JPH05344892A - Ｔｐａ同族体をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 改良されたＴＰＡ同族体をコードするＤＮＡ
を提供する。 【構成】 ９００００ダルトン未満の分子量を有し、お
よび、その天然の順序がＦＧＫ１Ｋ２ＡであるＴＰＡと
比較して、ＦＫ２Ａ、ＦＫ２Ｋ２ＡまたはＦＫ１Ｋ２Ａ
の順序を有し、ここに、Ｆはフィンガードメインであ
り、Ｇは成長因子ドメインであり、Ｋ１およびＫ２はク
リングル１および２ドメインであって、Ａは活性部位で
あるＴＰＡ様蛋白をコードし、かつインタードメイン領
域をコードするヌクレオチド配列内に、該ドメイン領域
をコードするヌクレオチド配列に存在しない非天然エン
ドヌクレアーゼ制限部位を含有するＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター(ＴＰＡ)同族体をコードする組換体デ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）に関する。該同族体は天然ド
メイン領域が再配置された、欠失された、付加されたま
たはそれらを組合せた処理をされたのいずれかであるＴ
ＰＡ様分子である。該同族体は本発明のＤＮＡの発現の
産生物である。さらに、本明細書中には前記ＴＰＡ−コ
ーティングＤＮＡ配列を含有する複製および発現プラス
ミドならびに適当なプラスミドで形質転換された状態と
なった後、ＴＰＡ同族体を発現することができる適当な
宿主微生物を記載する。

【０００２】

【従来の技術】ＴＰＡは、血餅が形成されるときに該血
餅を溶解するのを補助することによって血液凝固を治療
するのに治療価値を有する。血栓崩壊はフィブリン塊溶
解の過程である。その目的のためには、その不活性チモ
ーゲン、プラスミノーゲンからセリンプロテアーゼプラ
スミンが形成される。プラスミノーゲンの活性化はプラ
スミノーゲンアクチベーターと呼ばれる一群のセリンプ
ロテアーゼによる蛋白質加水分解切断によって構成され
る。これらのアクチベーターはほとんどの体液中に存在
し、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を開始す
る。これにより、少量のプラスミノーゲンアクチベータ
ーが多量のプラスミノーゲンを活性化することができる
カスケードが作られる。in vivo において、プラスミノ
ーゲンアクチベーターはプラスミノーゲンをプラスミン
に活性化し、次いでプラスミンが作用してフィブリン塊
を分解する。血餅溶解に対して生理学的に重要であるプ
ラスミノーゲンアクチベーターはＴＰＡである。

【０００３】ＴＰＡは、血管内皮細胞によって産生され
る分子量が約６６０００ダルトンのセリンプロテアーゼ
である。それはグリコシル化されており、その唯一の公
知蛋白質基質はプラスミノーゲンである。ＴＰＡは５種
のドメイン:フィブロネクチンフィンガー(finger)ドメ
イン(Ｆ)、発育因子(growth factor)ドメイン(Ｇ)、ク
リングル(kringle)１ドメイン(Ｋ１)、クリングル(krin
gle)２ドメイン(Ｋ２)および活性部位ドメイン(Ａ)を有
する。これらのドメインの１またはそれ以上はＴＰＡの
特別のフィブリン結合活性を担っている。

【０００４】そのフィブリン親和性に加え、プラスミノ
ーゲンの活性化はフィブリンの存在において促進され
る。ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼの如き他の
血餅分解薬剤はフィブリン塊に対する特異性を全く持っ
ていないので、これらの特性はＴＰＡを価値ある治療剤
とする。

【０００５】該ドメインを操作することによって、フィ
ブリンに対する天然酵素の親和性を改良し、その in vi
vo 半減期を増大させることが可能である。より具体的
には、クリングル(Ｋringle)２またはフィンガー(Ｆing
er)ドメインの複製はフィブリン親和性を促進するであ
ろう。発育因子ドメインの除去は in vivo 半減期を増
加させ、フィンガー(finger)領域ドメインをクリングル
(kringle)領域１または２の次に置くとフィブリン親和
性を高めるであろう。

【０００６】ヒトＴＰＡは精製され、その物理特性が研
究されてきた。リジケンら(Ｒijkenet al.)、「培養中の
ヒト黒色腫細胞により分泌されたプラスミノーゲンアク
チベーターの精製および特徴づけ」、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhe
m．)、２５６巻、Ｎo．１３、７０３５〜４１頁(１９８
１年７月１０日)。実験量のヒトＴＰＡはヒト黒色腫細
胞の培地から得られる。クルフト・シイら(Ｋluft、Ｃ
et al.)、アドバーンシズ・イン・バイオテクノロジカ
ル・プロセシズ(Ａdvances in Ｂiotecchnological Ｐr
ocesses)中の「ヒト黒色腫細胞からの外来性(組織タイ
プ)プラスミノーゲンアクチベーターの大規模産生」、ミ
ズラヒ・エイおよびウエゼル・エイ・エル(Ｍizrahi、
Ａ.and Ｗezel、Ａ.Ｌ.)編、２:９７〜１１０(１９８
３)。ヒトＴＰＡのバイオ活性は研究されており、生命
を脅かす血液凝固物を分解するその能力により、動物モ
デルおよびヒトにおいて治療価値を有することが証明さ
れている。コルニンガーら(Ｋorninger et al.)、「大腿
静脈血栓症を有するイヌにおけるヒト外来性(組織タイ
プ)プラスミノーゲンアクチベーターを用いる血栓崩
壊」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲ
ーション(Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.)、６９巻、５７３〜５８
０頁(１９８２年３月); ワイマールら(Ｗeimar et a
l.)、「外来性(組織タイプ)プラスミノーゲンアクチベー
ターの投与による腸骨大腿血栓の特異的溶解」、ザ・ラ
ンセット(Ｔhe Ｌancet)、１０１８〜２０頁(１９８１
年１１月７日); およびバン・デ・ウエルフ・エフら(Ｖ
an Ｄe Ｗerf、Ｆ.et al.)、進展した心筋梗塞を持つ患
者における組織タイププラスミノーゲンアクチベーター
を用いる冠血栓崩壊、ジャーナル・オブ・ニュー・イン
グランド・メディシン(Ｊ.of Ｎ.Ｅng.Ｍed.)、３１０:
６０９〜６１３(１９８４)。ＴＰＡの半減期は２〜３分
であると見積られており、そのため、非実用的ではない
にせよ、治療剤として使用するには不都合となってい
る。コレン、デイら(Ｃollen、Ｄ.et al.)、組織タイプ
プラスミノーゲンアクチベーターを用いる血塊−選択的
冠血栓崩壊、サイエンス(Ｓcience)、２２０:１１８１
〜１１８３(１９８３)。

【０００７】ＴＰＡの酵素反応機構は研究されてきた。
リジケンら(Ｒijken et al.)、「一本鎖および二本鎖ヒ
ト外来性(組織タイプ)プラスミノーゲンアクチベーター
のフィブリン溶解現象特性」、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)、２５７
巻:２９２０〜２９２５(１９８２)。他の動物の血塊に
ついてよりもヒト血塊についてより優れたヒトＴＰＡの
結合親和性およびフィブリン溶解親和性は公知である。
コルニンガーら(Ｋorninger et al.)、「in virtoでのヒ
ト血液および各種動物種におけるヒト外来性(組織タイ
プ)プラスミノーゲンアクチベーターの特異的フィブリ
ン溶解現象特性についての研究」、スロンボウシウ・ア
ンド・ヘマトスタシス(Ｔhrombos.Ｈaemostas.)、４６
(２): ５６１〜５６５(１９８１)。フィブリン溶解活性
および親和性に関するドメインの構造関係も記載されて
きた。バヌアイ・エルら(Ｂanyai、Ｌ.et al.)、フィブ
ロネクチンおよび組織タイププラスミノーゲンアクチベ
ーターのフィブリン結合構造の共通の進化的起源、エフ
・イー・ビイ・エス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)、１
６３(１): ３７〜４１(１９８３)およびヌイ・テイら
(Ｎy、Ｔ.et al.)、ヒト組織タイププラスミノーゲンア
クチベーター遺伝子の構造: 機能および構造ドメインに
対するイントロンおよびエクソン構造の関係、プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)ＵＳＡ、８１:５
３５５〜５３５９(１９８４)。

【０００８】形質転換した細菌および酵母によるＴＰＡ
の発現も公知である。ヒトＴＰＡのメッセンジャーリボ
核酸(ＲＮＡ)は最初１９８２年に単離された。オプデン
アッカーら(Ｏpdenakker et al.)、「ヒト組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターについてのメッセンジャーＲＮ
Ａ」、ユアロピーアン・ジャーナル・オブ・バイオロジ
ー(Ｅur.Ｊ.Ｂiol.)、２６９〜７４頁(１９８２)。ペニ
カら(Ｐennica et al.)によって、ＴＰＡの発現用に細
菌が形質転換された。「イー・コリ(Ｅ．coli)における
ヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターcＣＮ
Ａのクローニングおよび発現」、ネイチャー(Ｎature)、
３０１:２１４〜２１(１９８３)。ヒトＴＰＡを発現す
るための酵母を形質転換する方法は米国特許出願ＳＮ
６６３０２５号および公開されたヨーロッパ特許出願Ｅ
Ｐ １４３０８１号に記載されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、改良
されたヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターをコー
ドするＤＮＡの提供にある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝子組換え
によって天然ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター
のドメイン領域を再配置することによる該蛋白質の改良
された薬理学効果に関する。該改良された効果は延長さ
れた半減期および増大されたフィブリン親和性を包含す
る。本明細書中にて開示するのは、ドメインの好都合な
切断および再配置に有用であるユニークな制限部位をＴ
ＰＡのインタードメイン領域内に含有するＤＮＡ配列で
ある。また、このＴＰＡをコード付けするＤＮＡを含有
するプラスミドおよび再配置されたＴＰＡを発現する適
当な宿主も記載する。最後に再配置したＴＰＡ蛋白質を
記載する。

【００１１】具体的には、本発明は、９００００ダルト
ン未満の分子量を有し、および、その天然の順序がＦＧ
Ｋ１Ｋ２ＡであるＴＰＡと比較して、ＦＫ２Ａ、ＦＫ２
Ｋ２ＡまたはＦＫ１Ｋ２Ａの順序を有し、ここに、Ｆは
フィンガードメインであり、Ｇは成長因子ドメインであ
り、Ｋ１およびＫ２はクリングル１および２ドメインで
あって、Ａは活性部位であるＴＰＡ様蛋白をコードし、
かつインタードメイン領域をコードするヌクレオチド配
列内に、該ドメイン領域をコードするヌクレオチド配列
に存在しない非天然エンドヌクレアーゼ制限部位を含有
するＤＮＡを提供する。

【００１２】さらに具体的には、Ｘba部位がヌクレオチ
ド塩基１８７〜１９８間に挿入され、ＨpaＩもしくはＳ
paＩ部位またはそれらの組み合わせがヌクレオチド塩基
３２８〜３４２間に挿入され、ＥcoＲＶ、ＣlaＩ、もし
くはＳmaＩ部位またはそれらの組み合わせがヌクレオチ
ド塩基４４２〜４６２間に挿入され、ＢamＨＩもしくは
ＨpaＩ部位またはそれらの組み合わせがヌクレオチド塩
基７０９〜７２６間に挿入され、およびＭstＩ、Ｓph
Ｉ、もしくはＸmaIII部位またはそれらの組み合わせが
ヌクレオチド塩基９７３〜９９７間に挿入された前記Ｔ
ＰＡ−コーティングＤＮＡの化合物を本明細書中にて開
示する。

【００１３】前記したそれらのＴＰＡ−コーティングＤ
ＮＡ配列のうちには、ドメイン領域についてコード付け
するヌクレオチドの配列がそれらの順序、出現または双
方に関して天然の配置から変えられたものがある。さら
に具体的には、ＤＮＡが、該ドメインがアミノ末端から
(a)ＦＡ; (b)ＦＧＫ１Ａ; (c)ＦＧＫ２Ａ; (d)ＦＫ２
Ａ; (e)ＦＫ１Ｋ２Ａ; (f)ＦＫ２Ｋ２Ａ; および、(g)
ＦＧＫ１Ｋ２Ａの順序で並べられたＴＰＡ様蛋白質につ
いてコード付けするＴＰＡコーティングＤＮＡ配列を本
明細書中にて開示する。

【００１４】さらに、ＴＰＡ様蛋白質をコード付けする
配列から上流および下流の双方のヌクレオチド配列が化
合物を適当な宿主中で維持されることを可能とする前記
した如きＴＰＡ−コーティングＤＮＡ配列の化合物があ
る。さらに具体的には、発現される蛋白質の総分子量が
９００００ダルトンを超えずかつドメインが２回以上現
れない場合、適当な宿主細胞がドメイン領域がその順
序、出現または双方において変化されたＴＰＡ様蛋白質
特にそれらの同族体を発現できるようにすることもでき
る化合物を本明細書中に記載する。なお、さらに具体的
には、ドメインがアミノ末端から次のように: (a)ＦＡ;
(b)ＦＧＫ１Ａ; (c)ＦＧＫ２Ａ; (e)ＦＡ２Ａ; (e)Ｆ
Ｋ１Ｋ２Ａ; (f)ＦＫ２Ｋ２Ａ; (g)ＦＫ１Ａまたは(h)
ＦＧＫ１Ｋ２Ａの順で並べられたＴＰＡ様蛋白質につい
てコード付けするＤＮＡを含有する発現および複製プラ
スミド(ベクター)を本明細書中に記載する。

【００１５】前記プラスミドであって再配置されたＴＰ
Ａ蛋白質の発現用のものを維持することができる適当な
宿主微生物も本明細書中に記載する。例えば、適当な宿
主が: (a)酵母; (b)エシエリヒア種(Ｅscherichia); お
よび、(c)細胞培養物よりなる群から選択される、ＴＰ
Ａ様蛋白質についてコード付けするＤＮＡ配列を含有す
る発現および非発現ベクターを本明細書中に記載する。
さらに具体的には、適当な宿主細胞がチャイニーズハム
スター卵巣(ＣＨＯ)細胞である、ＴＰＡ様蛋白質につい
てコード付けするＤＮＡ配列を含有する好ましい発現ベ
クターを本明細書中に記載する。

【００１６】最後に、活性部位(Ａ)ならびにフィンガー
(finger)ドメイン(Ｆ)、発育因子ドメイン(Ｇ)、クリン
グル(kringle)１ドメイン(Ｋ１)、およびクリングル(kr
ingle)２ドメイン(Ｋ２)よりなる群から選択される１ま
たはそれ以上のドメインよりなり、発現される蛋白質の
総分子量が９００００ダルトンを超えずかつドメインが
２回以上現れない場合、該ドメイン領域がそれらの順
序、出現またはその双方に関して天然配置から変えられ
たＴＰＡ様蛋白質の化合物を本明細書中に記載する。以
下のＴＰＡドメインの配置が好ましい: (a)ＦＡ; (b)Ｆ
ＧＫ１Ａ; (c)ＦＧＫ２Ａ; (d)ＦＫ２Ａ; (e)ＦＫ１Ｋ
２Ａ; (f)ＦＫ２Ｋ２Ａ; および(g)ＦＫ１Ａ。

【００１７】本発明は、種々の公知方法で達成すること
ができる一連の分子遺伝子操作を含む。ＴＰＡのドメイ
ン間にユニークなエンドヌクレアーゼ制限部位を有する
２種の始原型遺伝子はブダペスト条約に従って寄託し
た。宿主微生物は、各々チャート１０および１１に示す
pＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４(a)およびpＴＰＡ−Ｂ１、
２、３、４と名付けたプラスミドを含有するイー・コリ
(Ｅ．coli)株である。pＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４(a)の
寄託は１９８６年８月２９日に米国、イリノイ州、ペオ
リア(Ｐeoria)、ノーザン・リージョナル・リサーチ・
センター(Ｎorthern Ｒegional Ｒesearch Ｃenter)
に対してなし、与えられた受託番号はＮＲＲＬ Ｂ−１
８１０６であった。pＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４の寄託
は１９８６年１１月２８日に米国、イリノイ州、ペオリ
ア(Ｐeoria)、ノーザン・リージョナル・リサーチ・セ
ンター(Ｎorthen Ｒegional Ｒesearch Ｃenter)に
対してなし、与えられた受託番号はＮＲＲＬ Ｂ−１８
１４２であった。

【００１８】寄託されたプラスミドは断じて本発明を限
定するものと解釈されるべきではない。使用が容易な出
発材料ではあるが、以下に別法出発材料からＴＰＡ同族
体を作製するのに利用できる各種方法を、続いて好まし
い方法の具体的な実施例を詳しく記載する。

【００１９】要約すると、必要な遺伝子操作は、ＴＰＡ
のcＤＮＡを得ること、インタードメイン領域に選択さ
れた制限部位を有する各種ＴＰＡドメインのコーディン
グ配列を含有するオリゴヌクレオチドのブロックの合
成、イー・コリ(Ｅ．coli)におけるドメインのクローニ
ングおよび複製ならびに所望のＴＰＡ同族体の発現とし
て記載できる。

【００２０】Ａ．配列の表 表２〜５の配列の表は、合成ＴＰＡ ＤＮＡについての
特異的配列および塩基のナンバリング位置を天然cＤＮ
Ａと比較して示す。天然ドメインは表２〜５の配列の表
のそれらの天然順列のうちにすべて存在する。表６〜８
の配列の表は天然ＴＰＡのアミノ酸配列を、それらの正
規の順列中にすべての天然ドメインを有するＴＰＡ同族
体に対して比較する(チャート１１)参照。表２〜５およ
び表６〜８の配列の表において、上側の配列はヌクレオ
チドまたはアミノ酸のいずれかの天然配列を表わし、下
側の配列は修飾されたＴＰＡを表わす。表９〜１２の配
列はＴＰＡ同族体を合成によってつくるのに用いられる
オリゴヌクレオチドを表わす。表１３は、ドメイン領域
内に含有されるアミノ酸およびヌクレオチドを示すこと
によってＴＰＡの天然順列を含有するチャート１１に記
載された同族体に対して天然ＴＰＡ蛋白質を比較する。
インタードメイン領域は表３に記載されたドメイン間に
存在するアミノ酸である(定義参照)。本明細書を通じ、
ヌクレオチドまたはアミノ酸はのいずれかに対する添数
字はこれらの表や表中の番号をいう。

【００２１】Ｂ．一般的方法 一般に、本願にて必要な命名法および一般的な実験室的
手法はマニアティス・ティら(Ｍaniatis、Ｔ.et al.)、
モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニ
ュアル(Ｍolecular Ｃloning Ａ Ｌaboratory Ｍanua
l)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory)、コールド・ス
プリング・ハーバー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor)、ニュー
ヨーク、１９８２中に見い出すことができる。該マニュ
アルは以後マニアティスとして参照する。

【００２２】すべてのイー・コリ(Ｅ．coli)株は、グル
コースを含むルリア(Ｌuria)・ブロス(ＬＢ)、ディフコ
(Ｄifco)の抗生物質培地＃２ならびにグルコースおよび
酸加水分解カゼインアミノ酸を補足したＭ９培地上で増
殖させる。抗生物質耐性株はマニアティスに記載されて
いる薬剤濃度で維持した。形質転換は、モリソン・デイ
・エイ(Ｍorrison、Ｄ.Ａ.)(１９７７)、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー(Ｊ.of Ｂact.)、１３２:３４
９〜３５１; またはクラーク−クルティス・ジェイ・イ
ーおよびクルティス・アール(Ｃlark−Ｃurtiss、Ｊ.
Ｅ.and Ｃurtiss、Ｒ.)、１９８３、メソッズ・イン・
エンザイモロジー(Ｍethods in Ｅnzymology)、１０１:
３４７〜３６２、ウー・アール、グロスマン・エルおよ
びモルダブ・ケイ(Ｗu、Ｒ.、Ｇrossman、Ｌ.and Ｍold
ave、Ｋ.)編、アカデミック・プレス(Ａcademic Ｐres
s)、ニューヨークによって記載されている方法により行
った。

【００２３】すべての酵素は製造業者の指示に従って用
いた。コロニーハイブリダイゼーションは次の方法を提
供するために修飾した以外は一般にグルンステイン・エ
ムら(Ｇrunstein、Ｍ.et al.)、プロシィーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
(Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.)、７２、７２巻、３９６１〜
５頁(１９７５)に記載されている如く行う: ニトロセル
ロースフィルターに前記調製の細胞コロニーが含有され
るようにする。次いで、コロニー側を上にして、１.５
Ｍ ＮaＣl、１.５Ｍ ＮaＯＨよりなる変性溶液中に浸
漬した５−８の厚みのワットマン３ＭＭペーパーのベッ
ド上に該フィルターを置く。変性剤を１.５〜２分間上
方にコロニー中に拡散させ、その時点で０.５Ｍトリス
・ＨＣl、pＨ７.４、２×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５
Ｍ ＮaＣl; ０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム; pＨ７.
１)、および２５mＭ ＥＤＴＡを含有する中和溶液に１
〜３分間浸漬した３ＭＭペーパーの第２のベッドに該フ
ィルターを移す。次いで、フィルターを完全に風乾し、
真空中、８０℃にて２〜４時間加熱した。

【００２４】オリゴヌクレオチドプローブについてのハ
イブリダイゼーション条件は以前ゲデル・デイ・ブイら
(Ｇoeddel、Ｄ.Ｖ.et al.)、ネイチャー(Ｎature)、２
９０巻、２０〜２６頁(１９８１)によって記載されたの
と同様である。

【００２５】ハイブリダイゼーション後、プローブ含有
溶液を除去し、保存し、４００mlずつで５回交換して合
計３時間、０.１％ＳＤＳ、０.２×ＳＳＣ中でフィルタ
ーを洗浄する。フィルターを完全に風乾し、セットし、
コダック(Ｋodak)Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルムおよびデ
ュポン・クロネックス・ライトネニング(Ｄupont Ｃro
nex Ｌightnening)と増感スクリーンを用いるオートラ
ジオグラフィーに−７０℃にて１６時間付す。

