JPH0550271B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 90000ダルトン未満の分子量を有し、および、
その天然の順序がFGK1K2AであるTPAと比較
して、FK2A、FK2K2AまたはFK1K2Aの順序
を有し、ここに、Ｆはフインガードメインであ
り、Ｇは成長因子ドメインであり、K1およびK2
はクリングル１および２ドメインであつて、Ａは
活性部位であるTPA様蛋白。 ２ 該順序がFK2Aである請求の範囲第１項記載
の蛋白。 本発明はヒト組織プラスミノ−ゲンアクチベータ
ー（TPA）同族体を開示する。該同族体は天然
ドメイン領域が再配置された、欠失された、付加
されたまたはそれらを組合せた処理をされたのい
ずれかであるTPA様分子である。該同族体は本
明細書中に同様に記載する組換体デオキシリボ核
酸（DNA）の発現の産生物である。さらに、本
明細書中には前記TPA−コーデイングDNA配列
を含有する複製および発現プラスミドならびに適
当なプラスミドで形質転換された状態となつた後
TPA同族体を発現することができる適当な宿主
微生物を記載する。 背景 TPAは、血餅が形成されるときに該血餅を溶
解するのを補助することによつて血液凝固を治療
するのに治療価値を有する。血栓崩壊はフイブリ
ン塊溶解の過程である。その目的のためには、そ
の不活性チモーゲン、プラスミノーゲンからセリ
ンプロテアーゼプラスミンが形成される。プラス
ミノーゲンの活性化はプラスミノ〜ゲンアクチベ
ーターと呼ばれる一群のセリンプロテアーゼによ
る蛋白質加水分解切断によつて達成される。これ
らのアクチベーターはほとんどの体液中に存在
し、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を
開始する。これにより、少量のプラスミノーゲン
アクチベーターが多量のプラスミノーゲンを活性
化することができるカスケードがつくられる。in
vivoにおいて、プラスミノーゲンアクチベーター
はプラスミノーゲンをプラスミンに活性化し、次
いでプラスミンが作用してフイブリン塊を分解す
る。血餅溶解に対して生理学的に重要であるプラ
スミノーゲンアクチベーターはTPAである。 TPAは、血管内皮細胞によつて産生される分
子量が約66000ダルトンのセリンプロテアーゼで
ある。それはグリコシル化されており、その唯一
の公知蛋白質基質はプラスミノーゲンである。
TPAは５種のドメイン：フイブロネクチンフイ
ンガー（finger）ドメイン(F)、発育因子
（growth factor）ドメイン(G)、クリングル
（kringle）１ドメイン（K1）、クリングル
（kringle）２ドメイン（K2）および活性部位ド
メイン(A)を有する。これらのドメインの１または
それ以上はTPAの特別のフイブリン結合活性を
担つている。 そのフイブリン親和性に加え、プラスミノーゲ
ンの活性化はフイブリンの存在において促進され
る。ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼの如
き他の血餅分解薬剤はフイブリン塊に対する特異
性を全く持つていなので、これらの特性はTPA
を価値ある治療剤とする。 該ドメインを操作することによつて、フイブリ
ンに対する天然酵素の親和性を改良し、そのin
vivo半減期を増大させることが可能である。より
具体的には、クリングル（Kringle）２またはフ
インガー（Finger）ドメインの複製はフイブリ
ン親和性を促進するであろう。発育因子ドメイン
の除去はin vivo半減期を増加させ、フインガー
（finger）領域ドメインをクリングル（kringle）
領域１または２の次に置くとフイブリン親和性を
高めるであろう。 情報の開示 ヒトTPAは精製され、その物理特性が研究さ
れてきた。リジケンら（Rijken et al.）、「培養
中のヒト黒色腫細胞により分泌されたプラスミノ
ーゲンアクチベーターの精製および特徴づけ」、
ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）、256巻、No.13、7035〜41頁
（1981年７月10日）。実験量のヒトTPAはヒト黒
色腫細胞の培地から得られる。クルフト・シイら
（Kluft、Ｃ et al.）、アドバーンシズ・イン・バ
イオテクノロジカル・プロセシズ（Advances in
Biotecchnological Processes）中の「ヒト黒色
腫細胞からの外来性（組織タイプ）プラスミノー
ゲンアクチベーターの大規模産生」、ミズラヒ・
エイおよびウエゼル・エイ・エル（Mizrahi、A.
