JPS63133988A - 変形された組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般にフィブリン溶解因子に関し、さらに詳
しくは、変形された組織プラスミノーゲンアクチベータ
−（活性化因子）に関する。

〔従来の技術〕

血液凝固は、究極的にフィブリンの網状構造すなわち凝
塊を生ずる種々の血液成分の複雑な相互作用から成るプ
ロセスである。フィブリンの網状構造の分解は、酵素前
駆体プラスミノーゲンのプラスミン、すなわち、フィブ
リン網状構造を直接分解する作用をするセリンプロテア
ーゼ、への活性化によって達成することができる。プラ
スミノーゲンのプラスミンへの転化は、組織プラスミノ
ゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、すなわち、フィブリ
ン特異的セリンプロテアーゼによって触媒することがで
きる。

ｔ−ＰＡはプラスミノーゲンの生理学的脈管活性化因子
であると信じられ、そして通常単一のボリペプチド鎖（
分子１７２，０００）として循環する。

ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ　
−Ｐ　Ａ）は、セリンプロテアーゼとして特徴づけられ
るプラスミノーゲンアクチベーターの部類の他の構成員
である。ｕ−ＰＡはｔ−ＰＡと機能的にかつ免疫学的に
区別することができる。

フィブリンの存在下に、ｔ−ＰＡはこの分子の中央領域
中の一ケ所の部位での裂開によって活性化される。ｔ−
ＰＡの重鎖（分子１１４０．０００および３７．０００
の２つの型）はｔ−ＰＡ分子のアミノ末端に由来し、こ
れに対して軽鎖（分子量３３，０００）はカルボキシ末
端に由来する。

潜在的前駆体ｔ−ＰＡタンパク質の二次元のモデルが確
立された（Ｎｙ等、ハ旦　旦：５３５５−５３５９．１
９８４）。このモデルから、重鎮は「クリングル（ｋｒ
ｉｎｇｌｅ）　Ｊとして知られる２つの三重ジスルフィ
ド構造を含有することが決定された。これらのクリング
ル構造は、また、プロトロンビン、プラスミノーゲンお
よびウロキナーゼ中にも存在し、そしてフィブリンへの
結合のために重要であると信じられるＣＮｙ　ら、同上
〕。ｔ−ＰＡの第２クリングル（Ｋ２）は第１クリング
ル（Ｋ、）よりもフィブリンに対して高い親和性をもつ
と信じられる（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ、ＴａｋｉｏおよびＦ
ｕｊｋａｗａ　、個人的通信〕。

ｔ−ＰＡの重鎖は、また、フィブロネクチンのフィンガ
ー領域（ｆｉｎｇｅｒ　ｄｏｍａｉｎ）と相同である「
フィンガー」領域を含有する。フィブリノネクチンはフ
ィブリンの結合を包含する種々の生物学的活動に関係づ
けられてきており、そしてこのような生物学的活動はフ
ィブリノネクチンがもつ９つのフィンガー領域のうち４
つまたは５つに関係づけられた。ｔ−ＰＡの重鎮は、ま
た、生長因子様領域を含有する。

ｔ−ＰＡの軽鎖はセリンプロテアーゼ活性のための活性
部位を含有し、この活性部位は他のセリプロテアーゼの
活性部位と高度に相同である。

天然ｔ−ＰＡはプレ区域（ｐｒｅ−ｒｅｇｉｏｎ）およ
びそれより下流のプロ区域（ｐｒｏ−ｒｅｇｉｏｎ）を
さらに含み、これらの区域をまともて「プレープロ（ｐ
ｒｅ−ｐｒｏ）　Ｊ区域と呼ぶ、プレ配列は、血管の内
皮細胞によるｔ−ＰＡの分泌にとって重要であるシグナ
ルペプチドを含有するＣＮｙら、同上〕。プレ配列は、
細胞外分泌における必須の過程である、小胞体のルーメ
ン中へのｔ−ＰＡの分泌の原因となると信じられる。プ
ロ配列は、小胞体からゴルジ装置へ移送された後、ｔ−
ＰＡ分子から切離されると信じられる。

ｔ−ＰＡの生物学的活性はフィブリンの存在で実質的に
増大される（Ｓｈｅｒｒｙ、、ニュー・イングランド・
ジャーナル・オフ・メディシン（欺ＬｈＬＪ、Ｍｅｄ、
）　３１３　　：　１０１４　１０１７．１９８５）　
、特異性に劣るプラスミノゲンアクチベーターであるス
トレプトキナーゼおよびウロキーゼと異なり、ｔ−ＰＡ
は凝塊の部位を除外して比較的わずかのプロテアーゼ活
性をもつ。プラスミノゲンおよびｔ−ＰＡはフィブリン
の凝塊に最初に結合し、その結果プラスミノゲンのプラ
スミンへの酵素的分解は立体的に促進されると理論づけ
られる。

動物およびヒトにおけるフィブリン溶解のためのｔ−Ｐ
Ａの使用は、天然分子のいくつかの欠点が際立っている
。生体内でのｔ−ＰＡの半減期はヒトにおいて３分程度
に短いことが示された〔ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）ら
、スカンジ　ビアン・ジャーナル・オフ・ヘモトロジー
（Ｓｃａｎｄ、Ｊ、Ｈａｅｍｏｔｏｌ、）別、４９−５
３．１９８４）。注射されたｔ−ＰＡは肝臓によって急
速に浄化され、そして注射された物質の大部分は３０分
以内に低分子量の形態に代謝される。この短い半減期は
、高い投与量および延長された注入を必要とすることに
よって、血栓溶解剤としてのｔ−ＰＡの有効性を制限す
ることがある。Ｆｕｃｈｓ　らＢｌｏｏｄ　　６５：　
　５３９−５４４．１９８５）は、注入されたｔ−ＰＡ
がタンパク質加水分解部位とは独立のプロセスにおいて
肝臓によって開裂され、そして注入されたｔ−ＰＡは体
の中に蓄積されないであろうことを結論した。さらに、
冠動脈の血栓を溶解するために十分なｔ−ＰＡの投与量
は、正常の生理学的レベルよりも非常に多く、そしてフ
ィブノゲンの全身的分解を導び＜　　（Ｓｈｅｒｒｙ、
同上〕。

従って、臨床的応用のため、天然ｔ−ＰＡに比較して、
増大したフィブリン結合能力、増加した生物学的半減期
または増加した溶解度を有するフィブリン溶解剤を使用
することは有利であろう。

このような溶解剤はフィブリン溶解において活性な役割
を演するこのできない構造的および機能的特徴をもない
ことが好まい。例えば、表皮生長因子（ＥＧＦ）ｐＩ域
を含有しないフィブリン溶解分子を生成することが望ま
しいであろう。なぜなら、Ｅ　Ｇ　Ｆ　領域はフィブリ
ン溶解活性に不必要であることが発見されたからである
。生長因子領域のすべてまたは一部分の欠失は、その領
域の疎水性のため、その分子の溶解度を増加することも
ある。

溶解度の増加は、より少ない（注射可能な）量のｔ−Ｐ
Ａの使用を可能とし、そして患者へのより速い投与を可
能とする。活性化部位はｔ−ＰＡの生理学的クリアラン
スに参加しないので、余分なドメインの除去は、また、
得られる変形されたｔ−ＰＡ分子の生体内の半減期を、
それを不活性化しないで、増加することができる。また
、特異的活性を増加し、これによってより少ない投与量
を用いることができる。さらに、ｔ−、ＰＡのフィブリ
ン結合の増大は追加のクリングル構造および／またはフ
ィンガー領域の付加によって達成することができる。さ
らに、より小さい分子は組換え細胞によっていっそう容
易に分泌されることができる。

天然ｔ−ＰＡは複合モザイクポリペプチドであり、そし
てｔ−ＰＡ遺伝子は前述の構造的および機能的領域をコ
ードする多数のエクソンを含むという事実ＣＮｙら、同
上〕に照らして、ｔ−ＰＡの特異的フィブリン溶解活性
を最適に発現するＤＮＡ配列を構成することが望ましい
であろう。

タンパク質の最適化は、ｔ−ＰＡの所望の構造的および
機能的性質をコードするヌクレオチド配列のみをクロー
ニングし、同時に所望の生物学的活性に寄与しない配列
を排除することによって達成できるであろう。所望の構
造の多数のコピーを、最適化されたタンパク質の中に組
込むこともできる。

明らかなように、ｔ−ＰＡの臨床的効能と投与の容易さ
および最小の望ましくな副作用とを兼ね備えた、フィブ
リン溶解剤がこの分野において要求されている。本発明
は、比較的大量に生産することができる変形された形態
のｔ−ＰＡを提供することによって、この要求を満足さ
せる組換えＤＮＡ技術を使用することによって、変度さ
れた（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）　ｔ　−Ｐ　Ａの絶えず一定
した均質な入手源が提供される。心臓の発作および搏動
の罹病において存在する凝塊（ｃｌｏｔ）を溶解するた
めに、そしてフィブリンのマトリ７クスを溶解しあるい
はその形成を抑制することの必要性が治療上望ましい他
の場合において、変形されたｔ−ＰＡを利用できる。

Ｃ発明の開示〕 節単に述べると、本発明は、フィブリン結合領域をコー
ドする第１区域と、第１区域より下流に位置する第２区
域とから本質的に成るヌクレオチド配列を含有し、第２
区域が組織プラスミノゲンアクチベーターのセリンプロ
テアーゼ活性のための触媒領域をコードする、ＤＮＡ構
成体を開示する。この配列は、ｔ−ＰＡと実質的に同一
の生物学的活性を有するタンパク質の遺伝情報を指定す
る。第１区域および第２区域は、ｔ−ＰＡのゲノムのク
ローンまたはｃＤＮＡのクローンに由来することができ
、あるいは普通のＤＮＡ合成技術によって構成できる。

好ましくは、フィブリン結合領域をコードする第１区域
は、１または２以上のクリングル構造をコードする。と
くに、第１区域はｔ−ＰＡのＫ。

およびに２クリングル構造、二重に２構造または単一の
に２構造をコードするか、あるいは他のタンパク質から
のクリングル構造を代わりに使用できる。フィブリン結
合領域をコードする第１区域は、１または２以上のフィ
ンガー領域をさらにコードすることができる。

第２区域は、本質的にｔ−ＰＡのセリンプロテアーゼ領
域である触媒領域をコードする。とくに好ましい第２区
域は、第１図に従い、アミノ酸番号２７６から延びかつ
アミノ酸番号５２７を通して続（ｔ−ＰＡの軽鎖をコー
ドする。

さらに、本発明は、ｔ−ＰＡと実質的同一の生物学的活
性を有するタンパク質の発現を命じる（ｄｉｒｅｃｔ）
ことのできる発現ベクターを開示する。

これらのベクターは作用可能にヌクレオチド配列に結合
しているプロモーターを含み、このヌクレオチド配列は
フィブリン結合領域をコードする第１区域と、第１区域
より下流に位置する第２区域とから本質的に成り、第２
区域はｔ−ＰＡのセリンプロテアーゼ活性のための触媒
領域をコードする。この配列はｔ−ＰＡと実質的に同一
の生物学的活性を有するタンパク質の遺伝情報を指定す
る。

本発明の第３の面は、ｔ−ＰＡと実質的に同一の生物学
的活性をもつタンパク質を生産するようにトランスフェ
クションあるいは形質転換された細胞を開示する。これ
らの細胞は、フィブリン結合領域をコードする第１区域
と、第１区域より下流に位置する第２区域とから本質的
に成るヌクレオチドに作用可能に結合した、プロモータ
ーを含んでなるＤＮＡ構成体を含有し、第２区域は１−
ＰＡのセリンプロテアーゼ活性のための触媒領域をコー
ドする。この配列はｔ−ＰＡと実質的に同一の生物学的
活性を有するタンパク質の遺伝情報を指定する。

細胞は哺乳動物の細胞または微生物であることができる
。好ましい微生物はバクテリア、とくに大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）　、および真核生物の微生物、とくに酵母菌サ
ッカラミセス・セレビシアエ（錘ユｃｃｈａｒｏｍ　ｃ
ｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および糸状菌類、例え
ば、アスペルギルス（ハ脛■旦旦蛙を包含する。

本発明は、さらに、ｔ−ＰＡと実質的に同一の生物学的
活性を有するタンパク質を生産する方法を提供する。こ
の方法は宿主細胞の中にＤＮＡ構成体をそう人する工程
を含んでなり、このＤＮＡ構成体はフィブリン結合領域
をコードする第１区域と第１区域より下流に位置する第
２の区域とから本質的に成るヌクレオチド配列に作用的
に結合したプロモーターを含有し、第２区域はｔ−ＰＡ
のセリンプロテアーゼ活性のための触媒領域をコードす
る。この配列はｔ−ＰＡと実質的に同一の生物学的活性
を有するタンパク質の遺伝情報を指定する。第２工程は
宿主細胞を適当な培地中で生長させることを包含し、次
の工程は宿主細胞が生産したＤＮＡ構成体によってコー
ドされたタンパク質生崖物を単離することを包含する。

宿主細胞は哺乳動物の細胞または微生物であることがで
きる。好ましい微生物はバクテリア、とくに大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）　、および真核動物の微生物、とくに酵母
画成じ仁立う」上皇ノ、・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏ−狂態り並島旦紅封）および糸状菌類、例えば、ア
スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）を包含する。

さらに本発明の他の面は、アミノ末端フィブリン結合領
域とカルボキシ末端プロテアーゼ領域とから本質的に成
る、ｔ−ＰＡと実質的に同一の生物学的活性をもつタン
パク質を開示する。

本発明の他の面は、以下の詳細な説明および添付図を参
照すると明らかとなるであろう。

以下余白 〔発明を実施するための最良の方法〕 本発明を説明する前に、ここで使用する幾つかの用語の
定義を記載することは、本発明の理解の助けになるであ
ろう。

・ＤＮＡすなわちｃＤＮＡ　：ｍＲＮＡ鋳型中に存在す
る配列から合成されたＤＮＡの分子または配列。

Ｄ　Ｎ　Ａ　　　　（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）　：自然に
存在する遺伝子から部分的な形態で単離することができ
、あるいは自然にはそうでなければ存在しない方法で結
合および並置されたＤＮＡのセグメントを含有するよう
に変更された、一本積または二本鎖のＤＮＡ分子、また
はこのような分子のクローン。

ブースミド　たはベク　−：宿主細胞中にそう人された
とき、その複製を提供する遺伝子情報を含有するＤＮＡ
構成体。複製は自律的であるか、あるいは宿主ゲノム中
への組込みであることができる。プラスミドは、一般に
、宿主細胞中で発現すべき少なくとも１つの遺伝子配列
、ならびにこのような遺伝子の発現を促進する機能をコ
ードする配列、例えば、プロモーターおよび転写の開始
部位およびターミネータ−を含有する。それは線状また
は閉じた環状の分子であることができる。

ブレー１１ｍ！　×ｈ　　（ｒｅ−ｒｏ　ｒｅ　１ｏｎ
）：ある種のタンパク質の前駆体のアミノ末端に存在し
、そして一般に分泌の間に、少なくとも一部分、タンパ
ク質から裂開されるアミノ酸配列。プレープロ区域は、
一部分、タンパク質を細胞の分泌通路の中に向ける配列
を含む。

研域ユｄｏｍａ圏しタンパク質分子の特定の生物学的活
性のために必要な構成要素を含有する、タンパク質分子
の特定のアミノ酸の三次元的自己集成列。

フィフ゛Ｔン′士Ａ令＋５　：タンパク質をフィフ゛リ
ンへ結合するために必要なそのタンパク質の部分。

天然ｔ−ＰＡにおいて、クリングル構造およびフィンガ
ー領域はフィブリン結合に寄与する。本発明によれば、
Ｅ　Ｇ　Ｆ　領域はｔ−ＰＡまたは変形されたｔ−ＰＡ
のフィブリン結合に有意に寄与しないことが発見された
。

生立ヱ泣孟性二ある分子が生物学的関係において（すな
わち、生物体、細胞、または生体外の複製物中において
）なす機能または機能の組。タンパク質の生物学的活性
は、触媒活動とエフェクター活動とに分けることができ
る。フィブリン熔解因子の触媒活性は、前駆体の特異的
裂開（ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｌｅａｖａｇｅ）による他の
タンパク質の活性化をしばしば含む。対照的に、エフェ
クター活性は生物学的に活性な分子を他の分子、例えば
、フィブリン、または細胞に特異的に結合することを含
む。エフェクター活性は、しばしば、生理学的条件下で
の触媒活性を増強し、あるいはそれに必須である。

触媒活性およびエフェクター活性は、ある場合において
、タンパク質の同一領域に存在する。天然のｔ−ＰＡに
ついて、生物学的活性は、フィブリン、プロ酵素または
酵素前駆体の存在下に、プラスミンに転化することによ
って特徴づけられ、そしてプラスミンはフィブリンマト
リックスを分解する。フィブリンはプラスミノゲンの活
性化においてコファクターとして作用するので、天然の
ｔ−ＰＡはフィブリンの不存下ではほとんど活性をもた
ない。ここで使用するとき、ｌ’−ｔ−ＰＡと実質的に
同一の生物学的活性」という用語は、フィブリン、プロ
酵素または酵素前駆体の存在下に、プラスミノゲンをブ
ラミンに転化することを包含する。

前述のように、ｔ−ＰＡはフィブリン凝塊の分解（ｄｅ
ｇｒａｄａｔｉｏｎ）において主要な役割を演すること
が知られている。天然ｔ−ＰＡはｔ−ＰＡのフィブリン
溶解活性に不必要であることがわかった区域をその分子
内に有するモザイクタンパク質であるので、フィブリン
結合活性およびセリンプロテアーゼ活性が保持されてい
るが、Ｅ　Ｇ　Ｆ　９Ｍ域のすべてまたは一部分および
他の非フィブリン溶解領域がこのような変形ｔ−ＰＡか
ら排除された、変度ｔ−ＰＡを提供することが望ましい
。さらに、増強されたフィブリン結合活性または増延長
され生体内半減期を有する変更ｔ−ＰＡを生産すること
が望ましいであろう。

本発明によれば、出発物質としてｃＤＮＡクローンまた
はゲノムのクローンを使用して、組換え技術を用いるこ
とによって、これらの新規なタンパク質を生産すること
が好ましい。適当なりＮＡ配列は、また、標準的手順に
従って合成できる。

ｃＤＮＡクローンを使用することが好ましい。なぜなら
、変形ｔ　−ＰＡを生産するための出発物質として、天
然ｔ−ＰＡをコードする完全長のｃＤＮＡを使用するこ
とによって、イントロンが除去され、こうして天然ｔ−
ＰＡのすべてのエクソンが存在しかつ互いに関して正し
く配向されているからである。完全長のｃＤＮＡは、ま
た、ｔ−ＰＡのＣＤＮＡを５′末端から［チューイング
バック（ｃｈｅｗｉｎｇ　ｂａｃｋ）　Ｊ　Ｌ／、こう
して宿主細胞の中に究極的にそう人できる多数のｃＤＮ
Ａ断片を得ることによって、変形分子を容易に発生させ
るという利点を提供する。あるいは、ＣＤＮＡはオリゴ
ヌクレオチド指令（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発を
経る配列の欠失またはそう人のための鋳型として使用で
きる。

ｔ−ＰＡのｃＤＮＡの利用は、追加のクリングル構造お
よびフィンガー領域のそう人によって、天然のｔ−ＰＡ
のフィブリン結合領域の便利な増強を可能とする。この
方法は、天然ｔ−ＰＡまたは他のタンパク質中に見出さ
れる機能的領域の最適な組合せを選択して、フィブリン
結合およびセリンプロテアーゼ活性に関して増強された
生物活性をもつフィブリン溶解剤を得る手段を提供する
。

したがって、本発明は、ｔ−ＰＡと実質的に同一の生物
学的活性を有する新規なタンパク質を生産する方法を提
供する。ここに記載する新規なタンパク質は、天然のｔ
−ＰＡよりも５倍〜１０倍大きい生体内半減期を有する
ことが示された。これらの新規なタンパク質は、トラン
スフェクションした哺乳動物細胞、および形質転換され
た菌類およびバクテリア中において発現される。

成熟ヒトｔ−ＰＡをコードする配列を含有するｃＤＮＡ
クローンは、すでに同定されている。

ｔ−ＰＡのｃＤＮＡ配列はプラスミドｐＤＲ１２９６中
にそう人され、そしてこのプラスミドは大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）　ＪＭ８３中に導入された。この形質転換体は
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（八
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅ−ｓｄａ、ＭＤ）に受託され
、そして受託１１ｋＬ５３３４７を受けた。

菌株ｐＤＲ１２９６／　ＪＭ８３をｔ−ＰＡのｃＤＮＡ
源として使用した。プラスミドｐＤＲ１２９６を単離し
、そしてｔ−ＰＡのｃＤＮＡを制限エンドヌ・フレアー
ゼ消化によって切り取った。ｔ−ＰＡ制限断片を次いで
Ｂａｌ　３１とともにインキュベーションし、そして酵
素の反応時間を調節して、大きさの不均一性を示す一連
のｔ−ＰＡヌクレオチド配列を生産した。この大きさの
不均一性は、ｔ−ＰＡのｃＤＮＡの５′末端の漸進的短
縮から生ずる。

Ｂａｌ　３１消化した断片をゲル電気泳動によって分離
し、そして所望の大きさの範囲の断片を選択した。断片
を常用の技術に従いゲルから溶離した。

第２のアプローチにおいて、ｐＤＲ１２９６からのｃＤ
ＮＡ配列の部分をオリゴヌクレオチド指令欠失突然変異
誘発のための鋳型として使用した。この方法により、天
然ｔ−ＰＡの特定の領域をコードする配列を正確に欠失
または変更した。

第３のアプローチにおいて、変形ｔ−ＰＡ配列の５′コ
一ド区域を、合成オリゴヌクレオチドから構成し、そし
てｃＤＮＡの３′区域に連結した。

次いで、変形ｔ−ＰＡ断片を適当なプレープロ配列に連
結した。ｔ−ＰＡのプレープロ配列は、ｃＤＮＡまたは
ゲノムのライブラリーから単離することができ、あるい
は合成したオリゴヌクレオチドから構成することができ
る。オリゴヌクレオチドは好ましくは機械合成し、精製
し、そしてアニーリングして二本鎖断片を構成する。得
られた二本鎖断を、必要に応じて、結合してプレープロ
配列を生成する。このプレープロ配列は、第１図に描か
れているように、１ｏｓｂｐ配列からなる。次いで、合
成したプレープロ配列を変形ｔ−ＰＡ断片の５′末端に
接合した。選択した宿主細胞のタイプに依存して他のプ
レープロ配列を使用できる。

ある場合において、宿主種に対して内因性のプレープロ
配列を使用することが望ましいであろう。

プレープローｔ−ＰＡ断片を適当な発現ベクター中にそ
う人し、次いでこれを適当な宿主細胞中にそう人する。

そう人の方法は選択した特定の宿主細胞に依存するであ
ろう。異種ＤＮＡで哺乳動物の細胞をトランスフェクシ
ョンする方法およびバクテリアおよび菌類を形質転換す
る方法は、この分野においてよく知られている。適当な
発現ベクターは、宿主細胞中の異種遺伝子の転写を命令
できるプロモータを含むであろう。

ある場合において、発現ベクターは、さらに、複製起点
ならびに、選択した宿主細胞に依存して、発現のレベル
を調節しそて／または増強する配列を含むことが好まし
い。適当な発現ベクターはプラスミド、ＲＮＡおよびＤ
ＮＡウィルスまたは細胞のＤＮＡ配列から誘導すること
ができ、あるいは各々の要素を含有することができる。

本発明の実施において使用するために好ましい原核細胞
は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の菌株
であるが、バシルス（Ｂａｃｉｌ　１ｕｓ）および他の
属も有用である。これらの宿主を形質転換しそしてそれ
らの中でクローン化された異種ＤＮＡ配列を発現する技
術はこの分野においてよく知られている〔例えば、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　
　：　ＡＬａｂ＋■追旦ひ」直凹剣工、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８２参照〕。バ
クテリア宿主中の異質ＤＮＡの発現に使用されるベクタ
ーは、一般に、選択可能な遺伝標識、例えば、抗生物質
耐性のための遺伝子、および宿主細胞中で機能するプロ
モーターを含有するであろう。適当なプロモーターは、
次のものを包含する：　　ｔｒｐ　（Ｎｉ−ｃｈｏｌｓ
およびＹａｎｏｆｓｋｙ、　Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ　
ｍｏｌ。

匪：　１５５．１９８３）、　ｌａｃ　（Ｃａｓａｄａ
ｂａｎ　ら、ムＢａｃｔ、、１４３　　：　　９７１−
９８０．１９８０）、ＴＡＣ（Ｒｕｓｓｅｌ）ら、堕吠
　別：　　２３１−２４３．１９８３）　、およびファ
ージプロモーター系。バクテリアの形質転換に有用なプ
ラスミドは、次のものを包含する：　ｐＢＲ３２２（Ｂ
ｏｌｉｖａｒ　ら、傾匹）叢、９５−１１３．１９７７
）、ｐｕｃプラスミド（Ｍｅｓｓｉｎｇ　、　Ｍｅｔｈ
、ｉｎ　Ｅｎｚ　ｎｏｌｏ　　。

１０１、２０−７７．１９８３、およびＶｉｅｉｒａお
よびＭｅｓｓｉｎｇ＋Ｇｅｎｅ、　　１９　：　　２５
９−２６８　　、１９８２）　　、　ｐＣＱＶ２　　（
口ｕｅｅｎ。

Ｌμ占１旺旦止ｌ佳、　、　　２　　：　１−１０．１
９８３）　、およびそれらの誘導体。

真核生物の微生物、例えば、酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏ−
ｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または線状苗頻、
例えば、アスペルギルス（Ｍ匹」旦居蛙もまた、宿主細
胞として使用できる。アスペルギルス（船り見■ｊυ上
り一のとくに好ましい種は、Ａ、ニドランス（Ａ、ｎ１
ｄｕ−加）、Ａ、ニガー（虹旦Ｕ旦　、Ａ、オリゼー（
Ｌｇす、およびＡ、テレウス（Ａ、ｔｅｒｒｅｕｓ　）
を包含する。酵母菌を形質転換するための技術はＢｅｇ
ｇｓによって記載された（Ｎａｔｕｒｅ、　２７５　　
：　　１０４−１０８．１９７８）。酵母菌中で使用す
るための発現ベクターは、次のものを包含する：　ＹＲ
ｐ７　（Ｓｅｒｅｎｌら、Ｐｒｏｃ　。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　）　ＵＳＡ　、　７６　
：　１０３５−１０３９．１９７９）、ＹＥｐ１３　　
（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ、　　８　：　　１２１−
１３３．１９７９）、ｐＪＤＢ２４８　ｐＪＤＢ２１９
　　（Ｂｅｇｇｓ　、同上〕、およびそれらの誘導体。

このようなベクターは、一般に、選択可能な遺伝標識、
例えば、栄養遺伝標識ＴＲＰを含み、これにより庇突然
変異を有する宿主での選択が可能となる。酵母菌の発現
ベクター中の使用に好ましいプロモーターは、次のもの
を包含する：酵母菌解糖系遺伝子のだめのプロモーター
（Ｈｉ　ｔｚｅｎ＋ａｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｉｍ、
、　２５５　　：　　１２０７３−１２０８０．１９８
０　；　ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、　Ｊ　Ｍ
ｏｌ紅鮭」弘虱、、上：　４１９−４３４．１９８２）
　、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＣＹｏｕ
ｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎ　　１ｎｅｅｒｉｎ　
　　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｏｒ　　ａｎｉｓｍｓ　　ｆｏ
ｒＣｈｅｍｉｃａｌｓ　、　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒら！
、　　３３５ページ・プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）　、ニ
ューヨーク、１９８２　；および八ｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅ
ｔｈ、ｉｎ　　Ｅｎｚ　　ｍｏｌｏ　　　、　　１０１
　　　：　　　１９２−２０１　．１９８３）。酵母菌
形質転換体中で生産された変形ｔ−ＰＡタンパク質の精
製を促進しかつ適切なジスルフィド結合の形成を得るた
めに、ｔ−ＰＡプレープロ配列の代りに分泌されるタン
パク賞をコードする酵母菌遺伝子からのシグナル配列を
使用することができる。とくに好ましいシグナル配列は
、用１遺伝子のプレープロ区域である（Ｋｕｒｊａｎお
よびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　Ｃａ旦、　３０　：　　
９３３−９４３．１９８２）　。

アスペルギルス（飴」且Ｉ土１１ｕリーの種は既知の方
法、例えば、Ｙｅ　Ｉ　ｔｏｎらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　　８１　：　１７４０−１７４７．１９８４）
に従って形質転換することができる。

より高等な真核動物の細胞は、本発明の実施において宿
主細胞として機能することができる。培養した哺乳動物
の細胞、例えば、ＢＨＡ、ＣＨＯ、およびＪ５５８Ｌの
細胞系が好ましい。ｔｋ　−ＢＨＫ細胞はとくに好まし
い。哺乳動物の細胞中に使用するための発現ベクターは
、哺乳動物中に導入された異質遺伝子の転写を指令でき
るプロモーターを含むであろう。とくに好ましいプロモ
ーターはＳＶ４０［Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　ら、Ｍｏ１．
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、土：　　８５４−６４．１９８
１）およびＭＴ−１プロモ一ターＣＰａ１ｍ１ｔｅｒら
、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２２　　：　　８０９　８１
４．１９８３）を包含する。

また、発現ベクター中に転写ターミネータ−が含有され
、このターミネータ−は発現すべきＤＮＡ配列のための
そう入部位より下流に位置する。好ましいターミネータ
ーはヒト生長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子ターミネータ−
である（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、、　　９　：３７１９　３７３０．１９８１）。

培養した哺乳動物の細胞中の突然変異体ｔ−ＰＡ。

の発現のため、クローン化ｔ−ＰＡを含有する発現ヘク
ターは、適当なトランスフェクション技術、例えば、リ
ン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、　
ＵＳＡ″７７　：　３５６７−３５７０．１９７８によ
って改変された、Ｇｒａｈａｍおよびνａｎ　ｄｅｒ　
Ｅｂ、　■匹圏■５２　：　　４５６−４６７．１９７
３）の方法によって細胞の中に導入される。

ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿物を形成し、そしてこの
沈殿物をクロロキン（１００声）を含有する媒質の存在
下に細胞に適用する。細胞を沈殿物とともに４時間イン
キュベーションし、次いで２分間１５％のグリセロール
ショックを与える。ある比率の細胞はＤＮＡを取り込み
、そしてそれを細胞内に数日間維持する。小比率の細胞
は宿主のゲノムの中にＤＮＡを組込むか、あるいは非染
色体核構造体中にＤＮＡを維持する。これらのトランス
フェクシント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）は選択可能
な表現型（選択可能な遺伝標識）を与える遺伝子との同
時トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎ）によって同定される。好ましい選択可能な遺伝標識
はＤＨＰＲ遺伝子であり、この遺伝子はヌクレオチド合
成の阻害剤であるメトトレキセイト　（ＭＴＸ）に対す
る耐性を細胞に付与する。宿主細胞がＤＮＡを吸収した
後、薬物選択を適用して、適当な方法で選択可能な遺伝
標識を発現している細胞の個体群を選択する。

ＭＴＸを培地に添加し、好ましくは培地中のＭＴＸの濃
度を順次に増加し、次いで薬物耐性の細胞系を希釈によ
ってクローニングすることを反復することにより、発現
レベルを増加する１つの手段として、同時増幅（ｃｏａ
ｍｐｌｊｆ　１ｃａｔｉｏｎ）を達成することができる
。増幅能力の変動は、同時トランスフェクションしたＤ
ＮＡ配列の初期のゲノム配置（すなわち、染色体外対染
色体）ならびに種々の量のＤＮＡの転位が起こりうる、
増幅自体の機構の両者に関係する。これは、頻繁かつ安
定な同時増幅を行うことができることが前に示されたク
ローンのそれ以上の増幅において認められる。

この理由のため、各増幅工程後に希釈によってクローン
化することが必要である。次いで、Ｄ　ＩＩ　Ｐ　Ｒ遺
伝標識を発現する細胞を選択し、そしてｔ−ＰＡの生産
についてスクリーニングする。スクリーニングは、酵結
合免疫収着アッセイ　（ＥＬＩＳＡ）または生物学的活
性のアッセイによって実施できる。

さらに、ある条件下に、ｔ−ＰＡの生産は培養中の哺乳
動物の細胞に悪影響を及ぼすことが発見された。これは
一部分プラスミン（非特異的プロテアーゼ）のためであ
ると信じられ、このプラスミンはｔ−ＰＡを生産するよ
うにトランスフェクションされた細胞を血清の一成分で
あるプラスミノゲンを含有する培地中で培養するとき発
生する。

トランスフェクションされた細胞によって生産されるｔ
−ＰＡはプラスミノゲンを活性化してプラスミンにし、
このプラスミンは細胞膜を攻撃し、そして胞胞の剥離に
寄与する。他のタンパク質加水分解活性も関与すると信
じられる。培地中にプロテアーゼ阻害剤を含めると、プ
ラスミノゲンの活性化がブロッキングされ、そしてｔ−
ＰＡの生産を促進する。とくに好ましいプロテアーゼ阻
害剤はアプロチニンであり、これは培地中にほぼ１００
単位／−〜５０，０００単位／−の濃度で、好ましくは
プラスミノゲン不含血清を含有する培地中に１００単位
の濃度で、あるいは正常の胎児子牛血清を用いる場合、
はぼ１０００単位／−〜５０．０００単位／ｄ、好まし
く　１ｏｏｏ単位／−の濃度で含められる。

そのように生産されたｔ−ＰＡは、培地をを取り出し、
そしてそれを分画することによって培養細胞から回収さ
れる。好ましい分別法は、抗１−ＰＡ抗体、フィブリン
−セライト（ｃｅｌｉｔｅ）カラムまたはりジン−セフ
ァロースカラムを用いるアフィニティークロマトグラフ
ィーである。また、他の普通の精製法、例えば、イオン
交換クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィ
ーまたはゲル濾過を用いることができる。

要約すると、本発明は、変形ｔ−ＰＡタンパク質を提供
し、そして安定にトランスフェクションされたあるいは
形質転換された宿主細胞を使用することによって、天然
ｔ−ＰＡと実質的に同一の生物学的活性を有する変形ｔ
−ＰＡタンパク質を生産する方法を提供する。次いで、
こうして発現されたタンパク質生産物を細胞または細胞
増殖培地から精製し、そして生物学的活性についてアッ
セイする。このアッセイは、プラスミノゲンのプラスミ
ンへの転化、フィブリン結合親和性または血漿半減期特
性を監視できる。免疫学的アッセイもまた使用できる。

以下の実施例を要約すると、実施例１はボウウェス（Ｂ
ｏｗｅｓ）黒色腫の細胞系からのｍＲＮＡからつくった
ｔ−ＰＡのｃＤＮＡクローンを開示する。

このｃＤＮＡを使用してプラスミドｐＤＲ１２９６を構
成し、そしてこのプラスミドを使用してＥ、ｃｏｌｉ菌
株ＪＭ８３を形質転換した。次いで、ｐＤＲ１２９６の
ｔ−ＰＡ配列を、オリゴヌクレオチドから構成した合成
プレープロ配列に連結した。？ＩＴ−１プロモーターお
よびヒト生長ホルモンのターミネータ−を加え、そして
第２図に示すベクターＺｅｍ　９９を構成した。

実施例２は、正常肝Ｆａ組織から誘導されたＤＮＡライ
ブラリーから得られた、ヒトゲノムｔ−ｐＡのクローニ
ングおよび配列決定を開示する。

実施例３は、全長のｐＤＲ１２９６ｔ　−Ｐ　Ａクロー
ンを使用して、ランダム５′末端欠失を有するｔ−ＰＡ
配列の調製を開示する。ＴＡＣプロモーターおよびｔ−
ＰＡブレープロ配列を、不規則に欠失したｔ−ＰＡのｃ
ＤＮＡ配列に結合した。ｐＤｌ’＋８１７構成体は、完
全長のｔ−ＰＡクローンを用いて得られたものよりも１
０〜３０倍大きいｔ−ＰＡフィブリン溶解活性の生成を
指令した。培養した哺乳動物中の端を切った（ｔｒｕｎ
ｃａｔｅｄ）配列の発現も開示した。

実施例４および５は、ｔ−ＰＡのフィンガー領域および
生長因子領域のためのコード配列をループアラ）　（Ｉ
ｏｏρｉｎｇ　ｏｕｔ）する方法を記載する。

実施例６および７は、フィンガー領域、生長因子領域お
よびクリングル１構造のためのコード配列をループアウ
トして、変形ｔ−ＰＡを生産する方法を開示する。

実施例８は、合成オリゴヌクレオチドを使用する突然変
異体ｔ−ＰＡ配列の構成を開示する。

実施例９は、欠失突然変異誘発によって構成される、生
長因子領域コード配列を欠失した突然変異体配列を開示
する。

実施例１０は、バクテリア発現ベクターｐＤＲ８１６（
実施例３に記載する）を使用して、形質転換されたＥ、
ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５中で変異体ｔ−ＰＡを発現する方
法を記載する。

実施例１１は、子供ハムスター腎（Ｂ　ＨＫ）細胞を変
異体ｔ−ＰＡ配列を含んでなる発現ベクターでトランス
フェクションすることによって、哺乳動物中で変異体ｔ
−ＰＡを発現する方法を教示する。

実施例１２は、変異体ｔ−ＰＡヌクレオチド配列を含ん
でなるベクターで形質転換された、３−ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ細胞中で突然変異体ｔ−ＰＡを発現することを記
載する。

次の実施例により、本発明をさらに説明する。

〔実施例〕

ヒトｔ−ＰＡｃＤＮＡクローンの配列は報告されている
（Ｐｅｎｎｉｃａ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３０し：　　
２１４−２２１．１９８３）。この配列は、３２−３５
アミノ酸のプレプロペプチドおよび引続＜　　５２７−
５３０アミノ酸の成熟タンパク質をコードする。

変異体ｔ−ＰＡのためのコード配列を含んでなるｃＤＮ
Ａクローンは、（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞系からのｍＲ
ＮＡを出発物質として使用して構成された（Ｒｉｊｋｅ
ｎおよびＣｏ１１ｅｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
　２５６　ニア０３５−７０４１．１９８１）　、次い
で、このｃＤＮＡを使用してプラスミドｐＤＲ１２９６
を構成した。ｐＤＲ１２９６で形質転換したニジエリシ
ャ・コリ　（Ｅｓｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉａ部）菌株は、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（八ｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ
−ｔｉｏｎ）に受託Ｎｃｉ　５３３４７で受託された。

プレープロ配列はｃＤＮＡクローンｐＤＲ１２９６中に
存在しないので、それは合成オリゴヌクレオチドから構
成し、引続いてｃＤＮＡに連結した。合成ｔ−ＰＡプレ
ープロ配列において、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏｌの裂開
部位はプレープロ配列の第１コドン（ＡＴＧ）に対して
５′のすぐ近くに導入し、そしてＢｇｌ　Ｕ　（Ｓａｕ
３Ａ　、　ＸｈｏＩＩ）部位はプレープロ配列の３′末
端に維持された。天然プレープロ配列は中央付近に便利
な制限部位を欠く。しかし、配列ＧＧＡＧＣＡ　（アミ
ノ酸−２０および一１９Ｇ１ｙ−Ａｌａの遺伝情報を指
定する）をＧＧＣＧＣＣに変更して、アミノ酸配列を変
化させないで、ＮａｒＩ部位を得ることができる。

プレープロ配列を構成するために、アプライド・バイオ
システム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）　３
８０−Ａ型ＤＮＡ合成装置を使用して、次のオリゴヌク
レオチドを合成した： ＺＣ１３１：　　５　’ＧＧＡ　ＴＣＣＡＴＧ　ＧＡＴ
　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＡＡＧＡＧＡ　　ＧＧＧ　　ＣＴＣ
ＴＧＣＴＧＴ　　ＧＴＧ　　３　　’ＺＣ１３２：　　
　　５’　　ＴＣＧ　　ＣＧＣＣＡＣＡＣＡ　　ＧＣＡ
　　ＧＣＡ　　ＧＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧ３　’ ＺＣ１３３：　　５　’　ＧＧＣＧＣＣＧＴＣＴＴＣＧ
ＴＴ　ＴＣＧ　ＣＣＣＡＧＣＣＡＧ　ＧＡＡ　ＡＴＣＣ
ＡＴＧ３　’ＺＣ１３４：　　５　’　ＡＧＡ　ＴＣＴ
　ＧＧＣＴＣＣＴＣＴ　ＴＣＴ　ＧＡＡＴＣＧ　ＧＧＣ
ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＴＴＣＣＴ　３　’精製後、オリゴマ
ーｚＣ￥３１およびＺＣ１３２をアニーリングして１２
塩基対のオーバラップを生成した（切片１）。オリゴマ
ーＺＣ１３３およびＺＣ１３４を同様にアニーリングし
た（切片２）。

オリゴマーをＰｏ１Ｉ緩衝液〔ベセスダ・リサーチ・ラ
プス（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ
）　）中で混合し、６５℃に５分間加熱し、そして室温
にゆっくり４時間冷却してアニーリングした。１０単位
のＤＮＡポリメラーゼを加え、そして反応を室温におい
て２時間進行させた。この混合物を８％のポリアクリル
アミド−尿素の配列決定ゲル上で１　、０００ボルトで
２．５時間電気泳動させて、反応生成物を大きさで分別
した。正しい大きさの断片（ポリメラーゼの反応が完結
したもの）をゲルから切断し、そして抽出した。

アニーリング後、切片１をＢａｍＨＩおよびＮａｒＴで
切断し、ＢａｍＨＩ　＋　Ｎａｒ　Ｉ−切断ｐＵＣ８中
にクローン化した（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ
＋Ｇｅｎｅ、　１９　：　　２５９−２６８．１９８２
　；およびＭｅｓｓｉｎｇ）、　Ｍｅｔｈ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚ　−匹旦■、」迎−２０−７７，１９８３）。切片２
を再アニーリングし、そしてＮａｒＩおよびＢｇｌＩ［
で切断し、そしてＢａｍＩＩ　＋Ｎａｒ　（Ｓａｕ３Ａ
、Ｘｈｏｌ−切断ｐＵｃ８）中にクローン化した。コロ
ニーを適当な標識オリゴヌクレオチドでスクリーニング
した。コロニーとのハイブリダイゼーションによって陽
性と同定されたプラスミドを配列決定して、正しい配列
がクローン化されたこと確かめた。

次いで、切片■を適当なｐＵＣクローンのＢａｍＨＩ＋
Ｎａｒに重消化物から精製した。２つの断片をＮａｒ１
部位で連結し、そしてＢａｍＨＩ−切断ｐＵｃＢ中にク
ローン化した。

次いで、ｐＤＲ１２９６のｔ−ＰＡ配列を、次の方法で
、合成プレープロ配列に連結した（第２図）。

プラスミドｐｌｃ１９Ｒ（Ｍａｒｓｈ　ら、Ｇｅｎｅ、
　３２　：　　４８１−４８６．１９８４）をＳｍａｌ
および旧ｎｄＵで消化した。

次いで、地図位置２７０（ＰｖｕＩｒ）から位置５１７
１（Ｈｉｎｄ　ｍ　）までのＳＶ４０のｏｒｉ区域を直
線化されたｐＩｃ１９Ｒに結合してプラスミドＺｅｍ　
６７を生成した。

このプラスミドをＢｇｌｎで次に裂開し、そしてヒト生
長ホルモンの遺伝子からのターミネータ−区域（Ｄｅ　
Ｎｏｔｏ　ら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　　９
　：３７１９−３７３０．１９８１）をＢｇｌ　Ｕ　　
ＢａｍＨＩ断片としてそう人して、プラスミドＺｅｍ　
８６を生成した。合成ｔ−ｐＡプレープロ配列をＳ　ａ
ｕ３Ａで消化してｐＵＣ８ベクターから取り出した。こ
の断片をＢｇｌＵ消化したＺｅｍ　Ｅ！６中にそう人し
て、プラスミド８８を生成した。プラスミドｐＤＲ１２
９６をＢｇｌＩｒおよびＢａｍ１ｌで消化し、ｔ−ＰＡ
ｃＤＮＡ断片を単離し、そしてＢｇｌＩ［−切断Ｚｅｍ
　８８中にそう人した。得られたプラスミドをＺｅｍ　
９４と表示した。

次いで、ＭＩ−１プロモーター、完全む−ＰＡコード配
列、およびｈＧＨターミネータ−を含んでなるベクター
Ｚｅｍ　９９を、次の方法で組立てた（第２図）、ＭＴ
−１プロモーターを包むＫｐｎ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片
をＭＴｈＧｌｌｌｌｌ　（Ｐｏｌｍｉｔｅｒら、５ｃｉ
ｅｎｃｅ　、　２２２：８０９−８１４．１９８３）か
ら単離し、そしてｐＵｃ１８中にそう人してＺｅｍ　９
３を構成した。プラスミドＭＴｈＧＨ１１２（Ｐａｌｎ
＋１ｔｅｒら、同上〕をＢｇｌＩＩで消化し、そして再
連結してｈＧＨコード配列を排除した。次いで、ＭＴ−
１プロモーターおよびｈＧＨターミネータ−をＥｃｏＲ
Ｉ断片として単離し、そしてｐＵｃ１３中にそう人して
Ｚｅｍ４を構成した。次いで、Ｚｅｍ　９３をＢａｍＨ
Ｉおよび５ａｌｌで消化して直線化した。

Ｚｅｍ４をＢｇｌＩＴおよび５ａｉｌで消化し、そして
ｈＧＨターミネータ−を精製した。ｔ−ＰＡプロープロ
配列を、ＢａｍＨＩ　−Ｘ　ｈｏ断片としてｐＵｃ８ベ
クターから取り出した。次いで３つのＤＮＡ断片を連結
し、そしてＺｅｍ　９７の構造を有するプラスミド（第
２図）を選択した。Ｚｅｍ　９７をＢｇｌｆｆで切断し
、そしてＺｅｍ　９４からのＸｈｏＩＩｔ−ＰＡ断片を
そう人した。得られたベクターはＺｅｍ　９９である。

ケリムｔ−ＰＡクローンを、正常の肝組織から％ｆｉ　
導されたＤＮＡライブラリーから得た。このライブラリ
ーは胎児ヒト肝ｌｌＤＮＡ断片をハグテリオファージ・
ラムダ中にそう人することによって構成した（Ｌａｗｎ
ら、釦旦、　１５　：　１１５７−１１７４．１９７８
）。

このライブラリーを使用してＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ
）菌株ＬＥ３９２　（＾ＴＣＣ３３５７２）を感染させ
た（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏ
ｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ）
。

コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９
８２，５０４ページ〕。０．２％のマルトース、１０１
のＭｇＳＯ４、および５０ｇ／ｍｊのチミジンを含有す
るしブイヨン中で細胞を一夜培養して、１０ｍＭのＭｇ
５Ｏ，中で２倍に濃縮した。７５０Ｉのこの濃縮物を、
ＩＩのファージライブラリー（２００，０００フアージ
／Ｊｌりと一緒に、２５ｃｍｘ２２ｃｍの平板を使用す
るＮＺＹアミン軟質寒天の上層中のしブイヨン寒天上で
平板培養した。３７℃で一夜のインキュベーション後、
はぼ１０５／平板のコロニーが得られた。コロニーをニ
トロセルロースに移し、そしてリフト（ｌｉｆｔ）を０
．１ＭのＮａＯＨ，１，５ＭのＮａＣ１で処理し、空気
乾燥し、そして８０°Ｃで２時間ベーキングした。ＳＥ
Ｔ緩衝液（ＳＥＴは１１につき１７５．２ｇのＮａＣ１
、７２，７ｇのトリス、１４．８ｇのＥＤＴ八を含有す
る、ＨＣＩでｐＨ８，０）中で６５℃において、プレハ
イブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション（
全長の、ニック翻訳したｔ−ＰＡｃＤＮＡプローブ）を
実施した。フィルターを２ＸＳＳＣ，０，１％のＳＤＳ
中で洗浄し、乾燥し、そしてオートラジオグラフにかけ
た。

１３の予備的陽性のものが同定された。プラーク精製の
２つのラウンド（上のようにスクリーニングした）は、
１３の群から９つの陽性物を同定した。９つの陽性のゲ
ノムのクローンをＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２
上で平板培養し、−夜増殖させ、そしてリゼイトを調製
した。ファージをＣｓＣβ勾配で精製し、そして表１に
示すオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに
よってマツピングを実施した。

以下余ｉ 、表−」− ＺＣ４６（５’　ＴＣＧ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＣＴＡ　Ｇ
Ｇ　３　’　）ＺＣ８８（５’ＴＧＣＡＧＣＧＡＧ　Ｃ
ＣＡ　ＡＧＧ　　３　’　）ＺＣ８９（５’　ＡＣＧ　
ＴＧＧ　ＡＧＣＡＣＡ　ＧＣＧ　　３　’　）ＺＣ９１
（５’　ＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣ３’　）ＺＣ
９４（５’　　ＴＡＧ　　ＧＡＴ　　ＣＣＡ　　ＴＧＧ
　　ＡＴＧ　　ＣＡＡ　　ＴＧＡＣＡＡ　　ＧＡＧ　　
ＧＧＣ３’　　）ＺＣ９６（５’　　ＣＴＧ　　ＣＴＧ
　　ＴＧＴ　　ＧＧＡ　　ＧＣＡ　　ＧＴＣＴＴＣＧＴ
Ｔ　ＴＣＧ　ＣＣＣ３’　） ＺＣ９８（５’　　ＴＧＣＣＣＧ　　ＡＴＴ　　ＣＡＧ
　　ＡＡＧ　　ＡＧＧ　　ＡＧＣＣＡＧ　ＡＴＣＴＴＣ
３’　） フローブＺＣ９４、ＺＣ９６およびＺＣ９８はシグナル
ペプチドのコード区域にハイブリダイズするであろう。

残りのプローブは成熟ペプチドコード区域ヘハイプリダ
イズする。９つの陽性単離物は３つの明確なりラスに入
ることがわかり、これらは−緒になって全ｔ−ＰＡコー
ド区域にわたる。インサートの大きをＥｃｏＲＩの消化
によって決定した。

各クラスについて、最大のインサートをもつクローンを
ＥｃｏＲＩ　、　　Ｂｇｌ　ｍ、およびＥｃｏＲＩ　＋
　Ｂｇｌ　ＩＩで消化し、そして代表的オリゴヌクレオ
チドプローブを使用してサザンブロソト（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ、　Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　９８：　５０３−５１７．１９７
５）でプロービングした。クローン番号９は成熟ｔ−Ｐ
Ａのための全コード配列を含有したが、プレープロ区域
を含有しないことがわかった。クローン番号９からのイ
ンサートのＥｃｏＲＩ断片およびＢｇｌ　ＩＩ　−Ｅｃ
ｏＲＩ断片を、配列決定およびそれ以上の分析のために
、Ｍ１３およびｐｕｃ１３の中にそう人した。断片はジ
デオキシ法によって配列決定したＣＳａｎｇｅｒら、ム
Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．　、１４３　　：　　１６１−１９
８３、およびＳａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、　、　　ＵＳＡ　　７４　：　５４６
３．１９７７）。

１ＯＮのｐＤＲ１２９６を５単位のＢｇｌＩＩまたは５
単位のＮａｒＩで完全に消化した。得られた直線化ＤＮ
Ａを０．７％のアガロースゲル上で電気泳動させた。Ｄ
ＮＡ断片をＴＥ緩衝液＜１０ｍＭのトリス、ｐＨ７，４
，５ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離した。ＤＮＡ断片を４６４
のＨ２Ｏおよび１２４の５　ＸＢａ１３１緩衝液（３Ｍ
のＮａＣ１，６２，５ｍＭのＣａＣｌ　２．１００１の
トリス−Ｈ（Ｊ’　１．ｐｆ１８．０．５０ｍ門のＥＤ
Ｔ八、ｐＨ８，０）＋２ＪｌｌのＢａｌ　３１　（０，
５単位／ｉ、ベセスダ、リサーチ・ラボラトリーズから
入手した）中に再懸濁させた。反応混合物を３０℃でイ
ンキュベーションし、そして１０μｌのアリコートを１
分間隔で６分間にわたり取出した。消化した試料を一緒
にし、フェノール−ＣＨＣｌ　、で抽出し、そしてエタ
ノールで沈殿させた。断片の末端をＤＮＡポリメラーゼ
■（クレノー断片）およびｄＮＴＰでフィルインした。

このフィルイン（ｆｉｌ−ｉｎ）反応後、試料をＸｂａ
Ｉで消化し、そして０．７％のアガロースゲル上で分離
した。１７００ｂｐより小さい断片を切出し、そしてＴ
Ｅ緩衝液で抽出した。引続くマツピングは５５の末端が
切られた配列を同定した。

Ｂ、ＤＲ８１７ベクターのｉｕ１ 第３図を参照して、２８ｂｐのｔｒｐＡターミネータ−
（Ｐ−Ｌバイオケミカルスから入手した）を、５ｓｔｌ
で切断しかつＴ４ＤＮＡ断片によりフィルインしたｐｌ
Ｊｃ１８中にそう人して、プラスミドｐＤＲ８１３を形
成した。２８ｂｐのターミネータ−断片を同様にｐｌｃ
１９ＲのフィルインされたＣｌａＩ部位にそう人して、
プラスミドｐＤＩ？８１２を構成した。ＴＡＣプロモー
ターおよびｌａｃオペレーター（ｎ並）を含有するプラ
スミドｐＤＲ５４０（Ｒｕｓｓｅｌら、Ｇｅｎｅ、　２
０：２３１−２４３．１９８２）を、旧ｎｄ■で切断し
、クレノー断片で充填し、そしてＢａｍＨＩで消化した
。得られる９２ｂｐの断片は、ＴＡＣプロモーターおよ
び１　ａｃＯを含み、ＢａｍＨＩ　＋Ｓａｍａ　Ｉ　ｃ
ｕｔ　ｐＤＲ８１３中に結合してｐＤＲ８１４を形成し
た。次いで、プラスミドｐＤＲ８１４をＥｃｏＲＩおよ
びｔ（ｉｎｄｌＩｌで消化し、そしてｔｒｐＡターミネ
ータ−１ＴＡＣプロモーターおよｆｆ１ａｃ。

を含むこの断片を単離し、）ＩｉｎｄＩＩＩで完全に消
化しかつＥｃｏＲＩで部分的に消化したｐＤＲ８１２中
に連結した。得られたプラスミドをρＤＲ８１５と表示
した。

プラスミドＺｅｍ　９９　（実施例１参照）をＤａｍｌ
Ｉ［およびＸｂａＩで消化し、そしてｔ−ＰＡｃＤＮＡ
を含むこの断片（プレープロ配列を含む）を単離した。

プラスミドｐＤＲ８１５をＢａｍ１ｌ　ＩおよびＸｂａ
Ｔで切断し、そしてｔ−ＰＡ断片に結合してプラスミド
ｐＤＲ８１６を構成した。

１０鱈のｐＤＲ８１６を５単位のＢ−ｇｌＩ［で完全に
消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片
）を使用して末端をフィルインした。次いでこのＤＮＡ
を５単位のＸｂａＩで完全に消化し、フェノール−ＣＨ
Ｃｆ　：ｌで抽出し、エタノールで沈殿し、そして０．
７％のアガロースデルで電気泳動させた。

３０５０ｂｐの断片（ｐｌｃ１９Ｒ，Ｔ　Ａ　Ｃプロモ
ーターおよびｔ−ＰＡプレープロ配列を含む）をゲルか
ら溶離した。

この３０５０ｂρの断片および不規則に欠失したｔ−Ｐ
ＡｃＤＮＡ配列を、１６℃で一夜連結した。結合混合物
を使用して、コンビテンｌ−Ｅ、コリ　（Ｌｃｏｌｔ）
　ＪＭ８３細胞を形質転換した。形質転換した細胞をア
ンピシリン平板上で平板培養し、そして耐性コロニーを
選択し、そして新しいアンピシリン含有平板に移し、こ
れらの操作を３回実施した。

平板を３７℃で一夜インキユベーションし、そしてコロ
ニーをニトロセルロースフィルターに移した。フィルタ
ーをアンピシリン平板上に配置し、３７°Ｃで４時間イ
ンキユヘーションし、次いでＣＨＣ７！３蒸気で１０分
間処理した。フィルターを１０分間空気乾燥し、フィブ
リン平板上に直接配置し、そして３７℃で一夜インキユ
ベーションした。フィルターを平板から持上げ、そして
フィブリンの溶解を起こすことができるコロニーをさら
に分析するため採取した。フィルターの反復実験のｕを
コロニーの免疫プロットアッセイのために同様に処理し
た。ｔ−ＰＡ様ポリペプチドを生産できるコロニーを同
定した。

ｐＤＲ８１７と表示する１つのプラスミドを詳しく特性
づけた。このプラスミドをＢａｍＨ’ｉおよびＸｂａＩ
で消化し、そして１２７０ｂｐのｔ−ＰＡ断片をゲル精
製し、そしてＭ１３ｍｐ１８　（複製形）中にサブクロ
ーニングした。インサートＤＮＡ配列をジデオキシ法に
よって決定した。結果は、ｐＤＲ８１７がヌクレオチド
１９２−５２４　　（番号はＰｅｎｎ１ｃａ、同上、に
基づく〕を欠いていることを示した。こうして、それは
第４Ａ図に示すようなアミノ末端をもつ４１６アミノ酸
から成る成熟タンパク質をコードする。天然ｔ−ＰＡの
アミノ酸２−１１２は欠失された。

Ｅ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）菌株ＪＭ１０５をｐＤＲ８
１６およびｐＤＲ８１７で形質転換した。非形質転換細
胞および形質転換体を、０．４％のグルコースおよび０
．２％のカザアミノ酸を補充したＭ９培地中で１夜増殖
させた。１０−のアリコートを各培地から取り、そして
細胞を収得した。誘導物質ＩＰＴＧ　（イソプロピルチ
オガラクトシド）を、培養物の残部に１ｍＭの最終濃度
に加えた。１２０分および２４０分間誘導後、１０ｍ１
のアリコートを取り、そして細胞を収穫した。細胞の沈
殿物を水で１回洗浄し、そして１００ｍＭのトリス、ｐ
Ｈ８，０、中の２０％のスクロースの４５０　ＩＩｌ中
に再懸濁させた。５０ｍ？のＥＤＴＡ中の５■／ｍＺの
リソチームの５０ｍの添加によって、細胞を溶解した。

混合物を室温で１０分間インキユヘーションし、５００
！ｉ！の細胞溶解緩衝液（０，３％のトリトンＸ−１０
０，１５０ミリモルのトリス、ｐＨ８，０，０，２モル
のＥＤＴＡ）を加え、そしてこの混合物を氷上に３０分
間装いた。リゼイトをベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　
５Ｗ５０ローター中で３５．０ＯＯｒｐｒ＠で１時間遠
心した。上澄みを取出し、そしてフィブリン溶解法によ
ってアッセイした。結果（第２表）が示すように、ｐＤ
Ｒ８１７構成体は全長のｔ−ＰＡクローンを使用して得
られたものよりも１０〜３０倍高いｔ−ＰＡ活性の生成
を指令した。

ＪＭ１０５　　　　　　　　　　　　　　　０Ｊ門１０
５　　　１２０分　　　　Ｏ ＪＭ１０５　　　２４０分　　　　０ ｐＤＲ８１６：ＪＭ１０５　　　　　　　　　　７．４
ｐＤＲ８１６：ＪＭ１０５　１２０分　　　５．０ｐＤ
Ｒ８１６：ＪＭ１０５　２４０分　　　７．４ｐＤＲ８
１７：ＪＭ１０５　　　　　　　　　１６０．０ｐＤＲ
８１７劉Ｍ１０５　　１２０分　　　　１５０．０ｐＤ
Ｒ８１７：ＪＭ１０５　２４０分　　１２０．０＊　　
ＩＰＴＧの添加後の時間。

（−）　ＩＰＴＧの添加前に採取した試料を示す。

形質転換した細胞および形質転換しない対照のアリコー
トを、ウェスターンプロットアッセイによりタンパク質
の生産ついて分析した。ＤＮＡ配列の分析によると、ｐ
ＤＲ８１７ｔ　−Ｐ　ＡポリペプチドはｐＤＲ８１６に
より生産されたポリペプチドよりもほぼ１００アミノ酸
だけ短いことが示された（第４Ａ図）　、　ｐＤＲ８１
７で形質転換したＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５は、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（八＋ｎｅｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ）に受託階５３４４６で受託された。

発現ベクターは以下の方法で構成した。プラスミドＺｅ
ｍ　８６　（実施例１に記載）を旧ｎｄｎ［を用いて分
解して、両端をＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏ
ｗフラグメント）を用いてフィルインした。次に、線形
化したＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いて分解し、ＳＶ４０複
製開始点配列を有する約４５０個の塩基対断片をゲル精
製し、Ｓｍａ　Ｉ　＋ＥｃｏＲＩで分解したｐＵｃ１３
に連結した。生成するベクターをｐＤＲ３００１と命名
した。プラスミドｐＤＲ３００１を５ａｌＩとＥｃｏＲ
Ｉで分解し、ＳＶ４０複製開始点とポリリンカー配列と
を有する約４５０個の塩基対を精製した。Ｚｅｍ　８６
をＥｃｏＲＩで部分的に分解し、Ｘｈｏｌで完全に分解
して、ＳＶ４０複製開始点配列を除去した。次に、ｐＤ
Ｒ３００１からのＳＶ４０断片を、線形化したＺｅｍ　
８６に連結した。

生成するプラスミドをｐＤＲ３００２と命名した（第５
図）。

哺乳類の細胞の発現ベクターを次に構成した。

プラスミドｐＤＲ３００２をＢａｍＨＩはＸｂａｌで分
解した。

実施例３Ｂに記載のバクテリアのベクターをＢａｍＨ■
とＸｂａｌとで分解し、ｔ−ＰＡ配列をゲル精製し、線
形化したｐＤＲ３００２に連結した。生成するベクター
（表３）ＳＶＩＯプロモーター変異ｔ−ＰＡ配列−ｈＧ
Ｈターミネータ−の発現単位を含む。ベクターｐＤＲ３
００４（第５図）はｐＤＲ８１７からの変異ｔ−ＰＡ配
列を有する。ｐＤＲ３００４からの一次翻訳生成物は、
第４Ａ図に示される配列を有することが予想される。ｐ
［１Ｒ３００４で形質転換したＥ、コリ　（ｈｃｏｌｊ
）　ＬＭ１０３５は、受託番号が５３４４５でＡｍｅｒ
ｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎに寄託された。

玉主人 連続的欠失変異のまとめ ｐＤＲ３００４ＡＧＡ　ＴＣＧ　ＴＧＣＡＣＣＡＡＣＫ
　、　　（部分）１１１３１１４１１５　　Ｋ２．　Ｓ
ＰＡｒｇ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　ＡｓｎｐＤＲ３０
０６ＡＧＡ　ＴＣＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＡＣＫ＋　　（
部分）１１３８１３９１４０　　Ｋ、　　、　ＳＰＡｒ
ｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＡｓｎｐＤＲ３００７Ａ
ＧＡ　ＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＴ　　Ｋ　＋　　（部分
）１１１４１１５１１６　　Ｋｚ　　、　ＳＰＡｒｇ　
Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＴｒｐｐＤＲ３００８ＡＧＡ
　ＴＣＧ　ＧＧＡ　ＡＡＣＡＧＴ　　Ｋｚ　　、　Ｓ　
Ｐｌ　１７６１７７１７８ Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　５ｅｒｐＤＲ３０１
０ＡＧＡ　ＴＣＧ　ＧＧＴ　ＧＣＣＴＣＣＫ　ｔ　　（
部分）１　１９８　１９９　２００　　３　ＰＡｒｇ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　　５ｅｒｐＤＲ３０１１ＡＧ
Ａ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＧＡ　ＡＣＣＫｔ　　、Ｓ　Ｐ
ｌ　　１７５　１７６　１７７ Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　ＡｓｎｐＤＲ３
０１２ＡＧＡ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＴＡＣＡＧＣＫ＋　　
（部分）１　１６２１６３　１６４　　　Ｋ、　　、　
　ＳＰＡｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　５ｅｒｐＤＲ
３０１３ＡＧＡ　ＴＣＣＴＧＣＣＡＧ　ＣＡＧ　　Ｇ　
Ｆ　（部分）１　６２　６３　６４　　　Ｋ、　　、に
２　。

Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　　　Ｓ　
ＰｐＤＲ３０１４ＡＧＡ　ＴＣＧ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　Ｔ
ＣＡ　　　Ｋｚ　　、　Ｓ　Ｐｌ　　１８４　１８５　
１８６ Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＳｅｒρＤＲ３０１
６ＡＧＡ　ＴＣＧ　ＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧ　Ｆ　（部分
）１　６０　６１　６２　　　Ｋ＋　　＋Ｋｚ　　。

Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ　　　Ｓ
　Ｐ”ＧＦ：成長因子、Ｋ１　：クリングルｌ、Ｋ２　
＝クリングル２、ＳＰ：セリン・プロテアーゼ。

第３表に記載のベクターは、標準的処理法に従って培養
した哺乳類の細胞をトランスフェクションするのに使用
される。対数的に増殖するＴＫ−子ハムスター腎臓（Ｂ
ＨＫ）細胞を用いてマウスの野性型ＤＨＦＲ遺伝子（ｐ
ＳＶ２−ＤＨＦＲ、Ｓｕｂｒａｍａｎｉ等、Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１１．Ｂｉｏｌ、　、上：　　８５４〜８６４頁、１
９８１年に開示）をコードする発現ベクターと変異ｔ−
ＰＡタンパク質をコードする発現ベクターとの混合物（
比率、１：１）を同時トランスフェクションした。トラ
ンスフェクションから２４時間後に、細胞に（リジン−
セファロースカラム上を通過させることによってプラス
ミノーゲンを除いた）１０％の胎児ウシ血清、アプロチ
ニン（１００単位／ｒｎり、ペニシリンおよび２５０ｍ
ＭのＭＴＸを含むＤｕｌｂｅｃｃ。

の改質Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥ）を加えた。細胞に、こ
の選択培地を引き続＜１０〜１４日間に亙り数回補給し
た。フィブリン・プレート法によって薬剤耐性コロニー
のｔ−ＰＡ活性をスクリーニングした。

ｌｐｇ／細胞／日より高い水準で活性タンパク質を産生
ずる細胞系を更に増幅し、希釈によってクローン化し、
そしてタンパク質と単離と特徴付けのためにスケールア
ップした。

上記の欠失変異株の３種類を選択して、更に特徴づけを
行った。これらは変異株３０１６　、３００４および３
００８に対応し、３種類の異なる領域に欠失を有してい
る（第３表参照）。これら３種類の試験した端が切除さ
れて分子総てを検出することができるモノクローナル抗
体を端が切除されたｔＰＡの検出のための一次抗体とし
て用いた。端が切除されたｔＰＡ類の検出の標準的なＥ
ＬＩＳＡ試験法を以下に示す。

端が切除されたｔＰＡのＥＬＩＳＡ法 １ｐｇ／ｍ１の緩衝液Ａ中モノクローン抗体１００１！
Ｉをプレートしく緩衝液Ａ　”　１００ｍＭのＮａｚＣ
Ｏ，、、ｐＨ９，６）； ４℃で一晩インキュベートし； 緩衝液Ｂで３回洗浄しく緩衝液Ｂ＝１０ｍＭのリン酸ナ
トリウム、ｐＨ７，２，１５０ｍＭのＮａＣＡ　、０．
５％のＴｗｅｅｎ２０　）　　； 緩衝液Ｃで３７℃で２時間ブロックしく緩衝液Ｃ＝緩衝
液Ｂ＋１％ＢＳＡ）； 試料を緩衝液Ｃに加え、３７℃でインキュベートい 緩衝液Ｂで３回洗浄し； ４．５ｎ／−のポリクローン・ウサギ抗−ｔＰＡを１０
０Ｉ加え； ３７℃で１時間インキュベートし； 緩衝液Ｂで３回洗浄し； ＨＲＰ結合ヤギ抗−ウサギを加え； 室温で１時間インキュベートシ； 緩衝液Ｂで４回洗浄し；そして、 発色させる。

変異タンパク質３００４および３００Ｂを、リジン−セ
ファロースカラム上で精製した。細胞培地を負荷緩衝液
（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，３，０，１Ｍ
のＮａＣ１，０，００５％のＴｗｅｅｎ８０．０．００
３Ｍ′のＮａＮ５）に対して一晩透析した。透析した溶
液を０．５ｍＺ／分でリジン−セファロースカラムに加
えた。カラムを負荷緩衝液で洗浄した後、結合した物質
を０．４　Ｍのアルギニンを含む負荷緩衝液で溶出し。

溶出液分画をＥＬＩＳＡおよびフィブリン溶解法によっ
て分析した。

フィブリン溶解法はＢｉｎｄｅｒ等の方法（Ｊ、Ｂｔｏ
ｌ。

Ｃｈｅｍ、　、　２５虹、１９９８頁、１９７９年）に
基づいている。

１０−のウシ・フィブリノーゲン溶？＆（０，０３６Ｍ
の酢酸ナトリウム、ｐ）１Ｂ、４．０．０３６Ｍのバル
ビツール・ナトリウム、０．１４５ＭのＮａＣｊ！、１
０−’ＭのＣａＣ１ｚ　、０．０２％ＮａＮ、中３．０
ｍｇ／ｍｉ）を、１．５％の同じ緩衝液中低融点アガロ
ースの溶液１０ｒｎｌに４０℃で加えた。この溶液に１
０１１１のウシ・トロンビン（５００単位／ｍりを加え
た。混合物をＧｅ１ｂｏｎｄアガロース支持シート（Ｍ
ａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ）に加えて、放冷した。

ウェルをアガロース中で切断して、ウェルに試験試料１
０Ｊｌｌ、及び０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン
酸緩衝食塩水１０Ｊ１１を添加した。結果を、精製した
ｔＰＡを用いて調製した標準曲線と比較した。ウェルの
周りの透明なハロの出現は、生物的に活性なプラスミノ
ーゲン・アクティベータの存在を示している。

ｔ−ＰＡのフィンガー領域及び生長因子領域をコードす
る配列を、Ｚｏｌｌｅｒ等のＭａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ａ
ｄｖａｎ−ｃｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　＋ｎ　　　
　　ｒ　　ｏｎｔｎ　　Ｃｏｕｒｓｅ。

’　　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ　　　Ｃ１。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ｔｏｒｙ−、１９８３年に記載の方法と本質的に同様に
して、部位特異的変異誘発によってｃＤＮＡから欠失さ
せた。オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ　３８０−　Ａ　　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装置上
で合成し、変性ゲル上で電気泳動によって精製した。

ゲノム配列およびｃＤＮＡｔ−ＰＡ配列を比較すること
によって正確な欠失をデザインした。フィンガー領域お
よび生長因子領域をコードするエクソンに対応するｃＤ
ＮＡの配列を欠失させた。

ｔ−ＰＡの配列を変異誘発させるための鋳型を調製する
ため、約１塀のＺｅｍ　９９をＢａｍ１（ＩおよびＥｃ
ｏＲＩ各１単位で分解した。ＤＮＡフラグメントを１％
アガロースゲル上で分離して、約７３０個の塩基対のＢ
ａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントをＮＡ−４５ＤＥ
ＡＥ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）
上に製造業者によって指示された方法で電気溶出した。

ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣ１２ｓで抽出して、Ｅ　ｔ
ＯＨで沈殿させた。精製したフラグメントを、次に、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼの存在で２４時間１２℃でＢａｍＨＩ
　＋ＥｃｏＲＩで分解したＭ１３ｍｐＢ　（複製型）と
共にインキュベートすることによって連結した。組換フ
ァージを、コンピテントＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　
ＪＭＩＯＩ中にトランスフェクションした。ファージＤ
ＮＡをプラクから精製し、ジデオキシ法によって配列決
定して、正しいｃＤＮＡ配列の存在を確かめた。単鎖Ｍ
１３鋳型ＤＮＡを調製して、変異誘発プライマーとして
オリゴヌクレオチドＺＣ４９０（５’　ＴＡＣＣＡＡＧ
ＴＧ　ＡＣＣＡＧＧ　ＧＣＣ３’　）を用いて部位特異
的変異誘発を行った。第二のプライマーとしてユニバー
サルＭ１３プライマーを用いた。２０ピコモルのホスホ
リル化した変異誘発性プライマーおよび２０ピコモルの
第二のプライマーと１０ｐ１の２０ｍＭトリス（ｐＨ７
，５）　、ｌ　ＯｍＭのＭｇＣ’ｚ　、５０ｍＭのＮａ
Ｃ４および１ｍＭのＤＴＴ中で１ピコモルの単鎖鋳型と
混合し、６５℃で１０分間インキュベートした後、室温
で５分間インキュベートし、氷上に置いた。２０ｍＭの
トリス（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭのＭｇＣｊ！ｚ　、
２ｍＭのＡ　Ｔ　Ｐ　、　　１　ｍＭのｄＮＴＰ類を含
む１０ｍＭのＤＴＴ、２．５単位のＫｌｅｎｏｗポリメ
ラーゼおよび３．５単位のＤＮＡリガーゼ１０ｍをアニ
ーリングしたＤＮＡに加えて、混合物を１５℃で３時間
インキュベートした。次いで、ＤＮＡをコンピテントＥ
、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＪＭＩＯＩにトランスフェ
クションして、細胞をＹＴ寒天上に置いて、３７℃で培
養した。プラークをニトロセルロースに移して、６　Ｘ
５ＳＣ％　１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液中でＴｍ−４℃
で変異誘発プライマーをブレ・ハイブリダイゼーション
し、同じ溶液中でＴｍ−４℃で３２ｐを標識した変異誘
発性プライマーにハイブリダイズせしめた。Ｔｍ−４℃
で３回洗浄した後、フィルターを一晩Ｘ線フィルムに暴
露した。変異プラークを同定するのに必要ならば、温度
を５℃高くして、更に洗浄工程を行った。変異したイン
サートをジデオキシ法によって配列させ、所望なループ
・アウトを有するクローンを選択した。ｔ−ＰＡをコー
ドする配列の残りに連結するときには、この配列は第４
Ｂ図に示したアミノ末端を有するタンパクをコードする
。

フィンガー配列および生長因子配列を欠失させる第二の
ストラテジーは、出発物質としてｔ−ｐＡコード配列を
有するプラスミドＩ）ＤＲ１４９６を用いる。ｐＤＲ１
４９６で形質転換したＳ、セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒ
　ｉｖ　ｉｓ　１ｎｅ）株Ｅ８−１１Ｃを受託番号２０
７２８はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託された。

ｔ−ＰＡ配列の変異誘発の鋳型を調製するため、１イの
ｐＤＲ１４９６を５ｐｈｌおよびＸｂａＩ各５単位で３
７℃で２時間分解した。ＤＮＡを０．７％アガロース・
ゲル上で電気泳動して約２１００の塩基対の断片を精製
した。この断片を、Ｓｐｈ　Ｉ　＋　Ｘｂａ　Ｉで分解
したＭ１３ｔｇ１３０　（複製型、Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製、Ｋｉｅｎｙ等、Ｇｅｎｅ２６．９１頁、１９８３年
）に連結してＭ１３ｔｇＢＯＷを形成せしめた。組換フ
ァージをＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０３中にト
ランスフェクションして単鎖鋳型ＤＮＡを調製した。オ
リゴヌクレオチド指令欠失変異誘発は、２０ｍＭのトリ
ス（ｐＨ７，５）、１０ｍＭのＭｇＣ’ｚ　、５０ｍＭ
のＮａＣｌ　％　　１　ｍＭのＤＴＴ中で２０ピコモル
のリン酸化変異誘発プライマー（配列：　５　’　ＣＧ
Ｔ　ＧＧＣＣＣＴ　ＧＧＴ　ＡＴＣＴＴＧ　ＧＴＡＡＣ
３’）と１ピコモルの鋳型ＤＮＡとを用いて６５℃にて
１０分間行った。次に、この混合物を室温で５分間イン
キュベートした後、氷上に置いた。２０ｍＭのトリス（
ｐＨ７，５）　、１０ｍＭの−ｇ（１２，２ｆｆｉＭの
ＡＴＰ、ＩＩＩＩＭのｄＮＴＰ類を含む１０ｍＭのＤＴ
Ｔ、２．５単位のＫｌｅｎｏｗフラグメントおよび３．
５単位のＴ、ＤＮＡリガーゼを含む１０μｌを加え、そ
してアニールしたＤＮＡ混合物を１５°Ｃで３時間イン
キュベートした。ＤＮＡをＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　
ＪＭ１０３中にトランスフェクションして細胞をＹＴ寒
天上に置いて３７°Ｃで培養した。プラージを実施例４
に記載の方法でスクリーニングした。フィンガー配列お
よび生長因子配列の所望の欠失を有する変異配列を、ク
ローン＃　２６００と命名した。コードされたタンパク
の配列を第６図に示す。

フィンガー配列、生長因子配列およびクリングル１配列
をコードする配列を、実施例４に記載の欠失方法に類似
の方法で、クローン化されたｃＤＮＡから除去した。こ
のループ・アウトは成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸４のコドン
とアミノ酸１７６のコドンを正確に連結し、フィンガー
領域、生長因子領域およびクリングル１領域をコードす
るエクソンに対応するＤＮＡ配列の欠失を生じさせた（
第４Ｃ図）。

Ｚｅｍ　９９からのプレープロおよび成熟配列の５′末
端を有する約７３０個の塩基対のＢａｍＨＩ　−Ｅｃｏ
ＲＩｔ−ＰＡ断片を調製し、そしてＭ１３ｍｐ１９　（
複製型）中にクローン化した。単鎖鋳型Ｄ　Ｎ　Ａを調
製し、そしてオリゴヌクレオチドＺＣ７２２（５’　Ａ
ＣＴ　ＧＴＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧ　ＧＴＡ　３　’　）
およびＭ１３ユニバーサル・プライマーを用いて変異誘
発を行った。変異プラークをスクリーニングして、配列
し、所望の変異を有するクローンを同定した。

フィンガー配列、生長因子配列およびクリングル１領域
は、実施例５に記載の単鎖Ｍ１３ｔｇ１３０Ｗ鋳型を用
いて第二の変異誘発において除去した。変異誘発は実施
例５に記載のように、配列５’ＧＣＡＧＴＣＡＣＴ　Ｇ
ＴＴ　ＴＣＣＴＴＧ　ＧＴＡ　ＡＣ３’を有するオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて行った。変異プラーク
を上記と同様にスクリーニングした。正確な欠失を有す
るクローンを＃　２７００と命名した。コードされたタ
ンパクの配列を第７図に示す。

以下余ｅ ス屓ＬＬＬ フィンガー領域、生長因子領域およびクリングル１領域
の欠失を有する成熟ｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ配列の
・５′部分を合成オリゴヌクレオチドから構成した。次
に、生成するフラグメントを３’ｃＤＮＡおよびブレー
プロ配列に連結した。

下記のオリゴヌクレオチドを用いた。

ＺＣ６３６： ５　’　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＡＣＣＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＡ
Ａ　ＡＣＡ　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＧＣＴＣＣＴ　　ＴＴＧ
　　ＧＧＡ　　ＡＴＧ　　ＧＧＴ　　ＣＡＧ　　３　　
’ＺＣ６３７： ５　’　ＴＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＣＣＣＡ　ＴＴＣＣＣＡ
　ＡＡＧ　ＴＡＧ　ＣＡＧ　ＴＣＡＣＴＧ　ＴＴＴ　Ｃ
ＣＣＡＣＴ　ＴＧＧ　ＴＡＡ　３　’ＺＣ６３８： ５　’　ＣＣＴ　ＡＣＣＧＴＧ　ＧＣＡ　ＣＧＣＡＣＡ
　ＧＣＣＴＣＡ　ＣＣＧ　ＡＧＴＣＧＧ　ＧＴＧ　ＣＣ
Ｔ　ＣＣＴ　ＧＣＣＴＣＣＣＧＴ　ＧＧ　３　’以下余
１ ＺＣ６３９： ５　　’　　ＡＡＴ　　ＴＣＣＡＣＧ　　ＧＧＡ　　Ｇ
ＧＣＡＧＧ　　ＡＧＧ　　ＣＡＣＣＣＧ　　ＡＣＴＣＧ
Ｇ　　ＴＧＡ　　ＧＧＣＴＧＴ　　ＧＣＧ　　ＴＧＣＣ
ＡＣＧＧ　３　　’４個のオリゴヌクレオチドをＴ４キ
ナーゼを用いて別々にリン酸化した。オリゴヌクレオチ
ドＺＣ６３５およびＺＣ６３７を、４４個の塩基対をオ
ーバーラツプさせて実施例１に記載の条件下でアニール
せめた。オリゴヌクレオチドＺＣ６３８およびＺＣ６３
９を、同様に４９個の塩基対をオーバーラツプさせてア
ニールせしめた。

変異ｔ−ＰＡ配列を含む哺乳類の細胞の発現ベクターを
構成するため、Ｚｅｍ　９９をＢｇｌＩＩを用いて完全
に分解し、ＥｃｏＲＩを用いて部分的に分解して、ｔ−
ＰＡ遺伝子の６００個の塩基対を有する５′部分を除去
した。ベクター、ｔ−ＰＡプレープロおよび３’ｔ−Ｐ
Ａ配列を有するフラグメントをゲル精製し、３部ライゲ
ーションで連結させて、対になったオリゴヌクレオチド
とした。暗号化されたタンパクのアミノ末端配列を第４
Ｃ図に示す。

以下余白 天［ 形質転換されたバクテリア細胞で発現させるために、複
製型のＤＮＡをＢｇｌｎで完全に分解し且つＥｃｏＲＩ
で部分的に分解することによって、上記の変異ｔ−ＰＡ
配列をそれぞれのＭ１３ベクターから取り出す。変異ｔ
−ＰＡ配列は、標準的な方法で精製する。

（実施例３に記載の）バクテリア発現ベクターｐＤＲ８
１６をＢｇｌｌｌおよびＸｂａｌで分解して、ｐｌｃ１
９Ｒ。

ＴＡＣプロモーター、ｔ−ＰＡプレープロおよびｔｒｐ
Ａターミネータ−配列を有する断片を精製する。

３’ｔ−ＰＡをコードする配列は、ｐＤＲ８１６のＥｃ
ｏＲＩ十ＸｂａＩ分解物から精製する。

３種の断片を三元連結で連結させて、完全な変異ｔ−Ｐ
Ａ配列を有するバクテリア性発現ベクターを構成する。

同様に、実施例８に記載のリン酸化されそしてアニーリ
ングしたオリゴヌクレオチドを、ＢｇｌＩＩで完全に分
解し且つＥｃｏＲＩで部分的に分解して成Ｐｔ　−Ｐ　
Ａ配列の５′部分の約６００塩基対を除去したｐＤＲ８
１６に挿入する。

生成するベクターを、Ｅ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）　
ＪＭ１０５を形質転換するのに使用する。形質転換され
た細胞を、０．４％グルコースおよび０．２％カザミノ
酸を添加したＭ９培地中で培養する。細胞を収得して、
細胞溶解させ、細胞破片を遠心分離によって除去した。

上澄液をフィブリン溶解分析法によってｔ−ＰＡについ
て分析し、ウェスタン・プロット分析法によってタンパ
ク生産を測定した。

上記実施例４，５，６．７および９に記載した変異体配
列を、ＳＶ４０またはＭＴ−１プロモーターおよびＤＨ
ＰＲ選択マーカーを含有する哺乳類細胞の発現ベクター
に挿入した。生成する発現ベクターをＴＫ−ＢＨＫ細胞
中にコトランスフェクションし、そして薬剤選択を適用
し、そしてトランスフェクトされた細胞系を選択し、タ
ンパク生産および特徴づけを行うためにスケールアップ
した。変異配列をＢｇｌ　ＩＩ　−Ａｐａ　Ｉ断片とし
てのクローン＃　２６００および＃　２７００から取り
出し、そしてＺｅｍ　９９　（実施例１）中に挿入した
。生成するベクターを、ｐＳＶ２−ＤＨＦＲＤ　Ｎ　Ａ
を用いて実施例３Ｃに記載したのと同様に、ＴＫ−ＢＨ
Ｋ細胞中にコトランスフェクションした。

プラスミドｐＵｃ１Ｂ　−８２０をＥｃｏＲＩおよびＲ
ａｍＨＩで分解し、変異ｔ−ＰＡ配列（６２０個の塩基
対）をｐＤＲ３００’２に挿入した。ｐ８２０と命名さ
れた生成するベクターを、上記と同様にしてＴＫ−ＢＨ
Ｘ細胞中にトランスフェクションした。

変異タンパク＃　２６００を、セファロースｅ（Ｐｈａ
ｒｍａ−ｃ４ａ製）上に固定したモノクローン抗体の２
．６ｘ２０ｃｌｌカラムで精製した。トランスフェクシ
ョンしたＢＨＫ細胞からの培養液を、このカラムに２０
０ｍ！／時の流速で４℃で加えた。カラムを０．５Ｍの
ＮａＣ１および２０ＩＵ／−のアプロチニンを含む０．
１　Ｍ　トリス−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡に
した。カラムを１０１００Ｏの上記緩衝液で洗浄し、ｔ
−ＰＡを５ＭのＫＳＣＮを含む同じ緩衝液で溶出した。

ｔ−ＰＡ分画を限外濾過によって５ｍ７の容積まで濃縮
して、１．５ＭのＫＳＣＮおよび０．５　ＭのＮａＣｊ
２を含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｊ２緩衝液（ｐＨ７，
５）で平衡にしたセファクリルＳ　　２００　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ製）のカラム（２，６ｘ９０ｃｍ）に加え
た。カラムを同じ緩衝液を用いて２５−７時の流速で展
開した。

ｔ−ＰＡ分画を限外濾過によって濃縮し、ＩＭの重炭酸
アンモニウムで平衡にしたセファデックスＧ　−２５（
ＰＤＩＯ１Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）のカラム上でゲル濾
過を行った。生成する精製されたタンパクをマンニトー
ルの存在で凍結乾燥した。

変異ｔ　−Ｐ　Ａ２７００を含む培養液をＩＭのＮａｆ
Ｊおよび２０にＩＵ／−のアプロチニンを含む５０ＩＩ
ＩＭのトリス−１１Ｃｊｌ緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡
にした亜鉛キレート化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ製）のカラム（５ｘ２０ａａ）に４００＋ｎｊ／時の
流速で４℃で加えた。カラムを２０００１１１７の同じ
緩衝液で洗浄した。

ｔ−ＰＡを、同じ緩衝液においてイミダゾールの濃度を
０〜５０ｍＭの範囲で徐々に増加させることによって溶
出させた。ｔ−ＰＡ分画をＩＭのＮａＣ１を含む１０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡にし
たセファロース４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）と結
合させたコンカナバリンＡのカラム（２，６ｘ２０ｃｍ
）に直接３０−７時の流速で加えた。カラムを同じ緩衝
液で洗浄した。ｔ−ＰＡをＩＭのＮａＣ１，２０ＫＩＵ
／ｍ７のアプロチニンおよび２ＭのＫＳＣＮを含む１０
ｍＭのリン酸ナトリウム上でα−メチルアマノシトの濃
度を０〜０．４Ｍの範囲で徐々に増加させることによっ
て溶出させた。ｔ−ｐＡ分画を限外濾過によって約５−
にまで濃縮して、１．５ＭのＫＳＣＮおよびＩＭのＮａ
Ｃｌ１を含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）
で平衡化したセファクリルＳ−２００のカラム（２，６
ｘ　９０ｃｍ）に加えた。

カラムを同じ緩衝液を用いて２５−７時の流速で展開し
、ｔ−ＰＡ分画を纏めて、濃縮し、脱塩し、上記と同様
にして凍結乾燥した。

２６００および２７００変異ｔ−ＰＡ分子の血漿クリア
ランスを、ラットで試験した。雄の５ｐｒａｑｕｅ　Ｄ
ａｗ−Ｉｅｙラット（体重２３０ｇ〜２７０ｇ）に０．
４＊／ｋｇ体重の１２５Ｉを標識した変異ｔ−ＰＡまた
はトランスフェクションされたＢＨＫ細胞から精製した
標準の組換ｔ−ＰＡを注射した。注射は大腿静脈から行
った。血液試料（０，５ｍＺ）を頚静脈から採取し、ア
フィニティー精製ポリクローン・ウサギ抗体を用いてサ
ンドイッチＥＬＩＳＡによってｔ−ＰＡタンパクを測定
した。第４表に示される結果は、変異タンパクが標準の
ｔ−ＰＡのほぼ５倍の血漿半減基を有することを示して
いる。

第土斐 変異ｔ−ＰＡの血漿半減類 タンパク　　　　α相（分）　　β相（分）標準ｔ　−
Ｐ　Ａ　　　　　　１．７　　　　　４０２７００　　
　　　　　　　９．６　　　　　８４変質タンパク３０
０８および２６００を精製して、生体内での半減期につ
いて試験した。変異タンパク３００８　、２６００又は
標準のｔ−ＰＡ　（対照物）を産生ずる細胞を含むコン
フルエントに達しない７５ｃｊフラスコを、１００Ｕ／
−のペニシリン、１００■／−ストレプトマイシンおよ
び１００Ｉ４／−アプロチニンを含みメチオニンを含ま
ないｌＱｍｌのＤｕｌｂｅｃｃ。

のＭＥＭで洗浄した。細胞を１ｍｃｉの３５８−メチオ
ニン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社製）
を含む同じ培地１０−で３７℃で２０時間培養した。上
澄液を２００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し、−２０℃
で保管した。非放射性ｔ−ＰＡが、１０００／ｍ７のペ
ニシリン、１００ｎ／−のストレプトマイシンおよび１
００■／ｍＩのアプロチニンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ培
地中に保持された１２００ｃｄ　）レーに細胞層から得
られた。

約４００　ｍｊの培養液を集めた。纏めた細胞培養液に
ＮａＣ１およびＴｗｅｅｎ　８０をそれぞれＩＭおよび
０．２％の濃度で加えた。ｐＨを７．５に調整した。０
．４５μ上で濾過した後、変異体をモノクローン抗体上
でイムノソーベント・クロマトグラフィを用いて精製し
た。

精製したｔ−ＰＡ変異体は、主として単一鎖の形である
ことが分かった。比活性をフィブリン・プレート法によ
って測定した。第５表にその結果を示す。

以下余白 第」巳表 タンパク　　　比活性（ＩＵ／■タンパク）標準ｔ　−
Ｐ　Ａ　　　　　　４００，０００３００８　　　　　
　　　　５９０、０００２６００　　　　　　　　　３
８０　、０００変異タンパク３００８およびび２６００
の生体内半減期を測定した。雌のＷｉｓｔｅｒラットを
麻酔して、頚静脈および頚動脈中にカテーテルを配置し
て、それぞれ静脈内投与を行い、試料を採取した。試験
溶液を投与する１０分前にヘパリン（Ｉｎ＋ｇ／ｋｇ体
重）を静脈内投与した。０．２５〜０．５−の試験溶液
を投与する前および２，３．４．６および８分後に、約
２５０４の血液試料を採取した。血漿中の放射能を液体
シンチレーションによって測定し、半減期を１コンパー
トメントモデルを用いて線形回帰によって計算した。半
減期（３〜５回の実験の平均）は下記のようになった。

元のｔ−ＰＡ、２．３分；３００８．１２分；および２
６００．１７分。

以下余白 尖ｆ 酵母で発現させるため、変異ｔ−ＰＡ配列を、実施例Ｉ
Ｏに記載されているバクテリア性ベクターからＢｇｌＩ
［ＸｂａＩフラグメントとして切り出した。

プラスミドｐＤＲ１４９６はＳ、セレビシェ−（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｔ　Ｐ　Ｉプロモーター（Ａ
ｌｂｅｒ、　Ｋａｗａｓａｋｉ　。

ムム肛卸匹副匹射、上、４１９〜４３４頁、１９８２年
）、Ｓ、セレビシェ−（Ｓ、ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅ　）
　Ｍ　Ｆ　１シグナル配列（Ｋｕｒｊａｎ、Ｈｅｒｓｋ
ｏｗｉｔｚ、Ｃｅ１ｌ、３０　ｓ　　９３３〜９４３頁
、１９８２年および米国特許第４．５４６．０８２号明
細書）、ｔ−ＰＡコード配列およびＳ、セレビシェ−（
Ｓ、ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅ）　Ｔ　Ｐ　Ｔターミネータ
−（Ａｌｂｅｒ。

Ｋａｗａｓａｋｉ、同上）を含有する酵母発現ベクター
である。ｐＤＲ１４９６で形質転換されたＳ、セレビシ
ェ−（Ｓ、ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅ　）株Ｅ８−１１ｃを
、受託番号２０７２８でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託した。プ
ラスミドを標準的な方法によって形質転換体から単離す
る。ｔ−ＰＡ配列をＢｇｌＩＩおよびＸｂａｌで部分的
に分解することによって、ｐＤＲ１４９６から切り出し
た。１２．２ｋｂベクタ一断片を精製してＢｇｌ　ＩＩ
　−Ｘｂａ　Ｉ変異ｔ−ＰＡ配列に連結した。

発現ベクターを使用して、Ｓ、セレビシェ−（Ｓ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ　）株Ｅ８−１１Ｃを形質転換する。

細胞を２％グルコースおよび０．１Ｍリン酸水素カリウ
ム（ｐＨ５，５）を加えたｌｅｕ培地中で３０°で培養
する。細胞を、対数増殖期に取り出し、そして遠心分離
によって集め、破砕して、ライセードのｔ−ＰＡ活性を
測定する。

上記の説明から、本発明の特定の態様を説明のために記
載したのであり、発明の精神および範囲から離反するこ
と無く各種変更を行うことが可能であることが理解され
るであろう。したがって、本発明は特許請求の範囲によ
って制限されることを除いては制限されない。

【図面の簡単な説明】

第１−１図〜第１−３図は、ｃＤＮＡから構成されたプ
レープロコード配列および合成オリゴヌクレオチド、な
らびにコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す。 行より上の数字はヌクレオチドの位置を示し、そして行
より下の数字はアミノ酸の位置を示す。 第２図は、ベクターＺｅｍ　９９の構成を示す。 第３図は、ｔ−ＰＡ発現ベクターｐＤＲ８１７の構成を
示す。 第４図は、ここで説明するいくつかの変形を−ＰＡ分子
の７ミノ末端の比較を示す。 第５図は、プラスミドｐＤＲ３００２およびｐ［１Ｒ３
０Ｑ２から誘導されたｔ−ＰＡベクターの構成を示す。 第６−１図及び第６−２図は、フィンガー領域および生
長因子領域を欠失する変異体ｔ−ＰＡタンパク質のアミ
ノ酸配列、およびこのタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を示す。 第７−１図〜第７−３図は、フィンガー領域、生長因子
領域およびクリングル１領域を欠く変異体ｔ−ＰＡタン
パク質のアミノ酸配列、ならびにこのタンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列を示す。 以下余白 Ｑ　　　Ｑフ　　（ＪＩａ　　＜コ く　　　トω　　０−　　く− ＜　　　　ｕｐ　　　ａ＜　　　ａ。 ト　の　　　　ＯＱ：　　　　　　　　Ｑ＞　　　　　
　　リ　Ｘ＜−０＜Ｉ′Ｉ　　ＬＪ＝、　　　０−ｓＵ
＝　へくく　　じＱ　　ＯＯ ←ＱシフＵＩ＋＜〉へ ’　　”　　　　　　［＋ＧＩ　　　　　　ＱＯＪ　　
　　　　Ｑ　　−〇く　　Ｑ−くの　　Ｑａ ０　　つ　　　　　　　　く　　）　　　　　　　　じ
　　■　　　　　　　　リ　　−＜＋＠　　　シω　　
０１＋　　リω （ｊ　Ｑ　　　（−＋　−１（Ｊ　＜　　　１＋（イ）
＠の　　９い　　−−９乙 くシ　　く・＠　　　Ｑ、Ｃ＜の く−〇＝　　にｈ　　　ｏ＜ ？ＯＱ＊Ｑ二Ｑ〇 すり、　　　（ＪＩＪ　　　＜力　　←ωｆＪｏ＋　　
←ω　　に＜８４ ｈｌ、　　　（ＯＵＱ、　　　○仁 Ｕω　　Ｑ−にの　　く切 ８の　　り山　　０く　　くく Ｃ〕ＱｕＱｕＯ＜１０ トω　　く為　　Ｑ、ｅ１５り一 ←−トド　　くト　ヘ０く Ｑの０フｔＪ＋○＝ Ｑ、Ｉ　　　［＋ω　　ヒロ　　くＨ ａ＜　　　ＵＪ　　　ａ＞　　　ｕ○ じ）　　く■　　く−　　リ０ く−→すＩ＋Ｃ，ｃ（〕・− ａａ　　　＜＜　　　＜−し− ｈｕＸ　　ｕ−＋　　に■　　０メ く・−ヒ０　　０−　０−＋ Ｕ＝　　じ〉　　くく　　りり ＣＣＣＣＴＧ　　ＧＴＧ　　ＴＣ；Ｔ　　ＣＴＧ　　Ａ
ＡＣＧＡ’ｌ’　　ＧＧＣＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃ
ｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＧｌｙＡＧＣＴにＧ　
　ＧＧＣＣＴＧ　　ＧＧＣＴＧＴ　　ＧＧＡ　　ＣＡＧ
Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　（Ｊｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　（
Ｊｙ　ＧｉｎＡＡＧ　　ＧＴＴ　　ＡＣＣＡＡＣＴＡＣ
Ｃ’ｌ’Ａ　　ＧＡＣＴＧＧＬｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　
Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＴｒｐＣＧＣＡＴに
　　八ＣＴ　　’ｒ’ｌ°Ｇ　　ＧＴに　　ＧにＣＡＴ
Ｃ△１°ＣＡｒｇ　　Ｍｅｔ：　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　
　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　ＩｌｅＡＡＧ　　に
ＡＴ　　ＧＴＣＣＣＧ　　ＣＧＴ　　ＧＴＧ　　ＴＡＣ
ＡＣＡＬｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　ＴｈｒＡＴＴ　　ＣＧＴ　
　ＧＡＣＡＡＣＡ’ｒＧ　　ＣＧＡ　　ＣＣＧ　　ＴＧ
Ａ工１ｅ　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｍｅヒ　
Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　”真★−今

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フィブリン結合領域をコードする第一の領域と該第
   一の領域の下流に位置した第二の領域とから本質的に成
   るヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構造体であり、上記第
   二の領域が組織プラスミノーゲンアクティベーター（ｔ
   −ＰＡ）のセリン・プロテアーゼ活性の触媒領域をコー
   ドし、該配列がｔ−ＰＡと実質的に同一の生物活性を有
   するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ構
   造体。 ２、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が少な
   くとも１個のクリングル構造をコードする、特許請求の
   範囲第１項記載のＤＮＡ構造体。 ３、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が２個
   のクリングル構造をコードする、特許請求の範囲第１項
   記載のＤＮＡ構造体。 ４、２個のクリングル構造がそれぞれｔ−ＰＡのｋ＿２
   クリングル構造のアミノ酸配列を本質的に有する、特許
   請求の範囲第３項記載のＤＮＡ構造体。 ５、フィブリン結合領域をコードする第一の領域がｔ−
   ＰＡのｋ＿１およびｋ＿２クリングル構造をコードする
   特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構造体。 ６、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が少な
   くとも１個のフィンガー領域をコードする特許請求の範
   囲第１項記載のＤＮＡ構造体。 ７、第二の領域によってコードされる触媒領域が本質的
   にｔ−ＰＡのセリン・プロテアーゼ領域である、特許請
   求の範囲第１項記載のＤＮＡ構造体。 ８、触媒領域をコードする第二の領域が、アミノ酸番号
   ２７６から伸びてアミノ酸番号５２７まで続いている、
   第１図記載のｔ−ＰＡのアミノ酸配列を本質的に暗号化
   する、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構造体。 ９、実質的にｔ−ＰＡと同じ生物活性を有するタンパク
   質を発現させることができる発現ベクターであって、上
   記ベクターがプロモーターを有し、該プロモーターはヌ
   クレオチド配列に作用可能に連結されており、該ヌクレ
   オチド配列はフィブリン結合領域をコードする第一の領
   域と該第一の領域の下流に配置された第二の領域とから
   本質的になり、該第二の領域はｔ−ＰＡのセリン・プロ
   テアーゼ活性の触媒領域をコードし、前記配列はｔ−Ｐ
   Ａと実質的に同じ生物活性を有するタンパク質をコード
   することを特徴とする発現ベクター。 １０、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が少
   なくとも１個のクリングル構造をコードする、特許請求
   の範囲第９項記載のベクター。 １１、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が２
   個のクリングル構造をコードする、特許請求の範囲第９
   項記載のベクター。 １２、２個のクリングル構造がそれぞれｔ−ＰＡのｋ＿
   ２クリングル構造のアミノ酸配列を本質的に有する、特
   許請求の範囲第１１項記載のベクター。 １３、フィブリン結合領域をコードする第一の領域がｔ
   −ＰＡのｋ＿１およびｋ＿２クリングル構造をコードす
   る、特許請求の範囲第１１項記載のベクター。 １４、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が少
   なくとも１種のフィンガー領域をコードする、特許請求
   の範囲第９項記載のベクター。 １５、第二の領域によってコードされる触媒領域が本質
   的にｔ−ＰＡのセリン・プロテアーゼ領域である、特許
   請求の範囲第９項記載のベクター。 １６、触媒領域をコードする第二の領域が、アミノ酸番
   号２７６から伸びてアミノ酸番号５２７まで続いている
   、第１図記載のｔ−ＰＡのアミノ酸配列を本質的にコー
   ドする、特許請求の範囲第９項記載のベクター。 １７、フィブリン結合領域をコードする第一の領域から
   本質的になるヌクレオチド配列に作用可能に連結された
   プロモーターと、上記第一の領域の下流に配置された第
   二の領域であってｔ−ＰＡのセリン・プロテアーゼ活性
   の触媒領域をコードする領域とを含有するＤＮＡ構造体
   を含み、該配列がｔ−ＰＡと実質的に同じ生物活性を有
   するタンパク質をコードすることを特徴とする細胞。 １８、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が少
   なくとも１個のクリングル構造をコードする、特許請求
   の範囲第１７項記載の細胞。 １９、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が２
   個のクリングル構造をコードする、特許請求の範囲第１
   ７項記載の細胞。 ２０、２個のクリングル構造がそれぞれｔ−ＰＡのｋ＿
   ２クリングル構造のアミノ酸配列を本質的に有する、特
   許請求の範囲第１９項記載の細胞。 ２１、フィブリン結合領域をコードする第一の領域がｔ
   −ＰＡのｋ＿１およびｋ＿２クリングル構造をコードす
   る、特許請求の範囲第１７項記載の細胞。 ２２、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が少
   なくとも１種のフィンガー領域をコードする、特許請求
   の範囲第１７項記載の細胞。 ２３、第二の領域によってコードされる触媒領域が本質
   的にｔ−ＰＡのセリン・プロテアーゼ領域である、特許
   請求の範囲第１７項記載の細胞。 ２４、触媒領域をコードする第二の領域が、アミノ酸番
   号２７６から伸びてアミノ酸番号５２７まで続いている
   、第１図記載のｔ−ＰＡのアミノ酸配列を本質的にコー
   ドする、特許請求の範囲第１７項記載の細胞。 ２５、上記細胞が酵母細胞である、特許請求の範囲第１
   ７項記載の細胞。 ２６、上記細胞がバクテリア性細胞である、特許請求の
   範囲第１７項記載の細胞。 ２７、上記細胞が哺乳類の細胞である、特許請求の範囲
   第１７項記載の細胞。 ２８、ｔ−ＰＡと実質的に同様な生物活性を有するタン
   パク質の製造法であって、 フィブリン結合領域をコードする第一の領域から本質的
   になるヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモ
   ーターと、上記第一の領域の下流に配置された第二の領
   域であってｔ−ＰＡのセリン・プロテアーゼ活性の触媒
   領域をコードする領域とを有し、ＰＡと実質的に同じ生
   物活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とす
   るＤＮＡ構造体を細胞中に挿入して、 上記細胞を適当な培地中で増殖させ、 上記細胞によって産生される該ＤＮＡ構造体によりコー
   ドされたクンパク質生成物を単離することを含んで成る
   、タンパク質の製造法。 ２９、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が少
   なくとも１個のクリングル構造をコードする、特許請求
   の範囲第２８項記載の方法。 ３０、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が２
   種のクリングル構造をコードする、特許請求の範囲第２
   ８項記載の方法。 ３１、２個のクリングル構造がそれぞｔ−ＰＡのｋ＿２
   クリングル構造のアミノ酸配列を本質的に有する、特許
   請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２、フィブリン結合領域をコードする第一の領域がｔ
   −ＰＡのｋ＿１およびｋ＿２クリングル構造をコードす
   る、特許請求の範囲第３０項記載の方法。 ３３、フィブリン結合領域をコードする第一の領域が少
   なくとも１種のフィンガー領域をコードする、特許請求
   の範囲第２８項記載の方法。 ３４、第二の領域によってコードされる触媒領域が本質
   的にｔ−ＰＡのセリン・プロテアーゼ領域である、特許
   請求の範囲第２８項記載の方法。 ３５、触媒領域をコードする第二の領域が、アミノ酸番
   号２７６から伸びてアミノ酸番号５２７まで続いている
   、第１図記載のｔ−ＰＡのアミノ酸配列を本質的にコー
   ドする、特許請求の範囲第２８項記載の方法。 ３６、上記細胞が酵母細胞である、特許請求の範囲第２
   ８項記載の方法。 ３７、上記細胞がバクテリア性細胞である、特許請求の
   範囲第２８項記載の方法。 ３８、上記細胞が哺乳類の細胞である、特許請求の範囲
   第２８項記載の方法。 ３９、ｔ−ＰＡと実質的に同様な生物活性を有するタン
   パク質の製造法であって、アミノ末端フィブリン結合領
   域とカルボキシル末端セリン・プロテアーゼ領域とから
   本質的になるタンパク質。 ４０、フィブリン結合領域が少なくとも１個のクリング
   ル構造を有する、特許請求の範囲第３９項記載のタンパ
   ク質。 ４１、フィブリン結合領域が２個のクリングル構造を有
   する、特許請求の範囲第３９項記載のタンパク質。 ４２、２個のクリングル構造がそれぞれｔ−ＰＡのｋ＿
   ２クリングル構造のアミノ酸配列を本質的に有する、特
   許請求の範囲第４１項記載のタンパク質。 ４３、フィブリン結合領域がｔ−ＰＡのｋ＿１およびｋ
   ＿２クリングル構造を有する、特許請求の範囲第４１項
   記載のタンパク質。 ４４、フィブリン結合領域が少なくとも１種のフィンガ
   ー領域を有する、特許請求の範囲第３９項記載のタンパ
   ク質。 ４５、セリン・プロテアーゼ領域がｔ−ＰＡのセリン・
   プロテアーゼ領域のアミノ酸配列を本質的に有する、特
   許請求の範囲第３９項記載のタンパク質。