JPH0829086B2

JPH0829086B2 - ポリクリングルプラスミノ−ゲン活性化因子

Info

Publication number: JPH0829086B2
Application number: JP61191173A
Authority: JP
Inventors: ポール・ポーウェン・ハング; ナレンダー・クマール・カルヤン; ショウグァング・リン・リー
Original assignee: アメリカン・ホ−ム・プロダクツ・コ−ポレイシヨン
Priority date: 1985-08-14
Filing date: 1986-08-13
Publication date: 1996-03-27
Anticipated expiration: 2011-03-27
Also published as: DK385686D0; GB2179948B; GR862076B; AU6110286A; US4916071A; CA1341449C; AU596369B2; IE59380B1; GB8619154D0; DK175420B1; PH26199A; EP0213794B1; HUT41443A; GB2179948A; EP0213794A1; DE3676760D1; JPS62104577A; HU200795B; JP2610783B2; KR900007649B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、組換えDNA技術により産生される非相同の
ポリペプチドクリングル（Kringle）を３個またはそれ
以上含有するハイブリッド第三世代プラスミノーゲン活
性化因子、およびプラスミノーゲンの血栓融解剤として
の使用方法に関する発明の背景プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンを
プラスミンに変換するセリンプロテアーゼの一種であ
る。プラスミンは、血餅のフイブリンマトリツクスを分
解し、これにより内部の血管障害により血栓症または血
栓塞栓症が起こつた後の開放性血管系の動的血液状態を
抑制する。プラスミノーゲン活性化因子で治療し得る部
分的または全体的な血管閉塞を含む血管系の症病には、
発作、肺動脈塞栓症、心筋梗塞症、および深部静脈およ
び末梢動脈閉塞が含まれる。

ヒト血漿および他の体液において、２種の免疫学的に
異なるプラスミノーゲン活性化因子、すなわち、ウロキ
ナーゼタイププラスミノーゲン活性化因子（ｕ−PA;Mr
＝55000）および組織タイププラスミノーゲン活性化因
子（ｔ−PA;Mr＝68000）が知られている。組織プラスミ
ノーゲン活性化因子の活性は、フイブリンにより増加す
る。該酵素は、血栓の部位で作用し、ウロキナーゼプラ
スミノーゲン活性化因子よりも、フイブリンに対して高
い親和力を示す〔ヘイレリスら、ジヤーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Haylaeris et al.,J.Bio
l.Chem.）257、2912（1982）参照〕。従つて、組織プラ
スミノーゲン活性化因子は、生理学的に適切な血栓溶解
剤と考えられる。

２つの活性化因子、ｕ−PAおよびｔ−PAはともに以下
の共通の特徴を有する:1）両者とも、プラスミンまたは
トリプシンにより、ジスルフイド結合した２つの鎖状分
子構造を壊さずに開列し得る一本鎖プロ酵素として合成
される。還元により、各プラスミノーゲン活性化因子
は、Ｈ鎖およびＬ鎖に分解する（ｕ−PA:Mr＝33000,t−
PA:Mr＝35000）;2）２つの酵素は、ともに、フルオロリ
ン酸ジイソプロピルなどのセリン特異性試薬により不活
化することができるセリンプロテアーゼである;3）２つ
の酵素は、ともに、分子内にループまたはクリングルを
形成する３つのジスルフイド結合したアミノ酸配列を有
する。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子は、１
つのクリングルを有する。組織プラスミノーゲン活性化
因子は、ヘキサペプチドリンカー配列により結合した２
つのクリングルを有する。これらのクリングルは、酵素
をフイブリンに結合させるものであると考えられる〔ト
ルセン、バイオヒミカ・バイオフイジカ・アクタ（Thor
sen.Biochem.Biophys.Acta.）、393、55（1975）参
照〕。

ｔ−PAのDNA配列分析およびアミノ酸配列は、ペニカ
ら、ネイチヤー（Pennica et al.,Nature）、301、214
（1983）；ニーら、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・ユー・エス・
エイ（Ny et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）81、535
5（1984）およびジエネンテク・インコーポレイテツド
（Genentech Inc.）のヨーロツパ特許出願第93619号に
より開示されている。ｕ−PAのDNA配列分析およびアミ
ノ酸配列は、ジエネンテク・インコーポレイテツドのヨ
ーロツパ特許出願第92182号に開示され、ウロキナーゼc
DNAは、ベルデら、プロシーデイングス・オブ・ナシヨ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・
エイ（Verde et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）18、
4727（1984）に開示されている。

発明の開示本発明に従って、非相同なポリペプチドクリングルを
３個またはそれ以上有するハイブリッド第三世代プラス
ミノーゲン活性化因子が提供される。本発明のポリペプ
チドは、好ましくは、３〜６個のクリングルを有する。
非相同なクリングルなる語は、異なる自然発生源におい
て見出されるクリングルに対応する少なくとも１つのク
リングルまたは天然のプラスミノーゲン活性化因子にお
いてみられるクリングルと共通の他のクリングル構造お
よびその他のクリングル構造を有するポリペプチドを意
味する。天然のプラスミノーゲン活性化因子に共通のク
リングル構造を付与して本発明のハイブリツドプラスミ
ノーゲン活性化因子を調製する場合、DNAが化学的に合
成され、該共通のクリングル産生のためのDNAコドンの
使用は、所望のアミノ酸配列のクリングルを生成する際
の組換え（ループの開裂）を避けるための天然のプラス
ミノーゲン活性化因子のDNAコーデイング配列とは異な
るものであると考えられる。本発明のハイブリツドプラ
スミノーゲン活性化因子において存在するクリングル
は、別々に相同領域を有するが、非相同であり、その結
果、本発明のプラスミノーゲン活性化因子は、アミノ酸
配列、数および／または大きさのいずれかに関して、天
然のプラスミノーゲン活性化因子とはそのクリングル構
造が異なつている。さらに、本発明は、ハイブリツドプ
ラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそ
のキー・フラグメント、完全ポリペプチドのDNA産生用
発現ベクターおよびそのキー・フラグメント、該発現ベ
クターで形質転換される微生物またはセル培養物、およ
び該ハイブリツドプラスミノーゲン活性化因子を用いる
方法を提供するものである。

クリングル構造は、３つのジスルフイド結合により形
成される３つのループになつたポリペプチド構造であ
る。クリングルの長さは、アミノ酸基約79〜82個であ
る。ヒトウロキナーゼの単一のクリングル〔グンツラー
ら、ホツペ−セイラーズ・ツアイトシユリフト・フユア
・フイジオロジツシエ・ヒエミー（Gunzler et al.,Hop
pe− Physiol.Chem.）、363、1155（1982）参照〕、ヒト組織
プラスミノーゲン活性化因子の２つのクリングル〔ペニ
カら、ネイチヤー（Pennica et al.,Nature）301、214
（1983）参照〕、ヒトプロトロンビンの２つのクリング
ル〔ワルツら、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ
（Walz et al.,Proc. Acad.Sci.USA）、74、1969（1977）参照〕およびヒトプ
ラスミノーゲンの５つのクリングル〔ソトラツプ−ジエ
ンセンら、プログレス・イン・ケミカル・フイブリノリ
シス・アンド・トロンボリシス、ダビツドソンら編（So
ttrup−Jensen et al.,in Progress in Chemical Fibri
nolysis and Thrombolysis（eds.Davidson et al））、
3、191（1978）参照〕の間に高度の配列相同がある。ク
リングル内のジスルフイド架橋に含まれる６個のシステ
インの相対的な位置は、全ての小環において同じであ
る。本明細書において用いる小環なる語は、前記タンパ
ク質中にかかる構造を有するものを意味する。また、こ
れらのタンパク質のクリングル部分における多形体は、
天然に存在し、その場合、１以上のアミノ酸が付加、欠
失または置換されている。近年の遺伝子の点変異テクノ
ロジーの出現とともに、または所望の配列を有する遺伝
子の化学的合成により、in vitroでタンパク質において
同様の変化が起こり得る。従つて、これらの修飾された
構造も、本発明で用いるクリングルなる語に包含され
る。

以下に、３クリングル（トリス−クリングル）プラス
ミノーゲン活性化因子およびテトラ−クリングルプラス
ミノーゲン活性化因子の調製を説明する。用いた方法
は、本発明の他のポリペプチドの調製に応用し得る代表
的なものである。

本発明のトリス−クリングルプラスミノーゲン活成化
因子により、ウロキナーゼおよびｔ−PAクローンの適当
な遺伝子コーデイング配列から組換DNA技術により組立
てられた場合、天然のプラスミノーゲン活性化因子のい
ずれと比較しても、in vivoで安定性が増大し、フイブ
リンに対する結合親和力が増大し、半減期が向上する利
点がある。トリス−クリングルプラスミノーゲン活性化
因子のこれらの性質により、生物学的有効性が改善さ
れ、保存性も改善される。トリス−クリングル−PA分子
は、天然のｔ−PAよりも、調製および精製の際に取扱い
が容易である。これは、後者のポリペプチドが、培養液
および種々の精製段階でみられる様に、低分子量で、Ｈ
鎖およびＬ鎖を含むためである。テトラ−クリングルプ
ラスミノーゲン活性化因子および他のポリ−クリングル
プラスミノーゲン活性化因子もこれらの性質を有する。