and Wezel、A.L.）編、２：97〜110（1983）。ヒ
トTPAのバイオ活性は研究されており、生命を
脅かす血液凝固物を分解するその能力により、動
物モデルおよびヒトにおいて治療価値を有するこ
とが証明されている。コルニンガーら
（Korninger et al.）、「大腿静脈血栓症を有する
イヌにおけるヒト外来性（組織タイプ）プラスミ
ノーゲンアクチベーターを用いる血栓崩壊」、ジ
ヤーナル・オブ・クリニカル・インベステイゲー
シヨン（J.Clin. Invest.）、69巻、573〜580頁
（1982年３月）；ワイマールら（Weimar et al.）、
「外来性（組織タイプ）プラスミノーゲンアクチ
ベーターの投与による腸骨大腿血栓の特異的溶
解」、ザ・ランセツト（The Lancet）、1018〜20
頁（1981年11月７日）；およびバン・デ・ウエル
フ、エフら（Van De Werf、F.et al.）、進展し
た心筋梗塞を持つ患者における組織タイププラス
ミノーゲンアクチベーターを用いる冠血栓崩壊、
ジヤーナル・オブ・ニユー・イングランド・メデ
イシン（J.of N.Eng.Med.）、310：609〜613
（1984）。TPAの半減期は２〜３分であると見積
られており、そのため、非実用的ではないにせ
よ、治療剤として使用するには不都合となつてい
る。コレン、デイら（Collen、D.et al.）、組織タ
イププラスミノーゲンアクチベーターを用いる血
塊−選択的冠血栓崩壊、サイエンス（Science）、
220：1181〜1183（1983）。 TPAの酵素反応機構は研究されてきた。リジ
ケンら（Rijken et al.）、「一本鎖および二本鎖
ヒト外来性（組織タイプ）プラスミノーゲンアク
チベーターのフイブリン溶解現象特性」、ジヤー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）、257巻：2920〜2925（1982）。他の
動物の血塊についてよりもヒト血塊についてより
優れたヒトTPAの結合親和性およびフイブリン
溶解親和性は公知である。コルニンガーら
（Korninger et al.）、「in Vitroでのヒト血液お
よび各種動物種におけるヒト外来性（組織タイ
プ）プラスミノーゲンアクチベーターの特異的フ
イブリン溶解現象特性についての研究」、スロン
ボウシス・アンド・ヘマトスタシス
（Thrombos.Haemostas.）、46(2)：561〜565
（1981）。フイブリン溶解活性および親和性に関す
るドメインの構造関係も記載されてきた。バヌア
イ・エルら（Banyai、L.et al.）、フイブロネク
チンおよび組織タイププラスミノーゲンアクチベ
ーターのフイブリン結合構造の共通の進化的起
源、エフ・イー・ビイ・エス・レターズ（FEBS
Lett.）、163(1)：37〜41（1983）およびヌイ・テイ
ら（Ny、T.et al.）、ヒト組織タイププラスミノ
ーゲンアクチベーター遺伝子の構造：機能および
構造ドメインに対するイントロンおよびエクソン
構造の関係、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.
