JPS63501841A - 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−（ｔｐａ）同族体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｅ、スボドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ ａ　）ｆ、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　）　；およびｇ、哺 乳動物細胞 の群から得られたものである前記第１０項の化合物を含有する宿主細胞。

明　細　書 組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）同族体 発明の背景 発明の分野 本発明はヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ＴＰＡ）同族体を開示する 。該同族体は天然ドメイン領域が再配置された、欠失された、付加されたまたは それらを組合せた処理をされたのいずれかであるＴＰＡ様分子である。該同族体 は本明細書中に同様に記載する組換体デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の発現の産生 物である。さらに、本発明は前記ＴＰＡ−コーディングＤＮＡ配列を含有する複 製および発現プラスミドならびに適当なプラスミドで形質転換された状態となっ た後ＴＰＡ同族体を発現することができる適当な宿主微生物を記載する。

背景 ＴＰＡは、血餅が形成されるときに該血餅を溶解するのを補助することによって 血液凝固を治療するのに治療価値を有する。血栓崩壊はフィブリン塊溶解の過程 である。その目的のためには、その不活性チモーゲン、プラスミノーゲンからセ リンプロテアーゼプラスミンが形成される。プラスミノーゲンの活性化はプラス ミノーゲンアクチベーターと呼ばれる一群のセリンプロテアーゼによる蛋白質加 水分解切断によって達成される。これらのアクチベーターはほとんどの体液中に 存在し、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を開始する。これにより、少 量のプラスミノーゲンアクチベーターが多量のプラスミノーゲンを活性化するこ とができるカスケードがつくられる。ｉｎ　ｖｉｖｏ　において、プラスミノー ゲンアクチベーターはプラスミノ−・ゲンをプラスミンに活性化し、次いでプラ スミンが作用してフィブリン塊を分解する。血餅溶解に対して生理学的に重要で あるプラスミノーゲンアクチベーターはＴＰＡである。

ＴＰＡは、血管内皮細胞によって産生される分子量が約６６０００ダルトンのセ リンプロテアーゼである。それはグリコジル化されており、その唯一の公知蛋白 質基質はプラスミノーゲンである。ＴＰＡは５種のドメイン：フィブロネクチン フィンガー（ｆｉｎｇｅｔ）ドメイン（Ｆ）、発育因子（ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃ ｔｏｒ）ドメイン（Ｇ）、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　１ドメイン（Ｋｌ ）　、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２ドメイン（Ｋ２）および活性部位ド メイン（Ａ）を有する。これらのドメインの１またはそれ以上はＴＰＡの特別の フィブリン結合活性を担っている。

そのフィブリン親和性に加え、プラスミノーゲンの活性化はフィブリンの存在に おいて促進される。ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼの如き他の血餅分解 薬剤はフィブリン塊に対する特異性を全く持っていないので、これらの特性はＴ ＰＡを価値ある治療剤とする。

該ドメインを操作することによって、フィブリンに対する天然酵素の親和性を改 良しミそのｉｎ　ｖｉｖｏ　半減期を増大させることが可能である。より具体的 には、クリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２またはフィンガー（Ｆ　ｉｎｇｅｒ 　）ドメインの複製はフィブリン親和性を促進するであろう。

発育因子ドメインの除去はｉｌ　ｖｉｖｏ　半減期を増加させ、フィンガー（ｆ ｉｎｇｅｒ　）領域ドメインをクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）領域１または２の 次に置くとフィブリン親和性を高めるであろう。

ヒ）　ＴＰＡは精製され、その物理特性が研究されてきた。リジケンら（Ｒｉｊ ｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　）、「培養中のヒト黒色腫細胞により分泌されたプラス ミノーゲンアクチベーターの精製および特徴づけ」、ジャーナル・オブ・バイオ ロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　、２５６巻、黒１ ３．７０３５〜４１頁（１９８１年７月１０日）。

実験量のヒ）　’ｒｐＡはヒト黒色腫細胞の培地から得られる。クルフト・シイ ら（ＫｌｕｆｔＳＣｅｔ　ａｌ、　）、アドバーンシズ・イン・バイオテクノロ ジカル・プロセシズ（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｃｈｎｏｌｏｇｉ ｃａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　）中の［ヒト黒色腫細胞からの外来性（組織タイ プ）プラスミノーゲンアクチベーターの大規模産生」、ミズラヒ・エイおよびウ エゼル・エイ・工／Ｌ／　（Ｍｉｚｒａｈｉ　％Ａ、　ａｎｄ　Ｗｅｚｅｌ　、 　Ａ、　Ｌ。

〕編、２：９７〜１１０（１９８３）。ヒトＴＰＡのバイオ活性は研究されてお り、生命を脅かす血液凝固物を分解するその能力により、動物モデルおよびヒト において治療価値を有することが証明されている。コルニンガーら（Ｋｏｒｎｉ ｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）、「大腿静脈血栓症を有するイヌにおけるヒト外来 性（組織タイプ）プラスミノーゲンアクチベーターを用いる血栓崩壊Ｊ、ジャー ナル・オブ・クリニカル・インベステイゲーション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　）、６９巻、５７３〜５８０頁（１９８２年３月）；シイマー ルら（Ｗｅｉｍａｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　、ｒ外来性（組織タイプ）プラスミノ ーゲンアクチベーターの投与による腸骨大腿血栓の特異的溶解」、ザ・ランセラ ！−（ＴｈｅＬａｎｃｅｔ　）、１０１８〜２０頁（１９８１年１１月７日）； およびバフ−デー＋７エ／Ｉ、’７、エフら（Ｖａｎ　Ｄｅ　Ｗｅｒｆ　１Ｆ、 　ｅｔａｌ、）、進展した心筋梗塞を持つ患者における組織タイププラスミノー ゲンアクチベーターを用いる冠血栓崩壊、ジャーナル・オブ・ニュー・イングラ ンド・メデイシン（Ｊ、、ｏｆ　Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｍｅｄ、　）、３１０：６０ ９〜６１３（１９８４）。ＴＰＡの半減期は２〜３分であると見積られており、 そのため、非実用的ではないにせよ、治療剤として使用するには不都合となって いる。コレン、ディら（Ｃｏ１１ｅｎ　、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ−）、組織タイブ プラスミノーゲンアクチベーターを用いる血塊−選択的冠血栓崩壊、サイエンス （５ｃｉｅｎｃｅ　）、２２０　：１１８１〜１１８３（１９８３）。

ＴＰＡの酵素反応機構は研究されてきた。リジケンら（Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ａ ｌ、　）、「−重鎖および二本鎖ヒト外来性（組織タイプ）プラスミノーゲンア クチベーターのフィブリン溶解現象特性」、ジャーナル・オブ・バイオロジカＪ Ｖ−ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　、２５７巻：２９２０〜 ２９２５（１９８２）。他の動物の血塊についてよりもヒト血塊についてより優 れたヒ）　ＴＰＡの結合親和性およびフィブリン溶解親和性は公知である。コル ニンガーら（Ｋｏｒｎｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　）、ｒ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏで のヒト血液および各種動物種におけるヒト外来性（組織タイプ）プラスミノーゲ ンアクチベーターの特異的フィブリン溶解現象特性についての研究」、スロンボ ウシス・アンド・ヘマトスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、 　）、４６Ｃ２）：５６１〜５６５　（１９８１）。フィブリン溶解活性および 親和性に関するドメインの構造関係も記載されてきた。バヌアイ・エルら（Ｂａ ｎｙａｉ　、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、）、フィブロネクチンおよび組織タイププラ スミノーゲンアクチベーターのフィブリン結合構造の共通の進化的起源、エフ・ イー・ビイ・ニス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）、１６３（１）：３７〜 ４１　（１９８３）およびヌイ・ティら（Ｎｙ、Ｔ、ｅｔａｌ、）、ヒト組織タ イププラスミノーゲンアクチベーター遺伝子の構造：機能および構造ドメインに 対するイントロンおよびエクソン構造の関係、プロシーデイングズ・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　１８１　：　５３５５〜５３５９　（１９８４）。

形質転換した細菌および酵母によるＴＰＡの発現も公知である。ヒトＴＰＡのメ ツセンジャーリボ核酸（ＲＮＡ）は最初１９８２年に単離された。オプデンアツ カーら（Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）、「ヒト組織プラスミノーゲ ンアクチベーターについてのメツセンジャーＲＮＡ」、ニアロビーアン・ジャー ナル・オブ・バイオロジー（Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　）、２６９〜７４頁（１９８２）。ペニカら（Ｐｅｎｎｉｃａｅｔ 　ａｌ、　）　によって、ＴＰＡの発現用に細菌が形質転換さプラスミノーゲン アクチベーターｃ　ＤＮＡのクローニングおよび発現」、ネイチャー（Ｎａｔｕ ｒｅ　）、３０１：２１４〜２１　（１９８３）。ヒ）　ＴＰＡを発現するため の酵母を形質転換する方法は米国特許出願ＳＮ　６６３０２５号および公開され たヨーロッパ特許出願ＥＰ　１４３０８１号に記載され本発明は、遺伝子組換え によって天然ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターのドメイン領域を再配置 する仁とによる該蛋白質の改良された薬理学効果に関する。該改良された効果は 延長された半減期および増大されたフィブリン親和性を包含する。本明細書中に て開示するのは、ドメインの好都合な切断および再配置に有用であるユニークな 制限部位をＴＰＡのインタードメイン領域内に含有するＤＮＡ配列である。また 、このＴＰＡをコード付けするＤＮＡを含有するプラスミドおよび再配置された ＴＰＡを発現する適当な宿主も開示する。最後に再配置したＴＰＡ蛋白質を記載 する。

具体的には、本発明は、活性部位ならびにフィンガー　（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメ イン（Ｆ）、発育因子ドメイン（Ｇ）、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　１ド メイン（Ｋ１）およびクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２ドメイン（Ｋ２）よ りなる群から選択される１またはそれ以上のドメインよりなり、＝（ａ）インタ ードメイン領域をコード付けするヌクレオチド配列内に、該ドメイン領域をコー ド付けするヌクレオチド配列中には存在しない非天然エンドヌクレアーゼ制限部 位を含有し、（ｂ）　９００００ダルトン以下の分子量を有するＴＰＡ様蛋白質 をコード付けし、ここに該ドメインが２回以上現われないことを特徴とするＴＰ Ａ様蛋白質についてコード付けするヌクレオチド塩基よりなるＤＮＡ化合物を記 載する。

さらに具体的には、Ｘｂａ部位がヌクレオチド塩基１８７〜１９８間に挿入され 、ＨｐａＩ　もしくはＳｐａ　Ｉ部位またはそれらの組合せがヌクレオチド塩基 ３２８〜３４２間に挿入され、ＥｃｏＲＶ　、　Ｃ１ａＩ　、もしくはＳｍａＩ 部位またはそれらの組合せがヌクレオチド塩基４４２〜４６２間に挿入され、Ｂ ａｍＨＩ　もしくはＨｐａＩ部位またはそれらの組合せがヌクレオチド塩基７０ ９〜７２６間に挿入され、およびＭｓｔＩ　、５ｐｈＩ、もしくはＸｍａｍ部位 またはそれらの組合せがヌクレオチド塩基９７３〜９９７間に挿入された前記Ｔ ＰＡ−コーディングＤＮＡの化合物を本明細書中にて開示する。

前記したそれらのＴＰＡ−コーディングＤＮＡ配列のうちには、ドメイン領域に ついてコード付けするヌクレオチドの配列がそれらの順序、出現または双方に関 して天然の配置から変えられたものがある。さらに具体的には、ＤＮＡが、該ド メインがアミノ末端から（ａ）ＦＡ；（ｂｌ　ＦＧＫＩ　Ａ　；　（ｃ）　ＦＧ Ｋ２Ａ；（ｄ）　ＦＫ２Ａ　；　（ｅ）　ＦＫＩＫ２Ａ　；　（ｆ）ＦＫ２に２ Ａ　ｉおよび、（ｇ）ＦＧＫＩＫ２Ａの順序で並べられたＴＰＡ様蛋白質につい てコード付けするＴＰＡコーディングＤＮＡ配列を本明細書中にて開示する。

さらに、ＴＰＡ様蛋白質をコード付けする配列から上流および下流の双方のヌク レオチド配列が化合物を適当な宿主中で維持されることを可能とする前記した如 きＴＰＡ−コーディングＤＮＡ配列の化合物がある。さらに具体的には、発現さ れる蛋白質の総分子量が９００００ダルトンを超えずかつドメインが２回以上現 われない場合、適当な宿主細胞がドメイン領域がその順序、出現または双方にお いて変化されたＴＰＡ様蛋白質特にそれらの同族体を発現できるようにすること もできる化合物を本明細書中に記載する。なおさらに具体的には、ドメインがア ミノ末端から次のように：　（ａｌ　ＦＡ　；　（ｂｌＦＧＫＩＡ　；　（ｃ） 　ＦＧＫ２Ａ　；　ｆｄｌ　ＦＡ２Ａ　；　（ｅｌ　ＦＫＩＫ２Ａ　；　（ｆ） ＦＫ２に２Ａｉ（ｇｌＦＫＩＡまたは（ｈｌ　ＦＧＫＩＫ２Ａの順で並べられた ＴＰＡ様蛋白質についてコード付けするＤＮＡを含有する発現および複製プラス ミド（ベクター〕を本明細書中に記載する。

前記プラスミドであって再配置されたＴＰＡ蛋白質の発現用のものを維持するこ とができる適当な宿主微生物も本明細書中に記載する。例えば、適当な宿主が＝ （ａｌ酵母白ｂ）エシェリヒア種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）　；および、（ ｃｌ細胞培養物よりなる群から選択される、ＴＰＡ様蛋白質についてフード付け するＤＮＡ配列を含有する発現および非発現ベクターを本明細書中に記載する。

さらに具体的には、適当な宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細 胞である、ＴＰＡ様蛋白質についてコード付けするＤＮＡ配列を含有する好まし い発現ベクターを本明細書中に記載する。

最後に、活性部位（Ａ）ならびにフィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメインｆＦｌ 、発育因子ドメイン（Ｇｌ、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）１ドメイン（Ｋｌ） 　、およびクリング／Ｌ／　（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２ドメイン（Ｋ２）よりな る群から選択される１またはそれ以上のドメインよりなり、発現される蛋白質の 総分子量が９００００ダルトンを超えずかつドメインが２回以上現われない場合 、該ドメイン領域がそれらの順序、出現またはその双方に関して天然配置から変 えられたＴＰＡ様蛋白質の化合物を本明細書中に記載する。以下のＴＰＡドメイ ンの配置が好ましい：　ｉａ）　ＦＡ　；（ｂ）　ＦＧＫＩＡ　；（ｃ）　ＦＧ Ｋ２Ａ　；　（ｄ）　ＦＫ２Ａ　；　（ｅ）　ＦＫＩＫ２Ａ　；　（ｆ）　ＦＫ ２に２Ａ　；および（ｇｌ　ＦＫＩＡ　０ 本発明は、種々の公知方法で達成することができる一連の分子遺伝子操作を含む 。ＴＰＡのドメイン間にユニークなエンドヌクレアーゼ制限部位を有する２種の 始原型遺伝子はブダペスト条約に従って寄託した。宿主微生物は、各々チャー） １０および１１に示すｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３．４（ａ）およびｐＴＰＡ−Ｂｌ 、２．３．４　と名付けたプラスミドを含有するイー・コ’）　（Ｅ、ｃｏｌｉ ）株である。ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３．４（ａ）の寄託は１９８６年８月２９日 に米国、イリノイ州、ベオリア（Ｐｅｏｒｉａ　）　、ノーザン・リージョナル ・リサーチ・センター（ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｃｅｎｔｅｒ　）に対してなし、与えられた受託番号はＮＲＲＬ　Ｂ−１８１ ０６であった。ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３．４の寄託は１９８６年１１月２８日に 米国、イリノイ州、ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ　）　ｓノーザン・リージョナル・ リサーチ０センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｃｅｎｔｅｒ）に対してなし、与えられた受託番号はＮＲＲＬ　Ｂ−１８１４ ２であった。

寄託されたプラスミドは断じて本発明を限定するものと解釈されるべきではない 。使用が容易な出発材料ではあるが、以下に別法出発材料からＴＰＡ同族体を作 製するのに利用できる各種方法を、続いて好ましい方法の具体的な実施例を詳し く記載する。

要約すると、必要な遺伝子操作は、ＴＰＡのｃ　ＤＮＡを得ること、インタード メイン領域に選択された制限部位を有する各種ＴＰＡドメインのコーディング配 列を含有するオリゴヌクレオチドのブロックの合成、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌ ｉ　）におけるドメインのクローニングおよび複製ならびに所望のＴＰＡ同族体 の発現として記載できる。

Ａ０図 第１図は、合成ＴＰＡ　ＤＮＡについての特異的配列および塩基のナンバリング 位置を天然ｃＤＮＡと比較して示す。天然ドメインは第１図のそれらの天然順列 のうちにすべて存在する。第２図は天然ＴＰＡのアミノ酸配列を、それらの正規 の順列中にすべての天然ドメインを有するＴＰＡ同族体に対して比較する（チャ ート１１参照）。両図において、上側の配列はヌクレオチドまたはアミノ酸のい ずれかの天然配列を表わし、下側の配列は修飾されたＴＰＡを表わす。第３図は ＴＰＡ同族体を合成によってつくるのに用いられるオリゴヌクレオチドを表わす 。第４図は、ドメイン領域内に含有されるアミノ酸およびヌクレオチドを示すこ とによってＴＰＡの天然順列を含有するチャート１１に記載された同族体に対し て天然ＴＰＡ蛋白質を比較する。インタードメイン領域は第４図に記載されたド メイン間に存在するアミノ酸である（定義参照）。本明細書を通じ、ヌクレオチ ドまたはアミノ酸のいずれかに対する添数字はこれらの図をいう。

Ｂ、一般的方法 一般に、本願にて必要な命名法および一般的な実験室的手法はマニアテイスーテ ィら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ。

）、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラドリーバマニュアル（Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）、コ ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）、コールド−スプリング＋／”ｉ−バー（ Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　）、ニューヨーク、１９８２中に見い 出すことができる。該マニュアルは以後マニアテイスとして参照する。

すべてのイー・コ！Ｊ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）株は、グルコースを含むルリア（ Ｌｕｒｉａ　）　・ブロス（ＬＢ）　、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）の抗生物質培地 ！２ならびにグルコースおよび酸加水分解カゼインアミノ酸を補足したＭ９培地 上で増殖させる。抗生物質耐性株はマニアテイスに記載されている薬剤濃度で維 持した。形質転換は、モリソン・ディ・エイ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、　Ａ、 　）　（１９７７）　、ジャーナＪＬ／−オブ・バタテリオロジー（Ｊ、　ｏｆ 　Ｂａｃｔ、　）、１３２：３４９〜３５１ｉまたはクラークークルテイス・ジ エイ・イーおよびクルテイス・アーｗ　（Ｃ１ａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓｌＪ、　 Ｅ、　ａｎｄ　Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｒ。

）、１９８３、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）、１０１　：３４７〜３６２、ウー・アール、グロスマ ン・エルおよびモルタフ・ケイ（Ｗｕ　、Ｒ。

、Ｇｒｏｓｓｍａｎ　、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｍｏ１ｄａｖｅ１に、　）編、アカデ ミツク・プレス（Ａ（ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）　、ニューヨークによって 記載されている方法により行った。

すべての酵素は製造業者の指示に従って用いた。コロニーハイブリダイゼーショ ンは次の方法を提供するために修飾した以外は一般にグルンスティン・エムら（ Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　）、ブロシイーデイングズ・オ ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、７２．７２巻、３９６１〜５頁（１９７５）に記載さ れている如く行う二ニトロセルロースフィルターに前記調製の細胞コロニーが含 有されるようにする。次いで、コロニー側を上にして、１．５ＭＮａＣ１，１， ５Ｍ　ＮａＯＨよりなる変性溶液中に浸漬した５−８の厚みのワットマン３ＭＭ ペーパーのベット上に該フィルターを置く。変性剤を１．５〜２分間上方にコロ ニー中に拡散させ、その時点で０．５　Ｍ　）リス・ＨＣＪｌ？、ｐＨ７，４， ２Ｘ　ＳＳＣ（Ｉ　Ｘ　５ＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１１Ｏ，０１５Ｍクエン酸 ナトリウム；ｐＨ７，１）、および２５ｍＭＥＤＴＡを含有する中和溶液に１〜 ３分間浸漬した３ＭＭペーパーの第２のベッドに該フィルターを移す。次いで、 フィルターを完全に風乾し、真空中、８０℃にて２〜４時間加熱した。

オリゴヌクレオチドプローブについてのハイブリダイゼーション条件は以前ゲデ ル・ディ・ブイら（Ｇｏｅｄｄｅｌ　、Ｄ、Ｖ、　ｅｔ　ａｌ、　）、ネイチャ ー（Ｎａｔｕｒｅ　）、２９０巻、２０〜２６頁（１９８１）によって記載され たのと同様である。

ハイブリダイゼーション後、プローブ含有溶液を除去し、保存し、４００ｍＱず つで５回交換して合計３時間、０．１チＳＤＳ　、　０．２ｘＳＳＣ中でフィル ターを洗浄する。フィルターを完全に風乾し、セットし、コダック（Ｋｏｄａｋ ）　Ｘ−ＯＭＡＴ　ＡＲフィルムおよびデュポン・クロネツクス・ライトネニン グ（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｎｅｎｉｎｇ　）と増感スクリー ンを用いるオートラジオグラフィーに一７０℃にて１６時間付す。

プラスミドの配列決定法には、ホルメス・ディ・ニスら（ＨｏｌｍｅｓｌＤ、　 Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　）、アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　、１１４巻、１９３頁ｍ１ｎｉ　ｐｒｅｐ　）を調 製する。ジデオキシ配列決定法はサンガー・エフら（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、　ｅｔ 　ａｌ、　）、［迅速ＤＮＡ配列決定法に対する助剤としての一重鎖バタテリオ ファージにおけるクローニング」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ ジー（Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）　１４３　：１６１〜１７８（１９７７） により行う。該ジデオキシ含有反応は、２分間で９０’まで加熱し、氷上でクエ ンチすることによる電気泳動で調製する。−通路当たり２〜３μｌを調製した０ 、８％配列決定法変性ポリアクリルアミドゲル上に載せ、サンガーおよびコルン ン（Ｓａｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ）、ｒＤＮＡ配列決定に対する薄い アクリルアミドゲルの使用」、エフ・イー・ビイ・ニス・レターズ（ＦＥＢＳＬ ｅｔｔ、　）　８７　：１０７〜１１０　（１９７８）により操作する。ゲルを 室温にて２〜４日間露出し、フィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−５）を 製造業者の推薦法に従って現像する。

