フラグメント
〔マックス（Max）ら、J. Biol. Chem., V.256, 5116〜
5120, 1981 を参照〕。これらのフラグメントは公知の
方法論に従って一連の反応により連結させた〔例えばマ
ニアチス（Maniatis）ら、Molecular Cloning:A Labora
tory Manual，コールド・スプリング・ハーバー，１９
８２ を参照されたい〕。
【００３９】この基本的な発現ベクターを使用して、ｔ
ＰＡを発現する一連のベクターを構築した。ｐＥＭ１−
ｔＰＡ−Ａ，−Ｂおよび−Ｃと呼ばれ３種類のベクター
はすべてｔＰＡｃＤＮＡの全コード領域を含んでいた
が、以下のようにそれらの３'非翻訳領域において相違
していた。
ＰＡを発現する一連のベクターを構築した。ｐＥＭ１−
ｔＰＡ−Ａ，−Ｂおよび−Ｃと呼ばれ３種類のベクター
はすべてｔＰＡｃＤＮＡの全コード領域を含んでいた
が、以下のようにそれらの３'非翻訳領域において相違
していた。
【００４０】ｔＰＡのｃＤＮＡは標準的手法（マニアチ
ス、上記文献参照）により得られた。全コード領域およ
び約８００塩基対の３'ＵＴ領域を含むｔＰＡクローン
はヌクレオチド配列決定により同定・確認した。ｔＰＡ
ｃＤＮＡは翻訳終止コドンの約４００塩基対下流にある
ＢｇｌII部位で切断し、次に基本ベクターの唯一のＸｈ
ｏI部位へＸｈｏIリンカーを介して挿入した。従って、
この発現ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ａ中のｔＰＡ３'
ＵＴ領域は、約４００塩基対の天然ｔＰＡ３'ＵＴおよ
び２００塩基対の免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子の
３'ＵＴ領域から成っていた。
ス、上記文献参照）により得られた。全コード領域およ
び約８００塩基対の３'ＵＴ領域を含むｔＰＡクローン
はヌクレオチド配列決定により同定・確認した。ｔＰＡ
ｃＤＮＡは翻訳終止コドンの約４００塩基対下流にある
ＢｇｌII部位で切断し、次に基本ベクターの唯一のＸｈ
ｏI部位へＸｈｏIリンカーを介して挿入した。従って、
この発現ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ａ中のｔＰＡ３'
ＵＴ領域は、約４００塩基対の天然ｔＰＡ３'ＵＴおよ
び２００塩基対の免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子の
３'ＵＴ領域から成っていた。
【００４１】ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｂでは、大部
分の天然ｔＰＡ３'ＵＴが翻訳終止コドンの３４塩基対
下流に位置するＳａｕ３Ａ部位でクローニングし、そし
て２００塩基対の免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子の
３'ＵＴへ結合させることにより除去された。
分の天然ｔＰＡ３'ＵＴが翻訳終止コドンの３４塩基対
下流に位置するＳａｕ３Ａ部位でクローニングし、そし
て２００塩基対の免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子の
３'ＵＴへ結合させることにより除去された。
【００４２】ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｃは、カッパ
軽鎖遺伝子の３'ＵＴ領域がＳＶ４０後期遺伝子の３'Ｕ
Ｔ領域からの約２００塩基対フラグメントと置換された
という点でｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｂと異なっていた。
軽鎖遺伝子の３'ＵＴ領域がＳＶ４０後期遺伝子の３'Ｕ
Ｔ領域からの約２００塩基対フラグメントと置換された
という点でｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｂと異なっていた。
【００４３】上記の種々の３'ＵＴ領域をもつ組換えｔ
ＰＡ遺伝子を第２図に示す。ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ
−Ａでは翻訳終止コドンとＡＡＴＡＡＡポリＡシグナル
との間が約０．５９ｋｂであり、ｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｂ
では０．２３ｋｂ、そしてｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｃでは
０．１６ｋｂである。
ＰＡ遺伝子を第２図に示す。ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ
−Ａでは翻訳終止コドンとＡＡＴＡＡＡポリＡシグナル
との間が約０．５９ｋｂであり、ｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｂ
では０．２３ｋｂ、そしてｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｃでは
０．１６ｋｂである。
【００４４】ｔＰＡ含有プラスミドはプロトプラスト融
合法（ギリエスら、上記文献参照）によってＪ５５８Ｌ
ミエローマ細胞へトランスフェクションした。このプラ
スミドを含み、それ故にｇｐｔ遺伝子を含む細胞はミコ
フェノール酸含有培地で培養することにより選択した。
このプラスミドを含む耐性コロニーをサブクローニング
して、ｔＰＡ発現についてスクリーニングした。ｔＰＡ
の合成および培地中へのｔＰＡの分泌は、ｔＰＡがプラ
スミノーゲンをプラスミンに転化し、次いでプラスミン
が色素原トリペプチドＳ２２５１を分解する検定法を用
いて調べた（ベニカら、上記文献参照）。血清はｔＰＡ
およびプラスミンの両方の阻害剤を含むことが知られて
いる〔コレン（Collen）およびリネン（Lijnen）、CRC
CriticalReviews in Oncology/Hematologｙ, V.4, 249
〜301, 1986 を参照〕ので、検定前に形質転換細胞を無
血清倍地中で４８時間培養した。活性は世界保健機構に
よって供給された標品に基づいて国際単位（ＩＵ）で測
定し、アメリカン・ダイアグノスティクス社から得られ
たｔＰＡ標品によって確認した。
合法（ギリエスら、上記文献参照）によってＪ５５８Ｌ
ミエローマ細胞へトランスフェクションした。このプラ
スミドを含み、それ故にｇｐｔ遺伝子を含む細胞はミコ
フェノール酸含有培地で培養することにより選択した。