Natl.Acad.Sci.）USA、81：5355〜5359（1984）。 形質転換した細菌および酵母によるTPAの発
現も公知である。ヒトTPAのメツセンジヤーリ
ボ核酸（RNA）は最初1982年に単離された。オ
プデンアツカーら（Opdenakker et al.）、「ヒト
組織プラスミノーゲンアクチベーターについての
メツセンジヤーRNA」、ユアロピーアン・ジヤー
ナル・オブ・バイオロジー（Eur.J.Biol.）、269〜
74頁（1982）。ペニカら（Pennica et al.）によ
つて、TPAの発現用に細菌が形質転換された。
「イー・コリ（E.coli）におけるヒト組織タイプ
プラスミノーゲンアクチベーターcDNAのクロー
ニングおよび発現」、ネイチヤー（Nature）、
301：214〜21（1983）。ヒトTPAを発現するため
の酵母を形質転換する方法は米国特許出願SN
663025号および公開されたヨーロツパ特許出願
EP 143081号に記載されている。 発明の要約 本発明は、遺伝子組換えによつて天然ヒト組織
プラスミノーゲンアクチベーターのドメイン領域
を再配置することによる該蛋白質の改良された薬
理学効果に関する。該改良された効果は延長され
た半減期および増大されたフイブリン親和性を包
含する。本明細書中にて記載するのは、ドメイン
の好都合な切断および再配置に有用であるユニー
クな制限部位をTPAのインタードメイン領域内
に含有するDNA配列である。また、このTPAを
コード付けするDNAを含有するプラスミドおよ
び再配置されたTPAを発現する適当な宿主も記
載する。最後に再配置したTPA蛋白質を記載す
る。 具体的には、本発明は、90000ダルトン未満の
分子量を有し、および、その天然の順序が
FGK1K2AであるTPAと比較して、FK2A、
FK2K2AまたはFK1K2Aの順序を有し、ここに、
Ｆはフインガードメインであり、Ｇは成長因子ド
メインであり、K1およびK2はクリングル１およ
び２ドメインであつて、Ａは活性部位である
TPA様蛋白を提供する。 また、本明細書中には、90000ダルトン未満の
分子量を有し、および、その天然の順序が
FGK1K2AであるTPAと比較して、FK2A、
FK2K2AまたはFGK2Aの順序を有し、ここに、
Ｆはフインガードメインであり、Ｇは成長因子ド
メインであり、K1およびK2はクリングル１およ
び２ドメインであつて、Ａは活性部位である
TPA様蛋白をコードし、かつインタードメイン
領域をコードするヌクレオチド配列内に、該ドメ
イン領域をコードするヌクレオチド配列に存在し
ない非天然エンドヌクレアーゼ制限部位を含有す
るDNAを記載する。 さらに具体的には、Xba部位がヌクレオチド
塩基187〜198間に挿入され、HpaもしくはSpa
部位またはそれらの組合せがヌクレオチド塩基
328〜342間に挿入され、EcoRV、Cla、もしく
はSma部位またはそれらの組合せがヌクレオ
チド塩基442〜462間に挿入され、BamHもし
くはHpa部位またはそれらの組合せがヌクレオ
チド塩基709〜726間に挿入され、およびMst、
Sph、もしくはXma部位またはそれらの組合
せがヌクレオチド塩基973〜997間に挿入された前
記TPA−コーデイングDNAの化合物を本明細書
中にて記載する。 前記したそれらのTPA−コーデイングDNA配
列のうちには、ドメイン領域についてコード付け
するヌクレオチドの配列がそれらの順序、出現ま
たは双方に関して天然の配置から変えられたもの
がある。さらに具体的には、DNAが、該ドメイ
ンがアミノ末端から(a)FK2A；(b)FK2K2A；およ
び、(c)FK1K2Aの順序で並べられたTPA様蛋白
質についてコード付けするTPAコーデイング
DNA配列を本明細書中にて記載する。 さらに、TPA様蛋白質をコード付けする配列
から上流および下流の双方のヌクレオチド配列が
化合物を適当な宿主中で維持されることを可能と
する前記した如きTPA−コーデイングDNA配列
の化合物がある。さらに具体的には、発現される
蛋白質の総分子量が90000ダルトンを超えずかつ
ドメインが２回以上現われない場合、適当な宿主