ヌクレオチドの大きさは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれか で表わす。これらはアガロ−。

スゲルミ気泳動から見積ったものである。

Ｃ，ＴＰＡ　ｃＤＮＡ ＴＰＡ　ｃＤＮＡ　は核酸配列の活性部位部分の好都合な源であった。従って、 活性部位を化学的に合成する必要はなかった。ＴＰＡ　ｃＤＮＡ　は多数の源か ら入手可能である。研究者は、多量のＴＰＡを産生ずる細胞培養物特にボウニス （Ｂｏｗｅｓ　）黒色腫細胞から単離したメツセンジャーＲＮＡからＴＰＡ　ｃ ＤＮＡの部分を調製することを報告している。ニドランドら（Ｅｄ−１ｕｎｄ　 ｅｔ　ａｌ　、　）、「ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの一部をコー ド付けするｃＤＮＡ配列の単離」、８０巻、３４９〜３５２（１９８３年１月） ；グロ／つら（＜；ｒｏｎｏｗ　ｅｔ　ａｌ、　）、「細胞培養によるヒトプラ スミノーゲンアクチベータ−ｃ５産生」、トレンズ・イン・バイオテクノロジー （Ｔｒｅｎｄｓｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）、１巻、＆１．２６〜２ ９　（１９８３）　ｉおよびペニカら（Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ａｔ、　）、「 イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）におけるヒト組織タイププラスミ／−ゲンアクチベ ーターｃ　ＤＮＡのクローニングおよび発現」、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ　 ）、３０１巻、２１４〜２１　（１９８３年１月２０日）。

さらに詳しくは、ジエネンテク・インコーホレイティラド（Ｇｅｎｅｎｊｅｃｈ 　、　Ｉｎｃ、　）は、各々１９８２年５月５日；。

１９８２年７月１４日および１９８３年４月７日の出願日付を有する米国特許出 願番号３７４８６０号ｉ　３９８００３号および４８３０５２号に基づく優先権 を主張して１９８３年５月４日にヨーロッパ特許出願（００９３６１９号）を行 つたが、以後これをジエネンテク出願として参照する。

該ジエネンテク出願はＡＴＣＣ番号３１４４６のイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　） 　Ｋｌ　２株２９４、すなわちＴＰＡについてコード付けする組換体ＤＮＡ化合 物を有する形質転換体を開示している。さらに、ｒ　ＤＮＡによって形質転換さ れたイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　Ｋｌ　２株Ｗ　３１１０がそれからフィ ブリン溶解活性の検定用のＴＰＡの抽出物も調製されるＡＴＣＣ番号２７３２５ 　として該ジェネンテク出願中に開示されている。かくして、該開示は本願にて 有用な組換体ＤＮＡ化合物を含む。同様に、該ジエネンテク出願の開示は、やは りＴＰＡを発現する増幅用に形質転換したＤＨＦＲＣＨＯ−ＫＩ　（ＡＴＣＣＣ Ｌ６１）細胞を提供する。

かくして、再度、該寄託物ＡＴＣＣＣＬ６１は本願にて有用なＴＰＡについてコ ード付けする組換体ＤＮＡヌクレオチドを開示している。

本明細書における調製例２の開示は、ＴＰＡについてコード付けする組換体ＤＮ Ａ化合物を得るためのボウエ。

ス（Ｂｏｗｅｓ　）黒色腫細胞に適用できる当該分野で公知な方法のうちから１ の単離方法を当業者に提供する。該ボウニス（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞は通常公 に入手可能である。

Ｄ、ＴＰＡドメインの合成 前記の如く、ＴＰＡ同族体ＤＮＡ配列の部分はｃ　ＤＮＡから調製した；しかし ながら、はとんどの配列および全配列でさえ合成により作製することができた。

コストおよび便利さが個々のＴＰＡ同族体配列の作製法を決定するｔこおける支 配的パラメーターである。所望の同族体のＴＰＡドメイン中に見い出されない制 限部位を選択し、これらの制限部位をＴＰＡのインタードメイン領域内に挿入す ることによって、ＴＰＡ　ＤＮＡ配列の所望の部分を消化することを避け、各個 々のドメインの容易な除去および挿入が可能となる。

ＴＰＡ遺伝子の一部を化学的に合成することによって、いずれのヌクレオチドが 用いられるべきかの塩基・塩基法を決定できる。以下の利点が本性から生ずる： （１）転写産生物における二次構造の最小化；（２）自己相補性のＡＴ−ＧＣ領 域の最小化；および（３）　ｃＤＮＡ配列に沿っての所望の位置におけるユニー ク制限部位の設置。

オリゴヌクレオチドは、ニードハム・パン・デバンター・ディ・アールら（Ｎｅ ｅｄｈａｍ　Ｖａｎ　Ｄｅｖａｎｔｅｒ　、Ｄ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　）、ヌク レイツク・アシツズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　）、１ ２　：　６１５９〜６１６８（１９８４）に記載されている如く、自動合成器を 用いるベカジ・ニス・エルおよびカルサー・エム・エイチ（Ｂｅａｕｃａｇｅ　 Ｓ、　Ｌ、　ａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ　、　Ｍ、　Ｈ，）、テトラヘドロン・ レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｓ、ン、２２（２０）：　１８５ ９〜１８６２（１９８１）によって最初に記載された固相ホスホルアミダイト（ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　）・トリエステル法によって化学的に合成す れる。オリゴヌクレオチドの精製は、パーソン・ジエイ・ディおよびレグニエ・ エフ・イー（Ｐｅａｒｓｏｎ　。

Ｊ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｒｅｇｎｉｅｒ　、　Ｆ、　Ｅ、　）　、ジャーナ／Ｌ／ −オブ・り（＋？トゲラフイー（Ｊ、Ｃｈｒｏｍ、　）　、２５５　：１３７〜 １４９（１９８３）に記載されている如く、天然アクリルアミドゲル電気泳動法 または陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかによった。

オリゴデオキシヌクレオチドはヌクレオチド４０個以下の長さで化学的に合成す る。各７ラグメントはその対応する相補鎖に対して相補的となるように設計し、 各二重鎖セグメントは結びを最適化する付着末端を含有する。フラグメントの合 成用ＤＮＡの配分においては以下の基準を考慮する：１）化学的合成および精製 が容易となるようにオリゴヌクレオチドフラグメントの長さは塩基４０個以下の 長さであること　２）相補する上方および下方ヌクレオチド７ラグメントから突 出する最小６個の塩基が出現してセグメントの最適な配列列のいずれかに連結で きる塩基４個またはそれ以上の領域は避けること。

合成オリゴヌクレオチドの配列はマキサム・エイ・エムおヨヒキルバート・ダフ リュー、グロスマン・エルおよびモルダブ・ディ（Ｍａｘａｍ　、　Ａ、Ｍ、　 ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ　。

Ｗ２、Ｇｒｏｓｓｍａｎ　％Ｌ、　ａｎｄ　Ｍｏ１ｄａｖｅ、　Ｄ、　）編、ア カデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）、ニューヨーク、メン ッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 　）、６５　：　４９９〜５６０　（１９８０）の化学的分解法を用いて確認で きる。別法として、該配列は、マキサムおよびギルバート（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ 　Ｇ１１ｂｅｒｔ　）、前掲の方法、またはワレイス・アール・ビイら（Ｗａｌ ｌａｃｅ　、　Ｒ，Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、　）、ジーン（Ｇｅｎｅ　）、１６：２ １〜２６　（１９８１）の二重鎖鋳型を配列決定するための鎖末端法を用いて、 オリゴヌクレオチドフラグメントを二重鎖ＤＮＡ配列に入れる組立ての後に確認 できる。

８７種の別異のオリゴヌクレオチド（第３図）を合成した。本明細書中で開示す る特別の組立法は、チャートαυに示す選択された制限部位を有するＴＰＡ同族 体の５′部分をコード付けする最初の１０９９個の塩基対を作製するものであっ た。次いで、この合成オリゴヌクレオチドを、活性部位を含有する位置１２８７ のＥｃｏＲＩ部位にてＴＰＡ　ｃＤＮＡの３′部分に連結する。

オリゴヌクレオチドフラグメントを二本Ｍ　ＤＮＡに入れて組立てるには、アニ ーリングおよび結びのために８７種のフラグメントすべてを一緒に混合すること ができる。さらに十分な結びには、オリゴヌクレオチドを４つのブロックに分割 した方がよい。各ブロックの結びおよび精製の後、次いで４つのブロックをアニ ールし、結んで最終産生物を得ることができる。組立てたブロックおよび最終産 生物の精製はマニアナイスに記載されている如くアクリルアミドゲル電気泳動法 によって行うことができる。アニーリングおよび結びを行うには、マニアナイス に記載されている一般法も用いられる。

合成ＴＰＡ遺伝子用の開始コードンを用意する必要があるであろう。イー・コリ （Ｅ、ｃｏｌｉ）系の目的には、Ｆ−ｍｅｔ　についてコー、ド付けする開始コ ードンＡＴＧが必要である。該開始コードンは合成遺伝子中に取り込むことがで きるか、あるいは所望の発現プラスミドによって供給できる。開始コードンに加 え、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）用には、シャイン・ダルガノ領域と開始コー ドン間に適当な間隔を付与する配列をＴＰＡの合成遺伝子中に取り込むのが便利 である。

配列の適当な選択は、さもなければ転写および翻訳を防害する二次構造を最小化 し、最適なコードン使用法を併合する（グロスジーン・エイチおよびフイエルズ ・ダブリ−ｙ−−（Ｇｒｏｓｊｅａｎ　Ｈ，ａｎｄ　Ｆｉｅｒｓ　、　Ｗ、　） 、ジーン（Ｇｅｎｅ　）、１８：１９９〜２０９．１９８２　）　ｉおよびリボ ンーム結合部位あたりの配列に見い出される統計的偏りを満足させる（ボルド・ エルら（Ｇｏｌｄ　、　Ｌ−１ｅｔ　ａｌ、　）、アニュアル・レビュー・オブ ・ミクロバイオロジー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）、３５ 　：　３６５〜４０３．１９８１）。本発明についての具体的な配列はその実際 の配列により本明細書中に記載する。しかしながら、異なる宿主細胞におけるＴ ＰＡ同族体の発現を最適化するのに別法配列を用いることができることを理解さ れたい。

Ｅ、　ｃＤＮＡおよびＴＰＡ遺伝子の合成部分のクローニング ｃ　ＤＮＡおよびＴＰＡの部分についてコード付けする組換体フラグメントの複 製用のＴＰＡの合成部分をクローンするのに用いる方法は当該分野で公知の標準 方法である。ひき続いて記載するすべてのクローニングを実行するのに十分な方 法を含有するマニアナイスマニュアル。すべてのクローニングは、十分に特徴づ けされたいずれの株も有用である形質転換イー・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）において行った。特に断わらない限り、株ＨＢ１０１が好ましい。

イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）を形質転換するのに有用なりローニングベクターは ｐＢＲ３２２およびｐＫＣ７を包含する。

Ｆ、ユニーク制限部位のＤＮＡ−コーディングＴＰＡ中への挿入 ＴＰＡのインタードメイン領域について選択した具体的な制限部位はチャート１ ０および１１に示す。これらが本発明において有用である唯一の制限部位ではな い。制限部位はそれらがＴＰＡ　ｃＤＮＡにおいてユニークである塩基に基づい て選択する。インタードメイン領域に最小のアミノ酸変化を導入する部位が好ま しく、アミノ酸変化に関してサイレントである部位が最も好ましい（第１図およ び第２図参照）。インタードメイン内に異なる解読フレームを有する多重部位は 、発現の目的で他のドメインに結んだ後ドメインが同相であるのを保証するため に有用である。０重複制限部位は、単に該部位を消化し、末端を平滑末端とした 後結ぶことによって除去できる。ユニーク部位の導入は、化学的合成、商業的に 入手可能なリンカ−によって、または単一部位突然変異によって実現できる。

天然ＴＰＡ　ｃＤＮＡはチャート１０および１１に示したＴＰＡの２の始原型ｃ 　ＤＮＡ中に入れられた部位以外に、以下のエンドヌクレアーゼ制限酵素によっ て認識される部位を含有しない： ＡＣＣＩ　Ａ′ＦＬ　２　ＡＦＬ３　ＡＨＡ　３ＡＳＵ　２　ＡＶＡ　３　ＡＶ Ｒ２ＢＣＬ　ＩＢＧＬＩ　Ｂ５５Ｈ２ＨＩＮＤ３ＫＰＮＩＭＬＵＩ　ＭＳＴ２　 ＮＡＥＩＮＣＯＩＮＤＥ　Ｉ　ＮＨＥ　Ｉ　Ｎ０ＴＩ　ＮＲＵ　ｌＮ５Ｉ　Ｉ　 ＰＶＵ　Ｉ　５ＡＣ２ＳＡＬ　ｌ５ＡＵ　Ｉ　ＳＦＩ　Ｉ　ＳＮＡ　Ｉ　ＳＮＡ 　ＢＩＳＰＥ　Ｉ　ＸＨＯＩ Ｇ、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　におけるＴＰＡ同族体の発現原核系にお いてクローンした遺伝子、例えば修飾したＴＰＡ遺伝子の高いレベルの発現を得 るには、最小限、ｍＲＮＡ転写を方向づける強力なプロモーター、翻訳開始用の リポソーム結合部位および転写ターミネータ−を含有する発現ベクターを組立て ることが必須である。多量の遺伝子産生物の蓄積はしばしば細胞増殖を抑制しし かも時々細胞死をひき起こすので、産生物の合成を方向づけるのに選択したプロ モーターは、プロモーターの誘導前に細胞増殖が高密度に達、することができる ように調節されなければならない。この目的に対して適当な調節領域の例は、ヤ ノフスキイ・シイ、ケリイ・アール・エルおよびホーン・ブイ（Ｙａｎｏｆｓｋ ｙ、Ｃ０、Ｋｅｌｌｅｙ　％Ｒ，Ｌ、　ａｎｄ　Ｈｏｒｎ　、　Ｖ、　）、ジャ ーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１５８： １０１８〜１０２４　（１９８４）によって記載されている如きイー・コリ（Ｅ 、ｃｏｌｉ）　トリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーターな らびにヘルスコビイツツ・アイおよびハーゲン・ディ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　 、　１．　ａｎｄ　Ｈａｇｅｎ、Ｄ。

）、アヌーレブ・ジエネト（Ａｎｎ−Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　）、１４：３９ ９〜４４５（１９８０）によって記載されている如きフ。

アージラムダ（ＰＬ）の左方プロモーターである。イー・コ！ｊ　（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ　）　中で産生されたＴＰＡは多数のシスティン残基のために正しく折りた たまれていない。該イ然状態に戻さなくてはならない。これは、イー・コリ（Ｅ 、　ｃｏｌｉ　）　産生ＴＰＡをグアニジンＨＣＩに溶解し、すべてのシスティ ン残基をβ−メルカプトエタノールで還元することによって達成できる。次いで 、ゆっくりとした透析またはゲル濾過のいずれかによって該蛋白質を天然状態に 戻す。米国特許第４５１１５０３号。

Ｈ，酵母におけるＴＰＡ同族体の発現 酵母における異種蛋白質の発現はよく知られている。メンツズ・イン・イースト ・ジエネテイツクス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　 ）　、ジャーマン・エフら（Ｓｈｅｒｍａｎ　、　Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、　）、コ ールド・スプリング・ハーバ−ｅラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）、（１９８２）は酵母におけるＴＰＡ同族 体を産生ずるのに有用な各種方法を記載しているよく知られた研究である。

酵母における遺伝子の高レベル発現のためには、原連結すること、および酵母遺 伝子から効果的な転写上、△ ／ポリアゾニレージョン配列も供給することが必須である。有用なプロモーター の例はＧＡＬＩ、１０（ジョンストン・エムおよびディビス・アール・ダブリュ ー（Ｊ（＋ｈｎｓｔｏｎ　Ｍ、、ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、　）、モレキ ュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１１．Ｂ ｉｏｌ。

）、４：１４４０〜４８．１９８４）、ＡＤＨ２（ラッセル・ディら（Ｒｕ５ｓ ｅｌ、Ｄ、　、ｅｔ　ａｌ、　）、ジャーナ／Ｌ／−オブ・バイオロジカル・ケ ミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２５８：２６７４〜２６８２ ．１９８３）、ＰＨ０５（ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガ ナイゼイション・ジャーナル（ＥＭＭＯＪ、）、６：６７５〜６８０．１９８２ ）、およびＭＦｃｔｌである。Ｌｕｅ−２、ＵＲＡ−３、Ｔｒｐ−１、およびＨ ｉｓ−３の如き選択マーカーを有するマルチコピー（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ　）プ ラスミドもまた望ましいものである。

細胞をグルコース上で増殖させる場合、ＧＡＬおよびＡＤＨ２プロモーターは抑 制され、かくして細胞が高密度まで増殖することが可能となる。ＧＡＬプロモー ターは細胞をガラクトース培地に移すことによって作動で−きるが、ＡＤＨ２は すべてのグルコースが細胞によって利用されてしまった後作動する。ＰＨ０５プ ロモーターは培地中のリン酸塩濃度乞操作することによって作動または作動停止 できる。α接合型の宿主におけるＭＦｃｔ１Ｆｃ上−ターは終始作動状態にある が、二倍体またはα接合型を有する細胞中では作動停止の状態である。しかし、 それは１のＳＩＲ座にｔＳ突然変異を有する宿土中で温度を上げ下げすることに よって調節できる。

３５℃におけるかかる突然変異のα型細胞に対する効果はａ接合型についてコー ド付けする正常なサイレント遺伝子を作動させることにある。一方、サイレント ａ接合型遺伝子の発現はＭＦｃｔ、　１プロモーターを作動停止する。増殖の温 度を２７℃まで下げると該過程を逆に進行させ、ａ接合型を作動停止し、ＭＦ（ ｔｌを作動させる（ヘルスコビイッッ・アイおよびオーシマ・ワイ（Ｈｅｒｓｋ ｏｗｉｔｚ　、　１．　ｋ　Ｏｓｈｉｍａ　、　Ｙ、　（１９８２）、ザ・モレ キュラー・バイオロジー・オブ・ザ・イースト・サツカロミセス（ｉｎ　Ｔｈｅ 　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｓａｃｃ ｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ　）　、ストラザン・ジエイ・エヌ、ジョーンズ・イー・ ダブリューおよびブローチ・ジエイ・アール（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ　、　Ｊ、Ｎ 、、Ｊｏｎｅｓ、　Ｅ、Ｗ、、＆　Ｂｒｏａｃｈ　、　Ｊ、Ｒ，）編、コールド ・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂ、　）　、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　）　、＝−ｘ、−ヨーク、１８１〜２０９頁）。

ポリアゾニレ−ジョン配列はＡＤＨＩ　、ＭＦα１、またはＴＰＩのような高度 に発現された遺伝子のいずれの３′−末端配列によっても供給される（アルバー ト・ティおよびカワサキ・シイ（Ａｌｂｅｒｔ　、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｋａｗａｓ ａｋｉ　、　Ｇ、　）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド ・ジエネテイックス（Ｊ、　ｏｆ　Ｍｏ１．　ｋ　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、） 、１：４１９〜４３４．１９８２）。

ＹＥｐ６　、ＹＥｐ１３　、ＹＥｐ２４のような数多くの酵母発現プラスミドを ベクターとして使用できる。ＴＰＡの如き注目する遺伝子を前記のいずれのプロ モーターにも融合することができ、次いで各種酵母宿主中での発現のためのプラ スミドに結ぶことができる。前記プラスミドは文献中に詳細に記載されている（ プロスティンら（Ｂｒｏｓｔｅｉｎ　、　ｅｔ　ａｌ、　）、ジーン（Ｇｅｎｅ 　）、８　：　１７〜２４．１９７９　’；ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ、　ｅｔ 　ａｌ、　）、ジーン（Ｇｅｎｅ　）、８：１２１〜１３３．１９７９）。

前記プラスミドは酵母において外来性遺伝子を発現するのに用いることができか つ用いられたことがあるが、本明細書中にて開示するのは発現ベクターの各種成 分の挿入および／または切除に関して大いなる融通性を可能とするベクターであ る。かかる例の１つは、チャート１８に示すベクターｐα１−ＡＤＨｔである。

酵母細胞を形質転換するのに２つの方法を用いる。

１の場合、ザイモリアーゼ、リチカーゼまたはグルスラーゼを用いて酵母細胞を まずプロトプラストに変換し、続いてＤＮＡおよびポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）を添加する。該ＰＥＧ処理プロトプラストを次いで選択した条件下、３悌 アガール培地中で再生する。この方法の詳細は、ジエイ・ディ・ベグズ（Ｊ、Ｄ 、　Ｂｅｇｇｓ　）、ネイチャー（１’Ｊａｔｕｒｅ　）　（ロンドン（Ｌｏｎ ｄｏｎ　）　）、２７５：１０４〜１０９（ｉ９７８）ｉおよびヒネン・エイら （Ｈｉｎｎｅｎ　。

Ａ、、ｅｔａｌ、）　、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ、　７５　：１９２９〜１９３３（１９７８ ）による報告文中に記載されている。第２の方法は、細胞壁の除去を含まない。

その代りに、細胞を塩化もしくは酢酸リチウムおよびＰＥＧで処理し、選択した プレート上に置（（イトー−ｘイチら（Ｉｔｏ、Ｈｌ、ｅｔ　ａｔ、　）、ジャ ーナル・オブ・バグテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔ、　）、　１５３：１６３〜 １６３．１９８３）。

ＴＰＡ同族体は、細胞を溶解し、次いで標準的な蛋白質単離法を溶解物に適用す ることによって単離できる。ＴＰＡ同族体は、ウェスタンプロット法またはラジ オイム／アッセイを用いることによって検出できる。

■、細胞培養物における発現 ＴＰＡ同族体をコード付けするＤＮＡは宿主細胞培養体を形質転換するのに用い る各種発現ベクターに結ぶことができる。該ベクターはすべて、形質転換される べき宿主細胞に受容可能なＴＰＡ同族体の転写および翻訳を開始する遺伝子配列 を含有する。宿主細胞が高等動物細胞、例えば哺乳動物細胞である場合、ＴＰＡ 遺伝子の天然に生じる転写および翻訳遺伝子配列を用いることができるか、ある いは天然に生じる遺伝子配列を異種プロモーター配列と共に用いることができる 。加えて、該ベクターは好ましくは、マーカーを含有して形質転換宿主細胞の選 択のための表現型特性を提供する。さらに、複製ベクターはレプリコンを含有し てもよい。

