FI97809C - Rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa kudosperäisen plasminogeenin aktivaattorin (TPA) analogia - Google Patents

Description

97809

Rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa kudosperäisen plasmi-nogeenin aktivaattorin (TPA) analogia Tämä keksintö koskee ihmisen kudosperäisen plasminogeenin aktivaattorin (TPA) analogeja. Analogit ovat TPA:n kaltaisia molekyylejä, jotka ovat sisältäneet natiiveja domeenialueita (erillinen, yhtenäinen jakson osa), joko uudelleen järjestäytyneinä, vaillinaisina, lisättyinä tai niiden yhdistelminä. Analogit ovat yhdistelmä-deoksiribonukleiinihapon (DNA) tuotteita, jota DNA:ta myös kuvataan tässä yhteydessä. Esillä olevan keksinnön mukaisesti esitetään lisäksi replikointi- ja ekspressioplasmideja, jotka sisältävät edellä kuvailtuja TPA:ta koodittavia DNA-sekvenssejä, ja sopivia isäntämikro-organismeja, jotka kykenevät ilmentämään TPA-analogeja tultuaan transformoiduksi sopivalla plasmidilla.

Hoidettaessa veritulppia TPA:11a on terapeuttista arvoa siinä, että se auttaa liuottamaan hyytymiä niiden muodostuessa. Trom-bolyysi on fibriinihyytymän liuotusprosessi. Sitä tarkoitusta varten muodostuu seriiniproteaasia, plasmiinia, inaktiivisesta tsymogeenimuodostaan, plasminogeenista. Plasminogeenin aktivointi saadaan aikaan proteolyyttisen hajotuksen kautta, plasminogeenin aktivaattoreiksi nimitettyjen seriiniproteaasien ryhmän välityksellä. Näitä aktivaattoreita on läsnä kehon useimmissa nesteissä, ja ne aloittavat plasminogeenin aktivoimisen plasmiiniksi. Tämä saa aikaan kaskadivaikutuksen, jolla pieni määrä plasminogeenin aktivaattoria voi aloittaa suuren plasminogeenimäärän aktivoinnin. In vivo plasminogeeniakti-vaattori aktivoi plasminogeenin plasmiiniksi, joka sen jälkeen toimii hajottaen fibriinihyytymän. TPA on hyytymän liuotuksen kannalta fysiologisesti merkittävä plasminogeenin aktivaatto-ri.

TPA on seriiniproteaasi, jonka molekyylipaino on suunnilleen 66 000 daltonia, jota tuottavat verisuonien endoteelisolut. Se on glykosyloitunut, ja sen ainoa tunnettu proteiinisubstraat- 2 97809 ti on plasminogeeni. TPA sisältää viisi domeenia (jakson osa-aluetta) : fibronektiini-eormidomeeni (F), kasvutekijädomeeni (G), silmukka l-domssni <K1), silmukka 2-domesni (K2) ja aktiivisen paikan domeeni (A). Yksi tai useampi näistä domee-neista vastaa TPA:lle ominaisesta, erikoisesta fibriiniä sitovasta aktiivisuudesta.

Fibriiniaffiniteetin lisäksi, TPA:n aiheuttamaa plasminogee-nin aktivointia kohottaa fibriinin läsnäolo. Näiden ominaisuuksien ansiosta TPA on arvokas terapeuttinen aine, koska muut hyytymää liuottavat aineet, kuten urokinaasi tai strep-tokinaasi, eivät ole spesifisiä fibriinihyytymää kohtaan.

Käsittelemällä domeeneja on mahdollista parantaa natiivin entsyymin fibriiniaffiniteettia ja lisätä sen in vivo puoli intumisaikaa. Erityisesti silmukka 2- tai sormidomeenin kahdentaminen kohottaa fibriiniaffiniteettia. Kasvutekijädo-meenin eliminoiminen kohottaa in vivo puoliintumisaikaa, ja sijoittaa sormialueen domeenin silmukka-alueiden i tai 2 viereen, jolloin fibriiniaffiniteetti lisääntyy.

Ihmisen TPA on puhdistettu, ja sen fysikaalisia ominaisuuksia on tutkittu. Rijken et ai. "Purification and Characterization of the Plasminogen Activator Secreted by Human Melanoma Cells in Culture", J. Biol. Chem., vol. 256, nro 13, s. 7035-41 (heinäkuun 10. päivänä, 1981). Kokeisiin tarvittavia määriä ihmisen TPA:ta on saatavissa ihmisen melanoomasolujen kasvualustasta. Kluft, C. et ai., "Large-scale production of extrinsic (tissue-type> plasminogen activator from human melanoma cells" teossarjassa Advances in Biotechnological Processes, toim. Mizrahi, A. ja Wezel, A.L. 2:97-110 (1983). Ihmisen TPA:n bioaktiivisuutta on tutkittu, ja sen on osoitettu olevan terapeuttisesti arvokas koe-eläimi1lä ja ihmisellä sen kyvykkyyden ansiosta liuottaa hengenvaarallisia verihyytymiä. Korninger et ai., "Thrombolysis with Human Extrinsic (Tissue- 97809 3 type) Plaeminogen Activator in Doge with Femoral Vein Throm-boeie", J. Clin. Invest., vol. 69, s. 573-580 (maaliskuu, 1982); Weimar et al., "Specific Lyeie of an Iliofemoral Thrombus by Administration of Extrinsic (Tissue-type) Plasminogen Activator", The Lancet, s. 1018-20 (marraskuu 7, 1981); ja Van De Werf, F. et al., Coronary Thrombolysis with Tissue-type Plaeminogen Activator in Patients with Evolving Myocardial Infarction, J. of N. Eng. Med., 310:609-613 (1984).

TPA:n puoliintumisajaksi arvioidaan 2-3 minuuttia, mikä tekee siitä hankalan, ellei epäkäytännöllisen käyttää terapeuttisena aineena. Collen, D. et al., Clot-selective Coronary Thrombolysis with Tissue-type Plasminogen Activator, Science, 220: 1181-1183 (1983).

TPA:n entsyymikinetiikka on tutkittu. Rijken et al., "Fibrinolytic Properties of One-Chain and Two-Chain Human Extrinsic (Tissue-type) Plaeminogen Activator", J. Biol. Chem., vol. 257:2920-2925 (1982). Ihmisen TPA:n sitoutuminen ja fibrino-lyyttinen affiniteetti ihmisen verihyytymiin, verrattuna muiden eläinten verihyytymiin, tunnetaan. Korninger et al., "Studies on the Specific Fibrinolytic Effect of Human Extrinsic (Tissue-type) Plasminogen Activator in Human Blood and in Various Animal Species in Vitro", Thrombos. Haemostas., 46(2): 561-565 (1981). Domeenien rakenteellista yhteyttä fibrino-lyyttiseen aktiivisuuteen ja affiniteettiin on myös kuvattu. Banyai, L. et al., Common evolutionary origin of the fibrinbinding structures of fibronectin and tissue-type plaeminogen activator, FEBS Lett. 163(1):37-41 (1983) ja Ny, T. et al..

The Structure of the Human Tissue-type Plasminogen Activator Gene: Correlation of Intron and Exon Structures to Functional and Structural Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5355-5359 (1984).

TPA:n ilmentyminen transformoiduilla bakteereilla ja hiivoilla tunnetaan myös. Ihmisen TPA:n lähetti-ribonukleiinihappo (RNA) eristettiin ensimmäisen kerran vuonna 1982. Opdenakker 97809 4 et ai., "Messenger RNA for Human Tissue Plasminogen Activator", Eur. J. Biol., s. 269-74 (1982). Pennica et al. transformoivat bakteereja TPA:n ilmentämiseksi, "Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli.", Nature, 301:214-21 (1983). Menetelmiä hiivan transfor-moimiseksi ihmisen TPA:n ilmentämistä varten on kuvailtu US-patenttihakemuksessa SN 663 025 ja julkaistussa EP-patentti-hakemuksessa EP 143 081.

Tämä keksintö koskee ihmisen natiivin kudosplasminogeeniakti-vaattorin paranneltuja farmakologisia vaikutuksia proteiinin domeenialueiden uudelleenjärjestelyjen seurauksena geneettisen rekombinaation avulla toteutettuna. Paranneltuihin vaikutuksiin kuuluvat pidempi puoliintumisaika ja lisääntynyt fibrii-niaffiniteetti. Tässä yhteydessä tuodaan esille DNA-sekvenssejä, jotka sisältävät erikoisia restriktiopaikkoja TPA:n domee-nien välialueilla, jotka ovat käyttökelpoisia domeenien pilkkomisen ja uudelleenjärjestämisen kannalta. Plasmideja, jotka sisältävät tämän TPA:ta koodattavan DNA:n, ja sopivia isäntä-organismeja uudelleenjärjestelyn TPA:n ilmentämiseksi tuodaan myös esille. Lopuksi kuvaillaan uudelleenjärjestelyjä TPA-proteiineja.

Tämän keksinnön mukaisesti kuvaillaan erityisesti DNA-yhdis-tettä, joka sisältää nukleotidiemäksiä, jotka koodittavat TPA:n kaltaisia proteiineja, jotka käsittävät aktiivisen paikan, sormidomeenin (F) ja silmukka-2-domeenin (K2), jolle DNA-yhdisteelle on tunnusomaista se, että se sisältää nukleotidi-sekvensseissä, jotka koodittavat domeenien välialueita, ei-natiiveja endonukleaasin katkaisukohtia, joita ei ole läsnä nukleotidisekvensseissä, jotka koodittavat domeenialueita, ja että mainittujen domeenien järjestys aminopäästä on F, K2 ja A, jonka rekombinantti-DNA-molekyylin nukleotidisekvenssi on, kuten kuviossa 1 on esitetty, nukleotidistä 190 nukleotidiin 342 (F), nukleotidistä 727 nukleotidiin 999 (K2) ja nukleotidistä 1000 nukleotidiin 1782 (A).

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

97809 5

Erityisemmin tässä yhteydessä tuodaan esille edellisen, TPA:ta koodittavan DNA:n yhdisteitä, joissa Xba-paikka on sijoitettu nukleotidiemästen 1Θ7 - 198 väliin, joissa Hpal- tai Sphl-paikat tai niiden yhdistelmä on sijoitettu nukleotidiemästen 328 - 342 väliin, joissa EcoRV-, Clal-, tai Smal-paikat tai niiden yhdistelmä on sijoitettu nukleotidiemästen 442 - 462 väliin, joissa BamHI- tai Hpal-paikat tai niiden yhdistelmä on sijoitettu nukleotidiemästen 709 - 726 väliin, ja joissa Mstl-, Sphl-, tai Xmal-paikat tai niiden yhdistelmä on sijoitettu nukleotidiemästen 973 - 997 väliin.

Edellä kuvailtujen, TPA:ta koodittavien DNA-sekvenssien joukossa on sellaisia, joissa domeenialueita koodittavien nukleotidien sekvenssiä on muutettu natiiviryhmityksestä koskien niiden järjestystä, esiintymistä tai molempia. Erityisesti tässä yhteydessä kuvaillaan TPA:ta koodattavia DNA-sekvensse-jä, joissa DNA koodittaa TPA:n kaltaisia proteiineja, joissa domeenit esiintyvät seuraavassa järjestyksessä aminoterminaa-lisesta päästä lähtien: <a> FA; <b> FGK1A; <c> FGK2A; <d> FK2A; < e > FK1K2A; (f) FK2K2A; ja <g> FGK1K2A.

On lisäksi olemassa TPA:ta koodittavia, DNA-sekvenssejä sisältäviä yhdisteitä, kuten edellä on määritelty, joiden nuk-leotidisekvenssit, jotka sijaitsevat sekä yläpuolella että alapuolella niihin sekvensseihin nähden, jotka koodattavat TPA:n kaltaista proteiinia, mahdollistavat yhdisteen säilymisen sopivassa isäntäsolussa. Tässä yhteydessä on erityisemmin kuvailtu sellaisia yhdisteitä, joiden avulla sopivan isäntä-solun on myös mahdollista ilmentää TPA:n kaltaisia proteiineja, erityisesti niitä analogeja, joissa domeenialueita on muutettu koskien niiden järjestystä, esiintymistä tai molempia, edellyttäen, että ilmennettävän proteiinin kokonaismole-kyylipaino ei ylitä 90 000 daltonia eikä mikään domeeneista esiinny useammin kuin kahdesti. Vielä erityisemmin kuvataan tässä yhteydessä ekspressio- ja replikointiplasmideja (vektoreita), jotka sisältävät DNA:ta, joka koodittaa TPA:n kaltai- 6 97809 eia proteiineja, joissa domeenit esiintyvät seuraavasea järjestyksessä lähtien aminoterminaalisesta päästä: (a) FA; (b) FGK1A; <c> FGK2A; (d) FK2A; <e) FK1K2A; (f) FK2K2A; (g) FK1A tai <h) FGK1K2A.

Tässä yhteydessä kuvataan myös sopivia isäntämikro-organisme-ja, jotka kykenevät ylläpitämään edellä kuvattuja plaemideja ja ilmentämään uudelleenjärjesteltyjä TPA-proteiineja. Tässä yhteydessä kuvataan esimerkiksi ekspressio- ja ei-ekspressio-vektoreita, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka kooditta-vat TPA:n kaltaisia proteiineja, jossa yhteydessä sopiva isäntä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat: <a> hiiva; <b) Esc herichia sp.; ja (c) soluviljelmät. Tässä yhteydessä kuvataan erityisemmin edullista ekspressiovektoria, joka sisältää DNA-sekvenssejä, jotka koodattavat TPA:n kaltaisia proteiineja, jossa yhteydessä sopiva isäntäsolu on kiinalaisen hamsterin munasarjan solu <CHO).

Tässä yhteydessä kuvaillaan lopuksi TPA:n kaltaisia proteii-niyhdieteitä, jotka sisältävät aktiivisen paikan (A) ja yhden tai useamman domeenin, jotka on valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat sormidomeeni (F), kaavutekijädomeeni (G), silmukka l-domeeni <K1), ja silmukka 2-domeeni (K2), joille yhdisteille on tunnusomaista se, että domeenialueita on muuteltu na-tiiviryhmittelystä koskien niiden järjestystä, esiintymistä tai molempia, edellyttäen, että ilmentyvän proteiinin koko-naismolekyylipaino ei ylitä 90 000 daltonia eikä mikään do-meeni esiinny useammin kuin kahdesti. Seuraavat TPA-domeenien ryhmittelyt ovat edullisia: (a) FA; <b) FGK1A; (c> FGK2A; <d) FK2A; < e) FK1K2A; <f) FK2K2A; ja (g) FK1A.

Tämä keksintö pitää sisällään joukon molekyyligeneettisiä manipulointeja, joita voidaan saada aikaan monella eri tavalla. Kaksi prototyyppigeeniä, jotka sisältävät ainutlaatuisia en-donukleaasin restriktiopaikkoja TPA-domeenien välissä, on talletettu Budapestiin sopimuksen mukaisesti. Isäntämikro- 7 97809 organismeina ovat E. colin kannat, jotka sisältävät plasmide-ja, joita on merkitty pTPA-Bl,2,3,4(a) ja pTPA-Bl,2,3,4, ja jotka on kuvattu kartoissa 10 ja 11, vastaavasti. Plasmidi pTPA-Bl,2,3,4<a) talletettiin the Northern Regional Research Center'iin, Peoria, Illinois, USA, 29. elokuuta, 1986, ja sille annettiin tailetusnumero NRRL B-18106. Plasmidi pTPA-B 1,2,3,4 talletettiin the Northern Regional Research Center'iin, Peoria, Illinois, USA, 28. marraskuua, 1986, ja sille annettiin tailetusnumero NRRL B-18142.

Talletettua plasmidia ei pidä tulkita mitenkään tätä keksintöä rajoittavana. Vaikka se onkin lähtömateriaaliksi sopiva, seuraavassa esitetään yksityiskohtaisesti erilaisia saatavilla olevia menetelmiä TPA-analogien muodostamiseksi vaihtoehtoisista lähtöaineista, joiden jälkeen seuraa spesifisiä esimerkkejä edullisista menetelmistä.

Välttämättömiä geneettisiä manipulointeja voidaan tiivistettynä kuvailla siten, että saadaan aikaan TPA:ta vastaava cDNA, syntetisoidaan oligonukleotidiryhmiä, jotka sisältävät eri TPA-domeeneja koodittavat koodaussekvenssit, valikoitujen restriktiopaikkojen ollessa domeenien välialueilla, kloonataan ja replikoidaan domeenit E. colissa, ja ilmennetään tavoiteltu TPA-analogi.

A. Kuviot

Kuviossa 1 kuvataan spesifistä sekvenssiä ja emästen asemien numerointia synteettiselle TPA DNA:lie verrattuna natiiviin cDNA:han. Natiivit domeenit ovat kaikki läsnä kuviossa 1 luonnollisessa järjestyksessään. Kuviossa 2 verrataan natii-vin TPA:n aminohapposekvenssiä TPA-analogiin kaikkien luonnollisten domeenien ollessa normaali järjestyksessä (katso kartta 11). Kummassakin kuviossa yläpuoliset sekvenssit edustavat joko nukleotidien tai aminohappojen natiiveja sekvenssejä, alempien sekvenssien kuvastaessa modifioitua TPA:ta.

8 97809

Kuviossa 3 esitetään oligonukleotideja, joita käytetään muodostettaessa TPA-analogeja synteettisesti. Kuviossa 4 vertaillaan natiivia TPA-proteiinia kartassa 11 kuvattuun analogiin, jossa kartassa on TPA—domeenien natiivijärjeetys, kuvaamalla domeenialueiden sisältämiä aminohappoja ja nukleotideja. Domeenien välialueet muodostuvat niistä aminohapoista, jotka sijaitsevat domeenien välissä, kuten on kuvattu kuviossa 4 (katso määritelmiä). Numeroidut viitteet joko nukleoti-deihin tai aminohappoihin viittaavat näihin kuvioihin kauttaaltaan tässä julkaisussa.

B. Yleiset menetelmät

Yleisesti ottaen, tähän patenttihakemukseen tarvittava nimistö ja yleiset laboratoriomenetelmät voidaan löytää teoksesta Maniatis, T. et ai., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982. Manuaalista käytetään tämän jälkeen nimitystä Maniatis.

Kaikkia E. coli-kantoja kasvatetaan Luria-1iemessä <LB> glukoosin kanssa, Difcon antibioottialustalla no 2 ja M9-alustal-la, johon on lisätty glukoosia ja happohydrolysoidun kaseiinin aminohappoja. Antibiooteille resistenttejä kantoja säilytettiin Maniatiksessa kuvatuissa lääkeainepitoisuuksissa. Transformaatiot suoritettiin menetelmän mukaan, jota on kuvannut Morrison, D.A. (1977), J. of Bact., 132:349-351; tai Clark-Curtiss, J.E. ja Curtiss, R., 1983, teoksessa Methods in Enzymology, 101:347-362, toimittajina Wu, R., Grossman, L. ja Moldave, K., Academic Press, New York.

Kaikkia entsyymejä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaan. Pesäkehybridisaatiot toteutetaan kuten Grunstein, M. et ai. ovat yleisesti kuvanneet, Proc. Nat. Acad. Sei., 72, voi. 72, s. 3961-5 (1975), mutta modifioituna toteuttaen seuraavaa menetelmää: Nitroselluloosakalvoille kasvatetaan edellä preparoitujen solujen pesäkkeitä. Kalvot asetetaan sen jälkeen, • 97809 9 peeäkepuoli ylöspäin 5-8 paksuisen Whatman 3MM paperin muodostamalle alustalle, joka on kastettu denaturoivaan liuokseen, joka sisältää 1,5 M NaCl:a ja 0,5 M NaOH:a. Denaturan-tin annetaan diffundoitua ylöspäin pesäkkeisiin 1,5-2 minuutin ajan, jonka kuluttua kalvot siirretään toiselle, 3MM paperien muodostamalle alustalle, joka on kastettu neutraloivaan liuokseen, joka sisältää 0,5 M Tris-HCl:a pH 7,4; 2 x SSC:a <1 x SSC = 0,15 M NaCl; 0,015 M Na-sitraatti; pH 7,1), ja 25 mM EDTA:, 1-3 minuutin ajaksi. Filtterit kuivataan sen jälkeen perusteellisesti ilmassa ja paistetaan vakuumissa o 2-4 tuntia 80 C:ssa.

Hybridisointiolosuhteet oligonukleotidikoettimille ovat sellaiset kuin Goeddel, D.V. et ai. ovat aikaisemmin kuvailleet. Nature, voi. 290, s. 20-26 <1981).

Hybridisaation jälkeen koettimen sisältävä liuos poistetaan ja säästetään, ja kalvoja pestään 0,1 % SDS:ssä, 0,2 x SSC:8sä kaikkiaan 3 tunnin ajan vaihtamalla pesunesteitä 5 kertaa, a' 400 ml. Kalvot ilmakuivataan kauttaaltaan, asetetaan paikoilleen ja autoradiografoidaan käyttämällä Kodak X- OMAT AR-filmiä ja Dupont Cronex Lightening Plus-vahvistusvar- o jostinta 16 tunnin ajan -70 C:ssa.

Plasmidien sekventointia varten, pienen mittakaavan plasmidi-DNA:ta preparoidaan Holmes, D.S. et ai.'in mukaan, Analyt. Biochem., voi. 114, s. 193 (1981). Dideoksisekventointi suoritetaan Sanger F. et ai.'in mukaan, "Cloning in single stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing", J. Mol. Biol. 143:161-178 <1977). Dideokeisieältöiset reaktio- seokset preparoidaan elektroforeesia varten kuumentamalla o 90 : seen 2 minuutin ajan ja jäähdyttämällä jäiden päällä.

2-3 /Ui:aa pipetoidaan kaistaa kohden 8 * denaturointi-sekventointipolyakryyliamidigeelille, joka oli valmistettu ja ajettiin Sangerin ja Coulsonin mukaan, “The use of thin ac- 10 97809 rylamide gale for DNA sequencing", FEBS Lett. 87:107-110, (1978). Geelejä valotetaan huoneen lämpötilassa 2-4 päivää, ja filmit (Kodak XAR-5) kehitetään valmistajan suositusten mukaisesti.

Nukleotidien koot ilmoitetaan joko kiloemäksinä (kb) tai emäspareina (bp). Nämä ovat estimaatteja, jotka ovat peräisin agaroosigeelielektrof oreesista.

Q.TFA cDH& TPA cDNA oli nukleiinihapposekvenssin aktiivisen paikan sopiva lähde. Sen vuoksi oli tarpeetonta syntetisoida aktiivinen paikka kemiallieeeti. TPA cDNA on saatavissa monesta eri lähteestä. Tutkijat ovat raportoineet TPA cDNA:n osien valmistamisesta lähetti-RNA:sta, jota oli eristetty soluviljelmistä, jotka tuottivat suuria määriä TPA:ta, erityisesti Bowesin me-lanoomasoluista. Edlund et ai., "Isolation of cDNA Sequences Coding for a Part of Human Tissue Plasminogen Activator, vol.

80, s. 349-352 (tammikuu, 1983); Gronow et al., "Production of Human Plasminogen Activators by Cell Culture", Trends in Biotechnology, voi. 1, nro 1, s. 26-29 (1983); ja Pennica et al., "Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli.", Nature, vol. 301, s. 214-21 (20. tammikuuta 1983).

Erityisemmin Genentech, Inc., jätti EP-patenttihakemuksen 0 093 619 4. toukokuuta 1983, luottaen prioriteettihakemuk-siin, joiden US-sarjanumerot ovat 374 860; 398 003 ja 483 052, joiden vastaavat jättöpäivät ovat 5. toukokuuta, 1982; 14. heinäkuuta, 1982 ja 7. huhtikuuta, 1983, jota patenttihakemusta nimitetään tämän jälkeen Genentech-hakemukseksi. Genen-tech-hakemuksessa tuodaan esille E. colin K12 kanta 294, jonka ATCC talletusnumero on 31446, joka on transformantti, joka sisältää yhdistelmä-DNA-yhdisteen, joka koodittaa TPA:ta. Lisäksi E. colin K12 kanta W3110, joka on transformoitu rDNA: 11a, tuodaan esille Genentech-hakemuksessa numerolla ATCC nro

Ml m i «m lii as ! > 97809 11 27325, josta myös valmistetaan TPA-uutteita fibrinolyyttieen aktiivisuuden määrittämistä varten.

Julkaisut sisältävät täten yhdistelmä-DNA-yhdisteen, joka on käyttökelpoinen tässä yhteydessä. Samalla tavalla, Genentech-hakemuksen julkaiseminen tuo käyttöön DHFR CHO-KI <ATCC CL 61)soluja, jotka on transformoitu monistamista varten, ilmentäen myös TPA:ta. Tallenne ATCC CL61 tuo täten jälleen esille yhdistelmä-DNA:n nukleotideja, jotka koodittavat tässä yhteydessä käyttökelpoista TPA:ta.