細胞がドメイン領域がその順序、出現または双方
において変化されたTPA様蛋白質特にそれらの
同族体を発現できるようにすることもできる化合
物を本明細書中に記載する。なおさらに具体的に
は、ドメインがアミノ末端から次のように：(a)
FK2A；(b)FK2K2A；および、(c)FK1K2Aの順
で並べられたTPA様蛋白質についてコード付け
するDNAを含有する発現および複製プラスミド
（ベクター）を本明細書中に記載する。 前記プラスミドであつて再配置されたTPA蛋
白質の発現用のものを維持することができる適当
な宿主微生物も本明細書中に記載する。例えば、
適当な宿主が：(a)酵母；(b)エシエリヒア種
（Escherichia）；および、(c)細胞培養物よりなる
群から選択される、TPA様蛋白質についてコー
ド付けするDNA配列を含有する発現および非発
現ベクターを本明細書中に記載する。さらに具体
的には、適当な宿主細胞がチヤイニーズハムスタ
ー卵巣（CHO）細胞である、TPA様蛋白質につ
いてコード付けするDNA配列を含有する好まし
い発現ベクターを本明細書中に記載する。 詳細な記載 本発明は、種々の公知方法で達成することがで
きる一連の分子遺伝子操作を含む。TPAのドメ
イン間にユニークなエンドヌクレアーゼ制限部位
を有する２種の始原型遺伝子はブダペスト条約に
従つて寄託した。宿主微生物は、各々チヤート１
０および１１に示すpTPA−B1、２、３、４(a)
およびpTPA−B1、２、３、４と各付けたプラ
スミドを含有するイー・コリ（E.coli）株であ
る。pTPA−B1、２、３、４(a)の寄託は1986年
８月29日に米国、イリノイ州、ペオリア
（Peoria）、ノーザン・リージヨナル・リサー
チ・センター（Northern Regional Research
Center）に対してなし、与えられた受託番号は
NRRL Ｂ−18106であつた。pTPA−B1、２、
３、４の寄託は1986年11月28日に米国、イリノイ
州、ペオリア（Peoria）、ノーザン・リージヨナ
ル・リサーチ・センター（Northern Regional
Research Center）に対してなし、与えられた受
託番号はNRRL Ｂ−18142であつた。 寄託されたプラスミドは断じて本発明を限定す
るものと解釈されるべきではない。使用が容易な
出発材料ではあるが、以下に別法出発材料から
TPA同族体を作製するのに利用できる各種方法
を、続いて好ましい方法の具体的な実施例を詳し
く記載する。 要約すると、必要な遺伝子操作は、TPAの
cDNAを得ること、インタードメイン領域に選択
された制限部位を有する各種TPAドメントのコ
ーデイング配列を含有するオリゴヌクレオチドの
ブロツクの合成、イー・コリ（E.coli）における
ドメントのクローニングおよび複製ならびに所望
のTPA同族体の発現として記載できる。 Ａ 図 第１図は、合成TPA DNAについての特異的
配列および塩基のナンバリング位置を天然cDNA
と比較して示す。天然ドメインは第１図のそれら
の天然順列のうちにすべて存在する。第２図は天
然TPAのアミノ酸配列を、それらの正規の順列
中にすべての天然ドメインを有するTPA同族体
に対して比較する（チヤート１１参照）。両図に
おいて、上側の配列はヌクレオチドまたはアミノ
酸のいずれかの天然配列を表わし、下側の配列は
修飾されたTPAを表わす。第３図はTPA同族体
を合成によつてつくるのに用いられるオリゴヌク
レオチドを表わす。第４図は、ドメイン領域内に
含有されるアミノ酸およびヌクレオチドを示すこ
とによつてTPAの天然順列を含有するチヤート
１１に記載された同族体に対して天然TPA蛋白
質を比較する。インタードメイン領域は第４図に
記載されたドメイン間に存在するアミノ酸である
（定義参照）。本明細書を通じ、ヌクレオチドまた
はアミノ酸のいずれかに対する添数字はこれらの
図をいう。 Ｂ 一般的方法 一般に、本願にて必要な命名法および一般的な
実験室的手法はマニアテイス・テイら
（Maniatis、T.et al.）、モレキユラー・クローニ
ング・ア・ラボラトリー・マニユアル