本発明のトリス−クリングルプラスミノーゲン活性化
因子は、ウロキナーゼのＮ末端部分からその１つのクリ
ングル領域を、適当なリンカーを介して、２つのクリン
グル領域の開始点またはそれ以前から始まるｔ−PAのＮ
末端部分と結合させることにより組立てられる。ウロキ
ナーゼの１つのクリングルは、131位のアミノ酸のグリ
シン残基の前にあることが知られている。ｔ−PAの２つ
のクリングルは、91位のトレオニン残基に続くシステイ
ンから始まることが知られている。従つて、131位のグ
リシン残基で終わるウロキナーゼのＮ−末端部は、所望
により、ｔ−PAの２つのクリングル間のヘキサペプチド
結合を模倣する適当なリンカーを介して、最初の91N−
末端アミノ酸が欠失したｔ−PA分子と結合する。得られ
たハイブリツド分子は、ｔ−PAよりもアミノ酸残基46個
分大きく、用いたリンカーにより異なるが、分子量約73
000のタンパク質が得られる（ｔ−PAは、68000の分子量
を有する）。同様に、ウロキナーゼの１つのクリングル
（UKKaa50−131）は、クリングルリンカーとともに、ア
ミノ酸91〜92または261〜262間のｔ−PAポリマーに挿入
され、トリス−クリングルプラスミノーゲン活性化因子
産生用の２つの異なる遺伝子を得る。同様に、また標準
的技術により、適当なリンカーを用いて、ｕ−PAクリン
グルを、２つのｔ−PAクリングル間に挿入してもよい。
さらに、プロトロンビンまたはプラスミノーゲンにみら
れるクリングルを、単離し、前記ｔ−PAのどの位置に挿
入してもよい。本発明のいずれのポリクリングルプラス
ミノーゲン活性化因子の組立ては、前記タンパク質か
ら、１または２クリングル領域を単離し、これをｔ−PA
分子に挿入する同様の基本的操作に従つて行なう。

ウロキナーゼのシングルクリングル部（UKK）を、ｔ
−PAのダブルクリングル領域（ｔ−PK₁およびｔ−PK₂）
と結合させるのに用いるクリングルリンカーは、６〜10
個の天然のアミノ酸を含有するポリペプチドである。好
ましくは、クリングルリンカーは、ｔ−PAの２つのクリ
ングル間に存在するものに似た配置を保持するように選
択される。好ましいリンカーは、Ｌ−Ser−Ｌ−Glu−Gl
y−Ｌ−Asn−Ｌ−Ser−Ｌ−Aspである。これは、ｔ−PA
においてｔ−PK₁をｔ−PK₂に結合するものと同等だから
である。しかし、ヘキサペプチドＬ−Thr−Ｌ−Asp−Ｌ
−Ala−Ｌ−Glu−Ｌ−Thr−Ｌ−Gluも用い得るヘキサペ
プチドリンカーであり、Ｌ−Ala、Gly、Ｌ−Ser、Ｌ−G
lu、Ｌ−ThrおよびＬ−Aspのいかなる組合せも、ヘキサ
ペプチドリンカーのＮ−末端またはＣ−末端に用いて、
ｔ−PAクリングルおよびUKクリングル間に、ヘプタ、オ
クター、ノナーまたはデカペプチド結合等の、より間隔
の大きい構造を得る。他のリンカーは公知である。簡便
のために、以下、本明細書では、クリングルリンカーと
して、前記の好ましいリンカーを用いた場合について記
載する。

トリス−クリングルプラスミノーゲン活性化因子は、
選択された制限酵素を用いてウロキナーゼおよびｔ−PA
コーデイング配列を制限的に消化することにより調製さ
れ、所望のｕ−PAおよびｔ−PAフラグメントを得る。該
フラグメントは、アガロースまたはアクリルアミドゲル
上で分別することにより単離し、結紮し、適当なベクタ
ーまたはクローニングおよびその後の発現用ベクターに
導入される。

図面の説明第１図は、本発明の方法により調製される３つのトリ
ス−クリングルプラスミノーゲン活性化因子および１つ
のテトラ−クリングルプラスミノーゲン活性化因子の配
列図である。構造式１（ａ〜ｃ）の太線部分は、ウロキ
ナーゼクリングル（UKK）を含むウロキナーゼ部分を示
す。構造式１（ｄ）の太線部分は、プロトロンビン（PT
K₁およびPTK2）のダブルクリングル領域を示す。略号tP
K₁およびtPK₂は、各々、組織プラスミノーゲン活性化因
子クリングル１および２を示す。

第２図は、組織プラスミノーゲン活性化因子組換体ク
ローンpWP−42の制限地図である。

第３図は、pWP−42からプラスミドptPBM−１を産生す
るのに用いる技術を示すフローチヤートである。ptPBM
は、完全ｔ−PA分子を産生するのに必要な遺伝子情報を
有する。

第４図は、プラスミドpUK−53からプラスミドpUKBMを
産生するのに用いる技術を示すフローチヤートである。
pUKBMは、完全なウロキナーゼタンパク質を産生するの
に必要な遺伝子情報を担持する。

第５図は、第１図（ａ）に示すトリス−クリングルを
コードする遺伝子を産生するのに用いる方法のフローチ
ャートである。

第６図は、ウロキナーゼのアミノ酸51〜131（ｕ−PA
^51-131）をコードする遺伝子を産生するのに用いる方法
のフローチヤートである。

第７図は、第１図（ｂ）に示すトリス−クリングルを
コードする遺伝子を産生するのに用いる方法のフローチ
ヤートである。

第８図は、第１図（ｃ）に示すトリス−クリングルを
コードする遺伝子を産生するのに用いる方法のフローチ
ヤートである。

第９図および第9a図は、ウロキナーゼシグナルペプチ
ド領域（アミノ酸20）、UKK領域（ウロキナーゼのアミ
ノ酸１〜131）、ヘキサペプチドリンカーおよびｔ−PA
分子の残りの部分（アミノ酸92〜527）に関する第１図
（ａ）の生成物をコードする遺伝子のDNA配列図であ
る。

第10図および第10a図は、ｔ−PAシグナルペプチド（ア
ミノ酸35）、ｔ−PAのＮ−末端部（アミノ酸１〜91）、
UKK（ウロキナーゼのアミノ酸50〜131）、ヘキサペプチ
ドリンカーおよびｔ−PAのＣ−末端部（アミノ酸92〜52
7）に関する第１図（ｂ）の生成物をコードする遺伝子
のDNA配列図である。

第11図および第11a図は、ｔ−PAシグナルペプチド
（アミノ酸35）、ｔ−PAのＮ−末端部（アミノ酸１〜26
1）、ヘキサペプチドリンカー、UKK（ウロキナーゼのア
ミノ酸50〜131）およびｔ−PAのＣ−末端部（アミノ酸2
62〜527）に関して第１図（ｃ）の生成物をコードする
遺伝子のDNA配列図である。

第12図は、プロトロンビンのダブルクリングル領域を
コードする遺伝子を産生するのに用いる方法のフローチ
ヤートである。

第13図は、第１図（ｄ）に示すテトラクリングル生成
物をコードする遺伝子を産生するのに用いる方法のフロ
ーチヤートである。

第14aおよびｂ図は、哺乳動物細胞系Ｃ−127（マウ
ス）におけるプラスミノーゲン活性化因子ハイブリツド
Ａ（第１図（ａ）参照）およびハイブリツドＢ（第１図
（ｂ）参照）遺伝子の発現用の、BPV−Ｉを基本とする
発現ベクター系を示す制限地図である。発現されるベク
ターを、マウスメタロチオネイン転写プロモーターエレ
メントおよびSV40初期転写プロセツシングシグナル間に
挿入する。

第15a図は、フイブリンアガープレート上でウエルあ
たり培地10μｌを加え、ウエルのまわりに透明な領域が
現われるまで（２〜７列）37℃にてインキユベートする
ことによるPA産生セルまたはフオーカスのスクリーニン
グを示す図である。第１列は、標準的なｔ−PAを示す
（上部から底部の酵素濃度（単位/ml）:500、250、10
0、50、25、０）。

第15b図は、ポリアクリルアミドゲル（PAGE）中電気
泳動によりハイブリツド−PAを分離した後のハイブリツ
ドＢ、ハイブリツドＡおよび組織タイププラスミノーゲ
ン活性化因子のフイブリンアガープレート上のザイモグ
ラムである。

第15c図は、抗ｔ−PA抗血清でラジオ−パルス処理し
た培地を免疫沈降し、次いで非還元性ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）/PAGE上電気泳動した後の35_Sで標識した
プラスミノーゲン活性化因子、ハイブリツドＡおよびハ
イブリツドＢのオートラジオグラムである。分子量が公
知のタンパク質マーカー（右利）を同時に実験した。

方法および材料ａ）酵素反応：制限酵素およびDNA修飾酵素は、ニユー・イングラン
ド・バイオラブズ・インコーポレイテツド（New Englan
d Biolabs Inc.,Beverly,MA）またはインターナシヨナ
ル・バイオテクノロジーズ・インコーポレイテツド（In
ternational Biotechologies Inc.New Heaven,CT.）よ
り入手した。代表的な制限酵素反応は、該酵素の販売者
の推奨する方法に従つて、全容積50μｌで行なつた。

接着末端DNAの結紮反応は、代表的には、DNA100〜200
ngおよびT₄ DNAリガーゼ400単位（ニュー・イングラン
ド・バイオラブズ）を含有する緩衝溶液20μｌ中15℃に
て一夜行なう。平滑末端に関しては、前記反応混合物に
T₄ RNAリガーゼ４単位（ニユー・イングランド・バイオ
ラブズ）を加える〔グツドマン、エイチ・エムおよびマ
クドナルド、アール・ジエイ、メソツズ・イン・エンザ
イモロジー（Goodman,H.M.and Mac Donald,R.J.,Metho
d.Enzymol.）68、75（1979）参照〕。用いる緩衝溶液
は、0.5Mトリス・HCl（pH7.6）、0.1MMgCl₂および0.1
M DTT（ジチオトレイトール）の10X保存溶液として調製
する。

ｂ）オリゴヌクレオチドの合成：本発明において記載したオリゴヌクレオチドは全て、
ホスフオトリエステル法〔クレアら、プロシーデイング
ス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Crea et al.,Proc. Acad.Sci.（USA））、75、5765（1978）参照〕により、
ジーン・マシーン・モデル（Gene Machine Model）380A
（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテツ
ド（Applied Biosystems Inc.,Foster city、CA）を用
いて合成した。結紮反応で用いる前に、オリゴマーを、
DNA200〜500ng、T₄ DNAキナーゼ10単位、0.5mM ATPおよ
びキナーゼ緩衝液（0.05Mトリス・HCl、pH7.6、10mM Mg
Cl₂、5mM DTT）を含有する容積50μｌ中で、５′末端を
ホスホリス化し、37℃にて半時間インキユベートした。
ハイブリツド化プローブとして用いるために、オリゴマ
ーを100μCiγ³²P−ATP（5000Ci/ミリモル、アマーシヤ
ム（Amersham、Arlington Heights、II）で、マキサ
ム、エイ・エムおよびギルバード、ダブリユー、メソツ
ズ、イン・エンザイモロジー（Maxam,A.M.and Gilbert,
W.Method Enzymol.）、65、499（1980）参照）の方法に
従つて放射線標識した。

ｃ）DNAフラグメントの単離： DNAフラグメントをまず0.5〜1.5％アガロースゲルで
電気泳動により分離する。電気泳動は、約100ボルトに
て２〜４時間、トリス−ホウ酸−EDTA（TBE）緩衝液
（0.089Mトリス、0.089Mホウ酸、2mM EDTA、pH8.0）中
で行なう。0.5μg/ml臭化エチジウム溶液中ゲルを着色
することによりUVライト下で視覚化する（シヤープら、
バイオケミストリー（Sharp et al.Biochem.）、12、30
55（1973）参照〕。DNAバンドを含有するアガロースを
かみそりで切除する。該DNAをゲルから電気溶出する
〔マニアテイスら、モレキユラ・クローニング、ア・ラ
ボラトリー・マニユアル（Maniatis et al.Molecular C
loning,a Laboratory Manual）、p.164（1982）参
照〕。DNAをエリユーチツプ−ｄ（Elutip−ｄ）カラ
ムを通すことによりさらに精製する〔シユライヒヤーお
よびシユル（Schleicher and Schuell、Keene、N
H）〕。DNAをエタノールで沈降させる。エツペンドルフ
・マイクロヒユージ（Eppendorf Microfuge）で15分間
遠心分離した後、ペレツトを70％エタノールで一度洗浄
し、真空下で乾燥し、脱イオン水50μｌに溶かす。

ｄ）ミニプラスミドDNA調製：適当な抗生物質を含有するLB（ルリア・ベルタニ）培
地約2mlを、単一のバクテリアのコロニーとともにイン
キユベートし、激しく振とうしながら37℃にて一夜イン
キユベートする。約1.5mlの培地を用いて、前記マニア
テイスら、p.366により記載されている沸騰法によりプ
ラスミドDNAを単離する。残りの培地を後で使用するた
めに−20℃にて15％グリセロール中で保存する。該DNA
を10μgRNアーゼ/mlを含有するH₂O40μｌに溶かす。一
回の制限酵素分析に関しては約８μｌで十分である。

ｅ）プラスミドDNAの大規模な調製：代表的には、LB培地１を単一のバクテリアのコロニ
ーとともにインキユベートする。クロラムフエニコール
でプラスミドDNAを増幅した後、バクテリアセルを回収
し、沸騰法に従つて、溶解する〔ホームズ、デイー・エ
スおよびクイグレイ、エム、アナリテイカル・バイオケ
ミストリー（Holmes,D.S.and Quigley,M.Anal.Bioche
m.）114、193（1981）参照〕。塩化セシウム勾配遠心分
離によるか、または、前記マニアテイスら、pp93〜96に
より記載の如く、セフアロース（Sepharose）4Bカラム
（フアルマシア（Pharmacia,Clppsala,Swden））上カラ
ムクロマトグラフイーによるかのいずれかにより、プラ
スミドDNAをさらに精製する。培養液１につき約400μ
ｇのDNAを回収する。

ｆ）ベクター： dG末端を有するpBR322プラスミドDNA（ベゼスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ・インコーポレイテツド（Beth
esda Research Laboratories,Inc.,Gaithersburg,M
D））を用いて、ｔ−PAおよびｕ−PAのcDNAをクローン
する。pBR322の詳細な分子構造は、前記マニアテイス
ら、pp5および488により記載されている。組換体pBR322
を用いた物質転換に用いるイー・コリ（E.coli）株は、
HB101またはMM294（前記マニアテイスら、p504参照）の
いずれかである。

ｔ−PAおよびｎ−PA遺伝子からのDNAフラグメントの
サブローニングは全て、pUCプラスミドIacZおよびアン
ピシリナーゼ遺伝子を含有する一連のpBR322由来のベク
ター〔ビーリア、ジエイおよびメシング、ジエイ、ジー
ン（Vieria,J.and Messing,J.,Gene）19、259（1982）
参照〕中で行なう。さらに、該プラスミドはまた、以下
に示す如く、IacZに多重クローニングまたは制限サイト
の配列を有する： IIサイトのいずれかのクローニングは、Ｘ−gal（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクト
シド）を含有する指示プレート上、青色のベクターコロ
ニー中に白色の組換体コロニーが出現することによりモ
ニターできる〔ルサー、モレキユラー、アンド・ジエネ
ラル・ジエネテイクス（Ruther,Mol.Gen.Genetics）17
8、475（1980）参照〕。組換体pUCプラスミドを用いた
形質転換に用いるイー・コリ株はJM103である。pUCプラ
スミドおよびイー・コリJM103は、フアルマシア・ピー
・エル・バイオケミカルズ（Pharmacia P−L Biochemic
als,Milwaukee,WI）より入手した。

ｇ）宿主／ベクター系 1.微生物系本明細書において記載した操作は、微生物イー・コリ
ｋ−12 JM103株（ピー・エル・バイオケミカルズ（PL B
iochemicals））およびイー・コリｋ−12 MM294株（ATC
C No.33625）を用いて行なつた。この方法において用い
得る他の微生物としては、他の有用なイー・コリ株およ
びバチルス・サタイリス（Bacillus subtilis）などの
バチルス層が挙げられる。これらの微生物は、全て、非
相同な遺伝子配列を複製および発現し得るプラスミドを
利用するものである。

酵母における発現には、イー・コリおよび／または酵
母（サツカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae））における選択および複製可能なプラスミドを
用いる。酵母における選択に関しては、該プラスミド
は、トリプトフアンについて原栄養性の形質転換trp-^-
酵母株（RH218）を与えるTRP1遺伝子を含有する。酵母
発現ベクターは、酵母およびイー・コリ間で往復でき
る。プラスミドは以下の成分を有する:1）複製開始点お
よびアンピシリン耐性遺伝子を含有するPBR322由来のDN
Aセグメント、２）酵母TRP1遺伝子、３）酵母において
高い安定性でプロスミドを複製し得る酵母２μ DNA、
４）アルコールデヒドロゲナーゼ、α因子、グリセルア
ルデヒド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼなどの酵
母遺伝子由来のプロモーター領域、５）発現系において
適当な終止およびmRNAのポリアデニル化に用いることが
できる翻訳開始および転写終了配列。

2.哺乳動物細胞培養物系複製および非相同なタンパク質産生用のベクターの発
現が可能な哺乳動物細胞系を本発明において用いる。こ
れらは、例えば、Cos−７、WI38、3T3、CHO、ヒーラセ
ルおよびC127セルである。用いるベクターは、１）ウイ
ルス（SV40、アデノ、ポリオーマ、BPV）または細胞染
色体DNA由来の複製開始点;2）プロモーター;3）リボソ
ーム結合サイトなどの翻訳開始シグナル;4）RNAプロセ
ツシングシグナル（RNAスプライシング、ポリアデニル
化および転写終止配列）を含む。本明細書に示した発現
ベクターの具体例では、BPVウイルス複製開示点、マウ
スメタロチオネインプロモーターおよびSV40 RNAプロセ
ツシングシグナルを用いる。該ベクターも、哺乳動物細
胞培養物およびイー・コリの両方で増殖可能である。こ
れは、イー・コリアンピシリン耐性の選択マーカーおよ
びDNA複製のイー・コリ起源を提供するPBR322配列の誘
導体を含む。これらの配列は、プラスミドpML−2d由来
である。

BamHI接着末端を有する修正ハイブリツドプラスミノ
ーゲン活性化因子をまずプラスミド341−３（ロ−・エ
ム・エフら、メデイカル・セル・バイオロジイ・アンド
・フアンクシヨン（Law MF et al.,Md.Cell.Biol.F）
3、2110（1983）参照〕のBgl IIサイトで、マウスメタ
ロチオネイン転写プロモーター・エレメントおよびSV40
初期転写プロセツシングシグナル間に挿入する。プラス
ミド142−６（ATCC No.37134）をBamHIで消化した後得
られる完全BPVゲノムを非反復BamHIサイトと結紮する。
プラスミド341−３もpML2、pBR322誘導体を含有し、こ
れにより、バクテリアセルにおけるプラスミド複製が可
能になる。本明細書において組立てる発現プラスミド
は、マウスＣ−127セルにおいて排他的に染色体外エピ
ソームとして複製し得る。トランスフエクトしたセル
は、形質転換した表現型に関して選択され得る。より高
度な発現レベルを得るためにエンハンサーエレメントを
添加したり、遺伝子に薬剤耐性（ネオマイシン耐性な
ど）を挿入することなどにより、発現ベクターをさらに
修飾することも可能である。

トリス−クリングルプラスミノーゲン活性化因子組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）メツセンジヤーRNA イソチオシアネート法（前記マニアテイスら、p196参
照）により、あらかじめ内皮細胞成長因子（ECGF）およ
びヘパリンで刺激した正常ヒト繊維芽細胞（WI−38セ
ル）からRNAを単離し、ｔ−PAを得る。同じ刺激したセ
ルからウロキナーゼを得る。オリゴ−デオキシチミジン
（dT）−セルロースカラム上クロマトグラフイーによ
り、RNAからメツセンジヤーRNA（mRNA）を得る〔アビブ
ら、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Aviv et
al.,Proc. Acad.Sci.USA）、69、1408（1972）参照〕。15〜30％ス
クロース濃度勾配中遠心分離によりmRNAをさらに分別
し、各mRNAフラクシヨンを³²Pプローブでハイブリツド
化する（後記参照）。ｔ−PA情報を有するフラクシヨン
（約20〜24S）を相補DNA（cDNA）の調製において用いる
ためにためる。

相補DNA 前節に記載した、ためておいたmRNA 5μｇを用いて二
本鎖cDNAを得、該cDNAを末端ヌクレオチドトランスフエ
ラーゼを用いて、ポリデオキシシチジレート（poly d
C）でホモポリマー末端にする。生成物を、PstI消化ポ
リデオキシグアニレート（poly dG）末端pBR322でアニ
ールする。アニールしたDNAを用いて、コンピテント・
イー・コリ294セルを形質転換し、該セルを培養して、
約10⁵のバクテリアクローンを得る（前記マニアテイス
ら、p229参照）。

ｔ−PAクローンのスクリーニングおよび同定以下に示す３つのオリゴヌクレオチドを、³²p−ATPで
放射線標識した後用いて、組換体クローンのライブラリ
ーをスクリーンする。これらのオリゴマーは、以下のア
ミノ酸配列に対応する:t−PA分子の34〜39（17mer）、2
53〜258（18mer）および523〜527（15mer）〔ペニカ、
デイーら、ネイチヤー（Pennica,D.et al.,Nature）、3
01、214（1983）参照〕５′−CCA CTGTTGCACC−AGCA−
３′;18mer:5′−CAC ATCACAGTACTCCCA−３′ ;15mer:
5′−CGG TCGCATGTTGTC−３′。約20コロニーが、ため
ておいたプローブに関して、中程度〜強度のホモロジー
を示した。これらのコロニーを再びプレーテイングし、
再びハイブリツド形成して正のシグナルを有する16のク
ローンを得る。これらのクローンから調製したプラスミ
ドDNAをニトロセルロース紙上にしみこませ、各プロ
ーブでハイブリツド形成する。２つのクローン（42およ
び62a）は、中間（18mer）および３′未満（15mer）プ
ローブの両者とハイブリツド形成する。プラスミドDNA
をPst Iを用いて酵素で消化すると、クローンNo.42は、
1.1、0.6および0.4K^1bの３つのフラグメントの形態で、
２キロベース（Kb）より大きい最大の挿入部を有するこ
とが示される。該クローン（pWP42）の完全な制限地図
を第２図に示す。このクローンは、５′−および３′−
未翻訳領域を含む2600bpを有するｔ−PA遺伝子に関する
完全な長さの配列を有する。

ｔ−PA遺伝子の編整約10μｇのpWP42プラスミドDNAを９単位のXho IIで、
37℃にて２時間消化する。反応混合物を調製用1.2％ア
ガロースゲルに付し、アガロースゲル中電気泳動によ
り、1618bp DNAフラグメントを単離する。接着末端をイ
ー・コリポリメラーゼ１〔クレノウ・フラグメント（Kl
enow fragment）〕およびdNTP（４種のデオキシヌクレ
オチド三燐酸:dATP、dGTP,dCTPおよびdTTP）でうめた
後、このようにして修飾したDNAを、ホスホリル化Sal I
リンカー300ngで一夜結紮する。フエノール／クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈降の後、DNAをSal I50Uで
１時間消化し、反応混合物を調製用１％アガロースゲル
に付して、所望のDNAフラグメントを単離する。

Sal I末端を有するDNAを、Sal I切断PUC13と結紮し、
イー・コリJM103セルを形質転換するのに用い、該セル
を、アンピシリンおよびＸ−galプレートに移す。８つ
のアンピシリン耐性の白色コロニーを選択し、増殖させ
て、ミノプラスミド調製物を得る。２つのクローン（pt
PS34BおよびptPS39）が、所望のDNAフラグメントを含有
することが判明した。BamHIおよびNar Iで完全に消化し
たptPS39プラスミドDNA10μｇを調製的アガロースゲル
に付し、ｔ−PAのＣ−末端をコードする1288bpフラグメ
ントを得る。

ｔ−PA遺伝子の５′末端は、PWP42 10μｇをHgaI4単
位で37℃にて８時間消化することにより得られる。515b
pフラグメントを、１％アガロースゲル中電気泳動によ
り単離する。DNAフラグメントの接着末端をDNAポリメラ
ーゼ１（クレノウフラグメント）およびdNTPでうめ、生
成物をSmaI切断pUC13と結紮する。イー・コリJM103セル
を形質転換した後、約75のアンピシリン耐性白色コロニ
ーを得る。これらのうち24コロニーを増殖して、ミニプ
ラスミド調製物を得る。該ミニプラスミド調製物をNar
Iで消化すると、17クローンがいずれかの順序で所望の
挿入部を有することが判明した。１つのクローン（pt P
Hga4）を、アンピシリンを含有するLB培地1.0l中で増殖
させ、沸騰法を用いて、多量のプラスミドDNAを得る。
該プラスミドDNA（pt PHga4）をBam HIおよびNar Iで消
化し、1.2％アガロースゲル上で電気泳動に付して、ｔ
−PAのＮ−末端をコードする434bpDNAフラグメントを単
離する。

1288bp DNA300ngおよび434bp DNA100ngを一夜結紮し
て1722bp DNAフラグメントを得る。このDNAを、Bam HI
切断pUC13と結紮した後、イー・コリJM103セルを形質転
換するのに用いる。100以上のアンピシリン耐性コロニ
ーを得る。沸騰法により、12コロニーからプラスミドDN
Aを調製する。プラスミドDNAを、BamHI、Nar IおよびXh
o IIの各々で切断することにより同定する。得られたプ
ラスミドは全て所望の1722bp DNAフラグメントを含有す
ることが判明した。１つのプラスミド（pt PBM I）を、
大規模なプラスミドDNA調製に用いる。このプラスミド
は、Bam HIで切断した場合、完全なｔ−PA分子をコード
する1722bp DNAを生成する。pt PBM Iクローン制限地図
およびその調製法のフローチヤートを第３図に示す。

ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕ−PA）ｕ−PAクローンのスクリーニングおよび同定前記のｔ−PA遺伝子を生成する10⁵組換体バクテリア
クローンのライブラリーを、グルンシユタインら、プロ
シーデイングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ（Grunstein et at.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA）、72、3961（1975）の方法により、放射線標識
した18merプローブでスクリーンする。ジーン・マシー
ン（Gene Machine）〔アプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）〕を用いて標準的ホスホトリエ
ステル法により合成したプローブから、ウロキナーゼ遺
伝子（aa^173〜179）の中間部に対応するオリゴマー配列
５′−GTAGATGGC CGC AAA CCA−３′が得られる。約13
クローンが、中程度〜強度のハイブリツド形成シグナル
を示した。これらのクローンを、テトラサイクリンを含
有するLB培地2ml中で増殖させ、ミニプラスミド調製物
を得る。該ミニプラスミド調製物を10μg/mlのRNアーゼ
を含有するH₂O40μｌを溶かす。このようにして得られ
たDNA約８μｌをPstI 1単位で消化し、生成物を１％ア
ガロースゲル上電気泳動により分離する。１つのクロー
ン（pUK53）は、1.2、0.4および0.1Kbの長さの３つのフ
ラグメントの形態で1.7Kbの最大の挿入部を有すること
が判明した。ウロキナーゼの完全な３′−末端ヌクレオ
チド配列からPst I切断1.2Kb DNAフラグメントを得る。
マキサムおよびギルバート法、メソツズ・イン・エンザ
イモロジー（Maxam and Gilbert method,Methods Enzym
ol.）、65、1499（1980）によるヌクレオチド配列決定
により、遺伝子の５′−末端配列は、ウロキナーゼタン
パク質のシグナルペプチドコーデイング領域のはじめの
10アミノ酸に対応する約30ヌクレオチドが欠失している
ことが判明した。従つて、欠失したヌクレオチドに対応
する二重鎖DNA配列を合成し、存在する遺伝子と結紮す
る。

ウロキナーゼ遺伝子の編整ウロキナーゼプラスミド（pUK53）DNAをNco IおよびM
st IIで切断し、生成物を１％アガロースゲル上電気泳
動により分離する。1198bpのDNAフラグメントを電気溶
出により単離する。Nco I切断片に対応するDNAフラグメ
ントの突出した５′−末端を、dNTPおよびイー・コリDN
Aポリメラーゼ（クレノウ・フラグメント）でうめるこ
とにより平滑末端にする。DNAを次いでSmal I切断pUC13
と結紮し、この修正したプラスミドを用いてコンピテン
トイー・コリJM103セルを形質転換する。DNAをpUC13のS
ma Iサイトと結紮すると、挿入部のNco Iサイトが再生
する。該セルをアンピシリンおよびＸ−galプレートに
移し、白色コロニーからミニプラスミド調製物を得る。
該ミニプラスミドDNA調製物をNco IおよびSal Iで消化
して、約1200bpのDNAフラグメントを得る。陽性クロー
ン由来の大規模なプラスミドDNA調製物（pUKNM−３′）
を調製し、Nco IおよびSal Iで消化して、多量の約1200
bpのDNAフラグメントを得、これを調製用アガロースゲ
ル電気泳動により分離する。

ウロキナーゼタンパク質の５′シグナルペプチドコー
デイング領域の最初の10のアミノ酸に対応する約30ヌク
レオチドを得るために、pUK53プラスミドDNAをまずPst
Iで消化して、400bpのDNAフラグメントを単離する。こ
のDNAを次いでScr FIで処理して、DNAの242bpフラグメ
ントを得る。DNAの突出した末端を、dNTPおよびイーコ
リDNAポリメラーゼ１（クレノウ・フラグメント）でう
める。

32および42塩基の長さの２つの相補オリゴヌクレオチ
ド配列をジーン・マシーンで合成し、アミノ酸が欠失し
（−９〜−20）、かつ適当な翻訳解読フレームを保持
し、Sal IS切断pUC13におけるサブクローニングのため
にDNAの両端にSal I配列を付与する。２つのオリゴマー
を等モル量のリガーゼ緩衝液（50mMトリス・HCl、pH7.
6、10mM MgCl₂、10mMジチオトレイトール）中で混合
し、５分間80℃に加熱し、約１時間室温に冷却する。こ
のようにして形成した２つの相補ヌクレオチド配列の二
重鎖（約１μｇ）をT4DNAリガーゼ400単位を用いて、リ
ガーゼ緩衝液中４℃にて16時間242bp DNAフラグメント
約300ngと結紮する。結紮混合物を1.2％アガロースゲル
上電気泳動により分離し、電気溶出により約320bp DNA
フラグメントを単離する。このフラグメント約20ngをSa
l I切断pUC13 100ngと結紮し、該ベクターを用いてコン
ピテントイー・コリJM103セルを形質転換する。該セル
を、アンピシリンＸ−galプレートに移す。12個の白色
コロニーを選択し、増殖させて、ミニプラスミド調製物
を得る。該ミニプラスミド調製物をSal Iで切断する。
所望の320bp DNA挿入部を有するクローンを、大規模な
プラスミドDNA調製のために増殖させる。該DNAをSal I
およびNco Iで切断して、調製用アガロースゲル電気泳
動に付して、260bp DNAフラグメントを得る。

260bp DNAおよび遺伝子の333bpに共通のNco I制限部
位を含有する1200bp DNAを等モル量混合して結紮する。
結紮生成物をSal Iで切断し、反応混合物をプレパラテ
イブ１％アガロースゲル電気泳動で分離する。1460bp D
NAフラグメントを電気溶出により単離する。このDNAをS
al I切断pUC13と結紮し、このプラスミドを、アンピシ
リンおよびＸ−galプレート上で増殖したコンピテント
イー・コリJM103の形質転換に用いる。12個の白色コロ
ニーを選択し、増殖させてボイリング法によりミニプラ
スミド調製物を得る。このミニプラスミド調製物をSal
Iで切断し、１つのクローン（pUKBM）が所望の1460bp D
NAインサートを含有していることを見出した。該合成リ
ンカーを含有する５′端からのオリゴヌクレオチド配列
をマキシマーギルバート法により配列づけして、その確
認を行なう。

pUKBMプラスミド中のDNAインサートは、これにより、
翻訳開始コドンAUG（met,リーダー配列中、−20aa）な
らびに終止コドンTGAを含有することが証明された。こ
の完全遺伝子はシグナルペプチドの20個のアミノ酸（−
１〜−120）および成熟したウロキナーゼ蛋白の411個の
アミノ酸をコードする。

実施例１ UKaa^1-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp）^1-91t−
PA 第１図に示す物質（ａ）において、シグナルペプチド
（aa（アミノ酸）−35〜−１）を含有するｔ−PA配列お
よびＮ−末端ペプチド（aa1〜90）域はシグナルペプチ
ド、（aa−20〜−１）およびウロキナーゼの最初の131
個のアミノ酸を含有するアミノ酸配列で置換されてい
る。ｕ−PA配列は、ヘキサペプチド、Ｌ−Ser−Ｌ−Glu
−Gly−Ｌ−Asn−Ｌ−Ser−Ｌ−Aspをコードするオリゴ
ヌクレオチド配列を介してｔ−PAの最初のクリングル
（ｔ−PKI）と連結している。

プラスミドpUKBMの約10μｇを標準的条件下、EcoRIお
よびMst Iで消化する。反応混合物を1.2％アガロースゲ
ルを通し、150ボルトで３時間電気泳動させる。ゲルを
臭化エチジウムで染色してDNAバンドを可視化した後、4
52bp DNAフラグメントを単離し、精製する。このDNAフ
ラグメントは、リーダーまたはシグナルペプチド（20個
のアミノ酸）およびウロキナーゼ遺伝子のＮ−末端およ
びクリングル域（aa1〜131）についてのコード情報を含
有している。

ｔ−PA−デスaa1〜91配列を得るため、約10μｇの組
換体プラスミドptPBM−１をAvaIIで消化して仕上げ、1.
2％アガロースゲル上で電気泳動に付して747bp DNAフラ
グメントを単離する。このフラグメントにオリゴマーリ
ンカーを加え、ついで、EcoRIで消化して、実施例２に
記載し、第７図に示した354bp DNAフラグメントを得
る。この354bp DNAはヘキサペプチドリンカーおよびｔ
−PAペプチド（aa92〜204）の118個のアミノ酸配列をコ
ードする。前記で得られた452bp DNAフラグメントとこ
の354bp DNAフラグメントの等モル量をT4DNAリガーゼを
用い、15℃で16時間結紮する。反応混合物を1.2％アガ
ロースゲル上で電気泳動により分離し、806bpのサイズ
に対応するDNAバンドを溶出させ、精製する。806bp DNA
フラグメントの約100ngを、約20μｌの反応容量中、BAR
（細菌性アルカリホスフアターゼ）処理EcoR I pUC13
（フアルマシア・ピー・エル・バイオケミカルス・イン
コーポレーテツド、米国ウイスオンシン州、ミルウオー
キー）約300ngで結紮する。この溶液の約1/4を、ジエイ
・ビエラおよびジエイ・メツシング、ジーン（J.Viera,
J.Messing,Gene）19,259,（1982）の方法に従い、コン
ピテントイー・コリJM103セルの形質転換に用いる。12
個の組換体白色コロニーから調製したミニプラスミドDN
Aを標準条件下、EcoR Iで消化する。必要なインサート
を含有する１つのクローン、pt PUK−806をBam HIおよ
びNar Iで消化し、1.2％アガロースゲル上の電気泳動に
より分離する。519bpフラグメントに対応するDNAバンド
を切断し、溶出し、精製する。同じ操作により、Bam HI
およびNar Iでpt PBM−１を消化して1300bp DNAフラグ
メントを得る。519bpと1300bpのDNAフラグメントの等モ
ル量を、エイチ・エム・グツドマンおよびアール・ジエ
イ・マクドナルド、メソツド・オブ・エンザイモロジー
（Goodman,H.M.,Mac Donald,R.J.Method.Enzymol）68,7
5,（1979）の標準的な方法に従つて結紮する。結紮混合
物をフエノール：クロロホルム（1:1）混液で２回抽出
し、２容の無水エタノールでDNAを沈澱させる。ペレツ
トを水50μｌに溶解した後、DNAを標準検定条件下、Bam
HIで消化し、１％アガロース・ゲル上で電気泳動に付し
て分離する。1819bpを含有するDNAフラグメントを切断
し、ゲルから溶出させ、精製する。このDNAフラグメン
トはシグナルペプチド（20アミノ酸）および第１図
（ａ）に示した（UK_aa ^1-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser
−Asp）^1-91−ｔ−PAに対応する573個のアミノ酸の成熟
ハイブリツドまたはトリス−クリングルPA分子について
の必要な全てのコード情報を含んでいる。

ついで、このトリス−クリングル遺伝子を、完全表現
ベクターとして役立つ、Bgl II切断表現ベクター、ウシ
乳頭腫ウイルス（BPV）に結紮する。通常の培養によ
り、第１図（ａ）のトリス−クリングルプラスミノーゲ
ン活性化因子を得る。

ウロキナーゼクリングル配列の組立実施例２および３において、ウロキノーゼのクリング
ル部分（aa50〜131）のみを利用し、ｔ−PAの二重クリ
ングル域の前または後に挿入する。第６図は組換体プラ
スミドpUK53からaa51〜131をコードするヌクレオチド配
列の組立を示す。アミノ酸131に対応するヌクレオチド
鎖の直後に都合よい制限部位Mst Iがある。しかし、aa5
0付近には何もない。かくして、aa50付近に制限部位を
作る（この例ではNdeI）チヤートを第６図に示す。ウロ
キナーゼのクリングル域はbp284（aa50）〜bp530（aa13
1）のヌクレオチド配列に対応する。

約10μｇのpUK53プラスミドDNAを、ウロキナーゼ配列
におけるbp204を切断するScaIで消化する。フエノール
抽出およびエタノール沈澱の後、DNAペレツトを緩衝液
（10mM CaCl₂、12mM MgCl₂、0.2M NaCl、20mMトリスHCl
（pH8.0）、1mM EDTA）50μｌ中に溶解する。反応混合
物にヌクレアーゼBal 31 1μｌ（２単位）を加え、混合
物を30℃で15秒間インキユベートする〔レガースキイ，
アール・ジエイ、ジエイ・エル・ホドネツト、エイチ・
ビイ・グレイ・ジユニア・ニユークレイツク・アシド・
リサーチ（Legerski,R.J.,J.L.Hodnett,H.B.Gray,Jr.,N
ucleic Acid Res.）5,145,1978〕。0.4M EGTA5μｌを添
加して反応を停止させる。この反応時間は、DNAフラグ
メントの各端から約80bpを除去するのに充分であること
が判明した。フエノール抽出およびエタノール沈澱後、
標準的反応条件下、DNAをオリゴヌクレオチド・リンカ
ー（10bp）に結紮する。配列TGGAATTCCAを有するオリゴ
マーリンカー（EcoRI/Nde Iリンカー）を、配列TATG（a
a51に対応）を含有するDNAフラグメント端と結紮させて
Nde I部位（CATATG）を作り出す。さらに、リンカー中
に制限部位EcoRIを作り、pUC13ベクター中でクローンす
る。フエノール抽出、エタノール沈澱後、DNAをEcorIで
消化し、１％プレパラテイブ・アガロース・ゲル上で電
気泳動によつて分離する。340bpに対応するDNAバンドを
切断し、溶出し、エタノール沈澱を行なう。このDNA約4
0ngをEcoRI切断pUC13ベクターDNA約0.4μｇと結紮し、
コンピテントイー・コリJM103セルの形質転換に用いる
〔マニアチスら（Maniatis et al）前出、250頁〕。10
平板から約1000個の組換体コロニーを得る。細菌コロニ
ーをニトロセルロース紙上でレプリカ−プレーテイング
し、放射性オリゴヌクレオチドプローブを用いる特定部
間ハイブリツド形成によりスクリーニングする〔グラン
スタインら、プロシーデイングス・イン・ナシヨナル・
アカデミー・サイエンス・オブ・ユー・エス・エイ（Gr
unstein et al.,Proc. Acad.Sci.USA）72,3961,1975〕。用いたオリゴヌクレオ
チドプロープは18bpの長さで（TTCCATATGAGGGGAATG）、
EcoRI/Nde Iリンカーからの最初の５個のヌクレオチド
およびaa51〜54に対応するウロキナーゼ配列からのつぎ
の13個の塩基を含有する。約12のクローンがＸ線フイル
ム上に中程度〜強いシグナルを示した。これらの12クロ
ーンから調製したミニプラスミドDNAをNde Iで消化し、
１％アガロースゲル上の電気泳動で分離する。１つのク
ローン、pUKKNd16は新たに生じたNde I部位を含有する
ことが判明した。このプラスミドDNAを、Nde IおよびMs
t Iで消化後、1.4％アガロースゲル上の電気泳動により
分離し、246bpのDNAフラグメントを得る。このDNAフラ
グメントはaa51〜131をコードするウロキナーゼヌクレ
オチド配列を含有する。欠損アミノ酸50（Cys）につい
てのDNA配列を第７図および第８図に示すごとくオリゴ
マーリンカーに組み込む。

実施例２ 91−（UKaa^50-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp）−
92−ｔ−PA 第１図（ｂ）に示したウロキナーゼクリングル配列を
ｔ−PAの二重クリングル領域の前、すなわち、アミノ酸
91および92の間に挿入する。前記のごとく、pUKKNd16プ
ラスミドDNAのNde IおよびMst I消化により、ウロキナ
ーゼのaa51〜131に対応する246bp配列を作成する。UKク
リングル配列（246bp）の２つの端を、２つのオリゴヌ
クレオチドリンカーを用い、ヌクレオチドNo.462（aa9
1）および463（aa92）の間でｔ−PA遺伝子に挿入する。
用いた操作を第７図に示す。

ptPBM−１プラスミドDNA約50μｇをEcoRIで消化し、
１％アガロースゲル中での電気泳動で740bp DNAフラグ
メントを単離する。このDNAをSau 961（AsuIのイソスキ
ゾマー）で部分的に消化し、385bp DNAフラグメントを
単離、精製する。

ホスホトリエステラーゼ法〔クイアら、プロシーデイ
ングス・イン・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・
ユー・エス・エイ（Crea et al.,Proc. Acad.Sci（USA））75,5765,1978〕により、ｔ−PAのア
ミノ酸91（Thr）およびウロキナーゼクリングルのアミ
ノ酸50（Cys）をコードする２つの補助オリゴヌクレオ
チド配列を合成する。

オリゴヌクレオチドリンカーはAsuIおよびNdeI制限部位
によりフランキングされる。上流のオリゴヌクレオチド
（GGCCACCTGC）のみがその５′端でホスホリル化され
る。

385bpDNAフラグメント約１μｇをオリゴマーリンカー
約１μｇと一夜結紮する。フエノール抽出およびエタノ
ール沈澱後、DNAをEcoRIで２時間消化し、1.2％アガロ
ースゲル上で電気泳動により分離して394bp DNAフラグ
メントを得る。このDNAフラグメントはシグナルペプチ
ド（35aa）およびｔ−PAのＮ末端ペプチドアミノ酸１〜
91をコードするヌクレオチド配列を含有する。さらに、
DNAフラグメントはその246bp DNAフラグメント中には存
在しないUKクリングルのアミノ酸50（Cys）についてのD
NA配列を復元する。

ｔ−PA配列のＣ−末端、アミノ酸92以前を得るため、
ptPBM−１プラスミドDNA約50μｇをAvaIIで消化し、１
％アガロースゲルから747bp DNAフラグメントを単離す
る。ホスホトリエステル法により、27bpおよび30bpの長
さの２つの補助DNAフラグメントを合成する。第７図に
示すごとく、このDNAリンカーはヘキサペプチドSer−Gl
u−Gly−Asn−Ser−Aspをコードし、また、Ava II切断7
47bp DNAにおける欠損アミノ酸92〜94（Cys−Tyr−Gl
u）を復元する。低級オリゴマー（30mer）のみがその
５′端でホスホリル化される。747bp DNA約１μｇおよ
びオリゴマーリンカー１μｇを一夜15℃で結紮する。フ
エノール抽出およびエタノール沈澱の後、DNAをEcoRIで
２時間消化して、1.4％アガロースゲルから354bp DNAフ
ラグメントを得る。３つのDNAフラグメント、394bp、24
6bp（UKクリングル）および354bp各々約500ngを、T4DNA
リガーゼを用い一夜結紮する。フエノール抽出およびエ
タノール沈澱後、DNAをEcoRIで消化し、１％アガロース
ゲルから994bp DNAフラグメントを単離、精製する。等
モル量のEcoRI切断pUC13ベクターと結紮後、このDNAを
用いてコンピテントイー・コリーJM103セルを形質転換
する。12の組換体クローンからのミニプラスミド調製物
をEcoRIで消化する。所望の994bpインサートを含有する
１つのクローンを１LB培地中で増殖させてプラスミド
DNAの大規模調製を行なう。このプラスミドDNA約10ugを
BamHIおよびNarIで消化し、700bpサイズに対応するDNA
フラグメントを１％アガロースゲルから精製する。

ptPBM−１プラスミドDNAをBamHIおよびNarI約10μｇ
で消化してｔ−PA遺伝子の３′端を得る。反応混合物を
１％アガロースゲル上の電気泳動で分離した後、電気溶
出で約1300bp DNAフラグメントを単離し、精製する。

ほぼ等モル量の２つのDNAフラグメント、700bpおよび
1300bpを一夜結紮し、１％アガロースゲルから2000bp D
NAフラグメントを回収する。制限酵素BamHI配列でフラ
ンキングしたDNAをBPV表現ベクターのBgl II部位に挿入
する。このDNAは合計650のアミノ酸（シグナルペプチド
用の35個のアミノ酸、成熟蛋白用の615個のアミノ酸）
を含有する蛋白をコードする。通常の培養、回収、単離
および精製技術により第１図（ｂ）のトリス−クリング
ルプラスミノーゲン活性化因子を得る。

実施例３ 261−（Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp−UKaa^50-131）
−262−ｔ−PA この実施例においては、ウロキナーゼクリングル配列
をｔ−PAの二重クリングル領域の直後、すなわち、アミ
ノ酸261（Cys）と262（Ser）に対応する配列の間に挿入
する。第８図にはこのトリス−クリングルPAの製造の種
々の工程を説明するフローチヤートを示す。

pWP42プラスミドDNA約10μｇをHga Iで消化し、400bp D
NAフラグメントを１％アガロースゲルから単離する。こ
のDNAフラグメントはｔ−PAのクリングル域の一部分、
すなわち、アミノ酸135〜261に対応する配列を含有す
る。ｔ−PAの二重クリングル域はアミノ酸92〜261の範
囲にわたり、２つのクリングルを連結するヘキサペプチ
ド（アミノ酸174〜179）を有する。第８図に示す２つの
DNA配列24merおよび21merからなるオリゴヌクレオチド
リンカーはホスホトリエステル法を用いて合成する。こ
のオリゴマーリンカーはヘキサペプチドリンカーおよび
UKクリングルの欠損アミノ酸50（Cys）をコードし、Hga
IおよびNde Iについての制限酵素配列でフランキング
される。上流のオリゴヌクレオチド、23merのみがその
５′端でホスホリル化し、ｔ−PAからの400bp DNAフラ
グメントのHgaI端に結紮する。421bp DNA生成物をプレ
パラテイブ１％アガロースゲルから単離する。

ｔ−PAの後クリングル部はpWP42プラスミド10μｇをR
saIで消化し、ついで1.2％アガロースゲルから501bp DN
Aを単離する。このDNAはｔ−PA分子のアミノ酸269〜435
を表わす。第８図に示すように22塩基の２つの補助オリ
ゴヌクレオチドをホスホトリエステル法により合成す
る。このDNAリンカーは、その５′端で501bp DNAと結紮
すると、欠損アミノ酸262〜268を復元する。

501bp DNA約１μｇおよびリンカーDNA1μｇを一夜結
紮し、523bpサイズに対応するDNAバンドを１％アガロー
スゲルから精製する。

サイズ421bp、246bp（UKクリングル）および523bpの
３つのDNAフラグメントをほぼ等モル量で15℃にて16時
間結紮する。フエノール抽出およびエタノール沈澱後、
DNAをEcoRIで切断し、741bpのDNAフラグメントを単離す
る。２つのEcoRI制限部位でフランキングされたこのDNA
を前記のごとくpUC13ベクター系中で増幅させる。

複クローニング部におけるEcoRI部を除去したptPBM−
１プラスミドDNA10μｇをEcoRIで消去し、約4.0Kbの大
きい方のベクターDNAフラグメントを１％アガロースゲ
ルから単離する。ほぼ等モル量のEcoRI切断ベクターDNA
および741bp DNAを結紮し、生成物をコンピテントイー
・コリJM103セルの形質転換に用いる。12個の組換体ク
ローンから調製したミニプラスミドDNAをBamHIで消化
し、約1.8Kbの所望のインサートを探す。インサートに
おける741bp DNAの正しい配向をプラスミドDNAのNar I
およびMst Iの消化によつて決定する。１つのクロー
ン、ptPUHYCは、Nar IおよびMst Iで消化した場合、正
しい配合の約700bpのフラグメントを含有していること
が判明した。

ptPUHYCプラスミドDNAのBamHI消化により得た1.8Kb D
NAは、650個のアミノ酸のペプチド（シグナルペプチド
用の35個のアミノ酸および第１図（ｃ）の生成物に対応
する成熟蛋白についての615個のアミノ酸）をコードす
るヌクレオチド配列を含有する。

ついで、このトリス−クリングル遺伝子を、完全表現
ペクターとして役立つBgl II切断ウシ乳頭腫ウイルス
（BPV）に結紮する。通常の培養により、第１図（ｃ）
のトリス−クリングルプラスミノーゲン活性化因子を得
る。