ＴＰＡ同族体の産生に有用な細胞培養物の例は昆虫もしくは哺乳動物源の細胞で ある。哺乳動物細胞浮遊液も用いることができるが、哺乳動物細胞系はしばしば 細胞の単層形態である。哺乳動物細胞系の例はベロ（ＶＥＲＯ）　およびヘラ（ ＨｅＬａ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）　細胞系、Ｗ１３８　 、　ＢＨＫ、　ＣＯ３−７またはＭＤＣＫ細胞系である。昆虫細胞系の例はスポ ドプテラ・フルギペルダ（５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）　 （行列毛虫ヨ゛トウガ幼虫）およびボンビツクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒ　 ｉン（カイコ）を包含する。

前記の如く、ベクター、例えば宿主細胞を形質転換するのに用いるプラスミドは 好ましくはＴＰＡ遺伝子配列の転写および翻訳を開始する遺伝子配列を含有する 。これらの配列を発現制御配列という。宿主細胞が昆虫もしくは哺乳動物源のも のである場合、例えば有用な発現制御配列は５Ｖ−４０プロモーター（サイエン ス（５ｃｉｅｎｃｅ　）、２２２．５２４〜５２７、（１９８３））、ＣＭＶｌ 、Ｅ、プロモーター（プロシーデイングズ・オプ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、８１：６５９〜６６３．１９８４）またはメタロチ オネインプロモーター（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　）、２９６．３９〜４ ２（１９８２））から得られる。前記の如く、宿主細胞が哺乳動物のものである 場合、ＴＰＡ遺伝子用発現制御配列を用いることができるが、ＴＰＡ同族体を異 種転写開始部位と組合せるのが好ましい。発現制御配列を含有するプラスミドま たは複製もしくは統合ＤＮＡ物質は制限酵素を用いて切断し、要すればあるいは 所望により大きさを調節し、当該分野でよく知られた方法によってＴＰＡ同族体 についてコード付けするｃ　ＤＮＡで結ぶ。

酵母の場合の如く、高等動物宿主細胞を用いる場合、公知哺乳動物遺伝子からの ポリアゾニレ−ジョン、またはターミネータ−配列はベクター中に取り込まれて いる必要がある。ターミネータ−配列の例はウシ成長ホルモン遺伝子からのポリ アゾニレ−ジョン配列である。

さらに、宿主細胞における複製を制御する遺伝子配列を、ウシ乳頭腫ウィルス型 ベクター中で見い出されるものの如きベクター中に取り込んでよい。サベリアー カンボ・エム（Ｓａｖｅｒｉａ−Ｃａｍｐｏ、Ｍ、）、［ウシ乳頭腫ウィルスＤ ＮＡ　：真核性クローニングベクター」、ディ・エヌーエイ・クローニング（Ｄ ＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）　ＩＩ巻ア・ブラクテイカＪＬ／　・アプローチ（ａ 　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　）、ディ・エム・グローバー（Ｄ、 Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　）編、アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ 　）　、アーリントン（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　）　、バージニア州、２１３〜２ ３８頁（１９８５）。

宿主細胞は形質転換について適格であるかまたは各種方法によって適格とされる 。ＤＮＡを動物細胞に導入するいくつかのよく知られた方法がある。これらはニ リン酸カルシウム沈殿、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストでの受容体細胞の 融合、ＤＮＡを含有するリポソームでの受容体細胞の処理、ＤＮＡの細胞中への 直接マイクロインジェクションを包含する。

形質転換した細胞は当該分野でよく知られた方法により増殖させ、バイオケミカ ル・メソツズ・イン・セル・カルチャー・アンド・パイロロジー（Ｂ　ｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ　）、クチラー・アール・ジエイ、ドウデン（Ｋｕｃｈｌｅｒ　、 　Ｒ，Ｊ、　、Ｄｏｗｄｅｎ　）　、ハツチンソン・アンド・ロス・インコーホ レイティラド（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｓｓ、　Ｉｎｃ、　）、（ １９７７）、例えば当該分野でよく知られた機械的もしくは酵素的方法によって 宿主細胞系を破壊した後、宿主細胞または細胞浮遊液から蛋白質を排出する系に おいて、発現されたＴＰＡ同族体を細胞培地から収穫する。

Ｊ、　ＴＰＡ同族体の評価 ＴＰＡおよびその同族体は２つの方法のうちいずれかで評価できる。プラスミ／ −ゲンを切断してプラスミンとする相対能力を評価することができ、およびプラ スミンの産生を阻止する抑制物質の相対能力を評価することができる。かかる評 価についての手順を以下に詳しく記載する。

アミトールアッセイ。ＴＰＡ同族体の機能活性は、ベルへインエン・ジエイ・エ イチら（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ　、　Ｊ、　Ｈ，、ｅｔａｌ、）、「血漿中の測定 に適用できる外来性（組織タイプ〕プラスミノーゲンアクチベーターについての 簡単で鋭敏な分光光度計アッセイ」、スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（ Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　ｌ　４８　：　２６６〜２６９（１９ ８２）によって記載されているアミトールアッセイを用いることによって測定さ れる。略言すれば、ＴＰＡ同族体を含有する試料をプラスミノーゲンおよびＣＮ Ｂｒ消化フィブリノーゲンフラグメントと混合する。か（して形成されたプラス ミンは、次いで、系外から加えた色素生成基質、Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−バリル −し−口イシル−Ｌ−ＩＪ　シン−ｐ−ニトロアニリド二塩酸塩；　ＫＡＢＩ　 、ストックホルム、スウェーデン）を切断し、分光光度計によりモニターされる 着色生成物を生じる。プロテアーゼ抑制物質のＴＰＡ同族体に対する効果は、ベ ルへインエン・ジエイ・エイチら（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ　、　Ｊ、　Ｈ，、ｅｔ 、ａｌ、）、「ヒト血漿中の組織タイププラスミノーゲンアクチベーターについ ての連作用抑制物質の出現の証拠」、スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（ Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　）、５１：３９２〜３９５（１９８４ ）によって記載されている本アッセイの修正法を用いることによって評価される 。添加した抑制物質はＴＰＡに結合し、不可逆的な複合体を形成し、それによっ てＴＰＡがプラスミノーゲンを活性化するのを阻止する。例えば、精製された天 然ＴＰＡは増加した量の抑制物質含有試料で力価測定され、残余ＴＰＡ活性は前 記を添加した抑制物質含有試料の量の関数としてグラフに表わすことによって標 準曲線を描く。同様に、ＴＰＡ同族体を抑制物質で力価測定する。得られた曲線 をＴＰＡ標準のものと比較する。曲線間の類似度が個々の同族体の抑制に対する 感受性に直接関係する。

フィブリンオートグラフィー。ＴＰＡ同族体の分子量は、該同族体を含有する試 料をドデシル硫酸すｌ−ＩＪウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ− ＰＡＧＥ　）に付し、次いでアクリルアミドゲルをプラスミノーゲン含有フィン プリンの指示薬フィルム上に置くことによって見積られる。同族体蛋白質がアク リルアミドゲルから指示薬フィルムに拡散するに従い、それはプラスミノーゲン をプラスミンに変換し、他の場合には不滑なゾーンの形成をひき起こす。このゾ ーンの出現はアクリルアミドゲル中の対応する位置に活性なＴＰＡ同族体が存在 することを示す。この方法は、ＴＰＡ同族体とプロテアーゼ抑制物質間の相互作 用を評価するのにも用いられる。前記の如く、この相互作用の結果、同族体自身 よりも大きな分子量を有する酵素−抑制物質複合体が形成される。５ＤＳ−ＰＡ ＧＥの後、該複合体はフィブリン指示薬フィルム中で可視化される残余ＴＰＡ活 性を呈する。この方法の詳細は、最初、グラネリ・ピペ）Ｖ／−１イおよびイー ・ライナ（Ｇｒａｎｅｌｌｉ　Ｐｉｐｅｒｎｏ　。

Ａ、　ａｎｄ　Ｅ、　Ｒｅ１ｃｈ　）、「生物学的流体におけるプロテアーゼお よびプロテアーゼ−抑制物質複合体の研究」、ジャーナル・オブ・エクスペリメ ンタル・メデイシン（Ｊ−Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ−）、１４８：２２３〜２３４（１ ９７８）によって記載された。

ＴＰＡ同族体の抗原性の評価 サイドイツチ型酵素免疫測定法（Ｓ−エライヤ法）。ＴＰＡ同族体の抗原性は２ つの異なるＳ−エライヤ法により免疫学的に測定される。第１のものは、ヒト子 宮ＴＰＡについて特異的なりギ多クローン抗体を用いる。第２のものは、マウス 単クローン抗体を用いる。この単クローン抗体はＴＰＡの活性について必要なエ ピトープに対して特異的に定方向化される。ＴＰＡの活性部位ドメインに対して 特異的な抗体の使用により、その主要構造がドメインにおいて活性部位以外のも のに変化してしまったいずれのＴＰＡ同族体の抗原性も測定する効果的な方法が 提供される。このアッセイは、コルニンガー・シイら（Ｋｏｒｎｉｎｇｅｒ、　 Ｃ−１ｅｔａ１．）によって記載された方法、単クローン抗体を使用するＴＰＡ 抗原性についてのサンドイツチェライサ（Ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ　 ）法と同様のものである。スロンボウシス・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ 、　）　、４１　：　５２７〜５３５（１９８６）　、両アッセイについての感 度限界は１ｍＱ当たりＴＰＡ約１ｎｇである。

ウェスタンイムノブロッティング法。抑制物質と共に複合体を形成するＴＰＡの 能力もまた、最初トウビン・エイチら（Ｔｏｗｂｉｎ　、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　 ）　、ｒ蛋白質のポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシートへの電気 泳動的移動：方法およびいくつかの応用」、プロシーデイングズ・オプ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ　、　７６　：　４３５０〜４３５４（１９７９）　によ って記載された如く、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンイム／ブロッティング 法を用いることによって評価できる。簡単に述べると、ＴＰＡ同族体を抑制物質 と相互作用をさせ、混合物を５ＤＳ−ＰＡＧＥに付シ、蛋白質をニトロセルロー スペーパーへ電気的に移動させる。複合体化してない遊離のＴＰＡおよび抑制物 質との複合状態にあるＴＰＡの双方を、ＴＰＡに対して特異的な精製した多クロ ーンヤギＩｇＧおよびヤギＩｇＧに対して定方向化されたウサギ抗血清を用いる ことによって検出する。次いで、１１２５−ラベル蛋白質Ａおよびオートラジオ グラフィーを用いることによってＴＰＡ含有免疫複合体を可視化する。

定義 「細胞培養物」なる語はもとの植物または動物の体外で細胞が生存を維持するの を可能とする、多細胞植物もしくは動物のいずれか由来の増殖している細胞の容 器をいう。

「ドメイン」なる語は特定の機能に一致し得るアミノ酸配列の別々の連続部分を いう。ＴＰＡに関しては、前記引用文献がドメイン領域を定義しており、本明細 書中の第４図はドメイン間に存在するインタードメイン領域の中央地点のおおよ その位置を開示する。

「下流」なる語は発現の方向においてさらに進行する配列に同一であり；例えば 、コーディング領域は開始コードンより下流にある。

「インタードメイン」なる語はドメイン間に存在する蛋白質のアミノ酸配列の領 域をいう。この適用において、インタードメイン領域は第４図に示した中央地点 からプラスもしくはマイナスの５個のアミノ酸残基である。かくしてフィンガー （ｆｉｎｇｅｒ　）および発育因子ドメイン間のインタードメイン領域はアミノ 酸４４〜アミノ酸５５間に存在しかつそれらを包含し；発育因子およびクリング ル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　１ドメイン間のインタードメインはアミノ酸８６〜ア ミノ酸９７間に存在しかつそれらを包含し；クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　 １およびクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２間のインタードメインはアミノ酸 １６９〜アミノ酸１８０間に存在しかつそれらを包含し；クリングル（ｋｒｉｎ ｇｌｅ　）　２および活性部位間のインタードメインはアミノ酸２５７〜アミノ 酸２６８間に存在しかつそれらを包含する。

「維持された」なる語はプラスミドが自律複製体としてまたは宿主のゲノムの統 合部分として存在する、形質転換宿主内のプラスミドの安定な存在をいう。

「微生物」なる語は細菌、放線菌および酵母の如き単細胞の原核生物および真核 生物を共に包含する。

「非天然エンドヌクレアーゼ制限部位」なる語句は天然ｃ　ＤＮＡ配列の同等位 置に見い出されないエンドヌクレアーゼ制限部位をいう。これらはユニークおよ び非ユニーク部位を共に包含する。

「オペロン」なる語は遺伝子発現および調節の完全な単位であり、構造遺伝子、 調節遺伝子、および調節遺伝子産生物によって認識されるＤＮＡ中の制御要素を 包含する。

「プラスミド」なる語は自律的に自己複製する染色体外環状ＤＮＡをいい、発現 型および非発現型を共に包含する。組換体微生物または細胞培養物が発現プラス ミドを宿すと記載される場合、「発現プラスミド」なる語は染色体外環状ＤＮＡ および宿主染色体中に取り込まれたＤＮＡを共に包含する。

「プロモーター」なる語はＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始するのに係 るＤＮＡ領域である。

ｒ　ＤＮＡ配列」なる語はヌクレオチド塩基、アデノシン、チミジン、シトシン およびグアノシンよりなる一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子をいう。

「適当な宿主」なる語は組換体プラスミドを受容することができ、該プラスミド が複製し、そのゲノム中に取り込まれるかまたは発現されることを可能とする細 胞培養物または微生物をいう。

「上流」なる語は発現から逆の方向に進行する配列に同一であり；例えば、細菌 プロモーターは転写単位から上流にあり、開始コードンはコーディング領域がら 上流にある。

本願にとっては特別であるが、チャート１〜２７においてプラスミドおよびフラ グメントを表わすのに用いる約束はプラスミドおよびそれらのフラグメントの常 用表現と同意義であることを意味する。常用環状図とは異なり、チャート上の単 一線の図は翻訳または転写が左から右に（５′から３′に〕起こる環状および直 線状二本鎖ＤＮＡを共に表わす。星印（米）はプラスミドのグメントは二本鎖Ｄ ＮＡの直線片であるから、星印を有しない。エンドヌクレアーゼ制限部位は直線 の上方に示す。遺伝子マーカーは直線の下方に示す。プラスミドまたはフラグメ ントを表わす図表の下方の棒線はＤＮＡ上の２つの地点間の塩基対の数を示すの に用いる。マーカー間の相対的間隔は実際の距離を示すものではなく、示したＤ ＮＡ配列上のそれらの相対的位置を示すことを単に意味する。

調製例 調製例１．　ベクター−ｐＳＫ４−チャート１〜３プラスミドｐ　ＳＫ４はイー ・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）において異種蛋白質の発現を定方向化できる発現ベ クターである。それは転写を伝達するための強力な、調節可能なプロモーターお よび翻訳開始についての強力なリポソーム結合部位を有する。具体的には、ｐ　 ＳＫ４はトリプトファン（ｔｒｐ　）オペロンからのプロモーターおよびリポソ ーム結合部位（Ｒ３Ｂ）　を用いる。ＲＢＳから直ぐの下流のユニークＣ１ａＩ 部位はＴＰＡの如き望ましい遺伝子の挿入に利用できる（チャート３）。

プラスミドｐ　ＳＫ４を作製するには、公知の、）ＫＯ２（チャート２）で新規 なｐＴＲＺ　１　（チャート１）をクローンする必要がある。ラオ・アール・エ ヌおよびロジャーズ・ニス・シイ（Ｒａｏ　、Ｒ，Ｎ、　ａｎｄ　Ｒｏｇｅｒｓ 、　Ｓ、Ｇ、　）、ジーン（Ｇｅｎｅ　）、７：７９〜８２（１９７９）。プラ スミドｐＴＲＺ　１はプロモーター／オペレーター領域、＋１ボソ一ム結合部位 、およびｔｒｐＬＥ融合△ＬＥ１４１３ならびにガラクトシダーゼ（ＩａｃＺ） およびラクトースペルメアーゼ（］ａｃＹ）についての構造遺伝子を包含するｔ ｒｐオペロンの部分を含有する。プラスミドｐＫＣ７はアンピシリンおよびカナ マイシンに対する耐性を特異化し、多（ノユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位 を有スるｐ　ＢＨ３２２の誘導体である。

ｐＴＲＺ　１およびｐＫＣ７の組換体プラスミドはｔｒｐプロモーター、ＲＢＳ 、およびｐＫＣ７内のＬＥを有するｐ　ＳＫ３を生じる。次いで融合ペプチド配 列ｔｒｐＬＥ　を除去するためにプラスミドｐ　ＳＫ３を修飾して一般的な発現 べ〃ターｐＳＫ４を得る。

１）　Ｉ）ＴＲＺ　１　の組立て−チャート１プラスミドｐＴＲＺ　１は公知プ ラスミドｐＭｃ１４０３およびｐＶＶｌのクローンである。

プラスミドｐＭｃ１４０３はｐＴＲＺｌ　からＮ末端の８個のアミノ酸を除いた ｐＴＲＺｌ　の１ａｃＺ遺伝子を供給するものであり、それはカサダバン・エム ・ジエイら（Ｃａｓａｄａｂａｎ、　Ｍ、Ｊ、　、ｅｔ　ａｌ、　）、ジャーナ ル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１９８０．１ ４３　：　９７１〜９８０によって詳細に記載されている。プラスミドｐＭｃ１ ４０３は３つのユニーク制限酵素切断部位を有する。それをＥｃｏＲＩで切断し 、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化し、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ ｉ　）　ＤＮＡポリメラーゼエのクレノーフラグメントで末端を一平滑とする。

プラスミドｐＶＶ１はｔｒｐプロモーターおよびオペレーター配列を供給し、そ れはニコルス・ビイ・ビイおよびヤノフスキイ・シイ（Ｎ１ｃｏｌｓ、　Ｂ、Ｐ 、　ａｎｄ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ、　Ｃ，）、１９８３、メソツズ・イン・エンザ イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　、エル・グロス マンおヨヒケイ・モルディプ（Ｌ、　Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｋ、　Ｍｏ１ ｄａｖｅ　）編、１０１：１５５〜１６５、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）、ニューヨークによって詳細に記載されている。プラス ミドｐＶＶ１はｔｒｐ先導配列をｔｒｐＬＥを形成するｔｒｐ　Ｅ遺伝子に融合 する９５２塩基対欠失を有するｔｒｐオペロン（△ＬＥ１４１３　）を含有する 。プラスミドＰＶＶＩをＰｖｕ　ＩＩおよびＢｇｌｍで切断してフラグメント２ 　（３２’３ｂｐ）を得、これを調製アガロース電気泳動で単離する。ＢｇｌＩ Ｉ部位をクレノー酵素で満たす。次いでフラグメント２をｐＭｃ１４０３　テ結 んテｐＴＲＺ　１　を得る。

＋２１ｐｓＫ３の組立て ｐＴＲＺｌ　の構造遺伝子ＬａｃＹ　およびＬａｃＺはｐ　ＳＫ４の組立てには 不要であり、それらの欠失はより多（のクローニング部位を有するより小さいプ ラスミドを供給する。さらに、ＬａｃＹの欠失ば膜結合蛋白質の過剰産生の有害 効果を回避する。チャート２に示す如く、ｔｒｐ配列（フラグメント３）をＥｃ ｏＲＩ　／ＢａｍＨＩ　消化によってｐＴＲＺｌ　から切り出し、アルカリ性ホ スファターゼで処理して再挿入を最小化し、次いでｐＫＣ７のＥｃｏＲ工／Ｂａ ｍＨＩ領域、フラグメント４、に挿入するが、それは消化の結果もはやカナマイ シンに対する耐性を特異化しない。アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）およびカナマ イシン感受性（ＫａｎＳ）を有するクローンをｔｒｐプロモーター／オペレータ ー配列の挿入について期待される制限フラグメントについてスクリーニングを行 う。このプラスミドをｐＳＫ３で示し、その均等体はチャート２に記載されてい るとおりである。

＋３）ｐＳＫ４の組立て ｐ　ＳＫ３のｔｒｐプロモーターは、直接発現ベクターの組立には不要なｔｒｐ ＬＥペプチドをなお保持している。ｔｒｐ　Ｌ　Ｅセグメントを以下の方法によ って切り出す。

チャート３に記載した如く、ｔｒｐ配列を有するＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨフラグメ ント５をｐ　ＳＫ３から切断し、ポリアクリルアミドゲルからの電気溶出によっ て精製する。

示した如く、このフラグメントは３つのＴａｑＩ部位を含有し、そのうちの１つ はプロモーター／オペレーター領域にあり（Ｔａｑ　Ｉ″）　、そのうちの１つ はリポソーム結合部位とＴｒｐＬＥ翻訳の開始間にある（　Ｔａ　ｑ　Ｉ″′） 。該フラグメントをＴａｑＩによって部分的に消化し、フラグメントの全集合物 を先にＥｃｏＲＩおよびＣ１ａＩの双方で切断したｐ　ＢＨ３２２との結び反応 に用いる。

ＴａｑＩはＴ↓ＣＧＡ　を認識しく矢印は鎖切断点を示す）、一方Ｃ１ａ　Ｉ　 はＡＴ　！　ＣＧＡＴを認識する。これらの２の酵素は適合する付着末端を産生 じ、塩基５′ないしリポソーム結合部位およびｔｒｐＬＥ間のＴａｑ”　までは Ａであるので（ジャーナル・オブ・バタテリオロジ−（Ｊ。

ｏｆ　Ｂａｃｔ、　）、１３３：１４５７〜１４６６）　、このＴａｑ　Ｉ末端 のＣ１ａＩ末端への結びはＣ１ａＩ　部位を再生する。このクローニング機構は 単一のＴａｑ　Ｉ切断部こついて選択することに注意されたい。また、プロモー ターからの転写は時計回り方向であることを確認されたい。２７８ｂｐＥｃｏＲ Ｉ　／　Ｃ１ａ　Ｉ挿入を表示するクローン、およびｔ　ｒ’ｐプロモーターの 制限パターン特性を選択するが、それはｐ　ＳＫ４に同等であろう。Ｃ１ａＩ部 位に挿入した場合、該クローンは翻訳開始が可能な蛋白質配列の発現に有用であ る。