（Molecular Cloning Ａ Laboratory
Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）、コールド・スプリング・ハーバー
（Cold Spring Harbor）、ニユーヨーク、1982中
に見い出すことができる。該マニユアルは以後マ
ニアテイスとして参照する。 すべてのイー・コリ（E.coli）株は、グルコー
スを含むルリア（Luria）・ブロス（LB）、デイフ
コ（Difco）の抗生物質培地＃２ならびにグルコ
ースおよび酸加水分解カゼインアミノ酸を補足し
たM9倍地上で増殖させる。抗生物質耐性株はマ
ニアテイスに記載されている薬剤濃度で維持し
た。形質転換は、モリソン・デイ・エイ
（Morrison、D.A.）（1977）、ジヤーナル・オブ・
バクテリオロジー（J.of Bact.）、132：349〜
351；またはクラーク−クルテイス・ジエイ・イ
ーおよびクルテイス・アール（Clark−Curtiss、
J.E.and Curtiss、R.）、1983、メソツズ・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、
101：347〜362、ウー・アール、グロスマン・エ
ルおよびモルダブ・ケイ（Wu、R.、Grossman、
L.and Moldave、K.）編、アカデミツク・プレ
ス（Academic Press）、ニユーヨークによつて
記載されている方法により行つた。 すべての酵素は製造業者の指示に従つて用い
た。コロニーハイブリダイゼーシヨンは次の方法
を提供するために修飾した以外は一般にグルンス
テイン・エムら（Grunstein、M.et al.）、プロシ
イーデイングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Nat.Acad.Sci.）、
72、72巻、3961〜５頁（1975）に記載されている
如く行う：ニトロセルロースフイルターに前記調
製の細胞コロニーが含有されるようにする。次い
で、コロニー側を上にして、1.5M NaCl、1.5M
NaOHよりなる変性溶液中に浸漬した５−８の
厚みのワツトマン3MMペーパーのベツド上に該
フイルターを置く。変性剤を1.5〜２分間上方に
コロニー中に拡散させ、その時点で0.5Mトリ
ス・HCl、PH7.4、２×SSC（１×SSC＝0.15M
NaCl；0.015Mクエン酸ナトリウム；PH7.1）、お
よび25mM EDTAを含有する中和溶液に１〜３
分間浸漬した3MMペーパーの第２のベツドに該
フイルターを移す。次いで、フイルターを完全に
風乾し、真空中、80℃にて２〜４時間加熱した。 オリゴヌクレオチドプローブについてのハイブ
リダイゼーシヨン条件は以前ゲデル・デイ・ブイ
ら（Goeddel、D.V.et al.）、ネイチヤー
（Nature）、290巻、20〜26頁（1981）によつて記
載されたのと同様である。 ハイブリダイゼーシヨン後、プローブ含有溶液
を除去し、保存し、400mlずつで５回交換して合
計３時間、0.1％SDS、0.2×SSC中でフイルター
を洗浄する。フイルターを完全に風乾し、セツト
し、コダツク（Kodak）Ｘ−OMAT ARフイル
ムおよびデユポン・クロネツクス・ライトネニン
グ（Dupont Cronex Lightnening）と増感スク
リーンを用いるオートラジオグラフイーに−70℃
にて16時間付す。 プラスミドの配列決定法には、ホルメス・デ
イ・エスら（Holmes、D.S.et al.）、アナリテイ
カル・バイオケミストリー（Analyt.Biochem.）、
114巻、193頁（1981）の方法によりプラスミド
DNAのミニプレプ（mini prep）を調製する。
ジデオキシ配列決定法はサンガー・エフら
（Sanger・F.et al.）、「迅速DNA配列決定法に対
する助剤としての一本鎖バクテリオフアージにお
けるクローニング」、ジヤーナル・オブ・モレキ
ユラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）143：161