【００２６】プラスミドの配列決定法は、ホルメス・デ
イ・エスら(Ｈolmes、Ｄ.Ｓ.et al.)、アナリティカル
・バイオケミストリー(Ａnalyt.Ｂiochem.)、１１４
巻、１９３頁(１９８１)の方法によりプラスミドＤＮＡ
のミニプレプ(mini prep)を調製する。ジデオキシ配列
決定法はサンガー・エフら(Ｓanger Ｆ.et al.)、「迅速
ＤＮＡ配列決定法に対する助剤としての一本鎖バクテリ
オファージにおけるクローニング」、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.)１４
３: １６１〜１７８(１９７７)により行う。該ジデオキ
シ含有反応は、２分間で９０°まで加熱し、氷上でクエ
ンチすることによる電気泳動で調製する。一通路当たり
２〜３μlを調製した０.８％配列決定法変性ポリアクリ
ルアミドゲル上に載せ、サンガーおよびコルソン(Ｓang
er and Ｃoulson)、「ＤＮＡ配列決定に対する薄いアク
リルアミドゲルの使用」、エフ・イー・ビイ・エス・レ
ターズ(ＦＥＢＳ Ｌett．)８７: １０７〜１１０(１９
７８)により操作する。ゲルを室温にて２〜４日間露出
し、フィルム(コダック(Ｋodak ＸＡＲ−５)を製造業
者の推薦法に従って現像する。

【００２７】ヌクレオチドの大きさは、キロベース(kb)
または塩基対(bp)のいずれかで表わす。これらはアガロ
ースゲル電気泳動から見積もったものである。

【００２８】Ｃ．ＴＰＡ cＤＮＡ ＴＰＡ cＤＮＡは核酸配列の活性部位部分の好都合な源
であった。従って、活性部位を化学的に合成する必要は
なかった。ＴＰＡ cＤＮＡ は多数の源から入手可能で
ある。研究者は、多量のＴＰＡを産生する細胞培養物、
特にボウエス(Ｂowes)黒色腫細胞から単離したメッセン
ジャーＲＮＡからＴＰＡ cＤＮＡ の部分を調製するこ
とを報告している。エドランドら(Ｅdlund et al.)、
「ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの一部をコ
ード付けするcＤＮＡ配列の単離」、８０巻、３４９〜３
５２(１９８３年１月); グロノウら(Ｇronow et al.)、
「細胞培養によるヒトプラスミノーゲンアクチベーター
の産生」、トレンズ・イン・バイオテクノロジー(Ｔrend
s in Ｂiotechnology)、１巻、Ｎo.１、２６〜２９(１
９８３); およびペニカら(Ｐennica et al.)、「イー・
コリ(Ｅ．coli)におけるヒト組織タイププラスミノーゲ
ンアクチベーターcＤＮＡのクローニングおよび発現」、
ネイチャー(Ｎature)、３０１巻、２１４〜２１(１９８
３年１月２０日)。

【００２９】さらに詳しくは、ジェネンテク・インコー
ポレイテイッド(Ｇenentech、Ｉnc．)は、各々１９８２
年５月５日; １９８２年７月１４日および１９８３年４
月７日の出願日付を有する米国特許出願番号３７４８６
０号; ３９８００３号および４８３０５２号に基づく優
先権を主張して１９８３年５月４日にヨーロッパ特許出
願(００９３６１９号)を行ったが、以後これをジェンネ
ンテク出願として参照する。該ジェンネンテク出願はＡ
ＴＣＣ番号３１４４６のイー・コリ(Ｅ．coli)Ｋ１２株
２９４、すなわち、ＴＰＡについてコード付けする組換
体ＤＮＡ化合物を有する形質転換体を開示している。さ
らに、rＤＮＡによって形質転換されたイー・コリ(Ｅ．
coli)Ｋ１２株Ｗ３１１０がそれからフィブリン溶解活
性の検定用のＴＰＡの抽出物も調製されるＡＴＣＣ番号
２７３２５として該ジェンネンテク出願中に開示されて
いる。かくして、該開示は本願にて有用な組換体ＤＮＡ
化合物を含む。同様に、該ジェンネンテク出願の開示
は、やはりＴＰＡを発現する増幅用に形質転換したＤＨ
ＦＲ＋ＣＨＯ−ＫＩ(ＡＴＣＣ ＣＬ６１)細胞を提供す
る。かくして、再度、該寄託物ＡＴＣＣ ＣＬ６１は本
願にて有用なＴＰＡについてコード付けする組換体ＤＮ
Ａヌクレオチドを開示している。

【００３０】本明細書における調製例２の開示は、ＴＰ
Ａについてコード付けする組換体ＤＮＡ化合物を得るた
めのボウエス(Ｂowes)黒色腫細胞に適用できる当該分野
で公知な方法のうちから１の単離方法を当業者に提供す
る。該ボウエス(Ｂowes)黒色腫細胞は通常公に入手可能
である。

【００３１】Ｄ．ＴＰＡドメインの合成 前記の如く、ＴＰＡ同族体ＤＮＡ配列の部分はcＤＮＡ
から調製した; しかしながら、ほとんどの配列および全
配列でさえ合成により作製することができた。コストお
よび便利さが個々のＴＰＡ同族体配列の作製法を決定す
るにおける支配的パラメーターである。所望の同族体の
ＴＰＡドメイン中に見い出されない制限部位を選択し、
これらの制限部位をＴＰＡのインタードメイン領域内に
挿入することによって、ＴＰＡ ＤＮＡ配列の所望の部
分を消化することを避け、各個々のドメインの容易な除
去および挿入が可能となる。

【００３２】ＴＰＡ遺伝子の一部を化学的に合成するこ
とによって、いずれのヌクレオチドが用いられるべきか
の塩基・塩基法を決定できる。以下の利点が本法から生
ずる: (１)転写産生物における二次構造の最小化; (２)
自己相補性のＡＴ−ＧＣ領域の最小化; および(３)cＤ
ＮＡ配列に沿っての所望の位置におけるユニーク制限部
位の設置。

【００３３】オリゴヌクレオチドは、ニードハム・バン
・デバンター・デイ・アールら(Ｎeedham Ｖan Ｄeva
nter、Ｄ.Ｒ.et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes.)、１２: ６１５９〜６１
６８(１９８４)に記載されている如く、自動合成器を用
いるベカジ・エス・エルおよびカルサー・エム・エイチ
(Ｂeaucage Ｓ.Ｌ.and Ｃaruthers、Ｍ.Ｈ.)、テトラヘ
ドロン・レターズ(Ｔetrahedron Ｌetts.)、２２(２
０): １８５９〜１８６２(１９８１)によって最初に記
載された固相ホスホルアミダイト(phosphoramidite)・
トリエステル法によって化学的に合成される。オリゴヌ
クレオチドの精製は、パーソン・ジェイ・デイおよびレ
グニエ・エフ・イー(Ｐearson、Ｊ.Ｄ.and Ｒegnier、
Ｆ.Ｅ.)、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(Ｊ.
Ｃhrom.)、２５５: １３７〜１４９(１９８３)に記載さ
れている如く、天然アクリルアミドゲル電気泳動法また
は陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかによった。

【００３４】オリゴデオキシヌクレオチドはヌクレオチ
ド４０個以下の長さで化学的に合成する。各フラグメン
トはその対応する相補鎖に対して相補的となるように設
計し、各二重鎖セグメントは結びを最適化する付着末端
を含有する。フラグメントの合成用ＤＮＡの配分におい
ては以下の基準を考慮する:１)化学的合成および精製が
容易となるようにオリゴヌクレオチドフラグメントの長
さは塩基４０個以下の長さであること２)相補する上方
および下方ヌクレオチドフラグメントから突出する最小
６個の塩基が出現してセグメントの最適な配列および結
びを可能とすること３)一次もしくは相補配列のいずれ
かに連結できる塩基４個またはそれ以上の領域は避ける
こと。

【００３５】合成オリゴヌクレオチドの配列はマキサム
・エイ・エムおよびギルバート・ダブリュー、グロスマ
ン・エルおよびモルダブ・デイ(Ｍaxam、Ａ.Ｍ.and Ｇi
lbert、Ｗ.、Ｇrossman、Ｌ.and Ｍoldave、Ｄ.)編、
アカデミック・プレス(Ａcademic Ｐress)、ニューヨ
ーク、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍethods i
n Ｅnzymology)、６５: ４９９〜５６０(１９８０)の
化学的分解法を用いて確認できる。別法として、該配列
は、マキサムおよびギルバート(Ｍaxam and Ｇilber
t)、前掲の方法、またはワレイス・アール・ビイら(Ｗa
llace、Ｒ.Ｂ.、et al.)、ジーン(Ｇene)、１６: ２１
〜２６(１９８１)の二重鎖鋳型を配列決定するための鎖
末端法を用いて、オリゴヌクレオチドフラグメントを二
重鎖ＤＮＡ配列に入れる組立ての後に確認できる。

【００３６】８７種の別異のオリゴヌクレオチド(表９
〜１２)を合成した。本明細書中で開示する特別の組立
法は、チャート(１１)に示す選択された制限部位を有す
るＴＰＡ同族体の５'部分をコード付けする最初の１０
９９個の塩基対を作製するものであった。次いで、この
合成オリゴヌクレオチドを、活性部位を含有する位置１
２８７のＥcoＲＩ部位にてＴＰＡ cＤＮＡの３'部分に
連結する。

【００３７】オリゴヌクレオチドフラグメントを二本鎖
ＤＮＡに入れて組立てるには、アニーリングおよび結び
のために８７種のフラグメントすべてを一緒に混合する
ことができる。さらに十分な結びには、オリゴヌクレオ
チドを４つのブロックに分割した方がよい。各ブロック
の結びおよび精製の後、次いで４つのブロックをアニー
ルし、結んで最終産生物を得ることができる。組立てた
ブロックおよび最終産生物の精製はマニアティスに記載
されている如くアクリルアミドゲル電気泳動法によって
行うことができる。アニーリングおよび結びを行うに
は、マニアティスに記載されている一般法も用いられ
る。

【００３８】合成ＴＰＡ遺伝子用の開始コードンを用意
する必要があるであろう。イー・コリ(Ｅ．coli)系の目
的には、Ｆ−metについてコード付けする開示コードン
ＡＴＧが必要である。該開始コードンは合成遺伝子中に
取り込むことができるか、あるいは所望の発現プラスミ
ドによって供給できる。開始コードンに加え、イー・コ
リ(Ｅ．coli)用には、シャイン・ダルガノ領域と開始コ
ードン間に適当な間隔を付与する配列をＴＰＡの合成遺
伝子中に取り込むのが便利である。

【００３９】配列の適当な選択は、さもなければ転写お
よび翻訳を妨害する二次構造を最小化し、最適なコード
ン使用法を併合する(グロスジーン・エイチおよびフィ
エルズ・ダブリュー(Ｇrosjean Ｈ.and Ｆiers、Ｗ.)、
ジーン(Ｇene)、１８: １９９〜２０９、１９８２); お
よびリポソーム結合部位あたりの配列に見い出される統
計的偏りを満足させる(ゴルド・エルら(Ｇold、Ｌ.、et
al.)、アニュアル・レビュー・オブ・ミクロバイオロ
ジー(Ａnn.Ｒev.Ｍicrobiol.)、３５: ３６５〜４０
３、１９８１)。本発明についての具体的な配列はその
実際の配列により本明細書中に記載する。しかしなが
ら、異なる宿主細胞におけるＴＰＡ同族体の発現を最適
化するのに別法配列を用いることができることを理解さ
れたい。

【００４０】Ｅ．cＤＮＡおよびＴＰＡ遺伝子の合成部
分のクローニング cＤＮＡおよびＴＰＡの部分についてコード付けする組
換体フラグメントの複製用のＴＰＡの合成部分をクロー
ンするのに用いる方法は当該分野で公知の標準方法であ
る。引き続いて記載するすべてのクローニングを実行す
るのに十分な方法を含有するマニアティスマニュアル。
すべとのクローニングは、十分に特徴づけされたいずれ
の株も有用である形質転換イー・コリ(Ｅ．coli)におい
て行った。特に断らない限り、株ＨＢ１０１が好まし
い。

【００４１】イー・コリ(Ｅ．coli)を形質転換するのに
有用なクローニングベクターはpＢＲ３２２およびpＫＣ
７を包含する。

【００４２】Ｆ．ユニーク制限部位のＤＮＡ−コーディ
ングＴＰＡ中への挿入 ＴＰＡのインタードメイン領域について選択した具体的
な制限部位はチャート１０および１１に示す。これらが
本発明において有用である唯一の制限部位ではない。制
限部位はそれらがＴＰＡ cＤＮＡにおいてユニークで
ある塩基に基づいて選択する。インタードメイン領域に
最小のアミノ酸変化を導入する部位が好ましく、アミノ
酸変化に関してサイレントである部位が最も好ましい
(表２〜５および表６〜８参照)。インタードメイン内に
異なる解読フレームを有する多重部位は、発現の目的で
他のドメインに結んだ後ドメインが同相であるのを保証
するために有用である。重複制限部位は、単に該部位を
消化し、末端を平滑末端とした後結ぶことによって除去
できる。ユニーク部位の導入は、化学的合成、商業的に
入手可能なリンカーによって、または単一部位突然変異
によって実現できる。

【００４３】天然ＴＰＡ cＤＮＡはチャート１０およ
び１１に示したＴＰＡの２の始原型cＤＮＡ中に入れら
れた部位以外に、以下のエンドヌクレアーゼ制限酵素に
よって認識される部位を含有しない: ＡＣＣ１ ＡＦＬ２ ＡＦＬ３ ＡＨＡ３ ＡＳＵ２ ＡＶＡ３ ＡＶＲ２ ＢＣＬ１ ＢＧＬ１ ＢＳＳＨ２ ＨＩＮＤ３ ＫＰＮ１ ＭＬＵ１ ＭＳＴ２ ＮＡＥ１ ＮＣＯ１ ＮＤＥ１ ＮＨＥ１ ＮＯＴ１ ＮＲＵ１ ＮＳＩ１ ＰＶＵ１ ＳＡＣ２ ＳＡＬ１ ＳＡＵ１ ＳＦＩ１ ＳＮＡ１ ＳＮＡＢ１ ＳＰＥ１ ＸＨＯ１

【００４４】Ｇ．イー・コリ(Ｅ．coli)におけるＴＰＡ
同族体の発現 原核系においてクローンした遺伝子、例えば修飾したＴ
ＰＡ遺伝子の高いレベルの発現を得るには、最小限、m
ＲＮＡ転写を方向づける強力なプロモーター、翻訳開始
用のリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含
有する発現ベクターを組立てることが必須である。多量
の遺伝子産生物の蓄積はしばしば細胞増殖を抑制し、し
かも時々細胞死を引き起こすので、産生物の合成を方向
づけるのに選択したプロモーターは、プロモーターの誘
導前に細胞増殖が高密度に達することができるように調
節されなければならない。この目的に対して適当な調節
領域の例は、ヤノフスキイ・シイ・ケリイ・アール・エ
ルおよびホーン・ブイ(Ｙanofsky Ｃ.,Ｋelley, Ｒ.Ｌ.
and Ｈorn Ｖ.)、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
(Ｊ.Ｂacteriol.)、１５８: １０１８〜１０２４(１９
８４)によって記載されている如きイー・コリ(Ｅ．col
i)トリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペ
レーターならびにヘルスコビィッツ・アイおよびハーゲ
ン・デイ(Ｈerskowitz Ｉ.and Ｈagen Ｄ.)、アヌ・レ
ブ・ジエネト(Ａnn.Ｒev.Ｇenet.)、１４: ３９９〜４
４５(１９８０)によッテ記載されている如きファージラ
ムダ(Ｐ_L)の左方プロモーターである。イー・コリ(Ｅ．
coli)中で産生されたＴＰＡは多数のシステイン残基の
ために正しく折り畳まれていない。該イー・コリ(Ｅ．c
oli)産生ＴＰＡはまず変性し、次いで天然状態に戻さな
くてはならない。これは、イー・コリ(Ｅ．coli)産生Ｔ
ＰＡをグアニジンＨＣlに溶解し、すべてのシステイン
残基をβ−メルカプトエタノールで還元することによっ
て達成できる。次いで、ゆっくりとした透析またはゲル
濾過のいずれかによって該蛋白質を天然状態に戻す。米
国特許第４５１１５０３号。

【００４５】Ｈ．酵母におけるＴＰＡ同族体発現 酵母における異種蛋白質の発現はよく知られている。メ
ソッズ・イン・イースト・ジェネティックス(Ｍethods
in Ｙeast Ｇenetics)、シャーマン・エフら(Sherman，
Ｆ.et al.)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー(ＣoldＳpring Ｈarbor Ｌaboratory)、(１９８
２)は酵母におけるＴＰＡ同族体を産生するのに有用な
各種方法を記載しているよく知られた研究である。

【００４６】酵母における遺伝子の高レベル発現のため
には、原核生物における如く遺伝子を強力なプロモータ
ー系に連結すること、および酵母遺伝子から効果的な転
写終止／ポリアデニレーション配列も供給することが必
須である。有用なプロモーターの例はＧＡＬ１、１０
(ジョンストン・エムおよびディビス・アール・ダブリ
ュー(Ｊohnston Ｍ.and Ｄavis Ｒ.Ｗ.)、モレキュラー
・アンド・セリユラー・バイオロジー(Ｍol.and Ｃell.
Ｂiol.)、４: １４４０〜４８、１９８５)、ＡＤＨ２
(ラッセル・デイら(Ｒussel Ｄ.et al.)、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhe
m.)、２５８: ２６７４〜２６８２、１９８３)、ＰＨＯ
５(ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オー
ガナイゼイション・ジャーナル(ＥＭＭＯＪ．)、６: ６
７５〜６８０、１９８２)、およびＭＦ_α１である。Ｌu
e−２、ＵＲＡ−３、Ｔrp−１、およびＨis−３の如き
選択マーカーを有するマルチコピー(multicopy)プラス
ミドもまた望ましいものである。

【００４７】細胞をグルコース上で増殖させる場合、Ｇ
ＡＬおよびＡＤＨ２プロモーターは抑制され、かくして
細胞が高密度まで増殖することが可能となる。ＧＡＬプ
ロモーターは細胞をガラクトース培地に移すことによっ
て作動できるが、ＡＤＨ２はすべてのグルコースが細胞
によって利用されてしまった後作動する。ＰＨＯ５プロ
モーターは培地中のリン酸塩濃度を操作することによっ
て作動または作動停止できる。α接合型の宿主における
ＭＦ_α１プロモーターは終始作動状態にあるが、二倍体
またはa接合型を有する細胞中では作動停止の状態であ
る。しかし、それは１のＳＩＲ座にts突然変異を有する
宿主中に温度を上げ下げすることによって調節できる。
３５℃におけるかかる突然変異のα型細胞に対する効果
はa接合型についてコード付けする正常なサイレント遺
伝子を作動させることにある。一方、サイレントa接合
型遺伝子の発現はＭＦ_α１プロモーターを作動停止す
る。増殖の温度を２７℃まで下げると該過程を逆に進行
させ、a接合型を作動停止し、ＭＦ_α１を作動させる(ヘ
ルスコビィッツ・アイおよびオーシマ・ワイ(Ｈerskowi
tz Ｉ.＆ Ｏshima Ｙ.(１９８２)、ザ・モレキュラー
・バイオロジー・オブ・ザ・イースト・サッカロミセス
(Ｔhe molecular biology of the yeast saccharomyce
s)、ストラザン・ジェイ・エヌ、ジョーンズ・イー・ダ
ブリューおよびブローチ・ジェイ・アール(Ｓtrathern
Ｊ.Ｎ.、Ｊones Ｅ.Ｗ.、＆ Ｂroach Ｊ.Ｒ.)編、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Ｃold Ｓp
ring Ｈarbor Ｌab.)、コールド・スプリング・ハーバ
ー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor)、ニューヨーク、１８１〜
２０９頁)。

【００４８】ポリアデニレーション配列はＡＤＨ１、Ｍ
Ｆ_α１またはＴＰＩのような高度に発現された遺伝子の
いずれの３'−末端配列によっても供給される(アルバー
ト・テイおよびカワサキ・ジイ(Ａlbert Ｔ.and Ｋawas
aki Ｇ.)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・
アプライド・ジェネティックス(Ｊ.of Ｍol.＆ Ａppl.
Ｇenet.)、１: ４１９〜４３４、１９８２)。

【００４９】ＹＥp６、ＹＥp１３、ＹＥp２４のような
数多くの酵母発現プラスミドをベクターとして使用でき
る。ＴＰＡの如き注目する遺伝子を前記のいずれのプロ
モーターにも融合することができ、次いで、各種酵母宿
主中での発現のためのプラスミドに結ぶことができる。
前記プラスミドは文献中に詳細に記載されている(ブロ
ステインら(Ｂrostein et al.)、ジーン(Ｇene)、８:
１７〜２４、１９７９;ブローチら(Ｂrach et al.)、ジ
ーン(Ｇene)、８:１２１〜１３３、１９７９)。

【００５０】前記プラスミドは酵母において外来性遺伝
子を発現するのに用いることができ、かつ用いられたこ
とがあるが、本明細書中にて開示するのは発現ベクター
の各種成分の挿入および／または切除に関して大いなる
融通性を可能とするベクターである。かかる例の１つ
は、チャート１８に示すベクターpα１−ＡＤＨtであ
る。

【００５１】酵母細胞を形質転換するのに２つの方法を
用いる。１の場合、ザイモリアーゼ、リチカーゼまたは
グルスラーゼを用いて酵母細胞をまずプロトプラストに
変換し、続いてＤＮＡおよびポリエチレングリコール
(ＰＥＧ)を添加する。該ＰＥＧ処理プロトプラストを次
いで選択した条件下、３％寒天培地中で再生する。この
方法の詳細は、ジェイ・デイ・ベグズ(Ｊ.Ｄ.Ｂeggs)、
ネイチャー(Ｎature)(ロンドン(Ｌondon))、２７５: １
０４〜１０９(１９７８); およびヒネン・エイら(Ｈinn
en Ａ.et al.)、プロシーディングズ・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Ｐroc.Ｎatl.Ａc
ad.Ｓci.)ＵＳＡ、７５: １９２９〜１９３３(１９７
８)による報告文中に記載されている。第２の方法は、
細胞壁の除去を含まない。その代わりに、細胞を塩化も
しくは酢酸リチウムおよびＰＥＧで処理し、選択したプ
レート上に置く(イトー・エイチら(Ｉto Ｈ.et al.)、
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Ｊ.Ｂact.)、１
５３: １６３〜１６３、１９８３)。