調製例２．　ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ−１こついてコード付けす る完全長ｃＤＮＡの単離 Ａ、材料および方法 （１）ボウニス（Ｂｏｗｅｓ　）黒色腫細胞の増殖ボウニス（Ｂｏｗｅｓ　）は ヒト自然発生黒色腫由来の株化細胞系を表わし、これはニューヨーク医科大学の ダニエル・リフキン（Ｄａｎｉｅｌ　Ｒｉｆｋｉｎ　）博士から贈られたもので ある。９５％空気／　５　Ｌｉ２ＣＯ３を用い、３７℃における湿潤雰囲気中、 １０％胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ　）および５０μｌｉ／ｒｎＱゲンタマイシン （Ｓ　ｉｇｍａ　）を補足したダルベラコラの修正イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ） 中で細胞を培養する。ＲＮＡ調製用に収穫した細胞をファルコン（Ｆａｌｃｏｎ 　）１５０ｃ′Ｉｎ　フラスコ中、接触し合うまで増殖させる。

ｔ２）　ＴＰＡ　ｍＲＮＡの調製 ボウニス（Ｂｏｗｅｓ　）黒色腫細胞からのＲＮＡを実質的にリザルデイら（Ｌ ｉｚａｒｄｉ　、　ｅｔ　ａｌ、　）、アナリテイカル・バイオケミストリー（ Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　）　、９８巻、１１６〜１２２頁（１９７９月こ よって記載されている如くに単離する。

ＤＮＡは、アビブ・エイチら（Ａｖｉｖ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　）、プロシーデ イングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　、６９巻、１４０８〜１２頁（１９７２） によって記載されている如く、オリコテオキシチミジン−セルロース（ＯｄＴ− セルロース−コル（Ｃｏｌ　）研究所〕カラムを通過させることによってポリＡ 豊富とする。別々のＯｄＴカラム上で２回選択した１０〜１５０ａ１１フフスコ からの典型的収率は約５０μｇポリＡ　ｍＲＮＡである。

１５〜３０％直線スクロースグラジェントによる遠心によってボ！Ｊ　、Ａ”ｍ ＲＮＡを分画する。滅菌蒸留水２００〜４００μｌに溶解したポリＡ”ｍＲＮＡ 　（〜３００　ｐｇ　）をグラジェント上に重ね、３５０００ｒｐｍにてベック マン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＳＷ４１　Ｔｉローター中で１８時間遠心し、ブチラー ・オート・デンシーフｏ　−（Ｂｕｃｈｌｅｒ　Ａｕｔｏ　Ｄｅｎｓｉ　−Ｆ　 ｌｏｗ　）モデル■Ｃを用いて０．５　ｍｍずつの両分を収集してトップからボ トムに収穫し、ギルソン・マイクロ（ＧｉｌｓｏｎＭ　１ｃｒｏ　）分画器（モ デルＦＣ８０−Ｋ）に連結する。各両分からの一部をクセノプス（Ｘｅｎｏｐｕ ｓ　）卵母細胞に注入し１．ミスキン・アールら（Ｍｉｓｋｉｎ　、　Ｒ，、ｅ ｔ　ａｌ、　）、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、　）、９巻、３３５５〜６３頁によって記載されているのに類似のカゼ イン−寒天プレート法によって、翻訳産生物をプラスミノーゲンアクチベーター 活性について検定する。

ＴＰＡ活性は約１９秒において移動するｍＲＮＡによって表わす。

具体的には、組織プラスミノーゲンアクチベーターＴＰＡを、プラスミ／−ゲン のプラスミン、カゼインを消化する非特異的プロテアーゼへの変換を観察するこ とによって検定する。該アッセイは以下の如くに行う。煮沸した８％カゼイン０ ．５　ｍＱを２　Ｘ　ＭＢＳ　１　ｒｎＱと混合し、５０℃まで加熱する。３％ アガロースを融解し、５０℃まで冷却する。３％アガロース０．５ｍＱをカゼイ ン／ＭＢＳに添加し、ピペットによって混合する。混合しながら１　’９　／　 ｒｎＱヒトプラスミノーゲン１００μｌを添加しく終濃度は５０μｇ／ｍＱ　） 、該物質を直径３．５αのプラスチック製ペトリ皿に注入する。アガロース溶液 を室温まで冷却する（約３０分〕。アガロース中の直径２門孔をバイオラド（Ｂ 　１ｏｒａｄ　）カッター・ゲル・パンチで切断子る。眼孔を使用直前に作成し 、ウェルをＭＢＳで満たす。アッセイの少くとも６時間前にＴＰＡＲＮＡを注入 した１または２の卵母細胞を各ウェルに加える。インキュベーションは湿らせた 皿の中で１２〜２４時間行う。カゼイン加水分解の明瞭なゾーンが容易に観察さ れる。

２倍容量のエタノールを添加し、ドライアイス上で１時間インキュベートするこ とによってＴＰＡ　ｍＲＮＡに富む両分を沈殿させる。エペンドルフ（Ｅｐｐｅ ｎｄｏｒｆ　）卓上マイクロヒュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ　）中、室温におけ る遠心により沈殿を収集し、滅菌蒸留水に溶解し、プールし、再沈殿させる。こ のＴＰＡポリＡ豊富化ｍＲＮＡはクローニング用ｃ　ＤＮＡを生成するのに用い る。

ｆ３）ｃＤＮＡの合成 すべてのこれらの反応物は氷上で組立てる。

（Ａ）　ＯｄＴよ。−０８プライマーを用いる第−鎖の合成豊富化した、ポリＡ ＋選択したボウニス（Ｂｏｗｅｓ）ｍＲＮＡ　（Ｈ２Ｏ１ｔｔ（ｌ中）の１ｏｔ ４を１０　ｍＭ　ＭｅＨｇＯＨ（アルファ（Ａｌｆａ））の存在において室温で １０分間インキュベートして二次構造のときほぐれを補助する。続いて、以下の 成分を加える；β−メルカプトエタノール〜２’　８　ｍＭ　；　ＲＮａｓｉｎ 　（バイオチク・インコーホレイティラド（Ｂｉｏｔｅｃ　Ｉｎｃ　）　１単位 ／μｇ最終反応容量；７５ｍＭ　）リス塩基ｐＨ８，３；　６　ｍＭ　ＭｇＣβ ２　ｉ　５０　ｍＭ　ＫＣβ９１０μｇオリゴデオキシチミジン（ＯｄＴ１２− １８コル（Ｃｏｔ）研究所；１００μＣｉ　α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ　（アメルス ハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）　）　；　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰ各 〜５ｏｏμｍｉ　ｄＣＴＰ〜２５０μｍ（ｆべてのヌクレオチドはビイ・エル・ バイオケミカルズ（Ｐ、Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）から入手、１０ｍ Ｍ）リス塩基ｐＨ８中に〜２０ｍＭ溶解し、ｉ、。

Ｍ　ＮａＣｊ？で中和〕および逆転写酵素（ライフ・サイエンシズ・インコーホ レイティラド（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ。

）１単位／ｐｇインプット（１ｎｐｕｔ　）　ＲＮＡ、最終反応容量５０μ１０ 反応物を４２℃にて６０分間インキュベートする。

［Ｂ）プライマーとして特異的１５一体オリゴヌクレオチドを用いる第−鎖の合 成（はぼ類似の方法についてはパナビエレス・エフら（Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓ、 　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　）、ジーン（Ｇｅｎｅ　）、１９巻、３２１〜６（１９ ８２）参照）３′ポリＡテイル部を合成始点とするｍＲＮＡからのＴＰＡについ てコード付けする完全なｃ　ＤＮＡ鎖を得るのは、前記方法を用いて常には可能 でない。恐らくポリＡテイル部から上流の配列を合成始点とすることによって、 ポリＡテイル配列で開始した不完全ｃ　ＤＮＡに連結できる５’ＴＰＡコーデイ ングｃ　ＤＮＡの配列が得られる。

ｃ　ＤＮＡ合成用のプローブまたはプライマーのいずれかとして用いるには、３ 種の１５体が好ましい。それらの配列は： ３’ＴＰＡ位置に対し、て 相補的 ５′３′ １、ＴＣＡ　ＣＧＧ　ＴＣＧ　ＣＡＴ　ＧＴＴ　１７５９〜１７７３２、ＧＧＧ 　ＧＴＴ　ＴＧＡ　ＧＴＣＴＣＧ　６３４〜６４８３、ＣＣＣＡＴＣＡＧＧ　Ａ ＴＴ　ＣＣＧ　８８６〜９００それらは前記方法によって合成され、精製される 。

ポリＡ＋選択したＲＮＡの２５μｇをプライマー（鋳型に対して５〜１０倍ピコ モル過剰のプライマー）１μｙおよび５８ｐｌ中の１．５　ｍＭ　ＥＤＴＡと共 に９０℃にてイ　。

ンキュベートす°る。最初９０℃まで加熱したｊｍＱ水浴中に浸漬することによ って、混合物をゆっくりと室温まで平衡化する。ＲＮＡ鋳型に対する該１５体を アニールシタ後、以下の試薬を加えるニジチオスレイトール（ＤＴＴ　）〜２　 ｍＭ　；　ＲＮａｓｉｎ　１単位／ｐ（ｌ最終反応容量；１００ｍＭ　）リス塩 基、ｐＨ８，３；　１１ｍＭ　ＭｇＣｎ２　；　５０ｍＭ　ＫＣ６；１００μｃ ｉα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ　ｉ各５００μｍのｄＧＴＰ　、　ｄＴＴＰ。

およびｄＡＴＰｉ２５０μＭ　ｄＣＴＰ　ｉ逆転写酵素（ライフ・サイエンス・ インコーホレイティラド（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　。

Ｉｎｃ、　）　）　〜１単位／ｐｌ／ＲＮＡ０２０℃にて３時間インキュベーシ ョンを行ない、その時点で等量の逆転写酵素をさらに加え、５０°にて３０分間 反応を継続する。

フェノール抽出によって反応を停止し、マニアナイス中に詳細に記載されている 如く、アルカリ加水分解によってＲＮＡ鋳型を除去する。

ｆｃ）第二鎖の合成 最終容量１００μｌ　で、４０　ｍＭ　ＫＰＯ４（Ｋ−ホスフェ−）　）　ｐＨ ７，５；　６．６　ｍＭ　ＭｇＣ（１２；　１　ｍＭ　ＤＴＴ；　各　５００μ ｍのｄＧＴＰ　、　ｄＴＴＰ　％ｄＡＴＡ　ｉ　２５０　ｔｔｒｎ　ｄＣＴＰ　 ｊ　ｉｏ。

μＣｉ　”Ｈ−ｄＣＴＰ　（アメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　））およびＤＮ Ａポリメラーゼクレノ＝フラグメント（ＢＲＬ）の１単位／μｇインプット（１ ｎｐｕｔ　）　ＲＮＡよりなる反応にて第二鎖を合成する。反応物を１５℃にて ４時間インキュベートするが、続いて３Ｈ−ｄＣＴＰの取込みをモニターするこ ともできる。フェノール抽出によって反応を停止し、第一エタノール沈殿の代り に（ＮａＣｇ〜０．３Ｍよりむしろ）　ＮＨ４Ａｃを２．５Ｍ加える以外は第− 鎖の合成について前記した如く二本鎖ｃＤＮＡを沈殿させる。

Ｓ工を用いてヘアピン構造を除去する。該Ｓ□反応はマニアテイスにより行う。

ＴＣＡ可溶カウントの増加によりヘアピンの除去が成功したことが測定される。

沈殿を省略してフエ／−ル抽出によって反応を停止する。

水性相をプールし、直接ポ！Ｊ　Ａ＋ｍＲＮＡの分画に用いたのと同一のスクロ ースグラジェントに付す。両分を収集し、５μ１分をアクアフルオール（Ａｑｕ ａｆｌｕｏｒ　）　シンチＬ／−ジョン流体（二ニー・イングランド・ヌクレア （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）　）　１０−中に溶解し、３２ ｐおよび３Ｈを共に測定することによって検定する。２倍容量のエタノールを加 え、ドライアイス上で３０分間インキュベートすることによって関連画分からの ｃ　ＤＮＡを沈殿サセル。エペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　）　マイクロヒ ュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ　）中、室温にて１５分間遠心することによって沈 殿物をペレット化する。ペレットを滅菌０．３Ｍ　ＮａＣ６に溶解し、プールし 、再沈殿させる。沈殿物をペレット化し、乾燥する。

（Ｄ）ｃＤＮＡのベクターＤＮＡへのティリング（ｔａｉｌｉｎｇ　）およびア ニーリング マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）によって記載されている方法によって、ｄ ＣＴＰのホモポリマー系をｃＤＮＡ分子の３′末端に酵素的に加える。理想的に は、ｄＣＴＰの１０〜３０残基を加えてクローニング効率を最大化すべきである 。

（ｐＢＲ３２２を消化してＰｓｔｌで完成し、ｄＧＴＰ残基のホモポリマー系を 添加することによって調製した）ベクターＤＮＡはニュー・イングランド・ヌク レア（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）　から商業的に入手可能であ る。該ベクターＤＮＡはマニアナイスによって記載されている方法によっても調 製できる。ベクターＤＮＡと共にｃ　ＤＮＡをアニールする方法もマニアナイス によって記載されている。簡単に述べると、１０　ｍＭ　）リスｐＨ７，４−０ ，４Ｍ　ＮａＣｌ；　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する５０ｐｌの反応において、 ティリングを行ったｃ　ＤＮＡを１：１のモル比でベクターと混合する。最終Ｄ ＮＡ濃度は２０〜６０μｙ／ｍＱ間で変化する。アニーリングは、１）６５°／ １０分；４２゜／６０分；３７°／２時間、および次いで室温での２時間よりな る定義したインキュベーション処理に付すか、または２）水浴を閉じて６５°／ １０分にてインキュベートし、次いでゆっくりと一晩で室温まで平衡化させるか のいずれかによって行う。

（Ｅ）完全長ＴＰＡ　ｃＤＮＡのクローニングおよび配列確認チャート４〜５ 既に記載した形質転換法を用いて、ｃ　ＤＮＡ含有ベクターをイ・コリ（Ｅ、ｃ ｏｌｉ　）　中に導入する。前記したハイブリダイゼーション法を用いて該細菌 をインシテユ（ｉｌ　５ｉｔｕ　）スクリーニングする。

本明細書中に記載するコロニーハイブリダイゼーションはプローブとして同様に 前記した１５体を用いる０ハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いるには、 ７０ｍＭトリス塩基（ｐＨ７，６）、１００ｍＭ　ＫＣ（１；１０ｍＭＭｇＣ１ ２，５ｍＭジチオスレイトール、および５０　μｃｉ　ｒ３２Ｐ　ｄＡＴＰ　（ ビイ・エル・バイオケミカルズ（Ｐ、Ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　）、ならびにポリヌクレオチドキナーゼにニュ ー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　） 　）　Ｉ　Ｕよりなる５ｃａ１反応容量中で、１５一体１μｙをホスホリル化す る。インキュベーションは３７゜において６０分間行う。このようにして、１５ 一体をクローンのＰｓｔ　１　制限分析を用い、プローブに対して相補性配列を 示すクローンを第二のスクリーニングについて選択して、消化産物が、第１図に 示すまたはペニカら（Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ａｌ　、　）、「イー・コリ（Ｅ 、ｃｏｌｉ　）　におけるヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベータ−ｃＤ ＮＡのクローニングおよび発現」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、３０１巻、 ２１４〜２１　頁（１９８３年１月２０日）により示された配列から得ることが できるＰｓｔ　１制限マツプと合致するかどうかを決定する。望ましいクローン はＴＰＡ　ｃＤＮＡの３′部の大きな部分である。消化により４種のフラグメン ト：元のｐＢＲ３２２ベクター、１１５０　ｂｐフラグメント、８０ｂｐフラグ メントおよび７８ｂｐ７ラグメントを得る。これらの結果は、遺伝子の３′末端 の約１３００ｂｐの挿入大きさくヌクレオチド１２５０〜２５５０　）を示唆す る。この仮定を確認するために、クローンをＰｓｔｌおよびＤｄｅ　１　で二重 消化する。後者の酵素は１１５０ｂｐフラグメントを切断して９２６ｂｐフラグ メントと２２９ｂｐ　フラグメントとし、一方７８または８０ｂｐフラグメント を無傷で残すべきである。

かかる二重消化の結果は、クローンが事実ＴＰＡ遺伝子の３′末端を示すという 結論を支持するであろう。

最後の証拠として、ＤＮＡのミニ調製物をクローンから単離し、ジデオキシ鎖停 止によって配列する。一般法の節に記載した如くにプラスミドＤＮＡのミニブレ プを調製する。２０：１モル過剰の鋳型中、１５体＃１をプライマーとして用い て、一般法の節に記載した如くにジデオキシ配列決定を行う。ｐＴＰＡ　Ｈで示 すこのクローンから得られた配列データは、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベ ーターについてのべ二重ら（Ｐｅｎｎｉｃａ　ｅｔ　ａｌ、　）　、ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ　）、３０１巻、２１４〜２１頁（１９８３）によって示された 配列データと同一である（チャート４）。

これより、遺伝子の５′末端の単離に焦点をあてる。

これを行うには、０ｄＴ１２−１８からよりもむしろ１５体＃１からプライマー 伸長させることによって、ｃ　ＤＮＡを２回選択ポ！Ｊ　Ａ　＋　ｍＲＮＡから 合成する。この方法によって得られる利点は２つある。まず、プライマー伸長が ＴＰＡに対して特異的であるので、生成したｃＤＮＡの高パーセンテージがＴＰ Ａの特異的配列によって示される。第２に、プライマー伸長がポ’ＪＡテイル部 の約８００ｂｐ５’であり、該部位は第、−鎖合成をプライマー伸長させるＯｄ Ｔ工２−０８によって利用される。これによって、この方法から得られたｃＤＮ ＡはｐＴＰＡ　Ｈよりもさらに５′を伸長させる転写を包含することがほぼ確認 される。

コノＴＰＡ−プライマー伸長のｃ　ＤＮＡでの形質転換効率はｃＤＮＡ　１μｇ につき２．５Ｘ１０”形質転換体である。

合計２５０００の形質転換体の２のバンクが生成する。ジ−ンーウオーキング（ ｇｅｎｅ　−ｗａｌｋｉｎｇ　）の概念を適用して故意にスクリーニングを偏ら せる。ｐＴＰＡ　Ｈ５’末端８゜ｂｐ　Ｐｓｔｌフラグメントをゲル単離し、プ ライマー伸長バンクから得られた２８０００　コロニーをプローブスルのに用い る。これにより少くともｐＴＰＡ　Ｈと同様に５′まで伸びるクローン、および プライマー伸長試行の結果、さらに５′配列を含有するクローンも同様に特異的 に選択される。

インシテユ・ハイブリダイゼーションにょるスクリーニングは多くの陽性体を生 成する。最も長いＴＰＡ挿入はＰｓｔ　１およびＤｄｅｌでの第２のスクリーニ ングにで示すクローンはヌクレオチド５５０〜１６００の挿入大きさを包含して いた（チャート４）。

制限データは３′末端の位置をかなり正確に（＋／−〜１０％）決定することを 可能とする。プライマー伸長がヌクレオチド１７５９で開始し、およびｐＴＰＡ ８０−１が約１６００位置に３′末端を有するならば、クローニングの間にどこ かの位置にて約１６０個の塩基対の損失が起こることになる。Ｓ１エンドヌクレ アーゼが最も可能性のある損失原因である。

ｐＴＰＡＨおよびｐＴＰＡ８０−１の配位を決定する。プラスミドｐＴＰＡＨお よびｐＴＰＨ８０−１を５ａｃＩおよびＰｙｕＩで切断して各々フラグメント７ 　（１２５１ｂｐ）および８（５、１ｋｂ　）を得、これをゲル単離する。該フ ラグメントを細菌アルカリ性ホスファターゼで処理し、Ｔ４ボリメラーセを用い て結んテＴＰＡ　ｃ’ＤＮＡ　（７）位置５５’Ｏ〜２２３０塩基を有するｐＴ ＰＡ　３’　ｃＤＮＡ　（６，３ｋｂ）を得る。新しい組立体をＰｓｔ　１　消 化によって確認する。

ｐＴＰＡ８０−１は第一のプライマー伸長バンクにおいて検知される陽性体の中 で最も長いＴＰＡ挿入を示すので、アミノ酸残基２３３〜２３７のコーディング 配列に対して相補的な第二のオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド８８６〜９００ ；１５一体＋１２）を用いてもう１つのｃＤＮＡライブラリーを生成し、５′末 端を完成する。もしＳ□が転写の３′末端から２００ｂｐまでも除去するならば 、ｐＴＰＡ　３’ｃＤＮＡでの十分な重複がなお存在してフラグメントの組立が 可能となるように遺伝子のこの特定領域を選択する。

５′塩基を含有するｃ　ＤＮＡをＰｓｔＩ　切断ｐＢＲ３２２に結び、前記の如 くにイー・コ’Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に形質転換した。このｃ　ＤＮＡでの形 質転換効率は３．６ｘｌＯ’形質転換体／μｉ　ｃＤＮＡの桁である。ヌクレオ チド６４５〜６６０（１５一体＃３）から伸長するコーディング配列に対して相 補的なオリゴヌクレオチドでこのラリブラリーからのコロニーをスクリーニング し、明らかな陽性体を選択する。Ｐｓｔ　１　およびＢｇｌｌＩ消化によって第 二のスクリーニングを行い、ｐＴＰＡ５’　ｃＤＮＡで示す１のクローンは残存 する５′配列１〜７５０を含有することが示された。再び、Ｓ工の挿入長に対す る影響はｐＴＰＡ　５’　ｃＤＮＡに関して明らかである。プライマー伸長はヌ クレオチド８８６にて開始するが、ｐＴＰＡ　５’　ｃＤＮＡはヌクレオチド約 ７５０個しか伸長しない；発明者らの実験は約１３６　ｂｐの損失を示した。

２のクローン（ｐＴＰＡ　３’　ｃＤＮＡおよびｐＴＰＡ５’　ｃＤＮＡ）につ いて利用可能な完全なＴＰＡ配列に関し、最後の組立作業が残る。方法はチャー ト５に示す。

プラスミドｐＴＰＡ５’　ｃＤＮＡをＴａｑＩで切断してフラグメント９　（２ １９４ｂｐ）を得る。ｐＴＰＡ５’　ｃＤＮＡ　のＴＰＡ配列内の１のＴａｑＩ 部位（位置６３４）は高度に酵素耐性である。フラグメント９をＢｇｌｌＩおよ びＨｇａ　Ｉで切断して蛋白質の成熟部分を表わすＴＰＡ　ｃＤＮＡの塩基１８ ８〜５９３を有するフラグメント１０　（４０５ｋｂ）を得る。