〜178（1977）により行う。該ジデオキシ含有反応
は、２分間で90゜まで加熱し、氷上でクエンチす
ることによる電気泳動で調製する。一通路当たり
２〜3μlを調製した0.8％配列決定法変性ポリアク
リルアミドゲル上に載せ、サンガーおよびコルソ
ン（Sanger and Coulson）、「DNA配列決定に
対する薄いアクリルアミドゲルの使用」、エフ・
イー・ビイ・エス・レターズ（FEBS Lett.）
87：107〜110（1978）により操作する。ゲルを室
温にて２〜４日間露出し、フイルム（コダツク
（Kodak XAR−５）を製造業者の推薦法に従つ
て現像する。 ヌクレオチドの大きさは、キロベース（kb）
または塩基対（bp）のいずれかで表わす。これ
らはアガロースゲル電気泳動から見積つたもので
ある。 Ｃ TPA cDNA TPA cDNAは核酸配列の活性部位部分の好都
合な源であつた。従つて、活性部位を化学的に合
成する必要はなかつた。TPA cDNAは多数の源
から入手可能である。研究者は、多量のTPAを
産生する細胞培養物特にボウエス（Bowes）黒
色腫細胞から単離したメツセンジヤーRNAから
TPA cDNAの部分を調製することを報告してい
る。エドランドら（Edlund et al.）、「ヒト組織
プラスミノーゲンアクチベーターの一部をコード
付けするcDNA配列の単離」、80巻、349〜352
（1983年１月）；グロノウら（Gronow et al.）、
「細胞培養によるヒトプラスミノーゲンアクチベ
ーターの産生」、トレンズ・イン・バイオテクノ
ロジー（Trends in Biotechnology）、１巻、No.
１、26〜29（1983）；およびペニカら（Pennica
et al.）、「イー・コリ（E.coli）におけるヒト組
織タイププラスミノーゲンアクチベーターcDNA
のクローニングおよび発現」、ネイチヤー
（Nature）、301巻、214〜21（1983年１月20日）。 さらに詳しくは、ジエネンテク・インコーポレ
イテイツド（Genentech、Inc.）は、各々1982年
５月５日；1982年７月14日および1983年４月７日
の出願日付を有する米国特許出願番号374860号；
398003号および483052号に基づく優先権を主張し
て1983年５月４日にヨーロツパ特許出願
（0093619号）を行つたが、以後これをジエネンテ
ク出願として参照する。該ジエネンテク出願は
ATCC番号31446のイー・コリ（E.coli）K12株
294、すなわちTPAについてコード付けする組換
体DNA化合物を有する形質転換体を開示してい
る。さらに、rDNAによつて形質転換されたイ
ー・コリ（E.coli）K12株W3110がそれからフイ
ブリン溶解活性の検定用のTPAの抽出物も調製
されるATCC番号27325として該ジエネンテク出
願中に開示されている。かくして、該開示は本願
にて有用な組換体DNA化合物を含む。同様に、
該ジエネンテク出願の開示は、やはりTPAを発
現する増幅用に形質転換したDHFR⁺CHO−KI
（ATCC CL61）細胞を提供する。かくして、再
度、該寄託物ATCC CL61は本願にて有用な
TPAについてコード付けする組換体DNAヌクレ
オチドを開示している。 本明細書における調製例２の開示は、TPAに
ついてコード付けする組換体DNA化合物を得る
ためのボウエス（Bowes）黒色腫細胞に適用で
きる当該分野で公知な方法のうちから１の単離方
法を当業者に提供する。該ボウエス（Bowes）
黒色腫細胞は通常公に入手可能である。 Ｄ TPAドメインの合成 前記の如く、TPA同族体のDNA配列の部分は
cDNAから調製した；しかしながら、ほとんどの
配列および全配列でさえ合成により作製すること
ができた。コストおよび便利さが個々のTPA同
族体配列の作製法を決定するにおける支配的パラ
メーターである。所望の同族体のTPAドメイン
中に見い出されない制限部位を選択し、これらの
制限部位をTPAのインタードメイン領域内に挿
入することによつて、TPA DNA配列の所望の
部分を消化することを避け、各個々のドメインの
容易な除去および挿入が可能となる。 TPA遺伝子の一部を化学的に合成することに