【００５２】ＴＰＡ同族体は、細胞を溶解し、次いで標
準的な蛋白質単離法を溶解物に適用することによって単
離できる。ＴＰＡ同族体は、ウェスタンブロット法また
はラジオイムノアッセイを用いることによって検出でき
る。

【００５３】Ｉ．細胞培養物における発現 ＴＰＡ同族体をコード付けするＤＮＡは宿主細胞培養体
を形質転換するのに用いる各種発現ベクターに結ぶこと
ができる。該ベクターはすべて、形質転換されるべき宿
主細胞に受容可能なＴＰＡ同族体の転写および翻訳を開
始する遺伝子配列を含有する。宿主細胞が高等動物細
胞、例えば哺乳動物細胞である場合、ＴＰＡ遺伝子の天
然に生じる転写および翻訳遺伝子配列を用いることがで
きるが、あるいは天然に生じる遺伝子配列を異種プロモ
ーター配列と共に用いることができる。加えて、該ベク
ターは好ましくは、マーカーを含有して形質転換宿主細
胞の選択のための表現型特性を提供する。さらに、複製
ベクターはレプリコンを含有してもよい。

【００５４】ＴＰＡ同族体の産生に有用な細胞培養物の
例は昆虫もしくは哺乳動物源の細胞である。哺乳動物細
胞浮遊液も用いることができるが、哺乳動物細胞系はし
ばしば細胞の単層形態である。哺乳動物細胞系の例はベ
ロ(ＶＥＲＯ)およびヒーラ(ＨeＬa)細胞、チャイニーズ
ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系、ＷＩ３８、ＢＨＫ、Ｃ
ＯＳ−７またはＭＤＣＫ細胞系である。昆虫細胞系の例
はスポドプテラ・フルギペルダ(Ｓpodoptera frugiperd
a)(行列毛虫ヨウトガ幼虫)およびボンビックス・モリ
(Ｂombyx mori)(カイコ)を包含する。

【００５５】前記の如く、ベクター、例えば宿主細胞を
形質転換するのに用いるプラスミドは、好ましくはＴＰ
Ａ遺伝子配列の転写および翻訳を開始する遺伝子配列を
含有する。これらの配列を発現制御配列という。宿主細
胞が昆虫もしくは哺乳動物源のものである場合、例えば
有用な発現制御配列はＳＶ−４０プロモーター(サイエ
ンス(Ｓcience)、２２２: ５２４〜５２７(１９８
３))、ＣＭＶ Ｉ.Ｅ.プロモーター(プロシーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)、８１: ６５９〜６６３、
１９８４)またはメタロチオネインプロモーター(ネイチ
ャー(Ｎature))、２９６: ３９〜４２(１９８２))から
得られる。前記の如く、宿主細胞が哺乳動物のものであ
る場合、ＴＰＡ遺伝子用発現制御配列を用いることがで
きるが、ＴＰＡ同族体を異種転写開始部位と組み合わせ
るのが好ましい。発現制御配列を含有するプラスミドま
たは複製もしくは統合ＤＮＡ物質は制限酵素を用いて切
断し、要すればあるいは所望により大きさを調節し、当
該分野でよく知られた方法によってＴＰＡ同族体につい
てコード付けするcＤＮＡで結ぶ。

【００５６】酵母の場合の如く、高等動物宿主細胞を用
いる場合、公知哺乳動物遺伝子からのポリアデニレーシ
ョンまたはターミネーター配列はベクター中に取り込ま
れている必要がある。ターミネーター配列の例はウシ成
長ホルモン遺伝子からのポリアデニレーション配列であ
る。

【００５７】さらに、宿主細胞における複製を制御する
遺伝子配列を、ウシ乳頭腫ウイルス型ベクター中で見い
出されるものの如きベクター中に取り込んでよい。サベ
リア−カンポ・エム(Ｓaveria−Ｃampo Ｍ.)、ウシ乳頭
腫ウイルスＤＮＡ: 真核性クローニングベクター」、デ
イ・エヌ・エイ・クローニング(ＤＮＡ Ｃloning)II
巻、ア・プラクティカル・アプローチ(a practical app
roach)、デイ・エム・グローバー(Ｄ.Ｍ.Ｇlover)編、
アイ・アール・エル・プレス(ＩＲＬ Ｐress)、アーリ
ントン(Ａrlington)、バージニア州、２１３〜２３８頁
(１９８５)。

【００５８】宿主細胞は形質転換について適格であるか
または各種方法によって適格とされる。ＤＮＡを動物細
胞に導入するいくつかのよく知られた方法がある。これ
らは: リン酸カルシウム沈澱、ＤＮＡを含有する細菌プ
ロトプラストでの受容体細胞の融合、ＤＮＡを含有する
リポソームでの受容体細胞の処理、ＤＮＡの細胞中への
直接マイクロインジェクションを包含する。

【００５９】形質転換した細胞は当該分野でよく知られ
た方法により増殖させ、バイオケミカル・メソッズ・イ
ン・セル・カルチャー・アンド・バイオロロジー(Ｂioc
hemical Ｍethods in Ｃell Ｃulture and Ｂiology)、
クチラー・アール・ジェイ・ドウデン(Ｋuchler Ｒ.
Ｊ.、Ｄowden)、ハッチンソン・アンド・ロス・インコ
ーポレイティッド(Ｈutchinson and Ｒoss Ｉnc.)(１９
７７)、例えば当該分野でよく知られた機械的もしくは
酵素的方法によって宿主細胞系を破壊した後、宿主細胞
または細胞浮遊液から蛋白質を排出する系において、発
現されたＴＰＡ同族体を細胞培地から収穫する。

【００６０】Ｊ．ＴＰＡ同族体の評価 ＴＰＡおよびその同族体は２つの方法のうちいずれかで
評価できる。プラスミノーゲンを切断してプラスミンと
する相対能力を評価することができ、およびプラスミン
の産生を阻止する抑制物質の相対能力を評価することが
できる。かかる評価についての手順を以下に詳しく記載
する。

【００６１】アミドールアッセイ。ＴＰＡ同族体の機能
活性は、ベルヘイジェン・ジェイ・エイチら(Ｖerheije
n Ｊ.Ｈ.et al.)、「血漿中に測定に適用できる外来性
(組織タイプ)プラスミノーゲンアクチベーターについて
の簡単で鋭敏な分光光度計アッセイ」、スロンボウシス
・アンド・ヘモスタシス(Ｔhromb.Ｈaemostas.)、４８:
２６６〜２６９(１９８２)によって記載されているア
ミドールアッセイを用いることによって測定される。略
言すれば、ＴＰＡ同族体を含有する試料をプラスミノー
ゲンおよびＣＮＢr消化フィブリノーゲンフラグメント
と混合する。かくして形成されたプラスミンは、次い
で、系外から加えた色素生成基質、Ｓ−２２５１(Ｈ−
Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジン−p−ニトロア
ニリド二塩酸塩; ＫＡＢＩ、ストックホルム、スウェー
デン)を切断し、分光光度計によりモニターされる着色
生成物を生じる。プロテアーゼ抑制物質のＴＰＡ同族体
に対する効果は、ベルヘイジェン・ジェイ・エイチら
(Ｖerheijen Ｊ.Ｈ.et al.)、「ヒト血漿中の組織タイプ
プラスミノーゲンアクチベーターについての速作用抑制
物質の出現の証拠」、スロンボウシス・アンド・ヘモス
タシス(Ｔhromb.Ｈaemostas.)、５１: ３９２〜３９５
(１９８４)によって記載されている本アッセイの修正法
を用いることによって評価される。添加した抑制物質は
ＴＰＡに結合し、不可逆的な複合体を形成し、それによ
ってＴＰＡがプラスミノーゲンを活性化するのを阻止す
る。例えば、精製された天然ＴＰＡは増加した量の抑制
物質含有試料で力価測定され、残余ＴＰＡ活性は前記で
概説した如くに測定される。次いで、残余ＴＰＡ活性を
添加した抑制物質含有試料の量の関数としてグラフに表
わすことによって標準曲線を描く。同様に、ＴＰＡ同族
体を抑制物質で力価測定する。得られた曲線をＴＰＡ標
準のものと比較する。曲線間の類似度が個々の同族体の
抑制に対する感受性に直接関係する。

【００６２】フィブリンオートグラフィー。ＴＰＡ同族
体の分子量は、該同族体を含有する試料をドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ)に付し、次いでアクリルアミドゲルをプラ
スミノーゲン含有フィブリンの指示薬フィルム上に置く
ことによって見積もられる。同族体蛋白質がアクリルア
ミドゲルから指示薬フィルムに拡散するに従い、それは
プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、他の場合には
不透明なフィブリン指示薬中にフィブリン溶解現象の清
澄なゾーンの形成を引き起こす。このゾーンの出現はア
クリルアミドゲル中の対応する位置に活性なＴＰＡ同族
体が存在することを示す。この方法は、ＴＰＡ同族体と
プロテアーゼ抑制物質間の相互作用を評価するのにも用
いられる。前記の如く、この相互作用の結果、同族体自
身よりも大きな分子量を有する酵素−抑制物質複合体が
形成される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、該複合体はフィブ
リン指示薬フィルム中で可視化される残余ＴＰＡ活性を
呈する。この方法の詳細は、最初、グラネリ・ピペルノ
・エイおよびイー・ライチ(Ｇranelli Ｐiperno Ａ.and
Ｅ.Ｒeich)、「生物学的流体におけるプロテアーゼおよ
びプロテアーゼ−抑制物質複合体の研究」、ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(Ｊ.Ｅxp.Ｍe
d.)、１４８: ２２３〜２３４(１９７８)によって記載
された。

【００６３】ＴＰＡ同族体の抗原性の評価 サンドイッチ型酵素免疫測定法(Ｓ−エライサ法)。ＴＰ
Ａ同族体の抗原性は２つの異なるＳ−エライサ法により
免疫学的に測定される。第１のものは、ヒト子宮ＴＰＡ
について特異的なヤギ多クローン抗体を用いる。第２の
ものは、マウス単クローン抗体を用いる。この単クロー
ン抗体はＴＰＡの活性について必要なエピトープに対し
て特異的に定方向化される。ＴＰＡの活性部位ドメイン
に対して特異的な抗体の使用により、その主要構造がド
メインにおいて活性部位以外のものに変化してしまった
いずれのＴＰＡ同族体の抗原性も測定する効果的な方法
が提供される。このアッセイは、コルニンガー・シイら
(Ｋorninger Ｃ.et al.)によって記載された方法、単ク
ローン抗体を使用するＴＰＡ抗原性についてのサンドイ
ッチエライサ(Ｓandwich ＥＬＩＳＡ)法と同様のもの
である。スロンボウシス・リサーチ(Ｔhromb.Ｒes.)、
４１: ５２７〜５３５(１９８６)。両アッセイについて
の感度限界は１ml当たりＴＰＡ約１ngである。

【００６４】ウェスタンイムノブロッティング法。抑制
物質と共に複合体を形成するＴＰＡの能力もまた、最初
トウビン・エイチら(Ｔowbin Ｈ.et al.)「蛋白質のポリ
アクリルアミドゲルからニトロセルロースシートへの電
気泳動的移動: 方法およびいくつかの応用」、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・オブ・サイエンシズ(Ｐr
oc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)ＵＳＡ、７６: ４３５０〜４３
５４(１９７９)によって記載された如く、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびウェスタンイムノブロッティング法を用いる
ことによって評価できる。簡単に述べると、ＴＰＡ同族
体を抑制物質と相互作用をさせ、混合物をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥに付し、蛋白質をニトロセルロースペーパーへ電気
的に移動させる。複合体化してない遊離のＴＰＡおよび
抑制物質との複合状態にあるＴＰＡの双方を、ＴＰＡに
対して特異的な精製した多クローンヤギＩgＧおよびヤ
ギＩgＧに対して定方向化されたウサギ抗血清を用いる
ことによって検出する。次いで、Ｉ¹²⁵−ラベル蛋白質
Ａおよびオートラジオグラフィーを用いることによって
ＴＰＡ含有免疫複合体を可視化する。

【００６５】定義「 細胞培養物」なる語はもとの植物または動物の体外で細
胞が生存を維持するのを可能とする、多細胞植物もしく
は動物のいずれか由来の増殖している細胞の容器をい
う。

【００６６】「ドメイン」なる語は特定の機能に一致し得
るアミノ酸配列の別々の連続部分をいう。ＴＰＡに関し
ては、前記引用文献がドメイン領域を定義しており、本
明細書中の図４はドメイン間に存在するインタードメイ
ン領域の中央地点のおおよその位置を開示する。

【００６７】「下流」なる語は発現の方向においてさらに
進行する配列に同一であり; 例えば、コーディング領域
は開始コードンより下流にある。

【００６８】「インタードメイン」なる語はドメイン間に
存在する蛋白質のアミノ酸配列の領域をいう。この適用
において、インタードメイン領域は表１３に示した中央
地点からプラスもしくはマイナスの５個のアミノ酸残基
である。かくしてフィンガー(finger)および発育因子ド
メイン間のインタードメイン領域はアミノ酸４４〜アミ
ノ酸５５間に存在し、かつそれらを包含し; 発育因子お
よびクリングル(kringle)１ドメイン間のインタードメ
インはアミノ酸８６〜アミノ酸９７間に存在し、かつそ
れらを包含し; クリングル(kringle)１およびクリング
ル(kringle)２間のインタードメインはアミノ酸１６９
〜アミノ酸１８０間に存在し、かつそれらを包含し; ク
リングル(kringle)２および活性部位間のインタードメ
インはアミノ酸２５７〜アミノ酸２６８間に存在し、か
つそれらをを包含する。

【００６９】「維持された」なる語はプラスミドが自律複
製体としてまたは宿主のゲノムの統合部分として存在す
る、形質転換宿主内のプラスミドの安定な存在をいう。

【００７０】「微生物」なる語は細菌、放線菌および酵母
の如き単細胞の原核生物および真核生物を共に包含す
る。

【００７１】「非天然エンドヌクレアーゼ制限部位」なる
語句は、天然cＤＮＡ配列の同等位置に見い出されない
エンドヌクレアーゼ制限部位をいう。これらはユニーク
および非ユニーク部位を共に包含する。

【００７２】「オペロン」なる語は遺伝子発現および調節
の完全な単位であり、構造遺伝子、調節遺伝子、および
調節遺伝子産生物によって認識されるＤＮＡ中の制御要
素を包含する。

【００７３】「プラスミド」なる語は自律的に自己複製す
る染色体外環状ＤＮＡを言い、発現型および非発現型を
共に包含する。組換体微生物または細胞培養物が発現プ
ラスミドを宿すと記載される場合、「発現プラスミド」な
る語は染色体外環状ＤＮＡおよび宿主染色体中に取り込
まれたＤＮＡを共に包含する。

【００７４】「プロモーター」なる語はＲＮＡポリメラー
ゼが結合して転写を開始するのに係るＤＮＡ領域であ
る。

【００７５】「ＤＮＡ配列」なる語はヌクレオチド塩基、
アデノシン、チミジン、シトシンおよびグアノシンより
なる一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子をいう。

【００７６】「適当な宿主」なる語は組換体プラスミドを
受容することができ、該プラスミドが複製し、そのゲノ
ム中に取り込まれるかまたは発現されることを可能とす
る細胞培養物をまたは微生物をいう。

【００７７】「上流」なる語は発現から逆の方向に進行す
る配列に同一であり; 例えば、細菌プロモーターは転写
単位から上流にあり、開始コードンはコーディング領域
から上流にある。

【００７８】本願にとっては特別であるが、チャート１
〜２７においてプラスミドおよびフラグメントを表わす
のに用いる約束はプラスミドおよびそれらのフラグメン
トの常用表現と同意義であることを意味する。常用環状
図とは異なり、チャート上の単一線の図は翻訳または転
写が左から右に(５'から３'に)起こる環状および直線状
二本鎖ＤＮＡを共に表わす。星印(＊)はプラスミドの環
状形を完成するヌクレオチドの架橋を表わす。フラグメ
ントは二本鎖ＤＮＡの直線片であるから、星印を有しな
い。エンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上方に示す。
遺伝子マーカーは直線の下方に示す。プラスミドまたは
フラグメントを表わす図表の下方の棒線はＤＮＡ上の２
つの地点間の塩基対の数を示すのに用いる。マーカー間
の相対的間隔は実際の距離を示すものではなく、示した
ＤＮＡ配列上のそれらの相対的位置を示すことを単に意
味する。

【００７９】調製例 調製例１．ベクター−pＳＫ４−チャート１〜３ プラスミドpＳＫ４はイー・コリ(Ｅ．coli)において異
種蛋白質の発現を定方向化できる発現ベクターである。
それは転写を伝達するための強力な、調節可能なプロモ
ーターおよび翻訳開始についての強力なリボソーム結合
部位を有する。具体的には、pＳＫ４はトリプトファン
(trp)オペロンからのプロモーターおよびリボソーム結
合部位(ＲＳＢ)を用いる。ＲＢＳから直ぐの下流のユニ
ークＣlaＩ部位はＴＰＡの如き望ましい遺伝子の挿入す
る利用できる(チャート３)。

【００８０】プラスミドpＳＫ４を作製するには、公知
のpＫＣ７(チャート２)で新規なpＴＲＺ１(チャート１)
をクローンする必要がある。ラオ・アール・エヌおよび
ロジャーズ・エス・ジイ(Ｒao Ｒ.Ｎ.and Ｒogers Ｓ.
Ｇ.)、ジーン(Ｇene)、７: ７９〜８２(１９７９)。プ
ラスミドpＴＲＺ１はプロモーター／オペレーター領
域、リボソーム結合部位、およびtrpＬＥ融合ΔＬＥ１
４１３ならびにガラクトシダーゼ(lacＺ)およびラクト
ースパーミアーゼ(lacＹ)についての構造遺伝子を包含
するtrpオペロンの部分を含有する。プラスミドpＫＣ７
はアンピシリンおよびカナマイシンに対する耐性を特異
化し、多くのユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位を有
するpＢＲ３２２の誘導体である。

【００８１】pＴＲＺ１およびpＫＣ７の組換体プラスミ
ドはtrpプロモーター、ＲＢＳおよびpＫＣ７内のＬＥを
有するpＳＫ３を生じる。次いで、融合ペプチド配列trp
ＬＥを除去するためにプラスミドpＳＫ３を修飾して一
般的な発現ベクターpＳＫ４を得る。

【００８２】(１)pＴＲＺ１の組立て−チャート１ プラスミドpＴＲＺ１は公知プラスミドpＭＣ１４０３お
よびpＶＶ１のクローンである。

【００８３】プラスミドpＭＣ１４０３はpＴＲＺ１から
Ｎ末端の８個のアミノ酸を除いたpＴＲＺ１のlacＺ遺伝
子を供給するものであり、それはカサダバン・エム・ジ
ェイら(Ｃasadaban Ｍ.Ｊ.et al.)、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー(Ｊ.Ｂacteriol.)、１９８０、１４
３: ９７１〜９８０によって詳細に記載されている。プ
ラスミドpＭＣ１４０３は３つのユニーク制限酵素切断
部位を有する。それをＥcoＲＩで切断し、細菌アルカリ
性ホスファターゼで脱リン酸化し、イー・コリ(Ｅ．col
i)ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ−フラグメントで末端
を平滑とする。プラスミドpＶＶ１はtrpプロモーターお
よびオペレーター配列を供給し、それはニコルズ・ビイ
・ピイおよびヤノフスキイ・シイ(Ｎicols Ｂ.Ｐ.and
Ｙanofsky Ｃ.)、１９８３、メソッズ・イン・エンザイ
モロジー(Ｍethods in Ｅnzymology)、エル・グロスマ
ンおよびケイ・モルディブ(Ｌ.Ｇrossman and Ｋ.Ｍold
ave)編、１０１: １５５〜１６５、アカデミック・プレ
ス(Ａcademic Ｐress)、ニューヨークによって詳細に
記載されている。プラスミドpＶＶ１はtrp先導配列をtr
pＬＥを形成するtrpＥ遺伝子に融合する９５２塩基対欠
失を有するtrpオペロン(ΔＬＥ１４１３)を含有する。
プラスミドpＶＶ１をＰvuIIおよびＢgl IIで切断してフ
ラグメント２(３２３bp)を得、これを調製アガロース電
気泳動で単離する。Ｂgl II部位をクレノー酵素で満た
す。次いでフラグメント２をpＭＣ１４０３で結んでpＴ
ＲＺ１を得る。

【００８４】(２)pＳＫ３の組立て pＴＲＺ１の構造遺伝子ＬacＹおよびＬacＺはpＳＫ４の
組立てには不要であり、それらの欠失はより多くのクロ
ーニング部位を有するより小さいプラスミドを供給す
る。さらに、ＬacＹの欠失は膜結合蛋白質の過剰産生の
有害効果を回避する。チャート２に示す如く、trp配列
(フラグメント３)をＥcoＲＩ／ＢamＨＩ消化によってp
ＴＲＺ１から切り出し、アルカリ性ホスファターゼで処
理して再挿入を最小化し、次いでpＫＣ７のＥcoＲＩ／
ＢamＨＩ領域、フラグメント４に挿入するが、それは消
化の結果もはやカナマイシンに対する耐性を特異化しな
い。アンピシリン耐性(ＡmpＲ)およびカナマイシン感受
性(ＫanＳ)を有するクローンをtrpプロモーター／オペ
レーター配列の挿入について期待される制限フラグメン
トについてスクリーニングを行う。このプラスミドをp
ＳＫ３で示し、その均等体はチャート２に記載されてい
る通りである。

【００８５】(３)pＳＫ４の組立て pＳＫ３のtrpプロモーターは、直接発現ベクターの組立
てには不要なtrpＬＥペプチドをなお保持している。trp
ＬＥセグメントを以下の方法によって切り出す。チャー
ト３に記載した如く、trp配列を有するＥcoＲＩ／Ｂam
Ｈフラグメント５をpＳＫ３から切断し、ポリアクリル
アミドゲルからの電気溶出によって精製する。示した如
く、このフラグメントは３つのＴaqＩ部位を含有し、そ
のうちの１つはプロモーター／オペレーター領域にあり
(ＴaqＩ")、そのうちの１つのリボソーム結合部位とＴr
pＬＥ翻訳の開始間にある(ＴaqＩ"')。該フラグメント
をＴaqＩによって部分的に消化し、フラグメントの全集
合物を先にＥcoＲＩおよびＣlaＩの双方で切断したpＢ
Ｒ３２２との結び反応に用いる。

【００８６】ＴaqＩはＴ↓ＣＧＡを認識し(矢印は鎖切
断点を示す)、一方、ＣlaＩはＡＴ↓ＣＧＡＴを認識す
る。これらの２つの酵素は適合する付着末端を産生し、
塩基５'ないしリボソーム結合部位およびtrpＬＥ間のＴ
aq"'まではＡであるので(ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー(Ｊ.of Ｂact.)、１３３: １４５７〜１４６
６)、このＴaqＩ末端のＣlaＩ末端への結びはＣlaＩ部
位を再生する。このクローニング機構は単一のＴaqＩ切
断について選択することに注意されたい。また、プロモ
ーターからの転写は時計回り方向であることを確認され
たい。２７８bpＥcoＲＩ／ＣlaＩ挿入を表示するクロー
ン、およびtrpプロモーターの制限パターン特性を選択
するが、それはpＳＫ４に同等であろう。ＣlaＩ部位に
挿入した場合、該クローンは翻訳開始が可能な蛋白質配
列の発現に有用である。

【００８７】調製例２．ヒト組織プラスミノーゲンアク
チベーターについてコード付けする完全長 cＤＮＡの単
離 Ａ．材料および方法 (１)ボウエス(Ｂowes)黒色腫細胞の増殖 ボウエス(Ｂowes)はヒト自然発生黒色腫由来の株化細胞
系を表わし、これはニューヨーク医科大学のダニエル・
リフキン(Ｄaniel Ｒifkin)博士から贈られたものであ
る。９５％空気／５％ＣＯ₂を用い、３７℃における湿
潤雰囲気中、１０％胎児ウシ血清(Ｇibco)および５０μ
g／mlゲンタマイシン(Ｓigma)を補足したダルベッコウ
の修正イーグル培地(Ｇibco)中で細胞を培養する。ＲＮ
Ａ調製用に収穫した細胞をファルコン(Ｆalcon)１５０c
m²フラスコ中、接触し合うまで増殖させる。

【００８８】(２)ＴＰＡ mＲＮＡの調製 ボウエス(Ｂowes)黒色腫細胞からのＲＮＡを実質的にリ
ザルディら(Ｌizardiet al.)、アナリティカル・バイオ
ケミストリー(Ａnal.Ｂiochem.)、９８巻、１１６〜１
２２頁(１９７９)によって記載されている如くに単離す
る。

【００８９】ＤＮＡは、アビブ・エイチら(Ａviv Ｈ.et
al.)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ(Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓc
i.)、６９巻、１４０８〜１２頁(１９７２)によって記
載されている如く、オリゴデオキシチミジン−セルロー
ス(ＯdＴ−セルロース−コル(Ｃol)研究所)カラムを通
過させることによってポリＡ⁺豊富とする。別々のＯdＴ
カラム上で２回選択した１０〜１５０cm²フラスコから
の典型的収率は約５０μgポリＡ⁺mＲＮＡである。

【００９０】１５〜３０％直線スクロースグラジエント
による遠心によってポリＡ⁺mＲＮＡを分画する。滅菌蒸
留水２００〜４００μlに溶解したポリＡ⁺mＲＮＡ(〜３
００μg)をグラジエント上に重ね、３５０００rpmにて
ベックマン(Ｂeckman)ＳＷ４１ Ｔiローター中で１８
時間遠心し、ブチラー・オート・デンシーフロー(Ｂuch
ler Ａuto Ｄensi−Ｆlow)モデルIIＣを用いて０.５ml
ずつの画分を収集してトップからボトムに収穫し、ギル
ソン・マイクロ(Ｇilson Ｍicro)分画器(モデルＦＣ８
０−Ｋ)に連結する。各画分からの一部をクセノプス(Ｘ
enopus)卵母細胞に注入し、ミスキン・アールら(Ｍiski
n Ｒ.et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎu
c.Ａcids Ｒes.)、９巻、３３５５〜６３頁によって記
載されているのに類似のカゼイン−寒天プレート法によ
って、翻訳産生物をプラスミノーゲンアクチベーター活
性について検定する。ＴＰＡ活性は約１９秒において移
動するmＲＮＡによって表わす。

【００９１】具体的には、組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターＴＰＡを、プラスミノーゲンのプラスミン、カ
ゼインを消化する非特異的プロテアーゼへの変換を観察
することによって検定する。該アッセイは以下の如くに
行う。煮沸した８％カゼイン０.５mlを２×ＭＢＳ１ml
と混合し、５０℃まで加熱する。３％アガロースを融解
し、５０℃まで冷却する。３％アガロース０.５mlをカ
ゼイン／ＭＢＳに添加し、ピペットによって混合する。
混合しながら１mg／mlヒトプラスミノーゲン１００μl
を添加し(終濃度は５０μg／ml)、該物質を直径３.５cm
のプラスチック製ペトリ皿に注入する。アガロース溶液
を室温まで冷却する(約３０分)。アガロース中の直径２
mm孔をバイオラド(Ｂiorad)カッター・ゲル・パンチで
切断する。該孔を使用直前に作成し、ウエルをＭＢＳで
満たす。アッセイの少なくとも６時間前にＴＰＡ ＲＮ
Ａを注入した１または２の卵母細胞を各ウエルに加え
る。インキュベーションは湿らせた皿の中で１２〜２４
時間行う。カゼイン加水分解の明瞭なゾーンが容易に観
察される。

【００９２】２倍容量のエタノールを添加し、ドライア
イス上で１時間インキュベートすることによってＴＰＡ
mＲＮＡに富む画分を沈澱させる。エペンドルフ(Ｅppen
dorf)卓上マイクロヒュージ(microfuge)中、室温におけ
る遠心により沈澱を収集し、滅菌蒸留水に溶解し、プー
ルし、再沈澱させる。このＴＰＡポリＡ⁺豊富化mＲＮＡ
はクローニング用cＤＮＡを生成するのに用いる。

【００９３】(３)cＤＮＡの合成 すべてのこれらの反応物は氷上で組立てる。 (Ａ)ＯdＴ_12-18プライマーを用いる第一鎖の合成 豊富化した、ポリＡ＋選択したボウエス(Ｂowes)mＲＮ
Ａ(Ｈ₂Ｏ１μl中)の１０μgを１０mＭ ＭeＨgＯＨ(ア
ルファ(Ａlfa))の存在において室温で１０分間インキュ
ベートして二次構造のときほぐれを補助する。続いて、
以下の成分を加える; β−メルカプトエタノール〜２８
mＭ; ＲＮasin(バイオテク・インコーポレイティッド
(Ｂiotec Ｉnc.)１単位／μl最終反応容量; ７５mＭト
リス塩基pＨ８.３; ６mＭ ＭgＣl₂; ５０mＭ ＫＣl;
１０μgのオリゴデオキシチミジン(ＯdＴ_12-18コル(Ｃo
l)研究所; １００μＣi α−³²Ｐ−dＣＴＰ(アメルス
ハム(Ａmersham)); dＧＴＰ、dＴＴＰおよびdＡＴＰ各
〜５００μm; dＣＴＰ〜２５０μm(すべてのヌクレオチ
ドはピイ・エル・バイオケミカルズ(Ｐ.Ｌ.Ｂiochemica
ls)から入手、１０mＭ トリス塩基pＨ８中に〜２０mＭ
溶解し、１.０Ｍ ＮaＣlで中和)および逆転写酵素(ラ
イフ・サイエンシズ・インコーポレイティッド(Ｌife
Ｓciences Ｉnc.)１単位／μgインプット(input)ＲＮ
Ａ、最終反応容量５０μl。反応物を４２℃にて６０分
間インキュベートする。

【００９４】(Ｂ)プライマーとして特異的１５−体オリ
ゴヌクレオチドを用いる第一鎖の合成(ほぼ類似の方法
についてはパナビエレス・エフら(Ｐanabieres Ｆ.et a
l.)、ジーン(Ｇene)、１９巻、３２１〜６(１９８２)参
照)。

【００９５】３'ポリＡテイル部を合成始点とするmＲＮ
ＡからのＴＰＡについてコード付けする完全なcＤＮＡ
鎖を得るのは、前記方法を用いて常には可能でない。恐
らくポリＡテイル部から上流の配列を合成始点とするこ
とによって、ポリＡテイル配列で開始した不完全cＤＮ
Ａに連結できる５'ＴＰＡコーディングcＤＮＡの配列が
得られる。

【００９６】cＤＮＡ合成用のプローブまたはプライマ
ーのいずれかとして用いるには、３種の１５体が好まし
い。それらの配列は: ３'ＴＰＡ位置に対して相補的 ５' ３' １． ＴＣＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＣＡＴ ＧＴＴ １７５９〜１７７３ ２． ＧＧＧ ＧＴＴ ＴＧＡ ＧＴＣ ＴＣＧ ６３４〜６４８ ３． ＣＣＣ ＡＴＣ ＡＧＧ ＡＴＴ ＣＣＧ ８８６〜９００ それらは前記方法によって合成され、精製される。

【００９７】ポリＡ＋選択したＲＮＡの２５μgをプラ
イマー(鋳型に対して５〜１０倍ピコモル過剰のプライ
マー)１μgおよび５８μl中の１.５mＭ ＥＤＴＡと共
に９０℃にてインキュベートする。最初９０℃まで加熱
した５ml水浴中に浸漬することによって、混合物をゆっ
くりと室温まで平衡化する。ＲＮＡ鋳型に対する該１５
体をアニールした後、以下の試薬を加える: ジチオスレ
イトール(ＤＴＴ)〜２mＭ; ＲＮasin１単位／μl最終反
応容量; １００mＭ トリス塩基、pＨ８.３;１１mＭ
ＭgＣl₂; ５０mＭ ＫＣl; １００μＣi α−³²Ｐ−d
ＣＴＰ; 各５００μmのdＧＴＰ、dＴＴＰ、およびdＡＴ
Ｐ; ２５０μＭ dＣＴＰ; 逆転写酵素(ライフ・サイエ
ンス・インコーポレイティッド(Ｌife Ｓcience Ｉn
c.))〜１単位／μgＲＮＡ。２０℃にて３時間インキュ
ベーションを行い、その時点で等量の逆転写酵素をさら
に加え、５０°にて３０分間反応を継続する。フェノー
ル抽出によって反応を停止し、マニアティス中に詳細に
記載されている如く、アルカリ加水分解によってＲＮＡ
鋳型を除去する。

【００９８】(Ｃ)第二鎖の合成 最終容量１００μlで、４０mＭ ＫＰＯ₄(Ｋ−ホスフェ
ート)pＨ７.５; ６.６mＭ ＭgＣl₂; １mＭ ＤＴＴ;
各５００μmのdＧＴＰ、dＴＴＰ、dＡＴＡ; ２５０μmd
ＣＴＰ; １００μＣi ³Ｈ−dＣＴＰ(アメルスハム(Ａme
rsham))およびＤＮＡポリメラーゼクレノーフラグメン
ト(ＢＲＬ)の１単位／μgインプット(input)ＲＮＡより
なる反応にて第二鎖を合成する。反応物を１５℃にて４
時間インキュベートするが、続いて、³Ｈ−dＣＴＰの取
込みをモニターすることもできる。フェノール抽出によ
って反応を停止し、第一エタノール沈澱の代わりに(Ｎa
Ｃl〜０.３Ｍよりむしろ)ＮＨ₄Ａcを２.５Ｍ加える以外
は第一鎖の合成について前記した如く二本鎖cＤＮＡを
沈澱させる。

【００９９】Ｓ₁を用いてヘアピン構造を除去する。該
Ｓ₁反応はマニアティスにより行う。ＴＣＡ可溶カウン
トの増加によりヘアピンの除去が成功したことが測定さ
れる。沈澱を省略してフェノール抽出によって反応を停
止する。水性相をプールし、直接ポリＡ⁺mＲＮＡの分画
に用いたのと同一のスクロースグラジエントに付す。画
分を収集し、５μlをアクアフルオール(Ａquafluor)シ
ンチレーション流体(ニュー・イングランド・ヌクレア
(Ｎew Ｅngland Ｎuclear))１０ml中に溶解し、³²Ｐお
よび³Ｈを共に測定することによって検定する。２倍容
量のエタノールを加え、ドライアイス上で３０分間イン
キュベートすることによって関連画分からのcＤＮＡを
沈澱させる。エペンドルフ(Ｅppendorf)マイクロヒュー
ジ(microfuge)中、室温にて１５分間遠心することによ
って沈澱物をペレット化する。ペレットを滅菌０.３Ｍ
ＮaＣlに溶解し、プールし、再沈澱させる。沈澱物を
ペレット化し、乾燥する。

【０１００】(Ｄ) cＤＮＡのベクターＤＮＡへのティリ
ング(tailing)およびアニーリング マニアティス(Ｍaniatis)によって記載されている方法
によって、dＣＴＰのホモポリマー系をcＤＮＡ分子の
３'末端に酵素的に加える。理想的には、dＣＴＰの１０
〜３０残基を加えてクローニング効率を最大化すべきで
ある。

【０１０１】(ｐＢＲ３２２を消化してＰst１で完成
し、dＧＴＰ残基のホモポリマー系を添加することによ
って調製した)ベクターＤＮＡはニュー・イングランド
・ヌクレア(Ｎew Ｅngland Ｎuclear)から商業的に入手
可能である。該ベクターＤＮＡはマニアティスによって
記載されている方法によっても調製できる。ベクターＤ
ＮＡと共にcＤＮＡをアニールする方法もマニアティス
によって記載されている。簡単に述べると、１０mＭト
リスpＨ７.４; ０.４Ｍ ＮaＣl; １mＭ ＥＤＴＡを含
有する５０μlの反応において、テイリングを行ったcＤ
ＮＡを１:１のモル比でベクターと混合する。最終ＤＮ
Ａ濃度は２０〜６０μg／ml間で変化する。アニーリン
グは、１)６５°／１０分; ４２°／６０分; ３７°／
２時間、および次いで室温での２時間よりなる定義した
インキュベーション処理に付すか、または２)水浴を閉
じて６５°／１０分にてインキュベートし、次いでゆっ
くりと一晩で室温まで平衡化させるかのいずれかによっ
て行う。

【０１０２】(Ｅ)完全長ＴＰＡ cＤＮＡのクローニング
および配列確認 チャート４〜５ 既に記載した形質転換法を用いて、cＤＮＡ含有ベクタ
ーをイー・コリ(Ｅ．coli)中に導入する。前記したハイ
ブリダイゼーション法を用いて該細菌をインシテュ(in
situ)スクリーニングする。

【０１０３】本明細書中に記載するコロニーハイブリダ
イゼーションはプローブとして同様に前記した１５体を
用いる。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる
には、７０mＭトリス塩基(pＨ７.６)、１００mＭ ＫＣ
l; １０mＭ ＭgＣl₂、５mＭジチオスレイトール、およ
び５０μＣiγ³²Ｐ dＡＴＰ(ピイ・エル・バイオケミカ
ルズ(Ｐ.Ｌ.Ｂiochemicals))、ならびにポリヌクレオチ
ドキナーゼ(ニュー・イングランド・バイオラブズ(Ｎew
Ｅngland Ｂiolabs))１Ｕよりなる５０μl反応容量中
で、１５−体１μgをリン酸化する。インキュベーショ
ンは３７°において６０分間行う。このようにして、１
５−体を１μgにつき１×１０⁸cpmの特異的活性にラベ
ルすることができる。

【０１０４】クローンのＰst１制限分析を用い、プロー
ブに対して相補性配列を示すクローンを第二のスクリー
ニングについて選択して、消化産物が、配列番号１の配
列表に示すまたはペニカら(Ｐennica et al.)「イー・コ
リ(Ｅ．coli)におけるヒト組織タイププラスノーゲンア
クチベーターcＤＮＡのクローニングおよび発現」、ネイ
チャー(Ｎature)、３０１巻、２１４〜２１頁(１９８３
年１月２０日)により示された配列から得ることができ
るＰst１制限マップと合致するかどうかを決定する。望
ましいクローンはＴＰＡ cＤＮＡの３'部の大きな部分
である。消化により４種のフラグメント: 元のpＢＲ３
２２ベクター、１１５０bpフラグメント、８０bpフラグ
メントおよび７８bpフラグメントを得る。これらの結果
は、遺伝子の３'末端の約１３００bpの挿入大きさ(ヌク
レオチド１２５０〜２５５０)を示唆する。この仮定を
確認するために、クローンをＰst１およびＤde１で二重
消化する。後者の酵素は１１５０bpフラグメントを切断
して９２６bpフラグメントと２２９bpフラグメントと
し、一方、７８または８０bpフラグメントを無傷で残す
べきである。かかる二重消化の結果は、クローンが事実
ＴＰＡ遺伝子の３'末端を示すという結論を支持するで
あろう。

【０１０５】最後の証拠として、ＤＮＡのミニ調製物を
クローンから単離し、ジデオキシ鎖停止によって配列す
る。一般法の節に記載した如くにプラスミドＤＮＡのミ
ニプレプを調製する。２０:１モル過剰の鋳型中、１５
体＃１をプライマーとして用いて、一般法の節に記載し
た如くにジデオキシ配列決定を行う。pＴＰＡ Ｈで示
すこのクローンから得られた配列データは、ヒト組織プ
ラスノーゲンアクチベーターについてのペニカら(Ｐenn
ica et al.)、ネイチャー(Ｎature)、３０１巻、２１４
〜２１頁(１９８３)によって示された配列データと同一
である(チャート４)。

【０１０６】これより、遺伝子の５'末端の単離に焦点
をあてる。これを行うには、ＯdＴ_12-18からよりむしろ
１５体＃１からプライマー伸長させることによって、c
ＤＮＡを２回選択ポリＡ＋mＲＮＡから合成する。この
方法によって得られる利点は２つある。まず、プライマ
ー伸長がＴＰＡに対して特異的であるので、生成したc
ＤＮＡの高パーセンテージがＴＰＡの特異的配列によっ
て示される。第２に、プライマー伸長がポリＡテイル部
の約８００bp５'であり、該部位は第一鎖合成をプライ
マー伸長させるＯdＴ_12-18によって利用される。これに
よって、この方法から得られたcＤＮＡはpＴＰＡ Ｈよ
りもさらに５'を伸長させる転写を包含することがほぼ
確認される。

【０１０７】このＴＰＡ−プライマー伸長のcＤＮＡで
の形質転換効率はcＤＮＡ１μgにつき２.５×１０⁵形質
転換体である。合計２５０００の形質転換体の２のバン
クが生成する。ジーン・ウォーキング(gene−walking)
の概念を適用して故意にスクリーニングを偏らせる。p
ＴＰＡ Ｈ５'末端８０bp Ｐst１フラグメントをゲル
単離し、プライマー伸長バンクから得られた２８０００
コロニーをプローブするのに用いる。これにより少なく
ともpＴＰＡ Ｈと同様に５'まで伸びるクローン、およ
びプライマー伸長試行の結果、さらに５'配列を含有す
るクローンも同様に特異的に選択される。

【０１０８】インサイチュ・ハイブリダイゼーションに
よるスクリーニングは多くの陽性体を生成する。最も長
いＴＰＡ挿入はＰst１およびＤde１での第２のスクリー
ニングにおいて検知される。本発明においては、pＴＰ
Ａ８０−１で示すクローンはヌクレオチド５５０〜１６
００の挿入大きさを包含していた(チャート４)。

【０１０９】制限データは３'末端の位置をかなり正確
に(＋／−〜１０％)決定することを可能とする。プライ
マー伸長がヌクレオチド１７５９で開始し、およびpＴ
ＰＡ８０−１が約１６００位置に３'末端を有するなら
ば、クローニングの間にどこかの位置にて約１６０個の
塩基対の損失が起こることになる。Ｓ₁エンドヌクレア
ーゼが最も可能性のある損失原因である。

【０１１０】pＴＰＡＨおよびpＴＰＡ８０−１の配位を
決定する。プラスミドpＴＰＡＨおよびpＴＰＨ８０−１
をＳacＩおよびＰvu１で切断して各々フラグメント７
(１２５１bp)および８(５.１kb)を得、これをゲル単離
する。該フラグメントを細菌アルカリ性ホスファターゼ
で処理し、Ｔ４ポリメラーゼを用いて結んでＴＰＡ cＤ
ＮＡの位置５５０〜２２３０塩基を有するpＴＰＡ３'c
ＤＮＡ(６.３kb)を得る。新しい組立体をＰst１消化に
よって確認する。

【０１１１】pＴＰＡ８０−１は第一のプライマー伸長
バンクにおいて検知される陽性体の中でも最も長いＴＰ
Ａ挿入を示すので、アミノ酸残基２３３〜２３７のコー
ディング配列に対して相補的な第二のオリゴヌクレオチ
ド(ヌクレオチド８８６〜９００; １５−体＃２)を用い
てもう１つのcＤＮＡライブラリーを生成し、５'末端を
完成する。もし、Ｓ₁が転写の３'末端から２００bpまで
も除去するならば、pＴＰＡ３'cＤＮＡでの十分な重複
がなお存在してフラグメントの組立が可能となるように
遺伝子のこの特定領域を選択する。

【０１１２】５'塩基を含有するcＤＮＡをＰst１切断p
ＢＲ３２２に結び、前記の如くにイー・コリ(Ｅ．coli)
に形質転換した。このcＤＮＡでの形質転換効率は３.６
×１０⁴形質転換体／μg cＤＮＡの桁である。ヌクレオ
チド６４５〜６６０(１５−体＃３)から伸長するコーデ
ィング配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドでこの
ライブラリーからのコロニーをスクリーニングし、明ら
かな陽性体を選択する。Ｐst１およびＢgIII消化によっ
て第二のスクリーニングを行い、pＴＰＡ５'cＤＮＡで
示す１のクローンは残存する５'配列１〜７５０を含有
することが示された。再び、Ｓ₁の挿入長に対する影響
はpＴＰＡ５'cＤＮＡに関して明らかである。プライマ
ー伸長はヌクレオチド８８６にて開始するが、pＴＰＡ
５'cＤＮＡはヌクレオチド約７５０個しか伸長しない;
発明者らの実験は約１３６bpの損失を示した。

【０１１３】２のクローン(pＴＰＡ３'cＤＮＡおよびp
ＴＰＡ５'cＤＮＡ)について利用可能な完全なＴＰＡ配
列に関し、最後の組立作業が残る。方法はチャート５に
示す。

【０１１４】プラスミドpＴＰＡ５'cＤＮＡをＴaq１で
切断してフラグメント９(２１９４bp)を得る。pＴＰＡ
５'cＤＮＡのＴＰＡ配列内の１のＴaq１部位(位置６３
４)は高度に酵素耐性である。フラグメント９をＢgl II
およびＨgaＩで切断して蛋白質の成熟部分を表わすＴＰ
ＡcＤＮＡの塩基１８８〜５９３を有するフラグメント
１０(４０５kb)を得る。

【０１１５】ＴＰＡ cＤＮＡの中央部分は、まずpＴＰ
Ａ３'cＤＮＡをＰuvIIで切断し、フラグメント１１(１
７４８bp)をＥcoＲＩ分離することによって得られる。
ついで、フラグメント１１をＨgaＩで切断して塩基５９
４〜８０２を含有するフラグメント１２(２０９bp)を得
る。

【０１１６】cＤＮＡの３'部分を得るには、pＴＰＡ３'
cＤＮＡをＰuvＩで消化し、６.５kbフラグメントを単離
し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＥcoＲＩで部分的に消
化して塩基８０２〜２２３０を含有するフラグメント１
３(１８７１bp)を得る。

【０１１７】cＤＮＡの３つの部分の結びは、公に入手
でき、かつラオ・アール・エヌおよびロジャース・エス
・ジイ(Ｒao Ｒ.Ｎ.and Ｒogers Ｓ.Ｇ.)、プラスミドp
ＫＣ７: ＤＮＡセグメントをクローンするのに適当な１
０の制限部位を含有するベクター、ジーン(Ｇene)７:
７９〜８２(１９７９)に詳細に記載されているpＫＣ７
の使用を含む。プラスミドpＫＣ７をＢgl IIおよびＳma
Ｉで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで処理して
フラグメント１４(４.８kb)を得、これをゲル単離す
る。

【０１１８】フラグメント１０、１２、１３および１４
を単一の結びプールにおいて結ぶ。この方法の１の注目
すべき態様は、それにより内部フラグメントのアルカリ
性ホスファターゼ処理の必要性が排除される方法であ
る。

【０１１９】典型的には、多数片(＞４フラグメント)結
びはフラグメントのコンカテマー化のための非常に低い
効率で所望の組立てを実現する。適当な方法にてのアル
カリ性ホスファターゼでの処理はこの問題を最小限と
し、その結果、正しい多数片組立ての効率が劇的に増加
する。ＴＰＡフラグメントを組立てるにおいて、発明者
らは、制限エンドヌクレアーゼＨgaＩがＤＮＡを切断す
る特別な方法を利用した。酵素の認識(結合)配列はＧＡ
ＣＧＣであるが、該酵素はその認識部位を超えた地点で
切断を行う。その結果、ＨgaＩで切断されたフラグメン
トはそれらの元々隣接していた反対部分でのみ結ばれ
る。ＨgaＩ突出部分によって促進される自己結びは起こ
り得ない。該４片ＴＰＡ結びはＨgaＩ末端を有する２の
フラグメントを含有する。(自己閉鎖を最小化するため
に)ベクターをアルカリ性ホスファターゼで処理するこ
とを付け加えることにより、その結果ほとんどの形質転
換体が正しく組立てられたＴＰＡ遺伝子を有することに
なる。正しい組立ては制限的消化によって証明される。
ＴＰＡについての完全なcＤＮＡ配列を含有するプラス
ミドをpＴＰＡcＤＮＡ(７.４kb)で示す。

【０１２０】

【実施例】

実施例１． 合成オリゴヌクレオチドの調製 前記した方法により８７種の別々のオリゴヌクレオチド
(表９〜１２参照)を合成した。記載した方法により、位
置１８７におけるＢgl II部位および位置１２８７にお
けるＥcoＲＩ部位間の合成ＤＮＡの１０８４塩基対を組
立ててpＴＰＡ−Ｂ１、２、３に入れる(チャート９)。
インタードメイン領域への挿入のために選択した特異的
制限部位はチャート１０および１１に示す。各ブロック
をイー・コリ(Ｅ．coli)における複製用のおよび配列証
明用の適当なクローニングベクターと再び組み合わせ
る。用いたすべての結びおよびクローニング方法はマニ
アティスら(Ｍaniatis et al.)、前掲、によって記載さ
れた通りである。すべてのクローンした配列をサンガー
(Ｓanger)ジデオキシ配列決定法を用いて配列して配列
を証明する。

【０１２１】ブロック１． オリゴヌクレオチドＰ１−
Ｐ４、Ｐ８−Ｐ１１をアニールし、結んで二本鎖セグメ
ントを得、これをオリゴヌクレオチドＰ５−Ｐ７および
Ｐ１２−Ｐ１４よりなる第２のセグメントに結ぶ。得ら
れたブロック１はフィンガー(finger)ドメインについて
コード付けする配列を含有する。ブロック１をクローン
して調製例１に記載したpＳＫ４のＢgl IIおよびＳphＩ
部位に入れる。

【０１２２】ブロック２． フィンガー(finger)ドメイ
ンについてコード付けする配列を含有するオリゴヌクレ
オチドＰ１５−Ｐ１８およびＰ１９−Ｐ２３を単一工程
のアニーリングおよび結びにおいて一緒に結んでブロッ
ク２を得、クローンしてpＢＲ３２２のＳphＩおよびＣl
aＩ部位に入れる。

【０１２３】ブロック３． オリゴヌクレオチドＰ２４
−Ｐ２８、Ｐ３４−Ｐ３８をアニールし、結んで二本鎖
セグメントを得、これをオリゴヌクレオチドＰ２９−Ｐ
３３およびＰ３９−Ｐ４３よりなる第２のセグメントに
結ぶ。得られたブロック３はクリングル(kringle)１ド
メインについてコード付けする配列を含有する。ブロッ
ク３をクローンしてpＢＲ３２２のＣlaＩおよびＢamＨ
Ｉ部位に入れる。

【０１２４】ブロック４． オリゴヌクレオチドＰ４４
−Ｐ４７およびＰ６７−Ｐ７０; Ｐ４８−Ｐ５１および
Ｐ７１−７４; Ｐ５２、Ｐ５３、Ｐ９２、Ｐ９３および
Ｐ７５、Ｐ７６、Ｐ９４、Ｐ９５; Ｐ５７−Ｐ６１およ
びＰ８０−Ｐ８４; ならびにＰ６２−Ｐ６６およびＰ８
５−Ｐ８９を各々５個の別の試験管中でアニールして二
本鎖セグメントとし、次いでこれらをプールし、結んで
ブロック４を得る。ブロック４はクリングル(kringle)
２ドメインについてコード付けするＤＮＡ配列を含有す
る。ブロック４をクローンしてpＢＲ３２２のＢamＨＩ
およびＥcoＲＩ部位に入れる。

【０１２５】実施例２． ＴＰＡ cＤＮＡの活性部位を
用いてのブロック１−４の組立て、チャート６〜１１ 以下の実施例は、実施例１の各種合成ブロックを組立て
て生物学的に活性なＴＰＡについてコード付けすること
ができる遺伝子に入れるのに必要な工程の要約を提供す
る。２つの始原型遺伝子を記載する。プラスミドpＴＰ
Ａ−Ｂ１、２、３、４(a)はクローン(kringle)２ドメイ
ンおよび活性部位間に人工的に導入されたエンドヌクレ
アーゼ部位を有しないＴＰＡをコード付けする遺伝子を
有する。プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４はクリ
ングル(kringle)２および活性部位間に人工的に導入さ
れたエンドヌクレアーゼ制限部位を有するＴＰＡをコー
ド付けする遺伝子を有する。

【０１２６】Ａ．pＴＰＡ−Ｂ１の組立て−チャート６ プラスミドpＳＫ４をＣlaＩおよびＳphＩで消化し、大
きな４.１kbフラグメント１５を単離し、ＣlaＩ／Ｘba
Ｉリンカーを用いてブロック１フラグメントに結ぶ。マ
ニアティスによって記載された塩化カルシウム形質転換
法を用いて、結んだ混合物をＨＢ１０１に形質転換す
る。マニアティスら(Ｍaniatis et al.)によって記載さ
れたニックトランスレーション法を用いて、形質転換体
をニックトランスレーションを行ったブロック１フラグ
メントでスクリーニングを行う。次いで、サンガー(Ｓa
nger)ジデオキシ配列決定法を用いて、プローブに対し
ハイブリダイゼーションされた形質転換体を配列して正
しい配列および配位を確認する。この新しい形質転換体
をpＴＰＡ−Ｂ１(４.２５kb)で示す。

【０１２７】Ｂ．pＴＰＡ−Ｂ１、２の組立て−チャー
ト７ プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１をＥcoＲＩおよびＳphＩで消
化し、フラグメント１６(４５０bp)を単離する。プラス
ミドpＢＲ３２２をＥcoＲＩおよびＣlaＩで消化し、大
きなフラグメント１７(４.３５kb)をゲル単離する。次
いでフラグメント１６および１７を合成したＳphＩ／Ｃ
laＩブロック２に結ぶ。結んだ混合物をＨＢ１０１に形
質転換し、形質転換体をニックトランスレーションを行
ったブロック２でスクリーニングを行う。プローブに対
してハイブリダイゼーションされた形質転換体を配列し
てそれらが正しい配位にあるブロック２を含有すること
を確認する。この組立体をpＴＰＡ−Ｂ１、２(４.８kb)
で示す。

【０１２８】Ｃ．pＴＰＡ−Ｂ１、２(a)の組立て−チャ
ート８ プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２(a)はフィンガー(finger)
および発育因子ドメインから上流にＨind IIIおよびＢg
l II制限部位を含有する。プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、
２をＸbaＩおよびＥcoＲＩで消化し、大きな４.５kbフ
ラグメント１８をゲル単離し、Ｈind IIIおよびＢgl II
部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカーに結ぶ。結
んだ混合物をＨＢ１０１に形質転換し、形質転換体をＨ
ind III／Ｂgl II部位の存在についてスクリーニングす
る。新しい組立体をpＴＰＡ−Ｂ１、２(a)(４.５kb)で
示す。

【０１２９】Ｄ．pＴＰＡ−Ｂ１、２、３の組立て−チ
ャート９ プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２(a)をＣlaＩおよびＢamＨ
Ｉで消化し、大きな４.０kbフラグメント１９を単離す
る。このフラグメントをブロック３(２７０bp)よりなる
合成したＣlaＩ／ＢamＨＩクリングル(kb)１領域に結
び、ＨＢ１０１に形質転換する。形質転換体をニックト
ランスレーションを行ったブロック３でスクリーニング
した。ブロック３に対してハイブリダイゼーションした
形質転換体を配列して配列および配位を確認した。この
新しい組立体をpＴＰＡ−Ｂ１、２、３(４.３kb)で示
す。

【０１３０】Ｅ．pＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４aの組立て
−チャート１０ このプラスミドは酵素活性を有するＴＰＡ同族体につい
てコード付けする全始原型ＴＰＡ遺伝子を含有する。こ
の遺伝子には、クリングル(kringle)２および活性部位
間のインタードメイン領域に対する変化はない。pＴＰ
Ａ−Ｂ１、２、３、４a(４.２kb)の組立てにはいくつか
の工程を必要とする。プラスミドpＴＰＡ cＤＮＡ(チャ
ート５)をＳcaＩで切断し、ＴＰＡ遺伝子の３'端部をつ
いてコード付けするフラグメント２０(６.０bp)をゲル
単離する。プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３(チャート
９)をＳcaＩおよびＢamＨＩで切断してフィンガー(fing
er)、発育因子およびクリングル(kringle)１ドメインを
含有するフラグメント２１(１１００bp)を得る。ブロッ
ク４をＢamＨＩおよびＳcaＩで切断することによって第
３のフラグメント４a(２３０bp)を得る。Ｔ４リガーゼ
を用いて３つのフラグメントを結んでpＴＰＡ−Ｂ１、
２、３、４＊を得る。Ｈind IIIおよびＡatIIを用いて
ＴＰＡ遺伝子をpＢＲ３２２から切断して２.２kbフラグ
メントを得、これをpＵＣ−１９に継代クローンする。
プラスミドpＵＣ−１９は種々の源から商業的に入手可
能であり、ＴＰＡドメインの操作を面倒でなくする選択
した制限部位をそのＤＮＡ配列中に含有する。

【０１３１】Ｆ．pＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４の組立て
−チャート１１ このプラスミドは酵素的に活性なＴＰＡ同族体について
コード付けする全始原型ＴＰＡ遺伝子を含有する。この
同族体において、すべての４のドメインおよび活性部位
はユニーク制限部位がクリングル(kringle)２および活
性部位間の領域を包含するすべてのインタードメイン領
域中に入れられた状態で存在する。まずpＴＰＡ−Ｂ
１、２、３、４aをＥcoＲＩおよびＢamＨＩで切断し、
フィンガー(finger)、発育因子およびクリングル(kring
le)１ドメインを含有する大きな３.７kbフラグメントを
単離することによってプラスミドを組立てる。合成によ
り生成したブロック４を、ＢamＨＩでの消化およびＥco
ＲＩでの部分的消化によりそのクローンから得て５６０
kbを有する無傷のブロック４を得る。Ｔ４リガーゼを用
いて２つのフラグメントを結んでpＴＰＡ−Ｂ１、２、
３、４を得る。プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４a
およびpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４は種々の合成ＴＰＡ
同族体を組立てるのに用いることができる。

【０１３２】実施例３． ＴＰＡ同族体の組立て Ａ．pＦＫ１Ｋ２Ａの組立て(発育因子ドメインの欠失)
プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４aをＥcoＲＶで、
およびＨpaＩで部分的に消化して７２４ではなく３３４
における部位を消化する。大きなフラグメント(４.１k
b)を単離し、再び結んでpＦＫ１Ｋ２Ａを得る。次いで
プラスミドpＦＫ１Ｋ２ＡをＨＢ１０１またはいくつか
の他の適当な宿主に形質転換する。次いで正しい配位お
よび配列について該プラスミドをスクリーニングする。

【０１３３】Ｂ．pＦＫ２Ａの組立て(発育因子およびク
リングル(Ｋringle)１ドメインの欠失) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４をＨpaＩで消化
する。大きな６.５kbフラグメントを単離し、再び結ん
でpＦＫ２Ａを得る。該プラスミドをＨＢ１０１または
いくつかの他の適当な宿主に形質転換し、正しい配位お
よび配列についてスクリーニングする。

【０１３４】Ｃ．pＦＫ２Ｋ２Ａの組立て−チャート１
２(発育因子およびクリングル(kringle)１の欠失ならび
にクリングル(kringle)２の複製) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４(チャート１１)
をＨpaＩで消化してフラグメント２２(３.９kb)を得、
これを単離する。pＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４の第２の
試料をＨpaＩおよびＭstＩで消化し、クリングル(kring
le)２ドメインを含有する得られた５６０bpフラグメン
ト２３を単離する。ＨpaＩ消化のＦＫ２Ａフラグメント
を平滑末端でＨpaＩ／ＭstＩフラグメントに結んでpＦ
Ｋ２Ｋ２Ａ(４.１kb)を得る。次いでプラスミドpＦＫ２
Ｋ２ＡをＨＢ１０１に形質転換し、正しい配位および正
しい配列についてスクリーニングする。

【０１３５】Ｄ．イー・コリ(Ｅ．coli)プラスミドpＴ
ＰＡＥxp１における発現−チャート１３ ＴＰＡ同族体の発現は、チャート７に示す発現プラスミ
ドpＴＰＡ−Ｂ１、２、チャート６に示すpＴＰＡ−Ｂ
１、またはそれらの均等体を用いることによってイー・
コリ(Ｅ．coli)で達成できる。いずれの同族体も発現用
のＸbaＩおよびＢamＨＩ部位内に置くことができる。イ
ー・コリ(Ｅ．coli)においてpＦＫ２Ｋ２Ａを発現する
には、pＴＰＡ−Ｂ１、２(チャート７)およびpＦＫ２Ｋ
２Ａ(チャート１２)をＸbaＩおよびＢamＨＩで切断し、
フラグメント２４(４.２kb)および２５(２.０kb)をゲル
単離する。フラグメント２４および２５を結んで発現プ
ラスミドpＴＰＡＥxp１(６.２kb)を得る。

【０１３６】プラスミドpＴＰＡＥxp１はＴrpプロモー
ターおよびオペレーターを含有し、発現は構成的であ
る。イー・コリ(Ｅ．coli)の培養はマニアティス(前掲)
による。該イー・コリ(Ｅ．coli)培養は活性なＴＰＡを
産生しないであろう。イー・コリ(Ｅ．coli)によって産
生されたＴＰＡは再び折り畳んで天然状態としなければ
ならない。公知のシステイン再シャフリング(shufflin
g)法によって活性ＴＰＡを得ることができる。米国特許
第４５１１５０２号。

【０１３７】実施例４． 真核生物における発現 Ａ．酵母におけるヒトＴＰＡの発現 本実施例は、ＭＦα１プロモーターおよびpre−pro配列
を有する酵母発現プラスミドpα１−ＦＫ２Ｋ２Ａの組
立てを説明する。酵母におけるＴＰＡ同族体の発現用の
培養条件および好ましい宿主株も提供する。

【０１３８】(１)pα１−ＡＤＨt、酵母発現ベクターの
組立て プラスミド、pα１−ＡＤＨtは酵母についての多目的発
現ベクターである。都合よい地点の制限部位がその構造
中に組み込まれており、ＭＦα１プロモーター下の制御
は一般に高レベルの発現に適合する。以下の工程はpα
１−ＡＤＨtの組立てを記載する(チャート１４〜１
８)。

【０１３９】a．pＹＲep３'Ｂの組立て−チャート１４ ＲＥＰ IIIおよび２μプラスミドの複製開始点配列をp
ＹＩＰ３１のＵＲＡ３遺伝子のＳamＩ部位に入れて都合
よいカセットを得ることによってプラスミドpＹＲep３'
Ｂを組立てる。プラスミド、２μおよびpＹＩＰ３１は
共に公に入手可能であり、文献中に詳細に記載されてい
る。該２μプラスミドは、「酵母サッカロミセス・セレ
ビシェ(Ｓaccharomyces cerevisiae)」[ライフ・サイク
ル・アンド・インヘリタンス(Ｌife cycle and inherit
ance)]、４４５〜４７０頁においてジェイ・アール・ブ
ローチ(Ｊ.Ｒ.Ｂroach)によって詳細に記載され、Ｒep
III領域はセル(Ｃell)３４: ９５〜１０４(１９８３)お
よびセル(Ｃell)３５: ４８７〜４９３(１９８３)に記
載されている。プラスミドpＹＩＰ３１はジーン(Ｇen
e)、１８: １７〜２４(１９７２)に記載されていた。

【０１４０】プラスミドpＹＩＰ３１をまずＳamＩで切
断し、細菌アルカリ性ホスファターゼで処理してフラグ
メント２６(５.４kb)を得、これを単離する。酵母の２
μプラスミドをＰstＩおよびＸbaＩで切断し、クレノー
で満たし、フラグメント２７(１.３kb)を単離する。Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼを用いてフラグメント２６および２
７を結んでpＹＲep３'Ｂ(６.７kb)を得る。

【０１４１】b．pＡＤＨtの組立て−チャート１５〜１
６ プラスミドpＡＤＨt(３.８６kb)は酵母発現ベクターを
組立てるのに有用な制限部位を供給するので有用であ
る。pＡＤＨtの組立用の出発プラスミドはpＧＧ４００
(４.０kb)である。プラスミドpＧＧ４００を公に入手容
易なプラスミドpＢＲ３２２およびpＭＬ２１から組立て
る。ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Ｊ.Ｂacte
r.)、１２６: ４４７〜４５３(１９７６)。具体的に
は、テトラサイクリン耐性についてコード付けするpＢ
Ｒ３２２の遺伝子をカナマイシン耐性についてコード付
けするpＭＬ２１の一部で置き換える。プラスミドpＢＲ
３２２をまずＥcoＲＩおよびＰvu IIで切断し、クレノ
ー酵素でＥcoＲＩ突出部を満たし、アガロースゲルから
単離してフラグメント２８(２.３kb)を得る。プラスミ
ドpＭＬ２１をＰuv IIで切断してカナマイシンに対する
耐性用の遺伝子を有するフラグメント２９(１.７kb)を
得る。満たしたＥcoＲＩ部位を用いてＰuv II切断部を
結ぶことにより、結んだ後、ＥcoＲＩ部位が再生する。
フラグメント２８および２９を結んでpＧＧ４００を
得、これをpＡＤＨtを組立てるのに用いる(チャート１
５)。

【１４２】pＧＧ４００をＰvu IIおよびＸhoＩで切断
し、クレノー酵素で処理してフラグメント３０(３.５k
b)を得、これを単離することによってプラスミドpＡＤ
Ｈtを組立てる。まず、Ｈinc IIおよびＢamＨＩで切断
し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、フラグメント３１(０.
３６kb)を単離することによって酵母アルコールデヒド
ロゲナーゼＩ(ＡＤＨＩ)の３'端部をpＡＤＨＢＣから得
る。プラスミドpＡＤＨＢＣは公に入手可能であり、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂ
iol.Ｃhem.)２５７: ３０１８〜１０２５(１９８２)に
詳細に記載されている。フラグメント３０および３１を
結んで特にpＡＤＨtを得、イー・コリ(Ｅ.coli)に形質
転換する。pＡＤＨtを有するそれらの形質転換体はそれ
らのプラスミドにおいてＢamＨＩおよびＸhoＩ部位を再
生するであろう。これらの形質転換体を選択し、制限酵
素分析法および配列決定法によってクローンしたＡＤＨ
Ｉ３'端部の正しいことを確認する(チャート１６)。

【０１４３】c．pＡＤＨt−ＲＥＰ IIIの組立て−チャ
ート１７ プラスミドpＡＤＨt−ＲＥＰ III(６.２kb)は、ＵＲＡ
３−ＲＥＰ III−複製開始点カセットをpＡＤＨtに入れ
て酵母における発現および複製を容易とするpＡＤＨtお
よびpＹＲep３１Ｂの組立体である。ＥcoＲＩ−ＨindII
IまたはＥcoＲＩ−ＳmaＩフラグメントは適当な酵母プ
ロモーターを有する所望のＤＮＡフラグメントで置き換
えることができる、あるいはそれは複製開始点、選択可
能なマーカーおよび酵母ＵＲＡ３遺伝子の３'端部を有
するＳalＩ−ＸhoＩフラグメントを供給するのに用いる
ことができるので、プラスミドpＡＤＨt−ＲＥＰIIIは
発現ベクターの組立てに有用である。ＢamＨＩで切断
し、端部をクレノー酵素で満たし、８−体ＳalＩリンカ
ーを満たしたＢamＨＩ部位に挿入することによってプラ
スミドpＡＤＨtを修飾する。(修飾した)プラスミドpＡ
ＤＨtをＳphＩで切断し、端部をＴ４ポリメラーゼで満
たしてフラグメント３２(３.８kb)を得る。プラスミドp
ＹＲep３１ＢをＨindIIIで切断し、ＵＲＡ３の３'端部
および安定性を増大させると考えられる２μＲepIII領
域ならびに複製開始点を含有させてフラグメント３３
(２.４kb)を単離する。フラグメント３２および３３を
結び、時計回りの転写を可能とする配位のＵＲＡ３遺伝
子を持つプラスミドを有するイー・コリ(Ｅ．coli)形質
転換体をスクリーニングしてpＡＤＨt−ＲＥＰIIIを得
る。

【０１４４】d．pα１−ＡＤＨtの組立て−チャート１
８ pＡＤＨt−ＲＥＰIIIのＥcoＲＩ−ＨindIIIフラグメン
トをプロモーターおよびＭＦα１遺伝子のpre−pro配列
を含有するpα１からのＥcoＲＩ−ＨindIIIフラグメン
トで置き換えることによってpα１−ＡＤＨt(６.５kb)
の組立て完成する。プラスミドpα１はエイ・シンら
(Ａ.Ｓingh et al.)、ヌクレイック・アシッド・リサー
チ(Ｎucleic Ａcid Ｒesearch)、１１: ４０４９〜６
３(１９８３)およびジェイ・クルヤンら(Ｊ.Ｋurjan et
al.)、セル(Ｃell)、３０: ９３３〜９４３(１９８３)
によって詳細に記載されている。プラスミドpＡＤＨt−
ＲＥＰIIIをまずＥcoＲＩおよびＨindIIIで切断してフ
ラグメント３４(５.３kb)を得、これを単離する。ま
た、プラスミドpα１をＥcoＲＩおよびＨindIIIを切断
してフラグメント３５(１.２kb)を得、これを単離す
る。次いでフラグメント３４および３５をＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて結んでpα１−ＡＤＨtを得る。

【０１４５】(２)pα１−ＦＫ２Ｋ２Ａの組立て、ＴＰ
Ａ同族体cＤＮＡの酵母発現ベクターへの挿入−チャー
ト１９ 酵母中でＴＰＡ同族体を産生するための好ましい発現ベ
クターをＭＦα１プロモーターを有するpα１−ＦＫ２
Ｋ２Ａで示す。プラスミドpＦＫ２Ｋ２Ａ(チャート１
２)をＢgl IIで切断してフラグメント３６(２.０kb)を
得、これをゲル単離する。プラスミドpα１−ＡＤＨtを
ＨindIIIおよびＸhoＩで切断してフラグメント３７(５.
６kb)を得、転写、ポリアデニレーションおよび翻訳部
位を供給する。本明細書中で記載する系は成熟ＴＰＡ蛋
白質より下流で停止し、得られた産生物は酵母起源の少
しのアミノ酸をさらに有するであろう。ＴＰＡ遺伝子の
正確な端部で翻訳を停止するために、停止コードンを供
給することができる。

【０１４６】同族体がＭＦαpre−pro配列の解読フレー
ムと同相であることを確認するには、同族体の５'およ
び３'端部を変化させない。もう１つのリンカーを挿入
するかあるいはクレノー(ＰolＩ)およびマングビーン
(Ｍung Ｂean)ヌクレアーゼと組み合わせるのいずれか
によって５'端部におけるＢgl II部位を操作して解読フ
レームをＭＦα１“pre−pro"配列と同相に維持しつつ
ＨindIII部位を得ることができる。本実施例について
は、アデノシンおよびグアノシンと共にクレノーを用い
てフラグメント３７のＢgl II部位を部分的に満たす。
次いで部分的に満たした部分をマングビーン(Ｍung Ｂ
ean)ヌクレアーゼで平滑末端とし、pα１−ＡＤＨtのＨ
indＩＩＩ部位に結ぶ。(端部を部分的に満たした)フラ
グメント３６および３７を結んでpＦＫ２Ｋ２Ａ(７.６k
b)を得る。解読フレームが酵母配列と同相に維持される
限り、他の同族ＴＰＡ遺伝子を平滑末端として発現ベク
ターに挿入することもできる。

【０１４７】(３)酵母におけるプラスミドpα１−ＦＫ
２Ｋ２ＡからのＴＰＡ同族体の発現 酵母株ＹＮＮ２２７(α、ura３−５２ trp１−２８９)
をpα１−ＦＫ２Ｋ２Ａで形質転換する。グルコース最
小培地(２％グルコース、０.７％酵母窒素ベース、１％
カザミノ酸、４０μg／mlアデニン、５０μg／mlトリプ
トファン)中で形質転換体を１０時間増殖させる。次い
で遠心により細胞をペレット化する。ガラスビーズで撹
拌することによって細胞を溶解する。ＴＰＡ量はウェス
タンブロッティング法またはラジオイムノアッセイ法あ
るいはクセノプス(Ｘenopus)卵母細胞について前記した
寒天中のカゼイン酵素アッセイ法を用いて検知すること
ができる。

【０１４８】まず、０.５mmガラスビーズで溶解し、続
いてアフィニティカラム上で精製することによってＴＰ
Ａを酵母細胞から単離することができる。標準的な蛋白
質精製法を適用してさらに精製を行うことができる。

【０１４９】Ｂ．チャイニーズハムスター卵巣細胞にお
けるＴＰＡ同族体の発現−チャート２０〜２２ 以下の実施例はチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細
胞においてpＦＫ２Ｋ２Ａを発現する好ましい方法を示
すものである。要約すると、各々イー・コリ(Ｅ．coli)
およびＣＨＯ細胞においてアンピシリン耐性およびジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子をマーカーとして用いてＣＨＯ
およびイー・コリ(Ｅ．coli)の両細胞において複製する
シャトルベクターpＳＶＣＯＷ７をここに開示する。プ
ラスミドpＳＶＣＯＷ７は、また、ＣＨＯ細胞における
発現に必要なウシ成長ホルモンからのポリアデニレーシ
ョン配列を供給するものである。プラスミドpＳＶＣＯ
Ｗ７をまず切断し、細菌プロモーターおよびＴＰＡ同族
体を挿入する。ＣＨＯ細胞において発現されるＴＰＡに
ついての形質転換培養条件および抽出方法も以下に記載
する。

【０１５０】(１)pＳＶＣＯＷ７の組立て−チャート２
０ (アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａme
rican Ｔype ＣultureＣollection)から入手可能な、あ
るいはエス・スブラマニら(Ｓ．Ｓubramaniet al．)、
「シミアン(Ｓimian)ウイルス４０におけるマウスジヒド
ロ葉酸還元酵素相補性デオキシリボ核酸の発現」、モレ
キュラー・アンド・セリユラー・バイオロジー(Ｍolecu
lar and Ｃelluar Ｂiology)２: ８５４〜８６４(１９
８１年９月)の方法により調製した)出発プラスミドpＳ
Ｖ２dhfrをＢamＨＩおよびＥcoＲＩで消化してアンピシ
リン耐性遺伝子、ＳＶ４０複製開始点、およびdhfr遺伝
子を含有するフラグメント３８(５.０kb)を得る。pＳＶ
ＣＯＷ７の第２の部分はpＳＶ２dhfrを切断するのに用
いたのと同一の制限エンドヌクレアーゼで消化してゲノ
ムウシ成長ホルモン遺伝子、すなわち、ＢＧＨ gＤＮＡ
の３'端部を含有するフラグメント３９を得るプラスミ
ドpλＧＨ２Ｒ２から得られる。プラスミドpλＧＨ２Ｒ
２は、イリノイ州、ペオリア(Ｐeoria)のノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ(Ｎorthern Ｒe
gional Ｒesearch Ｌaboratories)に寄託した(ＮＲＲＬ
Ｂ−１５１５４)イー・コリ(Ｅ．coli)ＨＢ１０１宿
主から公に入手可能である。フラグメント３８および３
９を結んでpＳＶＣＯＷ７(７.１kb)を得る。

【０１５１】(２)pＴＰＡ−cＤＮＡ、ＢamＨＩの組立て
−チャート２１ ＴＰＡ同族体をpＳＶＣＯＷ７に都合よく挿入するため
には、都合よいＢamＨＩ部位を成熟蛋白質配列から上流
にあるＴＰＡの先導配列内に挿入する必要がある。これ
を達成するには、pＴＰＡ５'cＤＮＡ(チャート５)をＨg
aＩで切断し、塩基７８〜５９３を含有するフラグメン
ト４０(５１７bp)をクレノー酵素で平滑にする。平滑末
端を１０−体ＢamＨＩリンカーに結び、フラグメント４
０をＮarＩで切断してＴＰＡ cＤＮＡの塩基６８〜５２
１を有するフラグメント４１を得る。

【０１５２】プラスミドpＴＰＡ−cＤＮＡ(チャート５)
をＮarＩおよびＢgl IIで切断し、ＴＰＡ cＤＮＡの３'
部分を含有するフラグメント４２(１６４４bp)をゲル単
離する。フラグメント４１および４２をpＫＣ７のＢam
ＨＩおよびＢgl II消化の結果得られたフラグメント４
３(４.３kb)に結んでpＴＰＡ−cＤＮＡ、ＢamＨＩ(６.
５kb)を得る。

【０１５３】(３)pＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡの組立て−チャ
ート２２ ＴＰＡドメインの天然配置を有するＴＰＡ修飾 cＤＮＡ
を含有するプラスミドpＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡはＣＨＯ細
胞によって発現されることが可能である、あるいはＴＰ
Ａ同族体を含有する別法発現プラスミドの組立を容易と
するのに用いることができる。pＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡの
組立ては２つの工程で達成される。まず、pＴＰＡ−cＤ
ＮＡからのＴＰＡ cＤＮＡをpＳＶＣＯＷ７に挿入し、
次いでサイトメガロウイルスの即時型プロモーターを挿
入してＴＰＡ同族体の転写を開始する。

【０１５４】工程１．プラスミドpＳＶＣＯＷ７をＥco
ＲＩおよびＰuvIIで切断し、ＢＧＨ遺伝子の３'ほとん
どのエクソンにおけるＰuvII部位から３'末端より下流
のＥcoＲＩ部位まで伸びるウシ成長ホルモンのポリアデ
ニレーション配列を含有するフラグメント４４(６００b
p)を得る。ＢＧＨポリアデニレーション配列の完全な記
載については、以下の文献を参照されたい: (１)bＧＨ
ゲノムＤＮＡの同定および特徴づけが開示されている１
９８４年６月２７日出願のヨーロッパ特許出願０１１２
０１２号; (２)ウォイチック・アール・ピイら(Ｗoychi
k Ｒ.Ｐ.et al.)、「正確なポリアデニレーションのため
のウシ成長ホルモン遺伝子の３'フランキング領域の要
件」、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)
ＵＳＡ８１: ３９４４〜３９４８(１９８４年７月); お
よび、ディ・アール・ヒッグズら(Ｄ.Ｒ.Ｈiggs et a
l.)、ネイチャー(Ｎature)３０６: ３９８〜４００(１
９８３年１１月２４日)およびそこに引用されている文
献。

【０１５５】pＳＶＣＯＷ７の第２の試料をＥcoＲＩお
よびＢamＨＩで切断してフラグメント４５を得る。別法
として、フラグメント４５はベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ(Ｂethesda Ｒesearch Ｌaboratories)から
入手可能な親プラスミドpＳＶ２dhfrからのＥcoＲＩ／
ＢamＨＩフラグメントから得られる。フラグメント４５
はpＢＲ３２２からの複製開始点およびイー・コリ(Ｅ．
coli)においてプラスミドの選択を可能とするイー・コ
リ(Ｅ．coli)において発現されたアンピシリン耐性遺伝
子を含有する。該フラグメントは、また、哺乳動物細胞
において発現を可能とする組立体中にマウスジヒドロ葉
酸還元酵素 cＤＮＡを該する。スブラマニら(Ｓubraman
i et al.)、モレキュラー・アンド・セリユラー・バイ
オロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)１: ８５４〜８６４(１９
８１)。

【０１５６】ＴＰＡ cＤＮＡは、pＴＰＡ−cＤＮＡ、Ｂ
amＨＩをＢamＨＩおよびＢglＩで切断することから得ら
れるフラグメント４６(１.９kb)から得られる。フラグ
メント４６はtＰＡcＤＮＡからの全コーティング領域を
含有する。ＢamＨＩ切断はmＲＮＡの５'末翻訳配列につ
いてコード付けするcＤＮＡにおけるものであり、Ｂgl
Ｉ切断はcＤＮＡの３'末翻訳領域についてコード付けす
るcＤＮＡにおけるものである。フラグメント４４、４
５および４６を結んでイー・コリ(Ｅ．coli)およびＣＨ
Ｏ細胞間を行き来できる複製ベクターであるpＴＰＡ−
ＰＡ(８.４kb)を得る。プラスミドpＴＰＡ−ＰＡをイー
・コリ(Ｅ．coli)に形質転換する。

【０１５７】工程２．工程２においては、ヒトサイトメ
ガロウイルスからの即時型遺伝子プロモーター(ＣＭＶ
Ｉ.Ｅ.プロモーター)を挿入することによって、pＴＰＡ
−ＰＡを発現プラスミドpＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡに変換す
る。ＣＭＶ Ｉ.Ｅ.プロモーターはＣＭＶゲノムのＰst
Ｉ消化から得られる。主たる即時型遺伝子を含有するヒ
トサイトメガロウイルスゲノム(ＣＭＶ Ｉ.Ｅ.)の領域
の制限エンドヌクレアーゼ切断マップは詳細に記載され
ている(スティンスキイら(Ｓtinsti et al.)、ジャーナ
ル・オブ・バイロロジー(Ｊ.Ｖirol.)４６: １〜１４、
１９８３; ステンベルグら(Ｓtenberg et al.)、ジャー
ナル・オブ・バイロロジー(Ｊ.Ｖirol.)４９: １９０〜
１９９、１９８４; およびトムセンら(Ｔhomsen et a
l.)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)
ＵＳＡ、８１: ６５９〜６６３、１９８４)。

【０１５８】これらの文献は、その配列の中に主要な即
時型遺伝子についてのプロモーターを含有する２.０キ
ロベースのＰstＩフラグメントを記載している。それに
より所望の７６０塩基対フラグメントが産生物の中に得
られるこの２.０kb ＰstＩフラグメントのＳau３ＡＩ
での単離消化によってＣＭＶ Ｉ.Ｅ.プロモーターをさ
らに単離することができる。この７６０塩基対フラグメ
ントは、その大きさならびにフラグメント内のＳcaＩ切
断部位およびＢglＩ切断部位の存在によって他の産生物
から区別できる。その便利な同定のため、このＳau３Ａ
Ｉフラグメントの利用は本明細書中に記載するＣＭＶ
Ｉ.Ｅ.プロモーターを用いる好ましい方法である。

【０１５９】工程１で組立てたプラスミドpＴＰＡ−Ｐ
ＡをＢamＨＩで切断し、ＣＭＶ即時型プロモーターを含
有するＳau３ＡＩフラグメントをＢamＨＩ部位に結ぶ。
プロモーターからの転写がＴＰＡについてのmＲＮＡを
合成するような配位でＣＭＶプロモーターフラグメント
を含有するプラスミドは、プラスミドをＳacＩで切断す
ることによって同定される。得られたプラスミドを、Ｔ
ＰＡ cＤＮＡの５'端部にＣＭＶ Ｉ.Ｅ.プロモーターを
有し、およびその３'端部にbＧＨポリアデニレーション
シグナルを有するpＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡで示す。

【０１６０】(４)pＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２Ｋ２Ａの組立
て−チャート２３ pＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２Ｋ２Ａの組立ては２段工程であ
る。工程１は所望のＴＰＡ同族体、ＢＧＨからのポリア
デニレーションシグナル配列ならびにpＳＶＣＯＷ７の
選択可能なマーカーおよびレプリコンを含有するpＴＰ
Ａ−ＦＫ２Ｋ２Ａの生成を含み、工程２は前記ＣＭＶ
Ｉ.Ｅ.プロモーターの挿入を含む。以下の実施例はＴＰ
Ａ同族体ＦＫ２Ｋ２Ａの挿入を記載するが、同一の酵素
および方法を用いて他の同族体を挿入することもでき
る。

【０１６１】工程１．プラスミドpＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡ
(チャート２２)をＢamＨＩおよびＢgl IIで切断してＴ
ＰＡ先導配列塩基１〜１８８を含有するフラグメント４
７を得る。pＳＶＣＯＷ７(チャート２０)をＥcoＲＩお
よびＰvuIIで切断してフラグメント４８(６００bp)を得
ることによって、ＢＧＨのポリアデニレーションシグナ
ル配列が得られる。ＴＰＡ同族体配列はpＦＫ２Ｋ２Ａ
(チャート１２)をＢgl IIおよびＢglＩで切断してフラ
グメント４９(２.０kb)を得ることにより得られる。pＳ
ＶＣＯＷ７の第２の試料をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで切
断してpＳＶＣＯＷ７のマーカーおよびレプリコンを含
有するフラグメント５０(５.８kb)を得る。４種のフラ
グメントをゲル単離し、Ｔ４リガーゼを用いて結んでp
ＴＰＡ−ＦＫ２Ｋ２Ａ(８.３kb)を得る。 工程２．プラスミドpＴＰＡ−ＦＫ２Ｋ２ＡをＢamＨＩ
で切断し、Ｓau３Ａ消化のＣＭＶ−ＩＥプロモーター配
列を挿入してpＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２Ｋ２Ａを得、これ
をＣＨＯ細胞中へのトランスフェクションまでイー・コ
リ(Ｅ．coli)中で維持する。

【０１６２】(５)ＣＨＯ細胞のトランスフェクションお
よび培養 グラハムら(Ｇraham et al.)(イントロダクション・オ
ブ・マクロモレキュールズ・イントウ・バイアブル・マ
マリン・セルズ(Ｉntroduction of Ｍacromolecules in
to Ｖiable Ｍammalian Ｃells)、アラン・アール・リ
ス・インコーポレイティッド(Ａlan Ｒ.Ｌiss Ｉnc.)、
ニューヨーク、１９８０、３〜２５頁)によって詳細に
記載されているＤＮＡの細胞中へのトランスフェクショ
ンのためのリン酸カルシウム法を用いて、プラスミドp
ＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２Ｋ２Ａをジヒドロ葉酸還元酵素(d
hfr)を欠くチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞中
にトランスフェクトする。用いる細胞系は元来コロンビ
ア大学のエル・チェイシン(Ｌ.Ｃhasin)から入手可能な
突然変異体ＤＸＢ−１１であり、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)ＵＳＡ７７: ４２１６〜４
２２０、１９８０にすべて記載されている。前記トラン
スフェクション法は、トランスフェクトされたプラスミ
ドを一体化する細胞はもはやdhfrを欠くものではなくて
ダルベッコウの修正イーグル培地＋プロリン中で増殖す
るという事実に基づくものである。

【０１６３】pＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２Ｋ２Ａでトランス
フェクトした細胞からクローンを単離するが、それは、
単層で２日間増殖させた場合、百万細胞当たり少なくと
も１０ngのＴＰＡを合成する。pＩＥＴＰＡ−ＩＰＡ−d
hfrを有する細胞からクローンを単離するが、それは、
百万細胞当たり少なくとも１００ngのＴＰＡを合成す
る。ＴＰＡ同族体の発現はラジオイムノアッセイ、また
はウェスタンブロット法によって検知できる。

【０１６４】リジケンおよびコレン(Ｒijken and Ｃoll
en)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry)２５６: ７０
３５〜７０４１(１９７９)の方法によりＴＰＡ同族体を
精製する。組換体ＴＰＡ同族体を含有するＣＨＯ細胞を
無血清培地中で増殖させる。７２時間後培地を収穫し、
１.０Ｍ ＮaＣlおよび０.０１％ツイーン(Ｔween)８０
を含有する０.０２Ｍトリス−ＨＣl pＨ７.５で平衡化
した亜鉛−キレートアガロースカラムに付す。カラムを
同一の緩衝液で洗浄し、同一の緩衝液中で０〜０.０５
Ｍイミダゾールの直線グラジエントでＴＰＡ同族体を溶
出する。ＴＰＡ同族体を含有する画分をプールし、１.
０Ｍ ＮaＣlおよび０.０１％ツイーン(Ｔween)８０を
画分する０.０１Ｍリン酸緩衝液pＨ７.５で平衡化した
コンカナバリンＡ−アガロースカラムに付す。同一緩衝
液でカラムを洗浄した後、平衡化緩衝液〜０.０１％ツ
イーン(Ｔween)８０、０.４Ｍ Ｄ−メチルマンノシド
および２Ｍチオシアン酸カリウムを含有する０.０１Ｍ
リン酸緩衝液pＨ７.５の直線グラジエントで溶出する。
ＴＰＡ活性を有する画分をプールし、固体ＫＳＣＮを加
えてＫＳＣＮ濃度を１.６Ｍまで増加させる。画分を約
１０倍の濃度とし、１.６Ｍ ＫＳＣＮおよび０.０１％
ツイーン(Ｔween)８０を含有する０.０１Ｍリン酸緩衝
液pＨ７.５で平衡化したセファデックスＧ−１５０カラ
ムに付す。ＴＰＡ活性を有する画分をプールし、０.１
５Ｍ ＮaＣlおよび０.０１％ツイーン(Ｔween)８０に
対して透析し、−８０℃にて保存する。

【０１６５】Ｃ．スポドプテラ・フルギペルダ(Ｓpodop
tera frugiperda)における発現 以下の実施例は昆虫細胞培養におけるＴＰＡの発現に関
する。すべての手順はサマーズ・エム・ディおよびスミ
ス・ジィー・イー(Ｓummers Ｍ.Ｄ.and ＳmithＧ.
Ｅ.)、テキサス州、カレッジ・ステーション(Ｃollege
Ｓtation)、テキサス・アグリカルチュラル・イクステ
ンション・サービス(Ｔexas ＡgriculturalＥxtension
Ｓervice)、テキサス・アグリカルチュラル・エクスペ
リメント・ステーション(Ｔexas Ａgricultural Ｅxp
eriment Ｓtation)、農業単科大学によって発行された
バクロウイルスベクター取扱法および昆虫細胞培養手順
に詳細に記載されている。出発プラスミドpＡc３７３
(７.１kb)は、アウトグラファ・カルホルニカ・ヌクレ
ア・ポリヘドロシス・ウイルス(Ａutographa californi
canuclear polyhedrosis virus)(ＡcＮＰＶ)についての
多角体プロモーターから直ぐ下流にユニークＢamＨＩ部
位を有する一般的なバクロウイルス発現ベクターであ
る。多角体蛋白質はウイルス感染および in vitro 複製
には必須でないマトリックス蛋白質である。該プラスミ
ドはテキサス７７８４３、カレッジ・ステーション(Ｃo
llege Ｓtation)、テキサスＡ＆Ｍ大学、昆虫学部部門
のマックス・サマーズ(Ｍax Ｓummers)教授より入手可
能であり、モレキュラー・アンド・セリユラー・バイオ
ロジー(Ｍolecular and Ｃell.Ｂiology)、３(１２):
２１５６〜２１６５(１９８３)に詳細に記載されてい
る。

【０１６６】(１) pＡcＴＰＡの組立て−チャート２４ ユニークＢamＨＩ部位をやはりユニークであるＢal II
部位を挿入することによって出発プラスミドpＡc３７３
を修飾してＴＰＡ同族体を受容するようにする。プラス
ミドpＡc３７３をまずＢamＨＩで切断し、次いでマング
・ビーン(Ｍungbean)ヌクレアーゼで処理して平滑末端
を得る。次いでＢgl IIリンカーを該末端に結び、該末
端を再び結合してpＡc３７３、Ｂgl IIを得る。チャー
ト２１からのプラスミドpＴＰＡcＤＮＡ、ＢamＨＩをＢ
amＨＩで十分に消化し、Ｂgl IIで部分的に消化して無
傷ＴＰＡcＤＮＡについてコード付けするフラグメント
５１(１.９５kb)を得る。フラグメント５１をゲル単離
し、pＡc３７３、Ｂgl IIのＢgl II部位に挿入してエス
・フルギペルダ(Ｓ．frugiperda)において天然ＴＰＡを
発現できるpＡcＴＰＡを得る。

【０１６７】(２) pＡcＦＫ２Ｋ２Ａの組立て−チャー
ト２５ この発現プラスミドについては、Ｂgl IIを用いてＴＰ
Ａ同族体ＦＫ２Ｋ２ＡをpＦＫ２Ｋ２Ａ(チャート１２)
から切り出し、ＴＰＡ同族体をコード付けするcＤＮＡ
をフラグメント５３(２.０kb)としてゲル単離する。プ
ラスミドpＡcＴＰＡ(チャート２４)をＢgl IIで切断し
てフラグメント５２(７.１５kb)を得る。フラグメント
５２および５３を結んでpＡcＦＫ２Ｋ２Ａ(９.１５kb)
を得、これをエス・フルギペルダ(Ｓ．frugiperda)にト
ランスフェクトするまでイー・コリ(Ｅ.coli)中で維持
する。

【０１６８】(３)エス・フルギペルダ(Ｓ.frugiperda)
のトランスフェクションおよび培養 エス・フルギペルダ(Ｓ．frugiperda)における共トラン
スフェクションによってＴＰＡ同族体を天然ＡＣＮＰＶ
ＤＮＡと再び組み合わせる。エス・フルギペルダ
(Ｓ．frugiperda)(ＳＦ９; ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１
１)はデイフコ(Ｄifco)ラクトアルブミン加水分解物お
よび酵母分解物を補足したグレイス(Ｇrace)培地(ジブ
コ・ラブ(Ｇibco Ｌab.)、リボニア(Ｌivonia)、ミシガ
ン州４８１５０)、１０％胎児ウシ血清中で培養する。
細胞を各々１μ／mlおよび２μ／mlにてＡcＮＰＶ Ｄ
ＮＡおよびpＡcＴＰＡＦＫ２Ｋ２Ａで共トランスフェク
トする。得られたウイルス粒子は、培地を収集し、低速
遠心によって細胞物質を除去することにより得られる。
次いでウイルス含有培地を用いてエス・フルギペルダ
(Ｓ．frugiperda)を感染する。天然ウイルスＤＮＡおよ
びＦＫ２Ｋ２Ａ ＴＰＡ同族体についてコード付けする
cＤＮＡと再び組み合わせたＤＮＡを共に包含するこれ
らのウイルス粒子を用いる引き続いてのエス・フルギペ
ルダ(Ｓ．frugiperda)の感染の結果、多角体蛋白質の代
わりにＴＰＡ同族体を発現するいくらかの細胞が得られ
る。ＴＰＡ同族体を産生する感染細胞コロニーの検出
は、系統的に希釈した(１０^-1〜１０^-6)培地を含有する
ウイルスであらかじめ１時間感染したエス・フルギペル
ダ(Ｓ．frugiperda)の単層を重ねることによって決定す
る。次いで、６mg／mlフィブリノーゲンおよび０.５単
位トロンビンを含有する０.７％低融点寒天を有するグ
レース(Ｇrace)培地を細胞に重ねる。活性ＴＰＡを産生
する細胞は感染の中心付近に明瞭なプラークを形成す
る。

【０１６９】実施例５ 以下の同族体をＣＨＯ細胞から単離し、活性および抗原
性について評価した:ＦＧＫ１Ｋ２Ａ、ＦＫ１Ｋ２Ａお
よびＦＫ２Ａ。表１は２つの異なる in vitro テスト、
活性および抗体認識の結果を要約する。同族体ＦＧＫ１
Ｋ２ＡおよびＦＫ２Ａは血小板からのプラスミノーゲン
アクチベーター抑制物質と共に複合体を形成する(トロ
ンビン誘導血小板放出体)。同族体の分子量は各々約６
２０００および４００００ダルトンである。酵素抑制物
質複合体の分子量は各々約１１００００および８５００
０ダルトンである。

【０１７０】実施例６ ＴＰＡ同族体の治療応用 ＴＰＡは血栓を溶解し、治療的に有用であることは公知
である。ザ・ランセット(Ｔhe Ｌancet)、１０１８〜
２０頁(１９８１年１１月７日); サイエンス(Ｓcienc
e)、２２０: １１８１(１９８３); およびニュー・イン
グランド・ジャーナル・オブ・メディシン(Ｎ.Ｅng.Ｊ.
Ｍed.)、３１０: ６０９(１９８４)。冠血栓を有する患
者へのＴＰＡ同族体の投与は、前記２つの文献に記載さ
れた一般法により、歯冠内もしくは静脈内経路を介して
行うことができる。

【０１７１】

【発明の効果】本発明により改良されたＴＰＡをコード
するＤＮＡが提供される。

【０１７２】

【表１】 試料 活性＊(Ｕ／ml) 抗原＊＊(ng／ml) 精製した天然組換体ＴＰＡ ４９０００ ９１２０００ ＦＧＫ１Ｋ２Ｐ ２.１±.０３ ４７±２ ＦＫ１Ｋ２Ｐ ８.４±.３４ ２００±６ＦＫ２Ｐ ４.２±.０６ ９７±２８ ＊活性は標準ＴＰＡ調製に対し相対的に示す。 ＊＊抗原測定値は前記ＴＰＡに対するヤギ多クローン抗体を用いて得た。

【０１７３】

【表２】

【０１７４】

【表３】

【０１７５】

【表４】

【０１７６】

【表５】

【０１７７】

【表６】

【０１７８】

【表７】

【０１７９】

【表８】

【０１８０】

【表９】

【０１８１】

【表１０】

【０１８２】

【表１１】

【０１８３】

【表１２】

【０１８４】

【表１３】

【０１８５】チャート１． pＴＲＺ１の組立 (a) pＭＣ１４０３をＥcoＲＩ、クレノー酵素および細
菌アルカリ性ホスファターゼで処理してフラグメント１
を得る。図１参照。 (b) pＶＶ１をＰvuII、Ｂgl IIおよびクレノー酵素で処
理し、続いてtrpプロモーターおよびＴrpＬＥ部分を含
有するフラグメント２(３２３bp)を精製する。図２参
照。 (c) Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼを用いてフラグメント１お
よび２を結んでpＴＲＺ１(１０kp)を得る。図３参照。

【０１８６】チャート２． pＳＫ３(４.３kp)の組立 (a) pＴＲＺ１(１０kp)をＢamＨＩおよびＥcoＲＩなら
びにアルカリ性ホスファターゼで処理してフラグメント
３(３５０bp)を得る。図４参照。 (b) pＫＣ７(５.８kp)をＢamＨＩおよびＥcoＲＩで処理
してフラグメント４(４.０kp)を得る。図５参照。 (c) フラグメント３および４を結んでpＳＫ３(４.３kp)
を得る。図６参照。

【０１８７】チャート３． pＳＫ４ (a) pＳＫ３をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで切断してフラ
グメント５(３２２bp)を単離する。図７参照。 (b) 部分ＴaqＩ消化により２７８bpフラグメント６Ｅco
ＲＩ〜ＴaqＩ"'および他のフラグメントを得る。 (c) フラグメント６をpＢＲ３２２にクローンし、Ｅco
ＲＩおよびＣlaＩで切断してpＳＫ４(４.６kp)を得る。
図８参照。

【０１８８】チャート４． pＴＰＡ３'cＤＮＡの組立 (a) pＢＲ３２２をＰstＩで切断し、テイリングし、位
置１２５０〜２５３０を有するＴＰＡcＤＮＡの３'端部
を挿入することによってプラスミドpＴＰＡＨ(５.７kp)
を得る。図９参照。 (b) pＢＲ３２２をＰstＩで切断し、テイリングし、位
置５５０〜１６００を有するＴＰＡのcＤＮＡを挿入す
ることによってプラスミドpＴＰＡ８０−１(５.４kp)を
得る。図１０参照。 (c) プラスミドpＴＰＡＨおよびpＴＰＡ８０−１をＳac
ＩおよびＰvuＩで切断し、フラグメント７(１２５１bp)
および８(５.１kp)を各々ゲル単離する。該フラグメン
トを細菌アルカリ性ホスファターゼで処理し、Ｔ４で結
んでＴＰＡcＤＮＡの塩基５５０〜２５３０を有するpＴ
ＰＡ３'cＤＮＡ(６.３kp)を得る。図１１参照。

【０１８９】チャート５． pＴＰＡcＤＮＡの組立 (a) pＢＲ３２２をＰstＩで切断し、テイリングし、Ｔ
ＡＰcＤＮＡ位置１−７５０の５'領域を挿入することに
よってプラスミドpＴＰＡ５'cＤＮＡを得る。図１２参
照。 (b) プラスミドpＴＰＡ５'をＴaqＩで切断してフラグメ
ント９(２１９４bp)を得、これをゲル単離し、Ｂgl II
およびＨgaＩで切断してＴＰＡcＤＮＡの塩基１８８〜
５９３を含有するフラグメント１０(４０５bp)を得る
(成熟ＴＰＡ蛋白質)。図１３参照。 (c) プラスミドpＴＰＡ３'cＤＮＡ(チャート４)をＰvuI
IおよびＥcoＲＩで切断し、フラグメント１１(１７４８
bp)をゲル単離する。フラグメント１１をＨgaＩで切断
してフラグメント１２(２０９bp)を得、これをゲル単離
するが、このものは塩基５９４〜８０２を含有する。図
１４参照。 (d) プラスミドpＴＰＡ３'cＤＮＡをＰvuＩで切断し、
直線状６.３kpフラグメントをＴ４ポリメラーゼで処理
して平滑末端とし、ＥcoＲＩで部分的に消化してpＢＲ
３２２の塩基８０２〜２５３０と１２３bpを含有するフ
ラグメント１３(１８７１kp)を得る。図１５参照。 (e) プラスミドpＫＣ７をＢgl IIおよびＳmaＩで切断
し、細菌アルカリ性ホスファターゼで処理し、フラグメ
ント１４(４.８kp)をゲル単離する。図１６参照 。 (f) フラグメント１０、１２、１３および１４をプ
ールし、Ｔ４リガーゼを用いて結んで成熟ＴＰＡcＤＮ
Ａを含有するpＴＰＡcＤＮＡ(７.４kp)を得る。図１７
参照。

【０１９０】チャート６． pＴＰＡ−Ｂ１の組立 (a) プラスミドpＳＫ４をＣal１およびＳphＩで切断し
てフラグメント１５(４.１kp)を得、これを単離し、Ａ
ＴＧを含有するＣal１／ＸbaＩリンカーによりフィンガ
ー(finger)ドメインを含有するブロック１に結ぶ。図１
８〜２０参照。 (b) リンカーによりフラグメント１５およびブロック１
を結んでpＴＰＡ−Ｂ１(４.２５kp)を得る。図２１参
照。

【０１９１】チャート７． pＴＰＡ−Ｂ１、２の組立 (a) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１をＥcoＲＩおよびＳphＩ
で切断してフラグメント１６(４５０bp)および発育因子
ドメインを含有するブロック２(１００bp)を得、ＥcoＲ
ＩおよびＳphＩを用いて適当なクローンから単離する。
図２２および図２３参照。 (b) フラグメント１６およびブロック２をpＢＲ３２２
のＥcoＲＩ／Ｃal１消化から得たフラグメント１７(４.
３５kp)に結んでpＴＰＡ−Ｂ１、２(４.８kp)を得る。
図２４および図２５参照。

【０１９２】チャート８． pＴＰＡ−Ｂ１、２(a)の組
立 (a) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２をＸbaＩおよびＥco
ＲＩで切断してフラグメント１８(４.５kp)を得、これ
を単離し、ＨindIII部位およびＢgl II部位を含有する
リンカーに結んでpＴＰＡ−ＢglＩＩ、２(a)(４.５kp)
を得る。図２６〜図２８参照。

【０１９３】チャート９． pＴＰＡ−Ｂ１、２、３の
組立 プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２(a)をＣal１／ＢamＨＩで
切断し、フラグメント１９(４.０kp)を単離し、クリン
グル(kringle)１ならびに上流にＣal１部位および下流
にＢamＨＩを含有するブロック３(２７０bp)で結んでp
ＴＰＡ３(４.３kp)を得る。図２９および図３０参照。

【０１９４】チャート１０． pＴＰＡ−Ｂ１、２、
３、４(a)の組立 (a) プラスミドpＴＰＡcＤＮＡ(チャート５)をＳcaＩで
切断し、ＴＰＡ遺伝子の３'端部を含有するフラグメン
ト２０(６.０kp)をゲル単離する。図３１参照。 (b) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３(チャート９)を
ＳcaＩおよびＢamＨＩで切断し、フラグメント２１(１
１００bp)をゲル単離する。図３２参照。 (c) ブロック４を含有するクローンからクリングル(kri
ngle)２領域を含有するＢamＨＩ／ＳcaＩフラグメント
４a(２３０bp)を単離する。図３３参照。 (d) フラグメント２０、２１および４aを結んでpＴＰＡ
−Ｂ１、２、３、４aを得る。図３４参照。 (e) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４＊をＨindII
IおよびＡstIIで切断し、２.２kp始原型ＴＰＡ遺伝子を
継代クローンしてＨindIIIおよびＡstIIで同様に消化し
たpＵＣ１９に入れてpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４＊(４.
２kp)を得る。プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４＊
は記号的にpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４＊に似ている
が、より好都合な制限部位の配置を有する。

【０１９５】チャート１１． pＴＰＡ−Ｂ１、２、
３、４の組立 (a) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４aをＥcoＲＩ
およびＢamＨＩで消化する。大きなフラグメント(３.７
kp)をやはりＥcoＲＩ(部分消化)およびＢamＨＩで切断
した適当なクローンから得たブロック４(５６０bp)に結
んでpＴＰＡ−ＢamＨＩ、２、３、４を得る。図３５参
照。

【０１９６】チャート１２． pＦＫ２Ｋ２Ａの組立 (a) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４aをＨpaＩで
切断してフラグメント２２(３.９kp)を得、これをゲル
から単離する。図３６参照。 (b) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２、３、４をＨpaＩお
よびＭstＩで切断してクリングル(kringle)２を含有す
るフラグメント２３(２５０bp)を得る。図３７参照。 (c) フラグメント２２および２３を一緒に結んでpＦＫ
２Ｋ２Ａ(４.１kp)を得る。図３８参照。

【０１９７】チャート１３． pＴＰＡＥxp１の組立 (a) プラスミドpＴＰＡ−Ｂ１、２(チャート７)をＸba
ＩおよびＢamＨＩで切断し、フラグメント２４(４.２k
b)を得、これをゲル単離する。図３９参照。 (b) プラスミドpＦＫ２Ｋ２Ａ(チャート１２)をＸbaＩ
およびＢgl IIで切断してフラグメント２５(２.０kb)を
得、これをゲル単離する。図４０参照。 (c) フラグメント２４および２５を結んでpＴＰＡＥxp
１(６.２kb)を得る; ＢamＨＩおよびＢalＩＩは相補的
であるが回復されない。図４１参照。

【０１９８】チャート１４． pyＲep３'Ｂの組立 (a) プラスミドpＹＩＰ３１をＳmaＩで切断し、細菌ア
ルカリ性ホスファターゼで処理してフラグメント２６を
得る。図４２参照。 (b) 酵母の２μプラスミドをＰstＩおよびＸbaＩで切断
し、クレノー酵素で処理する。得られたフラグメント２
７(１.３kb)を単離する。図４３参照。 (c) フラグメント２６および２７を結んでpyＲep３'Ｂ
(６.７kb)を得る。図４４参照。

【０１９９】チャート１５． プラスミドpＧＧ４００
の組立 (a) プラスミドpＢＲ３２２をＥcoＲＩおよびＰvuIIで
切断し、末端をクレノー酵素で満たしてフラグメント２
８(２.３kb)を得る。図４５参照。 (b) プラスミドpＭＬ２１をＰvuIIで切断してフラグメ
ント２９(１.７kb)を得る。図４６参照。 (c) Ｔ４を用いてフラグメント２８および２９を結んで
pＧＧ４００(４.０kb)を得る。図４７参照。

【０２００】チャート１６． pＡＤＨtの組立 (a) プラスミドpＧＧ４００をＸhoＩおよびＰvuIIで切
断し、クレノー酵素で処理し、得られたフラグメント３
０(３.５kb)を単離する。図４８参照。 (b) プラスミドpＡＤＨＢＣをＨincIIおよびＢamＨＩで
切断し、末端をＴ４リガーゼで満たし、得られたフラグ
メント３１(０.３６kb)を単離する。図４９参照。 (c) Ｔ４リガーゼを用いてフラグメント３０および３１
を結んでpＡＤＨt(３.８６kb)を得る。図５０参照。

【０２０１】チャート１７． プラスミドpＡＤＨt−Ｒ
epIIIの組立 (a) ＢamＨＩで制限し、８−体ＳalＩリンカーを満たし
たＢamＨＩ部位へ結ぶことによってプラスミドpＡＤＨt
を修飾する。図５１参照。 (b) (修飾した)プラスミドpＡＤＨtをＳphＩで切断し、
Ｔ４リガーゼで末端を満たしてフラグメント３２(３.８
kb)を得る。 (c) プラスミドpyＲep３１Ｂ(チャート１６)をＨindIII
で切断し、Ｔ４リガーゼで末端を満たしてフラグメント
３３(２.４kb)を得る。図５２参照。 (d) Ｔ４リガーゼを用いてフラグメント３２および３３
を結んでpＡＤＨt−ＲepIII(６.２kb)を得る。図５３参
照。

【０２０２】チャート１８．pα１−ＡＤＨtの組立 (a) プラスミドpＡＤＨt−ＲepＩＩＩ(チャート１５)を
ＥcoＲＩおよびＨindIIIで切断し、フラグメント３４
(５.３kb)を単離する。図５４参照。 (b) ＥcoＲＩおよびＨindIIIでプラスミドpα１を制限
して１.２kbを有するフラグメント３５を含有するＭＦ
α１遺伝子を得る。図５５参照。 (c) Ｔ４リガーゼを用いてフラグメント３４および３５
を結んでpα１−ＡＤＨt(６.５kb)を得る。図５６参
照。

【０２０３】チャート１９．pα１−ＦＫ２Ｋ２Ａの組
立 (a) プロモーターpＦＫ２Ｋ２Ａ(チャート１２)をＢgl
IIで切断してフラグメント３６(２.０kb)を得、これを
ゲル単離する。図５７参照。 (b) プラスミドpα１−ＡＤＨtをＨindIIIおよびＸhoＩ
で切断する; 塩基アデノシンおよびグアノシンの存在に
おいて末端をクレノー酵素で部分的に満たし、マング・
ビーン(Ｍung bean)ヌクレアーゼで処理してフラグメ
ント３７(５.６kb)を得、これをゲル単離する。図５８
参照。 (c) フラグメント３６および３７を結んでpα１−ＦＫ
２Ｋ２Ａ(７.６kb)を得る。図５９参照。

【０２０４】チャート２０． pＳＶＣＯＷ７の組立 (a) プラスミドpＳＶ２dhfrをＢamＨＩおよびＥcoＲＩ
で切断してフラグメント３８(５.０kb)を得る。図６０
参照。 (b) プラスミドpλＧＨ２Ｒ２をＢamＨＩおよびＥcoＲ
Ｉで切断してフラグメント３９(２.１kb)を得る。図６
１参照。 (c) フラグメント３８および３９を結んでpＳＶＣＯＷ
７(７.１kb)を得る。図６２参照。

【０２０５】チャート２１． pＴＰＡcＤＮＡ、ＢamＨ
Ｉの組立 (a) プラスミドpＴＰＡ５'cＤＮＡ(チャート５、パート
a)をＨgaで切断し、フラグメント４０(５１７bp)をクレ
ノーで平滑とし、１０−体ＢamＨＩリンカーに結ぶ。フ
ラグメント４０をＮarＩで切断してＴＰＡcＤＮＡの塩
基７８〜５１８を有するフラグメント４１(４４０bp)を
得る。図６３参照。 (b) プラスミドpＴＰＡcＤＮＡ(チャート５)をＮarＩお
よびＢgl IIで切断し、ＴＰＡcＤＮＡの３'部分を含有
するフラグメント４２(１６４４bp)をゲル単離する。図
６４参照。 (c) プラスミドpＫＣ７をＢamＨＩおよびＢgl IIで切断
してフラグメント４３(４.３kb)を得、これをゲル単離
し、フラグメント４１および４２を結んでpＴＰＡcＤＮ
Ａ、ＢamＨＩ(６.５kb)を得る。図６５参照。

【０２０６】チャート２２． pＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡの
組立 (a) プラスミドpＳＶＣＯＷ７をＥcoＲＩおよびＰvuII
で切断してウシ成長ホルモンのポリアデニレーション配
列を含有するフラグメント４４(６００bp)を得、これを
ゲル単離する。図６６参照。 (b) プラスミドpＳＶＣＯＷ７(チャート２０)をＥcoＲ
ＩおよびＢamＨＩで切断してフラグメント４５(５.８k
b)を得る。図６７参照。 (c) プラスミドpＴＰＡcＤＮＡ、ＢamＨＩ(チャート２
１)をＢamＨＩおよびＢglＩで切断してフラグメント４
６(２.０kb)を得る。図６８参照。 (d) フラグメント４４、４５および４６を結んでpＴＰ
Ａ−ＰＡ(８.４kb)を得る。図６９参照。 プラスミドpＴＰＡ−ＰＡをＢamＨＩで切断し、ＣＭＶ
ゲノムのＰstＩおよびＳau３ＡＩ消化からのＣＭＶ−Ｉ
Ｅプロモーター(７６０bp)を挿入してpＴＰＡ−ＩＥ−
ＰＡを得る。図７０参照。

【０２０７】チャート２３． pＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２
Ｋ２Ａの組立 (a) pＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡ(チャート２２)をＢamＨＩお
よびＢgl IIで切断してフラグメント４７(１２０bp)を
得、これをゲル単離する。図７１参照。 (b) プラスミドpＳＶＣＯＷ７をＥcoＲＩおよびＰvuII
で切断してウシ成長ホルモンのポリアデニレーション配
列を含有するフラグメント４８(６００bp)を得、これを
ゲル単離する。図７２参照。 (c) プラスミドpＦＫ２Ｋ２Ａ(チャート１２)をＢgl II
およびＢglＩで切断してフラグメント４９(１.７kb)を
得、これをゲル単離する。図７３参照。 (d) プラスミドpＳＶＣＯＷ７(チャート２０)をＥcoＲ
ＩおよびＨamＨＩで切断してフラグメント５０を得る。
図７４参照。 (e) Ｔ４リガーゼを用いてフラグメント４７、４８、４
９および５０を結んでpＴＰＡＦＫ２Ｋ２Ａ(８.３kb)を
得る。図７５参照。 (f) プラスミドpＴＰＡＦＫ２Ｋ２ＡをＢamＨＩで切断
し、ＣＭＶゲノムのＰstＩおよびＳau３ＡＩから消化か
らのＣＭＶ−ＩＥプロモーター(７６０bp)を挿入してp
ＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２Ｋ２Ａを得る。図７６参照。

【０２０８】チャート２４． pＡcＴＰＡの組立 (a) プラスミドpＡc３７３(７.１kb)をＢamＨＩで切断
し、マング・ビーン(Ｍung bean)ヌクレアーゼで処理
して平滑末端を得、これにＢgl IIリンカーを加える。
末端を再び連結してpＡc３７３、Ｂgl IIを得る。図７
７および７８参照。 (b) プラスミドpＴＰＡcＤＮＡ、ＢamＨＩ(チャート２
１)をＢamＨＩで切断し、Ｂgl IIで部分的に消化して無
傷ＴＰＡcＤＮＡを含有するフラグメント５１(１.９５k
b)を得る。図７９参照。 (c) フラグメント５１を挿入し、pＡc３７３、Ｂgl II
のＢgl II部位に結んでpＡcＴＰＡ(９.０５kb)を得る。
図８０参照。

【０２０９】チャート２５． pＡcＦＫ２Ｋ２Ａの組立 (a) pＡcＴＰＡ(チャート２４)をＢglＩＩで切断してフ
ラグメント５２(７.１５kb)を得る。図８１参照。 (b) プラスミドpＦＫ２Ｋ２Ａ(チャート１２)をＢgl II
で切断し、同族体cＤＮＡをフラグメント５３(２.０kb)
としてゲル単離する。図８２参照。 (c) フラグメント５２および５３を結んでpＡcＦＫ２Ｋ
２Ａ(９.１５kb)を得る。図８３参照。

【図面の簡単な説明】

【図１】 フラグメント１の制限地図である。

【図２】 フラグメント２の制限地図である。

【図３】 ｐＴＲＺ１の制限地図である。

【図４】 フラグメント３の制限地図である。

【図５】 フラグメント４の制限地図である。

【図６】 ｐＳＫ３の制限地図である。

【図７】 フラグメント５の制限地図である。

【図８】 ｐＳＫ４の制限地図である。

【図９】 プラスミドｐＴＰＡＨの制限地図である。

【図１０】 プラスミドｐＴＰＡ８０−１の制限地図で
ある。

【図１１】 ｐＴＰＡ３’ｃＤＮＡの制限地図である。

【図１２】 プラスミドｐＴＰＡ５’ｃＤＮＡの制限地
図である。

【図１３】 フラグメント１０の制限地図である。

【図１４】 フラグメント１１の制限地図である。

【図１５】 フラグメント１３の制限地図である。

【図１６】 フラグメント１４の制限地図である。

【図１７】 ｐＴＰＡｃＤＮＡの制限地図である。

【図１８】 フラグメント１５の制限地図である。

【図１９】 ブロック１の制限地図である。

【図２０】 ＣｌａＩ／ＸｂａＩリンカーの配列図であ
る。

【図２１】 ｐＴＰＡ−Ｂ１の制限地図である。

【図２２】 フラグメント１６の制限地図である。

【図２３】 ブロック２の制限地図である。

【図２４】 フラグメント１７の制限地図である。

【図２５】 ｐＴＰＡ−Ｂ１，２の制限地図である。

【図２６】 フラグメント１８の制限地図である。

【図２７】 ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩリンカーの配列図で
ある。

【図２８】 ｐＴＰＡ−Ｂ１，２（ａ）の制限地図であ
る。

【図２９】 フラグメント１９の制限地図である。

【図３０】 ｐＴＰＡ−Ｂ１，２，３の制限地図であ
る。

【図３１】 フラグメント２０の制限地図である。

【図３２】 フラグメント２１の制限地図である。

【図３３】 フラグメント４ａの制限地図である。

【図３４】 ｐＴＰＡ−Ｂ１，２，３，４ａの制限地図
である。

【図３５】 ｐＴＰＡ−Ｂ１，２，３，４の制限地図で
ある。

【図３６】 フラグメント２２の制限地図である。

【図３７】 フラグメント２３の制限地図である。

【図３８】 ｐＦＫ２Ｋ２Ａの制限地図である。

【図３９】 フラグメント２４の制限地図である。

【図４０】 フラグメント２５の制限地図である。

【図４１】 ｐＴＰＡＥｘｐ１の制限地図である。

【図４２】 フラグメント２６の制限地図である。

【図４３】 フラグメント２７の制限地図である。

【図４４】 ｐｙＲｅｐ３’Ｂの制限地図である。

【図４５】 フラグメント２８の制限地図である。

【図４６】 フラグメント２９の制限地図である。

【図４７】 ｐＧＧ４００の制限地図である。

【図４８】 フラグメント３０の制限地図である。

【図４９】 フラグメント３１の制限地図である。

【図５０】 ｐＡＤＨｔの制限地図である。

【図５１】 プラスミドｐＡＤＨｔの制限地図である。

【図５２】 フラグメント３３の制限地図である。

【図５３】 ｐＡＤＨｔ−Ｒｅｐ IIIの制限地図であ
る。

【図５４】 フラグメント３４の制限地図である。

【図５５】 フラグメント３５の制限地図である。

【図５６】 ｐα１−ＡＤＨｔの制限地図である。

【図５７】 フラグメント３６の制限地図である。

【図５８】 フラグメント３７の制限地図である。

【図５９】 ｐα１−ＦＫ２Ｋ２Ａの制限地図である。

【図６０】 フラグメント３８の制限地図である。

【図６１】 フラグメント３９の制限地図である。

【図６２】 ｐＳＶＣＯＷ７の制限地図である。

【図６３】 フラグメント４０の制限地図である。

【図６４】 フラグメント４２の制限地図である。

【図６５】 ｐＴＰＡｃＤＮＡ，ＢａｍＨＩの制限地図
である。

【図６６】 フラグメント４４の制限地図である。

【図６７】 フラグメント４５の制限地図である。

【図６８】 フラグメント４６の制限地図である。

【図６９】 ｐＴＰＡ−ＰＡの制限地図である。

【図７０】 ｐＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡの制限地図である。

【図７１】 フラグメント４７の制限地図である。

【図７２】 フラグメント４８の制限地図である。

【図７３】 フラグメント４９の制限地図である。

【図７４】 フラグメント５０の制限地図である。

【図７５】 プラスミドｐＴＰＡＦＫ２Ｋ２Ａの制限地
図である。

【図７６】 ｐＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２Ｋ２Ａの制限地図
である。

【図７７】 ｐＡｃ３７３の制限地図である。

【図７８】 ｐＡｃ３７３，Ｂｇｌ IIの制限地図であ
る。

【図７９】 フラグメント５１の制限地図である。

【図８０】 ｐＡｃＴＰＡの制限地図である。

【図８１】 フラグメント５２の制限地図である。

【図８２】 フラグメント５３の制限地図である。

【図８３】 ｐＡｃＦＫ２Ｋ２Ａの制限地図である。

【符号の説明】

（１）図１〜３ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 ＬacＺ、ＬacＹ、ＬacＡ＝ラクトースオペロンにおける
遺伝子 Ｐtrp＝Ｔrpプロモーター／オペレーター trpＬＥ＝trpＬおよびtrpＥの融合 （２）図４〜６ Ｄ＝Ｔrpプロモーター／オペレーター Ｅ＝ＴrpＬリボソーム結合部位 Ｆ＝trpＬＥおよび制限部位 ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 （３）図７および８ Ｄ＝Ｔrpプロモーター／オペレーター Ｅ＝シャイン・ダルガノ領域 （４）図９〜１１ Ｔet.Ｒ＝テトラサイクリン耐性 Ｐ＝ＴＰＡcＤＮＡの５５０〜８０２塩基位置 Ａ＝ＴＰＡcＤＮＡの８０２〜２５３０塩基位置 Ｎ＝ＴＰＡの未翻訳３'領域 （５）図１２〜１７ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｔ＝ＴＰＡcＤＮＡの５'部分 Ｐ＝ＴＰＡcＤＮＡの中央部分 Ａ＝ＴＰＡcＤＮＡの３'部分 Ｎ＝ＴＰＡcＤＮＡの未翻訳３'部分 （６）図１８〜２１ Ｄ＝Ｔrpプロモーター／オペレーター Ｅ＝ＴrpＬリボソーム結合部位 Ｆ＝フィンガー(finger)ドメイン ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 ＡＴＧ＝翻訳開始コードン （７）図２２〜２５ Ｐ／Ｏ＝Ｔrpプロモーター／オペレーター ＲbＳ＝Ｔrpリボソーム結合部位 ＡＴＧ＝翻訳開始コードン Ｆ＝フィンガー(finger)ドメイン Ｇ＝発育因子ドメイン ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｏri＝pＢＲ３２２の複製開始点 （８）図２６〜２８ Ｆ＝フィンガー(finger) Ｇ＝発育因子領域 ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 （９）図２９および３０ Ｆ＝フィンガー(finger)ドメイン Ｇ＝発育因子ドメイン Ｋ＝クリングル(kringle)１ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 （１０）図３１〜３４ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｆ＝フィンガー(finger)ドメイン Ｇ＝発育因子ドメイン Ｋ＝クリングル(kringle)１ドメイン Ｋ＝クリングル(kringle)２ドメイン a ＝活性部位 Ｎ＝ＴＰＡcＤＮＡの未翻訳３'部分 （１１）図３５ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｆ＝フィンガー(finger)ドメイン Ｇ＝発育因子ドメイン Ｋ＝クリングル(kringle)１ドメイン Ｋ＝クリングル(kringle)２ドメイン Ａ＝ＴＰＡcＤＮＡの３'部分 Ｎ＝ＴＰＡcＤＮＡの未翻訳３'部分 （１２）図３６〜３８ Ｏri＝pＢＲ３２２についての複製開始点 ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｋ＝クリングル(kp)２ドメイン Ｆ＝フィンガー(finger)ドメイン Ａ＝活性部位 Ｎ＝非コード３'配列 （１３）図３９〜４１ trp.Ｐ／Ｏ＝トリプトファージプロモーター／オペレー
ター ＲbＳ＝リボソーム結合部位 Ｋ＝クリングル(kringle)２ Ｆ＝フィンガー(finger)ドメイン Ｎ＝非コード３'配列 ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 ＡＴＧ＝翻訳開始コードン （１４）図４２〜４４ Ｕ＝ＵＲＡ３ Ｒ＝ＲepIIIおよび複製開始点に及ぶ配列 （１５）図４５〜４７ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 ＫmＲ＝カナマイシン耐性 （１６）図４８〜５０ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 ＫmＲ＝カナマイシン耐性 Ｈ＝ＡＤＨt３'末端 （１７）図５１〜５３ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｈ＝ＡＤＨt３'末端 u＝Ｕra３ Ｒ＝ＲepIIIおよび複製開始点 （１８）図５４〜５６ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｈ＝ＡＤＨt'末端 u＝Ｕra３ Ｒ＝ＲepIIIおよび複製開始点 ＭＦα１＝プロモーターおよびＭＦα１遺伝子について
のシグナル配列 （１９）図５７〜５９ ＭＦα１＝プロモーターおよびＭＦα１遺伝子について
のシグナル配列 Ｆ＝フィンガー(finger) Ｋ＝クリングル(kringle)領域２ Ａ＝未翻訳３'配列 Ｈ＝ＡＤＨt３'末端 u＝ＵＲＡ３ Ｒ＝ＲepIIIおよび複製開始点 （２０）図６０〜６２ Ａ＝ウシ成長ホルモンポリＡテイル部 Ｇ＝ゲノムウシ成長ホルモン Ｉ＝イントロン dhfr＝ジヒドロ葉酸還元酵素 ＳＶ４０＝ＳＶ４０プロモーターおよび複製開始点 ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 （２１）図６３〜６５ Ｌ＝先導配列 Ｔ＝ＴＰＡcＤＮＡの５'部分 Ｐ＝ＴＰＡcＤＮＡの中央部分 Ａ＝ＴＰＡcＤＮＡの３'部分 Ｎ＝ＴＰＡcＤＮＡの未翻訳３'部分 （２２）図６６〜７０ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｏri＝pＢＲ３２２複製開始点 ＳＶ４０／ori＝シミアン(Ｓimian)ウイルス複製開始点 Ｍo／dhfr＝マウスジヒドロ葉酸還元酵素マーカー ＣＭＶ／Ｐrom＝サイトメガロウイルスプロモーター Ｌ＝ＴＰＡ先導配列 Ｔ＝ＴＰＡcＤＮＡの５'領域 Ｐ＝ＴＰＡcＤＮＡの中央領域 Ａ＝ＴＰＡcＤＮＡの３'領域 Ｎ＝ＴＰＡcＤＮＡの未翻訳３'領域 a ＝ポリアデニレーションシグナル配列（２３）図７１
〜７６ ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｏri＝pＢＲ３２２複製開始点 ＳＶ４０＝シミアン(Ｓimian)ウイルス複製開始点 Ｍo／dhfr＝マウスジヒドロ葉酸還元酵素マーカー ＣＭＶ／Ｐrom＝サイトメガロウイルスプロモーター Ｌ＝ＴＰＡの先導配列 Ｔ＝ＴＰＡcＤＮＡの５'領域 Ｐ＝ＴＰＡcＤＮＡの中央領域 Ｆ＝フィンガー(finger)ドメイン Ｋ＝クリングル(kringle)２ Ａ＝活性部位 Ｎ＝ＴＰＡcＤＮＡの未翻訳３'領域 a ＝ポリアデニレーションシグナル配列 （２４）図７７〜８０ Ｌ＝先導配列 Ｔ＝ＴＰＡcＤＮＡの５'部分 Ｐ＝ＴＰＡcＤＮＡの中央部分 Ａ＝ＴＰＡcＤＮＡの３'部分 Ｎ＝ＴＰＡcＤＮＡの未翻訳３'部分 ＡmpＲ＝アンピシリン耐性 Ｐoly＝多角体蛋白質遺伝子 （２５）図８１〜８３ Ｌ＝先導配列 Ｆ＝フィンガー(finger)ドメイン Ｋ＝クリングル(kringle)２ドメイン Ａ＝活性部位ドメイン Ｎ＝ＴＰＡcＤＮＡの未翻訳３'部分 ＡmpＲ＝アンピシリン耐性

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ニコル・ワイ・セリオールト アメリカ合衆国ミシガン州49001、カラマ ズー、アパートメント820、イー・キャン ドルウイック108番

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ９００００ダルトン未満の分子量を有
   し、および、その天然の順序がＦＧＫ１Ｋ２ＡであるＴ
   ＰＡと比較して、ＦＫ２Ａ、ＦＫ２Ｋ２ＡまたはＦＫ１
   Ｋ２Ａの順序を有し、ここに、Ｆはフィンガードメイン
   であり、Ｇは成長因子ドメインであり、Ｋ１およびＫ２
   はクリングル１および２ドメインであって、Ａは活性部
   位であるＴＰＡ様蛋白をコードし、かつインタードメイ
   ン領域をコードするヌクレオチド配列内に、該ドメイン
   領域をコードするヌクレオチド配列に存在しない非天然
   エンドヌクレアーゼ制限部位を含有するＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ＴＰＡ様蛋白が、９００００ダルトン未
   満の分子量を有し、および、その天然の順序がＦＧＫ１
   Ｋ２ＡであるＴＰＡと比較して、ＦＫ２Ａの順序を有
   し、ここに、Ｆはフィンガードメインであり、Ｇは成長
   因子ドメインであり、Ｋ１およびＫ２はクリングル１お
   よび２ドメインであって、Ａは活性部位である請求項１
   記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 天然配置のヌクレオチド塩基１８７と１
   ９８の間のＸｂａＩ部位よりなる請求項１記載のＤＮ
   Ａ。
4. 【請求項４】 天然配置のヌクレオチド塩基３２８と３
   ４２の間のＨａｐＩまたはＳｐｈＩ部位あるいはその組
   合せよりなる請求項１または２記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 天然配置のヌクレオチド塩基４４２と４
   ６２の間のＥｃｏＲＶ、ＣｌａＩまたはＳｍａＩ部位あ
   るいはその組合せよりなる請求項１ないし４いずれか１
   つに記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 天然配置のヌクレオチド塩基７０９と７
   ２６の間のＢａｍＨＩまたはＨｐａＩ部位あるいはその
   組合せよりなる請求項１ないし５いずれか１つに記載の
   ＤＮＡ。
7. 【請求項７】 天然配置のヌクレオチド塩基９７３と９
   ９７の間のＭｓｔＨＩ、ＳｐｈＩまたはＸｍａIII部位
   あるいはその組合せよりなる請求項１ないし６いずれか
   １つに記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 該ＴＰＡ様蛋白をコードする配列から上
   流または下流双方のヌクレオチドの配列が、該ＤＮＡ
   を、適当な宿主の細胞によって維持され得るようにする
   請求項１ないし７いずれか１つに記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 該細胞が該ＴＰＡ様蛋白を発現し得るよ
   うにすることができる請求項８記載のＤＮＡ。