ＴＰＡ　ｃＤＮＡの中央部分は、まずｐＴＰＡ３’　ｃＤＮＡをＰｕｖ■で切断 し、フラグメント１１　（１７４８ｂｐ）をＥｃｏＲＩ分離することによって得 られる。次いでフラグメント１１をＨｇａＩで切断して塩基５９４〜８０２を含 有するフラグメント１２　（２０９ｂｐ）を得る。

ｃ　ＤＮＡの３′部分を得るには、ｐＴＰＡ３’　ｃＤＮＡ　をＰｖｕＩで消化 し、６．５　ｋｂ　７ラグメントを単離し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、Ｅｃｏ ＲＩで部分的に消化して塩基８０２〜２２３０を含有するフラグメント１３　（ １８７１ｂｐ）を得る。

ｃ　ＤＮＡの３つの部分の結びは、公に入手でき、かつラオ・アール・エヌおよ びロジャーズ・ニス・シイ（Ｒａｏ　、　Ｒ，Ｎ、　ａｎｄ　Ｒｏｇｅｒｓ　、 Ｓ、Ｇ、　）　、プラスミドｐＫＣ７：ＤＮＡセグメントをクローンするのに適 当な１０の制限部位を含有するベクター、ジーン（Ｇｅｎｅ）　７　：　７９〜 ８２（１９７９）に詳細に記載されているｐＫＣ７の使用を含む。プラスミドｐ ＫＣ７をＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで 処理してフラグメン）　１４　（４，８ｋｂ）を得、これをゲル単離する。

フラグメント１０．１２．１３および１４を単一の結びプールにおいて結ぶ。こ の方法の１の注目すべき態様は、それにより内部フラグメントのアルカリ性ホス ファターゼ処理の必要性が排除される方法である。

典型的には、多数片（≧４７ラグメント）結びはフラグメントのコンカテメリゼ ーション（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）のため非常に低い効率で所望 の組立を実現する。適当な方法にてのアルカリ性ホスファターゼでの処理はこの 問題を最小限とし、その結果圧しい多数片組立ての効率が劇的に増加する。ＴＰ Ａフラグメントを組立てるにおいて、発明者らは、制限エンドヌクレアーゼＨｇ ａＩがＤＮＡを切断する特別な方法を利用した。酵素の認識（結合）配列はＧＡ ＣＧＣであるが、該酵素はその認識部位を超えた地点で切断を行う。その結果、 Ｈｇａ　Ｉで切断されたフラグメントはそれらの元々隣接していた反対部分での み結ばれる。ＨｇａＩ突出部分によって促進される自己結びは起こり得ない。該 ４片ＴＰＡ結びはＨｇａＩ末端を有する２の７ラグメントを含有する。（自己閉 鎖を最小化するために）ベクターをアルカリ性ホスファターゼで処理することを つけ加えることにより、その結果はとんどの形質転換体が正しく組立てられたＴ ＰＡ遺伝子を有することになる。正しい組立ては制限的消化によって証明される 。ＴＰＡについての完全なｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドをｐＴＰＡｃＤＮ Ａ　（７，’４　ｋｂ）で示す。

実施例 実施例１１合成オリゴヌクレオチドの調製前記した方法により８７種の別々のオ リゴヌクレオチド（第３図）を合成した。記載した方法により、位置１８７にお けるＢｇｌ　Ｉ［部位および位置１２８７におけるＥｃｏＲＩ部位間の合成りＮ Ａの１０８４塩基対を組立ててｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３に入れる（チャート９） 。インタードメイン領域への挿入のために選択した特異的制限部位はチャート１ ０および１１に示す。各ブロックをイ　−−・コＩＪ　（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　に おける複製用のおよび配列証明用の適当なりローニングベクターと再び組合せる 。用いたすべての結びおよびクローニング方法はマニアテイスら（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ　ｅｔ　ａｔ、　）　、前掲、によって記載されたとおりである。すべての クローンした配列をサンが−（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ配列決定法を用０て配 列して配４Ｊを証明する。

ブロック１．　オリゴヌクレオチドＰＩ−Ｐ４、Ｐ８−ｐＨオリゴヌクレオチド Ｐ５．Ｐ７およびＰＩ３−ＰＩ３よりなる第２のセグメントに結ぶ。得られたブ ロック１はフィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメインについてコード付けする配列 を含有する。ブロック１をクローンして調製例１に記載したｐＳＫ４のＢｇｌ　 ＩＩおよび５ｐｈＩ部位に入れる。

ブロック２．　フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメインについてコード付けする 配列を含有するオリゴヌクレオチドＰ１５−Ｐ１８およびＰＩ３−Ｐ２３を単一 工程のアニーリングおよび結びにおいて一緒に結んでブロック２を得、クローン してｐＢＲ３２２の５ｐｈＩおよびＣＩａＩ部位に入れる。

ブロック３．　オリゴヌクレオチドＰ２４−Ｐ２８　、Ｐ３４−Ｐ３８をアニー ルし、結んで二本鎖セグメントを得、これをオリゴヌクレオチドＰ２９−Ｐ３３ およびＰ３９−Ｐ４３よりなる第２のセグメントに結ぶ。得られたブロック３は クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　１ドメインについてコード付けする配列を含 有する。ブロック３をクローンしてｐＢＲ３２２のＣ１ａＩおよびＢａｍＨＩ部 位に入れる。

ブロック４．　オリゴヌクレオチドＰ４４−Ｐ４７おヨヒＰ６７−Ｐ７０１Ｐ４ ８−Ｐ５１およびＰ７１−Ｐ７４　ｉ　Ｐ５２、Ｐ５３、Ｐ９２、Ｐ９３および 、Ｐ７５、Ｐ７６、Ｐ９４、Ｐ９５　ｉ　Ｐ５７−Ｐ６１およびＰ２Ｏ−Ｐ８４ 逼ならびにＰ６２−Ｐ６６およびＰ８５−Ｐ２Ｏを各々５個の別の試験管中でア ニールして二本鎖セグメントとし、次いでこれらをプールし、結んでブロック４ を得る。ブロック４はクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）２ドメインについてコー ド付けするＤＮＡ配列を含有する。ブロック４をクローンしてｐＢＲ３２２のＢ ａｍＨＩおよびＥ　ｃｏＲＩ部位に入れる。

実施例２．　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの活性部位を用いてのブロック１−４の組立て、 チャート６〜１１ 以下の実施例は、実施例１の各種合成ブロックを組立てて生物学的に活性なＴＰ Ａについてコード付けすることができる遺伝子に入れるのに必要な工程の要約を 提供する。２の始原型遺伝子を記載する。プラスミドｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３． ４（ａ）はクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２ドメインおよび活性部位間に人 工的に導入されたエンドヌクレアーゼ部位を有しないＴＰＡをコード付けする遺 伝子を有する。プラスミドｐＴＰＡ−Ｂ　１．２．３．４　はクリングル（ｋｒ ｉｎｇｌｅ　）　２および活性部位間に人工的に導入されたエンドヌクレアーゼ 制限部位を有するＴＰＡをコード付けする遺伝子を有する。

Ａ、ｐＴＰＡ−Ｂｌの組立て−チャート６プラスミドｐ　ＳＫ４をＣ１ａ　Ｉお よびｓｐｈ　Ｉで消化し、大きな４．１ｋｂフラグメント１５を単離し、Ｃ１ａ 　Ｉ／Ｘ　ｂａ　Ｉリンカ−を用いてブロック１フラグメントに結ぶ。マニアテ イスによって記載された塩化カルシウム形質転換法を用いて、結んだ混合物を形 質転換してＨＢＩＯｌに入れる。マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ ｌ、　）によって記載されたニックトランスレーション法を用いて、形質転換体 をニックトランスレーションを行ったブロック１フラグメントでスクリーニング を行う。次いで、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）ジデオキシ配列決定法を用いて、 プローブに対しハイブリダイゼーションされた形質転換体を配列して正しい配列 および配位を確認する。この新しい形質転換体をｐＴＰＡ−８１（４，２５ｋｂ 　）で示す。

Ｂ、ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２　の組立て−チャート７プラスミドｐＴＰＡ−Ｂ　１を ＥｃｏＲＩおよびｓｐｈ　Ｉで消化し、フラグメント１６（４５０ｂｐ）を単離 する。プラスミドｐ　ＢＲ３２２をＥ　ｃｏ　ＲＩおよびＣ１ａＩで消化し、大 きなフラグメント１７　（４，３５ｋｂ　）をゲル単離する。次いでフラグメン ト１６および１７を合成した５ｐｈＩ／Ｃ１ａＩブロツク２に結ぶ。結んだ混合 物を形質転換してＨＢＩＯＩニ入し、形質転換体をニックトランスレーションヲ 行つたブロック２でスクリーニングを行う。プローブに対してハイブリダイゼー ションされた形質転換体を配列してそれらがその正しい配位にあるブロック２を 含有することを確認する。この組立体をｐＴＰＡ−８１，２（４，８ｋｂ　）で 示す。

Ｃ，ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２（ａ）の組立て−チャート８゛プラスミドｐＴＰＡ　− Ｂ　１．２（ａ）はフィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　）および発育因子ドメインから 上流にＨｉｎｄ　ＭおよびＢｇｌ　ＩＩ制限部位を含有する。プラスミドｐ、Ｔ ＰＡ−Ｂ　１．２をＸｂａＩオＪ：　Ｕ　Ｅ　ｃｏＲ，Ｉで消化し、大きな４． ５ｋｂフラグメント１８をゲル単離し、ＨｉｎｄＩ［およびＢａｌｌＩ部位を含 有するオリゴヌクレオチドリンカーに結ぶ。結んだ混合物を形質転換してＨＢＩ ＯＩに入れ、形質転換体をＨｉｎｄＩ［Ｉ／Ｂｇｌ　ＩＩ部位の存在についてス クリーニングする。新しい組立体をｐＴＰＡ　−Ｂ　１．２ｆａ）（４，５ｋｂ 　）で示す。

Ｄ、ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３の組立て−チャート９プラスミドｐＴＰＡ−Ｂ　１ ．２（ａ）をＣＩａＩ　およびＢａｍＨＩで消化し、大きな４．０ｋｂフラグメ ント１９を単離する。このフラグメントをブロック３　（２７０ｂｐ）よりなる 合成したＣ１　ａ　Ｉ　／　Ｂａｍ’ＨＩ　クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　 １領域に結び、形質転換してＨＢＩＯｌに入れる。形質転換体をニックトランス レーションを行ったブロック３でスクリーニングした。ブロック３に対してハイ ブリダイゼーションした形質転換体を配列して配列および配位を確認した。この 新しい組立体をｐＴＰＡ−Ｂ　１．２．３（４，３ｋｂ）で示す。

Ｅ、ｐＴＰＡ−Ｂｌ、　２．３．４ａの組立て一チャート１０このプラスミドは 酵素活性を有するＴＰＡ同族体についてコード付けする全始原型ＴＰＡ遺伝子を 含有する。

この遺伝子には、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２および活性部位間のイン タードメイン領域に対する変化はない。

ｐＴＰＡ　−Ｂ　１．２．３．４ａ（４，２ｋｂ）の組立てにはいくつかの工程 を必要とする。プラスミドｐＴＰＡ　ｃＤＮＡ　（チャート５）を５ｃａＩ　で 切断し、ＴＰＡ遺伝子の３′端部についてコード付けするフラグメント２０　（ ６，Ｏｂｐ）をゲル単離する。プラスミドｐＴＰＡ　−Ｂｌ、２．３（チャート ９）をＳｃａ　ＩおよびＢａｍＨＩ　で切断してフィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　） 　、発育因子およびクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　１ドメインを含有するフ ラグメント２１　（１１００ｂｐ）ヲ得る。

ブロック４をＢａｍ　ＨＩ　およびＳｃａ　Ｉで切断することによって第３のフ ラグメン）　４　ａ　（２３０ｂｐ）　ヲ得る。Ｔ４リガーゼを用いて３つのフ ラグメントを結んでｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３．４ａ　を得る。Ｈｉｎｄｌ［およ びＡａｔ　ＩＩを用いてＴＰＡ遺伝子をｐＢｒ３２２から切断して２．２　ｋｂ フラグメントを得、これを継代クローンしてｐＵＣ−１９に入れる。プラスミド ｐＵＣ−１９は種々の源から商業的に入手可能であり、ＴＰＡドメインの操作を 面倒でなくする選択した制限部位をそのＤＮＡ配列中に含有する。

Ｆ、ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３．４の組立て一チャート１１このプラスミドは酵素 的に活性なＴＰＡ同族体についてコード付けする全始原型ＴＰＡ遺伝子を含有す る。この同族体において、すべての４のドメインおよび活性部位はユニーク制限 部位がクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２および活性部位間の領域を包含する すべてのインタードメイン領域中に入れられた状態で存在する。まずｐＴＰＡ− Ｂｌ、２．３．４ａをＥ　ｃｏ　ＲＩおよびＢａｍ　ＨＩ　で切断し、フィンガ ー（ｆｉｎｇｅｒ　）、発育因子およびクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　１ド メインを含有する大きな３．７　ｋｂフラグメントを単離することによってプラ スミドを組立てる。

合成により生成したブロック４を、ＢａｍＨＩでの消化およびＥ　ｃｏ　ＲＩで の部分的消化によりそのクローンから得て５６０ｋｂを有する無傷のブロック４ を得る。Ｔ４１Ｊガーゼを用いて２つの７ラグメントを結んでｐＴＰＡ　−Ｂ　 １プラスミドｐＴＰＡ　−Ｂ　１．２（３，４は種々の合成ＴＰＡへ 同族体を組立てるのに用いることができる。

実施例３．　ＴＰＡ同族体の組立て Ａ、ｐＦＫＩＫ２Ａの組立て（発育因子ドメインの欠失〕プラスミドｐＴＰＡ　 −Ｂ　１．２．３．４ａをＥｃｏＲＶで、およびＨｐａＩ　で部分的に消化して ７２４ではなく３３４　における部位を消化する。大きなフラグメント（６，９ ｋｂ）ヲ単離し、再び結んでｐＦＫＩＫ２Ａを得る。次いでプラスミドｐＦＫＩ Ｋ２Ａを形質転換してＨＢＩＯＩまたはいくつかの他の適当な宿主に入れる。次 いで正しい配位および配列について該プラスミドをスクリーニングする。

Ｂ、ｐＦＫ２Ａ　の組立て（発育因子およびクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ　）　 １ドメインの欠失）プラスミドｐＴＰＡ　−Ｂ　１．２．３．４　をＨｐａ　Ｉ 　で消化する。大きな６．５ｋｂ　フラグメントを単離し、再び結んでｐＦＫ２ Ａ　を得る。該プラスミドを形質転換してＨＢｌｏｌまたはいくつかの他の適当 な宿主に入れ、正しい配位および配列についてスクリーニングする。

Ｃ，ｐＦＫ２に２Ａの組立て−チャート１２（発育因子およびり、す、ングｉ） しく　ｋｒｉｎｇｌｅ　）　１の欠失ならびにタリング／Ｌ／　（ｋｒｉｎｇｌ ｅ　）　２の複製〕プラスミドｐＴＰＡ　−Ｂ　１．２．３．４　（チャート１ １）をＨｐａ　Ｉ　で消化してフラグメント２２　（６，５ｋｂ）　を得、これ を単離する。ｐＴＰＡ−Ｂ　１．２．３．４　の第２の試料をＨｐａＩおよびＭ ｓｔＩで消化し、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２ドメインを含有する得ら れた５　６０　ｂｐ　フラグメント２３を単離する。ＨｐＡＩ消化のＦＫ２Ａフ ラグメントを平滑末端でＨｐａＩ／ＭｓｔＩフラグメントに結んでｐＦＫ２に２ Ａ　（６，５ｋｂ）　を得る。次いでプラスミドｐ　ＦＫ２　Ｋ２　Ａを形質転 換してＨＢＩＯＩに入れ、正しい配位および正しい配列についてスクリーニング する。

Ｄ、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　プラスミドｐＴＰＡ　ＥＸＰ　１における 発現−チャード１３ ＴＰＡ同族体の発現は、チャート７に示す発現プラスミドｐＴＰＡ−Ｂｌ、２、 チャート６に示すｐＴＰＡ−Ｂｌ　、またはそれらの均等体を用いることによっ てイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）中で達成できる。いずれの同族体も発現用のＸ 　ｂａ　Ｉ　およびＢａｍＨＩ　部位内に置くことができる。イー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ　）　においてｐＦＫ２に２Ａを発現するには、ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２（ チャート７）およびｐＦＫ２に２Ａ　（チャート１２）をＸｂａＩおよびＢａｍ 　ＨＩ　で切断し、フラグメ７　）　２４　（４，２ｋｂ）　オよび２５（２， ０ｋｂ）をゲル単離する。フラグメント２４および２５を結んで発現プラスミド ｐＴＰＡ　Ｅｘｐ　１　（６，２ｋｂ　）　を得る。

プラスミドｐＴＰＡＥｘｐ　１　はＴｒｐプロモーターおよびオペレーターを含 有し、発現は構成的である。イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）の培養はマニアテ イス（前掲）による。該イー・コ’）　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）培養は活性なＴＰ Ａを産生じないであろう。イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　によって産生された ＴＰＡは再び折りたたんで天然状態としなければならない。公知のシスティン再 シャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　）法によって活性ＴＰＡを得ることができ る。米国特許第４５１１５０２号。

実施例４．真核生物における発現 Ａ、酵母におけるヒ）　ＴＰＡの発現 本実施例は、ＭＦα１プロモーターおよびｐｒｅ−ｐｒｏ配列を有する酵母発現 プラスミドｐα１−ＦＫ２に２Ａ　の組立てを説明する。酵母におけるＴＰＡ同 族体の発現用の培養条件および好ましい宿主株も提供する。

（１）ｐα１−ＡＤＨｔ１酵母発現ベクターの組立てプラスミド、ｐα１−ＡＤ Ｈｔｌは酵母についての多目的発現ベクターである。都合よい地点の制限部位が その構造中に組込まれており、ＭＦα１プロモーター下の制御は一般に高レベル の発現に適合する。以下の工程はｐα１−ＡＤＨｔの組立てを記載する。（チャ ート１４〜１８）ａ、　’　ｐＹＲｅｐ３’Ｂの組立て一チャート１４ＲＥＰ　 ｍおよび２μプラスミドの複製開始点配列をｐＹＩＰ３１のＵＲＡ３遺伝子のＳ ａｍ　Ｉ部位に入れて都合よいカセットを得ることによってプラスミドｐＹＲｅ ｐ３’Ｂを組立てる。プラスミド、２μおよびｐＹＩＰ３１は共に公に入手可能 であり、文献中に詳細に記載されている。

該２μプラスミドは、［酵母サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　Ｊ　Ｃライフ“サイクル・アンド・イン へりタンス（Ｌｉｆｅ　ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　１ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）Ｌ４４ ５〜４７０頁においてジエイ・アール・ブローチ（Ｊ、Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ　）に よって詳細に記載され、ＲｅｐＩ［領域はセル（Ｃｅ１１）３４：９５〜１０４ （１９８３）およびセル（Ｃｅｌｌ）３５：４８７〜４９３（１９８３）＋Ｃ記 載されティる。プラスミドｐＹＩＰ３１はジーン（Ｇｅｎｅ　）、１８：１７〜 ２４（１９７９）に記載されていた。

プラスミドｐＹＩＰ３１をまずＳａｍＩで切断し、細菌アルカリ性ホスファター ゼで処理してフラグメント２６（５，４ｋｂ）を得、これを単離する。酵母の２ μプラスミドをＰｓｔＩ　およびＸｂａＩで切断し、フレ／−で満たし、フラグ メント２７　（１，３ｋｂ）を単離する。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いてフラグ メント２６および２７を結んでｐＹＲｅｐ３’　Ｂ（６，７ｋｂ　）を得る。

ｂ、ｐＡＤＨＬの組立て一チャート１５〜１６プラスミドｐＡＤＨｔ　（３，８ ６ｋｂ）は酵母発現ベクターを組立てるのに有用な制限部位を供給するので有用 である。

ｐＡＤＨｔ　の組立用の出発プラスミドはｐＧＧ４００（４，０ｋｂ）である。

プラスミドｐＧＧ４００を公に入手容易なプーナ／Ｌ／−オブ・バクテリオロジ −ＣＪ、　Ｂａｃｔｅｒ、　）、１２６：４４７〜４５３（１９７６）。°具体 的には、テトラサイクリン耐性についてコード付けするｐＢＲ３２２の遺伝子を カナマイシン耐性についてコード付けするｐＭＬ２１　の一部で置換える。プラ スミドｐＢＲ３２２をまずＥｃｏＲＩおよびＰｖｕ　ＩＩで切断し、クレノー酵 素でＥｃｏＲ工突出部を満たし、アガロースゲルから単離してフラグメント２８ （２，３ｋｂ　）　を得る。プラスミドｐＭＬ２１　をＰｕｖ　Ｉ［で切断して カナマイシンに対する耐性用の遺伝子を有するフラグメント２９　（１，７ｋｂ ）を得る。満たしたＥｃｏＲＩ部位を用いてＰｕｖ　Ｈ切断部を結ぶことにより 、結んだ後ＥｃｏＲＩ部位が再生する。フラグメント２８および２９を結んでｐ ＧＧ４００を得、これをｐＡＤＨｔ　を組立てるのに用いる（チャート１５）。

ｐＧＧ４００をＰｖｕＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、クレノー酵素で処理してフ ラグメン）　３’　Ｏ（３，５ｋｂ）を°得、これを単離することによってプラ スミドｐＡＤＨｔを組立てる。まずＨｉｎｃ　ＩＩ　およびＢａｍ　ＨＩで切断 し、Ｔ４　ポリメラーゼで処理し、フラグメント３１　（０，３６ｋｂ）を単離 することによって酵母アルコールデヒドロケナーゼエ（ＡＤＨＩ）の３′端部を ｐＡＤＨＢＣから得る。プラスミドｐＡＤＨＢＣは公に入手可能であり、ジャー ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ＝（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　） 　２５７：３０１８〜１０２５（１９８２）に詳細に記載されている。フラグメ ント３０および３１を結んで特にｐＡＤＨｔ　を得、形質転換してイー・コ！Ｊ 　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）に入れる。ｐ　ＡＤＨｔを有するそれらの形質転換体は それらのプラスミドにおいてＢａｍＨＩ　およびＸｈｏＩ部位を再生するであろ う。これらの形質転換体を選択し、制限酵素分析法および配列決定法によってク ローンしたＡＤＨＩ３’端部の正しいことを確認する（チャート１６）。

ｃ、ｐＡＤＨｔ−ＲＥＰＩＩＩの組立て一チャート１７プラスミドｐＡＤＨｔ　 −ＲＥＰ　ｍ　（６，２ｋｂ　）は、ＵＲＡ３−ＲＥＰ　ｌｌｌ−複製開始点カ セットをｐＡＤＨｔに入れて酵母における発現および複製を容易とするｐＡＤＨ ｔおよびｐＹＲｅｐ３１Ｂの組立体である。Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ｆｆｌ またはＥｃｏＲＩ−３ｍａＩフラグメントは適当な酵母プロモーターを有する所 望のＤＮＡフラグメントで置換えることができる、あるいはそれは複製開始点、 選択可能なマーカーおよび酵母ＵＲＡ３遺伝子の３′端部を有するＳａｔ　Ｉ　 −ＸｈｏＩフラグメントを供給するのに用いることができるので、プラスミドｐ ＡＤＨｔ−ＲＥＰＴＩＬは発現ベクターの組立てに有用である。

ＢａｍＨＩで切断し、端部をクレノー酵素で満たし、８一体５ａｌＩ！Ｊンカー を満たしたＢａｍＨＩ部位に挿入することによってプラスミドｐＡＤＨｔ　を修 飾する。（修飾した〕プラスミドｐＡＤＨｔをｓｐｈ　Ｉで切断し、端部をＴ４ ポリメラーゼで満たしてフラグメント３２　（３，８ｋｂ。

）を得る。プラスミドｐＹＲｅｐ３１Ｂ　をＨｉｎｄｌＩ［で切断し、ＵＲＡ３ の３′端部および安定性を増大させると考えられる２μＲｅｐ　ｆｆｉ領域なら びに複製開始点を含有させてフラグメント３３　（２，４ｋｂ）を単離する。フ ラグメント３２および３３を結び、時計回りの転写を可能とする配位のＵＲＡ３ 遺伝子を持つプラスミドを有するイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）形質転換体を スクリーニングしてｐＡＤＨｔ　−ＲＥＰＩ［を得る。

ｄ、ｐα１−ＡＤＨｔの組立て一チャート１８ｐＡＤＨｔ　−ＲＥＰｍのＥｃｏ ＲＩ　−Ｈｉｎｄｌ［フラグメントをプロモーターおよびＭＦα１遺伝子のｐｒ ｅ−ｐｒｏ　配列を含有するｐα１からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌｌＩ　フラグ メントで置き換えることによってｐα１−ＡＤＨｔ　（６，５ｋｂ　）の組立て を完成する。プラスミドｐα１はエイ・シンラ（Ａ、Ｓｉｎｇｈ％ｅｔ　ａｌ。

）、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａ ｒｃｈ　）、１１：４０４９〜６３（１９８３）およびジエイ・クルヤンら（Ｊ 、　Ｋｕｒｊａｎ、　ｅｔ　ａｌ、　）セル（Ｃｅｌｌ）、３０：９３３〜９４ ３（１９８３）によって詳細に記載されている。プラスミドｐＡＤＨｔ−ＲＥＰ ＩＩＩをまずＥｃｏＲＩ　およびＨｉｎｄｕ　で切断してフラグメント３４　（ ５，３ｋｂ）を得、これを単離する。また、プラスミドｐα１をＥ　ｃｏ　ＲＩ およびＨｉｎｄｌＩ［を切断してフラグメント３５　（１，２ｋｂ）を得、これ を単離する。次いでフラグメント３４および３５をＴ４　ＤＮＡ’Ｊガーゼを用 いて結んでｐα１−ＡＤＨｔを得る。

（２）ｐα１−ＦＫ２に２Ａの組立て、ＴＰＡ同族体ｃＤＮＡの酵母発現ベクタ ーへの挿入−チャード１９酵母中でＴＰＡ同族体を産生ずるための好ましい発現 ベクターをＭＦα１プロモーターを有するｐα１−ＦＫ２に２Ａで示す。プラス ミドＩ）ＦＫ２に２Ａ　（チャート１２）をＢｇｌｎで切断してフラグメント３ ６　（２，０ｋｂ）を得、これをゲル単離する。プラスミドｐα１−ＡＤＨｔを ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏ　Ｉで切断してフラグメント３７　（５，６ｋｂ） を得、転写、ポリアゾニレ−ジョンおよび翻訳部位を供給する。本明細書中で記 載する系は成熟ＴＰＡ蛋白質より下流で停止し、得られた産生物は酵母起源の少 しのアミノ酸をさらに有するであろう。ＴＰＡ遺伝子の正確な端部で翻訳を停止 するために、停止コードンを供給することができる。

同族体がＭＦαｐｒｅ−ｐｒｏ　配列の解読フレームと同相であることを確認す るには、同族体の５′および３′端部を変化させない。もう１つのリンカ−を挿 入するかあるいはクレノー（ＰｏｌＩ）およびマングビーン（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａ ｎ）ヌクレアーゼと組合せるのいずれかによって５′端部におけるＢｇ１ｍ部位 を操作して解読フレームをＭＦα１’　ｐｒｅ−ｐｒｏ”配列と同相に維持しつ つＨｉｎｄｕ部位を得ることができる。本実施例については、アデノシンおよび グア／シンと共にクレノーを用いてフラグメント３７のＢｇｌ、Ｉ［部位を部分 的に満たす。次いで部分的に満たした部分をマングビーン（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ 　）ヌクレアーゼで平滑末端とし、ｐα１−ＡＤＨｔのＨｉｎｄｌｌＩ部位に結 ぶ。（端部を部分的に満たした〕フラグメント３６および３７を結んでｐＦＫ２ に２Ａ　（７，６ｋｂ　）を得る。解読フレームが子を平滑末端として発現ベク ターに挿入することもできる。

（３）酵母におけるプラスミドｐα１−ＦＫ２に２Ａ　からのＴＰＡ同族体の発 現 酵母株ＹＮＮ２２７　（α、ｕｒａ３−５２　ｔｒｐｌ−２８９）をｐα１−Ｆ Ｋ２に２Ａで形質転換する。グルコース最小培地（２哄グルコース、０．７％酵 母窒素ベース、１％カザミノ酸、４０μｇ／［［１区アデニン、５０１１１１／ ｒｎＱ　）リプトファン）中で形質転換体を１０時間増殖させる。次いで遠心に より細胞をペレット化する。ガラスピーズで撹拌することによって細胞を溶解す る。ＴＰＡ量はウェスタンブロッティング法またはラジオイムノアッセイ法ある いはクセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　）卵母細胞について前記したアガール中のカ ゼイン酵素アッセイ法を用いて検知することができる。

まずＱ、　５　ｔｘｍガラスピーズで溶解し、続いてアフィニテイカラム上で精 製することによってＴＰＡ酵母細胞から単離することができる。標準的な蛋白質 精製法を適用してさらに精製を行うことができる。

Ｂ、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＴＰＡ同族体の発現−チャード２ ０〜２２ 以下の実施例はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてｐＦＫ２に ２Ａを発現する好ましい方法を示すものである。要約すると、各々イー・コリ（ Ｅ、ｃｏｌｉ）およびＣＨＯ細胞においてアンピシリン耐性およびジヒドロ葉酸 還元酵素遺伝子をマーカーとして用いてＣＨＯおよびイー・コ！Ｊ　（Ｅ、　ｃ ｏｌｉ　）の両細胞において複製するシャトルベクターｐｓＶｃＯＷ７をここに 開示する。プラスミドｐｓＶｃＯＷ７は、また、ＣＨＯ細胞における発現に必要 なウシ成長ホルモンからのポリアゾニレ−ジョン配列を供給するものである。プ ラスミドｐｓＶｃＯＷ７をまず切断し、細菌プロモーターおよびＴＰＡ同族体を 挿入する。ＣＨＯ細胞において発現されるＴＰＡについての形質転換培養条件お よび抽出方法も以下に記載する。

（１）ｐＳｖＣＯＷ７ノ組立チー１−ヤ−ト２０（アメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ　）から入手可能な、あるいはニス・スブラマニら（Ｓ、　Ｓｕｂ ｒａｍａｎｉ　％ｅｔ　ａｌ、　）、［シミアン（Ｓｉｍｉａｎ）ウィルス４０ におけるマウスジヒドロ葉酸還元酵素相補性デオキシリボ核酸の発現］、モＭｏ １ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）　２　：　８ ５４〜８．６４　（１９８１年り月〕の方法により調製した）出発プラスミドｐ ＳＶ２ｄｈｆｒをＢａｍＨＩおよびＥ　ｃｏＲＩで消化してアンピシリ・ン耐性 遺伝子、ＳＶ４０複製開始点、およびｄｈｆｒ　遺伝子を含有するフラグメント ３８（５，０ｋｂ）　を得る。

ｐｓＶｃＯＷ７の第２の部分は、ｐＳＶ２ｄｈｆｒを切゛断するのに用いたのと 同一の制限エンドヌクレアーゼで消化してゲノムウシ成長ホルモン遺伝子、すな わち、ＢＧＨｇＤＮＡの３′端部を含有するフラグメント３９を得るプラスミド ｒλＧＨ２Ｒ２から得られる。プラスミドＰλＧＨ２Ｒ２は、イリノイ州、ペオ リア（Ｐｅｏｒｉａ　）のノ、−ザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー ズ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ　）に寄託した（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５１５４）　イー・コリ（Ｅ、　 ｃｏｌｉ　）　ＨＢＩ　０１宿主から公に入手可能である。フラグメント３８お よび３９を結んでｐｓＶｃＯＷ７　（７，１ｋｂ）を得る。

（２）　ｐＴＰＡ　−ｃＤＮＡ　、　ＢａｍＨＩの組立て一チャート２１ＴＰＡ 同族体をｐｓｖｃｏｗ７に都合よく挿入するために達成するには、ｐＴＰＡ　５ ’ｃ　Ｄ　ＮＡ　（チャート５）をＨｇａＩで切断し、塩基７８〜５９３を含有 するフラグメン）　４０　（５１７ｂｐ）をクレノー酵素で平滑にする。平滑末 端を１０一体ＢａｍＨＩ　リンカ−に結び、フラグメント４０をＮａｒＩで切断 してＴＰＡ　ｃＤＮＡの塩基６８〜５２１を有するフラグメント４１を得る。

プラスミドｐＴＰＡ−ｃＤＮＡ　（チャート５）をＮａｒ　ＩおよびＢｇｌｍで 切断し、ＴＰＡ　ｃＤＮＡの３′部分を含有するフラグメント４２　（１６４４ ｂｐ）をゲル単離する。フラグメント４１および４２をｐＫＣ７のＢａｍＨＩお よびＢｇｌ　ｍ消化の結果得られたフラグメンｌ−４３（４，３ｋｂ）に結んで ｐＴＰＡ・−ｃＤＮＡ　、　ＢａｍＨＩ　（６，５ｋｂ　）　を得る。

［３）　ｐＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡの組立て−チャート２２ＴＰＡドメインの天然配 置を有するＴＰＡ修飾ｃ　ＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＰＡ−Ｉ　Ｅ−ＰＡ はＣＨＯ細胞によって発現されることが可能である、あるいはＴＰＡ同族体を含 有する別法発現プラスミドの組立を容易とするのに用いることができる。ｐＴＰ Ａ−Ｉ　Ｅ−ＰＡの組立は２つの工程で達成される。まずｐＴＰＡ−ｃＤＮＡか らのＴＰＡｃＤＮＡをｐ　Ｓ　ＶＣＯＷ７に挿入し、次いでサイトメガロウィル スの即時型プロモーターを挿入してＴＰＡ同族体の転写を開始する。

工程１、　プラスミドｐｓＶｃＯＷ７をＥ　ｃｏ　ＲＩおよびＰｕｖＩＩで切断 し、ＢＧＨ遺伝子の３′はとんどのエクソンにおけるＰｕｖ　ＩＩ部位から３′ 末端より下流のＥｃｏＲＩ部位まで伸びるウシ成長ホルモンのポリアゾニレ−ジ ョン配列を含有するフラグメント４４（６００ｂｐ）を得る。ＢＧＨポリアゾニ レ−ジョン配列の完全な記載については、以下の文献を参照されたい：（１）ｂ ＧＨゲノムＤＮＡの同定および特徴づけが開示されている１９８４年６月２７日 出り・アール・ビイら（Ｗｏｙｃｈｉｋ、　Ｒ，Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、　）、「正 確なポリアゾニレ−ジョンのためのウシ成長ホルモン遺伝子の３′フランキング 領域の要件」、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ　８１ 　：　３９４４〜３９４８（１９８４年７月〕りおよび、ディ・アール・ヒッグ ズら（Ｄ、Ｒ，Ｈｉｇｇｓ、　ｅｔ　ａｔ、　）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ 　）３０６：３９８〜４００（１９８３年１１月２４日）およびそこに引用され ている文献。

ｐｓＶｃＯＷ７の第２の試料をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ　で切断してフラグ メント４５を得る。別法として、フラグメント４５はベセスダ・リサーチ・ラボ ラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 　）から入手可能な親プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒからのＥｃｏＲＩ　／　Ｂａ ｍＨＩフラグメントから得られる。フラグメント４５はｐＢＲ３２２からの複製 開始点およびイー・コ！Ｊ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　においてプラスミドの選択 を可能とするイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　において発現されたアンピシリ ン耐性遺伝子を含有する。該フラグメントは、また、哺乳動物細胞において発現 を可能とする組立体中にマウスジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡを含有する。スブ ラマニら（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　、　ｅｔ　ａｌ。

〕、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジ（Ｍｏ１．’Ｃｅ１１．　 Ｂｉｏｌ、　）１：８，５：４−８６４　（１９８１）。

ＴＰＡ　ｃＤＮＡは、ｐＴＰＡ−ｃＤＮＡ　、　ＢａｍＨＩをＢａｍＨＩおよび Ｂａ１Ｉで切断することから得られるフラグメント４６（１，９ｋｂ　）から得 られる。フラグメント４６はｔＰＡｃＤＮＡからの全コーディング領域を含有す る。ＢａｍＨＩ切断はｍＲＮＡの５′未翻訳配列についてコード付けするｃＤＮ Ａにおけるものであり、Ｂａ１Ｉ切断はｃ　ＤＮＡの３′未翻訳領域についてコ ード付けするｃＤＮＡにおけるものである。

フラグメント４４．４５および４６を結んでイー・コＩＪ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　 ）およびＣＨＯ細胞間を行き来できる複製ベクターであるｐＴＰＡ−ＰＡ（８， ４ｋｂ）を得る。プラスミドｐＴＰＡ−ＰＡを形質転換してイー・コリ（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）に入れる。

工程２．工程２においては、ヒトサイトメガロウィルスからの即時型遺伝子プロ モーター（ＣＭＶ　１．Ｂ、プロモーター）を挿入することによって、ｐＴＰＡ −ＰＡを発現プラスミドｐＴＰＡ−Ｉ　Ｅ−ＰＡに変換する。ＣＭＶｌ、Ｅ。

プロモーターはＣＭＶゲノムのＰｓｔ　Ｉ　消化から得られる。主たる即時型遺 伝子を含有するヒトサイトメガロウィルスゲノム（ＣＭＶ　１．Ｅ、　）の領域 の制限エンドヌクレアーゼ切断マツプは詳細に記載されている（ステインスキイ ら（５ｔｉｎｓｔｉ　、　ｅｔ　ａｌ、　）、リサーチ／Ｌ／　−オブ・パイロ ロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）４６：１〜１４．１９８３　；ステンベルグら（Ｓ ｔｅｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ、　）、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、　）　４９　：　１９０〜１９９．１９８４ｉおよび、トムセンら （Ｔｈｏｍｓｅｎ　、　ｅｔ　ａｌ、　）、プロシーデイングズ・オブ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ　、　８１　：　６５９〜６６３．１９８４）。

これらの文献は、その配列の中に主要な即時型遺伝子についてのプロモーターを 含有スる２、０キロベースのＰｓｔＩフラグメントを記載している。それにより 所望の７６０塩基対フラグメントが産生物の中に得られるこの２．　Ｏｋｂ　Ｐ ｓｔ　Ｉフラグメントの５ａｕ３ＡＩでの単離消化によってＣＭＶ　１．Ｅ、プ ロモーターをさらに単離することができる。この７６０塩基対フラグメントは、 その大きさならびにフラグメント内のＳｃａ　Ｉ切断部位およびＢａ１Ｉ切断部 位の存在によって他の産生物から区別できる。その便利な同定のため、このＳａ ｕ　３　Ａ　Ｉフラグメントの利用は本明細書中に記載するＣＭＶｌ、Ｅ、プロ モーターを用いる好ましい方法である。

工程１で組立てたプラスミドｐＴＰＡ−ＰＡをＢａｍＨｌで切断し、ＣＭＶ即時 型プロモーターを含有する５ａｕ３ＡＩフラグメントをＢａｍＨＩ　部位に結ぶ 。プロモーターからの転写がＴＰＡについてのｍＲＮＡを合成するような配位で ＣＭＶプロモーターフラグメントを含有するプラスミドは、プラスミドを５ａｃ Ｉ　で切断することによって同定される。得られたプラスミドを、ＴＰＡ　ｃＤ ＮＡの５′端部にＣＭＶ　１．Ｆ、、プロモーターを有し、およびその、３′端 部にｂＧＨポリアデニレーションシグナルヲ有スるｐＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡで示す 。

（４）　ｐＴＰＡ−Ｉ　Ｅ−ＦＫ２に２Ａの組立て−チャート２３ｐＴＰＡ−Ｉ 　Ｅ−ＦＫ２に２Ａの組立ては２段工程である。工程１は所望のＴＰＡ同族体、 ＢＧＨからのポリアゾニレ−ジョンシグナル配列ならびにｐｓＶｃＯＷ７の選択 可能なマーカーおよびレプリコンを含有するｐＴＰＡ−ＦＫ２に２Ａの生成を含 み、工程２は前記ＣＭＶ　１．Ｅ、プロモーターの挿入を含む。以下の実施例は ＴＰＡ同族体ＦＫ２に２Ａの挿入を記載するが、同一の酵素および方法を用いて 他の同族体を挿入するこ吉もできる。

工程１．　プラスミドｐＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡ　（チャート２２）をＢａｍＨＩお よびＢｇｌ　ｎで切断してＴＰＡ先導配列塩基１〜１８８を含有するフラグメン ト４７を得る。ｐ　５ＶＣＯＷ７（チャート２０）をＥｃｏＲＩおよびＰ　ｖｕ 　ＩＩで切断してフラグメント４８（６００ｂｐ）を得ることによって、ＢＧＨ のポリアゾニレ−ジョンシグナル配列が得られる。

ＴＰＡ同族体配列はｐＦＫ２に２Ａ　（チャート１２）をＢｇｌ　Ｉ［およびＢ ａ１Ｉ　で切断してフラグメン）　４９　（２，０ｋｂ）を得ることより得られ る。ｐｓＶｃＯＷ７の第２の試料をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ　で切断してｐ ｓＶｃＯＷ７のマーカーおよびレプリコンを含有するフラグメント５０（５，８ ｋｂ）を得る。４種のフラグメントをゲル単離し、Ｔ４　リガーゼを用いて結ん でｐＴＰＡ−ＦＫ２に２Ａ（８，３ｋｂ）を得る。

工程２．　プラスミドｐＴＰＡ−ＦＫ２に２ＡをＢａｍＨＩ　で切断し、５ａｕ ３Ａ消化のＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列を挿入してｐＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２に ２Ａを得、これをＣＨＯ細胞中へのトランスフェクションまでイー・コリ（Ｅ、 　ｃｏｌｉ　）中で維持する。

＋５１　ＣＨＯ細胞のトランスフェクションおよび培養グラバ春ら（Ｇｒａｈａ ｍ　、　ｅｔ　ａｌ、　）　（イントロダクション・オブ・マクロモレキュール ズ・イントウ・バイアプル・ママリアン・セルズ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｔｏ　Ｖｉａｂｌｅ　Ｍａｍｍａｌｉ ａｎ　Ｃｅ１ｌｓ　）、アラン・アール・リス・インコーホレイティラド（Ａｌ ａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、　）、ニューヨーク、１９８０．３〜２５頁）に よって詳細に記載されているＤＮＡの細胞中へのトランスフェクションのための リン酸カルシウム法を用いて、プラスミドｐＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２に２Ａをジヒ ドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）　 細胞中にトランスフェクトする。用いる細胞系は元来コロンビア大学のエル・チ ェイシン（Ｌ、　ＣｈａＳｉｎ　）　から入手可能な突然変異体ＤＸＢ−１１で あり、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ ズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ−）　ＵＳＡ　７７　：　４２１６〜４２２０ ．１９８０にすべて記載されている。前記トランスフェクション法は、トランス フェクトされたプラスミドを一体化する細胞はもはやｄｈｆｒ　を欠くものでは なくてダルベラコラの修正イーグル培地子プロリン中で増殖するという事実に基 づくものである。

ｐＴＰＡ−Ｉ　Ｅ−ＦＫ２に２Ａでトランスフェクトした細胞からクローンを単 離するが、それは、単層で２日間増殖させた場合、百万細胞当たり少く表も１０ 　ｎｇのＴＰＡを合成する。ｐ　Ｉ　ＥＴＰＡ−Ｉ　ＰＡ−ｄｈｆ　ｒを有する 細胞からクローンを単離するが、それは、百万細胞当たり少（とも１００　ｎｇ 　のＴＰＡを合成する。ＴＰＡ同族体の発現はラジオイムノアッセイ、またはウ ェスタンプロット法によって検知できる。

リジケンおよびコレン（Ｒ１ｊｋｅｎ　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｅｎ　）　、ジャーナ ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）２５６　：　７０３５〜７０４１（１９７９ ）の方法によりＴＰＡ同族体を精製する。組換体ＴＰＡ同族体を含有するＣＨＯ 細胞を血清の無い培地中で増殖させる。７２時間後培地を収穫し、１．　ＯＭＮ ａＣｎ　および０．０１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０を含有する０、０２Ｍ ドースカラムに付す。カラムを同一の緩衝液で洗浄し、同一の緩衝液中でＯ〜０ ．０５Ｍイミダゾールの直線グラジェントでＴＰＡ同族体を溶出する。ＴＰＡ同 族体を含有する画分をプールし、１．０　Ｍ　ＮａＣｎ　および０．０１％ツイ ーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０　を含有するＯ：０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５で平 衡化したコンカナバリンＡ−アガロースカラムに付す。同一緩衝液でカラムを洗 浄した後、平衡化緩衝液〜ｏ、ｏｉ’ｚツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０．０，４ ＭＤ−メチルマンノシドおよび２Ｍチオシアン酸カリウムを含有する０、　ＯＩ 　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５の直線グラジェントで溶出する。ＴＰＡ活性を 有する両分をプールし、固体ＫＳＣＮを加えてＫＳＣＮ濃度を１．６Ｍまで増加 させる。両分を約１０倍の濃度とし、１．６　Ｍ　ＫＳＣＮおよび０．０１％ツ イーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０を含有する０、０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５で平 衝化したセファデックスＧ−１５０カラムに付す。ＴＰＡ活性を有する画分をプ ールし、０．１５ＭＮａＣβおよび０．０１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ、　）８０ に対して透析し、−８０℃にて保存する。

Ｃ，スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ 　）における発現以下の実施例は昆虫細胞培養におけるＴＰＡの発現に関する。

すべての手順はサマーズ・エム・ディおよびスミス・シイ・イー（Ｓｕｍｍｅｒ ｓ　、　Ｍ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ％Ｇ、　Ｅ　。

）、テキサス州、カレンダ・ステーション（ＣｏｌｌｅｇｅＳｔＣｏｌｌｅ　） 、テキサス・アグリカルチュラル・イクステンション・サービス（Ｔｅｘａｓ　 Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ＥｘｔｅｎｓｉｏｎＳｅｒｖｉｃｅ　）　、テキサ ス・アグリカルチュラル・エクスペリメント・ステーション（Ｔｅｘａｓ　Ａｇ ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎ　）、農業単科大 学によって発行されたバクロウィルスベクター取扱法および昆虫細胞培養手順に 詳細に記載されている。出発プラスミドｐＡｃ　３７３　（７，１ｋｂ　）は、 アウトグラファ・カリホルニ力・ヌクレア・ポリヘドロシス−ウイノしス（Ａｕ ｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒ ｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　）　（ＡｃＮＰＶ）についての多角体プロモーターから 直ぐ下流にユニークＢａｍ　ＨＩ部位を有する一般的なバクロウィルス発現ベク ターである。多角体蛋白質はウィルス感染およびｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製には必須 でないマトリックス蛋白質である。該プラスミドはテキサス７７８４３　、カレ ンダ・ステーション（ＣｏｌｌｅｇｅＳｔＣｏｌｌｅ　）　、テキサスＡｇｅＭ 大学、昆虫学部門のマックス・サマーズ（Ｍａｘ　Ｓｕｍｍｅｒｓ　）教授より 入手可能であり、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）、３　ｏ２　：　２１５ ６〜２１６５　（１９８３）　に詳細に記載されている。

ｆｉｌ　ｐ　Ａ　ｃ　Ｔ　Ｐ　Ａの組立て−チャート２４ユニークＢａｍ　ＨＩ 部位をやはりユニークであるＢａｌＩＩ部位を挿入することによって、出発プラ スミドｐＡｃ３７３を修飾してＴＰＡ同族体を受容するようにする。プラスミド ｐＡｃ３７３をまずＢａｍＨＩで切断し、次いでマング・ビーン（Ｍｕｎｇ　ｂ ｅａｎ　）ヌクレアーゼで処理して平滑末端を得る。次いでＢｇｌＩＩ　ＩＪン カーを該末端に結び、該末゛端を再び結合してｐＡｃ３７３　、ＢｇｌｌＩ　を 得る。チャート２１からのプラスミドｐＴＰＡｃＤＮＡ　ＳＢａｍＨＩをＢａｍ ＨＩで十分に消化し、ＢｇｌｌＩ　で部分的に消化して無傷ＴＰＡｃＤＮＡにつ いてコード付けするフラグメント５１（１，９５ｋｂ　）を得る。フラグメント ５１をゲル単離シ、ｐＡｃ３７３　、　ＢｇｌＩＩのＢｇｌＩ［部位に挿入して ニス・フルギペルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）において天然ＴＰＡを発 現できるｐＡｃＴＰＡを得る。

（２１ｐＡｃＦＫ２に２Ａの組立て−チャート２５この発現プラスミドについて は、ＢｇｌＩＩ　を用いてＴＰＡ同族体ＦＫ２に２ＡをｐＦＫ２に２Ａ　（チャ ート１２）から切り出し、ＴＰＡ同族体をコード付けするｃＤＮＡをフラグメン ト５３（２，０ｋｂ）　としてゲル単離する。プラスミドｐＡｃＴＰＡ　（チャ ート２４）をＢｇｌｌＩ　で切断してフラグメント５２　（７，１５ｋｂ）　を 得る。フラグメント５２および５３を結んでｐＡｃＦＫ２に２Ａ（９，１５ｋｂ 　）を得、これをニス・フルギペルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）中にト ランスフェクトするまでイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）中で維持する。

（３）ニス・フルギペルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）のトランスフェク ションおヨヒ培養 ニス・フルギペルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）における共トランスフェ クションによってＴＰＡ同族体ヲ天然ＡＣＮＰＶＤＮＡと再び組合せる。ニス・ フルギペ／Ｌｌ”（Ｓ。

ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）　（ＳＦ９；ＡＴＣＣＣＲＬ　１７１１）はディフコ（ Ｄｉｆｃｏ）ラクトアルブミン加水分解物および酵母分解物を補足したブレイス （Ｇｒａｃｅ）培地（ジブコ・ラブ（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂ、）、リボニア（Ｌｉ ｖｏｎｉａ　）、ミシガン州４８１５０）、１０％胎児ウシ血清中で培養する。

細胞を各々１ｐ／ｍＱおよび２μ／己にてＡｃＮＰＶ　Ｄ’ＮＡおよびｐＡｃＴ ＰＡＦＫ２に２Ａで共トランスフェクトする。得られたウィルス粒子は、培地を 収集し、低速遠心によって細胞物質を除去することにより得られる。次いでウィ ルス含有培地ヲ用いてニス・フルギペルダ（Ｓ。

ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）を感染する。天然ウィルスＤＮＡおよびＦＫ２に２Ａ 　ＴＰＡ同族体についてコード付けするｃＤＮＡｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）の感 染の結果、多角体蛋白質の代りにＴＰＡ同族体を発現するいくらかの細胞が得ら れる。ＴＰＡ同族体を産生ずる感染細胞コロニーの検出は、系統的に希釈した（ Ｎｏ−’〜１Ｏ−６）培地を含有するウィルスであらかじめ１時間感染したニス ・フルボ　ペルダ（Ｓ。

ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）の単層を重ねることによって決定する。次いで、　６ 　ｍ９　／　ｒｎＱフィブリノーゲンおよび０．５単位トロンビンを含有する０ 、７％低融点アガールを有するブレる細胞は感染の中心付近に明瞭なプラークを 形成する。

実施例５ 以下の同族体をＣＨＯ細胞から単離し、活性および抗原性について評価した：　 ＦＧＫＩＫ２Ａ％ＦＫＩＫ２ＡおよびＫ２Ａ　０ 第１表は２つの異なるｉｎ　ｖｉｔｒｏ　テスト、活性および抗体認識の結果を 要約する。同族体ＦＧＫＩＫ２ＡおよびＦＫ２Ａは血小板からのプラスミノーゲ ンアクチベーター抑制物質と共に複合体を形成する（トロンビン誘導血小板放出 体）。同族体の分子量は各々約６２０００　および４００００　ダルトンである 。酵素抑制物質複合体の分子量は各々約１１００００および８５０００　ダルト ンである。

実施例６　、　ＴＰ、Ａ同族体の治療応用ＴＰＡは血栓を溶解し、治療的に有用 であることは公知である。ザ・ランセット（Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　）、１０１ ８〜２０頁（１９８１年、１１月７日）；サイエンス（３（ｉｅｎｃｅ　）、２ ２０：１１８１（１９８３）暮およびニュー・イングランド・ジャーナル・オブ ・メデイシン（Ｎ、Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、）、３１０：６０９（１９８４） 。冠血栓を有する患者へのＴＰＡ同族体の投与は、前記２つの文献に記載された 一般法により、歯冠内もしくは静脈内経路を介して行うことができる。

第１表 米 試料　活性（Ｕ／ｍＱ）　抗原”（ｎｇ／ｍＱ）精製した天然 組換体ＴＰＡ　４９０００　９１２００ＯＦＧＫＩＫ２Ｐ　２．１±、０３　４ ７±２ＦＫＩＫ２Ｐ　８．４±、３４　２００±６ＦＫ２Ｐ　４．２±、０．６ 　９７±２８来活性は標準ＴＰＡ調製に対し相対的に示す。

■抗原測定値は前記ＴＰＡに対するヤギ多クローン抗体を用いて得た。

第　１　図 第１図（続き］ 第１図（紐き） 第１図（続き〕 一致＝２５２６　誤一致＝１５　不一致＝１２長さ＝２５５３　一致／長さ＝９ ９．０”−セント第　２　図 第２図（続き） 第２□□□（続き］ 一致＝５５６　誤一致＝７　不一致＝３長さ＝５６６　一致／長さ＝９８．２パ ーセント第　３　図 ＴＰＡ万リゴすクレ万ナト ブロック１＝フインガー（ｆｉｎｇｅｒ）ドメインブロック２＝発育因子ドメイ ン Ｐ２６５’ＧＧＣＡ（１：ＧＴＧＧＡＧＣＡＣＡＧ（：ＧＧＡＧ第３図（続き） Ｐ３７　５’ＡＣＧＣＧ（：ＴＧＣＴＣＴＴ（：ＣＡＧＴｒＧＧＴＧＣＡＣ：Ｔ ＣＧＧＰ３８　５’ＣＣＣＧＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧにＧＣＣＡブロック ４＝クリング／Ｌ／（ｋｒｉｎｇｌｅ］２ドメインＰ８３５’ＡＴにＣＣＣ（１ ：ＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＧＣＰ８４５’ＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣ（：ＡＧＣＡＧ ＧＡＧＣ：ＴＧＡＴＧＡＧＴ第３図（＠き） Ｐ８５５’ＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣ：Ｐ８６５’Ｃに ＴＣＡにＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣ第４図 ＴＰＡドメイン ドメイン　天然ＴＰＡ フィンガー　セリン＃１−リジン＃４９（Ｆｉｎｇｅｒ　）　ヌクレオチド１９ ０−３３６発育因子　セリン＃５０−スレオーニン＃９１ヌクレオチド３３７− ４６２ クリングル１　システィン＃９２→セリン＃１７４（Ｋｒｉｎｇｌｅ　）　ヌク レオチド４６３−７１１クリングル２　グルタミン酸＃１７５→セリン＃２６２ （Ｋｒｉｎｇｌｅ　）　ヌクレオチド７１２−９７５活性部位　スレオニン＃２ ６３−−ｊロリン＃５２７ヌクレオチド９７６→１７７０ ＴＰＡ同族体（チャート１１） フィンガー　セリン＃１→バリン＃４９（Ｆｉｎｇｅｒ　）　ヌクレオチド１９ ０−３４２発育因子゛　アラニン＃５ニーアラニン＃９１ヌクレオチド３４３− ４５６ クリングル１　スレオニン＃９２−システィン＃１７５（Ｋｒｉｎｇｌｅ　）　 ヌクレオチド４５７−７２６クリングル２　グルタミン酸＃１７ローアラニン＃ ２６６（Ｋｒｉｎｇｌｅ　）　ヌクレオチド７２７−９９９活性部位　システィ ン＃２６７−９プロリン＃５３゜ヌクレオチド１０００−１７８２ チャート１．　ｐＴＲＺｌの組立 （ａｌｐＭｃ１４０３をＥｃｏＲＩ、クレノー酵素および細菌アルカリ性ホスフ ァターゼで処理してフラグメント１を（ｂｌｐＶＶｌをｐｖｕ　ＩＩ、Ｂｇｌｌ Ｉおよびクレノー酵素で処理し、続いてｔｒｐプロモーターおよびＴｒｐ　Ｌ　 Ｅ部分を含有するフラグメント２（３２３ｂｐ）を精製する。

（ｃｌ　Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　リガーゼを用いてフラグメント１および２を結ん でｐＴＲＺｌ　（１０ｋｐ　）を得る。

チャート１（続き） ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 １ａｃＺ、　ＬａｃＹ％ＬａｃＡ＝ラクトースオペロンにおけ、る遺伝子 Ｐｔｒｐ　＝　Ｔｒｐプロモーター／オペレーターｔｒｐＬＥ　＝　ｔｒｐＬお よびｔｒｐＥの融合チャート２（続き） （ａｌ　ｐＴＲＺｌ　（１０ｋｂ　）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩならびニア ルカリ性ホスファターゼで処理してフラグメント３（３５０ｂｐ）を得る。

（ｂ）　ｐＫＣ７（５，８ｋｂ　＞をＢａｍ　Ｈ工およびＥｃｏＲＩ　で処理し てフラグメント４（４，０ｋｂ）を得る。

（ｃｌフラグメント３および４を結んでｐＳＫ３　（４，３ｋｂ　）を得る。

５Ｋ３ Ｄ　＝　Ｔｒｐプロモーター／オペレーターＥ　＝　Ｔｒｐ　Ｌリポソーム結合 部位Ｆ、＝ｔｒｐＬＥ　および制限部位 ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 チャート３．　ｐＳＫ４の組立 （ａｌｐｓＫ３をＥｃｏ　ＲＩおよびＢａｍＨＩで切断してフラグメント５（３ ２２ｂｐ）を単離する。

（ｂ）部分子ａｑＩ消化により２７８ｂｌ）フラグメント６ＥｃｏＲＩ〜Ｔａｑ Ｉおよび他のフラグメントを得る。

ｆｃ）フラグメント６をクローンしてｐＢＲ３２２に入れ、ＥｃｏＲＩおよびＣ １ａ　Ｉで切断してｐＳＫ４　（４，６ｋｂ　）を得る。

Ｄ　＝　Ｔｒｐプロモーター／オペレーターＥ＝シャイン・ダルガノ領域 チャート４．　ｐＴＰＡ　３’　ｃ　ＤＮ、Ａの組立（ａｌｐＢＲ３２２をＰｓ ｔＩで切断し、ティリングし、位置１２５０〜２５３’Ｏを有するＴＰＡｃＤＮ Ａの３′端部を挿入することによってプラスミドｐＴＰＡＨ（５，７ｋｂ　）を 得る。

（ｂ）ｐＢＲ３２２をＰｓｔＩで切断し、ティリングし、位置５５０〜１６００ を有するＴＰＡのｃＤＮＡ　を挿入することによってプラスミドｐＴＰＡ８０− １（’５．４ｋｂ）を得る。

（ｃ）プラスミドｐＴＰＡＨおよびｐＴＰＡ８０−１をＳａｃ　ＩおよびＰｖｕ 　Ｉで切断し、フラグメント７（１２５１ｂｐ）および８（５，１ｋｈ）を各々 ゲル単離する。該フラグメントを細菌アルカリ性ホスファターゼで処理し、Ｔ４ で結んでＴＰＡｃＤＮＡの塩基５５０〜２５３０を有するｐＴＰＡ３’ｃＤＮＡ 　（’　６．３　ｋｂ　）を得る。

チャート４（続き） ＴｅｔＲ＝テトラサイタリン耐性 Ｐ＝ＴＰＡｃＤＮＡの５５０〜８０２塩基位置Ａ　＝　ＴＰＡｃＤＮＡの８０２ 〜２５３０塩基位置Ｎ＝ＴＰＡの未翻訳３′領域 チャート５．　ｐＴＰＡｃＤＮＡの組立（ａｌｐＢＲ３２２をＰｓｔＩで切断し 、テーイリングし、ＴＡＰｃ　ＤＮＡ位置１−７５０の５′領域を挿入すること によってプラスミドｐＴＰＡ５’ｃＤＮＡを得る。

（ｂｌプラスミドｐＴＰＡ５’をＴａｑＩ　で切断してフラグメント９（２１９ ４ｂｐ）を得、これをゲル単離し、ＢｇｌＩＩおよびＨｇａ　Ｉで切断してＴＰ ＡｃＤＮＡの塩基１８８〜５９３を含有するフラグメン）　１０　（’４０５　 ｂｐ　）を得る（成熟ＴＰＡ蛋白質）。

フラグメント１０ （ｃｌプラスミドｐＴＰＡ３’ｃＤＮＡ　（チャート４）をＰｖｕ　ＩＩおよび Ｅｃｏ’ＲＩで切断し、フラグメント１１（１７４８ｂｐ）をゲル単離する。フ ラグメント１１をＨｇａ　Ｉ　で切断してフラグメン）１２（２０９ｂｐ）を得 、これをゲル単離するが、このものは塩基５９４〜８０２を含有する。

チャート５（続き） ｆｄ）プラスミドｐＴＰＡ３’ＣＤＮＡをＰｖｕ　Ｉ　で切断し、直線状６．３ ｋｂフラグメントをＴ４ポリメラーゼで処理して平滑末端とし、ＥｃｏＲＩで部 分的に消化してｐＢＲ３２２の塩基８０２〜２５３０と１２３　ｂｐ　を含有す るフラグメント１３（１８７１ｋｂ）　を得る。

（ｅ）プラスミドｐＫＣ７をＢｇｌｌＩおよびＳｍａ　Ｉで切断し、細菌アルカ リ性ホスファターゼで処理し、フラグメント１４（４，８ｋｂ）をゲル単離する 。

フラグメント１４ チャート５（続き） （ｆｌフラグメント１０．１２．１３および１４をプールし、Ｔ４１Ｊガーゼを 用いて結んで成熟ＴＰＡｃＤＮＡを含有するｐＴＰＡｃＤＮＡ　（７，４ｋｂ　 ）を得る。

ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｔ　＝ＴＰＡ　ｃＤＮＡの５′部分 Ｐ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの中央部分 Ａ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの３′部分 Ｎ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの未翻訳３′部分チャート６、ｐＴＰＡ−Ｂｌの組立 （ａｌプラスミドｐＳＫ４をＣ１ａ　１および５ｐｈＩ　で切断してフラグメン ト１５（４，１ｋｂ）を得、これを単離し、ＡＴＧを含有するＣ１ａ　Ｉ／Ｘｂ ａ　Ｉ　リンカ−によりフィンガー（ｆ　ｉｎｇｅｒ　）　ドメインを含有する ブロック１に結Σず。

フラグメント１５ （ｂｌリンカ−によりフラグメント１５およびプロ゛ンク１を結んでｐＴＰＡ− Ｂｌ（４，２５ｋｂ）を得る。

ｐＴＰＡ−Ｂｌ ± チャート６（続き） Ｄ　＝　Ｔｒｐプロモーター／オペレーターＥ＝ＴｒｐＬ　リポソーム結合部位 Ｆ−フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメインＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 ＡＴＧ　＝　翻訳開始コードン チャート？、ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２の組立（ａｌプラスミドｐＴＰＡ−ＢｌをＥｃ ｏ　ＲＩおよびｓｐｈ　Ｉで切断してフラグメン）１６（４５０ｂｐ）および発 育因子ドメインを含有するブロック２（’１００ｂｐ）を得、Ｅｃｏ　ＲＩおよ びｓｐｈ　Ｉを用いて適当なりローンから単離する。

フラグメント１６ （ｂ）フラグメント１６およびブロック２をｐＢＲ３２２のＥｃｏ　ＲＩ　／　 Ｃ１ａ　Ｉ消化から得たフラグメント１７（４，３５ｋｂ）に結んでｐＴＰＲ− Ｂｌ、２（４，８ｋｂ）を得る。

フラグメント１７ チャート７（続き） ｐＴＰＡ−８１，２ Ｐ１０＝Ｔｒｐプロモーター／オペレーターＲｂＳ　＝Ｔｒｐリポソーム結合部 位 ＡＴＧ　＝翻訳開始コードン Ｆ＝フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメインＧ＝発育因子ドメイン ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｏｒｉ　＝　ｐＢＲ３２２の複製開始点チャート８．　ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２（ａ ）の組立（ａ）プラスミドｐＴＰＡ−Ｂｌ、２をＸｂａ　ＩおよびＥｃｏＲＩで 切断してフラグメン）１８（４，５ｋｂ）を得、これを単一に結んでｐＴＰＡ− Ｂｌ、２（ａｌ　Ｃ４，ｓ　ｋｂ　）を得る。

フラグメント１８ ｐＴＰＡ−Ｂ’Ｌ、２（ａ） Ｆ＝フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　） Ｇ＝発育因子領域 ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 チャート９．　ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３の組立プラスミドｐＴＰＡ−Ｂｌ、２（ ａ）をＣ１ａ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩ　で切断し、フラグメント１９（４，０ｋｂ ）を単離し、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　１ならびに上流にＣ１ａ　Ｉ部 位および下流にＢａｍＨＩ　を含有するブロック３（２７０ｂｐ）で結んでｐＴ ＰＡ　３　（４，３ｋｂ）を得る。

フラグメント１９ ｐＴＰＡ−Ｂｌ　、２．３ Ｆ＝フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメインＧ＝発育因子ドメイン に＝クリングル（’　ｋｒｉｎｇｌｅ　）　ＩＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 チャー）　１０．　ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３．４（ａ）の組立（ａ）プラスミド ｐＴＰＡｃＤＮＡ　（チャート５）をＳｃａ　Ｉで切断し、ＴＰＡ遺伝子の３′ 端部を含有するフラグメント２０　（６，０ｋｂ）をゲル単離する。

フラグメント２０ （ｂ）プラスミドｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３（チャート９）をＳｃａ　ＩおよびＢ ａｍＨＩで切断し、フラグメント２１（１１００ｂｐ　’）をゲル単離する。

（Ｃ）フロック４を含有するクローンからクリングル（ｋｒｉｎｇ！ｅ　）　２ 領域を含有するＢａｍ　ＨＩ　／　Ｓｃａ　Ｉフラグメン）４ａ（２３０ｂｐ） を単離する。

チャート１０（続き） フラグメント４ａ （ｅｌプラスミドｐＴＰＡ　−Ｂ　１．２．３．４ａをＨｉｎｄＩ［［およびＡ ａｔＩＩで切断し、２．２ｋｂ始原型ＴＰＡ遺伝子を継代クローンしてＨｉｎｄ 　Ｉ［およびＡａｔＩＩで同様に消化したｐＵＣ１９に入れてｐＴＰＡ　−Ｂ　 １．２．３．４（ａｔ　（４，２ｋｂ）を得る。

プラスミドｐＴＰＡ　−Ｂ　１．２．３．４ａは記号的にｐＴＰＡ−Ｂｌ、２． ３．４ａに似ているが、より好都合な制限部位の配置を有する。

ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｆ＝フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメインチャート１２．　ｐＦＫ２に２Ａの 組立（ａ）プラスミドｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３．４ａをＨｐａＩで切断してフラ グメン）　２２　（’６．５ｋｂ）を得、これをゲルがら単離する。