よつて、いずれのヌクレオチドが用いられるべき
かの塩基・塩基法を決定できる。以下の利点が本
例から生ずる：(1)転写産生物における二次構造の
最小化；(2)自己相補性のAT−GC領域の最小
化；および(3)cDNA配列に沿つての所望の位置に
おけるユニーク制限部位の設置。 オリゴヌクレオチドは、ニードハム・バン・デ
バンター・デイ・アールら（Needham Van
Devanter、D.R.、et al.）、ヌクレイツク・アシ
ツズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、12：
6159〜6168（1984）に記載されている如く、自動
合成器を用いるベカジ・エス・エルおよびカルサ
ー・エム・エイチ（Beaucage S.L.and
Caruthers、M.H.）、テトラヘドロン・レターズ
（Tetrahedron Letts.）、22(20)；1859〜1862
（1981）によつて最初に記載された固相ホスホル
アミダイト（phosphoramidite）・トリエステル
法によつて化学的に合成される。オリゴヌクレオ
チドの精製は、パーソン・ジエイ・デイおよびレ
グニエ・エフ・イー（Pearson、J.D.and
Regnier、F.E.）、ジヤーナル・オブ・クロマト
グラフイー（J.Chrom.）、255：137〜149（1983）
に記載されている如く、天然アクリルアミドゲル
電気泳動法または陰イオン交換HPLCのいずれか
によつた。 オリゴデオキシヌクレオチドはヌクレオチド40
個以下の長さで化学的に合成する。各フラグメン
トはその対応する相補鎖に対して相補的となるよ
うに設計し、各二重鎖セグメントは結びを最適化
する付着末端を含有する。フラグメントの合成用
DNAの配分においては以下の基準を考慮する：
１）化学的合成および精製が容易となるようにオ
リゴヌクレオチドフラグメントの長さは塩基40個
以下の長さであること ２）相補する上方および
下方ヌクレオチドフラグメントから突出する最小
６個の塩基が出現してセグメントの最適な配列お
よび結びを可能とすること ３）一次もしくは相
補配列のいずれかに連結できる塩基４個またはそ
れ以上の領域は避けること。 合成オリゴヌクレオチドの配列はマキサム・エ
イ・エムおよびギルバート・ダブリユー、グロス
マン・エルおよびモルダブ・デイ（Maxam、A.
M.and Gilbert、W.、Grossman、L.and
Moldave、D.）編、アカデミツク・プレス
（Academic Press）、ニユーヨーク、メソツズ・
イン・エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）、65：499〜560（1980）の化学的分
解法を用いて確認できる。別法として、該配列
は、マキサムおよびギルバート（Maxam and
Glibert）、前掲の方法、またはワレイス・アー
ル・ビイら（Wallace、R.B.、et al.）、ジーン
（Gene）、16：21〜26（1981）の二重鎖鋳型を配列
決定するための鎖末端法を用いて、オリゴヌクレ
オチドフラグメントを二重鎖DNA配列に入れる
組立ての後に確認できる。 87種の別異のオリゴヌクレオチド（第３図）を
合成した。本明細書中で開示する特別の組立法
は、チヤート(11)に示す選択された制限部位を有す
るTPA同族体の5′部分をコード付けする最初の
1099個の塩基対を作製するものであつた。次い
で、この合成オリゴヌクレオチドを、活性部位を
含有する位置1287のEcoR部位にてTPA
cDNAの3′部分に連結する。 オリゴヌクレオチドフラグメントを二本鎖
DNAに入れて組立てるには、アニーリングおよ
び結びのために87種のフラグメントすべてを一緒
に混合することができる。さらに十分な結びに
は、オリゴヌクレオチドを４つのブロツクに分割
した方がよい。各ブロツクの結びおよび精製の
後、次いで４つのブロツクをアニールし、結んで
最終産生物を得ることができる。組立てたブロツ
クおよび最終産生物の精製はマニアテイスに記載
されている如くアクリルアミドