JPS62104577A - ポリクリングルプラスミノ−ゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術により産生される複数の非
相同のポリペプチドクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）を含
有するハイブリッド第三世代プラスミノーゲン活性化因
子および該活性化因子をコードする遺伝子、前記遺伝子
を含有するベクター、および前記プラスミノーゲンの血
栓融解剤としての使用方法に関する。

発明の背景 プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンをプ
ラスミンに変換するセリンプロテアーゼの一種である。

プラスミンは、血餅のフィブリンマドＩＪックスを分解
し、これにより内部の血管障害により血栓症または血栓
塞栓症が起こった後の開放性血管系の動的血液状態を抑
制する。プラスミノーゲン活性化因子て治療し得る部分
的または全体的な血管閉塞を含む血管系の症病には、発
作、肺動脈塞栓症、心筋梗塞症、および深部静脈および
末梢動脈閉塞が含まれる。

ヒト血漿および他の体液において、２種の免疫学的に異
なるプラスミノーゲン活性化因子、すなわち、ウロキナ
ーゼタイププラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ　；
　Ｍｒ＝５５０００）および組織タイププラスミノーゲ
ン活性化因子（ｔ−ＰＡ；Ｍｒ＝６８０００　）か知ら
れている。組織プラスミノーゲン活性化因子の活性は、
フィブリンにより増加する。該酵素は、血栓の部位で作
用し、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子よりも
、フィブリンに対して高い親和力を示す〔ヘイレリスら
、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ＝（
Ｈｎｙｌａｅｒｉｓ　ｅｔ　ａ＋、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、）２５７．２９１２（１９８２）参照〕。

従って、組織プラスミノーゲン活性化因子は、生理学的
に適切な血栓溶解剤と考えられる。

２つの活性化因子、ｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡはともに以
下の共通の特徴を有する＝１）両者とも、プラスミンま
たはトリプシンにより、ジスルフィド結合した２つの鎖
状分子構造を壊さずに開裂し得る一本鎖プロ酵素として
合成される。還元により、各プラスミノーゲン活性化因
子は、Ｈ鎖およびＬ鎖に分解する（　ｕ−ＰＡ：Ｍｒ＝
３３ＱＱＱ、ｔ−ＰＡ：Ｍｒ＝３ｓｏｏｏ）ｉ　２）２
つの酵素は、ともに、フルオロリン酸ジイソプロピルな
どのセリン特異性試薬により不活化することができるセ
リンプロテアーゼである；３）２つの酵素は、ともに、
分子内にループまたはクリングルを形成する３つのジス
ルフィド結合したアミノ酸配列を有する。ウロキナーゼ
プラスミノーゲン活性化因子は、１つのクリングルをを
する。組織プラスミノーゲン活性化因子は、ヘキサペプ
チドリンカ−配列により結合した２つのクリングルを有
する。これらのクリングルは、酵素をフィブリンに結合
させるものであると考えられる〔トルセン、バイオヒミ
カ・バイオフイジカ・アクタ（Ｔｈｏｒｓｅｎ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　）、３９３．５５（１９７５）参照〕。

ｃ−ＰＡのＤＮＡ配列分析およびアミノ酸配列は、ヘニ
カら、ネイチャー（Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｎａｔｕｒｅ　）、３０１．２１４（１９８３）；　　
ニーら、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｎｙ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ　、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＴＪ、Ｓ
　、　）〜、）８１　　、５３５５（１９８４）および
ジエネンテク・インコーホレイテッド（Ｇｅｎｅｎｔｅ
ｃｈ　Ｉｎｃ、　）のヨーロッパ特許出願第９３６１９
号により開示されている。ｕ−ＰＡのＤＮＡ配列分析お
よびアミノ酸配列は、ジエネンテク・インコーホレイテ
ッドのヨーロッパ特許出願第９２１８２号に開示され、
ウロキナーゼＣＤＮＡは、ベルブら、プロシーデイング
ズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ
ズ・ニー・ニス・エイ（Ｖｅｒｄｅ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ
　、Ａ、　）８１．４７２７（１９８４）に開示されて
いる。

発明の開示 本発明に従って、複数の非相同なポリペプチドクリング
ルを有するハイブリッド第三世代プラスミノーゲン活性
化因子が提供される。本発明のポリペプチドは、２〜６
個のクリングルを有する。

非相同なりリンゲルなる語は、異なる自然発生源におい
て見出されるクリングルに対応する少なくとも１つのク
リングルまたは天然のプラスミノーゲン活性化因子にお
いてみられるクリングルと共通の他のクリングル構造お
よびその他のクリングル構造を有するポリペプチドを意
味する。天然のプラスミノーゲン活性化因子に共通のク
リングル構造を付与して本発明のハイブリッドプラスミ
ノーゲン活性化因子を調製する場合、ＤＮＡが化学的に
合成され、該共通のクリングル産生のためのＤＮＡコド
ンの使用は、所望のアミノ酸配列のクリングルを生成す
る際の組換え（ループの開裂）を避けるための天然のプ
ラスミノーゲン活性化因子のＤＮＡコーディング配列と
は異なるものであると考えられる。本発明のハイブリッ
ドプラスミノーゲン活性化因子において存在するクリン
グルは、別々に相同領域を有するが、非相同であり、そ
の結果、本発明のプラスミノーゲン活性化因子は、アミ
ノ酸配列、数および／または大きさのいずれかに関して
、天然のプラスミノーゲン活性化因子とはそのクリング
ル構造が異なっている。さらに、本発明は、ハイブリッ
ドプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およ
びそのキー・フラグメント、完全ポリペプチドのＤＮＡ
産生用発現ベクターおよびそのキー・フラグメント、該
発現ベクターで形質転換される微生物またはセル培養物
、および該ハイブリッドプラスミノーゲン活性化因子を
用いる方法を提供するものである。

／）　ＩＪングル構造は、３つのジスルフィド結合によ
り形成される３つのループになったポリペプチド構造で
ある。クリングルの長さは、アミノ酸基約７９〜８２個
である。ヒトウロキナーゼの単一のクリングル〔グンツ
ラーら、ホツペーセイラーズ・ツアイトシュリフト・フ
ユア・フイジオロジッ’、ｉ　ｘ　−ヒ、：ｃ　ミー　
（Ｇｕｎｚｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｏｐｐｃ−５ｅ
ｙｌｅｒｓＺ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、３６３
．１１５５（１９８２）　　参照〕、ヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子の２つのクリングル〔ペニカら、ネ
イチャー（Ｐｅｎｎｉｃａｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　）、３０１．２１４（１９８３）参照〕、ヒトプロ
トロンビンの２つのクリングル〔ワルツラ、フロシーデ
イングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｗａｌｚ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ）、７４．１９６９　（１９７７）参照〕および
ヒトプラスミノーゲンの５つのクリングル〔ソトラツプ
ージエンセンら、プログレス・イン・ケミカル・フィブ
リツリシス・アンド・トロンポリシス、ダビツドソンら
編（５ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、　
ｉｎ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｆｉ
ｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓ
ｉｓ　（ｅｄｓ。

Ｄａｖｉｄｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ　）　）、３．１９１（
１９７８）参照〕の間に高度の配列相同がある。クリン
グル内のジスルフィド架橋に含まれる６個のシスティン
の相対的な位置は、全ての小環において同じである。本
明細書において用いる小環なる語は、前記タンパク質中
にかかる構造を有するものを意味する。また、これらの
タンパク質のクリングル部分における多形体は、天然に
存在し、その場合、１以上のアミノ酸が付加、欠失また
は置換されている。近年の遺伝子の点変異テクノロジー
の出現とともに、または所望の配列を有する遺伝子の化
学的合成により、ｉｎ　ｖｉｃｒｏでタンパク質におい
て同様の変化が起こり得る。従って、これらの修飾され
た構造も、本発明で用いるクリングルなる語に包含され
る。

以下に、３クリングル（トリス−クリングル）プラスミ
ノーゲン活性化因子およびテトラ−クリングルプラスミ
ノーゲン活性化因子の調製を説明する。用いた方法は、
本発明の他のポリペプチドの調製に応用し得る代表的な
ものである。

本発明のトリス−クリングルプラスミノーゲン活成化因
子により、ウロキナーゼおよびｔ−ＰＡクローンの適当
な遺伝子コーディング配列から組換ＤＮＡ技術により組
立てられた場合、天然のプラスミノーゲン活性化因子の
いずれと比較しても、ｉｎ　ｖｉｖｏで安定性が増大し
、フィブリンに対する結合親和力が増大し、半減期が向
上する利点かある。トリス−クリングルプラスミノーゲ
ン活性化因子のこれらの性質により、生物学的有効性が
改善され、保存性も改善される。トリス−クリングル−
ＰＡ分子は、天然のｔ−ＰＡよりも、調製および精製の
際に取扱いが容易である。これは、後者のポリペプチド
が、培養液および種々の精製段階でみられる様に、低分
子量で、Ｈ鎖およびＬ鎖を含むためである。テトラ−ク
リングルプラスミノーゲン活性化因子および他のポリ−
クリングルプラスミン−ゲン活性化因子もこれらの性質
を有する。

本発明のトリス−クリングルプラスミノーゲン活性化因
子は、ウロキナーゼのＮ末端部分からその１つのクリン
グル領域を、適当なリンカ−を介して、２つのクリング
ル領域の開始点またはそれ以前から始まるｔ−ＰＡのＮ
末端部分と結合させることにより組立てられる。ウロキ
ナーゼの１つのクリングルは、１３１位のアミノ酸のグ
リシン残基の前にあることが知られている。ｔ−ＰＡの
２つのクリングルは、９１位のトレオニン残基に続（シ
スティンから始まることが知られている。従って、１３
１位のグリシン残基で終わるウロキナーゼのＮ−末端部
は、所望により、ｔ−ＰＡの２つのクリングル間のへキ
サペプチド結合を模倣する適当なリンカ−を介して、最
初の９１Ｎ−末端アミノ酸か欠失したｔ−ＰＡ分子と結
合する。得られたハイブリッド分子は、ｔ−ＰＡよりも
アミノ酸残基４６個分大きく、用いたリンカ−により異
なるが、分子量約７３０００のタンパク質か得られる（
【−ＰＡは、６８０００の分子量を有する）。同様に、
ウロキナーゼの１つのクリングル（ＵＫＫａａ　５　Ｑ
　−１３１）は、クリングルリンカ−とともに、アミノ
酸９１〜９２または２６１〜２６２間のｔ−ＰＡポリマ
ーに挿入され、トリス−クリングルプラスミノーゲン活
性化因子産生用の２つの異なる遺伝子を得る。同様に、
また標準的技術により、適当なリンカ−を用いて、ｕ−
ＰＡクリングルを、２つの１−ＰＡツクリングル間挿入
してもよい。さらに、プロトロンビンまたはプラスミノ
ーゲンにみられるクリングルを、単離し、前記ｔ−ＰＡ
のどの位置に挿入してもよい。本発明のいずれのポリク
リングルブラスミ／−ゲン活性化因子の組立ては、前記
タンパク質から、１または２クリングル領域を単離し、
これをｔ−ＰＡ分子に挿入する同様の基本的操作に従っ
て行なう。

ウロキナーゼのシングルクリングル部（ＵＫＫ）を、ｔ
−ＰＡのダブルクリングル領域（ｔ−ＰＫｌおよびｔ−
ＰＮ２）と結合させるのに用いるクリングルリンカ−は
、６〜１０個の天然のアミノ酸を含有するポリペプチド
である。好ましくは、クリングルリンカ−は、Ｌ−ＰＡ
の２つのクリングル間に存在するものに似た配置を保持
するように選択さレル。好マシイリンカーは、Ｌ−２４
８−Ｌ−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−２４８−
Ｌ−Ａｓｐであ杭これは、ｔ−ＰＡにおいてｔ−ＰＫｌ
をＬ−ＰＸ３に結合するものと同等だからである。しか
し、ヘキサペプチドＬ　−Ｔｈ　ｒ　−Ｌ−Ａｓ　ｐ　
−Ｌ−Ａｌ　ａ　−Ｌ−Ｇｌ　ｕ　−Ｌ−Ｔｈｒ　−Ｌ
−Ｇｌｕも用い得るヘキサペプチドリンカ−であり、Ｌ
−Ａｌａ、ＧｌｙｌＬ−２４８、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｔｈ
ｒおよびＬ−Ａｓｐのいかなる組合せも、ヘキサペプチ
ドリンカ−のＮ−末端またはＣ−末端に用いて、ｔ−Ｐ
ＡクリングルおよびＵＫツクリングル間、ヘプタ、オク
タ−、ノナ−またはデカペプチド結合等の、より間隔の
大きい構造を得る。他のリンカ−は公知である。簡便の
ために、以下、本明細書では、クリングルリンカ−とし
て、前記の好ましいリンカ−を用いた場合について記載
する。

トリス−クリングルプラスミノーゲン活性化因子は、選
択された制限酵素を用いてウロキナーゼおよびｃ−ＰＡ
ココ−ィング配列を制限的に消化することにより調製さ
れ、所望のｕ−ＰＡおよび（−ＰＡフラグメントを得る
。該フラグメントは、アガロースまたはアクリルアミド
ゲル上で分別することにより単離し、結紮し、適当なベ
クターまたはクローニングおよびその後の発現用ベクタ
ーに導入される。

図面の説明 第１図は、本発明の方法により調製される３つのトリス
−クリングルプラスミノーゲン活性化因子および１つの
テトラ−クリングルプラスミノーゲン活性化因子の配列
図である。構造式１（ａ−ｃ）の太線部分は、ウロキナ
ーゼクリングル（ＵＫＫ）を含むウロキナーゼ部分を示
す。構造式１（ｄ）の太線部分は、プロトロンビン（Ｐ
ＴＫ　ｌ　オヨヒＰＴＫ２）のダブルクリングル領域を
示す。略号ｔＰＫｌおよびｔ　ｐｉｃ２は、各々、組織
プラスミノーゲン活性化因子クリングル１および２を示
す。

第２図は、組織プラスミノーゲン活性化因子組換体クロ
ーンｐＷＰ　−４２の制限地図である。

第３図は、ｐｗｐ−４２からプラスミドｐｔＰＢＭ−１
を産生ずるのに用いる技術を示すフローチャートである
。ｐｔＰＢＭは、完全ｔ−ＰＡ分子を産生ずるのに必要
な遺伝子情報を有する。

第４図は、プラスミドｐＵＫ−５３からプラスミドｐＵ
ＫＢＭを産生ずるのに用いる技術を示すフローチャート
である。ｐＵＫＢＭは、完全なウロキナーゼタンパク質
を産生ずるのに必要な遺伝子情報を担持する。

第５図は、第１図（ａ）に示すトリス−クリングルをコ
ードする遺伝子を産生ずるのに用いる方法のフローチャ
ートである。

第６図は、ウロキナーゼのアミノ酸５１〜１３１（ｕＰ
Ａ５１−１３１）をコードする遺伝子を産生ずるのに用
いる方法のフローチャートである。

第７図は、第１図（ｂ）に示すトリス−クリングルをコ
ードする遺伝子を産生ずるのに用いる方法のフローチャ
ートである。

第８図は、第１図（Ｃ）に示すトリス−クリングルをコ
ードする遺伝子を産生ずるのに用いる方法のフローチャ
ートである。

第９図および第９ａ図は、ウロキナーゼシグナルペプチ
ド領域（アミノ酸２０　　）、ＵＫＫ　領域（ウロキナ
ーゼのアミノ酸・１〜１３１　）、ヘキサペプチドリン
カ−およびｔ−ＰＡ分子の残りの部分（アミノ酸９２〜
５２７　　）に関する第１図（ａ＋の生成物をコードす
る遺伝子のＤＮＡ配列図である。

第１０図および第１０ａ図は、ｔ−ＰＡシグナルペプチ
ド（アミノ酸３５　）、ｔ−ＰＡのＮ−末端部（アミノ
酸１〜９１　）、ＵＫＫ（ウロキナーゼのアミノ酸５０
〜１３１　　）、ヘキサペプチドリンカ−およびｔ−Ｐ
ＡのＣ−末端部（アミノ酸９２〜５２７　）に関する第
１図ｔｂｌの生成物をコードする遺伝子のＤＮＡ配列図
である。

第１１図および第１１ａ図は、ｔ−ＰＡシグナルペプチ
ド（アミノ酸３５　）、ｔ−ＰＡのＮ−末端部（アミノ
酸１〜２６１　　）、ヘキサペプチドリンカ−１ＵＫＫ
（ウロキナーゼのアミノ酸５０〜１３１　）およびｔ−
ＰＡのＣ−末端部（アミノ酸２６２〜５２７　）に関し
て第１図（Ｃ１の生成物をコードする遺伝子のＤＮＡ配
列図である。

第１２図は、プロトロンビンのダブルクリングル領域を
コードする遺伝子を産生ずるのに用いる方法のフローチ
ャートである。

第１３図は、第１図（ｄ）に示すテトラクリングル生成
物をコードする遺伝子を産生ずるのに用いる方法のフロ
ーチャートである。

第１４１およびｂ図は、噴孔動物細胞系Ｃ−１２７（マ
ウス）におけるプラスミノーゲン活性化因子ハイブリッ
ドＡ（第１図（ａ）参照）およびハイブリッドＢ（第１
図（Ｉ〕）参照）遺伝子の発現用の、ＢＰＶ−１を基本
とする発現ベクター系を示す制限地図である。発現され
るベクターを、マウスメタロチオネイン転写プロモータ
ーエレメントおよび５Ｖ４Ｑ初期転写プロセッシングシ
グナル間に挿入する。

第１５ａ図は、フィブリンアガープレート上でウェルあ
たり培地１０μｌを加え、ウェルのまわりに透明な領域
が現われるまで（２〜７列）３７℃にてインキュベート
することによるＰＡ産生セルまたはフォーカスのスクリ
ーニングを示す図である。第１列は、標準的なｔ−ＰＡ
を示す（上部かう底部（Ｏｎ　素濃度（単位／ｍＱ）＝
５ｏｏ、２５ｏ、１００．５０．２５．０）。

第１５ｈ図は、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）中
電気泳動によりハイブリッド−ＰＡを分離した後のハイ
ブリッドＢ、ハイブリッドＡおよび組織タイププラスミ
ノーゲン活性化因子のフィブリンアガープレート上のザ
イモグラムである。

第１５Ｃ図は、抗ｔ−ＰＡ抗血清でラジオ−パルス処理
した培地を免疫沈降し、次いで非還元性ドデシル硫酸す
Ｉ−ＩＪウム（ＳＤＳ）／ＰＡＧＥ　上電気泳動した後
の３５５で標識したプラスミノーゲン活性化因子、ハイ
ブリッドＡおよびハイブリッドＢのオートラジオグラム
である。分子量が公知のタンパク質マーカー（右列）を
同時に実験した。

ａ）酵素反応： 制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、ニュー・イングラン
ド・バイオラブズ・インコーホレイテッド（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ、、　Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ、　ＭＡ）またはインターナショナル・バイオチ
クノロシーズ・インコーホレイテッド（Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　
Ｉｎｃ、Ｎｅｗ　Ｈｅａｖｅｎ、　ＣＴ、）より入手し
た。代表的な制限酵素反応は、該酵素の販売者の推奨す
る方法に従って、全容積５０μｅで行なった。

接着末端ＤＮＡの結紮反応は、代表的には、ＤＮＡ１０
０〜２００ｎ７およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ４００ｉ
Ｉｔ位（二ニー・イングランド・バイオラブズ）を含有
する緩衝溶液２０μｅ中１５℃にて一夜行なう。平滑末
端に関しては、前記反応混合物にＴ４ＲＮＡリガーゼ４
単位にニュー・イングランド・バイオラブズ）を加える
〔グツドマン、エイチ・エムおよびマクドナルド、アー
ル・ジェイ、メソツズ・イン・エンザイモロジー（Ｇｏ
ｏｄｍａｎ　。

Ｈ，Ｍ、　ａｎｄ　Ｍａｃ　Ｄｏｎａｌｄ、　Ｒ，Ｊ、
、　Ｍｅｔｈｏｄ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ　、）靜、７５（
１９７９）参照〕。用いる緩衝溶液は、０．５■ Ｍ　ｌ−’Ｊ　ス・Ｈ（４（ｐＨ７，６）、０．　Ｉ　
Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２オよひＱ、１Ｍ　ＤＴＴ　（ジチオ
トレイトール）の１０Ｘ保存溶液として調製する。

ｂ）オリゴヌクレオチドの合成： 本発明において記載したオリゴヌクレオチドは全て、ホ
スフォトリエステル法〔フレアら、プロシーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミ−、オブ、サイエンシズ
（Ｃｒｅａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　（ＵＳＡ）　）、７５．５７６
５（１９７８）参照〕により、ジーン・マシーン・モデ
ル（ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ　Ｍｏｄｅｌ　）　３　ｇ
　Ｑ　Ａ（アプライド・バイオシステムズ・インコーホ
レイテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏ　−ｓｙｓｔｅ
ｍｓ　Ｉｎｃ、、　Ｆｏｓｔｅｒ　ｃｉｔｙ、　ＣＡ　
）を用いて合成した。結紮反応で用いる前に、オリゴマ
ーを、ＤＮＡ２００〜５００ｎ、＠　、Ｔ４　ＤＮＡキ
ナーゼ１０単位、Ｑ、５ｍＭ　ＡＴＰおよびキナーゼ緩
衝液（０，０５Ｍ１−リｘ　、ＨＣＩ、ｐＨ７，６、ｌ
　Ｑ　ｒｎＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１２，５ｍＭ　ＤＴＴ）を
含有する容積５０　μｌ中で、５′末端をホスホリル化
し、３７℃にて半時間インキュベートした。ハイブリッ
ド化プローブとして用いるために、オリゴマーを１００
μＣｉ　γ３２Ｐ−ＡＴＰ（５０００Ｃｉ／ミリモル、
アマ−ジャム（、Ａｍｅｒｓｈａｍ　。

ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　、　ＴＩ　）で
、マキサム、エイ・工ムおよびギルバート、ダブリュー
、メソ°ンズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍａｘａｍ、
　Ａ、Ｍ、ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ。

Ｗ、　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　、　）、６５．
４９９（１９８０）参照）の方法に従って放射線標識し
た。

ｃ）ＤＮＡフラグメントの単離： ＤＮＡフラグメントをまず０．５〜１．５％アガロース
ゲルで電気泳動により分離する。電気泳動は、約１００
ボルトにて２〜４時間、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（Ｔ
ＢＥ）　緩衝液（０，０８９Ｍトリス、０．０８９Ｍ　
ホウ酸、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＩ（８，０）中で
行なう。

Ｏ１５μｇ／ｍＱ臭化エチジウム溶液中ゲルを着色する
ことによりＵＶライト下で視覚化する〔シャープら、バ
イオケミストリー（５ｈａｒｐ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）、１２．３０５５（１９７３）参照〕。ＤＮ
Ａバンドを含有するアガロースをかみそりで切除する。

該ＤＮＡをゲルから電気溶出する〔マニアナイスら、モ
レキュラ・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュ７
　ル（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ　）、ｐ、１６４　（１９８２）参照〕
。

ＤＮＡをエリューチップーｄ　（Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ■）
カラムを通すことによりさらに精製する〔シュライヒヤ
ーおよびシュル（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃ
ｈｕｅｌｌ　、Ｋｅｅｎｅ。

ＮＨ）’Ｉ。ＤＮＡをエタノールで沈降させる。エツペ
ンドルフ番マイクロヒュージ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｍ
ｉｃｒｏ−ｆｕｇｅ　）で１５分間遠心分離した後、ペ
レットを７０％エタノールで一度洗浄し、真空下で乾燥
し、脱イオン水５０μ召に溶かす。

ｄ）ミニプラスミドＤＮＡ調製： 適当な抗生物質を含有するＬＢ（ルリア・ベルタニ）培
地的２ｍＱを、単一のバクテリアのコロニーとともにイ
ンキュベートし、激しく振とうしながら３７℃にて一夜
インキユベートする。約１．５ｍＱの培地を用いて、前
記マニアナイスら、ｐ、３６６により記載されている沸
騰法によりプラスミドＤＮＡを単離する。残りの培地を
後で使用するために一２０℃にて１５％グリセロール中
で保存する。該ＤＮＡを１０　ｔｔｆｉ　ＲＮアーゼ／
ｍＱを含有するＨ２Ｏ４０μｅ　に溶かす。−回の制限
酵素分析に関しては約８μ４で十分である。

ｅ）プラスミドＤＮＡの大規模な調、ｉ！：代表的には
、ＬＢ培地１ｅを単一のバクテリアのコロニーとともに
インキュベートする。クロラムフェニコールでプラスミ
ドＤＮＡを増幅シた後、バクテリアセルを回収し、沸騰
法に従って、溶解する〔ホームズ、ディー・ニスおよび
クイグレイ、エム、アナリテイカル・バイオケミストリ
ー（Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｄ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｑｕｉｇｌｅ
ｙ、　Ｍ、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、１１４
．１９３（１９８１）参照〕。塩化セシウム勾配遠心分
離によるか、または、前記マニアナイスら、ｐｐ９３〜
９６　により記載の如く、セファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　）　４　Ｂカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ。

Ｃ１ｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ　）　）上刃ラムク
ロ？トゲラフイーによるかのいずれかにより、プラスミ
ドＤＮＡをさらに精製する。培養液１１につき約４００
μｙのＤＮＡを回収する。

０　ベクター： ｄＧ末端を有するｐ　ＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（ベ
ゼスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコーホレイテ
ッド（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ　）　
）を用いて、ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡのＣＤＮＡをクロ
ーンする。ｐＢＲ３２２の詳細な分子構造は、前記マニ
アナイスら、ＰＰ５および４８８により記載されている
。組換体ｐＢＲ３２２を用いた形質転換に用いるイー・
コＩＪ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）株は、Ｉ（ＢＩＯＩまたはＭＭ２９４（前記
マニアナイスら、Ｐ５０４参照）のいずれかである。

ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡ遺伝子からのＤＮＡフラグメン
トのサブクローニングは全て、ｐＵＣプラスミド　１ａ
ｃＺおよびアンピシリナーゼ遺伝子を含有する一連のｐ
ＢＲ３２２由来のベクター〔ビーリア、ジエイおよびメ
シング、ジエイ、ジーン（Ｖｉｅｒｉａ、　Ｊ、ａｎｄ
　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　ＪｌＧｅｎｅ　）　１９．２５９
（１９８２）参照〕中で行なう。さらに、該プラスミド
はまた、以下に示す如く、１ａｃＺに多重クローニング
または制限サイトの配列を有する：■サイトのいずれか
のクローニングは、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルβ−Ｄ−４ラクトシト）を含有する
指示プレート上、青色のベクターコロニー中に白色の組
換体コロニーが出現することによりモニターできる〔ル
サー、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイ
クス（Ｒｕｔｈｅｒ、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ　）　１７８．４７５（１９８０）参照〕。組換
体ｐＵＣプラスミドを用いた形質転換に用いるイー・コ
リ株はＪＭＩＯ３である。ｐＵＣプラスミドおよびイー
・コリＪＭ１０３は、７アμマシア・ピー・エル・バイ
オケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ。

ＷＩ）　　より入手した。

ｇ）宿主／ベクター系 １、微生物系 本明細書において記載した操作は、微生物イー・コリに
−１２ＪＭ１０３株（ピー・エル・バイオケミカルズ（
ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　）およびイー・
コリに−１２ＭＭ２９４株（ＡＴＣＣＡ３３６２５　）
を用いて行なった。この方法において用い得る他の微生
物としては、他の有用なイー・コリ株およびバチルス・
サタイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）
などノハチルス属が挙げられる。これらの微生物は、全
て、非相同な遺伝子配列を複製および発現し得るプラス
ミドを利用するものである。

酵母における発現には、イー・コリおよび／まタハ酵母
（サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ　））における選択およ
び複製可能なプラスミドを用いる。酵母における選択に
関しては、該プラスミドは、トリプトファンについて原
栄養性の形質転換ｔｒｐ　　酵母株（ＲＨ２１８）を与
えるＴＲＰ１遺伝子を含有する。酵母発現ベクターは、
酵母およびイー・コリ間で往復できる。プラスミドは以
下の成分を有する＝１）複製開始点およびアンピシリン
耐性遺伝子を含有するＰＢＲ３２２由来のＤＮＡセグメ
ント、２）酵母ＴＲＰ　ｌ遺伝子、３）酵母において高
い安定性でプラスミドを複製し得る酵母２μＤＮＡ、４
）アルコールデヒドロゲナーゼ、α因子、グリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼなどの酵母
遺伝子由来のプロモーター領域、５）発現系において適
当な終止およびｍＲＮＡのポリアデニル化に用いること
ができる翻訳開始および転写終止配列。

２、補乳動物細胞培養物系 複製および　　　　非相同なタンパク質産生用のベクタ
ーの発現が可能な補乳動物細胞系を本発明において用い
る。これらは、例えば、Ｃｏ５−７、ＷＩ３８．３Ｔ３
　、ＣＨＯ，ヒーラセルおよびＣ１２７セルである。用
いるベクターは、１）ウィルス（ＳＶ４Ｑ、アデノ、ポ
リオーマ、ＢＰＶ）または細胞染色体ＤＮＡ由来の複製
開始点；２）プロモーター；３）リボンーム結合サイト
などの翻訳開始シグナル１４）ＲＮＡプロセッシングシ
グナル（ＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化および
転写終止配列）を含む。本明細書に示した発現ベクター
の具体例では、ＢＰＶウィルス複製開示点、マウスメタ
ロチオネインプロモーターおよびＳＶ４０　ＲＮＡプロ
セッシングシグナルを用いる。該ベクターも、浦乳動物
細胞培養物およびイー・コリの両方で増殖可能である。

これは、イー・コリアンピシリン耐性の選択マーカーお
よびＤＮＡ複製のイー・コＩＪ　ｇ源を提供するＰＢＲ
３２２配列の誘導体を含む。これらの配列は、プラスミ
ドｐＭＬ−２ｄ　　由来である。

ＢａｍＨ工接着未接着末端る修正ハイブリッドプラスミ
ノーゲン活性化因子をまずプラスミド３４１−３（ロー
・エム・エフら、メディカル・セル・バイオロジイ・ア
ンド・ファンクション（Ｌａｗ　ＭＦｅｔ　ａｌ、、　
Ｍｄ、　Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、　Ｆ　）３１２１１０（
１９８３）参照〕のＢｇｌ　ｆｆサイトで、マウスメタ
ロチオネイン転写プロモーター・エレメントおよび５Ｖ
４Ｑ初期転写プロセッシングシグナル間に挿入する。プ
ラスミド１４２−６（ＡＴＣＣＡ３７１３４）をＢａｍ
Ｈ工で消化した後得られる完全ＢＰＶゲノムを非反復Ｂ
ａｍＨＩサイトと結紮する。プラスミド３４１−３もＰ
ＭＬ２、ｐＢＲ−３２２誘導体を含有し、これにより、
バクテリアセルにおけるプラスミド複製が可能になる。

本明細書において組立てる発現プラスミドは、マウスＣ
−１２７セルにおいて排他的に染色体外エピゾームとし
て複製し得る。トランスフェクトしたセルは、形質転換
した表現型に関して選択され得る。より高度な発現レベ
ルを得るためにエンハンサ−エレメントを添加したり、
遺伝子に薬剤耐性（ネオマイシン耐性など）を挿入する
ことなどにより、発現ベクターをさらに修飾することも
可能である。

組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）メツセン
ジャーＲＮＡ インチオシアネート法（前記マニアテイスら、Ｐ１９６
参照）により、あらかじめ内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ
）およびヘパリンで刺激した正常ヒト繊維芽細胞（ＷＩ
−３８セル）からＲＮＡを単離し、ｔ−ＰＡを得る。同
じ刺激したセルからウロキナーゼを得る。オリゴ−デオ
キシチミジン（ｄＴ）−セルロースカラム上クロマトグ
ラフィーにより、ＲＮＡからメツセンジャーＲＮ　Ａ　
（ｍＲＮＡ　）を得る〔アビブら、プロシーデイングズ
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ
・ニー・ニス・エイ（Ａｖｉｖ　ｅｔ　ａｌ　、、　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）　、５９．１４０８　（１９７２）参照〕。１
５〜３０％スクロース濃度勾配中遠心分離によりｍＲＮ
Ａをさらに分別し、各ｍ　Ｒ１’Ｊ　Ａフラクションを
　Ｐプローブでハイブリッド化する（後記参照）。ｔ　
−ＰＡ情報を有するフラクション（約２０〜２４Ｓ）を
相補Ｄ　ＮＡ　（ｃ　ＤＮＡ　）の調製において用いる
ためにためる。

相補ＤＮＡ 前節に記載した、ためておいたｍＲＮＡ５μｙを用いて
二本鎖ＣＤＮＡを得、該ＣＤＮＡを末端ヌクレオチドト
ランスフェラーゼを用いて、ポリデオキシシチジレート
（ｐｏｌｙ　ｄＣ）でホモポリマー末端にする。生成物
を、Ｐｓｔ　工消化ポリデオキシグアニレート（ｐｏｌ
ｙ　ｄＧ）末端ｐＢＲ３２２でアニールする。

アニールしたＤＮＡを用いて、コンピテント・イー・コ
リ２９４セルを形質転換し、該セルを培養して、約１０
５のバクテリアクローンを得る（前記マニアティスら、
Ｐ２２９参照）。

ｔ−ＰＡクローンのスクリーニングおよび同定以下に示
す３つのオリゴヌクレオチドを、３２゜ＡＴＰで放射線
標識した抜用いて、組換体クローンのライブラリーをス
クリーンする。これらのオリゴマーは、以下のアミノ酸
配列に対応する：ｔ−ＰＡ分子（７）３４〜３９　（１
，７ｍｅｒ）、２５３〜２５８（１８ｍｅｒ　）および
５２３〜５２７　（１５ｍｅｒ）　［ペニカ、ディーら
、ネイチャー（Ｐｅｎｎ１ｃａ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、
。

Ｎａｔｕｒｅ　）　、３０１．２１４（１９８３）参照
〕５′−ＣＣＡＣＴＧＴＴＧＣＡＣＣ−ＡＧＣＡ−３’
；ｌ　８ｍｅｒ：５’　−ＣＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣ
ＴＣＣＣＡ−３’；１５ｍｅｒ　：５’−ＣＧＧＴＣＧ
ＣＡＴＧＴＴＣ，ＴＣ−３１０約２０コロニーが、ため
ておいたプローブに関して、中程度〜強度のホモロジー
を示した。これらのコロニーを再びブレーティングし、
再びハイブリッド形成して正のシグナルを有する１６の
クローンを得る。これらのクローンから調製したプラス
ミドＤＮＡをニトロセルロース戸紙上にしみこませ、各
プローブでハイブリッド形成する。２つのクローン（４
２および６２ａ）は、中間（１８ｍｅｒ　）および３′
末端（１５　ｍｅｒ　）プローブの両者とハイブリッド
形成する。プラスミドＤＮＡをＰｓｔ　工を用いて酵素
で消化すると、クローンＡ４２は、１．１．０．６およ
び０、４　Ｋ、ｂの３つのフラグメントの形態で、２キ
ロベース（Ｋｂ）より大きい最大の挿入部を有すること
が示される。該クローン（ｐＷＰ　４２　）の完全な制
限地図を第２図に示す。このクローンは、５′−および
３′−未翻訳領域を含む２６００ｂｐ　を有する（−Ｐ
Ａ遺伝子に関する完全な長さの配列を有する。

ｔ−ＰＡ遺伝子の編整 約１０μｙのＰＷＰ４２プラスミドＤＮＡを９単位のＸ
ｈｏ　ＩＩで、３７℃にて２時間消化する。反応混合物
を調製用１．２％アガロースゲルに付し、アガロースゲ
ル中電気泳動により、１６１８ｂｐ　ＤＮＡフラグメン
トを単離する。接着末端をイー・コリポリメラーゼ１〔
フレ／つ・フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ　）　）およびｄＮＴＰ（４種のデオキシヌクレオ
チド三燐酸：　ｄＡＴＰ　１ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよび
ｄＴＴＰ）でうめた後、このようにして修飾したＤＮＡ
を、ホスホリル化Ｓａｌ■リンカー３００ｎｙチー夜結
紮する。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノー
ル沈降の後、ＤＮＡを５ａｌＩ５０ｔＪで１時間消化し
、反応混合物を調製用１％アガロースゲルに付して、所
望のＤＮＡフラグメントを単離する。

Ｓａｌ工末端を有するＤＮＡを、Ｓａｌ工切断ｐＵＣ１
３と結紮し、イー・コｌＪＪＭ１０３セルを形質転換す
るのに用い、該セルを、アンピシリンおよびＸ−ｇａｌ
プレートに移す。８つのアンピシリン耐性の白色コロニ
ーを選択し、増殖させて、ミニプラスミド調製物を得る
。２つのクローン（ｐｔＰ５３４ＢおよびｐｔＰｓ３９
）が、所望のＤＮＡフラグメントを含有することが判明
した。ＢａｍＨ工およびＮａｒＩで完全に消化したｐｔ
　ＰＳ３９　プラスミドＤＮＡｌ０μｙを調製的アガロ
ースゲルに付し、ｔ−ＰＡのＣ−末端をコードする１２
８８ｂｐ　　フラグメントを得る。

ｔ−ＰＡ遺伝子の５′末端は、ｐＷＰ４２　１０μｙ　
をＨｇａ工４単４単位７℃にて８時間消化することによ
り得られる。５１５ｂｐフラグメントを、１％アガロー
スゲル中電気泳動により単離する。ＤＮＡフラグメント
の接着末端をＤＮＡポリメラーゼ１（クレ／ウフラグメ
ント）およびｄＮＴＰでうめ、生成物をＳｍａ工切断ｐ
ＵＣ１３と結紮する。イー・コｌＪＪＭ１０３セルを形
質転換した後、約７５のアンピシリン耐性白色コロニー
を得る。これらのうｔ）２４：＋ｏ＝−を増殖して、ミ
ニプラスミド調製物を得る。該ミニプラスミド調製物を
ＮａｒＩで消化すると、１７クローンかいずれかの順序
で所望の挿入部を有することが判明した。１つのクロー
７　（ｐｃ　ＰＨｇａ　４　）を、アンピシリンを含有
するＬＢ培地１．Ｏｅ中で増殖させ、沸騰法を用いて、
多量のプラスミドＤＮＡを得る。該プラスミドＤ　Ｎ　
Ａ　（ｐｔ　ＰＨｇａ４　）をＢａｍ　ＨＩおよびＮａ
ｒ　工で消化し、１．２％アガロースゲル上で電気泳動
に付して、ｔ−ＰＡのＮ−末端をコードする４３４ｂｐ
ＤＮＡフラグメントを単離する。

１２８８ｈＰ　ＤＮＡ３００ｎ、Ｆおよび４３４ｂｐ　
　ＤＮＡ１００　ｎｐを一夜結紮して１７２２１）ｐ　
　ＤＮＡフラグメントを得る。このＤＮＡを、Ｂａｍ　
Ｈ’ｆ−切断ｐＵＣ１３と結紮した後、イー・コリＪＭ
１０３セルを形質転換するのに用いる。１０００以上の
アンピシリン耐性コロニーを得る。沸騰法により、１２
コロニーからプラスミドＤＮＡを調製する。プラスミド
ＤＮＡを、ＢａｒｎＨ工、ＮａｒＩおよびＸｈｏ　ｆｌ
の各々で切断することにより同定する。得られたプラス
ミドは全て所望の１７２２ｂｐ　ＤＮＡフラグメントを
含有することが判明した。１つのプラスミド（ｐｔＰＢ
ＭＩ）を、大規模なプラスミドＤＮＡ調製に用いる。こ
のプラスミドは、Ｂａｍ　Ｈ工で切断した場合、完全な
ｔ−ＰＡ分子をコードする１７２２ｂｐＤＮＡを生成す
る。ｐｔ　ＰＢＭ　Ｉクローン制限地図およびその調製
法のフローチャートを第３図に示す。

ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ） ｕ−ＰＡクローンのスクリーニングおよび同定前記のｔ
−ＰＡ遺伝子を生成する１０５組換体バクテリアクロー
ンのライブラリーを、グルンシュタインら、プロシーデ
ィングズーオブーナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシズ（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）、７
２．３９６１（１９７５）　　の方法により、放射線標
識した１１３ｍｅｒプローブでスクリーンする。ジーン
・マ’ｉ　−７（Ｇｅｎｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ　）　（ア
プライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ　）　）を用イテ標準的ホスホトリエス
テル法により合成したプローブ１７３〜１７９ から、ウロキナーゼ遺伝子（ａａ）の中間部に対応する
オリゴマー配列５’−ＧＴＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＡＡ
ＣＣＡ−３’が得られる。約１３クローンが、中程度〜
強度のハイブリッド形成シグナルを示した。これらのク
ローンを、テトラサイクリンを含有するＬＢ培地２ｄ中
で増殖させ、ミニプラスミド調製物を得る。該ミニプラ
スミド調製物を１０　ｔｔｌ／ｍＱのＲＮアーゼを含有
するＨ２Ｏ４０μｍ１に溶、か、す。このようにして得
られたＤＮＡ約８μｅをＰｓｔＩｌ単位で消化し、生成
物を１％アガロースゲル上電気泳動により分離する。１
つのクローン（ｐＵＫ５３）は、１．２．０．４および
０，１ｉｃｂ　の長さの３つのフラグメントの形態で１
，７Ｋｂの最大の挿入部を有することが判明した。ウロ
キナーゼの完全な３′−末端ヌクレオチド配列からＰｓ
ｃ　］：切断１．２ｘｂ　　ＤＮＡ７ラグメントを得る
。マキサムおよびギルバート法、メソツズ・イン・エン
ザイモロジ−（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ　
ｍｅｔｈｏｄ、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、　）
、６５．１４９９（１９８０）によるヌクレオチド配列
決定により、遺伝子の５′−末端配列は、ウロキナーゼ
タンパク質のシグナルペプチドコーディング領域のはじ
めの１０アミノ酸に対応する約３０ヌクレオチドが欠失
していることが判明した。従って、欠失したヌクレオチ
ドに対応する二重鎖ＤＮＡ配列を合成し、存在する遺伝
子と結紮する。

ウロキナーゼ遺伝子の編整 ウロキナーゼプラスミド（ＰＵＫ５３）ＤＮＡをＮｅｏ
　ＩおよびＭｓｔｌＩで切断し、生成物を１％アガロー
スゲル上電気泳動により分離する。１１９８ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを電気溶出により単離する。

ＮＣＯ工期断片に対応するＤＮＡフラグメントの突出し
た５′−末端を、ｄＮＴＰおよびイー・コＩＪ　ＤＮＡ
ポリメラーゼ（フレノウ・フラグメント）でうめること
により平滑末端にする。ＤＮＡを次いでＳｍａ工切断ｐ
Ｕｃ１３と結紮し、この修正したプラスミドを用いてコ
ンピテントイー・コリＪＭＩ　Ｏ３セルを形質転換する
。ＤＮＡをｐＵｃ１３のＳｍａｍミニサイト紮すると、
挿入部のＮＣ０Ｉサイトが再生する。該セルをアンピシ
リンおよびＸ−ｇａｌプレートに移し、白色コロニーか
らミニプラスミド調製物を得る。該ミニプラスミドＤＮ
Ａ調製物をＮＣＯ工およびＳａｌ　工で消化して、約１
２００ｂｐ　　のＤＮＡフラグメントを得る。陽性クロ
ーン由来の大規模なプラスミドＤＮＡ調製物（ｐＵＫＮ
Ｍ−３’）を調製し、ＮＣＯ工およびＳａｌ工で消化し
て、多量の約１２００ｂｐ　　のＤＮＡフラグメントを
得、これを調製用アガロースゲル電気泳動により分離す
る。

ウロキナーゼタンパク質の５′シグナルペプチドコーデ
イング領域の最初の１０のアミノ酸に対応する約３０ヌ
クレオチドを得るために、ｐ　Ｕ　Ｋ　５３プラスミド
ＤＮＡをまずＰｓｔ　１で消化して、４００ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを単離する。このＤＮＡを次いで５ｃｒ
ＦＩ　で処理して、ＤＮＡの２４２ｂｐフラグメントを
得る。ＤＮＡの突出した末端を、ｄＮＴＰおよびイー・
コリＤＮＡポリメラーゼ１（フレノウ・フラグメント）
でうめる。

３２および４２塩基の長さの２つの相補オリゴヌクレオ
チド配列をジーン・マシーンで合成し、アミノ酸が欠失
しく−９〜−２０）、かつ適当な翻訳解読フレームを保
持し、Ｓａｌ　Ｉ切断ｐＵｃ１３におけるサブクローニ
ングのためにＤＮＡの両端にＳａｌ　工配列を付与する
。２つのオリゴマーを等モル量のりガーゼ緩衝液（５０
ｍＭトリス・ＨＣｇ、ＰＨ７，６，１０ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ
１２、ｌＱｍＭ　　ジチオトレイトール）中で混合し、
５分間８０℃に加熱し、約１時間室温に冷却する。この
ようにして形成した２つの相補ヌクレオチド配列の二重
鎖（約１μｇ）をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ４００単位を用
いて、リガーゼ緩衝液中４℃にて１６時間２４２ｂｐ　
　ＤＮＡフラグメント約３００ｎｇと結紮する。結紮混
合物を１．２％アガロースゲル上電気泳動により分離し
、電気溶出により約３２０ｂｐ　ＤＮＡ　フラグメント
を単離する。このフラグメント約２０ｎｇ　をＳａｌ工
切断ｐＵｃ１３　１００ｎ、ｐと結紮し、該ベクターを
用いてコンピテントイー・コリＪＭＩＯ３セルを形！転
換する。該セルを、アンピシリンＸ−ｇａｌ　　プレー
トに移す。１２個の白色コロニーを選択し、増殖させて
、ミニプラスミド調製物を得る。該ミニプラスミド調製
物を５ａｌＩで切断する。所望の３２０ｂｐ　ＤＮＡ挿
入部を有するクローンを、大規模なプラスミドＤＮＡ調
製のために増殖させる。

該ＤＮＡをＳａｌ　■およびＮＣ０Ｉで切断して、調製
用アガロースゲル電気泳動に付して、２６０ｂｐＤＮＡ
フラグメントを得る。

２６０ｂｐ　ＤＮＡおよび遺伝子の３３３ｂｐに共通の
ＮＣ０Ｉ制限部位を含有する１２００ｂＰ　ＤＮＡを等
モル量混合して結紮する。結紮生成物を５ａｌＩで切断
し、反応混合物をプレパラティ１１％アガロースゲル電
気泳動で分離する。１４６０ｂｐ　ＤＮＡフラグメント
を電気溶出により単離する。このＤＮＡをＳａｌ　工切
断ｐＵｃ１３と結紮し、このプラスミドを、アンピシリ
ンおよびＸ−ｇａｌ　　プレート上で増殖したコンピテ
ントイー、コｌＪＪＭ１０３の形質転換に用いる。１２
個の白色コロニーを選択し、増殖させてボイリング法に
よりミニプラスミド調製物を得る。このミニプラスミド
調製物をＳａｌ　工で切断し、１つのクロー　７　（ｐ
ＵＫＢＭ　）が所望の１４６０ｂＰ　ＤＮＡ　　インサ
ートを含有していることを見出した。該合成リンカ−を
含有する５′端からのオリゴヌクレオチド配列をマキシ
マ−ギルバート法により配列つけして、その確認を行な
う。

ｐＵＫＢＭプラスミド中のＤＮＡインサートは、これに
より、翻訳開始コドンＡＵＧ　（ｍｅｔ　、　＋Ｊ−ダ
ー配列中、−２Ｑａａ）ならびに終止コドンＴＧＡを含
有することか証明された。この完全遺伝子はシグナルペ
プチドの２０個のアミノ酸（−１〜−２０）および成熟
したウロキナーゼ蛋白の４１１個のアミノ酸をコードす
る。

実施例１ （ＵＫａａ　　−２４８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　−Ａｓｎ−
Ｓｅｒ−Ａｓｐ）’−９’をＰＡ 第１図に示す物質（ａｌにおいて、シグナルペプチド（
ａａ（アミノ酸）−３５〜−１）を含有する（−ＰＡ配
列およびＮ−末端ペプチド（ａａｌ〜９０）域はシグナ
ルペプチド（ａａ−２０〜−１）およびウロキナーゼの
最初の１３１個のアミノ酸を含有するアミノ酸配列で置
換されている。ｕ−ＰＡ配列は、ヘキサペプチド、Ｌ−
２４８−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−２４８
−Ｌ−Ａｓｐ　　をコードするオリゴヌクレオチド配列
を介してｃ−ＰＡの最初のクリングル（【−ＰＫ工）と
連結している。

プラスミドｐＵＫＢＭの約１０μｇを標準的条件下、Ｅ
ｃｏＲｌ：およびＭｓｔＩで消化する。反応混合物を１
．２％アガロースゲルを通し、１５０ボルトで３時間電
気泳動させる。ゲルを臭化エチジウムで染色してＤＮＡ
バンドを可視化した後、４５２ｈＰＤＮＡ　フラグメン
トを単離し、精製する。このＤＮＡフラグメントは、リ
ーダーまたはシグナルペプチド（２０個のアミノ酸）お
よびウロキナーゼ遺伝子のＮ−末端およびクリングル域
（ａａｌ〜１３１）についてのコード情報を含有してい
る。

ｔ−ＰＡ−デスａａｌ〜９１配列を得るため、約１０μ
ｇの組換体プラスミドｐｔＰＢＭ−１をＡｖａ［で消化
して仕上げ、１．２％アガロースゲル上で電気泳動に付
して７４７ｂｐ　ＤＮＡフラグメントを単離する。この
フラグメントにオリゴマーリンカ−を加え、ついで、Ｅ
ｃｏＲｌで消化して、実施例２に記載し、第７図に示し
た３５４ｂｐ　ＤＮＡ　フラグメントを得る。この３５
４ｂｐ　ＤＮＡはへキサペプチドリンカ−およびｔ−Ｐ
Ａペプチド（ａａ９２〜２０４　）の１１８個のアミノ
酸配列をコードする。前記で得られた４５２ｂｐ　ＤＮ
Ａフラグメントとこの３５４ｂｐＤＮＡ　　フラグメン
トの等モル量をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い、１５℃で
１６時間結紮する。反応混合物を１．２％アガロースゲ
ル上で電気泳動により分離し、８０６　ｂｐのサイズに
対応するＤＮＡバンドを溶出させ、精製する。８０６ｂ
ｐ　ＤＮＡフラグメントの約ｔｏｏｎｇを、約２０μｇ
の反応容量中、ＢＡＰ（細菌性アルカリホスファターゼ
）処理ＥｃｏＲＩ　ｐＵｃ１３　（ファルマシア・ピー
・エル・バイオケミカルス・インコーホレーテッド、米
国つィスコンシン州、ミルウオーキー）約３００ｎｇで
結紮する。この溶液の約１／４を、ジエイ・ビエラおよ
びジエイ・メツシング、ジーン（Ｊ。

Ｖｉｅｒａ、　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　）
　１９　、２５９　、　（１９８２）の方法に従い、コ
ンピテントイー・コｌＪＪＭ１０３セルの形質転換に用
いる。１２個の組換体白色コロニーから調製したミニプ
ラスミドＤＮＡを標準条件下、ＥｃｏＲ■で消化する。

必要なインサートを含有する１つのクローン、ｐｔＰＵ
Ｋ−８０６をＢａｍＨｌおよびＮａｒＩで消化し、１．
２％アガロースゲル上の電気泳動により分離する。５１
９ｂｐ　７ラグメントに対応するＤＮＡバンドを切断し
、溶出し、精製する。同じ操作により、ＢａｍＨＩおよ
びＮａｒｌでｐｔＰＢＭ−１を消化して１３００ｂＰＤ
ＮＡフラグメントを得る。５１９ｈｐと１３００ｂｐ　
　のＤＮＡフラグメントの等モル量を、エイチ・エム・
グツドマンおよびアール・ジエイ・マクドナルド、メソ
ッド・オブ・エンザイモロジ−（Ｇｏｏｄｍａｎ。

Ｈ，Ｍ、、　ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　Ｒ，Ｊ、　Ｍｅｔ
ｈｏｄ、Ｅｎｚｙｍｏｌ　）　６８　。

７５、（１９７９）の標準的な方法に従って結紮する。

結紮混合物をフェノール：クロロホルム（１：１）混液
で２回抽出し、２容の無水エタノールでＤＮＡを沈澱さ
せる。ペレットを水５０μａに溶解した後、ＤＮＡを標
準検定条件下、ＢａｍＨｌで消化し、１％アガロース・
ゲル上で電気泳動に付して分離する。１８１９ｂｐ　　
を含有するＤＮＡフラグメントを切断し、ゲルから溶出
させ、精製する。

このＤＮＡフラグメントはシグナルペプチド（２０アミ
ノ酸）および第１図（ａｌに示した（ＵＫａト１３１−
２４８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　−Ａｓｎ−２４８−Ａｓｐ）
”’−ｔ　−ＰＡに対応する５７３個のアミノ酸の成熟
ハイブリッドまたはトリス−クリングル遺伝子について
の必要な全てのコード情報を含んでいる。

ついで、このトリス−クリングル遺伝子を、完全表現ベ
クターとして役立つ、Ｂｇｌ［切断表現ベクター、ウシ
乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）に結紮する。

通常の培養により、第１図（ａｌのトリス−クリングル
プラスミノーゲン活性化因子を得る。

ウロキナーゼクリングル配列の組立 実施例２および３において、ウロキナーゼのクリングル
部分（ａａ５０〜１３１）のみを利用し、ｔ−ＰＡの二
重クリングル域の前または後に挿入する。第６図は組換
体プラスミドｐｕｉｃ５３からａａ５１〜１３１をコー
ドするヌクレオチド配列の組立を示す。アミノ酸１３１
に対応するヌクレオチド鎖の直後に都合よい制限部位Ｍ
ｓｔＩがある。しかし、ａａ５Ｑ付近には何もない。か
くして、ａａ５０付近に制限部位を作る（この例ではＮ
ｄｅＩ）チャートを第６図に示す。ウロキナーゼのクリ
ングル域はｂｐ２８４（ａａ５０）　〜ｂｐ５３０（ａ
ａ１３１）のヌクレオチド配列に対応する。

約１０４のｐＵＫ５３プラスミドＤＮＡを、ウロキナー
ゼ配列におけるｂｐ２０４　　を切断するＳｃａｌで消
化する。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、Ｄ
ＮＡペレットを緩衝液（ｌＱｍＭ　ＣａＣ％、１２ｍＭ
ＭｇＣｅ２．０．２Ｍ　ＮａＣ１，２０ｍＭ１−リスＨ
Ｃｇ　（ｐｉ（８，０）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）　５０
　ｐ（ｌ　　中に溶解する。反応混合物にヌクレアーゼ
Ｂａｌ　３１１μ４（２単位）を加え、混合物を３０℃
で１５秒間インキユヘートする〔レガースキイ、アール
・ジエイ、ジエイ・エル・ホトネット、エイチ・ビイ・
グレイ・ジュニア、ニュークレイツク・アシド・リサー
チ（Ｌｅｇｅｒｓｋｉ、　Ｒ，Ｊ、、　Ｊ、Ｌ、Ｈｏｄ
ｎｅｔｔ、　Ｈ，Ｂ、Ｇｒａｙ。

Ｊｒ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）　５
　、１４５　、１９７８　）。

０．４ＭＥＧＴＡ５μｌを添加して反応を停止させる。

この反応時間は、ＤＮＡフラグメントの各端から約８０
ｂｐ　を除去するのに充分であることが判明した。フエ
／−ル抽出およびエタノール沈澱後、標準的反応条件下
、ＤＮＡをオリゴヌクレオチド・Ｕ　７　ｆｙ　−（１
０ｂＰ　）　ニ結紮スル。配列ＴＧ　Ｇ　ＡＡＴＴＣＣ
Ａを有するオリゴマーリンカ−（Ｅｃｏ　ＲＩ　／Ｎｄ
ｅニリンカー）を、配列ＴＡＴＧ　（ａ　ａ　５１　ニ
対応）を含有するＤＮＡフラグメント端と結紮させてを Ｎｄｅ工部位（ＣＡＴＡＴＧ）作り出ｒ０さらに、ＩＪ
　７△ カー中に制限部位ＥｃｏＲ工を作り、ｐＵｃ１３ベクタ
ー中でクローンする。フェノール抽出、エタノール沈澱
後、ＤＮＡをＥｃｏＲ工で消化し、１％プレパラテイブ
・アガロース・ゲル上で電気泳動によって分離する。３
４０ｂｐに対応するＤＮＡバンドを切断し、溶出し、エ
タノール沈澱を行なう。

このＤＮＡ約４０　’ＶをＥｃｏＲｌ：切断ＰＵＣ１３
ヘクターＤＮＡ約０．４μｇと結紮し、コンピテントイ
ー・コ’ＪＪＭ１０３セルの形質転換に用いる〔マニア
チスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　）前出、２５
０頁〕。

１０平板から約１０００個の組換体コロニーを得る。

細菌コロニーをニトロセルロース紙上でレプリカ−ブレ
ーティングし、放射性オリゴヌクレオチドプローブを用
いる特定部間ハイブリッド形成によリスクリーニングす
る〔グランスタインら、プロシーディンゲス・イン・ナ
ショナル・アカデミ−・サイエンス・オブ・ニー・ニス
・エイ（Ｃｒｒｕｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）７
２．３９６１．１９７５　）。用いたオリゴヌクレオチ
ドプローブは１８　ｈｐ　の長さで（ＴＴＣＣＡＴＡＴ
ＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧ）　、ＥｃｏＲＩ／ＮｄｅＩ　リ
ンカ−がらの最初の５個のヌクレオチドおよびａａ５１
〜５４に対応するウロキナーゼ配列からのつぎの１３個
の塩基を含有する。約１２のクローンがＸ線フィルム上
に中程度〜強いシグナルを示した。これらの１２クロー
ンから調製したミニプラスミドＤＮＡをＮｄｅ工で消化
し、１％アガロースゲル上の電気泳動で分離する。１つ
のクローン、ｐＵＫＫＮｄ１５は新たに生じたＮｄｅ■
部位を含有することが判明した。このプラスミドＤＮＡ
を、Ｎｄｅ工およびＭｓｔ工で消化後、１．４％アガロ
ースゲル上の電気泳動により分離し、２４６　ｂｐのＤ
ＮＡフラグメントを得る。このＤＮＡフラグメントはａ
ａ５１〜１３１をコードするウロキナーゼヌクレオチド
配列を含有する。欠損アミノ酸５０　（Ｃｙｓ）につい
てのＤＮＡ配列を第７図および第８図に示すごとくオリ
ゴマーリンカ−に組み込む。

実施例２ ９１−（ＵＫａａ　　　　−２４８−Ｇｌｕ−Ｃ；１ｙ
−Ａｓｎ　−２４８−Ａｓｐ）−９２−ｔ　−ＰＡ 第１図（ｂｌに示したウロキナーゼクリングル配列をｔ
−ＰＡの二重クリングル領域の前、すなわち、アミノ酸
９１および９２の間に挿入する。前記のごとく、ｐＵＫ
ＫＮｄ１６プラスミドＤＮＡのＮｄｅ工およびＭｓｔ１
消化により、ウロキナーゼのａａ５１〜１３１に対応す
る２　４６　ｂｐ配列を作成する。

ＵＫクリングル配列（２４６ｂｐ）の２つの端を、２つ
のオリゴヌクレオチドリンカーを用い、ヌクレオチドＡ
４６２（ａａ９１）および４６３（ａａ９２）の間でｔ
−ＰＡ遺伝子に挿入する。用いた操作を第７図に示す。

ｐｔＰＢＭ−］プラスミドＤＮＡ約５０μｙをＥｃ。

Ｒ■で消化し、１％アガロースゲル中での電気泳動で７
４０ｂｐ　ＤＮＡ　フラグメントを単離する。こノＤ　
Ｎ　ＡをＳａｕ　９５１　（ＡｓｕＩのインスキシマー
）で部分的に消化し、３８５ｂｐ　ＤＮＡ　フラグメン
トを単離、精製する。

ホスホトリエステラーゼ法〔フレアら、プロシーディン
ゲス・イン・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ニ
ー・ニス・エイ（Ｃｒｅａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　（ＵＳ
Ａ）　）　７５．５７６５　。

１９７８　：ｌにより、ｔ−ＰＡのアミノ酸９１　（Ｔ
ｈｒ）オよびウロキナーゼクリングルのアミノ酸５０（
Ｃｙｓ　）をコードする２つの補助オリゴヌクレオチド
配列を合成する。

Ｔｈｒ　　　Ｃｙｓ ５／−ＧＧＣＣＡＣＣＴＧＣ Ｇ　　ＴＧＧ　　ＡＣＧＡＴ−５Ｉ Ａｓｕ　　　Ｉ　　　　　　　　　　　　　Ｎｄｅ：［
オリゴヌクレオチドリンカーはＡｓｕＩおよびｌ’Ｊｄ
ｅＩ制限部位によりフランキングされる。上流のオリゴ
ヌクレオチド（ＧＧＣＣＡＣＣＴＧＣ）のみがその５′
端でホスホリル化される。

３８５ｂｐ　ＤＮＡフラグメント約１μｙをオリゴマー
リンカ−約１μｇと一夜結紮する。フェノール抽出およ
びエタノール沈澱後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで２時間消化
し、１．２％アガロースゲル上で’Ｆ４気泳動により分
離して３９４ｂｐ　ＤＮＡフラグメントを得る。このＤ
　ＮＡフラグメントはシグナルペプチド（３５ａａ）お
よびｔ−ＰＡのＮ末端ペプチドアミノ酸１〜９１をコー
ドするヌクレオチトパ配列を含有する。さらに、ＤＮＡ
フラグメントはその２４６ｈｐ　　ＤＮＡフラグメント
中には存在しないＵＫクリングルのアミノ酸５０　（Ｃ
ｙｓ）についてのＤＮＡ配列を復元する。

ｔ−ＰＡ配列のＣ−末端、アミノ酸９２以前を得るため
、ｐｔＰＢＭ−１プラスミドＤＮＡ約５０μｙをＡｖａ
［で消化し、１％アガロースゲルから７４７ｂＰＤＮＡ
　フラグメントを単離する。ホスホトリエステル法によ
り、２７ｂＰおよび３０　ｂｐ　の長さの２つの補助Ｄ
ＮＡフラグメントを合成する。

第７図に示すごとく、このＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪンカーはへ
キサペプチド２４８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−２４８
−Ａｓｐをコートし、また、Ａｖａ　’ｆｌ切断７４７
ｂｐ　ＤＮＡ　における欠損アミノ酸９２〜９４　（Ｃ
ｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｇｌｕ　）を復元する。低級オリゴ
マー（３Ｑｍｅｒ）のみがその５′端でホスホリル化さ
れる。７４７ｂｐ　ＤＮＡ約１μｇおよびオリゴマーリ
ンカ−１μＩを一夜１５℃で結紮する。フェノール抽出
およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで２時
間消化して、１．４％アガロースゲルから３５４ｂｐ　
ＤＮＡフラグメントを得る。３つのＤＮＡフラグメント
、３９４ｈｐ、２４５ｂｐ　（ＵＫクリングル）および
３５４ｂｐ各々約５００　ｎ、＠を、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用イー夜結紮する。フェノール抽出およびエタ／−
ル沈澱後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロー
スケルから９９４ｂｐ　ＤＮＡ　フラグメントを単離、
精製する。等モル量のＥｃｏＲＩ切断ｐＵｃ１３ベクタ
ート結紮後、このＤＮＡを用いてコンピテントイー・コ
！ＪＪＭ１０３セルを形質転換する。１２の組換体クロ
ーンからのミニプラスミド調製物ヲＥＣＯＲ工で消化す
る。所望の９９４　ｂｐインサートを含有する１つのク
ローンを１ｅＬＢ培地中で増殖させてプラスミドＤＮＡ
の大規模調製を行なう。このプラスミドＤＮＡ約１０　
ｔＪをＢａｍＨＩおよび’Ｎａｒ工で消化し、７００ｂ
ｐサイズに対応するＤＮＡフラグメントを１％アガロー
スゲルから精製する。

ｐｔＰＢＭ−１プラスミドＤＮＡをＢａｍ　Ｈ■および
Ｎａｒ工約１０　ｐＨで消化してｔ−ＰＡ遺伝子ノ３′
端を得る。反応混合物を１％アガロースゲル上の電気泳
動で分離した後、電気溶出で約１３００ｂｐＤＮＡフラ
グメントを単離し、精製する。

はぼ等モル量の２つのＤＮＡフラグメント、７００ｂｐ
および１３００　ｂｐ　　を−夜結紮し、１％アガロー
スゲルから２０００ｂＰ　ＤＮＡ　　フラグメントを回
収する。制限酵素ＢａｍＨＩ配列でフランキングしたＤ
ＮＡをＲＰＶ表現ベクターのＢｇｌ　ＩＩ部位に挿入す
る。このＤＮＡは合計６５０のアミノ酸（シグナルペプ
チド用の３５個のアミノ酸、成熟蛋白用の６１５個のア
ミノ酸）を含有する蛋白をコードする。通常の培養、回
収、単離および精製技術により第１図（ｂｌのトリス−
クリングルプラスミノーゲン活性化因子を得る。

実施例３ ２６１−（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　−Ａｓｎ−Ｓｅｒ
　−Ａ、ｓｐ　−ＵＫａａ　　　　）−２６２−ｔ−Ｐ
Ａこの実施例においては、ウロキナーゼクリングル配列
をｔ−ＰＡの二重クリングル領域の直後、すなわち、ア
ミノ酸２６１（ＣｙＳ）と２６２（Ｓｅｔ）に対応する
配列の間に挿入する。第８図にはこのトリス−クリング
ルＰＡの製造の種々の工程を説明するフローチャートを
示す。

ｐＷＰ　４２プラスミドＤＮＡ約１０４をＨｇａ　工で
消化し、４００ｂｐ　ＤＮＡフラグメントを１％アガロ
ースゲルから単離する。このＤＮＡフラグメントはｔ−
ＰＡのクリングル域の一部分、すなわち、アミノ酸１３
５〜２６１に対応する配列を含有する。

ｔ−ＰＡの二重クリングル域はアミノ酸９２〜２６１の
範囲にわたり、２つのクリングルを連結するヘキサペプ
チド（アミノ酸１７４〜１７９）を有する。

第８図に示す２つのＤＮＡ配列２４　ｍｅｒおよび２１
ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチドリンカーはホスホト
リエステル法を用いて合成する。このオリゴマーリンカ
−はへキサペプチドリンカ−およびＵＫクリングルの欠
損アミノ酸５０　（Ｃｙｓ）ヲコードし、Ｈｇａ工およ
びＮｄｅ工についての制限酵素配列でフランキングされ
る。上流のオリゴヌクレオチド、２３　ｍｅｒのみがそ
の５′端でホスホリル化し、ｔ−ＰＡからの４００ｂｐ
　ＤＮＡフラグメントノＨｇａＩ端に結紮する。４２１
ｂｐ　ＤＮＡ生成物をプレパラティグ１％アガロースゲ
ルから単離する。

ｔ−ＰＡの後クリングル部はｐＷＰ４２プラスミド１０
μｙをＲｓａ：［で消化し、ついで１．２％アガロース
ゲルから５０１ｂｐ　ＤＮＡを単離する。このＤＮＡは
ｔ−ＰＡ分子のアミノ酸２６９〜４３５を表わす。第８
図に示すように２２塩基の２つの補助オリゴヌクレオチ
ドをホスホトリエステル法により合成する。このＤＮＡ
ＩＪンカーは、その５′端で５０１ｂＰ　ＤＮＡと結紮
すると、欠損アミノ酸２６２〜２６８を復元する。

５０１ｂｐ　ＤＮＡ約１μｙおよびリンカ−ＤＮＡ１μ
ｇを一夜結紮し、５２３ｂｐサイズに対応するＤＮＡバ
ンドを１％アガロースゲルから精製する。

サイズ４２１ｈｐ　、２４６ｂｐ　（ＵＫクリングル）
および５２３ｂｐの３つのＤＮＡフラグメントをほぼ等
モル量で１５℃にて１６時間結紮する。フェノール抽出
およびエタノール沈澱後、ＤＮＡをＥ　ｃｏＲ■で切断
し、７４１ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離する。２つ
のＥｃｏＲＩ制限部位でフランキングされたこのＤＮＡ
を前記のごと＜　ｐＵｃ１３ベクター系中で増幅させる
。

複クローニング部におけるＥｃｏＲＩ部を除去したｐ　
ｔ　Ｐ　ＢＭ−１プラスミドＤＮＡｌ０μｙをＥｃｏ　
Ｒ工で消化し、約４．ＱＫｂの大きい方のベクターＤＮ
Ａフラグメントを１％アガロースゲルから単離する。は
ぼ等モル量のＥｃｏＲ４切断ベクターＤＮＡおよび７４
１ｂｐ　ＤＮＡを結紮し、生成物をコンピテントイー・
コリＪＭ１０３セルの形質転換に用いる。１２個の組換
体クローンから調製したミニプラスミドＤＮＡをＢａｍ
Ｈ工で消化し、約１．８Ｋｂの所望のインサートを探す
。インサートにおける７４１ｂｐ　ＤＮＡの正しい配向
をプラスミドＤＮＡのＮａｒ工およびＭｓｔＩの消化に
よって決定する。１つのクローン、ｐｔＰＵＨＹＣは、
Ｎａｒ　工およびＭｓｔＩで消化した場合、正しい配合
の約７００ｂｐ　のフラグメントを含有していることが
判明した。

ｐｔＰＵＨＹＣプラスミドＤＮＡのＢａｍＨＩ消化によ
り得た１、３ＫｂＤＮＡは、６５０個のアミノ酸のペプ
チド（シグナルペプチド用の３５個のアミノ酸および第
１図ＦＣ＋の生成物に対応する成熟蛋白についての６１
５個のアミノ酸）をコードするヌクレオチド配列を含有
する。

ついで、このトリス−クリングル遺伝子を、完全表現ベ
クターとして役立つＢｇｌ　ｆｌ切断ウシ乳頭腫ウィル
ス（ＢＰＶ）に結紮する。通常の培養により、第１図＋
ＣＩのトリス−クリングルプラスミノーゲン活性化因子
を得る。

テトラ−クリングルプラスミノーゲン活性化因子 プロトロンビンＣＤＮＡ プロトロンビン遺伝子用のＣＤＮＡクローンを、フリー
ツナ−ら、バイオケミストリー（Ｆｒ１ｅｚｎｅｒｅｔ
　ａｔｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　２２．２０８
７．１９８３　の方法に従ってヒト肝臓ＣＤＮＡライブ
ラリーから単離する。このクローン、ｐＰＴＲは５７９
個のアミノ酸の成熟蛋白についての完全コード情報を含
有しテイル。プロトロンビンの二重クリングル領域はア
ミノ酸６　ｓ　（ｈｐ：ｎｃ＋）からアミノ酸２４８（
ｈｐ８４０）に延長する１８４個のアミノ酸のペプチド
である。２つのクリングルＰ’ｒＫ１（アミノ酸６５〜
１４３）およびＰＴＫ２　（アミノ酸１７０〜２４８）
の各々は７９個のアミノ酸の長さであり、２６個のアミ
ノ酸の長さのペプチド（アミノ酸１４４〜１６９）で連
結されている。

プロトロンビン二重クリングル配列の調製二重クリング
ル領域を表わすＤＮＡ配列を２工程でプロトロンビンＣ
ＤＮＡから単離する（第１２図）。

第１工程において、ｐＰＴＲプラスミドＤ　Ｎ　ＡＩＯ
μｙをＡｖａ工で消化し、１％アガロースゲルから７６
０ｂＰ　　ＤＮＡを単離する。このＤＮＡをＢａ１３１
で７．５秒間処理してＤＮＡの一端から約３８ｂｐを除
去する〔レガスキーら、ニュークレイツク・アシッド・
リサーチ（Ｌｅｇｅｒｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　）　５　、１４５　、１
９７８）。フェノール抽出およびエタノール沈澱後、Ｄ
ＮＡをＥｃｏＲＩリンカ−１ＧＧＡＡＴＴＣＣに４℃で
１５時間結紮する。

このリンカ−は、ＣＴＧＡＧ　　またはＴＧＡＧ（アミ
ノ酸６７、Ｇｌｕ）配列で終るＤＮＡと結紮し、二重ク
リングルのＮ−末端（アミノ酸６７）において、Ｍｓｔ
ｌＩに対する新しい制限配列（ＣＣＴＧＡＧＧ）を生じ
る。ＥｃｏＲＩで切断後、６３０　ｈｐサイズのＤＮＡ
フラグメントを単離する。このＤＮＡは、等モル量でＥ
ｃｏＲＩ／ｐＵｃ１３と結紮後、コンビテントイー・コ
ｌＪＪＭ１０３セルの形質転換に用いる。

所望のクローンについての最初のスクリーニングを、ア
ミノ酸６ｄ〜６８に対するー　ヌクレオチド配列を含有
する３２Ｐラベルプローブ、ＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＧ
ＧＴＣＴＧを用い特定部間ハイブリッド形成により行な
う。Ｘ線フィルム上に強いシグナルを示す１２個のクロ
ーンをミニプラスミド調製用に増殖させる。Ｍｓｔｌ）
およびＢａｍＨＩでプラスミドＤ　Ｎ　Ａを消化後、１
つのクローン、ｐＰＴＫ−５’が約６３０ｂｐの所望の
インサートと、３２２ｂｐのところに新たに作成された
Ｍｓｔ：［部位を有することか判明した。

第２の工程は前記と同様にして、およそアミノ酸２４８
のクリングル領域の３′末端を編整することを包含する
。ｐＰＴＫ−５’プラスミドＤＮＡ約１０μｙをＢａｍ
ＨＩで完全に消化する。ついで、ＤＮＡをＢａｌで３０
℃にて１５秒間処理し、ＤＮＡの両端から約８２　ｈｐ
　を除去する。フェノール抽出およびエタノール沈澱後
、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＦＳｐＩリンカ−１ＣＧＣＡＧ
ＡＡＴＴＣＴＧＣＧに結紮する。このリンカ−はその名
のとおり、ＴＧ−で終るいずれのＤＮＡ配列においても
Ｆｓｐ工配列配列ＧＣＧＣＡ）を生じる。ＥｃｏＲＩで
完全に切断後、１．２％アガロースゲルから５４６ｂｐ
　ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＵｃ１３に結紮す
る。この組換体プラスミドをコンピテントイー・コリＪ
ＭＩＯ３セルの形質転換に用いる。約１０００の組換体
クローンを、配列ＣＴＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＡＧＡ
Ａ　（アミノ酸２４５〜２４８）を有する３２Ｐラベル
オリゴマーを用いる特定部間ハイブリッド形成でスクリ
ーニングする。１２個の有力なりローンから調製したプ
ラスミドＤＮＡをＭｓｔｌおよびＦｓｐ　工で切断し、
１％アガロースゲル上で泳動させる。１つのクローン、
ＰＰＴ２には所望の５４６ｂｐサイズのインサートを含
有していることが判明した。このＤＮＡは二重クリング
ル域の合計１８２のアミノ酸、アミノ酸６７〜２４８を
コードする。６５位（Ｃｙｓ）および６６位（Ａｌａ）
の残りの２つのアミノ酸についてのヌクレオチド配列は
第１３図に示すようなオリゴマーリンカ−を介して加え
る。

実施例４ ｇｌ　（ＰＴＫａａ　　　　−２４８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｓｎ　−２４８−Ａｓｐ）　−９２−ｔ　−ＰＡプ
ロトロンビンの二重クリングル配列、アミノ酸６５〜２
４８をｔ−ＰＡの二重クリングル域の前（すなわち、ア
ミノ酸９１と９２の間）に挿入し、テトラクリングル−
ＰＡを得る。前記のごとく、Ｍｓｔ［モＦｓｐｌ：また
はＥｃｏＲ：［によるＰＰＴ２にプラスミドＤ　Ｎ　Ａ
の消化はプロトロンビンの６７〜２４８のアミノ酸をコ
ードする５４６ｂＰ　　ＤＮＡフラグメントを与える。

２つのオリゴヌクレオチドの使用により、５４６ｂｐ　
ＤＮＡの２つの端をヌクレオチド４６２（アミノ酸９１
）および４６３（アミノ酸９２）の間でｔ−ＰＡ遺伝子
中に挿入する。

第１３図にフローチャートを示す。

ペプチドリンカ−２４８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−２
４８−Ａｓｐおよびｔ−ＰＡのアミノ酸９２〜２０４用
のヌクレオチド配列を含有する３５４ｂｐ　ＤＮＡを実
施例２および第７図に示すごとくして調製する。

等モル量の３５４ｂｐ　　ＤＮＡおよび５４６ｂｐ　　
ＤＮＡ（プロトロンビンクリングル）を４℃で１６時間
結紮する。このＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロー
スゲルから９００ｂｐ　ＤＮＡフラグメントを単離する
。ＥＣＯＲ工切断ｐＵＫ１３ベクターに結紮後、このＤ
ＮＡをイー・コｌＪＪＭ１０３セルの形質転換に用いる
。１２個の組換体クローンから得られたミニプラスミド
調製物をＥＣＯλＩおよびＭｓｔｌＪで消化する。１つ
のクローン、ＰＰＴ２ＫＴＰＫは所望の９００ｂｐのイ
ンサートを含有することが判明した。このＤＮＡは合計
３００のアミノ酸（プロトロンビンに対応する１８２ア
ミノ酸（アミノ酸６７−２４８）、ヘキサペプチド配列
およびｔ−ＰＡの１１２アミノ酸（アミノ酸９２−２０
４））をコードする。

ｐｔＰＢＭ−１プラスミドをＥｃｏＲ工およびＡｓｕ　
ｌで消化して得られる３８５ｂｐ　　ＤＮＡの調製を第
７図に記載する。各々１２　ｂｐの２つの補助オリゴヌ
クレオチド配列をホスホトリエステル法で合成する。こ
のリンカ−はプロトロンビンクリングル域の欠損アミノ
酸、ＣｙｓおよびＡｌａを復元し、Ａｓｕ工およびＭｓ
ｔ［認識配列によってフランキングされる。ＤＮＡ（３
８５ｂｐ）約ｓ　ｏ　ｏ　ｎｇを第１３図に示すように
ホスホリル化リンカ−１μｇと結紮する。ＥｃｏＲｌで
切断後、４０２ｂｐ　ＤＮＡフラグメントを単離する。

はぼ等モル量の４０２ｂｐＤＮＡおよび９００ｂｐ　Ｄ
ＮＡを結紮し、Ｅｃｏ　Ｒ工で切断し、１３’０２ｂｐ
ＤＮＡ　フラグメントを１％アガロースゲルで単離する
。このＤＮＡをＥｃｏＲ工切断ＰＵＣ１３ベクター中で
サブクローンする。１２個の組換体クローンから単離し
たプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲ工で消化する。１つのク
ローン、所望のインサートを含有するｐＮＰＴ２ＫＰＡ
ＫをプラスミドＤＮＡの大規模調製用に増殖させる。こ
のグラスミｔ’Ｉ）ＮＡをＢａｍＨ：［で完全に、つい
で、Ｎａｒｌで部分的に消化し、９８６ｂｐ　ＤＮＡフ
ラグメントを得る。同様に、ｐｔＰＢＭ−１をＢａｍＨ
ＩおよびＮａｒ：［で消化して１３００ｂｐ　ＤＮＡ　
フラグメントを得る。２つのフラグメント、９８６ｂｐ
　　および１３００ｂｐ　　を等モル量で結紮し、Ｂａ
ｍＨＩで切断し、２２８６ｂｐ　ＤＮＡフラグメントを
１％アガロースゲル電気泳動で単離する。Ｂａｍ　Ｈ工
配列でフランキングされたＤＮＡをＢＰＶ表現ベクター
のＢｇｌ　■部位に挿入する。このＤＮＡは合計７５２
のアミノ酸（シグナルペプチドの３５アミノ酸および成
熟蛋白の７１７アミノ酸）をコードする。

成熟蛋白は概算分子量約９２ＱＯＯで、プロトロンビン
二重クリングル領域からの１８４アミノ酸、ヘキサペプ
チドリンカ−および５２７アミノ酸の完全ｔ−ＰＡ配列
を含有する。

ハイブリッド・プラスミノーゲン活性化因子の発現およ
び生化学的特徴 第１図（ａ）および第１図（ｂｌに示す２つのハイブリ
ッド・プラスミノーゲン活性化因子（ｈ−ＰＡ）　を調
製しＢＰＶ−１ベ一ス表現ベクター系に発現させる。こ
れらのｈ−ＰＡを、各々、本明細書を通してハイブリッ
ドＡおよびハイブリッドＢと称する。

ハイブリッドＡ（１，８Ｋｂ、第５図）およびハイブリ
ッドＢ（２，ｏｘｂ、　　第７図）にツいて、ＢａｍＨ
ｌでフランキングした完全遺伝子配列をＢｇｌ　［切断
プラスミドｐ３４１−３　に挿入する（詳細は方法およ
び材料参照）。１２個の組換体クローンからミニプラス
ミド調製物を調製し、Ｎａｒｌ、Ｂｇｌ　■またはＢａ
ｍＨＩおよびＡｖａ　ｌ：で消化する。これをハイブリ
ッド遺伝子の存在の確認、インサートの配向の決定に用
いる。遺伝子のただ１つの配向、すなわち、メタロチオ
ネイン・プロモーターの配列方向は、該プロモータの制
御下、遺伝子の発現を行なうので望ましい。さらに、遺
伝子の直後に位置する５Ｖ４ＱボＩＪ−Ａ配列は、その
３′末端におけるポリアゾニレ−ジョンによる遺伝子の
ＲＮＡ転写を加工し、遺伝子の翻訳を効率よくする。２
つの組換体クローンｐＨｙｂＡＭＴ−４３（ハイブリッ
ドＡ）およびｐＨｙｂ　Ｂ　ＭＴ　−５０（ハイブリッ
ドＢ）を得る。

前記のクローンから得られたプラスミドＤＮＡ約１μｙ
をＢａｍＨｌで消化し、細菌性アルカリホスファターゼ
で脱ホスホリル化する。これに完全８、ＯＫｂ　Ｂａｍ
Ｈｌ：切断ＢＰＶ−１ゲノムを挿入する。各々、ハイブ
リッドＡおよびハイブリッドＢをコードする遺伝子を含
有する２つの発現プラスミドｐＨｙｈ−ＡＭＴＢＰＶ−
４３８およびｐＨｙｂ　−ＢＭＴＢＰＶ−５０４（以下
、Ｐ２Ｓ５およびＰ２Ｏ３と略す）を得る。発現プラス
ミドの種々の成分の相対位置を示す完全地図を第１４図
に示す。

ｔ−ＰＡ／ウロキナーゼ分子をコードする遺伝子を含有
する２つの表現プラスミドをリン酸カルシウム沈澱法〔
グラハムら、パイロロジイ−（Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　）　５２．４５６（１９７
３）　〕ニ上ヨリマウスＣ１２フセにトランスフェクシ
ョンした。形態学的に形質転換したセルのフォーカスを
二次培養し、遺伝子発現についてスクリーニングする。

培地中におけるフィブリン溶解活性についての最初のス
クリーニングは第１５図（ａ）に示すようにフィブリン
寒天平板上で行なった〔プラウグら、バイオシミ力・バ
イオフイジカ・カクタ（Ｐｌｏｕｇ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　）　
２４　。

２７８（１９５７））　　。各トランスフェクションか
ら、ｐ５０４（ハイブリッドＢ）で形質転換したフォー
カスの平均５０％およびｐ４３８　（ハイブリッドＡ）
で形質転換したフォーカスの５％が培地中で陽性のフィ
ブリン溶解活性を示した。いくつかの高生産株を選択し
、個々のフォーカスからセル・ラインを展開させた。遺
伝子産生の予備的生化学的および免疫学的特徴づけの大
部分を行なった２つのセル・ラインをハイブリッドＢに
ついてクローン５Ａ５、ハイブリッドＡについてクロー
ン１６Ｃ１と表示する。