Valmisteen 2 esille tuominen tässä yhteydessä antaa alaa tuntevan käyttöön eristämisprosessin niiden alalla tunnettujen prosessien joukosta, jotka soveltuvat Bowesin melanoomasoluun TPA:ta koodittavan yhdistelmä-DNA-yhdisteen saamiseksi. Bowe-sin melanoomasoluja on yleisesti saatavilla julkisesti.

D. TPA-domeenien syntetisointi

Kuten edellä on mainittu, osia TPA-analogin DNA-sekvensseistä valmistettiin cDNA:sta; suurin osa sekvenssistä ja jopa koko sekvenssi olisi kuitenkin voitu saada aikaan synteettisesti. Kustannukset ja mukavuustekijät ovat määrääviä parametrejä päätettäessä siitä, kuinka saada aikaan tietty TPA-analogin sekvenssi. Valikoimalla katkaisupaikkoja, joita ei ole todettu tavoitellun analogin TPA-domeeneissa, ja sijoittamalla nämä katkaisupaikat TPA:n domeenien välisille alueille, vältytään pilkkomasta tavoiteltua TPA DNA-sekvenssin osaa, ja mahdollistetaan jokaisen yksittäisen domeenin helppo poistaminen ja sijoittaminen.

Syntetisoimalla kemiallisesti osa TPA-geenietä, voidaan päättää emäs emäkseltä menetelmässä, mitä nukleotideja tullaan käyttämään. Tästä prosessista on seurauksena seuraavia etuja: <1> sekundäärirakenteen minimoiminen transkriptiotuotteessa; 12 97809 <2> omakomplementaaristen AT-GC-alueiden minimoiminen; ja (3) erikoisten katkaieupaikkojen sijoittaminen haluttuihin asemiin pitkin cDNA-sekvenseiä.

Oligonukleotideja syntetisoidaan kemiallisesti kiinteätaasi-sen fosforamidiitttiriesterimenetelmän mukaisesti, jota ensiksi kuvailivat Beaucage S.L. ja Caruthers, M.H. Tetrahedron Lett. 22(20):1859-1862 (1981) käyttämällä automaattista syn-teesilaitetta; kuten ovat kuvanneet Needham-VanDevanter, D.R., et ai.. Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984). Oligonukleo-tidit puhdistettiin joko natiivilla akryyliamidigeelielektro-foreesilla tai anioninvaihtoisella HPLC:llä, kuten ovat kuvanneet Pearson, J.D. ja Regnier, F.E., J. Chrom., 255:137-149 (1983) .

01igonukleotideja syntetisoidaan kemiallisesti alle 40 nukleotidin käsittävinä kappaleina. Jokainen kappale suunnitellaan siten, että se täydentää vastaavaa vastinjuostettaan, ja että jokainen kaksijuosteinen segmentti sisältää tarttuvia päitä ligaation optimoimiseksi. Seuraavat kriteerit otetaan huomioon DNA:n jakamisessa kappaleiden syntetisoimista varten: 1) 01igonukleotidikappaleiden pituuksien tulisi olla alle 40 emästä kemiallisen synteesin ja puhdistamisen helpottamiseksi.

2) 6 emäksen minimimäärä, joka "työntyy esiin" toisiaan vastaavista "yläpuolisista" ja "alapuolisista" oligonukleotidi-kappaleista, näyttää tekevän mahdolliseksi segmenttien optimaalisen ojentumisen ja ligaation. 3) Neljän tai useamman emäksen käsittäviä alueita, jotka voivat liittyä joko primääriseen tai vastinsekvenssiin, tulisi välttää.

Synteettisten oiigonukleotidien sekvenssi voidaan varmistaa käyttämällä kemiallista hajotusmenetelmää, Maxam, A.M. ja Gilbert, W. , Grossman, L. ja Moldave, D., toim., Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499-560 (1980). Sekvenssi voidaan vaihtoehtoisesti varmistaa oligonukleotidi-kappaleiden kokoamisen jälkeen kaksijuosteiseksi DNA-sekvens-siksi, käyttämällä Maxamin ja Gilbertin, edellä, menetelmää, :* lM:t Kilit * 97809 13 tai ketjunpäättämismenetelmää kaksi juos teisten templaattien eekventoimieekei, Wallace, R.B., et ai., Gene, 16:21-26 (1981>.

Kahdeksankymmentäseitsemän erillistä oiigonukleotidia syntetisoitiin (kuvio 3). Spesifisenä kokoonpanoetrategiana, joka tässä yhteydessä on tuotu esiin, oli järjestää ensimmäiset 1099 emäsparia, jotka koodattavat TPA-analogin 5'-osaa, joka sisältää valikoidut katkaisupaikat, jotka on esitetty kartassa <11>. Tämä synteettinen oligonukleotidi liitetään sen jälkeen TPA cDNAtn 3'-osaan EcoRI-kohdassa asemassa 1287, joka sisältää aktiivisen paikan.

Oligonukleotidikappaleiden kokoamiseksi kaksijuosteiseksi DNA: ksi voidaan sekoittaa kaikki 87 kappaletta keskenään pariu-tumiskäsittelyä (kuumennus/jäähdytys) ja ligaatiota varten. Tehokkaamman ligaation kannalta on parempi jakaa oligonukleo-tidit neljään ryhmään. Ligaation ja jokaisen ryhmän puhdistamisen jälkeen, nuo neljä ryhmää voidaan sitten pariuttaa ja ligoida, jolloin saadaan lopullinen tuote. Yhteenkoottujen ryhmien ja lopputuotteen puhdistaminen voidaan suorittaa ak-ryyliamidigeelielektroforeesin avulla, kuten Maniatiksessa on kuvattu. Pariuttamisen ja ligoinnin suorittamiseksi myös Ma-niatiksessa kuvattuja yleisiä menetelmiä.

Saattaa olla tarpeen ottaa käyttöön aloituskodoni synteettisiä TPA-geenejä varten. E. coli-systeemin tarkoituksia varten tarvitaan aloituskodoni ATG F-met:n koodittamista varten. Aloituskodoni voidaan sisällyttää synteettiseen geeniin, tai se voidaan toimittaa halutun ekspressioplasmidin toimesta. E. colin kohdalla on tarkoituksenmukaista, aloituskodonin lisäksi, sisällyttää synteettiseen TPA-geeniin sekvenssi, joka tuo riittävää etäisyyttä Shine-Dalgarno-alueen ja aloituskodonin väliin.

• 97809 14

Sekvenssin oikea valinta minimoi sekundäärirakenteen, joka muutoin häiritsisi transkriptiota ja translaatiota, inkorpo-roi maksimaalisen kodonikulutuksen (Grosjean H. Ja Piere, W. , Gene, 16:199-209, 1962); ja korjaa statistiset vinoutumat, joita sekvenssissä todetaan ribosomin kiinnittymispaikan ympärillä (Gold, L., et ai., Ann. Rev. Microbiol., 35:365-403, 1981). Tämän keksinnön mukaista spesifistä sekvenssiä kuvaillaan tässä yhteydessä sen todellisen sekvenssin avulla. Tulee kuitenkin ymmärtää, että vaihtoehtoisia sekvenssejä voitaisiin käyttää TPA-analogien ilmentämisen optimoimiseksi eri isäntä-soluissa.

E. DNA:n ia TPA-aeenin synteettisten osien kloonaus Menetelmät, joita käytetään kloonattaessa cDNA:ta ja TPA:n synteettisiä osia, yhdistelmäkappaleiden kopioimiseksi, jotka koodittavat TPA:n osia, ovat alalla tunnettuja standardimenetelmiä. Maniatiksen manuaali sisältää menettelyohjeet, jotka riittävät toteuttamaan kaikki myöhemmin kuvattavat kloonaukset. Kaikki kloonaukset tehtiin transformoidussa E. colissa, kaikkien hyvin karakterisoitujen kantojen ollessa käyttökelpoisia. Kanta HB101 on edullinen, ellei toisin ole mainittu.

Kloonausvektoreihin, jotka ovat käyttökelpoisia E. colin transformoimiseksi, kuuluvat pBR322 ja pKC7.

F. Erikoisten katkaisuoaikkoien liittäminen TPA:ta kooditta-vaan DNA:hän TPA:n domeenien välialueille valittuja erikoisia katkaisukoh-tia kuvataan kartoissa 10 ja 11. Nämä eivät ole ainoita kat-kaisukohtia, jotka olisivat käyttökelpoisia tässä keksinnössä. Katkaisupaikat valitaan perustuen niiden erikoisuuteen TPA cDNA:ssa. Paikat, jotka tuottavat minimaalisesti aminohappo-muutoksia domeenien välialueille, ovat edullisia, ja ne paikat, jotka ovat ei-toimivia aminohappomuutosten suhteen, ovat edullisimpia (katso kuviot 1 ja 2). Multippelit paikat, jotka sisältävät erilaisia lukukehyksiä domeenien välialueella, ovat käyttökelpoisia sen varmistamiseksi, että domeenit ovat > m t li i.i.iju 97809 15 oikeassa vaiheessa ligaation jälkeen muihin domeeneihin, ilmentymistä varten. Kaksinkertaiset katkaisupaikat voidaan eliminoida yksinkertaisesti hydrolysoimalla paikka ja ligoi-malla sen jälkeen, kun päät on tehty tasapäisiksi. Erikoisen paikan käyttöönotto voidaan toteuttaa kemiallisella synteesillä, kaupallisesti saatavissa olevien linkkerien avulla tai yhden paikan mutaatiolla.

Natiivi TPA cDNA ei sisällä paikkoja, joita seuraavat endo-nukleaasirestriktioentsyymit tunnistavat, niiden paikkojen lisäksi, jotka on järjestetty TPA:n kahteen prototyyppi cDNA:han, jotka on kuvattu kartoissa 10 ja 11: ACC 1 AFL 2 AFL 3 AHA 3 ASU 2 AVA 3 AVR 2 BCL 1 BGL 1 BSS H2 HIND 3 KPN 1 MLU 1 MST 2 ΝΑΕ 1 NCO 1 NDE 1 NHE 1 NOT 1 NRU 1 NS I 1 PVU 1 SAC 2 SAL 1 SAU 1 SFI 1 SNA 1 SNA B1 SPE 1 XHO 1 G. TPA-analooien ilmeneminen E. colissa

Jotta saataisiin aikaan kloonatun geenin, esim. modifioidun TPA-geenin, korkea ilmenemisaste prokaryoottisessa systeemissä, on välttämätöntä konstruoida ekspressiovektoreita, jotka sisältävät vähintään voimakkaan promoottorin ohjaamaan mRNA:n kopiointia, ribosomaalisen kiinnittymispaikan lukemisen aloittamiseksi ja kopioinnin lopettamiseksi. Koska suurten geenituotemäärien kertyminen usein inhiboi solujen kasvua ja aiheuttaa joskus solukuolemia, täytyy tuotteen synteesin ohjaukseen valittua promoottoria säädellä siten, että solujen voidaan antaa kasvaa suuriin tiheyksiin ennen promoottorin indusoimista. Esimerkkeinä säätelyalueista, jotka ovat sopivia tähän tarkoitukseen, ovat E. colin tryptofaanin biosynteetti-sen reitin promoottori ja operaattorialueet, kuten ovat ku- 97809 16 vanneet Yanofsky, C., Kelley, R.L. ja Horn, V., J. Bacteriol., 158:1018-1024 <1984) ja lambda-faagin <PL) vasemmanpuoleinen promoottori, kuten ovat kuvanneet Herskowitz, I. ja Hagen, D., Annu. Rev. Genet., 14:399-445 (1980). E. colissa tuotettu TPA ei kierry sopivasti johtuen suuresta määrästä kysteiinitäh-teitä. E. colin tuottama TPA on ensin denaturoitava ja sen jälkeen renaturoitava. Tämä voidaan toteuttaa liuottamalla E. colin tuottama TPA guanidiini-HCl:ään ja pelkistämällä kaikki kystiinitähteet beeta-merkaptoetanoli1la. Proteiini renatu-roidaan sen jälkeen joko hitaasti dialysoimalla tai geelisuo-datuksella. US-patentti 4 511 503.

H. TPA-analoaien ilmentyminen hiivassa

Heterologisten proteiinien ilmeneminen hiivassa tunnetaan hyvin. Methods in Yeast Genetics, Sherman, F., et ai., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), on hyvin arvostettu teos, jossa kuvataan erilaisia menetelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia TPA-analogien tuottamista varten hiivassa.

Hiivan sisältämän geenin korkean ilmenemisasteen kannalta on välttämätöntä kytkeä geeni voimakkaaseen promoottorisystee-miin, kuten on laita prokaryootissa, ja myös tuottaa tehokkaita kopioinnin terminaatio/polyadenylaatio-sekvenssejä hiivan geenistä. Esimerkkeihin käyttökelpoisista promoottoreista kuuluvat GAL1,10 (Johnston M., ja Davis, R.W., Mol. and Cell. Biol., 4:1440-48, <1984), ADH2 (Russell, D., et ai., J. Biol. Chem. 258:2674-1682, (1983), PH05 (EMBOJ. 6:675-680, 1982), ja MF ai. Monikopioplasmidi selektiivisen markkerin kanssa, kuten esim. Lue-2, URA-3, Trp-1, ja Hie-3, on myös edullinen.

Kun soluja kasvatetaan glukoosilla, GAL- ja ADH2-promoottorit repressoituvat, sallien täten solujen kasvaa suureen tiheyteen. Siinä missä GAL-promoottorit voidaan käynnistää siirtämällä solut galaktoosialustaan, ADH2 käynnistyy sen jälkeen, kun solut ovat käyttäneet kaiken glukoosin. PH05-promoottori voidaan kytkeä päälle tai pois manipuloimalla alustan foe- 17 97809 faattipitoieuukaia. MFai-promoottori on kaiken aikaa toiminnassa isännässä, joka kuuluu crpariutumistyyppiin, mutta on poiskytkeytynyt diploideissa tai soluissa, jotka kuuluvat a-pariutumistyyppiin. Sitä voidaan kuitenkin säädellä kohottamalla tai laskemalla lämpötilaa isännässä, joka sisältää ts-mutaation yhdessä SIR-lokuksista. Sellainen mutaatio vai-o kuttaa 35 C: sea a -solutyyppiin kytkemällä päälle tavallisesti ei-toimivan geenin, joka koodittaa a-pariutumietyyppiä. Ei-toimivan, a-parlutumietyyppisen geenin ilmentyminen puolestaan kytkee pois MFal-promoottorin. Kasvulämpötilan pudotta-o minen 27 C:seen kääntää toisinpäin koko prosessin, ja kytkee pois a-pariutumistyypin ja kytkee päälle MFcilrn (Herskowitz, I. & Oshima, Y. <1982) teoksessa The molecular biology of the yeast Saccharomyces, <toim. Strathern, J.N., Jones, E.W., & Broach, J.R., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, s. 181-209).

Polyadenylaatiosekvenssit saadaan minkä tahansa voimakkaasti ilmenevän geenin 3' -pään sekvensseistä, kuten A0H1, MF etl, tai TPI (Alber, T. ja Kawasaki, G., J. of Mol. & Appi. Genet. 1:419-434, 1982).

Monia hiivan ekspressioplasmideja, kuten YEp6, YEpl3, YEp24, voidaan käyttää vektoreina. Kiinnostuksen kohteena oleva geeni, kuten TPA-geeni voidaan sulauttaa mihin tahansa edellä mainittuun promoottoriin ja ligoida sen jälkeen plasmideihin ilmentämistä varten eri hiivaisännissä. Edellä määriteltyjä plaemideja on täydellisesti kuvailtu kirjallisuudessa (Bot-stein, et ai., Gene, 8:17-24, 1979; Broach, et ai., Gene, 8:121-133, 1979).

Vaikkakin edellä määriteltyjä plaemideja voidaan ja on käytetty ilmentämään vieraita geenejä hiivassa, tuodaan tässä yhteydessä esille vektoreita, jotka antavat merkittävää joustavuutta koskien ekspressiovektoreiden erilaisten komponenttien liittämistä ja/tai leikkaamista. Yksi sellainen esimerkki on vektori p al_ADHt, jota kuvataan kartassa 18.

97809 18

Kahta menetelmää käytetään transformoitaessa hiivasoluja. Yhdessä tapauksessa hiivasolut muutetaan ensin protoplasteiksi käyttäen tsymolyaasia, lytikaasia tai glusulaasia, minkä jälkeen lisätään DNA ja polyetyleeniglykoli (PEG). PEG:llä käsitellyt protoplastit regeneroidaan sen jälkeen 3 %:ssa agar-alustassa valikoivissa olosuhteissa. Tämän menetelmän sisältämiä yksityiskohtia esitetään julkaisuissa J.D. Beggs, Nature (London), 275:104-109 (1978); ja Hinnen, A., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:1929-1933 (1978). Toiseen menetelmään ei liity soluseinän poistamista. Sen sijaan soluja käsitellään litiumkloridin tai -asetaatin ja PEG:n kanssa ja siirrostetaan valikoiville maljoille (Ito, H., et ai., J.

Bact., 153:163-168, 1983).

TPA-analogeja voidaan eristää hajottamalla solut ja soveltamalla standardeja proteiinien eristämismenetelmiä lyeaattei-hin, TPA-analogit voidaan ilmaista käyttämällä Western blot-menetelmiä tai radioimmunomäärityksiä.

I. Ilmentäminen soluviljelmissä TPA-analogia koodittava DNA voidaan liittää erilaisiin eks-pressiovektoreihin käytettäväksi isäntäsoluviljelmien transformaatiossa. Kaikki vektorit sisältävät geenisekvenssejä TPA-analogien transkription ja translaation aloittamiseksi, jotka sopivat yhteen transformoitavan isäntäsolun kanssa. Silloin kun isäntäsolu on korkeamman eläimen solu esim., nisäkässolu, voidaan käyttää luonnollisena esiintyvää TPA-geenin transkription ja translaation geenisekvenssiä, tai luonnollisena esiintyvää geenisekvenssiä voidaan käyttää yhdessä heterolo-gisen promoottorisekvenssin kanssa. Vektorit sisältävät lisäksi edullisesti markkerin, joka tuo käyttöön fenotyyppisen ominaisuuden transformoitujen isäntäsolujen seulomista varten. Replikointivektori voisi lisäksi sisältää replikonin.

Soluviljelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia TPA-analogien tuottamisessa, kuvastavat hyönteie- tai nisäkäsalkuperää olevat 97809 19 solut. Nieäkässolusyeteemit esiintyvät usein yksisolukerrok-sisessa muodossa, vaikka myös nisäkässolususpensioita voidaan käyttää. Kuvaaviin esimerkkeihin nisäkässolulinjoista kuuluvat VERO- ja HeLa-solut, kiinanhamsterin munasarjan (CHO) so-lulinjat, WI38-, BHK-, C0S-7- tai MDCK-solulinjät. Kuvaaviin hyönteissolulinjoihin kuuluvat Spodoptera frugiperda (fall armyworm) ja Bombyx mori (eilkkimato>.

Kuten edellä on osoitettu, vektori, esim., plasmidi, jota käytetään isäntäsolun transformointiin, sisältää edullisesti geenisekvenssejä TPA-geenisekvenssin transkription ja translaation aloittamiseksi. Näitä sekvenssejä nimitetään kontrol-liekepreeeiosekvensseiksi. Silloin kun isäntäsolu on hyönteistä! nisäkäsperäinen, kuvaavia käyttökelpoisia kontrol1ieks-pressiosekvenssejä saadaan SV-40-promoottorista (Science, 222, 524-527, (1983)), CMV I.E.-promoottorista (Proc. Natl. Acad. Sei., 81:659-663, 1984) tai metallitioneiinipromoottorista (Nature, 296, 39-42 (1982)). Kuten edellä on todettu, isäntä-solun ollessa nisäkässolu, voidaan käyttää kontrolliekspres-siosekvenssejä TPA-geeniä varten, mutta on edullista yhdistää TPA-analogi heterologisen transkription aloituspaikan kanssa. Plasmidin tai replikoitunut tai integroitunut DNA-materiaali, joka sisältää kontrolliekspreseiosekvenssit, katkaistaan käyttämällä restriktioentsyymejä, ja säädetään kooltaan tarvittaessa tai haluttaessa, ja liitetään cDNAthan, joka koo-dittaa TPA-analogeja, alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä.

Kuten hiivojen tapauksessa, silloin kun käytetään korkeampien eläinten isäntäsoluja, vektoriin on sisällytettävä polyade-nylaatio- tai terminaattorisekvenssejä tunnetuista nisäkäs-geeneistä. Esimerkki terminaattorisekvenssistä on polyadeny-laatioeekvenssi naudan kasvuhormonin geenistä.

Vektoriin voidaan sisällyttää lisäksi geenisekvenssejä isän-täsolussa tapahtuvan replikaation säätelemiseksi, kuten sellaisia sekvenssejä, joita on tavattu naudan papilloomavirus- . 97809 20 tyypin vektoreieea, Saveria-Campo, M. "Bovine papilloma virus DNA: a eukaryotic cloning vector” teoksessa DNA Cloning Voi II a practical approach. Ed. D.M. Glover, IRL Press, Arlington, Virginia, s. 213-238 (1985).

Isäntäsolut ovat kompetentteja tai tehdään kompetenteiksi transformaatiota varten erilaisten menetelmien avulla. On olemassa useita hyvin tunnettuja menetelmiä DNA:n siirtämiseksi eläinsoluihin. Näihin kuuluvat: kalsiumfosfaattisaostue, resipienttisolujen sulauttaminen bakteeriprotoplasteihin, jotka sisältävät DNA:n, resipienttisolujen käsitteleminen li-posomien kanssa, jotka sisältävät DNA:n, ja DNA:n mikroruis-kuttaminen suoraan soluihin.

Transformoituja soluja kasvatetaan hyvin alalla tunnetuilla tavoilla, Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R.J., Dowden, Hutchinson ja Ross, Inc., (1977), ja ilmentyneet TPA-analogit otetaan talteen solualustasta niissä systeemeissä, joissa proteiini erittyy isäntäsolusta, tai so-lususpensiosta isäntäsolusysteemin hajottamisen jälkeen, esim. mekaanisilla tai entsymaattisilla keinoilla, jotka tunnetaan alalla hyvin.

J. TPA-analooien laadunarvostelu TPA:ta ja sen analogeja voidaan arvostella kahdella tavalla. Suhteellinen kyky pilkkoa plasminogeeni plasmiinikei voidaan määritellä, ja inhibiittorien suhteellinen kyky estää plas-miinin muodostuminen voidaan määritellä. Seuraavat yksityiskohdat kuvailevat menetelmiä sellaisissa laadunarvosteluissa.

Amidolyyttinen määritys. TPA-analogien toiminnallinen aktiivisuus määritetään käyttämällä yhdistettyä amidolyyttistä koetta, jotka ovat kuvailleet Verheijen, J.H., et ai., A simple, sensitive epectrofotometric assay for extrinsic (tissue-type) plasminogen activator applicabie to measurements in plasma. Thromb. Haemostas., 48:266-269 (1982). Lyhyesti, TPA- • 97809 21 analogeja sisältävät näytteet sekoitetaan plasminogeenin ja CNBr-liuotettujen fibrinogeenipalasten kanssa. Täten muodostunut plasmiini pilkkoo sen jälkeen ulkopuolisesti lisätyn kro-mogeenisen substraatin, S-2251:n <H-D-valyyli-L-leusyyli-L-lysiini-p-nitroanilidi-dihydrokloridin; KABI, Stockholm, Ruotsi, muodostaen värillisen tuotteen, jota tarkkailaan spekt-rofotometrisesti. Proteaasi-inhibiittorien vaikutusta TPA-ana-logien aktiivisuuteen arvioidaan käyttämällä tämän määrityksen modifikaatiota, jota ovat kuvanneet Verheijen, J.H., et ai.. Evidence for the occurrence of a fast-acting inhibitor for tissue-type plasminogen activator in human plasma. Thromb. Haemostas., 51:392-395 (1984). Lisätty inhibiittori sitoutuu TPA:han muodostaen palautumattoman kompleksin, ja estäen siten TPAtta aktivoimasta plasminogeenia. Esimerkiksi puhdistettua natiivia TPA:ta titrataan kasvavien määrien kanssa inhibiittorin sisältävää näytettä, ja TPA:n jäännösaktiivisuus mitataan kuten edellä todettiin. Sen jälkeen piirretään standar-dikäyrä, esittämällä graafisesti TPA:n jäännösaktiivisuus lisätyn, inhibiittoria sisältävän näytemäärän funktiona. Vastaavalla tavalla titrataan TPA-analogit inhibiittorin kanssa. Muodostuneita käyriä verrataan TPA-standardikäyrään. Yhtäläi-syysaste käyrien välillä on suorassa suhteessa tietyn analogin alttiuteen inhibitiolle.

Fibriiniautografia. TPA-analogien molekyylipainot estimoidaan ajamalla näytteet, jotka sisältävät analogeja, natriumdode-kyy1isulf aatti-polyakryy1iamidigeelielektrof orees isea < SDS-PAGE), ja asettamalla sen jälkeen akryyliamidigeeli plasminogeenia sisältävän fibriini-indikaattorikalvon päälle. Kun analogiproteiinit diffundoituvat akryyliamidigeelistä indi-kaattorikalvoon, ne muuttavat plasminogeenin plasmiiniksi, mikä aiheuttaa kirkkaan fibrinolyysivyöhykkeen muodostumisen muutoin sameaan fibriini-indikaattoriin. Tämän vyöhykkeen ilmestyminen osoittaa aktiivisen TPA-analogin läsnäolon vastaavassa paikassa akryyliamidigeelillä. Tätä tekniikkaa käytetään myös määriteltäessä vuorovaikutusta TPA-analogien ja 97809 22 proteaasi-inhibiittorien välillä. Kuten edellä on mainittu, tästä vuorovaikutuksesta on seurauksena entsyymi-inhibiitto-rikompleksin muodostuminen, jonka molekyylipaino on suurempi kuin itse analogin. SDS-PAGE:n jälkeen, kompleksi ilmaisee TPA-jäännöksen aktiivisuuden, joka voidaan tehdä näkyväksi fibriini-indikaattorikalvolla. Tämän tekniikan yksityiskohtia kuvailivat alunperin Granelli-Piperno, A. ja E. Reich, A study of proteases and protease-inhibitor complexes in biological fluids. J. Exp. Med., 148:223-234 (1978).

TPA-analogien antigeenin määrittely. Sandwich-tyyppiset (kerrokselliset) entsyymikytkeiset immunosorbenttimääritykset <S-ELISA-määritykset). TPA-analogien antigeeni määritetään immu-nologisesti kahdella erilaisella S-ELISA-määrityksellä. Ensimmäisessä käytetään vuohen polyklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä ihmisen kohdun TPA:lie. Toisessa määrityksessä käytetään hiiren monoklonaalista vasta-ainetta. Tämä monoklonaalinen vasta-aine kohdistuu spesifisesti suoraan epitooppia vastaan, jota tarvitaan TPA:n aktiivisuuteen. Vasta-aineen käyttäminen, joka on spesifinen TPA:n sisältämälle aktiivisen paikan domeenille, antaa käyttöön tehokkaan mikä tahansa TPA-analogin antigeenin määritystavan, jonka analogin primäärirakennetta on muutettu muun kuin aktiivisen paikan domeenin osalta. Tämä määritys on samanlainen kuin Korninger, C., et ai.'in kuvailema määritys, Sandwich ELISA for TPA antigen employing a monoclonal antibody. Thromb. Res., 41:527-535 (1986). Molempien määritysten herkkyysraja on suunnilleen 1 ng TPA:ta ml:aa kohti.

Western immunoblottaustekniikka. TPA-analogien kyky muodostaa komplekseja inhibiittorien kanssa voidaan myös määritellä käyttämällä SDS-PAGE:a ja Western immunoblottaustekniikkaa, kuten alunperin ovat kuvanneet Towbin, H., et ai., Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Adac. Sci. USA, 76:4350-4354 (1979). Lyhyesti, TPA- 97809 23 analogin annetaan vuorovaikuttaa inhibiittorin kanssa, seos ajetaan SDS-PAGE:11a, ja proteiinit siirretään sähköisesti

nitroselluloosapaperille. Sekä kompleksoitumaton, vapaa TPA

että inhibiittorin kanssa kompleksoitunut TPA ilmaistaan käyttämällä puhdistettua polyklonaalista vuohen IgG:tä, joka on spesifinen TPA:lle, ja kanin antiseerumia, joka kohdistuu vuohen IgG:tä vastaan. TPA:ta sisältävät immunokomplekit teh- 125 dään sen jälkeen näkyviksi käyttämällä I -leimattua proteiini A:ta ja autoradiografiaa.

Ilmaisu "soluviljelmä" viittaa kasvavien solujen viljelykoko-naisuuteen, jotka solut ovat peräisin joko monisoluisesta kasvista tai eläimestä, joka kokonaisuus mahdollistaa solujen pysymisen elinkykyisinä alkuperäisen kasvin tai eläimen ulkopuolella.

Ilmaisu "domeeni" tarkoittaa aminohapposekvenssin sisältämää, erillistä jatkuvaa osaa, joka voidaan yhdistää tiettyyn toimintaan. Koskien TPA:ta, edellä siteeratut viitteet ovat määritelleet domeenialueet, ja kuviossa 4 tuodaan tässä yhteydessä esille domeenien välialueiden keskikohtien likimääräiset sijainnit, jotka sijaitsevat domeenien välissä.

Ilmaisulla "alapuolinen" identifioidaan sekvenssejä, jotka jatkuvat edemmäs ilmentymisen suuntaan; esimerkiksi, koodaus-alue sijaitsee alapuolisesti aloituskodoniin nähden.

Ilmaisu "domeenien välinen" viittaa niihin alueisiin proteiinin aminohapposekvenssissä, jotka sijaitsevat domeenien välissä. Tässä patenttihakemuksessa domeenien väliset alueet käsittävät plus tai miinus viisi aminohappotähdettä kuviossa 4 kuvatuista keskipisteistä. Sormi- ja kasvutekijädomeenien välinen alue sijaitsee täten aminohappojen 44 - 55 välissä mukaanlukien ne; kasvutekijä- ja silmukka l-domeenien välialue sijaitsee aminohappojen 86 - 97 välissä mukaanlukien ne; silmukka 1- ja silmukka 2-domeenien välialue sijaitsee aminohap- • 97809 24

Pojen 169 - 180 välissä mukaanlukien ne; silmukka 2- ja aktiivisen paikan domeenien välinen alue sijaitsee aminohappojen 257 - 268 välissä mukaanlukien ne.

Ilmaisulla "ylläpidetty" tarkoitetaan plasmidin pysyvää läsnäoloa (plasmidin säilymistä) transformoidun isäntäsolun sisällä, jossa plaemidi on läsnä itsenäisesti kahdentuvana kappaleena tai isäntägenomiin liittyneenä osana.

Ilmaisu “mikro-organismi” sisältää sekä yksisoluisia proka-ryoottisia että eukaryoottisia organismeja, kuten esim. bakteerit, sädesienet ja hiivat.

Ilmaisu "ei-natiivit endonukleaasin katkaisukohdat" viittaa sndonukleaasin katkaisukohtiin, joita ei todeta natiivin cDNA-sekvenssin vastaavassa paikassa. Näihin kuuluvat sekä erikoiset että ei-erikoiset paikat.

Ilmaisu "operoni" tarkoittaa geenin ilmentymisen ja säätelyn täydellistä yksikköä, joka sisältää rakennegeenejä, säätely-geenejä, ja ohjauselementtejä DNA:ssa, jotka säätelygeenin tuote tunnistaa.

Ilmaisulla ’'plaemidi" tarkoitetaan itsenäisesti replikoivaa ekstrakromosomaalista, renkaanmuotoista DNA:ta, ja se sisältää sekä ekspressio- että ei-ekepressiotyyppejä. Silloin kun rekombinanttimikro-organismia tai soluviljelmää kuvataan isännöimässä ekspressioplasmidia, ilmaisu "ekspreseioplasmi-di“ sisältää sekä ekstrakromosomaalisen renkaanmuotoisen DNA:n että DNA:n, joka on sisällytetty isännän kromosomiin (kromosomeihin).

Ilmaisulla "promoottori" tarkoitetaan DNA-aluetta, joka aiheuttaa RNA-polymeraasin sitoutumisen kopioinnin aloittamiseksi .

25 9 7 8 0 9

Ilmaisulla "DNA-sekveneei" tarkoitetaan yksi- tai kaksijuos-teieta DNA-molekyyliä, joka sisältää nukleotidiemäkset adeno-eiini, tymidiini, sytosiini ja guanosiini.

Ilmaisulla "sopiva isäntä" tarkoitetaan soluviljelmää tai mikro-organismia, joka sopii yhteen yhdistelmäplasmidin kanssa, ja antaa plasmidille mahdollisuuden replikoitua, inkorporoi-tua genomiinsa tai tulla ilmennetyksi.

Ilmaisulla “yläpuolinen" identifioidaan sekvenssejä, jotka jatkuvat vastakkaiseen suuntaan ekspressiosta; esimerkiksi, bakteeripromoottori sijaitsee kopiointiyksikön yläpuolella, aloituekodoni sijaitsee koodausalueen yläpuolella.

Merkintätavat, joita käytetään kuvaamaan plasmideja ja kappaleita kartoissa 1-27, vaikkakin ainutkertaisia koskien tätä hakemusta, on tarkoitettu olemaan synonyymisiä plasmidien ja niiden kappaleiden tavanomaisten esitystapojen kanssa. Toisin kuin tavanomaisissa renkaanmuotoisissa kuvioissa, kartoissa olevat yksiviivaiset kuviot kuvaavat sekä renkaanmuotoista että lineaarista kaksijuosteista DNA:ta aloituksen tai kopioinnin esiintyessä vasemmalta oikealle <5' -->3'). Tähdet <*) kuvaavat nukleotidien liittymiskohtaa plasmidien saattamiseksi renkaan muotoon. Kappaleilla ei ole tähtimerkkejä, koska ne ovat kaksijuosteisen DNA:n linaarisia pätkiä. Endo-nukleaasin katkaisupaikat esitetään viivan yläpuolella. Gee-nimarkkerit esitetään viivan alapuolella. Plasmideja tai kappaleita kuvaavien kaavioiden alapuolella esiintyviä viivoituksia käytetään osoittamaan emäsparien lukumäärää kahden DNA-kohdan välissä. Merkkien välinen suhteellinen tila ei osoita todellisia etäisyyksiä, vaan on tarkoitettu ainoastaan osoittamaan niiden suhteellisia asemia kuvattavassa DNA-sekvens-sissä.

97809 26

Valmiste 1. Vektori - pSK4 - Kartat 1-3.

Plasmidi pSK4 on ekspreseiovektori, joka kykenee ohjaamaan heterologieten proteiinien ilmentymistä E. colissa. Se sisältää voimakkaan, säädeltävän promoottorin välittämään kopiointia, ja voimakkaan ribosomin sitoutumispaikan luennan aloittamiseksi. Erityisesti pSK4 käyttää promoottoria ja ribosomin sitoutumispaikkaa (RBS) tryptofaanin (trp) operonista. Erikoinen Clal-paikka, välittömästi RBS:n alapuolella, on saatavilla TPA:n kaltaisten edullisten geenien liittämistä varten. (Kartta 3).

Plasmidin pSK4 valmistamiseksi on välttämätöntä kloonata uusi pTRZl (kartta 1) pKC7:n kanssa, joka on tunnettu (kartta 2). Rao, R.N. ja Rogers, S.G., Gene, 7:79-82 (1979). Plas-midi pTRZl sisältää osan trp-operonieta, joka sisältää promoottori /operaattorialueen, ribosomiin sitoutumispaikan, ja trpLE-fuusion ALE1413 kuin myös rakennegeenit galaktosidaa-sille (IacZ) ja laktoosipermeaasille (IacY). Plasmidi pKC7 on pBR322:n johdannainen, joka määrää resistenssin ampisillii-nille ja kanamysiini 1le, ja joka sisältää monta erikoista restriktioendonukleaasin paikkaa.

pTRZl:n ja pKC7:n yhdistelmäplasmidi tuottaa pSK3:n, joka sisältää trp-promoottorin, RBS:n ja LE:n pKC7:n sisällä. Plas-midia pSK3 modifioidaan sen jälkeen yhteensulatetun peptidi-sekvesein trpLe eliminoimiseksi, jolloin saadaan yleinen ekspreseiovektori pSK4.

(1) Plasmidin pTRZl konstruointi - Kartta 1.

Plasmidi pTRZl on tunnettujen plasmidien pMC1403 ja pVVl klooni.

Plasmidi pMC1403 antaa käyttöön pTRZl:n IacZ-geenin miinus N- 97809 27 terminaaliset kahdeksan aminohappoa, ja sitä kuvailee täydellisesti Casadaban, M.J., et ai., J. Bacteriol., 143:971-980 <1980). Plasmidi pMC1403 sisältää kolme erikoista restrik-tioentsyymin katkaisukohtaa. Se katkaistaan EcoRI:llä, defos-foryloidaan bakteriaalisella alkalisella fosfataasilla, ja päät tasoitetaan E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-kappa-leen kanssa. Plasmidi pVVl antaa käyttöön trp-promoottorin ja operaattorisekvenssin, ja sitä kuvailevat täydellisesti Nichols, B.P. ja Yanofsky, C., 1983, Methods in Enzymology, toim. L. Grossman ja K. Moldave, 101:155-164, Academic Press, N.Y. Plasmidi pVVl sisältää trp-operonin, jossa on 952 emäs-parin deleetio < /\LE1413), joka yhdistää trp-esisekvenssin trpE-geeniin muodostaen trpLE:n. Plasmidi pVVl katkaistaan PvuII:11a ja BglII:lla, jolloin saadaan kappale 2 <323 ep), joka eristetään preparatiivisella agaroosigeelielektroforee-eilla. Bglll-paikka täytetään Klenow-entsyymillä. Kappale 2 ligoidaan sen jälkeen pMC1403:n kanssa, jolloin saadaan pTRZl.

<2) Plasmidin pSK3 konstruointi.

pTRZl:n rakennegeenit LacY ja LacZ ovat tarpeettomia pSK4:n konstruoimiseksi, ja niiden muodostama deleetio antaa käyttöön pienemmän plasmidin, johon sisältyy erikoisempia kloo-nauspaikkoja. LacY-deleetiosta johtuen vältytään lisäksi membraaniin sidotun proteiinin ylituotannon haittavaikutuksilta. Kuten kartassa 2 on esitetty, trp-sekvenssit (kappale 3) leikataan pTRZl:stä EcoRI/BamHI-pilkkomisella, niitä käsitellään alkalisella fosfataasilla uudelleenliittymisen minimoimiseksi, ja liitetään sen jälkeen pKC7:n EcoRI/BamHI-alueeseen, kappale 4, joka pilkkomisen seurauksena ei enää spesifioi resistenssiä kanamysiinille. Klooneja, jotka sisältävät ampieilliiniresistensein <AmpR) ja ovat kanamysiinisen-sitiivejä <KanS), seulotaan restriktiokappaleiden osalta, joihin odotetaan liittyneen trp-promoottori/operaattorisek-venssin. Tätä plasmidia nimitetään pSK3:ksi, ja sitä vastaavat muodot ovat kuten on kuvattu kartassa 2.

28 97809 (3) Plaemidin pSK4 konstruointi.

pSK3:n trp-promoottori pitää vielä sisällään trpLE-peptidin, joka on tarpeeton suoran ekspressiovektorin konstruoimiseksi. trpLE-segmentti leikataan seuraavalla menetelmällä. Kuten on kuvattuna kartassa 3, EcoRI/BamHI-kappale 5, joka sisältää trp-sekvenssit, leikataan pSK3:sta ja puhdistetaan elektro-eluoimalla polyakryy1iamidigeeleietä. Kuten on esitetty, tämä kappale sisältää kolme Taql-paikkaa, joista toinen sijaitsee promoottori/operaattorialueella, (Taql'') ja toinen sijaitsee ribosomiin eitoutumispaikan ja trpLE:n translaation alkamis-paikan (Taql''') välissä. Kappale liuotetaan osittain Taql: llä, ja koko kappalevalikoimaa käytetään ligointireaktiossa pBR322:n kanssa, joka aikaisemmin on leikattu sekä EcoRI:llä että ClaI:llä.

Taql tunnistaa Ti»CGA:n (nuolet tarkoittavat juosteen leikkauskohtaa), kun taas Clal tunnistaa ATJ,CGAT:n. Koska nämä kaksi entsyymiä tuottavat yhteensopivia kohesiivisia päitä, ja emäs, joka on 5' —> Taql'''-paikkaan, ribosomiin sitoutu-mispaikan ja trpLE:n välissä, on A, <J. of Bact., 133:1457-1466), tämän Taql:n pään liittäminen Clal-päähän regeneroi Clal-paikan. Huomattakoon, että tämä kloonauskaavio valikoi yksinkertaisia TaqI-pätkiä ja varmistaa myös, että kopiointi promoottorista tapahtuu myötäpäivää. Kloonit, jotka sisältävät 278 ep:n EcoRI/ClaI-insenrtin, ja trp-promoottorille ominaiset restriktiomallit valitaan, ja ne ovat pSK4:n vastineita. Kloonit ovat käyttökelpoisia proteiinisekvenssien ilmentämiseen, jotka kykenevät translaation aloitukseen sijoitettuina Clal-paikkaan.

Valmiste 2. Täyspitkän cDNA:n eristäminen, joka koodittaa ihmisen kudoksen plasminogeenin aktivaattoria.

97809 29 A. Materiaalit -ia menetelmät (1) Boweein melanoomaeolujen kasvattaminen

Bowes tuo esille vakiintuneen solulinjan, joka on peräisin ihmisen spontaanista melanoomasta ja on lahja tri Daniel Rif-kiniltä New York University of Medicine'stä. Soluja viljellään Dulbeccon Modified Eagle Mediumeissa (Gibco), johon on lisätty 10 % naudan sikiön seerumia (Gibco) ja 50 /ug/ml gen- o tamysiiniä (Sigma), kosteutetussa ilmakehässä 37 :ssa, käyttämällä 95 % ilmaa/5 X CO2. RNA-valmistukseen talteenotettuja soluja kasvatetaan tiheäksi suspensioksi 150 cm Falcon-pulloissa.

(2) TPA mRNA:n valmistaminen RNA:ta eristetään Boweein melanoomasoluista pääasiallisesti siten, kuin Lizardi, et ai. ovat kuvanneet Anal. Biochem., voi. 98, s. 116-122 (1979).

+ DNA rikastetaan polyA :n suhteen viemällä oligodeoksitymidii- niselluloosa(Odt-eellulooea - Collaborative Research)kolonnin läpi, kuten Aviv, H. et ai. ovat kuvanneet, Proc. Nat. Acad.

Sei., voi. 69, s. 1408-12 (1972). Tyypillinen saanto 10-2 150 cm :n pulloista, jotka on kahdesti seulottu erillisissä +

Odt-kolonneiesa, on suunnilleen 50 ^ug polyA mRNA:ta.

+

PolyA mRNA fraktioidaan sentrifugoimalla lineaaristen 15-30 X sakkaroosigradienttien läpi. PolyA mRNA:ta, (-^300 /ug) liuotettuna 200-400 yulraan steriiliä tislattua vettä, ladataan gradienttiin ja sentrifugoidaan Beckman SW41 Ti-rootto-rissa 35 000 RPM 18 tuntia, 0,5 ml:n fraktioita kerätään talteen, käyttäen Buchler Auto Densi-flow Model IIC:a purkaen saalis ylhäältä alaspäin, liitettynä Gilsonin Micro-fraktion-kerääjään (Model FC80-K). Jokaisen fraktion tasaeriä ruiskutetaan Xenopuksen munasoluihin ja translaatiotuotteiden ei- 97809 30 eältämä plaeminogeenin aktivaattorin aktiivisuus määritetään kaseiiniagarmaljamenetelmällä, joka on analoginen Miskin, R. et ai.'in kuvaileman menetelmän kanssa, Nuc. Acids Res. voi. 9, s. 3355-63. TPA-aktiivisuuden tuo näkyviin mRNA, joka kulkeutuu noin 19S:n kohdalle.

Kudosperäinen plaeminogeenin aktivaattori TPA määritetään spesifisesti tarkkailemalla plaeminogeenin muuttumisesta plasmiiniksi, ei-spesifiseksi proteaasiksi, joka hydrolysoi kaseiinia. Määritys suoritetaan seuraavasti. 0,5 ml 8 % kaseiinia, keitettyä, sekoitetaan 1 ml:n kanssa 2 x MBS:ää ja o kuumennetaan 50 C:seen. 3 * agaroosia sulatetaan ja jäähdyte-o tään 50 C:seen. 0,5 ml 3 % agaroosia lisätään kaseiini/ MBS:ään ja sekoitetaan pipetin avulla. 100 ^ul ihmisen 1 mg/ml plasminogeenia lisätään <loppupitoisuus on 50 ^ug/ml) sekoittaen, ja materiaali kaadetaan 3,5 cm halkaisijaltaan olevaan muoviseen petrimaljaan. Agaroosiliuos jäähdytetään huoneen lämpötilaan (noin 30 minuuttia). Agaroosiin leikataan halkaisijaltaan 2 mm:n reikiä Bio-Rad:n leikkaavalla geeli-stanssilla. Reiät valmistetaan juuri ennen käyttöä, ja kaivot täytetään MBS:llä. Yksi tai kaksi munasolua, joihin on ruiskutettu TPA RNA:ta vähintään 6 tuntia ennen määritystä, lisätään kuhunkin kaivoon. Inkubointi tapahtuu kosteutetussa maljassa 12-24 tunnin aikana. Kaseiinihydrolyysin kirkkaat vyöhykkeet havaitaan helposti.

TPA mRNA:11a rikastuneet fraktiot saostetaan lisäämällä 2 tilavuutta etanolia ja inkuboimalla jäähauteesea 1 tunti. Saostumat kerätään talteen sentrifugoimalla huoneen lämpötilassa Eppendorfin pöytämikrofugilla, liuotetaan steriiliin tislattuun veteen, kootaan yhteen ja seostetaan uudelleen. Tätä rikastettua t-PA polyA mRNA:ta käytetään cDNA:n muodostamiseksi kloonausta varten.

(3) cDNA:n synteesi 97809 31

Kaikki nämä reaktioeeokeet muodostetaan jäähauteessa.

(A) Ensimmäisen juosteen synteesi käyttämällä OdT^2-i8~a^u_ kettä + 10 /ug rikastettua, polyA -valikoitua Bowesin mRNA:ta C ^ulissa H20:ta) inkuboidaan huoneen lämpötilassa 10 minuuttia MeHgOH:n (Alfa), 10 mM, läsnä ollessa auttamassa sekun-däärirakenteen avaamisessa. Myöhemmin lisätään seuraavia komponentteja; β-merkaptoetanolia pitoisuuteen 28 mM; RNaein:'a (Biotec Inc) 1 yksikkö/ /Ui lopullista reaktiotilavuutta; 75 mM Tris-emästä pH 8,3; 6 mM MgC^^a; 50 mM KCl:a; 10 ^ug oligodeoksit^midiiniä (OdTj^-ie ” Collaborative Research); 100 yuCi a - P-DCTP:tä (Amersham); dGTP:tä, dTTP:tä, ja dATP:tä, kutakin pitoisuuteen 500 ^uM; dCTP:tä pitoisuuteen 250 /uM (kaikki nukleotidit P.L. Biochemicals'lta, liuotettuina pitoisuuteen 20 mM, 10 mM Tris-emäksessä, pH 8 ja neutraloituina 1,0 M NaOH:lla) ja käänteistä transkriptaasia (Life Sciences Inc.) 1 yksikkö/ ^ug lisättynä RNA:ta, 50 /ul:ssa lopullisten reaktiotilavuutta. Reaktion annetaan inkuboitua 60 o minuuttia 42 Ctssa.

(B) Ensimmäisen juosteen synteesi käyttäen spesifisiä 15-mee-risiä oligonukleotideja alukkeina (katso Panabieres, F. et ai., Gene, 19, s. 321-6 (1982) koskien yleisesti analogisia menetelmiä) Täydellisen TPA:ta koodattavan cDNA-juosteen aikaansaaminen mRNA:sta, jonka synteesi on aloitettu 3'-polyA-hännästä, ei aina ole mahdollista käyttämällä edellä olevaa menetelmää. Aloittamalla synteesi sekvenssillä, joka sijaitsee polyA-hännän yläpuolella, saadaan todennäköisemmin aikaan TPA:ta koodittava 5'-cDNA-sekvenssi, joka voidaan liittää epätäydel- 97809 32 lieeen cDNA:han, jonka synteesi aloitettiin polyA-häntäsek-venssistä.

Kolme pentadekameeria ovat edullisia käytettäviksi joko koet-timina tai alukkeina cDNA:n synteesille. Niiden sekvenssit sisältävät:

Komplementaarisia 3' TPA-asemi1le; 5 ' 3 ' 1. TCA CGG TCG CAT GTT 1759-1773 2. GGG GTT TGA GTC TCG 634-648 3. CCC ATC AGG ATT CCG 886-900

Niitä syntetisoidaan ja puhdistetaan menetelmillä, joita on aikaisemmin kuvattu.

+

Kaksikymmentäviisi yug polyA -valikoitua RNA:ta inkuboidaan 1 /ugin kanssa aluketta <5-10-kertainen pikomolaarinen ylimäärä aluketta templaattiin nähden) ja 1,5 mM:n kanssa EDTAtta o 58 /Ultssa 90 C:ssa. Seoksen annetaan temperoitua huoneen lämpötilaan hitaasti upottamalla 5 ml:n vesihauteeseen, joka o alunperin oli lämmitetty 90 C:seen. Pentadekameerin liittämisen jälkeen RNA-templaattiin, seuraavat reagenssit lisätään: ditiotreitolia CDTT) pitoisuuteen 2 mM; RNasiinia 1 yksikkö/ ,ul lopullista reaktiotilavuutta; 100 mM Tris-emästä, ' 32 pH 8,3; 11 mM MgCl2:a; 50 mM KC1; 100 7uCi <* ~ P~dCTP:tä; dGTP:tä, dTTPttä, ja dATP:tä 500 /UM kutakin; 250 ^uM dCTP:tä; käänteistä transkriptaasia (Life Sciences, Inc.) 1 yksik- o kö/ /ug RNA:ta. Inkuboidaan 20 C:esa 3 tuntia, jossa kohdassa lisätään vastaava määrä vielä käänteistä transkriptaasia, ja o reaktion annetaan jatkua 50 :ssa 30 minuuttia. Reaktio lopetetaan f enoliuutolla , ja RNA-templaatt i poistetaan alkaneella hydrolyysi1lä täysin Maniatiksen mukaan.

97809 33 (C) Toisen juosteen synteesi

Toinen juoste syntetisoidaan reaktiossa, joka sisältää 40 mM

KP04:ää <K-fosfaatti) pH 7,5, 6,6 mM MgCl2:ta; 1 mM DTT:tä; dGTP:tä, dTTP:tä ja dATP:tä, 500 ^uM kutakin; 100 ^uCi H- dCTP:tä (Amersham) ja 1 yksikkö/ ^ug lisättyä RNA:ta DNA- polymeraasi-Klenow-kappaletta (BRL) lopputilavuudeesa 100 /ui.

o '

Reaktiota inkuboidaan 15 C:ssa 4 tuntia, ja sen kulkua voidaan seurata tarkkailemalla H-dCTP:n inkorporoitumista. Reaktio lopetetaan fenoliuutolla, ja kaksijuosteinen cDNA saostetaan kuten edellä on kuvattu ensimmäisen juosteen synteesille sillä

poikkeuksella, että NH^Ac:tä lisätään pitoisuuteen 2,5 M

(mieluummin kuin NaCl:a pitoisuuteen 0,3 M) ensimmäistä eta- nolisaostusta varten.

S^:tä käytetään hiusneularakenteiden poistamiseksi. Sj-reak-tiot suoritetaan Maniatiksen mukaan. Hiusneulojen onnistunut eliminointi määritetään TCA-liukoisten pulssien lisääntymisen avulla. Reaktio lopetetaan fenoliuutolla jättämällä pois saostamiset. Vesifaasit kerätään yhteen ja lisätään suoraan sakkarooeigradienteille, jotka ovat identtisiä polyA mRNA:n fraktioinnissa käytettyjen gradienttien kanssa. Fraktiot kerätään ja määritetään liuottamalla 5 /Ul:n eriä 10 ml:aan Aquafluor-tuikenestettä (New England Nuclear) ja mittaamalla sekä P että H. Asiaankuuluvien fraktioiden sisältämä cDNA seostetaan lisäämällä 2 tilavuutta etanolia ja inkuboimalla kuivan jään päällä 30 minuuttia. Saostumat pelletoidaan sent-rifugoimalla 15' huoneen lämpötilassa Eppendorf-mikrofugissa. Pelletit liuotetaan steriiliin 0,3 M NaClriin, kerätään yhteen ja saostetaan uudelleen. Saostumat pelletoidaan ja kuivataan .

(D) Päihin lisääminen ja cDNA:n liittäminen vektori-DNA:hän dCTP:n homopolymeerisiä juosteita lisätään entsymaattisesti cDNA-molekyy1 ien 3'-päihin Maniatiksen kuvailemien menetel- 34 97809 mien mukaisesti. Parhaassa tapauksessa tulisi lisätä 10-30 dCTP-tähdettä kloonaustehokkuuden maksimoimiseksi.

Vektori-DNA:ta (valmistettu liuottamalla pBR322 loppuun Pstl:llä ja lisäämällä dGTP-tähteiden homopolymeerisiä juos-teita) on kaupallisesti saatavissa New England Nuclear'lta. Vektori-DNA:ta voidaan myös valmistaa Haniatiksen kuvailemien menetelmien mukaisesti. Maniatis kuvailee myös menetelmää cDNA:n yhdistämiseksi vektori-DNA:hän. Lyhyesti, päistään lisättyä cDNA:ta sekoitetaan vektorin kanssa 1:1 molaarisessa suhteessa 50 ^ul:n reaktiossa, joka sisältää 10 mM Tris-pusku-ria pH 7,4; 0,4 M NaCl:a; 1 mM EDTA:aa.

Lopulliset DNA-pitoisuudet vaihtelivat välillä 20-60 ^ug/ml.

Liittäminen suoritetaan joko; 1) noudattamalla tiettyjä inku- o o o bointiohjeita, jotka käsittävät 65 /10'; 42 /60'; 37 /2 tuntia, ja sen jälkeen huoneenlämpötilassa 2 tuntia, tai 2) in-o kubointi 65 /10', sulkemalla pois päältä vesihaude, ja antamalla sen hitaasti temperoitua huoneen lämpötilaan yli yön.

(E> Kloonaus ja täyspitkän TPA cDNA:n sekvenssin varmistaminen. Kartat 4-5 cDNA:ta sisältäviä vektoreita siirretään E. coliin käyttämällä jo kuvailtuja transformointimenetelmiä. Bakteerit seulotaan in situ käyttämällä jo kuvailtuja hybridisaatiomenetel-miä .

Tässä kuvailluissa pesäkehybridisaatioissa käytetään pentade- kameereja, joita myös edellä on kuvailtu koettimina. Hybridi- saatiokoettimena käyttämistä varten yksi /ug 15-meeriä fosfo-

ryloidaan 50 /Ul:n reaktiotilavuudeesa, joka sisälsi 70 mM

Tris-emästä (pH 7,6), 100 mM KCl:ää; 10 mM MgCl2:a» 5 mM di- 32 tiotreitolia, ja 50 yuCi'f' P dATP : tä (P.L. Biochemicals > , ja » r Hill | i | - i 97809 35 1 U T4-polynukleotidikinaasia (New England Biolabe). Inkuboi-o daan 37 :eea 60 minuuttia. Tällä tavoin 15-meeri voidaan lei- θ mata spesifiseen aktiivisuuteen 1 x 10 cpm per /ug.

Klooneja, jotka sisältävät vastinsekvenssejä koettimia kohtaan, valikoidaan sekundääriseulontaa varten käyttämällä kloonien PstI-restriktioanalyysiä sen määrittämiseksi, vastaavatko hydrolyysituotteet Pet I-restriktiokarttaa, joka voidaan saada esille kuviossa 1 esitetystä sekvenssistä tai julkaisusta Pennica et ai., "Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli.", Nature, vol. 301, s. 214-21 <20. tammikuuta 1983). Edulliset kloonit sisältävät suuren osan TPA cDNA:n 3'-osasta. Hydrolyysissä saadaan 4 kappaletta: alkuperäinen pBR322-vektori, 1150 ep:n kappale, 80 ep:n kappale ja 78 ep:n kappale. Nämä tulokset viittaavat inserttiin, joka käsittää noin 1300 ep:a geenin 3'-päästä (nukleotidit 1250-2550). Tämän olettamuksen vahvistamiseksi klooni kaksoishydrolysoidaan Pstl:llä ja Ddel:llä. Jälkimmäisen entsyymin tulisi leikata 1150 ep:n kappale 926 ep:n kappaleeksi ja 229 ep:n kappaleeksi jättäen samanaikaisesti 78 tai 80 ep:n kappaleet koskemattomiksi. Sellaisen kaksoishydrolyysin tulokset tukevat johtopäätöstä, että klooni todellakin edustaa TPA-geenin 3'-päätä.

Lopullisena todisteena, pienessä mitassa preparoitua DNA:ta eristetään kloonista ja sekventoidaan käyttäen dideoksi-ketjunpäättämismenetelmää. Pienen mittakaavan plasmidi-DNA:ta valmistetaan kuten on kuvattu jaksossa Yleiset menetelmät. Dideoksisekventointi suoritetaan kuten on kuvattu jaksossa Yleiset menetelmät käyttäen no l:tä alukkeena 20:1 molaari-sena ylimääränä templaatin suhteen. Sekvenssitulos, joka saadaan tästä kloonista, nimeltä pTPA H, on sama kuin Pennican et ai. kuvailema sekvenssitulos, Nature, voi. 301, s. 214-21 (1983) ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattorille (kartta 4).

97809 36 Tästä eteenpäin kiintokohtana on geenin 5'-pään eristäminen. Tämän suorittamiseksi, cDNA:ta syntetisoidaan kahdesti väli- 4* koidusta polyA mRNA:sta alukkeen jatkamisella pentadekamee-ri no lrstä mieluummin kuin 0dTi2-18:8ta · Tästä lähestymistavasta saavutettu etu on kaksinkertainen. Ensiksi, koska synteesin aloittaminen on spesifistä TPA:lle, suuren cDNA-* määrän tekemisen tulisi näkyä TPA-spesifisinä sekvensseinä. Toiseksi, synteesi alkaa noin 800 ep:a 5'-suuntaan polyA-päästä, paikka, jota OdTj2-ie'c®Ly^^^L®» ensimmäisen juosteen synteesin aloituksessa. Tämä melkein varmistaa sen, että tästä lähtökohdasta peräisin oleva cDNA sisältää kopioita, jotka ulottuvat kauemmas 5'-suuntaan kuin pTPA H.

Transf ormaatioteho tällä TPA-aloitteisella cDNA:lla on 5 2,5 x 10 transformanttia per yug cDNA:ta. Kaksi pankkia, käsittäen kaikkiaan 25 000 transformanttia, muodostetaan. Käsitettä "geenien hyppiminen" käytetään tarkoituksella vaikuttamaan seulonnan suuntaan. pTPA H 5'-terminaalinen 80 ep:n Peti-kappale eristetään geelillä, ja sitä käytetään koestamaan 28 000 pesäkettä, jotka ovat peräisin alukejatkeisista pankeista. Tämä seuloo spesifisesti klooneja, jotka ulottuvat vähintään yhtä kauas 5' suuntaan kuin pTPA H, ja alukejatke-lähtökohdasta johtuen, klooneja, jotka sisältävät 5'-lisäsek-venssejä myös.

Seulonta in situ hybridisaatiolla tuottaa suuren määrän positiivisia. Pisin TPA-insertti havaitaan eekundääriseulonnassa Pstlrllä ja Ddel:llä. Tässä keksinnössä klooni, jota on merkitty pTPA80-l, sisälsi insertin, joka käsitti nukleotidit 550-1600 (kartta 4).

Restriktiotulokset tekevät mahdolliseksi määrittää melko tarkasti (+/-^10 %> 3'-pään asema. Joe synteesin aloitus alkaa nukleotidin 1759 kohdalla, ja pTPA80-l:llä on 3'-pää noin 1600-aeemaesa, silloin häviää suunnilleen 160 emäsparia jossain vaiheessa kloonauksen aikana. S^-endonukleaasi aiheuttaa todennäköisimmin häviön.

97809 37 pTPAH:n ja pTPA80-l:n orientaatiot määritetään. Plaemidit pTPAH ja pTPA80-l katkaistaan Sacl:llä ja PvuI:llä, jolloin saadaan kappaleet 7 (1251 ep:a) ja 8 (5,1 ke:ä) vastaavasti, jotka eristetään geelillä. Kappaleita käsitellään bakteerisella alkalisella fosfataasi1la, ja ne ligoidaan käyttäen T4-polymeraasia, jolloin saadaan pTPA3'cDNA:ta, joka sisältää asemat 550-2230 emästä TPA cDNA:sta. Uusi konstruktio osoitetaan oikeaksi Pstl-hydrolyysillä.

Koska pTPA80-l edustaa pisintä TPA-inserttiä positiivisten joukossa, jotka oli havaittu ensimmäisessä alukejatkeisessa pankissa, toista oligonukleotidia, joka on komplementaarinen aminohappotähteitä 233-237 koodaavalle sekvenssille (nukleotidit 886-900; 15-meeri no 2), käytetään muodostamaan toinen cDNA-kirjasto 5'-pään täydentämiseksi. Tämä erityinen alue geenistä valitaan siksi, että jos Sj sattuisi poistamaan niinkin monta kuin 200 ep:tä kopion 3'-päästä, riittävää päällekkäisyyttä esiintyisi vielä pTPA3'cDNA:n kanssa, jotta kappaleiden kokoaminen olisi mahdollista.

5'-emäksiä sisältävä cDNA liitettiin Pstl:llä leikattuun pBR322:een ja transformoitiin E. coliin kuten edellä kuvail- 4 tiin. Transformaatioteho tällä cDNA:lla on luokkaa 3,6 x 10 transformanttia/ /Ug cDNA. Tämän kirjaston pesäkkeitä seulotaan oligonukleotidin kanssa, joka on komplementaarinen koodaavalle sekvenssile käsittäen nukleotidit 645-660 (15-meeri no 3), ja selviä positiivisia seulotaan. Sekundääri-seulonta suoritetaan Peti- ja BgllI-hydrolyysillä, ja yhden kloonin, nimeltä pTPA5'cDNA, osoitettiin sisältävän loput 5'-sekvenssit 1-750. Jälleen Sjin vaikutukset insertin pituuteen ovat nähtävissä pTPA5'cDNA:11a. Koska synteesin aloitus aloitetaan nukleotidin 886 kohdalta, pTPA5'cDNA ulottuu ainoastaan noin nukleotidiin 750; keksinnön mukaisesti osoitettiin noin 136 ep:n häviö.

97809 38

Koko TPA-eekveneeillä, joka on käyttökelpoinen kahdella kloonilla (pTPA3'cDNA ja pTPA5'cDNA), säilyy lopullinen kokoamis-tehtävä. Strategiaa kuvataan kartassa 5.

Plasmidi pTPA5'cDNA katkaistaan Taql:llä, jolloin saadaan kappale 9 <2194 ep:a>. Yksi TaqI-paikka pTPA5'cDNA:n TPA-sekvenssin sisällä (asema 634) on hyvin entsyymiresistentti. Kappale 9 katkaistaan BglII:lla ja Hgal:llä, jolloin saadaan kappale 10 <405 ke:tä>, joka sisältää emäkset 188-593 TPA cDNAtsta, edustaen proteiinin kehittynyttä osaa.

TPA cDNA:n keksioea saadaan leikkaamalla ensin pTPA3'cDNA PuvI1:11a ja EcoRI:llä, eristäen kappale 11 <1748 ep:a). Kappale 11 katkaistaan sen jälkeen Hgal:llä, jolloin saadaan kappale 12 <209 ep:a>, joka sisältää emäkset 594-802.

Jotta saataisiin cDNA:n 3'-osa, pTPA3'cDNA hydrolysoidaan Pvul:llä, ja 6,3 ke:n kappale eristetään, sitä käsitellään T4-polymeraaeilla, ja se hydrolysoidaan osaksi EcoRI:llä, jolloin saadaan kappale 13 <1871 ep:a), joka sisältää emäkset 802-2230.

cDNA:n kolmen osan ligointi käsittää pKC7:n käyttämisen, jota on julkisesti saatavissa, ja täysin kuvailtuna julkaisussa Rao, R. N., ja Rogers, S. G., Plasmid pKC7: a vector containing ten restriction sites suitable for cloning DNA segments, Gene 7: 79-82 <1979). Plasmidi pKC7 hydrolysoidaan BglII:lla ja Smal:llä, ja sitä käsitellään bakteerisella alkaliaella fos fataasi1la , jolloin saadaan kappale 14 <4,8 ke:tä), eristetään geelillä.

Kappaleet 10, 12, 13 ja 14 ligoidaan yksinkertaisena ligoin- tipanoksena. Tämän strategian yksi merkille pantava näkökohta on se tapa, jolla sisäpuolisen kappaleen alkalisen fosfataa-sikäsittelyn välttämättömyydeltä vältytään.

97809 39

Monikappaleieet (24 kappaletta) liittämiset tuottavat edullisen konstruktion, jolla on hyvin alhainen tehokkuus, johtuen kappaleiden yhteenliittämisestä. Käsittely alkalisella fosfataasi1la sopivalla tavalla minimoi tämän ongelman, josta seuraa oikean monikappaleisen koostuman tehokkuuden dramaattinen lisääntyminen. Koottaessa TPA-kappaleita, käytettiin keksinnön mukaisesti hyödyksi erikoista tapaa, jolla restrik-tioendonukleaasi, Hgal, katkaisee DNA:n. Entsyymin tunnistus-sekvenssi (sitoutumia-) on GACGC, mutta entsyymi katkaisee kohdassa, joka sijaitsee tuon tunnistussekvenssin tuolla puolen, Tästä johtuen, kappaleet, jotka on katkaistu Hgal:n avulla, ligoivat ainoastaan alunperin viereisen vastinosansa kanssa. Itseligointia, jota Hgal-overhang edistää, ei voi tapahtua. 4-kappaleinen TPA-ligaatio sisältää kaksi kappaletta, jotka sisältävät Hgal-pään. Sen lisäksi se, että vektoria käsitellään alkalisella fosfataasilla (itsesulkeutumisen minimoimiseksi), johtaa siihen, että useimmat transformanteista sisältävät oikein kokoonpannun TPA-geenin. Oikea kokoonpano varmistetaan restriktiohydrolyyseillä. Plasmidia, joka sisältää täydellisen cDNA-sekvenssin TPA:ta varten, nimitetään merkinnällä pTPAcDNA (7,4 ke).

Esimerkki 1. Synteettisten oligonukleotidien valmistaminen Kahdeksankymmentäseitsemän erillistä oligonukleotidia (kuvio 3) syntetisoitiin aikaisemmin kuvailtujen menetelmien mukaisesti. Kuvaillun strategian mukaisesti synteettisen DNA:n 10Θ4 emäsparia kootaan välillä Bglll-paikka asemassa 187 ja EcoRI-paikka asemassa 1287 pTPA-Bl, 2, 3 (kartta 9). Spesifisiä restriktiopaikkoja, jotka on valittu insertiota varten domeenien välisille alueille, kuvaillaan kartoissa 10 ja 11. Jokainen ryhmä on yhdistetty sopivaan kloonausvektoriin replikointia varten E. colissa ja sekvenssin varmistamiseksi. Kaikki ligaatio- ja kloonausmenetelmät, joita on käytetty, ovat kuten Maniatis et ai., edellä, ovat kuvanneet. Kaikki kloonatut sekvenssit sekventoidaan käyttämällä Sangerin di-deoksi-sekventointitekniikkaa sekvenssin varmistamiseksi.

97809 40

Ryhmä 1. Oligonukleotidit P1-P4, P8-P11 yhdistetään lämpökäsittelyn avulla ja ligoidaan, jolloin muodostuu kaksijuostei-nen segmentti, joka ligoidaan toiseen segmenttiin, joka on koostunut oligonukleotideista P5-P7 ja P12-P14. Muodostunut ryhmä 1 sisältää sekvenssin, joka koodittaa sormidomeenia. Ryhmä 1 kloonataan Valmiste 1-kohdassa kuvaillun pSK4:n Bglll- ja SphI-paikkoihin.

Ryhmä 2. Oligonukleotidit P15-18 ja P19-P23, jotka sisältävät sekvenssin, joka koodittaa sormidomeenia, ligoidaan yhdessä yksivaiheisessa yhdistämisessä ja ligaatiossa, jolloin muodostuu ryhmä 2, ja kloonataan pBR322:n Sphl- ja ClaI-paikkaan.

Ryhmä 3. Oligonukleotidit P24-P28, P34-P38 yhdistetään ja ligoidaan, jolloin muodostuu kaksijuosteinen segmentti, joka ligoidaan toiseen segmenttiin, joka koostuu oligonukleoti-deista P29-P33 ja P39-P43. Muodostunut ryhmä 3 sisältää sek-vessin, joka koodittaa silmukka 1 -domeenia. Ryhmä 3 kloonataan pBR322:n paikkoihin Clal ja BamHI.

Ryhmä 4. Oligonukleotidit P44-P47 ja P67-P70; P48-P51 ja P71-P74; P52, P53, P92, P93 ja, P75, P76, P94, P95; P57-P61 ja P80-P84; ja P62-P66 ja P85-P89 yhdistetään kukin lämpökäsittelyn avulla 5 erillisessä putkessa kaksijuosteisiksi segmenteiksi, jotka kerätään sen jälkeen yhteen ja ligoidaan, jolloin muodostuu ryhmä 4. Ryhmä 4 sisältä DNA-sekvenssin, joka koodittaa silmukka 2 -domeenia. Ryhmä 4 kloonataan pBR322:n paikkoihin BamHI ja EcoRI.

Esimerkki 2. Ryhmien 1-4 yhdistäminen TPA cDNA:n aktiivisen paikan kansaa. Kartat 6-11.

Seuraava esimerkki antaa käyttöön yhteenvedon niistä vaiheista, joita tarvitaan yhdistämään esimerkin 1 mukaiset erilaiset synteettiset ryhmät geeniksi, joka kykenee koodittamaan biologisesti aktiivista TPA:ta. Kahta prototyyppigeeniä kuvaillaan. Plasmidi pTPA-B 1,2,3,4(a> sisältää geenin, joka . 97809 41 koodittaa TPA:ta, ja joka ei sisällä yhtään keinotekoisesti tuotettua endonukleaasipaikkaa silmukka 2 -domeenin ja aktiivisen paikan välillä. Plasmidi pTPA-B 1,2,3,4 sisältää geenin, joka koodittaa TPA:ta, joka sisältää keinotekoisesti tuotetut endonukleaasirestriktiopaikat silmukka 2:n ja aktiivisen paikan välillä.

A. pTPA-Bl:n konstruointi - Kartta 6

Plasmidi pSK4 hydrolysoidaan Claltllä ja Sphltllä, ja suuri 4,1 ke:n kappale 15 eristetään ja liitetään ryhmä 1 -kappaleeseen käyttäen Clal/Xbal-linkkeriä. Ligaatioeeoe siirretään HB101:een käyttäen kalsiumkloridi-transformaatiomenetelmää, jota Maniatis on kuvannut. Transformantit seulotaan nick-transloitujen ryhmä 1 -kappaleiden kanssa käyttämällä Mania-tiksen et ai. kuvailemaa nick-translaatiomenetelmää ("katko-translaatio"). Koettimeen hybridisoituvat transformantit sek-vensoidaan sen jälkeen käyttäen Sangerin dideoksi-sekventoin-titekniikkaa oikean sekvenssin ja orientaation varmistamiseksi. Tätä uutta transformanttia nimitetään nimellä pTPA-B1 (4,25 ke).

B. pTPA-B1.2:n konstruointi - Kartta 7

Plasmidi pTPA-Bl hydrolysoidaan EcoRI:llä ja Sphl:llä, ja kappale 16 (450 ep) eristetään. Plasmidi pBR322 hydrolysoidaan EcoRI:llä ja Clal:llä, ja suuri kappale 17 (4,35 ke) eristetään geelillä. Kappaleet 16 ja 17 ligoidaan sen jälkeen synteettiseen SphI/Clal ryhmään 2. Ligaatioeeoe transformoidaan HB101:een, ja transformantit seulotaan nick-transloidun ryhmä 2:n kanssa. Koettimen kanssa hybridoivat transformantit sekventoidaan sen vahvistamiseksi, että ne sisältävät ryhmän 2 oikeassa orientaatiossaan. Tätä konstruktiota merkitään pTPA-Bl,2 (4,8 ke).

C. pTPA-B 1.2(a):n konstruointi - Kartta 8

Plasmidi pTPA-B l,2(a) sisältää Hindlll- ja Bglll-paikat sormi- ja kasvutekijädomeenien yläpuolella. Plasmidi pTPA- 97809 42 B 1,2 hydrolysoidaan Xbal:llä ja EcoRI:llä, ja suuri 4,5 ke:n kappale 1Θ eristetään geelillä ja ligoidaan oligonukleotidi-linkkeriin, joka sisältää Hindlll- ja Bgl11-paikan. Ligaatio-eeos transformoidaan HBlOlreen, ja transformantit seulotaan Hindi 11/BglII-paikkojen läsnäolon suhteen. Uutta konstruktiota nimitetään nimellä pTPA-B l,2(a> <4,5 ke).

D. pTPA-B 1.2.3:n konstruointi - Kartta 9

Plasmidi pTPA-B l,2<a) hydrolysoidaan Clal:llä ja BamHI:llä, ja suuri 4,0 ke:n kappale 19 eristetään. Tämä kappale ligoidaan synteettiseen Clal/BamHI silmukka 1 -alueeseen, joka sisältää ryhmän 3 <270 ep> ja transformoidaan HB101:een. Trans-formantit seulottiin nick-transloidun ryhmän 3 kanssa. Trans-formantit, jotka hybridisoivat ryhmän 3 kanssa, sekventoitiin sekvenssin ja orientaation varmistamiseksi. Tätä uutta konstruktiota merkitään pTPA-B 1,2,3 <4,3 ke).

E. p.TPA-B 1 2.3 4a :n konstruointi - Kartta 10 Tämä plasmidi sisältää kokonaisen TPA-prototyyppigeenin, joka koodittaa TPA-analogia, joka sisältää entsymaattista aktiivisuutta. Tämä geeni ei sisällä mitään muutoksia välidomeeni-alueella silmukka 2:n ja aktiivisen paikan välillä. pTPA-B 1,2,3,4(a) <4,2 ke:n) konstruointi vaatii useita vaiheita. Plasmidi pTPAcDNA (kartta 5) leikataan Scal:llä, ja kappale 20 (6,0 ep), joka koodittaa TPA-geenin 3'-päätä, eristetään geelillä. Plasmidi pTPA-B 1,2,3 (kartta 9) leikataan Scal:llä ja BamHI:llä, jolloin saadaan kappale 21 <1100 ep), joka sisältää sormi-, kasvutekijä- ja silmukka 1 -domeenit. Kolmas kappale 4a <230 ep) saadaan katkaisemalla ryhmä 4 BamHI:llä ja Sea I : 1lä . Nuo kolme kappaletta ligoidaan käyttäen T4-li-gaasia, jolloin saadaan pTPA-B 1,2,3,4*. TPA-geeni leikataan pois pBR322:sta käyttäen Hindlllra ja Aatlrtä, jolloin saadaan 2,2 ke:n kappale, joka subkloonataan pUC-19:ään. Plasmidi pUC-19 on kaupallisesti saatavissa useista eri lähteistä, ja se sisältää DNA-sekvensseissään joukon restriktiopaikkoja, mikä tekee TPA-domeenimanipuloinnin vähemmän hankalaksi.

97809 43 F. pTPA-B 1.2.3·4:η konstruointi - Kartta 11 Tämä plaemidi sisältää kokonaisen TPA-prototyyppigeenin, joka koodittaa entsymaattisesti aktiivista TPA-analogia. Tässä analogissa kaikki 4 domeenia ja aktiivinen paikka ovat läsnä, erikoisten restriktiopaikkojen ollessa järjestettynä kaikkiin domeenien välialueisiin mukaan lukien alue silmukka 2:n ja aktiivisen paikan välissä. Plaemidi konstruoidaan leikkaamalla ensin pTPA-B 1,2,3,4a EcoRI:llä ja BamHI:llä ja eristämällä suuri 3,7 ke:n kappale, joka sisältää sormi-, kasvutekijä-ja silmukka 1 -domeenit. Synteettisesti luotu ryhmä 4 saadaan kloonistaan hydrolyysillä BamHI:llä ja osittaisella hydro-lyysillä EcoRI:llä, jolloin saadaan koskematon ryhmä 4, joka sisältää 560 ke. Nuo kaksi kappaletta ligoidaan käyttäen T4-ligaasia, jolloin saadaan pTPA-B 1,2,3,4.

Plasmidia pTPA-B 1,2,3,4a ja pTPA-B 1,2,3,4 voidaan käyttää konstruoimaan TPA:n useita erilaisia synteettisiä analogeja.

Esimerkki 3. TPA-analogien konstruointi A. pFK!K2A:n konstruointi (kasvutekiiädomeenin deleetio) Plaemidi pTPA-B 1,2,3,4a hydrolysoidaan EcoRV:llä ja osittain HpaI:1lä paikan hydrolysoimiseksi kohdassa 334 mutta ei kohdassa 724. Suuri kappale <4,1 ke) eristetään ja religoidaan, jolloin muodostuu pFKlK2A. Plaemidi pFKlK2A transformoidaan sen jälkeen HB101:een tai johonkin muuhun sopivaan isäntään. Plaemidi seulotaan sen jälkeen oikean orientaation ja sekvenssin suhteen.

B. pFK2A: n konstruointi (kasvuteki -iä- ia silmukka 1 -domeenien deleetio)

Plaemidi pTPA-B 1,2,3,4 hydrolyeoidaan Hpal:llä. Suuri 6,5 ke:n kappale eristetään ja ligoidaan uudelleen, jolloin muodostuu pFK2A. Plaemidi transformoidaan HB101:een tai johonkin muuhun sopivaan isäntään ja seulotaan oikean orientaation ja sekvenssin suhteen.

^ 97809 44 C. PFK2K2A:n konstruointi - Kartta 12 (kasvutekijän ia silmukka l:n deleetio._ia silmukka 2:n kahdentuminen)

Plaemidi pTPA-B 1,2,3,4 (kartta 11) hydrolysoidaan Hpal:llä, jolloin saadaan kappale 22 (3,9 ke), joka eristetään. Toinen pTPA-B 1,2,3,4 -näyte hydrolysoidaan Hpal:llä ja Mstl:llä, ja muodostunut 560 ep:n kappale 23, joka sisältää silmukka 2 -do-meenin, eristetään. Hpal:llä hydrolysoitu FK2A-kappale tasa-pääligoidaan HpaI/MetI-kappaleeseen, jolloin saadaan pFK2K2A (4,1 ke). Plaemidi pFK2K2A transformoidaan sen jälkeen HB101:een ja seulotaan oikean orientaation ja oikean sekvenssin suhteen.

D. Ilmentyminen E. colissa Plaemidi pTPAExp! - Kartta 13 TPA-analogien ilmentäminen voidaan suorittaa E. colissa käyttämällä ekspressioplasmidia pTPA-B 1,2, joka on kuvattuna kartassa 7, pTPA-B 1, joka on kuvattuna kartassa 6, tai niiden ekvivalentteja. Kaikki analogit voidaan sijoittaa Xbal- ja BamHI-paikkojen sisään ilmentämistä varten. pFK2K2A:n ilmentämiseksi E. colissa, pTPA-B 1,2 (kartta 7) ja pFK2K2A (kartta 12) leikataan kumpikin Xbal:llä ja BamHI:llä, ja kappaleet 24 (4,2 ke) ja 25 (2,0 ke) eristetään geelillä. Kappaleet 24 ja 25 ligoidaan, jolloin muodostuu ekspressioplasmidi pTPAExpl (6,2 ke).

Plaemidi pTPAExpl sisältää Trp-promoottorin ja -operaattorin, ja ilmentyminen on konstitutiivista. E. colin viljely suoritetaan Maniatiksen (edellä) mukaisesti. E. coli-viljelmät eivät tuota aktiivista TPA:ta. E. colin tuottama TPA on suoristettava natiiviin tilaan. Noudattamalla tunnettuja kysteiinin uudelleenjärjestelymenetelmiä, voidaan saada aktiivista TPA:ta. US-Patentti 4 511 502.

97809 45

Esimerkki 4. Ilmentyminen eukayvooteisea A. Ihmisen TPA:n ilmentyminen hiivassa Tällä esimerkillä valaistaan hiivan ekspressiovektorin pal-FK2K2A konstruktiota, joka sisältää MFal-promoottorin ja pre-proeekvenssejä. Viljelyolosuhteet ja edulliset isäntäkannat annetaan myös käyttöön TPA-analogien ilmentämiseksi hiivassa.

<1> pal-ADHt:n konstruointi, hiivan ekspressiovektori.

Plasmidi pod-ADHt on monikäyttöinen ekspressiovektori hiivaa varten. Restriktiopaikkoja on järjestetty sopivissa kohdissa sen rakenteeseen, ja säätely MFol-promoottorin alaisena on yleensä yhteensopiva suurten ekspressiotasojen kanssa. Seu-raavat vaiheet kuvaavat poä-ADHt:n konstruointia. (Kartat 14-18) .

a. pYRep3'B:n konstruointi - Kartta 14

Plasmidi pYRep3'B konstruoidaan sijoittamalla 2 /U-plaemidin REP III- ja replikoinnin aloituskohtasekvenssit pYIP31:n URA3-geenin SmaI-paikkaan sopivan kasetin muodostamieeksi. Molemmat plasmidit, 2 ^u ja pYIP31, ovat julkisesti saatavissa ja täysin kuvailtuja kirjallisuudessa. 2 /U-plasmidia kuvaili täydellisesti J.R. Broach teoksessa Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae £Life cycle and inheritance// s. 445-470, ja REP III -aluetta kuvaillaan julkaisussa Cell 34:95-104 (1983) ja Cell, 35:487-493 (1983). Plasmi-dia pYIP31 kuvailtiin julkaisussa Gene, 18:17-24 (1979).

Plasmidi pYIP31 leikataan ensin Smal:llä, ja sitä käsitellään bakteerisella alkalisella fosfataasilla, jolloin saadaan kappale 26 <5,4 ke), joka eristetään. Hiivan 2 ^u-plasmidi leikataan Pstl:llä ja Xbal:llä, täytetään Klenowin avulla, ja kappale 27 <1,3 ke) eristetään. Kappaleet 26 ja 27 ligoidaan käyttäen T4 DNA -ligaasia, jolloin saadaan pYRep3'B <6,7 ke).

46 97809 k. pADHt :n konstruointi - Kartat 15-16

Plaemidi pADHt (3,86 ke) on käyttökelpoinen, koska se tuo käyttöön käyttökelpoisia restriktiopaikkoja hiivan ekepres-siovektorin muodostamiseksi.

Lähtöplasmidi pADHt:n konstruoimiseksi on pGG400 <4,0 ke). Plaemidi pGG400 konstruoidaan plasmideista pBR322 ja pML21, jotka ovat helposti saatavissa julkisesti J. Bacter., 126:447-453 (1976). Erityisemmin, pBR322:n geeni, joka koodittaa tet-rasykliinireeistenssiä, korvataan osalla pML21:stä, joka koodittaa kanamysiiniresistenssiä. Plaemidi pBR322 leikataan ensin EcoRItllä ja PvuI1:11a, ja EcoRI-overhang täytetään Klenow-entsyymillä ja eristetään agaroosigeeliltä, jolloin saadaan kappale 28 <2,3 ke). Plasmidi pML2l leikataan PuvIIrlla, jolloin saadaan kappale 29 <1,7 ke), joka sisältää geenin kanamysiiniresistenssi1le . Puv11-katkaisupaikan li-gointi täytetyn EcoRI-paikan kanssa regeneroi EcoRI-paikan ligoinnin jälkeen. Kappaleiden 28 ja 29 ligointi tuottaa pGG400:n, jota käytetään konstruoimaan pADHt (kartta 15).

Plaemidi pADHt konstruoidaan leikkaamalla pGG400 PvuII:11a ja Xholrllä ja käsittelemällä Klenow-entsyymi1lä, jolloin saadaan kappale 30 <3,5 ke), joka eristetään. Hiivan alkoholide-hydrogenaasi I (ADHI):n 3pää saadaan pADHBC:stä leikkaamalla ensin Hindi :11a ja BamHI:llä, käsittelemällä T4-polyme-raasilla ja eristämällä kappale 31 <0,36 ke). Plaemidi pADHBC on julkisesti saatavissa ja täysin kuvailtu julkaisussa J.

Biol. Chem. 257:3018-3025 (1982). Kappaleet 30 ja 31 ligoi-daan, jolloin saadaan pADHt muun muassa, ja transformoidaan E. coliin. Ne transformantit, jotka sisältävät pADHt:n sisältävät plasmideissaan regeneroituja BamHI- ja XhoI-paikkoja. Nämä transformantit valikoidaan, ja kloonatun ADHI:n 3'-pään aitous varmistetaan reetriktioentsyymianalyysillä ja sekven-toinnilla (kartta 16).

,* du i viili lii ia ) 97809 47 c. pADHt-REPI11:n konstruointi - Kartta 17

Plaemidi pADHt-REPI11 <6,2 ke) on konstruktio pADHt:stä ja pYRep3IB :etä, jossa URA3-REPIII-ori- kasetti on sijoitettu pAHDt:hen ilmenemisen ja replikoinnin helpottamiseksi hiivassa. Plaemidi paADHt-REPI11 on käyttökelpoinen konstruoitaessa ekspressiovektoreita hiivalla, koska EcoRI-HindII I- tai EcoRI-SmaI-kappaleet voidaan korvata halutulla DNA-kappaleella, joka sisältää sopivia hiivan promoottoreja, tai sitä voidaan käyttää antamaan käyttöön Sall-XhoI- kappale, joka sisältää replikoinnin aloituskohdan, selektoituvan markkerin ja hiivan URA3-geenin 3'-pään.

Plaemidi pADHt modifioidaan leikkaamalla BamHI:llä, täyttämällä päät Klenow-enteyymillä ja sijoittamalla 8-meerinen SaiI-linkkeri täytettyyn BamHI-paikkaan. Plaemidi pADHt (modifioitu) katkaistaan Sphl:llä, ja päät täytetään T4-polymeraa-silla, jolloin saadaan kappale 32 <3,8 ke). Plaemidi pYRep31B katkaistaan HindIII:lla, ja kappale 33 <2,4 ke) eristetään, joka sisältää URA3:n 3'-pään ja 2 ^u REP 111-alueen, jonka kuvitellaan lisäävän stabiilieuutta, ja replikoinnin aloituskohdan. Kappaleet 32 ja 33 ligoidaan ja E. coli-transforman-tit, jotka sisältävät plasmideja, joilla URA3-geenin orientaation, mikä sallii myötäpäiväisen transkription, seulotaan pADHt-REPI11:n saamiseksi.

d. pQB.-ADHt:n konstruointi - Kartta 18 pal-ADHt:n <6,5 ke) konstruointi tulee valmiiksi kormaamalla pADHt-REP111:n EcoRI-HindIII-kappale palin EcoRI-HindI11-kappaleella, joka sisältää MFal-geenin promoottorin ja pre-prosekvenssin. Plasmidia pal kuvailee täydellisesti A. Singh, et ai., Nucleic Acid Research, 11:4049-63 <1983) ja J, Kurjan, et ai., Cell, 30:933-943 <1983). Plaemidi pADHt-REPIII leikataan ensin EcoRI:llä ja Hindi II:11a, jolloin saadaan kappale 34 <5,3 ke), joka eristetään. Plaemidi pal leikataan myös EcoRI:llä ja HindIII:lla, jolloin saadaan kappale 35 <1,2 ke), joka eristetään. Kappaleet 34 ja 35 ligoidaan sen jälkeen käyttäen T4 DNA -ligaasia, jolloin saadaan pal-ADHt.

46 97809 (2) p0tl-FK2K2A:n konstruointi, TPA-analogin cDNA:n liittäminen hiivan ekspressiovektoriin - Kartta 19.

Edullisella ekspressiovektorilla TPA-analogien tuottamiseksi hiivassa on merkintä pal-FK2K2A, joka sisältää MFa-promootto-rin. Plasmidi pFK2K2A (kartta 12) leikataan BglII:lla, jolloin saadaan kappale 36 (2,0 ke), joka eristetään geelillä. Plasmidi pal-ADHt leikataan HindIII:lla ja XhoI:llä, jolloin saadaan kappale 37 (5,6 ke) ja antaa käyttöön transkription, polyadenylaation ja translationaalisia paikkoja. Tässä kuvailtu systeemi päättyy kehittyneen TPA-proteiinin alapuolella, ja muodostunut tuote sisältää muutaman lisäaminohapon ollen hiivaperäistä. Translaation päättämiseksi TPA-geenin päässä tarkasti voidaan ottaa käyttöön terminaatiokodoni.

Sen varmistamiseksi, että analogi on oikeassa vaiheessa MFa~pre-pro-sekvenssien lukukehyksen kanssa, analogien 5'- ja 3'-päitä ei muuteta. Bgl11-paikkaa 5'-päässä voidaan manipuloida joko liittämällä toinen linkkeri, tai Klenowin (Pol I) ja Mung pavun yhdistelmällä Hindi II-paikan luomiseksi, samalla kun pitää lukukehyksen vaiheessa MFal 'pre-pro'-sekvenssien kanssa. Tätä esimerkkiä varten, kappaleen 37 Bglll-paikka täytetään osittain käyttäen Klenowia adenosiinin ja guanosiinin kanssa. Osittain täytetty paikka tehdään sen jälkeen tasapäiseksi Mung-pavun nukleaasilla ja ligoidaan pal-ADHt :n Hind 11 I-paikkaan. Kappaleet 36 ja 37 (osittain täytetyllä päällä) ligoidaan, jolloin saadaan pFK2K2A (7,6 ke). Myös muita analogisia TPA-geenejä voidaan liittää tasapäisinä ekspressiovektoriin niin kauan kuin lukukehys pidetään vaiheessa hiivasekvenssien kanssa.

(3) TPA-analogin, plasmidieta pal-FK2K2A, ilmentyminen hiivassa .

Hiivakanta YNN227 (a, ura 3-52 trpl-289) trans f ormoidaan Pal~FK2K2A:11a. Transformantteja kasvatetaan glukoosiminimaa- 97809 49 lialuetaeea (2 X glukoosi, 0,7 X hiivan typpialusta, 1 X kas-aminohapot, 40 yg/ml adeniini, 50 yg/ml tryptofaani) 10 tuntia. Solut pslletoidaan sen jälkeen pois sentrifugoimalla. Solut hajotetaan vortexsekoittaen lasihelmien kanssa. TPA-määriä voidaan ilmaista käyttäen Western Blotting-menetelmää tai radioimmunomääritystä tai kaseiinin entsymaattista määritystä agarissa, jota aikaisemmin kuvattiin xenopus oocytek-selle.

TPA voidaan eristää hiivasoluista hajottamalla hiivasolut ensin 0,5 mm:n lasihelmien kanssa ja puhdistamalla sen jälkeen af finiteettikolonnissa. Tavanomaisia proteiinien puhdistus-kaavioita voidaan käyttää lisäpuhdistuksen aikaansaamiseksi.

B. TPA-analoaien ilmentyminen kiinanhamsterin munasarjan soluissa - Kartat 20-22

Seuraava esimerkki valaisee edullista menetelmää pFK2K2A:n ilmentämiseksi kiinanhamsterin munasarjan soluissa (CHO). Yhteenvetona tuodaan tässä esille sukkulavektori pSVCOW7, joka replikoi sekä CHO- että E. coli -soluissa käyttäen ampieillii-niresistensein ja dihydrofolaattireduktaasin geenejä E. coli-ja CHO-soluissa, vastaavasti. Plasmidi pSVCOW7 antaa myös käyttöön polyadenylaatiosekvenssin naudan kasvuhormonista, joka on välttämätön ilmentymiselle CHO-soluissa. Plasmidi pSVCOW7 katkaistaan ensin, ja viruksen promoottori ja TPA-analogi liitetään. Jäljempänä kuvaillaan myös transformaatio-viljelyolosuhteita ja uuttamismenetelmiä CHO-soluissa ilmentyvälle TPArlle.

<1> pSVCOW7:n konstruointi - Kartta 20.

Lähtöplasmidi pSV2dhfr (saatavissa the American Type Culture Collection'lta tai valmistettuna S. Subramanin et ai. menetelmän mukaan, “Expression of the Mouse Dihydrofolate Reductase 50 97809

Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40", Molecular and Cellular Biology 2:854-864 (eyyeJcyy 1981) hydrolysoidaan BamHI:llä ja EcoRI:llä, jolloin saadaan kappale 38 <5,0 ke), joka sisältää ampisilliiniresistenssigeenin, SV40-aloituskohdan ja dhfr-geenin. Toinen osa pSVC0W7:stä saadaan plaemidista p\GH2R2, joka hydrolysoidaan samoilla restrik-tioendonukleaasei1la, joita käytettiin halkaisemaan pSV2dhfr, jolloin saadaan kappale 39, joka sisältää 3'-pään genomisesta naudan kasvuhormonigeenistä, so., BGH gDNA. Plasmidi pXGH2R2 on julkisesti saatavissa E. coli HB101 -isännästä, talletettuna the Northern Regional Research Laboratories'iin Peoriassa, Illinois (NRRL B-15154). Kappaleet 38 ja 39 ligoidaan, jolloin saadaan pSVC0W7 <7,1 ke).

<2) pTPA-cDNA, BamHI:n konstruointi - Kartta 21.

TPA-analogin liittämiseksi sopivasti pSVCOW7:ään, on välttämätöntä liittää sopiva BamHI-paikka TPA:n esisekvenssiin, joka sijaitsee kehittyneen proteiinin sekvenssin yläpuolella. Tämän suorittamiseksi tämä pTPA5'cDNA <kartta 5) leikataan Hgal:llä, ja kappale 40 <517 ep), joka sisältää emäkset 78 -593, tehdään tasapäieeksi Klenow-entsyymi1lä. Tasalla olevat päät ligoidaan 10-meeriseen BamHI-linkkeriin, ja kappale 40 katkaistaan Narlrllä, jolloin saadaan kappale 41, joka sisältää emäkset 68 - 521 TPAcDNA:sta.

Plasmidi pTPA-cDNA <kartta 5) katkaistaan Narltllä ja BglII:lla, ja kappale 42 <1644 ep), joka sisältää TPA cDNAtn 3 -osan, eristetään geelillä. Kappaleet 41 ja 42 ligoidaan kappaleeseen 43 <4,3 ke), joka on muodostunut pKC7:n hydro-lyysietä BamHI:llä ja BglII:lla, jolloin saadaan pTPA-cDNA, BamHI <6,5 ke).

;« S«.» MB lii. « . . .

97809 51 (3) pTPA-IE-PA:n konstruointi - Kartta 22.

Plaemidi pTPA-IE-PA, joka sisältää modifioitua TPA cDNA:ta, joka sisältää TPA-domeenien natiivin järjestyksen, pystyy ilmentymään CHO-soluieea, tai eitä voidaan käyttää helpottamaan TPA-analogeja sisältävän vaihtoehtoisen ekspressioplasmidin konstruointia. pTPA-IE-PA:n kokoaminen suoritetaan kahdessa vaiheessa. Ensin TPA cDNA pTPA-cDNA:sta liitetään pSVCOW7:ään, ja sen jälkeen sytomegaloviruksen välittömästi toimiva promoottori liitetään TPA-analogin kopioinnin aloittamiseksi.

Vaihe 1. Plaemidi pSVCOW7 katkaistaan EcoRI:llä ja PuvII:lla, ja kappale 44 (600 ep) , joka sisältää naudan kasvuhormonin polyadenylaatiosekvensein, joka ulottuu Pvu11-paikasta BGH-geenin eksonin enimmän osan 3'-suunnassa, EcoRI-paikkaan 3'-pään alapuolella. BGH-polyadenylaatiosekvenssin tyhjentävää käsittelyä koskien, katso seuraavat referenssit: (1) EP- patenttijulkaisu 0112012, julkaistu kesäkuun 27. 1984, jossa tuodaan esille BGH:n genomisen DNA:n identifiointi ja karakterisointi; (2) Woychik, R.P. et ai., "Requirement for the 3' Flanking Region of the Bovine Growth Hormone Gene for Accurate Polyadenylation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3944-3948 (heinäkuu 1984); ja D.R. Higgs, et al., Nature 306:398-400 (marraskuun 24. 1983), ja niissä siteeratut referenssit.

pSVCOW7:n toinen näyte katkaistaan EcoRI:llä ja BamHI:llä, jolloin saadaan kappale 45. Kappale 45 voidaan vaihtoehtoisesti saada kantaplasmidin pSVdhfr EcoRI/BamHI-kappaleesta, joka on saatavissa Bethesda Research Laboratories'lta. Kappale 45 sisältää replikoinnin aloituskohdan pBR322:sta ja E. colissa ilmentyvän ampieilliiniresistenssigeenin, joka mahdollistaa plasmidin seulonnan E. colissa. Kappale sisältää myös hiiren dihydrofolaattireduktaasin cDNA:n konstruktiossa, joka mahdollistaa ilmenemisen nisäkäesoluisea. Subramani, et ai., Mol. Cell. Biol. 1:854-864 (1981).

TPA cDNA:ta saadaan kappaleesta 46 (1,9 ke), joka saadaan katkaisemalla pTPA-cDNA, BamHI BamHI:llä ja Ball:llä. Kappale 52 97809 46 sisältää täyden koodattavan alueen TPA cDNA:sta. BamHI-leikkaus on cDNA:sea, joka koodittaa mRNA:n 5' lukemattomia sekvenssejä ja BalI-leikkaus on cDNA: ssa, joka koodittaa cDNA:n 3' lukematonta aluetta.

Kappaleet 44, 45 ja 46 ligoidaan, jolloin muodostuu pTPA-PA <B,4 ke), joka on replikointivektori, joka pystyy kulkemaan edestakaisin E. coli- ja CHO-solujen välillä. Plasmidi pTPA-PA transformoidaan E. coliin.

Vaihe 2. Vaiheessa 2 pTPA-PA muutetaan ekspressioplasmidiksi pTPA-IE-PA liittämällä välittömästi toimivan geenin promoottori ihmisen sytomegaloviruksesta (CMV I.E.-promoottori).

Restriktioendonukleaasin katkaisukartat siitä alueesta ihmisen sytomegaloviruksen genomia, joka sisältää pääasiallisen välittömästi toimivan geenin <CMV I.E.) on julkaistu yksityiskohtaisesti <Stinski, et ai., J. Virol. 46:1-14, 1983; Stenberg, et ai., J. Virol. 49:190-199, 1984; ja Thomsen, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:659-663, 1984).

Näissä referensseissä kuvataan 2,0 kiloemästä sisältävää Peti-kappaletta, joka sisältää sekvenssiensä joukossa promoottorin pääasialliselle välittömästi toimivalla geenille. CMV I.E.-promoottori voidaan edelleen eristää tämän 2,0 ke Peti-kappaleen eristämishydrolyysillä Sau3AI:llä, jossa yhteydessä haluttu 760 emäsparin kappale saadaan tuotteiden joukosta.

Tämä 760 emäsparia sisältävä kappale voidaan erottaa muista tuotteista kokonsa puolesta ja SacI-katkaisukohdan ja Ball-katkaisukohdan läsnäolon puolesta kappaleessa. Sopivasta identifioinnistaan johtuen, tämän Sau3AI-kappaleen käyttäminen on edullinen menetelmä käyttää CMV I.E. -promoottoria, kuten on kuvattu esillä olevassa julkaisussa.

Vaiheessa 1 konstruoitu plasmidi pTPA-PA leikataan BamHI:llä, ja Sau3AI-kappale, joka sisältää CMV:n välittömästi toimivan promoottorin, ligoidaan BamHI-paikkaan. Plasmidit, jotka ei- ii - **·t sis I'lts · 97809 53 eältävät CMV-promoottorikappaleen sellaisessa orientaatiossa, että transkriptio promoottorista syntetisoisi mRNA:ta TPA:ta varten, identifioidaan katkaisemalla plasmidit Sacl:llä. Muodostunutta plasmidia merkitään pTPA-IE-PA, joka sisältää CMV I.E -promoottorin TPA cDNA:n 5'-päässä, ja BGH-polyadenylaa-tioeignaalin 3'-päässään.

(4) pTPA-IE-FK2K2A:n konstruointi - 23.

pTPA-IE-FK2K2A:n konstruointi on kaksivaiheinen prosessi.

Vaihe 1 käsittää pTPA-FK2K2A:n muodostamisen, joka sisältää halutun TPA-analogin, polyadenylaatiosignaalisekvenssin BGH:sta ja pSVCOW7:n selektoituvia markkereita ja replikoneja, ja vaihe 2 käsittää aikaisemmin käsitellyn CMV I.E. -promoottorin liittämisen. Vaikka jäljempänä oleva esimerkki kuvailee TPA-analogin FK2K2A liittämistä, muita analogeja voidaan liittää käyttäen samoja entsyymejä ja menetelmiä.

Vaihe 1. Plasmidi pTPA-IE-PA (kartta 22) katkaistaan BamHItllä ja Bgll1:11a, jolloin saadaan kappale 47, joka sisältää TPA:n esisekvenseiemäkset 1-188. BGH:n polyadenylaa-tion signaalisekvenssi saadaan katkaisemalla pSVCOW? (kartta 20) EcoRI:llä ja PvuII:lla, jolloin saadaan kappale 48 (600 ep). TPA-analogin sekvenssi saadaan katkaisemalla pFK2K2A (kartta 12) Bglllilla ja Ball:llä, jolloin saadaan kappale 49 (2,0 ke). pSVCOW7:n toinen näyte katkaistaan EcoRI:llä ja BamHI:llä, jolloin saadaan kappale 50 (5,8 ke), joka sisältää pSVC0W7:n markkerit ja replikonit. Nuo neljä kappaletta eristetään geelillä ja ligoidaan käyttäen T4-ligaasia, jolloin saadaan pTPA-FK2K2A (8,3 ke).

Vaihe 2. Plasmidi pTPA-FK2K2A katkaistaan BamHI:llä, ja Sau3A:lla liuotettu CMV-IE-promoottorisekvenssi liitetään, jolloin muodostuu pTPA-IE-FK2K2A, jota säilytetään E. colissa CHO-soluihin tranefektoimiseen saakka.

. 97809 54 <5> CHO-solujen tranefektointi ja viljely.

Plaemidi pTPA-IE-FK2K2A tranefektoidaan kiinanhamsterin muna-earjaneoluihin <CHO), joista puuttuu dihydrofolaattireduktaa-ei (dhfr), käyttäen kaleiumfoafaattimenetelmää DNA:n trana-fektoimiaekai soluihin, jota Graham, et ai. kuvailevat yksityiskohtaisesti (teoksessa Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Celle, Alan R. Lies Inc., N.Y., 1980, e.

3-25>. Solulinja, jota käytetään on mutantti DXB-11, joka on alunperin saatavissa L. Chasin'ilta, Kolumbian yliopisto, ja jota on täyain kuvailtu julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 77:4216-4220, (1980). Edellä olevissa transfektiomenetel-missä luotetaan siihen tosiseikkaan, että solut, jotka ottavat transfektoitavia plasmideja, eivät enää ole dhfr-negatii-visia ja kasvavat Dulbeccon modifioidussa Eaglen alustassa lisättynä proliinilla.

Soluista, jotka on tranefektoitu pTPA-IE-FK2K2A:11a, eristetään klooneja, jotka, kasvettuaan yksisolukerroksena kaksi päivää, syntetisoivat vähintään 10 ng TPA:ta miljoonaa solua kohti. Soluista, jotka sisältävät plETPA-IPA-dhfr:n, eristetään klooneja, jotka syntetisoivat vähintään 100 ng TPA:ta miljoonaa solua kohti. TPA-analogin ilmentyminen voidaan ilmaista radioimmunomäärityksellä tai Western blottaus-teknii-kalla.

TPA-analogeja puhdistetaan Rijkenin ja Collenin menetelmän mukaisesti. Journal of Biological Chemistry 256:7035-7041 (1979). CHO-soluja, jotka sisältävät yhdistelmä-TPA-analogeja, kasvatetaan seerumivapaassa alustassa. Viljelyalusta otetaan talteen 72 tunnin kuluttua ja viedään sinkki-kelaatti-agaroo-sikolonniin, joka on tasapainoitettu 0,02 M Tris-HCl:llä pH 7,5, joka sisältää 1,0 M NaCl:a ja 0,01 % Tween 80:a. Ko-lonni pestään samalla puskurilla, ja TPA-analogit eluoidaan imidatsolin lineaarisella gradientilla 0 - 0,05 M samassa puskurissa. TPA:ta sisältävät fraktiot kerätään yhteen ja viedään konkanavaliini-A-agaroosikolonniin, joka on tasapai- 97809 55 notettu 0,01 M foefaattipuekurilla pH 7,5, joka sisältää 1,0 M NaCl:a ja 0,01 % Tween 80:a. Kolonnin pesemisen jälkeen samalla puskurilla, TPA-analogit eluoidaan taeapainotuspusku-rin lineaarisella gradientilla 0,01 M fosfaattipuskuriin pH 7,5, joka sisältää 0,01 X Tween 80:a, 0,4 M D-metyylimannosi-dia ja 2 M kaliumtiosyanaattia. Fraktiot, jotka sisältävät TPA-aktiivisuutta, kerätään yhteen, ja kiinteää KSCN:a lisätään KSCN-pitoieuuden lisäämiseksi tasolle 1,6 M. Fraktiot väkevöidään suunnilleen 10-kertaisesti ja viedään Sephadex G-150 -kolonniin, joka on tasapainotettu 0,01 M fosfaattipuskurilla pH 7,5, joka sisältää 1,6 M KSCNta ja 0,01 % Tween 80:a. Fraktiot, jotka sisältävät TPA-aktiivisuutta kerätään yhteen, dialysoidaan 0,15 M NaCl:a ja 0,01 X Tween 80:a vastaan ja o säilytetään -80 C:sea.

C. Ilmentyminen Spodoptara fruaioerdassa

Seuraava esimerkki koskee TPA:n ilmentymistä hyönteiesoluvil-jelmissä. Kaikki menetelmät on selostettu yksityiskohtaisesti teoksessa Summers, M.D. ja Smith, G.E., A Manual for Baculo-virus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, julkaisijana College of Agriculture, Texas Agricultural Extension Service, College Station, Texas, 1986. Lähtöplasmidi pAc373 <7,1 ke) on yleinen baculoviruksen ekspressiovektori, joka sisältää erikoisen BamHI-paikan sijaiten välittömästi alapuo-lisesti polyhedron-promoottorista Autographs californica-yti-melliselle polyhedroosivirukselle (AcNPV). Polyhedronipro-teiini on matriksiproteiini, joka ei ole välttämätön virusinfektion ja replikaation kannalta in vitro. Plasmidia on saatavissa professori Max Summereilta, the Department of Entomology, Texas A&M University, College Station, Texas 77843, ja sitä on täysin kuvailtu julkaisussa Molecular and Cell. Biology, 3(12):2156-2165 <1983).

<1) pAcTPA:n konstruointi - Kartta 24.

Lähtöplasmidi pAc373 modifioidaan hyväksymään TPA-analogeja liittämällä erikoiseen BamHI-paikkaan BglI I-paikka, joka myös 97809 56 on erikoinen. Plaemidi pAc373 katkaistaan ensin BamHI:llä, ja sitä käsitellään sitten Mung-pavun nukleaasilla päiden tekemiseksi tasaisiksi. BglII-linkkerit ligoidaan sen jälkeen päihin, ja päät yhdistetään uudelleen, jolloin saadaan pAc373, Bglll. Plaemidi pTPAcDNA, BamHI-kartasta 21 hydrolysoidaan loppuun BamHI:llä ja hydrolysoidaan osaksi BglII:lla, jolloin saadaan kappale 51 <1,95 ke), joka koodittaa käsittelemätöntä TPA cDNA:ta. Kappale 51 eristetään geelillä ja liitetään pAc373, Bgllltn BglI I-paikkaan, jolloin saadaan pAcTPA, joka pystyy ilmentämään natiivia TPA:ta S. frugiperdassa.

<2) pAcFK2K2A:n konstruointi - Kartta 25.

Tätä ek8pressioplasmidia varten TPA-analogi FK2K2A katkaistaan pFK2K2A:s ta (kartta 12) käyttäen BglII:ta, ja TPA-analogia koodittava cDNA eristetään geelillä kappaleena 53 <2,0 ke).

Plaemidi pAcTPA (kartta 24) katkaistaan BglII:lla, jolloin saadaan kappale 52 <7,15 ke). Kappaleet 52 ja 53 ligoidaan, jolloin saadaan pAcFK2K2A <9,15 ke), jota säilytetään E. co-lissa kunnes se transfektoidaan S. frugiperdaan.

<3) S. frugiperdan transfektointi ja viljely.

TPA-analogit yhdistetään natiivin ACNPV DNA:n kanssa yhteis-transfektiolla S. frugiperdassa. S. frugiperdaa <SF9; ATCC CRL 1711) viljellään Gracen-alustoissa (Gibco Lab. Livonia, MI 48150), 10 % vasikan sikiön seerumissa ja johon on lisätty Difco Lactalbumin-hydrolysaattia ja yeastolaattia. Soluja yh-teistransfektoidaan AcNPV DNA:11a ja PAcTPAFK2K2A:11a 1 /U/ml ja 2 /u/nil, vastaavasti. Muodostuneita viruspartikkeleita saadaan ottamalla alusta talteen ja poistamalla solumateriaali pieninopeuksisella sentrifugoinnilla. Viruspitoisia alustoja käytetään sen jälkeen infektoimaan S. frugiperda. Seuraava S.

97809 57 frugiperdan infektointi, käyttäen näitä viruspartikkeleja, jotka sisältävät sekä natiivia virus-DNA:ta että DNA:ta, joka on yhdistynyt cDNA:han, joka koodittaa FK2K2A TPA-analogia, johtaa siihen, että jotkut solut ilmentävät TPA-analogia poly-hedroniproteiinin sijasta. Infektoituneiden solupesäkkeiden, jotka tuottavat TPA-analogeja, havaitseminen määritetään asettamalla S. frugiperdan yksisolukerroksen päälle, joka on aikaisemmin infektoitu, yhdeksi tunniksi laimennussarja viruspi-toisia alustoja (10'1 - 10"6) . Solujen päälle laitetaan sen jälkeen Grace-alustaa, joka sisältää 0,7 % matalalla sulavaa aga-ria, joka sisältää 6 mg/ml fibrinogeenia ja 0,5 yksikköä trom-biinia. Ne solut, jotka tuottavat aktiivista TPA:ta, muodostavat kirkkaita plakkeja infektiokeskusten ympärille.

Esimerkki 5

Seuraavat analogit on eristetty CHO-soluista, ja niistä on määritetty aktiivisuus ja antigeenisuus: FGK1K2A, FK1K2A ja FK2A.

Taulukossa 1 on esitetty yhteenveto kahden eri in vitro-ko-keen tuloksista, aktiivisuus ja vasta-aineen tunnistaminen. Analogit FGK1K2A ja FK2A muodostavat komplekseja plas-minogeenin aktivaattorin inhibiittorin kanssa verihiutaleista (trombiinin indusoima verihiutale-erite) . Analogien molekyyli-painot ovat noin 62 000 ja 40 000 daltonia, vastaavasti. Entsyymi- inhibiittorikompleksien molekyylipainot ovat suunnilleen 110 000 ja 85 000 daltonia, vastaavasti.

Esimerkki 6. TPA-analoaien terapeuttinen käyttö TPA:n tiedetään olevan terapeuttisesti käyttökelpoinen hyytymien liuottajana. The Lancet, s. 1018-20 (marraskuun 7., 1981); Science, 220:1181 (1983); ja N. Eng. J. Med., 310:609 (1984). TPA-analogeja voidaan antaa potilaille, joilla on sepel valtimotukos, sepelvaltimonsisäistä tai laskimonsisäistä reittiä yleisten menetelmien mukaisesti, joita on kuvattu kahdessa edellisessä referenssissä.

97809 58

Taulukko 1

Aktiivisuus* Antigeeniä** Näyte (Yks./ml) (ng/ml)

Puhdistettu natiivi

Yhdistelmä-TPA 49 000 912 000 FGK1K2P 2,1+0,03 47+2 FK1K2P 8,4+0,34 200±6 FK2P 4,2+0,06 97+28 * Aktiivisuus on ilmaistu suhteessa standardiin TPA-valmistee-s e en.

** Antigeenimääritysmittaukset saatiin käyttäen vuohen poly-klonaalista vasta-ainetta TPA:lle, jota edellä on kuvattu.

„ 97809 59

Kuvio 1

1 TTCTGAGCACAGGGCTGGAGAGAAAACCTCTGCGAGGAAAGGGAAGGAGCAAGCCGTCAA

111111111II 11111111111111111111111111111!11111111111111111iI

1 TTCTGAGCACAGGGCTGGAGAGAAAACCTCTGCGAGGAAAGGGAAGCAGCAAGCCGTGAA

61 TTTAAGGGACGCTGTGAAGCAATCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTG

! 11111111 IM 111! 1111111 IM 1111MIII1111111! 1111111111! 1111! I

61 TTTAAGGGACGCTGTGAAGCAATCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTG

121 CTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGA

11111 II 11 II 111111M II II 11111 II EI II MI! 1! IS i I! 11111 i I! I i [ 11!I

121 CTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGA

181 GGAGCCAGATCT TACCAAGTGATCTGCAGAGATGAAAAAACGCAGATGATATACCAG

llllllllllll lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

181 GGAGCCAGATCTAGATACCAAGTGATCTGCAGAGATGAAAAAACGCAGATGATATACCAG

238 CAACATCAGTCATGGCTGCGCCCTGTGCTCAGAAGCAACCGGGTGGAATATTGCTGGTGC

llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

241 CAACATCAGTCATGGCTGCGCCCTGTGCTCAGAAGCAACCGGGTGGAATATTGCTGGTGC

298 AACAGTGGCAGGGCACAGTGCCACTCAGTGCCTGTCAAAAGTTGCAGCCAGCCAAGGTGT

lllllllllllllllllllllllllllllllllll II llllllllllllllllll 301 AACAGTGGCAGGGCACAGTGCCACTCAGTGCCTGTTAACGCATGCAGCGAGCCAAGGTG7

358 TTCAACGGGGGCACCTGCCAGCAGGCCCTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGCCCC

llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

361 TTCAACGGGGGCACCTGCCAGCAGGCCCTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGCCCC

418 GAAGGATTTGCTGGGAAGTGCTGTGAAATAGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAG

1111 II I II IM II 111 m 111111 II Milli lllllllllllllllllllllll

421 GAAGGATTTGCTGGGAAGTGCTGTGATATCGATACCCGGGCCACGTGCTACGAGGACCAG

478 GGCATCAGCTACAGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGACTGCACCAACTGG

IIIMIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

481 GGCATCAGCTACAGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGTGCACCAACTGG

538 aacagcagcgcgttggcccagaagccctacagcgggcggaggccagacgccatcaggctg

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMIIIIIIIIIIIIIIIIII

541 AACAGCAGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCCGAGGCCAGACGCCATCAGGCTG

egg GGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTAC

llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

601 GGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTAC

rce GTCTTTAAGGCGGGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGA

1111111111 II III111IIM 11 M M 11111II II I i 111M II 111! II111 MIΊ

661 GTCTTTAAGGCGGGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGA

71 o AAC AGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACC

I I IIIIIIIIIMIIIIIIllllllllllllllllllllllllllllllll!l

721 TCCGTTAACGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTCGCACGCACACCCTCAlC

60 97809

Kuvio 1 (jatkoa)

775 GAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACA

11 II 11II111! 1111! I II 1111 II 1111E111 ί 1111M11! 11 II M1111! 1111!

781 GAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACA 835 GCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCT

IIIIIIIIIIIIIIMIIIIIIIIIIIIIMIIIIIIIIIIMIIIIIIIIIIIIIMII

841 GCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCT 895 GATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTAC

1! M 11 M I! 111111 Μ I M ! 11 M I M 11! M M M 1111 M I! 11111111111111

901 GATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTAC 955 TGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACC TGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTT

1111 II 1111 II 11 II 11 I III lllllll IIN llllllllllllllllll

961 TGTGATGTGCCCTCCTGCGCAACCGCATGCGGCCGGAGA TACAGCCAGCCTCAGTTT

1012 CGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTT

llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

1021 CGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTT 1072 GCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCC

llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

1081 GCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCC 1132 TGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACG

1111 II 1111111 II M1111111M M 111M111 II 111111!1111 II 111111 i 11

1141 TGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACG 1192 GTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTC

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

1201 GTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGCAGCAGAAATTTGAAGTC 1252 GAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTG

I i 11 II 11111 II I! 11111M II 111111111111111111111111M 1111M MI (

1261 GAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTG 1312 CTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTG

llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

1321 CTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTG 1372 TGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTAC

11111 II f II 111111 II 1111 II 11111 II 111111111111111 II 111111111111

1381 TGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTAC 1432 GGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATCTCAGA

II II 11111 II 1111111111111111111111 II 11111 II 111111111111 II 1111

1441 GGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGA 1492 CTGTACCCATCCACCCCCTGCACATCACAACATTTACTTAACACAACACTCACCCAC.AAC

Il111111111II1111111111111II111111111111II1111II1111II111111

1501 CTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAAC

97809 61 1552 atgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcacgacccctgc ,,,, I [ 11!! I ί 111 (11 II I II 1111 II 11M 111111III II M 11! 111! 1111! I i 11!!

1301 ATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGC 1612 CAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGC

IIIIIIIIIIMIIIIIIIIMIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMIIIIIIIII

CAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGC 1672 ATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTT

II II M II IM11 MI II M11! 111111!1111 M 11! 1111111!li I ί II! 11111!

1681 ATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAACGTT 1732 ACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGACCAGGAACACCCGACTCC

17/1 11111 i I II 1111M M11111 M11 il 111111111111111! 11 < I! ί 111 II M! II

1741 ACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGACCAGGAACACCCGACTCC 1792 TCAAAAGCAAATGAGATCCCGCCTCTTCTTCTTCAGAAGACACTGCAAAGGCGCAGTGCT

IIIIMIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIllllllllMIIIIIIII

1801 TCAAAAGCAAATGAGATCCCGCCTCTTCTTCTTCAGAAGACACTGCAAAGGCGCAGTGCT 1852 TCTCTACAGACTTCTCCAGACCGACCACACCGCAGAAGCGGGACGAGACCCTACAGGAGA

llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

1861 TCTCTACAGACTTCTCCAGACCCACCACACCGCAGAAGCGGGACGAGACCCTACAGGAGA 1912 GGGAAGAGTGCATTTTCCCAGATACTTCCCATTTTGGAAGTTTTCAGGACTTGGTCTGAT

1qo1 II111111MII1111111111IIIII M11II111111 i! II111II1111111II11!

1921 GGGAAGAGTGCATTTTCCCAGATACTTCCCATTTTGGAAGTTTTC AGG ACTTGGTCTGAT 1972 TTCAGGATACTCTGTCAGATGGGAAGACATGAATGCACACTAGCCTCTCCAGGAATGCCT

IIIIIIIIIIMIIIIIIIIIIIIIIIIIlirilllllllllllllllllimilllll

1981 TTCAGGATACTCTGTCAGATGGGAAGACATGAATGCACACTAGCCTCTCCAGGAATGCCT 2032 CCTCCCTGGGCAGAAGTGGCCATGCCACCCTGTTTTCGCTAAAGCCCAACCTCCTGACCT

! 111111M 111M11 M MI II 1111111 II 111111 ί I Ml I! 11 i III II 1111111

2041 CCTCCCTGGGCAGAAGTGGCCATGCCACCCTGTTTTCGCTAAAGCCCAACCTCCTGACCT 2092 GTCACCGTGAGCAGCTTTGGAAACAGGACCACAAAAATGAAAGCATGTCTCAATAGTAAA

! 11111111111111II11111! 11111 i1111j I! 111111!111M1111 m 11111

2101 GTCACCGTGAGCAGCTTTGGAAACAGGACCACAAAAATGAAAGCATGTCTCAATAGTAAA 2152 AGAAACAAGAGATCTTTCAGGAAAGACGGATTGCATTAGAAATAGACAGTATATTTATAG

MIIIMIIIIIIIMIIIIIIIIIIIMIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIimillll

2161 AGAAACAAGAGATCTTTCAGGAAAGACGGATTGCATTAGAAATAGACAGTATATTTATAG 2212 TCACAAGGGCCCAGCAGGGCTCAAAGTTGGGGCAGGCTGGCTCGCCCGTCATGTTCCTCA

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

2221 TCACAAGGGCCCAGCAGGGCTCAAAGTTGGGGCAGGCTGGCTCGCCCGTCATGTTCCTCA 2272 AAAGCGCCCTTGACGTCAAGTCTCCTTCCCCTTTCCCCACTCCCTGGCTCTCACAACGTA

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMillllllllllllllllllllllllllllll

2821 AAAGCGCCCTTGACGTCAAGTCTCCTTCCCCTTTCCCCACTCCCTCCCTCTCACAACCTA

62 97809

2332 TTCCTTTTGAGTACAGTGTGTAAAGTGTAAATCCTTTTTCTTTATAAACTTTAGAGTAGC

m [ μ [ 1111 μ μ m 11 m 111 ί m m I [ i m 11 ί 1111 ί [ 111 m [ I ί [ m 2341 ttccttttgagtacagtgtgtaaagtgtaaatcctttttctttataaactttagagtagc 2392 atgagagaattgtatcatttgaacaactaggcttcagcatatttatagcgatccatcgtt

1111 II I II II III II lllllllllllll IIN IIIIII II II 111 lllllllll INI I

2401 atgagagaattgtatcatttgaacaactaggcttcagcatatttatagcgatccatcgtt 2452 agtttttactttccgttgccacaaccctgttttataccgtacttaataaattcggatata iiiiiifiiiiiimMiiiiiiiiimiiiiiiimiMiiiimiiiiiMiii 2461 agtttttactttccgttgccacaaccctgttttataccgtacttaataaattcggatata

2512 TTTTTTCACAGTTTTTTCCAAAAAAAAAAAAAA

IIMIIIIIMIIIIIIIimillllllllll

2521 TTTTTTCACAGTTTTTTCCAAAAAAAAAAAAAA

Pariutuneita = 2526 Huonosti yhteensopivia = 15 Pariutumattcmia = 12 Pituus - 2553 Pariutuneita/pituus = 99,0 prosenttia • I äa e i . ί

Kuvio 2 63 97809 1 MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysGlyAlaValPheVal

I I I I I I I I I I I I I I I ! II II

MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysClyAlaValPheVal 21 SerProSerGlnGluIleHisAlaArgPheArgArgGlyAlaArgSer TyrGlnVal I I I II I I I II I I I M I Ml 21 SerProSerGlnGluIleHisAlaArgPheArgArgGlyAlaArgSerArgTyrGlnVal 40 IleCysArgAspGluLysThrGlnMetlleTyrGlnGlnHisGlnSerTrpLeuArgPro

I I I I I I I I I I M I I I II I II

41 IleCysArgAspGluLysThrGlnMecIleTyrGlnGlnHisGlnSerTrpLeuArgPro 60 ValLeuArgSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHis

I I I I I II I I I I I I I I I I I I I

61 ValLeuArgSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHis 80 SerValProValLysSerCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGln

I I II II I I I I I I I I I I I I

81 SerValProValAsnAlaCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGln 100 AlaLeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAlaGlyLysCysCys

I I I II I I I I I I I I II I I I I I

101 AlaLeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAlaGlyLysCysCys 120 GluIleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGlnGlylleSerTyrArgGlyThrTrp

I I I I I I I I I I I I I I I I II I

121 AspIleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGlnGlylleSerTyrArgGlyThrTrp 140 SerThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLys

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

141 SerThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLys 160 ProTyrSerGlyArgArgProAspAlalleArgLeuGlyLeuGlyAsnHlsAsnTyrCys

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

161 ProTyrSerGlyArgArgProAspAlalleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCys 180 ArgAsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlvLysTyrSer

II I II I I I I I I I I I I I n I I

181 ArgAsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSar 200 SerGluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGly AsnSerAspCvsTyrPheGly

I I I I I II I I I II I f I I I

201 SerGluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGlySerValAsnAspCysTyrPheGly 219 AsnGlySerAlaTyrArgGlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuPro

I I I I I I I II I I II I I I I II I

221 AsnGlySerAlaTyrArgGlyThrHIsSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuPro 239 TrpAsnSerMetlleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAla

I I I I I I I I I I I II II II I I I

241 TrpAsnSerMetlleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnPi oSerAlaGinAia 64 97809 259 LeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCvsArgAsnProAspGlyAspAlaLvsProTrpCvs

I I I I II I I ΙΊ I I I I I I n ! I

261 LeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCys 279 HisValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThr

II I II II II I I I I I I II I I

281 HisValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysAlaThr 299 CysGlyLeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArglleLysGlyGlyLeuPheAla

I I II I I I I I I I I II I I II

301 AlaCysGlyArgArg TyrSerGlnProGlnPheArglleLysGlyGlyLeuPheAla 318 AspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlallePheAlaLysHisArgArgSerProGly

I II I I I I I I I I I I I II I I I I

321 AspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlallePheAlaLysHisArgArgSerProGly 338 GluArgPheLeuCysGlyGlylleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHis

I II I I I I I I I I I I I I II I II

341 GluArgPheLeuCysGlyGlylleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHis 358 CysPheGlnGluArgPheProProHisHisLeuThrVallleLeuGlyArgThrTyrArg

I I I I I I I I I I I II I I I Ί II I

361 CysPheGlnGluArgPheProProHisHisLeuThrVallleLeuGlyArgThrTyrArg , 378 ValValProGlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrlleValHisLysGlu

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

3gl ValValProGlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrlleValHisLysGlu •sag PheAspAspAspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSer

I I I I I I I I I I I I II I I I I II

4Q1 PheAspAspAspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSer λ ί a ArgCysAlaGlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGln

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

421 ArgCysAlaGlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGln / -so LeuProAspTrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerPro

3 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

LeuProAspTrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerPro , co PheTyrSerGluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysIhr

I I I - I I- II I I I I I I I II I I I I

, PheTyrSerGluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThr

SerGlnHisLeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArg SerGlnHisLeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCvsAlaGlyAspThrArg / oo SerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlvProLeu

4,8 I III I I I I I I I I I I I I I I M

SerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLau 97809 65 518 ValCvsLeuAsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyllelleSerTrpGlvLeuGlyCys

I f I I I I I I I I I I I II I I Ί I I

521 ValCysLeuAsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyllelleSerTrpGlyLeuGlyCys 538 GlyGlnLysAspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTi:pIleArg

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

541 GlyGlnLysAspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArg 558 AspAsnMetArgProEnd

I II I I I

561 AspAsnMetArgProEnd

Pariutuneita = 556 Huonosti yhteensopivia = 7 Pariutumattomia = 3 Pituus = 566 Pariutuneita/pituus = 98,2 prosenttia 97809 66

Kuvio 3 TPA- dLiganukleotidit

Ryhmä 1 = Somidomeeni

Pl 5'GATCTAGATACCAAGTG

P2 5'ATCTGCAGAGATGAAAAAACGC

P3 5'AGATGATATACCAGCAACAT

P4 5'CAGTCATGGCTGCGCCCTGTGG

P5 5'TCAGAAGCAACCGGGTGGAAT

P6 5'ATTGCTGGTGCAACAGTGGCAG

P7 5'AGCACAGTGTCACTCAGTTCCTGTTAACGCATG

P8 5'GCAGATCACTTGGTATCTA

P9 5'ATCATCTGCGTTTTTTCATCTCT

P10 5'ATGACTGATGTTGCTGGTAT

PII 5'CTTCTGAGCACAGGGCGCAGCC

P12 5'AGCAATATTCCACCCGGTTG

Pl3 5'TGTGCTCTGCCACTGTTGCACC

P14 5'CGTTAACAGGAACTGAGTGACAC

Ryhmä 2 = Kasvutekijädomeeni

P15 5'CAGCGAGCCAAGGTGTTTCAACGGGGGCACC

P16 5'TGCCAGCAGGCCCTGTACTTCTCAGATTTC

P17 5'GTGTGCCAGTGCCCCGAAGG

P18 5'ATTTGCTGGGAAGTGCTGTGATAT

P19 5'GAAACACCTTGGCTCGCTGCATG

P20 5'CCTGCTGGCAGGTGCCCCCGTT

P21 5'GGCACACGAAATCTGAGAAGTACAGGG

P22 5'AGCAAATCCTTCGGGGCACT

P23 5'CGATATCACAGCACTTCCC

R/hmä 3 = Silmukka 1 -domeeni

P24 5'CGATACCCGGGCCACGTGCTAC P25 5'GAGGACCAGGGCATCAGCTACAGG P26 5'GGCACGTGGAGCACAGCGGAG P27 5'AGTGGCGCCGAGTGCACCAACTGGAACAG — P28 5'CAGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCTAC

P29 5'AGCGGGCGGAGGCCAGACGCCATCA

P30 5'GGCTGGGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAG '

P31 5'AAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGC

P 3 2 5'TACGTCTTTAAGGCGGGGAAGTACAGCTCAGAG

P33 5'TTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGG

P34 5'GTCCTCGTAGCACGTGGCCCGGGTAT

P35 5'CGTGGCCCTGTAGCTGATGCCCTG

P36 5'CGCCACTCTCCGCTGTGCTCCA

P37 5'ACGCGCTGCTGTTCCAGTTGGTGCACTCGG

P38 5'CCCGCTGTAGGGCTTCTGGGCCA

P39 5'CCAGCCTGATGGCGTCTGGCCTCCG

P40 5'CTGGGTTTCTGCAGTAGTTGTGGTTCCCCAGGC

P41 5'AAAGACGTAGCACCAGGGCTTTGAGTCTCGAT

P42 5'GCAGAACTCTGAGCTGTACTTCCCCGCCTT

P43 5'GATCCCTCAGAGCAGGCAGGGGTGCT

67 97809

Kuvio 3 (jatkoa)

Ityhmä 4 = Silmukka 2 -domeeni

P44 5' GATCCGTTAACGACTGCTACTT

P45 5'TGGGAATGGGTCAGCCTACC

P46 5'GTGGCACGCACAGCCTCACCGAG

P47 5'TCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGA

P48 5'ATTCCATGATCCTGATAGGCAAG

P49 5'GTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCGC

P50 5'AGGCACTGGGGCTCGGGAAAC

P51 5'ATAATTACTGCCGGAATCCTGATG

P52 5'GGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGT

P53 5'GCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGG

P57 5'AAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCT

P58 5'CCCACCCCTGGCAGGCTGC

P59 5'CATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCC

P60 5'CGGAGAGCGGTTCCTGTGCG

P61 5'GGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGAT

P62 5'TCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCA

P63 5'GGAGAGGTTTCCGCCCCACCAC

P64 5'CTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATAC

P65 5'CGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAAT

P66 5'TTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGG

P67 5'TTCCCAAAGTAGCAGTCGTTAACG

P68 5'TGCCACGGTAGGCTGACCCA

P69 5'CACCCGACTCGGTGAGGCTGTGCG

P70 5'CATGGAATTCCACGGGAGGCAGGAGG

P71 5'GTAAACCTTGCCTATCAGGAT

P72 5'AGTGCCTGCGCACTGGGGTTCTGTGCTGT

P73 5’AGTAATTATGTTTCCCGAGCCCC

P74 5'CATCCCCATCAGGATTCCGGC

P75 5'CTTCAGCACGTGGCACCAGGGCTTGG

P76 5'AGTACTCCCACGTCAGCCTGCGGTT

P80 5'CCAGGGGTGGGAGGCGATGTCGGCGAAGAGCC

P81 5'TTGGCAAAGATGGCAGCCTG

P82 5'TCTCCGGGCGACCTCCTGTGC

P83 5' ATGCCCCCGCACAGGAACCGC

P84 5’AGAGAGAATCCAGCAGGAGCTGATGAGT

P85 5'CTCTCCTGGAAGCAGTGGGCGGC

P86 5'CGTCAGGTGGTGGGGCGGAAAC

P87 5'CACCCGGTATGTTCTGCCCAAGATCAC

P88 5'GACTTCAAATTTCTGCTCCTCCTCGCCAGGGAC

P89 5'AATTCCTTATGGACAATGTATTTTTC

P92 5'GAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCGCAACCGCATGC

P93 5'GGCCGGAGATACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATC

P94 5'GGCCGCATGCGGTTGCGCAGGAGGGCACATCAC

P95 5'CTCCTTTGATGCGAAACTGAGGCTGGCTGTATCTCC

97809 68

Kuvio 4

TPA-DOMEENIT

Domeenit Natiivi TPA

Sormi Seriiri no l-»Lysiini no 49

Nukleotidit 190-7336

Kasvutekijä Seriini no 50-7Treoniini no 91

Nukleotidit 337-7462

Silmukka 1 Kysteiini no 92-7Seriini no 174

Nukleotidit 463-7711

Silmukka 2 Glutamiinihappo no 175-7Seriini no 262

Nukleotidit 712—7975

Aktiivinen paikka Treoniini no 263-7Proliini no 527

Nukleotidit 976-=71770 TPA-ANALOGI < KARTTA 11)

Sormi Seriini no l-7Valiini no 49

Nukleotidit 190-7342

Kasvutekijä Alaniini no 51-7Alaniini no 91

Nukleotidit 343-9456

Silmukka 1 Treoniini no 92-7 Kysteiini no 175

Nukleotidit 457-9726

Silmukka 2 Glutami inihappo no 176~7Alaniini no 266

Nukleotidit 727-7999

Aktiivinen paikka Kysteiini no 267—7Proliini no 530

Nukleotidit 1000-71782 97809 69

Kartta 1. Plaemidin pTRZI konstruointi (a) pMC1403:a käsitellään EcoRI:n, Klenow-entsyymin ja bakte-riaalisen alkalieen foafataasin kanssa, jolloin saadaan kappale 1 .

Kappale 1

Smal BamHI Sali EcoRI

5' l._ I I 13'

I|-1-1-1-L

LacZ LacY LacA AmpR

<b> pVVlttä käsitellään PvuII:n, Bglllrn ja Klenow-entsyymin kanssa, minkä jälkeen kappale 2 <323 ep) puhdistetaan, joka sisältää trp-promoottorin ja osan TrpLE:etä.

Kappale 2

PvuII HpaI Bglll e; 1-a-L-.-1 3'

Ptrp trpLE

<c> Kappaleet 1 ja 2 ligoidaan käyttäen T4 DNA-1igaasia, jolloin saadaan pTRZl:tä <10 ke).

pTRZI

EcoRI HpaI Smal BamHI Sali *5' I I | | 3'* -1-,--1-1-L_-,-1-1-1

Ptrp trpLE LacZ LacY LacA AmpR

AmpR = Ampilliiniresistenssi.

LacZ, LacY, LacA = Laktoosioperonin geenit.

Ptrp = Tre-promoottori/operaattori. trpLE = trpLtn ja trpE:n yhtyminen.

97809 70

Kartta 2. Plaamidin pSK3 (4.3 ke) konstruointi (a) pTRZI:tä (10 ke) käeitellään BamHI:n ja EcoRI:n ja alkaneen foafataaein kanssa, jolloin saadaan kappale 3 <350 ep).

Kappale 3

EcoRI Smal BamHI

5' I---I_I 3'

DDDDDDEEEEEFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF

<b) pKC7:ää (5,8 ke) käeitellään BamHI:n ja EcoRI:n kanssa, jolloin saadaan kappale 4 <4,0 ke).

Kappale 4

BamHI Sali EcoRI

5' I_I_,_I

AmpR

<c) Kappaleet 3 ja 4 ligoidaan, jolloin muodostuu pSK3 <4,3 ke).

pSK3

EcoRI Smal BamHI Sali *5 * _I__I_|_l 3 *

JDDDDDDEEEEEFFFFFFFFFF AmpR

D = Trp-promoottori/operaattori .

E = TrpL-ribosomin sitoutumispaikka.

F = trpLE ja katkaisupaikat.

AmpR = Ampisilliinireeistenssi.

97809 71

Kartta 3. Plaemidin dSK4 konstruointi (a) pSK3 katkaistaan EcoRI:llä ja BamHI:llä kappaleen 5 (322 ep) eristämiseksi.

Kappale 5

EcoRI TaqI ' TaqI" TaqI"' Sma I BamHI

5 ' |_|_| AAAAAAG G G TAlj CGACAATG |_j 3 ' DDDDDDDDDDDDDDDDEEEE i— 278 bp —^ (b) Osittainen Taqltllä hydrolyeointi tuottaa 278 ep:n kappaleen 6, EcoRI - Taql''' ja muita kappaleita.

(c> Kappale 6 kloonataan pBR322:een, katkaistaan EcoRI:llä ja Clal:llä, jolloin saadaan pSK4 (4,6 ke).

pSK4

EcoRI ClaI BamHI Sali *5' [ lii 3'*

I DDDDDDDDDDDDEEEE

AmpR

D = Trp-promoottori/operaattori.

E = Shine-Dalgarno-alue.

72 97809

Kart-fca 4, pTPA 3' cDNA:n konstruointi (a) Plaemidi pTPAH <5,7 ke) saadaan katkaisemalla pBR322 Pstltllä, päiden lisäämisellä ja sijoittamalla TPAcDNAtn 3'-alue, joka sisältää asemat 1250-2530.

Peti Sacl EcoRI Peti PvuI

* _ I I I_1 I *

PPPPP AAAAA AAAANNNNN

TetR

<b> Plaemidi pTPA80-l <5,4 ke) saadaan katkaisemalla pBR322 Pstltllä, päiden lisäämisellä ja sijoittamalla TPA:n cDNA, joka sisältää asemat 50-1600.

Peti Sacl Peti PvuI

* -.-I_I_I_I *

PPPPPPPPPPPP AAAAAA

TetR

<c> Plasmidit pTPAH ja pTPA80-l katkaistaan Sacl:llä ja Pvultllä, ja kappaleet 7 <1251 ep) ja 8 <5,1 ke) eristetään vastaavasti geelillä. Kappaleita käsitellään bakteriaalisella alkalieella fosfataasi1la, ja ne ligoidaan T4:n kanssa, jolloin muodostuu pTPA3' cDHA:ta <6,3 ke), joka sisältää TPAcDNA:n emäkset 550-2530.

PvuII Peti Hgal EcoRI EcoRI Aatll Peti PvuI

*__TJ_I_I I I I I I ‘

PPPPPPPPPPPPPPPAAAAAAAAAAANNNNNNNNN TetR I I

I-1-1-1-j 550 590 802 1274 253Γ0

TetR = Tetrasykliiniresistenssi.

P = TPAcDNAtn emäsasemat 550-802.

A = TPAcDNAtn emäsasemat 803-2530.

N = TPAcDNAtn lukematon 3'-alue.

•I IH i liiti hi tu 73 97809

Kartta 5. Plaemidin pTPAcDNA konstruointi (a) Plaemidi pTPA 5' cDNA saadaan aikaan leikkaamalla pBR322 Pet I : llä, päiden lisäämisellä ja sijoittamalla TPAcDHAtn asemien 1-750 5'-alue.

TaqI Peti Hgal Bglll Narl Hgal Peti Taql

* I I I I I I I I

TTTTTTT T *J* *J* <b> Plasmidi pTPA 5' leikataan Taql:llä, jolloin saadaan kappale 9 <2194 ep), joka eristetään geelillä ja katkaistaan Bgl11:1la ja Hgal:llä, jolloin saadaan kappale 10 <405 ep), joka sisältää TPAcDNA:n <täyspitkä TPA-proteiini> emäkset 1ΘΘ-593.

Kappale 10

BglII Hgal

I_I

TTXTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

<c> Plaemidi pTPA 3' cDNA <kartta 4) leikataan PvuII:lla ja EcoRI:llä, ja kappale 11 <1748 ep) eristetään geelillä. Kappale 11 katkaistaan Hgal:llä, jolloin saadaan kappale 12 <209 ep), joka eristetään geelillä, ja joka sisältää emäkset 594-802.

Kappale 11

PvuI Peti Hgal EcoRI

1_I_I_1

PPPPPPPPPPPP

209 —> 97809 74

Kartta 5. (jatkoa) <d) Plaemidi pTPA 3' cDNA leikataan Pvul:llä, lineaarista 6,3 ke kappaletta käsitellään T4-polymeraasin kanssa päiden tasaamiseksi, ja hydrolysoidaan osaksi EcoRI:llä, jolloin saadaan kappale 13 <1871 ke), joka sisältää emäkset 802-2530 plus 123 ep:a pBR22:sta.

Kappale 13

EcoRi Seal EcoRI Bglll Aatll Peti PvuI

I_!_I_I_I_I_I

AAAAAAAAAAAAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

(e) Plaemidi pKC7 katkaistaan Bglll:11a ja Smal:llä, sitä käsitellään bakteriaalisella alkalisella foefataasilla, ja kappale 14 <4,8 ke) eristetään geelillä.

Kappale 14

Bglll Seal Smal l-Lj-1

AmpR

<f) Kappaleet 10, 12, 13 ja 14 kootaan yhteen ja ligoidaan käyttämällä T4-ligaasia, jolloin saadaan pTPAcDNA <7,4 ke), joka sisältää täyspitkän TPAcDNA:n.

Seal Hindlll Bglll Narl Hgal Seal EcoRi EcoRi Bglll Aatll *J_I_1_I_I 1 1 I I 1 * TTTTTTTTTT ppppp aaaaaaaaannhnnnnnhhhnnnnnnn

AmpR

AmpR = Ampieilliiniresistenesi.

T = TPA cDNA:n 5'-osa.

P = TPA cDNA:n keskiosa.

A = TPA cDNA:n 3'-osa.

N = TPA cDNA:n lukematon 3'-osa.

97809 75

Kartta 6. pTPA-Bl:n konstruointi (a) Plaemidi pSK4 leikataan Clal:llä ja Sphl:llä, jolloin kappale 15 <4,1 ke), joka eristetään ja ligoidaan ryhmään 1, joka sisältää sormidomeenin ClaI/XbaI-1inkkerin välityksellä, joka sisältää ATG:n.

Kappale 15

Sphl EcoRI Clal

la> I_I_I

DDDDEEEEE

XbaI Sphl

Ryhmä 1 <150 ke) | j

FFFFFFFFFF

Linkkeri <ClaI) CGATAAGCTATGT

TATTC G AT AC AG ATC < X b a I ) <b) Kappale 15 ja ryhmä 1 ligoidaan linkkerin välityksellä, jolloin saadaan pTPA-Bl <4,25 ke).

pTPA-Bl

EcoRI Clal Xba Sphl Seal *5' 1 I I II, 3·*

DDDEEEE FFFFFF I

ATG AmpR

D = Trp-promoottori/operaattori.

E = TrpL-riboeomin kiinnittymispaikka.

F = Sormidomeeni.

AmpR = Ampisilliiniresistenssi.

ATG = Aloituskodoni.

76 97809

Kartta 7. pTPA-B 1.2:n konstruointi (a) Plaemidi pTPA-Bl leikataan EcoRI:11a ja Sphl:llä, jolloin saadaan kappale 16 (450 ep> ja ryhmä 2 (100 ep), joka sisältää kasvutekijädomeenin, ja eristetään sopivasta kloonista käyttäen EcoRI:tä ja Sphl:tä.

Kappale 16

EcoRI Clal Xba Sphl

I , , I ' I I

I ||FFFFFFFF

P/O Rbs ATG

Ryhmä 2

Sphl Clal

L_I

GGGGGGGGG

(b) Kappale 16 ja ryhmä 2 ligoidaan kappaleeseen 17 (4,35 ke), joka on saatu pBR322:n EcoRI/ClaI-hydrolyysistä, jolloin saadaan pTPA-B 1,2 (4,8 ke).

Kappale 17

EcoRI Seal Clal 1-h-?-1

AmpR Ori pTPA-B1,2

Seal EcoRI Clal Xba Sphl Clal BamHI

*5' | || III 3 * I | | FFFFFFF GGGGG |

AmpR P/O RbS ATG Ori

: Ml- Hill I I I M

77 97 809 P/O = Trp-promoottori/operaattori.

RbS = Trp-riboeomin kiinnittymispaikka.

ATG = Aloituekodoni.

F = Sormidomeeni.

AmpR = Ampieilliiniresistenssi.

Ori = pBR322:n replikoinnin aloituskohta.

97809 78

Kartta 8. pTPA-B1.2(a):n konstruointi (a) Plasmidi pTPA-B 1,2 leikataan Xbal:llä ja EcoRI:llä, jolloin saadaan kappale 18 (4,5 ke), joka eristettiin ja ligoi-tiin linkkeriin, joka sisältää Hind I I I-paikan ja Bglll-paikan, jolloin saadaan pTPA-B l,2(a) (4,5 ke).

Kappale 18

Xba Sphl Clal Seal EcoRI

Il I 11

FFFFF GGGGG

AmpR

Hindi I I

Linkkeri (EcoRI) AATTCAAGCTTAGAT

GTTCGAATCTAGATC (XbaI)

Bgll I

pTPA-B 1,2(a)

Bglll Xba Sphl Clal BamHI Seal EcoRI Hindlll * I I I_I I I I I *

FFFFFF GGGGGG

AmpR

F = Sormi.

G = Kasvutekijäälue.

AmpR = Ampieilliiniresistenssi.

97809 79

Kartta 9. pTPA-B 1.2.3:n konstruointi (a) Plasmidi pTPA-B 1.2(a) leikataan Clal/BamHI:llä, ja kappale 19 (4,0 ke) eristetään ja ligoidaan ryhmä 3:n kanssa (270 ep), joka sisältää silmukka l:n ja Clal-paikan geenin yläpuolella, ja BamHl-paikan geenin alapuolella, jolloin saatiin pTPA3 (4,3 ke).

Kappale 19

BamHI Seal EcoRI Hindi II Bglll Xba Sphl Clal

I I_I_I_I_I_I_I

FFFFF GGGGG

AmpR

Clal BamHI

I_J

KKKKKKKKKKKKKKK pTPA-B 1,2,3

EcoRI Hindi II Bglll Xba Sphl Clal BamHI Seal * I I I I 1 1 I 1 *

FFFFFF GGGGGG KKKKKK

AmpR

F = Sormidomeeni.

G = Kasvutekijädomeeni.

K = Silmukka 1.

AmpR = Ampisilliiniresistensei.

97809 ΘΟ

Kartta 10. pTPA-B 1.2.3.4(a):n konstruointi (a) Plaemidi pTPAcDNA (kartta 5) leikataan Seal:llä, ja kappale 20 (6,0 ke), joka sisältää TPA-geeenin 3'-osan, eristetään geelillä.

Kappale 20

Seal EcoRI Bglll Aatll Seal

I_I_I_I I

aaaaaaaaaaNNNNNNNNNNNNNNNN |

AmpR

(b) Plaemidi pTPA-B 1,2,3 (kartta 9) leikataan Scaltllä ja BamHI:llä, ja kappale 21 (1100 ep> eristetään geelillä.

Kappale 21

Seal Xba Sphl Clal BamHI

I , I I I I

J FFFFFFF GGGGGGG KKKKKKKKKKK

AmpR

(e) Kloonista, joka sisältää ryhmän 4, eristetään BamHI/-ScaI-kappale 4a (230 ep), joka sisältää silmukka 2-alueen.

Kappale 4a

BamHI Seal (d) Kappaleet 20, 21 ja 4a ligoidaan, jolloin muodostuu pTPA-B 1,2,3,4a.

97809 81

Kartta 10. <iatkoa)

Hindi II Xbal Sphl Clal BamHI Seal Ball Aatll Sad Bglll Hpal EcoRV Smal HpaI EcoRI Bglll

Il Mill I II 11 II l·

FFF GGG KK kkk aaaaaaNNNNNNNNN

AmpR

<e> Plasmidi pTPA-B 1,2,3,4* leikataan HindIII:lla ja AatII:lla, 2,2 ke prototyyppi TPA-geeni subkloonataan pUC19:-ään, joka on samalla tavalla hydrolysoitu HindIII:lla ja AatII:lla, jolloin saadaan pTPA-B 1,2,3,4a (4,2 ke). Plasmidi pTPA-B 1,2,3,4* on symbolisesti samanlainen kuin pTPA-B 1,2,3, 4*, mutta sisältää restriktiopaikat tarkoituksenmukaisemmassa järjestyksessä.

AmpR = Ampieilliinireeistanssi.

F = Sormidomeeni.

G = Kasvutekijädomeeni.

K = Silmukka 1-domeeni.

k = Silmukka 2-domeeni.

a = Aktiivinen paikka.

N * TPAcDNA:n lukematon 3'-osa.

97809 82

Kartta 11. pTPA-B 1.2.3.4:n konstruointi <a> Plasmidi pTPA-B 1,2,3,4a leikataan EcoRI:llä ja BamHI:llä. Suuri kappale <3,7 ke) ligoidaan ryhmään 4 <560 ep), joka on saatu sopivasta kloonista, joka myös on leikattu EcoRI:llä (osittainen hydrolyysi) ja BamHI:llä, jolloin saadaan pTPA-B 1,2,3,4.

HindiII Xbal Sphl Clal BamHI Seal Xmall EcoRI Bglll Seal Bglll Hpal 1 EcoRV Smal Hpal MstI Sphl Ball Aatll *_j——i——i—I_i__ill__i___i-L·. *

FFF GGG KK kk AAAAANNNNNNNN

AmpR

AmpR = Ampisilliiniresistenssi.

P = Sormidomeeni.

G = Kasvutekijädomeeni.

K = Silmukka 1-domeeni.

k = Silmukka 2-domeeni.

A = TPAcDNA:n 3'-osa.

N = TPAcDNA:n lukematon 3'-osa.

Kartta 12. PFK2K2A:n konstruointi <a> Plaemidi pTPA-B 1,2,3,4a leikataan Hpal:xlä< jolloin saa daan kappale 22 <3,9 ke), joka eristetään geelillä 83 97809

Kappale 22

Hpal Heti EcoRI Ball Bglll Bglll^Xbal HpaI

kkk AAAAAANNNNNN | FFFF

Ori AmpR

<b> Plasmidi pTPA-B 1,2,3,4a leikataan Hpaltliä, jolloin saadaan kappale 23 (250 ep), joka sisältää silmukka 2:n.

HpaI Me 11 kkkkkkkkkk (c) Kappaleet 22 ja 23 ligoidaan yhdessä, jolloin saadaan PFK2K2A <4,1 ke).

Bglll XbaI Hpal Ball Bglll * |_ I_I_*

| FFFFFF kkk kkk AAAAA NNNNN

Ori AmpR

Ori * pBR322:n replikoinnin aloituskohta.

AmpR » Ampieilliinireeistenssi. k = Silmukka 2 -domeeni F = Sormidomeeni.

A = Aktiivinen paikka.

N * Ei-koodittava 3'-sekvenssi.

K»rtta_i3. ρΤΡΑΕχρ l;n konstruointi (a) Plaemidi pTPA-B 1,2 (kartta 7) leikataan Xbal:llä ja

BamHItHä, ja kappale 24 <4,2 ke) eristetään geelillä.

84 97809

BamHI EcoRI Clal Xbal 1-J-'-r-l , 1

AmpR P/O RbS ATG

<b> Plaemidi pFK2K2A (kartta 12) leikataan Xbal:llä ja BglII:Ha, jolloin saadaan kappale 25 (2,0 ke), joka eristetään geelillä.

Kappale 25

Xbal HpaI Mstl Sphl Ball Bglll

LI 11 II

FFFFF kkkk kkkk AAAAAANN NNNN

(c) Kappaleet 24 ja 25 ligoidaan, jolloin muodostuu ρΤΡΑΕχρ 1 (6,2 ke); BamHI ja Bglll ovat komplementaariset mutta eivät palaudu.

ρΤΡΑΕχρ 1

EcoRI Clal Xbal Hpal Mstl Sphl Ball 5* I I I I I I I 3*

|| I | FFFFF kkkk kkkk AAAAAA NNNN

AmpR trpP/0 RbS ATG

trP/O = Tryptofagipromoottori/operaattori.

RbS = Ribosomin kiinnittymispaikka. k = Silmukka 2.

F = Sormidomeeni.

A = Aktiivinen paikka.

N - Ei-koodittava 3'-sekvenssi.

AmpR = Ampieilliiniresistenssi.

ATG = Aloituskodoni.

97809 85

Kartta 14. pyRep3'B:n konstruointi (a) Plaemidi pYIP31 leikataan Smaltllä, ja eitä käsitellään bakterieella alkalieella fosfataasi1la, jolloin saadaan kappale 26 .

Kappale 26

Smal Hindlll EcoRI Hindi II

5' I I I I_3' uuuuuuu <b) Hiivan 2/U-plasmidi leikataan Pstl:llä ja Xbalrllä, ja sitä käsitellään Klenow-entsyymi1lä. Muodostunut kappale 27 <1,3 ke) eristetään.

Kappale 27

Peti Xbal *5' ]_| 3'

RRRRRRRRRRRRRRR

(c) Kappaleet 26 ja 27 ligoidaan, jolloin saadaan pyRep3'B <6,7 ke).

EcoRI Hindlll Hindlll *5' | | | 3'*

uuuuuuuRRRRRRRRR

u = URA3 R = Sekvenssi, joka käsittää RepiiI:n ja replikoinnin aloituskohdan.

86 97809

Kartta 15. pGG400:n konstruointi (a) Plaemidi pBR322 leikataan EcoRI:llä ja PvuII:lla, ja päät täytetään Klenow-enteyymin avulla, jolloin saadaan kappale 28 (2,3 ke).

Kappale 28

PvuI I EcoRI

5' I_,__J 3'

AmpR

<b) Plaemidi pML21 leikataan PvuI1:11a, jolloin saadaan kappale 29 <1,7 ke).

Kappale 29

PvuI I PvuI I

5' J_,_I3'

KmR

<c) Kappaleet 28 ja 29 ligoidaan käyttäen T4:ää, jolloin saadaan pGG400 <4,0 ke).

EcoRI XhoI PvuI I

*5' | || 3'* -!--|-

KmR AmpR

AmpR = Ampieilliinireeietenesi.

KmR = Kanamysiiniresistenssi.

I i41t Silli |.i l ia „ 97809 87

Kartta 16. pADHt:n konstruointi (a) Plasmidi pGG400 leikataan Xholrllä ja PvuII:lla, eitä käsitellään Klenow-enteyymillä, ja muodostunut kappale 30 (3,5 ke) eristetään.

Kappale 30

PvuII EcoRI XhoI

1-,-'-r-1

AmpR KmR

(b) Plasmidi pADHBC leikataan Hindi :11a ja BamHI:llä, päät täytetään T4-1igaasi1la, ja muodostunut kappale 31 (0,35 ke) eristetään.

Kappale 31

Hindi (XhoI) Sphl BamHI

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

(c) Kappaleet 30 ja 31 ligoidaan käyttäen T4-ligaaeia, jolloin saadaan pADHt (3,86 ke).

EcoRI Hindlll Smal XhoI Sphl BamHI

*. I I I ! I i, * HHHHHHHHHHHHHH|

AmpR

AmpR = Ampisilliiniresistenssi.

KmR = Kanamysiinireeietenssi.

H = ADHt 3'-pää.

97809 θθ

Kayt.a 17._Plaemidm_pADHt-R^p^ i i konstruointi <a) Plasmidia pADHt modifioidaan leikkaamalla B&mHIillä, ja β-meerieen SaiI-linkkerin ligoinnilla täytettyyn BamHI-Paikkaan.

EcoRI Hindi II XhoI Sphl Sali »j_|_L I i

HHHHHHHHHHHHH I

AmpR

<b) Plaemidi pADHt (modifioitu) leikataan Sphl:llä ja päät täytetään T4-ligaaeilla, jolloin saadaan kappale 32 <3,8 ke).

<c) Plaemidi pyRep31B (kartta 16) leikataan HindIII:lla ja päät täytetään T4-ligaasilla, jolloin saadaan kappale 33 (2,4 ke).

Hindlll Hindlll I_1

uuuuuuuuuuuuuuuRRRRRRRRRRRRRRR

(d) Kappaleet 32 ja 33 ligoidaan käyttäen T4-ligaaaia, jolloin saadaan pADHt-RepIII (6,2 ke).

EcoRI Smal Hindlll XhoI Sali * i_|_|_[__I * HHHHHH uuuuRRRRHHHH j

AmpR

AmpR = Ampisilliiniresistensei.

H = ADHt 3'-pää.

u - Ura3 R = Repi II ja replikoinnin aloituskohta.

Kartta 18. POil-ADHt:n konstruointi (a) Plasmidi pADHt-RepIII (kartta 15) leikataan EcoRI:llä ja

Hindlllrlla, ja kappale 34 <5,3 ke) eristetään.

69 97809

Kappale 34

Hindlll XhoI Sali EcoRI

I_I_I_,_I

HHHuuuuRRRRHHH

AmpR

<b) Plasmidi p ai katkaistaan EcoRI:llä ja Hindlllrlla, jolloin saadaan MFa 1-geeni, joka sisältää kappaleen 35, joka sisältää 1,2 ke.

Kappale 35

EcoRI Hindlll 5' I I 3' -1-1 MFai (c) Kappaleet 34 ja 35 ligoidaan käyttäen T4-ligaasia, jolloin saadaan pai-ADHt (6,5 ke).

EcoRI Hindlll XhoI Sali *5- 1 1_1_I 3'* | HHHuuuuRRRHHHH |

MF OMI AmpR

AmpR = Ampieilliiniresistensei.

H = ADHt 3'-pää.

u = Ura 3 R = Repii I ja replikoinnin aloituskohta.

MF 1 = Promoottori ja signaalisekvenssi MF ai-geeni 1le.

Kartta 19. p l-FK2K2A:n konstruointi (a> Plaemidi pFK2K2A (kartta 12) leikataan BglII:lla, jolloin saadaan kappale 36 <2,0 ke), joka eristetään geelillä.

90 97809

Kappale 36

Bglll Xbal Hpal Mstl Ball Bglll

I I I_I I I

FFFFFF kkkkkkk kkkkkkk AAAAAAA NNNNNNN

<b) Plaemidi pal-ADHt leikataan Hindi II:11a ja XhoI:llä, päät täytetään osaksi Klenow-entsyymi1lä emästen adenoeiini ja guanosiini läsnä ollessa, ja käsitellään Mung-pavun nukleaa-silla, jolloin saadaan kappale 37 (5,6 ke), joka eristetään geeli 1lä.

Kappale 37

XhoI Hindlll 3' J_I 5' HHHH uuuuuRRRRRHHHHH | MF ai (c) Kappaleet 36 ja 37 ligoidaan, jolloin muodostuu pal-FK2K2A (7,6 ke).

Hindi II Xbal Hpal Mstl Ball XhoI

**' I I 1 I 1 I_3'*

FFFFFF kkk kkk AAAAAAA NNNNNNNHHHuuuRRHH

MFal = Promoottori ja eignaalisekvenssi MFCtl-geenille.

F = Sormi.

k = Silmukka 2-alue.

A = Aktiivinen paikka.

N = Lukematon 3'-sekvenssi.

H = ADHt 3'-pää.

u = URA3 R = Repi II ja replikoinnin aloituskohta.

97809 91

Kartta 20. pSVCOW7:n konstruointi <a) Plaamidi pSV2dhfr leikataan BamHI:llä ja EcoRI:llä, jolloin saadaan kappale 38 (5,0 ke).

Kappale 38

BamHI PvuII Hindi II EcoRI

I I I_ I

dhf rSV40AmpR

<b> Plasmidi p\GH2R2 leikataan BamHI:llä ja EcoRI tila, jolloin saadaan kappale 38 (5,0 ke).

Kappale 39

EcoRI PvuII Peti BamHI

1 I_I_1

AAAGGGII IGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG

(c) Kappaleet 38 ja 39 ligoidaan, jolloin saadaan pSVCOW7 (7,1 ke).

pSVCOW7

EcoRI PvuII Pst I BamHI PvuII Hindi II

* I I 1 I I I

AAAGGGIIGGGGGGGGGG j | |

dhf r SV40 AmpR

A = Haudan kasvuhormonin poly A-pää.

G = Genominen naudan kasvuhormoni.

I = Introni.

dhfr = Dihydrofolaattireduktaaei.

SV40 = SV40-promoottori ja replikoinnin aloituskohta.

AmpR = Ampieilliinireeietenesi.

97809 92

Kartta 21. pTPAcDNA. BamHI:n konstruointi <a) Plaemidi pTPA5'cDNA (kartta 5, osa a) leikataan Hgal:llä, ja kappale 40 (517 ep) tehdään taaapäieekei Klenowin avulla ja ligoidaan 10-meerieeen BamHI-linkkeriin. Kappale 40 katkaistaan Narl-.llä, jolloin saadaan kappale 41 (440 ep), joka sisältää TPAcDNAtn emäkset 78-518.

Kappale 40

BamHI Bglll Narl BamHI

_I_I I

LLLTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT ^— 440 —} <b) Plaemidi pTPAcDNA (kartta 5) leikataan Narlrllä ja Bglll:11a, ja kappale 42 < 1644 ep) , joka sisältää TPAcDNA:n 3'-osan, eristetään geelillä.

Kappale 42

Narl Hgal EcoRI EcoRI Bglll

L I I 1 I

PPPPPPPPPPPPPP AAAAAAAAANNNNNNNNN

(c) Plaemidi pKC7 leikataan BamHI:llä ja Bglll:11a, jolloin saadaan kappale 43 (4,3 ke), joka eristetään geelillä ja ligoidaan kappaleiden 41 ja 42 kanssa, jolloin saadaan pTPAcDNA, BamHI (6,5 ke).

pTPAcDNA, BamHI

BamHI Bglll Ball Bglll * I I_I I__ *

LLLLTTTTPPPPNNNNN NNNNNN

AmpR

ii «tr» nm in «# 97809 93

Kartta 21. (jatkoa) L = Esisekvenssi.

T = TPAcDNA:n 5'-osa.

P = TPAcDNA:n keskiosa.

A = TPAcDNAtn 3'-osa.

N = TPAcDNArn lukematon 3'-osa.

94 97809

Kartta 22. pTPA-IE-PA:n konstruointi (a) Plasmidi pSVCOW7 leikataan EcoRI:llä ja PvuII:lla, jolloin saadaan kappale 44 <600 ep>, joka sisältää naudan kasvuhormonin polyadenylaatiosekvenssin, joka kappale eristetään geelillä.

Kappale 44

EcoRI PvuI I

I_1 aaaaaaaaaaaaaaaaaa <b) Plasmidi pSVCOW7 (kartta 20) leikataan EcoRI:llä ja BamHI:llä, jolloin saadaan kappale 45 <5,8 ke).

Kappale 45

BamHI EcoRI

i i i

dhfr SV40 Ori AmpR

(c) Plasmidi pTPAcDNA, BamHI (kartta 21) leikataan BamHI:llä ja Ballilla, jolloin saadaan kappale 46 <2,0 ke).

Kappale 46

BamHI Bglll Ball

LLLLLTTTTTPPPPPAAAAANNNNNNNNNNNNNNNNN

(d) Kappaleet 44, 45 ja 46 ligoidaan, jolloin muodostuu pTPA-PA <8,4 ke).

ϋ m i nm i um i 97809 95

Kartta 22. (jatkoa) pTPA-PA

EcoRI BamHI Bglll Ball * I I I_L * | | || LLLTTTTPPPAAANNNNNaaa

AmpR Ori SV40 dhfr

Plasmidi pTPA-PA leikataan BamHI:llä, ja CMV-IE-promoottori (760 ep) CMV-genomin Peti- ja Sau3AI-hydrolyysistä liitetään, jolloin muodostuu pTPA-IE-PA.

pTPA-IE-PA

Ball

EcoRI Sau3A Sau3A BamHI Bglll *5' | III 3'* | | | ^ LLLL TTPPAA NNNNaaa

AmpR Ori SV 40 dhfr CMV

AmpR = Ampieilliinireeietenesi.

Ori = pBR322:n replikoinnin aloituskohta.

SV40/ori = Simian viruksen replikoinnin aloituskohta.

Mo/dhfr = Hiiren dihydrofolaattiredukataasin markkeri.

CMV/Prom = Sytomegaloviruksen promoottori.

L = TPA-esisekvenssi.

T = TPAcDNA:n 5'-alue.

P = TPAcDNA:n keskialue.

A = TPAcDNA:n 3'-alue.

N = TPAcDNA:n lukematon 3'-alue.

a = Polyadenylaation signaalisekvenssi.

97809 96

Kartta 23. pTPA-IE-FK2K2A:n konstruointi <a) pTPA-IE-PA (kartta 22) leikataan BamHI:llä ja BglII:lla, jolloin saadaan kappale 47 (120 ep), joka eristetään geelillä.

Kappale 47

Ball Bflll I_l

LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL

(b) Plasmidi pSVC0W7 leikataan EcoRI:llä ja PvuII:lla, jolloin saadaan kappale 48 (600 ep), joka sisältää naudan kasvuhormonin polyadenylaatiosekvenssin, joka kappale eristetään geeli 1lä.

Kappale 48

EcoRI PvulI

aaaaaaaaaaaaaaaaaa (c) Plasmidi pFK2K2A (kartta 12) leikataan BglII:lla ja Ball:llä, jolloin saadaan kappale 49 (1,7 ke), joka eristetään geelillä.

Kappale 49

Bglll Xbal HpaI Mstl Ball

III I_I

FFFFFF kkk kkk AAAAAANNNNNNNN

(d) Plasmidi pSVCOW7 (kartta 20) leikataan EcoRI:llä ja BamHI:llä, jolloin saadaan kappale 50.

Kartta 23. (jatkoa) 97 97809

Kappale 50

BamHI EcoRI

J-1-1-1

dhfr SV40 Ori AmpR

<e> Kappaleet 47, 48 ja 50 ligoidaan käyttäen T4-ligaaeia, jolloin saadaan pTPAFK2K2A <8,3 ke).

pTPAFK2K2A

EcoRI BamHI Bglll MstI

*5' | III 3'* | | j | LLLLL FF kk kk AANNaaa

AmpR Ori SV40 dhfr <f) Plasmidi pTPAFK2K2A leikataan BamHI:llä, ja CMV-IE-promoottori (760 ep) CMV-genomin Peti- ja Sau3AI-hydrolyysie-tä liitetään, jolloin muodostuu pTPA-IE-FK2K2A.

pTPA-IE-FK2K2A

Ball

EcoRI Sau3A Sau3A BamHI Bglll *5' | III 3'* | | | | LLLL TTPPAA NNNaaa

AmpR Ori 5V40 dhfr CMV

AmpR = Ampisilliiniresietenesi.

Ori = pBR322:n replikoinnin aloituskohta.

SV40 = Simian viruksen replikoinnin aloituskohta.

Mo/dhfr = Hiiren dihydrofolaattireduktaasin markkeri.

CMV/Prom= Sytomegaloviruksen promoottori.

L = TPA-esisekvenssi.

Kartta 23. (jatkoa) 98 97809 T = TPAcDNAtn 5'-alue.

P = TPAcDNArn keskialue.

F = Sormidomeni.

k = S ilmukka 2.

A = Aktiivinen paikka.

N = TPAcDNA:n lukematon 3'-alue.

a = Polyadenylaation eignaa1isekvenesi.

97809 99

Kartta 24. pAcTPA-.π konstruointi (a) Plaemidi pAc373 (7,1 ke) leikataan BamHI:llä, ja eitä käsitellään mung-pavun nukleaaeilla päiden tasoittamisekei, joihin päihin lisätään BglII-linkkerit. Päät yhdistetään uudelleen, jolloin saadaan pAc373, Bglll.

pAc373

Hindi II EcoRI EcoRV BamHI Hindi II

* I 1 I II I_*

AmpR Poly

pAc373, BglII

Hindlll EcoRI EcoRV BglII Hindi II

* I l III

AmpR Poly <b) Plaemidi pTPAcDNA, BamHI (kartta 21) leikataan BamHI:llä ja hydrolysoidaan osittain BglII:lla, jolloin saadaan kappale 51 (1,95 ke) joka sisältää käsittelemättömän TPAcDNArn.

Kappale 51

BamHI BglII BglII

I_I_I

LLLLLLLLL TTT PPP AAA NNN

(c) Kappale 51 liitetään ja ligoidaan pAc373, BglII:n Bglll-paikkaan, jolloin saadaan pAcTPA (9,05 ke).

Hindlll EcoRI EcoRV Bglll Bglll * 1_J_I I I *

LLLLLL TTTPPPAAANNN

AmpR

Kartta 24. (jatkoa) 100 97809 L = Eeieekvenssi.

T = TPAcDNA:n 5'-osa.

P = TPAcDNA:n keskiosa.

A = TPAcDNArn 3'-osa.

N = TPAcDNA:n lukematon 3'-osa.

AmpR = Ampisilliiniresistenssi.

Poly = Polyhedriiniproteiinin geeni.

97809 101

Kartta 25. pAcFK2K2A:n konstruointi (a) pAcTPA (kartta 24) leikataan Bglll:11a, jolloin saadaan kappale 52 <7,15 ke).

Kappale 52

Bglll Hindlll EcoRI EcoRV BamHI Bglll I I ,_I_I_I_1

LLLLLL

AmpR

<b) Plasmidi pFK2K2A (kartta 12) leikataan Bglll:11a, ja cDNA-analogi eristetään geelillä kappaleena 53 (2,0 ke).

Kappale 53

Bglll Xbal Hpal Mstl Ball Bglll I_I_1_I_I_1

FFFFFF kkkkkkk kkkkkkk AAAAAAA NNNNNNN

<c) Kappaleet 52 ja 53 ligoidaan, jolloin muodostuu pAcFK2K2A (9,15 ke) .

L = Esisekvenssi.

F = Sormidomeeni.

k = Silmukka 2-domeeni.

A = Aktiivisen paikan domeeni.

N = TPAcDNA:n lukematon 3'-osa.

AmpR = Ampisilliiniresietensei.

Claims (2)

97809

1. Rekombinant-DNA-molekyl som kodar en tPA-analog innehällan-de tPA-aktivpositionen A, tPA-fingerdomänen F och tPA-kringla-2-domänen K2, kännetecknad av att nämnda DNA-molekyl innehäller icke-nativa endonukleasrestriktionspositioner i sekvenssen, som kodar regioner mellan domänerna, och att ordning av nämnda do-mänerna frän aminoterminal är F, K2 och A, varvid nukleotid- « sekvensen av nämnda rekombinant-DNA-molekyl är, säsom visats i figur 1, frän nukleotiden 190 tili nukleotiden 342 (F) , frän nukleotiden 727 tili nukleotiden 999 (K2), och frän nukleotiden 1000 tili nukleotiden 1782 (A).

1. Rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa tPA-analogia, joka käsittää tPA-aktiivikohdan A, tPA-sormidomeenin F ja tPA-silmuk-ka-2-domeenin K2, tunnettu siitä, että mainittu DNA-molekyyli sisältää ei-natiiveja restriktioendonukleaasikohtia sekvenssissä, joka koodaa domeenien välisiä alueita ja että mainittujen domeenien järjestys aminopäästä on F, K2 ja A, jonka rekombi-nantti-DNA-molekyylin nukleotidisekvenssi on, kuten kuviossa 1 on esitetty, nukleotidistä 190 nukleotidiin 342 (F) , nukleotidistä 727 nukleotidiin 999 (K2) ja nukleotidistä 1000 nukleotidiin 1782 (A) .

2. Isäntäsolu, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen rekombinantti-DNA-molekyylin, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on kiinanhamsterin munasarjasolu tai E. coli -solu.

2. Värdcell innehällande en rekombinant-DNA-molekyl enligt patentkrav 1, kännetecknad av att nämnda värdcell är en kinesiska hamsterovariumcell eller en E. coli -cell. '1 til l. Will I..1IU