フラグメント２２ （ｂｌプラスミドｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３．４をＨｐａＩ　およびＭｓｔｌで切 断してクリングル（’　ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２を含有するフラグメント２３（ ５０６ｂｐ）を得る。

（ｃｌフラグメント２２および２３を一緒に結んでｐＦＫ２に２Ａ（７，１ｋｂ ）を得る。

Ｏｒｉ　＝　ｐＢＲ３２２についての複製開始点ＡｍｐＲ＝アンピシリン酎性 チャ耐ト１２　（続き） Ｋ＝クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２ドメインＦ＝フインガー（ｆｉｎｇｅ ｒ　）　ドメインＡ＝活性部位 Ｎ＝非コード３′配列 チャート１３．　ｐＴＰＡ　Ｅｘｐ　１の組立（ａｌプラスミドｐＴＰＡ　−８ １，２（チャート７）をＸｂａ　ＩおよびＢａｍＨＩ　で切断し、フラグメント ２４（４，２ｋｂ）を得、これをゲル単離する。

フラグメント２４ （ｂｌプラスミドｐＦＫ２に２Ａ（チャート１２）をＸｂａ　ＩおよびＢｇｌＩ ［で切断してフラグメント２５（２，０ｋｂ）をフラグメント２５ （ｃｌフラグメント２４および：２５　ヲ結Ａ、　テｐＴＰＡ　Ｅｘｐ　１（６ ，２ｋｂ＞を得る；ＢａｍＨ：［およびＢａ１Ｉ［は相補的であるが回復されな い。

チャート１３（続き） ｐＴＰＡＥｘｐ　１ ｒｒｐＰ１０＝）リプトファージプロモーター／オペレーター Ｒｂ５＝リポソ一ム結合部位 に＝クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　）　２Ｆ＝フインガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ド メインＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 ＡＴＧ＝　翻訳開始コードン チャート１４．　ｐｙＲｅｐ　３’Ｂの組立（ａｌｌプラスミドルＹＩＰ３１を ＳｍａＩで切断し、細菌アルカリ性ホスファターゼで処理してフラグメント２６ を得る。

フラグメント２６ （ｂ）酵母の２μプラスミドをＰｓｔ　ＩおよびＸｂａ　Ｉで切断し、クレノー 酵素で処理する。得られたフラグメンフラグメント２７ （ｃ）フラグメント２６および２７を結んでｐｙＲｅｐ３’Ｂ　（６、７ｋｂ　 ）を得る。

Ｕ　＝　ＵＲＡ３ Ｒ＝Ｒｅｐｌ［および複製開始点に及、３コ配列チャート１５．　プラスミドｐ ＧＧ４００の組立（ａｌプラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩおよびＰｖｕ　Ｉ Ｉで切断し、末端をクレノー酵素で満たしてフラグメント２８（２，３ｋｂ）を 得る。

フラグメント２８ （ｂｌプラスミドｐＭＬ２１をＰｖｕ　ＩＩで切断してフラグメント２９（１， ７ｋｂ）を得る。

フラグメント２９ （ｃｌＴ４を用いてフラグメント２８および２９を結んでｐＧＧ４００　（４， ０ｋｂ　）を得る。

Ａｍｐ　Ｒ＝アンピシリン耐性 ＫｍＲ＝カナマイシン耐性 チャート１６．　ｐＡＤＨｔの組立 （ａｔプラスミドｐＧＧ４００をＸｈｏ　ＩおよびＰｖｕ　ＩＩで切断し、クレ ノー酵素で処理し、得られたフラグメント３゜（３Ｌ５ｋｂ）を単離する。

フラグメント３０ （ｂｌプラスミドｐＡＤＨＢＣをＨｉｎｃ　■およびＢａｍＨＩ　で切断し、末 端をＴ４リガーゼで満たし、得られたフラグメント３１（０，３６ｋｂ）を単離 する。

フラグメント３１ （Ｃ）Ｔ４リガーゼを用いてフラグメン）３０および３１を結んでｐＡＤＨｔ　 （３，８６ｋｂ）を得る。

チャート１６（続き） ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 ＫｍＲ＝カナマイシン耐性 Ｈ＝ＡＤＨｔ３’末端 チャート１７．　プラスミドｐ　ＡＤＨｔ　−Ｒｅｐ　ｍの組立（ａ）　Ｂａｍ ＨＩ　で制限し、８一体５ａｌＩリンカ−を満たしたＢａｍＨＩ　部位へ結ぶこ とによってプラスミドｐＡＤＨｔを修飾する。

（ｂ）（修飾した）プラスミドｐＡＤＨｔをｓｐｈ　Ｉ　で切断し、Ｔ４　リガ ーゼで末端を満たしてフラグメント３２（’　３−８　ｋｂ　）を得る。

（ｃ）プラスミドｐｙＲｅｐ　３１　Ｂ　（チャート１６）を）（ｉｎｄＩ［［ で切断し、Ｔ４リガーゼで末端を満たしてフラグメント３３　（２，４ｋｂ　） を得る。

（ｄｌＴ４リガーゼを用いてフラグメント３２および３３を結んでｐＡＤＨｔ　 −Ｒｅｐｍ　（６，２ｋｂ　）を得る。

チャート１８．ｐα１−ＡＤＨｔの組立チャート１７（続き） ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｈ＝ＡＤＨｔ３’末端 チャート１８（続き） （ａｌプラスミドｐＡＤＨｔ−Ｒｅｐｍ　（チャート１５）をＥｃｏ　ＲＩおよ び）（ｉｎｄＩ［で切断し、フラグメント３４（５，３ｋｂ）を単離する。

（ｂｌ　Ｅｃｏ　ＲＩおよび）（ｉｎｄ　ＩＩでプラスミドｐαｌを制限して１ ．２ｋｂを有するフラグメント３５を含有するＭＦα１遺伝子を得る。

フラグメント３５ （ｃｌＴ４リガーゼを用いてフラグメント３４および３５を結んでｐα１−ＡＤ Ｈｔ　（６，５ｋｂ　）を得る。

ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｈ＝ＡＤＨｔ’末端 ｕ　”　Ｕｒａ　３ Ｒ＝ＲｅｐＮおよび複製開始点 ＭＦα１＝プロモーターおよびＭＦα１遺伝子についてのシグナル配列 チャート１９．ｐα１−ＦＫ２に２Ａの組立（ａ）プラスミドｐＦＫ２に２Ａ（ チャート１２）をＢｇｌＩＩで切断してフラグメン）３６（２，０ｋｂ）を得、 これをゲル単離する。

フラグメント３６ （ｂ）プラスミドｐａ　１−ＡＤＨｔをＨｉｎｄｌ［およびＸｈｏ　Ｉで切断す る；塩基アデノシンおよびグアノシンの存在において末端をクレノー酵素で部分 的に満たし、マンク゛・ビーン（’Ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ　）ヌクレアーゼで処理 してフラグメンｌ−３７（５，６ｋｂ）を得、これをゲル単離する。

フラグメント３７ （ｃｌフラグメント３６および３７を結んでｐ　／２１−ＦＫ２に２Ａ（７，５ ｋｂ）を得る。

チャート１９　（続き） ＭＦα１＝プロモーターおよびＭＦα１遺伝子についてのシグナル配列 Ｆ＝フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　） Ｋ＝クリング／Ｌ／　（ｋｒｉｎｇｌｅ　）領域２Ａ＝活性部位 Ｎ＝未翻訳３′配列 Ｈ＝ＡＤＨ１３′末端 Ｒ＝ＲｅｐＩ［および複製開始点 チャート２０．　ｐｓＶｃＯＷ７の組−立（ａｌプラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒを ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断してフラグメント３８　（５，Ｏｋｂ　）を 得る。

フラグメント３８ （ｂ）プラスミドｐλＧＨ２Ｒ２をＢａｍＨＩおよびＥＣＯＲＩで切断してフラ グメン）３９（２，１ｋｂ）を得る。

フラグメント３９ （ｃｌフラグメント３８および３９を結んでｐｓＶｃＯＷ７（７，１ｋｂ）を得 る。

ｐｓＶｃＯＷ７ チャート２０（続き） Ａ−ウシ成長ホルモンポリＡティル部 Ｇ＝ゲノムウシ成長ホルモン ■＝イントロン ｄｈｆｒ　＝ジヒドロ葉酸還元酵素 ５Ｖ４０＝　ＳＶ４０プロモーターおよび複製開始点ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐 性 チャート２１．　ｐＴＰＡｃＤＮＡ、ＢａｍＨＩの組立（ａｌプラスミドｐＴＰ Ａ５’ｃＤＮＡ　（チャート５、パートクレノーで平滑とし、１ｏ一体ＢａｍＨ Ｉリンカ−に結ぶ。

フラグメント４０をＮａｒＩ　で切断してＴＰＡｃＤＮＡの塩基７８〜５１８を 有するフラグメント４１（４４ｏｂｐ）を得る。

フラグメント４０ （ｂｌプラスミドｐＴＰＡｃＤＮＡ　（チャート５）をＮａｒＩおよびＢｇｌｎ で切断し、ＴＰＡ　ｃＤＮＡの３′部分を含有するフラグメント４２（１６４４ ｂｐ）をゲル単離する。

フラグメント４２ （ｃ）プラスミドｐＫＣ７をＢａｍＨＩおよびＢｇｌｌＩ　で切断してフラグメ ント４３（４，３ｋｂ）を得、これをゲル単離し、フラグメント４１および４２ を結んでｐＴＰＡｃＤＮＡ、チャート２１（続き） ＢａｍＨＩ　（’　６．５　ｋｂ　）を得る。

ｐＴＰＡｃＤＮＡ、　ＢａｍＨＩ Ｌ−先導配列 Ｔ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの５′部分 Ｐ＝ＴＰＡｃＤＮＡの中央部分 Ａ　＝　ＴＰＡｃＤＮＡの３′部分 Ｎ＝ＴＰＡｃ’ＤＮＡの未翻訳３′部分チャー）　２２．　ｐＴＰＡ−ＩＥ−Ｐ Ａの組立（ａｌプラスミドｐｓＶｃＯＷ７をＥｃｏ　ＲＩおよびＰｖｕＩＩで切 断してウシ成長ホルモンのポリアゾニレ−ジョン配列を含有するフラグメン）　 ４４　（６００ｂｐ　）　ヲ得、コレラゲル単離する。

フラグメント４４ （ｂ）プラスミドｐｓｖｃｏｗ７（チャート２０）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ Ｉ　で切断してフラグメント４５　（’　５．８　ｋｂ）フラグメント４５ （ｃｌプラスミドｐＴＰＡｃＤＮＡ、ＢａｍＨＩ　（チャート２１）をＢａｍＨ ＩおよびＢａ１Ｉで切断してフラグメント４６（２，０ｋｂ）を得る。

チャート２２（続き） フラグメント４６ （ｄｌフラグメント４４．４５および４６を結んでｐＴＰＡ−ＰＡ　（８，４ｋ ｂ　）を得る。

ｐＴＰＡ−ＰＡ プラスミドｐＴＰＡ−ＰＡをＢａｍＨＩで切断し、ＣＭＶゲノムのＰｓｔＩおよ びＳａｕ　３　Ａ　Ｉ消化からのＣＭＶ　−Ｉ　Ｅ　プロモーター（７６０ｂｐ ）を挿入してｐＴＰＡ−ＩＥ−ＰＡを得る。

ｐＴＰＡ−ＩＥ−ＦＡ チャート２２　（続き） ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｏｒｉ　＝　ｐＢＲ３２２複製開始点 ＳＶ４０／□ｒｉ＝シミアン（５１ｍ１ａｎ　）ウィルス複製開始点 ＭＯ／ｄｈｆｒ＝マウスジヒドロ葉酸還元酵素マーカーＣＭＶ／Ｆｒｏｍ　＝サ イトメガロウィルスプロモーターＬ　＝　ＴＰＡ先導配列 Ｔ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの５′領域 Ｐ＝ＴＰＡｃＤＮＡの中央領域 Ａ＝ＴＰＡｃＤＮＡの３領域 Ｎ＝ＴＰＡｃＤＮＡの未翻訳３′領域 ａ＝ポリアゾニレ−ジョンシグナル配列チャー）　２３．　ｐＴＰＡ−４Ｅ−Ｆ Ｋ２に２Ａの組立（ａｌ　ｐＴＰＡ　−Ｉ　Ｅ　−ＰＡ　（チャート２２）をＢ ａｍＨＩおよびＢｇｌｌＩ　テ切ＩＦｒ　Ｌ、テア　ラフｌ　７　）　４７　（ ’１２０ｂｐ　）　ｆ得、これをゲル単離する。

フラグメント４７ 断してウシ成長ホルモンのポリアゾニレ−ジョン配列を含有するフラグメント４ ８（６００ｂｐ）　を得、これをゲル単離する。

フラグメント４８ （ｃｌプラスミドｐＦＫ２に２Ａ（チャート１２）をＢｇｌＩＩおよびＢａ１Ｉ で切断してフラグメント４９（１，７ｋｂ）を得、これをゲル単離する。

チャート２３（続き） フラグメント４９ （ｄ）プラスミドＩ）ＳＶＣＯＷ７　（チャート２０）をＥｃｏＲＩおよびＨａ ｍＨＩで切断してフラグメン）５０を得る。

フラグメント５０ （ｅｌＴ４リガーゼを用いてフラグメント４７．４８．４９および５０を結んで ｐＴＰＡ　ＦＫ２に２Ａ　（８，３ｋｂ　）を得る。

ｐＴＰＡＦＫ２に２Ａ ＣＭＶゲノムのＰｓｔＩおよびＳａｕ　３　Ａ　Ｉ消化からのＣＭＶ　−ＩＥプ ロモーター（７６ｏｂｐ）を挿入してｐＴＰＡ−４Ｅ−チャート２３（続き） ＦＫ２に２Ａ　を得る。

ｐＴＰＡ−ＩＥ−ＦＫ２に２Ａ ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｏｒｉ　＝　ｐＢＲ３２２複製開始点 ５Ｖ４０−シミアン（５１ｍ１ａｎ　）ウィルス複製開始点ＣＭＶ／Ｆｒｏｍ　 ＝サイトメガロウィルスプロモーターＬ＝ＴＰＡ先導配列 Ｔ＝ＴＰＡｃＤＮＡの５′領域 Ｐ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの中央領域 ＊　Ｆ＝フ、インガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメインに一クリングル（ｋｒｉｎｇ ｌｅ　）　２Ａ＝活性部位 Ｎ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの未翻訳３′領域ａ−ポリアゾニレ−ジョンシグナル 配列チャー）　２４．　ｐＡｃ　ＴＰＡの組立（ａ）プラスミドｐＡｃ　３７３ 　（７，１ｋｂ　）をＢａｍＨＩで切断し、マング・ビーン（Ｍｕｎｇ　ｂｅａ ｎ　）ヌクレアーゼで処理して平滑末端を得、これにＢｇｌｌＩＩＪンヵーを加 える。

末端を再び連結してｐＡｃ３７３、ＢｇｌｌＩを得る。

ｐＡｅ３７３．　ＥｇｌＩ工 （ｂｌプラスミドｐＴＰＡｃＤＮＡ、ＢａｍＨＩ　（チャート２１）をＢａｍＨ Ｉで切断し、ＢｇｌＩＩで部分的に消化して無傷ＴＰＡｃＤＮＡを含有するフラ グメント５１（１，９５ｋｂ　）を得る。

フラグメント５１ チャート２４（続き） （ｃｌフラグメント５１を挿入し、ｐＡｃ３７３、ＢｇｌＩＩのＢｇ１ｍ部位に 結んでｐＡｃ　ＴＰＡ　（９，０５ｋｂ　）を得る。

Ｌ＝先導配列 Ｔ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの５′部分 Ｐ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの中央部分 Ａ＝ＴＰＡｃＤＮＡの３′部分 Ｎ　＝ＴＰＡ　ｃＤＮＡの未翻訳３′邪分ＡｍｐＲ−アンピシリン耐性 Ｐｏ１ｙ−多角体蛋白質遺伝子 チヤード２５．　ｐＡｃＦＫ２に２Ａの組立（ａｌ　ｐＡｃ　ＴＰＡ　（チャー ト２４）をＢｇｌＩＩで切断してフラグメント５２（７，１５ｋｂ）を得る。

フラグメント５２ （ｂ）プラスミドＩ）ＦＫ２に２Ａ　（チャート１２）をＢｇｌｌＩで切断し、 同族体ｃＤＮＡをフラグメント５３（２，０ｋｂ　）としてゲル単離する。

フラグメント５３ （ｃ）　７ラグメント５２および５３を結んでｐＡｃ　ＦＫ２に２Ａ（９，１５ ｋｂ　）　を得る。

チャート２５　（続き） Ｌ−先導配列 Ｆ−フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ　）ドメインに＝クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ　 ）　２ドメインＡ＝活性部位ドメイン Ｎ＝ＴＰＡｃＤＮＡの未翻訳３′部分 ＡｍｐＲ−アンピシリン耐性 国際調査報告 １ｍｓｍｅ＋＋ｅａａｌ　Ａｓｔｈｍａｓ　Ｎ。　ＰＣＴ／υＳ　８６１０２６ ８４ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　°ｚｊＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨ ＲＥＰＯＲＴ　ＪＮＥＦ’−Ａ−０２０７５Ｂ９　０７１０１／８７　Ｎｏｎｅ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．溶性部位と、フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）ドメイン（Ｆ）、発育因子ドメイ ン（Ｇ）、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）１ドメイン（Ｋ１）およびクリングル （ｋｒｉｎｇｌｅ）２ドメイン（Ｋ２）よりなる群から選択される１またはそれ 以上のドメインよりなり、（ａ）インタードメイン領域をコード付けするヌクレ オチド配位内に該ドメイン領域をコード付けするヌクレオチド配列中には存在し ない非天然エンドヌクレアーゼ制限部位を含有し、（ｂ）９００００ダルトン以 下の分子量を有するＴＰＡ様蛋白質をコード付けし、ここに該ドメインはその中 で２回以上現われないことを特徴とするＴＰＡ様蛋白質コード付けヌクレオチド 塩基よりなるＤＮＡ化合物。 ２．該ドメイン領域コード付けヌクレオチド配列がその順序、出現またはそれら の双方に関し天然配置から変化されたものである前記第１項の化合物。 ３．Ｘｂａ部位がヌクレオチド塩基１８７〜１９８間に挿入された前記第１項の 化合物。 ４．ＨｐａＩもしくはＳｐｈＩ部位またはそれらの組合せがヌクレオチド塩基３ ２８〜３４２間に挿入された前記第１項の化合物。 ５．ＥｃｏＲＶ、ＣｌａＩ、もしくはＳｍａＩ部位またはそれらの組合せがヌク レオチド塩基４４２〜４６２間に挿入された前記第１項の化合物。 ６．ＢａｍＨＩもしくはＨａｐＩ部位またはそれらの組合せがヌクレオチド塩基 ７０９〜７２６間に挿入された前記第１項の化合物。 ７．ＭｓｔＩ、ＳｐｈＩ、もしくはＸｍａＩＩＩ部位またはそれらの組合せがヌ クレオチド塩基９７３〜９９７間に挿入された前記第１項の化合物。 ８．ＤＮＡが、該ドメインがアミノ末端からａ．ＦＡ； ｂ．ＦＧＫ１Ａ； ｃ．ＦＧＫ２Ａ； ｄ．ＦＫ２Ａ； ｅ．ＦＫ１Ｋ２Ａ； ｆ．ＦＫ２Ｋ２Ａ； ｇ．．ＦＫ１Ａ；または ｈ．ＦＧＫ１Ｋ２Ａ の順で並ぶＴＰＡ様蛋白質についてコード付けする前記第１項の化合物。 ９．ＴＰＡ様蛋白質をコード付けする配列から上流および下流の双方のヌクレオ チドの配列が該化合物を適当な宿主細胞によつて維持されることを可能とする前 記第１項の化合物。 １０．該適当な宿主細胞がＴＰＡ様蛋白質を発現することを可能とすることがで きる前記第９項の化合物。 １１．該ドメインがアミノ末端から ａ．ＦＡ； ｂ．ＦＧＫ１Ａ； ｃ．ＦＧＫ２Ａ； ｄ．ＦＫ２Ａ； ｅ．ＦＫ１Ｋ２Ａ； ｆ．ＦＫ２Ｋ２Ａ； ｇ．ＦＫ１Ａ；または ｈ．ＦＧＫ１Ｋ２Ａ の順で並ぶＴＰＡ様蛋白質をコード付けするＤＮＡを含有する前記第１０項の化 合物。 １２．該適当な宿主が： １．酵母、 ２．真核生物細胞、および ３．エシエリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種よりなる群から選択される前記 第１０項の化合物。 １３．該適当な宿主細胞がチヤイニーズハムスター卵巣細胞である前記第１０項 の化合物。 １４．該適当な宿主細胞が昆虫由来の真核生物細胞である前記第１０項の化合物 。 １５．該昆虫宿主細胞がボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）またはス ポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）から 選択される前記第１４項の化合物。 １６．活性部位ならびにフインガー（ｆｉｎｇｅｒ）ドメイン（Ｆ）、発育因子 ドメイン（Ｇ）、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）１ドメイン（Ｋ１）およびクリ ングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）２ドメインよりなる群から選択されろ１またはそれ以 上のドメインよりなり、該ドメイン領域が、蛋白質の総分子量が９００００ダル トンを超えずかつドメインが２回以上現われない場合、その順序、出現またはそ れらの双方に関し天然配置から変化されたものであることを特徴とするＴＰＡ様 蛋白質。 １７．該ドメインがアミノ末端から ａ．ＦＡ； ｂ．ＦＧＫ１Ａ； ｃ．ＦＧＫ２Ａ； ｄ．ＦＫ２Ａ； ｅ．ＦＫ１Ｋ２Ａ； ｆ．ＦＫ２Ｋ２Ａ；または ｇ．ＦＫ１Ａ の順で並んだものである群から選択される前記第１４項の蛋白質。 １８．該細胞が以下の真核生物および原核生物種：ａ．イー・コリ（Ｅ．Ｃｏｌ ｉ）； ｂ．酵母； ｃ．チヤイニーズハムスター細胞； ｄ．昆虫細胞； ｅ．スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）ｆ．ボンビツクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）；およびｇ．哺乳動物細胞 の群から得られたものである前記第１０項の化合物を含有する宿主細胞。