テトラ−クリングルプラスミノーゲン活性化因子プロトロンビンcDNA プロトロンビン遺伝子用のcDNAクローンを、フリーツ
ナーら、バイオケミストリー（Friezner et al.,Bioche
mistry）22,2087,1983の方法に従つてヒト肝臓のcDNAラ
イブラリーから単離する。このクローン、pPTRは579個
のアミノ酸の成熟蛋白についての完全コード情報を含有
している。プロトロンビンの二重クリングル領域はアミ
ノ酸65（bp319）からアミノ酸248（bp840）に延長する1
84個のアミノ酸のペプチドである。２つのクリングルPT
K1（アミノ酸65〜143）およびPTK2（アミノ酸170〜24
8）の各々は79個のアミノ酸の長さであり、26個のアミ
ノ酸の長さのペプチド（アミノ酸144〜169）で連結され
ている。

プロトロンビン二重クリングル配列の調製二重クリングル領域を表わすDNA配列を２工程でプロ
トロンビンcDNAから単離する（第12図）。

第１工程において、pPTRプラスミドDNA10μｇをAva I
で消化し、１％アガロースゲルから760bp DNAを単離す
る。このDNAをBal31で7.5秒間処理してDNAの一端から約
38bpを除去する〔レガスキーら、ニユークレイツク・ア
シツド・リサーチ（Legerski et al.,Nucleic Acid Re
s.）5,145,1978〕。フエノール抽出およびエタノール沈
澱後、DNAをEcoR Iリンカー、GGAATTCCに４℃で15時間
結紮する。このリンカーは、CTGAGまたはTGAG（アミノ
酸67、Glu）配列で終るDNAと結紮し、二重クリングルの
Ｎ−末端（アミノ酸67）において、Mst IIに対する新し
い制限配列（CCTGAGG）を生じる。EcoR Iで切断後、630
bpサイズのDNAフラグメントを単離する。このDNAは、等
モル量でEcoR I/pUC13と結紮後、コンピテントイー・コ
リJM103セルの形質転換に用いる。所望のクローンにつ
いての最初のスクリーニングを、アミノ酸66〜68に対す
るヌクレオチド配列を含有する³²Pラベルプローブ、GAA
TTCCTGAGGGTCTGを用い特定部間ハイブリツド形成により
行なう。Ｘ線フイルム上に強いシグナルを示す12個のク
ローンをミノプラスミド調製用に増殖させる。Mst IIお
よびBam HIでプラスミドDNAを消化後、１つのクロー
ン、pPTK−５′が約630bpの所望のインサートと、322bp
のところに新たに作成されたMst II部位を有することが
判明した。

第２の工程は前記と同様にして、およそアミノ酸248
のクリングル領域の３′未満を編整することを包含す
る。pPKT−５′プラスミドDNA約10μｇをBamHIで完全に
消化する。ついで、DNAをBalで30℃にて15秒間処理し、
DNAの両端から約82bpを除去する。フエノール抽出およ
びエタノール沈澱後、DNAをEcoRI/Fsp Iリンカー、CGCA
GAATTCTGCGに結紮する。このリンカーはその名のとお
り、TG−で終るいずれのDNA配列においてもFspI配列（T
GCGCA）を生じる。EcoRIで完全に切断後、1.2％アガロ
ースゲルから546bp DNAを単離し、EcoRI切断pUC13に結
紮する。この組換体プラスミドをコンピテントイー・コ
リJM103セルの形質転換に用いる。約1000の組換体クロ
ーンを、配列CTCAACTATTGCGCAGAA（アミノ酸245〜248）
を有する。³²Pラベルオリゴマーを用いる特定部間ハイ
ブリツド形成でスクリーニングする。12個の有力なクロ
ーンから調製したプラスミドDNAをMst IIおよびFsp Iで
切断し、１％アガロースゲル上で泳動させる。１つのク
ローン、pPT2Kは所望の546bpサイズのインサートを含有
していることが判明した。このDNAは二重クリングル域
の合計182のアミノ酸、アミノ酸67〜248をコードする。
65位（Cys）および66位（Ala）の残りの２つのアミノ酸
についてのヌクレオチド配列は第13図に示すようなオリ
ゴマーリンカーを介して加える。

実施例４ 91（PTKaa^65-248−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp）−9
2−ｔ−PA プロトロンビンの二重クリングル配列、アミノ酸65〜
248をｔ−PAの二重クリングル域の前（すなわち、アミ
ノ酸91と92の間）に挿入し、テトラクリングル−PAを得
る。前記のごとく、Mst II＋Fsp IまたはEco RIによるp
PT2KプラスミドDNAの消化はプロトロンビンの67〜248の
アミノ酸をコードする546bp DNAフラグメントを与え
る。２つのオリゴヌクレオチドの使用により、546bp DN
Aの２つの端をヌクレオチド462（アミノ酸91）および46
3（アミノ酸92）の間でｔ−PA遺伝子中に挿入する。第1
3図にフローチヤートを示す。

ペプチドリンカーSer−Glu−Gly−Asn−Ser−Aspおよ
びｔ−PAのアミノ酸92〜204用のヌクレオチド配列を含
有する354bp DNAを実施例２および第７図に示すごとく
して調製する。等モル量の354bp DNAおよび546bp DNA
（プロトロンビンクリングル）を４℃で16時間結紮す
る。このDNAをEcoR Iで切断し、アガロースゲルから900
bp DNAフラグメントを単離する。EcoRI切断pUK13ベクタ
ーに結紮後、このDNAをイー・コリJM103セルの形質転換
に用いる。12個の組換体クローンから得られたミニプラ
スミド調製物をEcoR IおよびMst IIで消化する。１つの
クローン、pPT2K TRKは所望の900bpのインサートを含有
することが判明した。このDNAは合計300のアミノ酸（プ
ロトロンビンに対応する182アミノ酸（アミノ酸67−24
8）、ヘキサペプチド配列およびｔ−PAの112アミノ酸
（アミノ酸92−204）をコードする。

ptPBM−１プラスミドをEcoR IおよびAsu 1で消化して
得られる385bp DNAの調製を第７図に記載する。各々12b
pの２つの補助オリゴヌクレオチド配列をホスホトリエ
ステル法で合成する。このリンカーはプロトロンビンク
リングル域の欠損アミノ酸、CysおよびAlaを復元し、As
uIおよびMst II認識配列によつてフランキングされる。
DNA（385bp）約500ngを第13図に示すようにホスホリル
化リンカー１μｇと結紮する。EcoR Iで切断後、402bp
DNAフラグメントを単離する。ほぼ等モル量の402bp DNA
および900bp DNAを結紮し、EcoR Iで切断し、1302bp DN
Aフラグメントを１％アガロースゲルで単離する。このD
NAをEcoR I切断pUC13ベクター中でサブクローンする。1
2個の組換体クローンから単離したプラスミドDNAをEcoR
Iで消化する。１つのクローン、所望のインサートを含
有するpNPT2KPAKをプラスミドDNAの大規模調製用に増殖
させる。このプラスミドDNAをBamHIで完全に、ついで、
NarIで部分的に消化し、986bp DNAフラグメントを得
る。同様に、pt PBM−１をBamHIおよびNar Iで消化して
1300bp DNAフラグメントを得る。２つのフラグメント、
986bpおよび1300bpを等モル量で結紮し、BamHIで切断
し、2286bp DNAフラグメントを１％アガロースゲル電気
泳動で単離する。BamHI配列でフランキングされたDNAを
BPV表現ベクターのBgl II部位に挿入する。このDNAは合
計752のアミノ酸（シグナルペプチドの35アミノ酸およ
び成熟蛋白の717アミノ酸）をコードする。成熟蛋白は
概算分子量約92000で、プロトロンビン二重クリングル
領域からの184アミノ酸、ヘキサペプチドリンカーおよ
び527アミノ酸の完全ｔ−PA配列を含有する。

ハイブリツド・プラスミノーゲン活性化因子の発現およ
び生化学的特徴第１図（ａ）および第１図（ｂ）に示す２つのハイブ
リツド・プラスミノーゲン活性化因子（ｈ−PA）を調製
しBPV−１ベース表現ペクター系に発現させる。これら
のｈ−PAを、各々、本明細書を通してハイブリツドＡお
よびハイブリツドＢと称する。

ハイブリツドＡ（1.8Kb、第５図）およびハイブリツ
ドＢ（2.0Kb、第７図）について、BamHIでフランキング
した完全遺伝子配列をBgl II切断プラスミドp341−３に
挿入する（詳細は方法および材料参照）。12個の組換体
クローンからミニプラスミド調製物を調製し、Nar I、B
gl IIまたはBam HIおよびAva Iで消化する。これをハイ
ブリツド遺伝子の存在の確認、インサートの配向の決定
に用いる。遺伝子のただ１つの配向、すなわち、メタロ
チオネイン・プロモーターの配列方向は、該プロモータ
の制御下、遺伝子の発現を行なうので望ましい。さら
に、遺伝子の直後に位置するSV40ポリ−Ａ配列は、その
３′末端におけるポリアデニレーシヨンによる遺伝子の
RNA転写を加工し、遺伝子の翻訳を効率よくする。２つ
の組換体クローンpHybAMT−43（ハイブリツドＡ）およ
びpHybAMT−50（ハイブリツドＢ）を得る。