このプラスミドを含む耐性コロニーをサブクローニング
して、ｔＰＡ発現についてスクリーニングした。ｔＰＡ
の合成および培地中へのｔＰＡの分泌は、ｔＰＡがプラ
スミノーゲンをプラスミンに転化し、次いでプラスミン
が色素原トリペプチドＳ２２５１を分解する検定法を用
いて調べた（ベニカら、上記文献参照）。血清はｔＰＡ
およびプラスミンの両方の阻害剤を含むことが知られて
いる〔コレン（Collen）およびリネン（Lijnen）、CRC
CriticalReviews in Oncology/Hematologｙ, V.4, 249
〜301, 1986 を参照〕ので、検定前に形質転換細胞を無
血清倍地中で４８時間培養した。活性は世界保健機構に
よって供給された標品に基づいて国際単位（ＩＵ）で測
定し、アメリカン・ダイアグノスティクス社から得られ
たｔＰＡ標品によって確認した。
【００４５】ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ａを用いてト
ランスフェクションした細胞には、ｔＰＡをコードする
ｍＲＮＡが低レベルで存在することが分析の結果分かっ
たが、有意量のｔＰＡを発現するクローンは全く検出で
きなかった。ｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｂでトランスフェクシ
ョンした２６個のクローンのうち、５個がｔＰＡを発現
した。最高発現レベルを相対値１．００とすると、ｐＥ
Ｍ１−ｔＰＡ−ＢトランスフェクションによるｔＰＡの
発現は０．２８〜１．００の範囲であった。ｐＥＭ１−
ｔＰＡ−Ｃでトランスフェクションした１４個のクロー
ンのうち、６個が０．１２〜０．４４の相対レベルでｔ
ＰＡを発現した。
ランスフェクションした細胞には、ｔＰＡをコードする
ｍＲＮＡが低レベルで存在することが分析の結果分かっ
たが、有意量のｔＰＡを発現するクローンは全く検出で
きなかった。ｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｂでトランスフェクシ
ョンした２６個のクローンのうち、５個がｔＰＡを発現
した。最高発現レベルを相対値１．００とすると、ｐＥ
Ｍ１−ｔＰＡ−ＢトランスフェクションによるｔＰＡの
発現は０．２８〜１．００の範囲であった。ｐＥＭ１−
ｔＰＡ−Ｃでトランスフェクションした１４個のクロー
ンのうち、６個が０．１２〜０．４４の相対レベルでｔ
ＰＡを発現した。
【００４６】本発明はその精神および範囲から逸脱する
ことなしに他の特定形態に具体化することが可能であ
る。
ことなしに他の特定形態に具体化することが可能であ
る。
【図１】第１図は本発明方法の全工程を例示する概略図
であり；
であり；
【図２】第２図は所望のタンパク質産物（ｔＰＡ）をコ
ードする遺伝子と融合させた種々のＤＮＡセグメントを
示す模式図であり；そして
ードする遺伝子と融合させた種々のＤＮＡセグメントを
示す模式図であり；そして
【図３】第３図はミエローマ細胞によりｔＰＡを生産す
るのに適した発現ベクターのプラスミドｐＥＭｐ−ｔＰ
Ａを示す模式図である。このベクターは現在のところ好
適な本発明の態様を示すものである。
るのに適した発現ベクターのプラスミドｐＥＭｐ−ｔＰ
Ａを示す模式図である。このベクターは現在のところ好
適な本発明の態様を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (73)特許権者 594075846 119 ＦＯＵＲＴＨ ＡＶＥＮＵＥ，Ｎ ＥＥＤＨＡＭ ＨＥＩＧＨＴＳ，ＭＡＳ ＳＡＣＨＵＳＥＴＴＳ 02194 ＵＮＩ ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲ ＩＣＡ
Claims (10)
- 【請求項１】免疫グロブリンを分泌するかまたは免疫グ
ロブリンを分泌する細胞株に由来する哺乳動物細胞株に
おいてタンパク質を生産する方法であって、 （ａ） 該タンパク質を自然界で生産する細胞に由来
し、順次コード領域、翻訳終止コドン、およびポリアデ
ニル化シグナルを含む非翻訳領域からなるＤＮＡを用意
し； （ｂ） 該ＤＮＡの非翻訳領域のヌクレオチド配列を改
変し、それにより翻訳終止コドンとポリアデニル化シグ
ナルとの間の距離が３００塩基対以下である改変された
非翻訳領域を有する、完全な、転写能力をもつ、より短
い組換えＤＮＡを作製し； （ｃ） 該哺乳動物細胞株において該組換えＤＮＡの転
写について作用可能なプロモーターを用意し； （ｄ） 該プロモーターと作用可能なように関連してい
る該組換えＤＮＡを用いて上記哺乳動物細胞株をトラン
スフェクションし；そして （ｅ） トランスフェクションした細胞株を培養して上
記タンパク質を生産させる； 各工程から成り、上記のトランスフェクションした細胞
株が生産するタンパク質の量は工程（ａ）に記載のＤＮ
Ａを含むがその他の点では同一である細胞株が生産する
タンパク質の量よりも多量であることを特徴とする上記
方法。 - 【請求項２】上記の改変された非翻訳領域は配列ＡＡＴ
ＡＡＡ（ここでＡはアデニンであり、Ｔはチミンであ
る）を含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】上記のより短いＤＮＡは上記ＤＮＡの非翻
訳領域の一部を含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】上記の改変された非翻訳領域の少なくとも
一部は哺乳動物以外のＤＮＡから得られる、請求項１記
載の方法。 - 【請求項５】上記の改変された非翻訳領域の少なくとも
一部は哺乳動物の遺伝子から得られる、請求項１記載の
方法。 - 【請求項６】上記コード領域は免疫グロブリン、ホルモ
ン、ワクチン、リンフォカイン、サイトカイン、酵素お
よびプロ酵素から成る群より選ばれるタンパク質をコー
ドする、請求項１記載の方法。 - 【請求項７】上記コード領域はプラスミノーゲン活性化
因子をコードする、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】上記活性化因子はヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子である、請求の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項９】上記哺乳動物細胞株はミエローマ細胞株で
ある、請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】上記組換えＤＮＡの転写を促進するため
に、該タンパク質をコードするＤＮＡに近接して、細胞
エンハンサー因子から成るＤＮＡを結合させる追加工程
を含む、請求項１記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US90706786A | 1986-09-12 | 1986-09-12 | |
| US907067 | 1986-09-12 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62505072A Division JP2619891B2 (ja) | 1986-09-12 | 1987-09-03 | 動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163388A JPH07163388A (ja) | 1995-06-27 |
| JP2622355B2 true JP2622355B2 (ja) | 1997-06-18 |
Family
ID=25423461
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62505072A Expired - Lifetime JP2619891B2 (ja) | 1986-09-12 | 1987-09-03 | 動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化 |
| JP6094831A Expired - Lifetime JP2622355B2 (ja) | 1986-09-12 | 1994-05-09 | 動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62505072A Expired - Lifetime JP2619891B2 (ja) | 1986-09-12 | 1987-09-03 | 動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化 |
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|---|---|
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| JP (2) | JP2619891B2 (ja) |
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| AU (1) | AU601214B2 (ja) |
| CA (1) | CA1297435C (ja) |
| DE (1) | DE3752281T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| WO2005073384A2 (en) * | 2004-01-28 | 2005-08-11 | Research Development Foundation | Human soluble neuropilin-1 primary polyadenylation signal and uses thereof |
| JP5240699B2 (ja) * | 2006-03-29 | 2013-07-17 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 効率的なトランスジェニックカイコの作出方法 |
| US9796973B2 (en) | 2011-04-28 | 2017-10-24 | Yamaguchi University | Terminator sequence-containing reverse primer for overexpression and linear DNA |
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|---|---|---|---|---|
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| JPS58146281A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-08-31 | Suntory Ltd | 酵母細胞の形質転換法 |
| US4663281A (en) * | 1984-03-22 | 1987-05-05 | Mass Institute Of Technology | Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells |
| DE3584341D1 (de) * | 1984-08-24 | 1991-11-14 | Upjohn Co | Rekombinante dna-verbindungen und expression von polypeptiden wie tpa. |
| US4666848A (en) * | 1984-08-31 | 1987-05-19 | Cetus Corporation | Polypeptide expression using a portable temperature sensitive control cassette with a positive retroregulatory element |
| US4675285A (en) * | 1984-09-19 | 1987-06-23 | Genetics Institute, Inc. | Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein |
| JP2549504B2 (ja) * | 1984-12-21 | 1996-10-30 | ア−ス製薬株式会社 | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 |
| JP2532858B2 (ja) * | 1985-04-01 | 1996-09-11 | セルテツク リミテツド | 形質転換したミエロ―マ細胞系 |
| FR2592449B1 (fr) * | 1985-12-30 | 1989-12-08 | Aerospatiale | Amortisseur de rotation |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
-
1987
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