生化学的特徴づけ ハイブリッド分子の酵素活性を、フィブリン寒天検定お
よび合成基質Ｓ−２４４４およびＳ−２２５１を用いる
アミド分解活性検定〔シモダら、トロンボシス・アンド
・ヘモスタシス（Ｓｈｉｍｏｄａ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　）　４６　、
５０７　（１９８１）　３により評価した。約１〜５単
位／μβの活性酵素が１６〜１８時間で培地中に分泌さ
れた。シグナル配列を切断し、成熟蛋白となった後、天
然のｔ　−ＰＡおよびウロキナーゼが前駆体として合成
され、細胞から分泌される。さらに、ｔ−ＰＡおよびウ
ロキナーゼの両方ともグリコジル化される。トランスフ
ェクションしたマウス細胞からｈ−ＰＡ、が分泌されて
いるか否かの判断は天然ｔ−ＰＡおよびウロキナーゼと
同様に行なわれ、ハイブリッド分子をＳＯ５／ポリアク
リルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動、ついで、フィブ
リン寒天重層〔グラネリーピペルＺら、ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンタル・メデイシ７　（Ｇｒａｎｅｌ
ｌｉ　−Ｐｉｐｅｒｎｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）１４８，２２３（１９７８））
により行なった。第１５図（ｂｌに示すように、ハイブ
リッドＢ含有培地からの活性酵素は７６０００の分子量
を有し、ハイブリッドＡでは７１０００である。これら
は挿入遺伝子から計算した分子量とよく一致した。

ｔ−ＰＡ精製に用いたと同様な方法で収穫培地からハイ
ブリッドＢを精製した。アミノ酸配列分析はハイブリッ
ドＢのＮ−末端が正しく加工され、成熟ｔ−ＰＡのＮ−
末端域と同じ配列、２４８−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−を有する
ことを示し、さらに、活性化開裂部位、Ａｒｇ−Ｉｌｅ
におけるアミノ酸に対応するＮ−末端配列、Ｉ　１ｅ−
Ｌｙｓ　−Ｇｌ　ｙ−が存在した。収穫培地から精製し
たハイブリッドＢは主として、活性化二本鎖型で存在す
ると結論された。

収穫培地へのプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン）の添
加により、一本鎖ｈ−ＰＡ分子が得られる。

３５Ｓ−ラベル収穫培地の免疫沈降、ついで、ＳＯ５／
Ｉ’ＡＧＥ　は、非還元条件下、見かけ分子量７１００
０〜７６０００に対応する位置に、各々、セル・ライン
５Ａ５（ハイブリッドＢ）および１６Ｃ１（ハイブリッ
ドＡ）からの試料にはバンドが見られるが、対照試料に
は見られないことを示した。

５Ａ５セルの培養培地のフィブリン溶解活性および精製
ｔ−ＰＡ（アスリカン・ダイアグノスティックス・イン
コーホレーテッド、グリニッチ、ＣＴ）は抗ｔ−ＰＡ抗
血清で中和されるが、抗ウロキナーゼ抗血清では中和さ
れず、ハイブリッドＢはｔ−ＰＡに加えてウロキナーゼ
クリングルを含有するが、ハイブリッドＢのプロテアー
ゼ領域は抗−ｔ−ＰＡで認識され、中和されることを示
唆している。抗ウロキナーゼ抗体はハイブリッド分子の
ウロキナーゼクリングル部に結合しつるが、この結合は
あるとしても、該ハイブリッド分子のＣ−末端における
プロテアーゼ領域により与えられる蛋白分解活性を干渉
しない。

本発明のポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子は
ｔ−ＰＡ自体と同じ方法で、同じ送達賦形剤により、哺
乳類における血管障害の治療に用いられる。かくして、
本発明のポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子は
、該ポリペプチドをｔ　−ＰＡへの適用で公知の医薬上
許容される適当な賦形剤に溶解または分散させることに
より、医薬組成物に処方できる。投与の必要な哺乳類へ
の静脈内注射または注入による投与は、ｔ−ＰＡ自体で
すでに確立された方法に従って行なわれる。

ｔ−ＰＡを用いる場合、４４０１Ｕ／ｋＱ　体重の静脈
内第１回投与が一般的であり、ついで、約４４０ＩＵ／
ｋｑ時間の連続注入を約６〜１２時間行なうのが通常の
グラクテイスである。

・　　　　　　１　　　　、−３七剖４→→→＋なお、
不発明における組換体プラスミド物質全含有するつぎの
イー・コリ３株をブダペスト条約の下、１９８６年８月
５日にアメリカン・タイプ・力μチャー・コレクション
に寄託した。

（１）第１図（ａ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含有するＡＴＣＣ６７１７５−ｐ４３８／イー・コリ
ＭＭ２９４ （２）第１図（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含有するＡ’ｒｃｃ５７１７４−Ｐ５０４／イー・コ
リＭＭ２９４ （３）第１図（Ｃ）のポリペプチド全コードするＤＮＡ
全含有するＡＴＣＣ６７１７６−Ｐ１１３／イー・コリ
ＭＭ２９４ イー・コリＭＭ２９４株はＡＴＣＣ３３６２５として入
手可能なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のポリタリングルプラスミノーゲン活性
化因子の代表例の配列図、第２図はクローンｐＷＰ　−
４２の制限地図、第３図はプラスミドｐｔＰＢＭ１産生
のフローチャート、第４図はプラスミドｐＵＫＢＭ産生
のフローチャート、第５図は第１図（ａ）のトリス−ク
リングルをコードする遺伝子産生のフローチャート、第
６図はウロキナーゼのアミノ酸をコードする遺伝子産生
のフローチャート、第７図は第１図（ｂ）のトリス−ク
リングルをコードする遺伝子産生のフローチャート、第
８図は第１図（Ｃ）のトリス−クリングルをコードする
遺伝子産生のフローチャート、第９図および第９ａ図は
第１図（ａ）の生成物をコードする遺伝子のＤＮＡ配列
図、第１０図および第１０ａ図は第１図（ｂ）の生成物
をコードする遺伝子のＤＮＡ配列図、第１１図および第
１１ａ図は第１図（ｃ＋の生成物をコードする遺伝子の
ＤＮＡ配列図である。第１２図はプロトロンビンのダブ
ルクリングル域をコードする遺伝子産生のフローチャー
ト、第１３図は第１図（ｄｌの生成物をコードする遺伝
子産生のフローチャート、第１４１およびｂ図は、各々
、ハイブリッドＡおよびＢの制限地図である。第１５ａ
図はフィブリン寒天平板上でスクリーニングにおける生
物の形態を示す図面代用写真、第１５ｂ図はハイブリッ
ドＡおよびＢのザイモグラム、第１５Ｃ図はハイブリッ
ドＡおよびＢのオートラジオグラムである。 代理人弁理士青　山　葆ほか２名 Ｏ≦ （ノ　（り ｉ く く −一一 （コ　　）句 ＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣ
ＣＴＧＧＴＧＣｙｓＧｌｎＧｌｙＡｓｐｓｅｒＧｌｙＧ
ｌｙＰｒｏＬｅｕＶａ１区 １ｐ ＴＧＴＣ’「ＧＡＡＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣΔＴＧＡＣ’
ｒＴＴＧＧＴＣｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＧｌｙＡｒｇλ
ＩｅＬＴｈｒＬｅｕＶａ１９１　　　　　１９０１　　
　　　１９１＋ＡＧＡ八ＧＧＡ’「ＧＴＣＣＣＧＧＧ’
ｌ”Ｇｌ’ＧＴＡＣＡＣΔΔＡＩｎ［、ｙｓＡｓｐｖａ
ｌＰｒｏＧｌｙＶａｌＴｙｒＴ１１ｒＬｙｓＡＣＡＴＧ
ＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＧＧΔＡＣＡＣＣＣＧＡＳＩ
ＴλｌｃＬＡｒｇＰｒｏＴｒＲ °、１０ａ（つづき］ −Ｉ：ＩＩ：。 ・、２　・、゛す′・＊　＋ｙ＋１　（＋ｊ＜・く・　
　　、ミ　Ｉ”Ｊ’　Ｅ〜）Ｆ／ｇ、１５σ −・、 ４６に 忙−３ＯＫ 一°１８、 手続補正書（方式〕 特許庁長官殿　　　昭和６１年１１月２７日１、　事件
の表示 ２　発明の名称 ボリタリングルプラスミノーゲン活性化因子３、　　？
ｉｌｉ正をする者 事件との関係　特許出願人 ４代理人

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）複数の、非相同のポリペプチドクリングルを含有
   するハイブリッド・プラスミノーゲン活性化因子。
2. （２）２〜６個のクリングルを有する前記第（１）項の
   プラスミノーゲン活性化因子。
3. （３）テトラクリングルプラスミノーゲン活性化因子で
   ある前記第（１）項のプラスミノーゲン活性化因子。
4. （４）式：９１−（ＰＴＫａａ＾６＾５＾−＾２＾４＾
   ８−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
   ）−９２−ｔ−ＰＡで示される前記第（３）項のプラス
   ミノーゲン活性化因子。
5. （５）トリスクリングルプラスミノーゲン活性化因子で
   ある前記第（１）項のプラスミノーゲン活性化因子。
6. （６）式：（ＵＫａａ＾１＾−＾１＾３＾１−クリング
   ルリンカー）＾１＾−＾９＾１ｔ−ＰＡで示され、該ク
   リングルリンカーが６〜１０個の天然アミノ酸を含有す
   るポリペプチド部分である前記第（５）項のプラスミノ
   ーゲン活性化因子。
7. （７）該クリングルリンカーがＬ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｇｌｕ
   −Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ａｓｐである
   前記第（６）項のプラスミノーゲン活性化因子。
8. （８）式：９１−（ＵＫａａ＾５＾０＾−＾１＾３＾１
   −クリングルリンカー）−９２　ｔ−ＰＡで示され、該
   クリングルリンカーが６〜１０個の天然アミノ酸を含有
   するポリペプチド部分である前記第（５）項のプラスミ
   ノーゲン活性化因子。
9. （９）該クリングルリンカーがＬ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｇｌｕ
   −Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ａｓｐである
   前記第（８）項のプラスミノーゲン活性化因子。
10. （１０）式：２６１−（クリングルリンカー−ＵＫａａ
    ＾５＾０＾−＾１＾３＾１）−２６２−ｔ−ＰＡで示さ
    れ、該クリングルリンカーが６〜２０個の天然アミノ酸
    を含有するポリペプチド部分である前記第（５）項のプ
    ラスミノーゲン活性化因子。
11. （１１）該クリングルリンカーがＬ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｇｌ
    ｕ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ａｓｐであ
    る前記第（１０）項のプラスミノーゲン活性化因子。
12. （１２）前記第（１）〜（１１）項いずれか１つのポリ
    ペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
    ユニット。
13. （１３）前記第（１）〜（１１）項いずれか１つのポリ
    ペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
    ユニットを含有する複製可能な発現ベクター。
14. （１４）ウロキナーゼのアミノ酸１〜１３１に対応する
    蛋白をコードするヌクレオチドからなるＤＮＡユニット
    。
15. （１５）前記第（１４）項のＤＮＡユニットを含有する
    クローニングベクター。
16. （１６）ウロキナーゼのアミノ酸５１〜１３１に対応す
    る蛋白をコードするヌクレオチドからなるＤＮＡユニッ
    ト。
17. （１７）前記第（１６）項のＤＮＡユニットを含有する
    クローニングベクター。
18. （１８）ｔ−ＰＡのアミノ酸１〜２６１に対応するポリ
    ペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
    ユニット。
19. （１９）前記第（１８）項のＤＮＡユニットを含有する
    クローニングベクター。
20. （２０）ｔ−ＰＡのアミノ酸９２〜５２７に対応するポ
    リペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮ
    Ａユニット。
21. （２１）前記第（２０）項のＤＮＡユニットを含有する
    クローニングベクター。
22. （２２）プロトロンビンのアミノ酸６５〜２４８に対応
    するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有す
    るＤＮＡユニット。
23. （２３）前記第（２２）項のＤＮＡユニットを含有する
    クローニングベクター。
24. （２４）プラスミノーゲンを前記第（１）項のポリペプ
    チドと接触させることを特徴とするプラスミノーゲンを
    プラスミンに変換する方法。
25. （２５）有効量の前記第（１）項のポリペプチドを哺乳
    類の血管系に投与することからなる哺乳類における凝血
    の崩壊法。