前記のクローンから得られたプラスミドDNA約１μｇ
をBamHIで消化し、細菌性アルカリホスフアターゼで脱
ホスホリル化する。これに完全8.0Kb BamHI切断BPV−１
ゲノムを挿入する。各々、ハイブリツドＡおよびハイブ
リツドＢをコードする遺伝子を含有する２つの表現プラ
スミドpHyb−AMTBPV−438およびpHyb−BMTBPV−504（以
下、p438およびp504と略す）を得る。発現プラスミドの
種々の成分の相対位置を示す完全地図を第14図に示す。
ｔ−PA/ウロキナーゼ分子をコードする遺伝子を含有
する２つの表現プラスミドをリン酸カルシウム沈澱法
〔グラハムら、バイロロジイー（Graham et al.,Virolo
gy）52,456（1973）〕によりマウスC127セルにトランス
フエクシヨンした。形態学的に形質転換したセルのフオ
ーカスを二次培養し、遺伝子発現についてスクリーニン
グする。培地中におけるフイブリン溶解活性についての
最初のスクリーニングは第15図（ａ）に示すようにフイ
ブリン寒天平板上で行なつた〔プラウグら、バイオシミ
カ・バイオフイジカ・カクタ（Ploug et al.,Biochim.B
iophys.Acta）24,278（1957）〕。各トランスフエクシ
ヨンから、p504（ハイブリツドＢ）で形質転換したフオ
ーカスの平均50％およびp438（ハイブリツドＡ）で形質
転換したフオーカスの５％が培地中で陽性のフイブリン
溶解活性を示した。いくつかの高生産株を選択し、個々
のフオーカスからセル・ラインを展開させた。遺伝子産
生の予備的生化学的および免疫学的特徴づけの大部分を
行なつた２つのセル・ラインをハイブリツドＢについて
クローン5A5、ハイブリツドＡについてクローン16C1と
表示する。

生化学的特徴づけハイブリツド分子の酵素活性を、フイブリン寒天検定
および合成基質Ｓ−2444およびＳ−2251を用いるアミド
分解活性検定〔シモダら、トロンボシス・アンド・ヘモ
スタシス（Shimoda et al.,Thromb.Haemostas.）46,507
（1981）〕により評価した。約１〜５単位／μｌの活性
酵素が16〜18時間で培地中に分泌された。シグナル配列
を切断し、成熟蛋白となつた後、天然のｔ−PAおよびウ
ロキナーゼが前駆体として合成され、細胞から分泌され
る。さらに、ｔ−PAおよびウロキナーゼの両方ともグリ
コシル化される。トランスフエクシヨンしたマウス細胞
からｈ−PAが分泌されているか否かの判断は天然ｔ−PA
およびウロキナーゼと同様に行なわれ、ハイブリツド分
子をSOS/ポリアクリルアミドゲル（PAGE）電気泳動、つ
いで、フイブリン寒天重層〔グラネリーピペルノら、ジ
ヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイシン（Gr
anelli−Piperno et al.,J.Exp.Med.）148,223（197
8）〕により行なつた。第15図（ｂ）に示すように、ハ
イブリツドＢ含有培地からの活性酵素は76000の分子量
を有し、ハイブリツドＡでは71000である。これらは挿
入遺伝子から計算した分子量とよく一致した。

ｔ−PA精製に用いたと同様な方法で収穫培地からハイ
ブリツドＢを精製した。アミノ酸配列分析はハイブリツ
ドＢのＮ−末端が正しく加工され、成熟ｔ−PAのＮ−末
端域と同じ配列、Ser−Tyr−Gln−を有することを示
し、さらに、活性化開裂部位、Arg−Ileにおけるアミノ
酸に対応するＮ−末端配列、Ile−Lys−Gly−が存在し
た。収穫培地から精製したハイブリツドＢは主として、
活性化二本鎖型で存在すると結論された。収穫培地への
プロテアーゼ阻害剤（アプロチニン）の添加により、一
本鎖ｈ−PA分子が得られる。³⁵S−ラベル収穫培地の免
疫沈降、ついで、SOS/PAGEは、非還元条件下、見かけ分
子量71000〜76000に対する位置に、各々、セル・ライン
5A5（ハイブリツドＢ）および16C1（ハイブリツドＡ）
からの試料にはバンドが見られるが、対照試料には見ら
れないことを示した。5A5セルの培養培地のフイブリン
溶解活性および精製ｔ−PA（アメリカン・ダイアグノス
テイツクス・インコーポレーテツド、グリニツチ、CT）
は抗ｔ−PA抗血清で中和されるが、抗ウロキナーゼ抗血
清では中和されず、ハイブリツドＢはｔ−PAに加えてウ
ロキナーゼクリングルを含有するが、ハイブリツドＢの
プロテアーゼ領域は抗−ｔ−PAで認識され、中和される
ことを示唆している。抗ウロキナーゼ抗体はハイブリツ
ド分子のウロキナーゼクリングル部に結合しうるが、こ
の結合はあるとしても、該ハイブリツド分子のＣ−末端
におけるプロテアーゼ領域により与えられる蛋白分解活
性を干渉しない。

本発明のポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子
はｔ−PA自体と同じ方法で、同じ送達賦形剤により、哺
乳類における血管障害の治療に用いられる。かくして、
本発明のポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子
は、該ポリペプチドをｔ−PAへの適用で公知の医薬上許
容される適当な賦形剤に溶解または分散させることによ
り、医薬組成物に処方できる。投与の必要な哺乳類への
静脈内注射または注入による投与は、ｔ−PA自体ですで
に確立された方法に従つて行なわれる。ｔ−PAを用いる
場合、440IU/kg体重の静脈内第１回投与が一般的であ
り、ついで、約440IU/kg時間の連続注入を約６〜12時間
行なうのが通常のプラクテイスである。

なお、本発明における組換体プラスミド物質を含有す
るつぎのイー・コリ３株をブダペスト条約の下、1986年
８月５日にアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨンに寄託した。

（１）第１図（ａ）のポリペプチドをコードするDNAを
含有するATCC67175−p438/イー・コリMM294 （２）第１図（ｂ）のポリペプチドをコードするDNAを
含有するATCC67174−p504/イー・コリMM294 （３）第１図（ｃ）のポリペプチドをコードするDNAを
含有するATCC67176−p113/イー・コリMM294 イー・コリMM294株はATCC33625として入手可能なもの
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のポリクリングルプラスミノーゲン活性
化因子の代表例の配列図、第２図はクローンpWP−42の
制限地図、第３図はプラスミドptPBM−１産生のフロー
チヤート、第４図はプラスミドpUKBM産生のフローチヤ
ート、第５図は第１図（ａ）のトリス−クリングルをコ
ードする遺伝子産生のフローチヤート、第６図はウロキ
ナーゼのアミノ酸をコードする遺伝子産生のフローチヤ
ート、第７図は第１図（ｂ）のトリス−クリングルをコ
ードする遺伝子産生のフローチヤート、第８図は第１図
（ｃ）のトリス−クリングルをコードする遺伝子産生の
フローチヤート、第９図および第9a図は第１図（ａ）の
生成物をコードする遺伝子のDNA配列図、第10図および
第10a図は第１図（ｂ）の生成物をコードする遺伝子のD
NA配列図、第11図および第11a図は第１図（ｃ）の生成
物をコードする遺伝子のDNA配列図である。第12図はプ
ロトロンビンのダブルクリングル域をコードする遺伝子
産生のフローチヤート、第13図は第１図（ｄ）の生成物
をコードする遺伝子産生のフローチヤート、第14aおよ
びｂ図は、各々、ハイブリツドＡおよびＢの制限地図で
ある。第15a図はフイブリン寒天平板上でスクリーニン
グにおける生物の形態を示す図面代用写真、第15b図は
ハイブリツドＡおよびＢのザイモグラム、第15c図はハ
イブリツドＡおよびＢのオートラジオグラムである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/64 ＺＣ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ショウグァング・リン・リーアメリカ合衆国ペンシルベニア州、ビラノーバ、サウス・スプリング・ミル・ロード 155番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】非相同のポリペプチドクリングルを３個ま
たはそれ以上含有するハイブリッド・プラスミノーゲン
活性化因子。
【請求項２】３〜６個のクリングルを有する特許請求の
範囲第１項記載のプラスミノーゲン活性化因子。
【請求項３】テトラクリングルプラスミノーゲン活性化
因子である特許請求の範囲第１項記載のプラスミノーゲ
ン活性化因子。
【請求項４】91−（PTKaa^65-248−Ser−Glu−Gly−Asn
−Ser−Asp）−92−ｔ−PAで示される特許請求の範囲第
３項記載のプラスミノーゲン活性化因子。
【請求項５】トリスクリングルプラスミノーゲン活性化
因子である特許請求の範囲第１項記載のプラスミノーゲ
ン活性化因子。
【請求項６】式（UKaa^1-131−クリングルリンカー）
^1-91t−PAで示され、該クリングルリンカーが６〜10個
の天然アミノ酸を含有するポリペプチド部分である特許
請求の範囲第５項記載のプラスミノーゲン活性化因子。
【請求項７】該クリングルリンカーがＬ−Ser−Ｌ−Glu
−Gly−Ｌ−Asn−Ｌ−Ser−Ｌ−Aspである特許請求の範
囲第６項記載のプラスミノーゲン活性化因子。
【請求項８】式:91−（UKaa^50-131−クリングルリンカ
ー）−92 t−PAで示され、該クリングルリンカーが６〜
10個の天然アミノ酸を含有するポリポプチド部分である
特許請求の範囲第５項記載のプラスミノーゲン活性化因
子。
【請求項９】該クリングルリンカーがＬ−Ser−Ｌ−Glu
−Gly−Ｌ−Asn−Ｌ−Ser−Ｌ−Aspである特許請求の範
囲第８項記載のプラスミノーゲン活性化因子。
【請求項１０】式:261−（クリングルリンカー−UKaa
^50-131）−262−ｔ−PAで示され、該クリングルリンカ
ーが６〜20個の天然アミノ酸を含有するポリペプチド部
分である特許請求の範囲第５項記載のプラスミノーゲン
活性化因子。
【請求項１１】該クリングルリンカーがＬ−Ser−Ｌ−G
lu−Gly−Ｌ−Asn−Ｌ−Ser−Ｌ−Aspである特許請求の
範囲第10項記載のプラスミノーゲン活性化因子。
【請求項１２】プラスミノーゲンを、非相同のポリペプ
チドクリングルを３個またはそれ以上含有するハイブリ
ッド・プラスミノーゲン活性化因子と接触させることを
特徴とするプラスミノーゲンをプラスミンに変換する方
法。
【請求項１３】非相同のポリペプチドクリングルを３個
またはそれ以上含有する有効量のハイブリッド・プラス
ミノーゲン活性化因子からなることを特徴とする凝血を
崩壊するための医薬組成物。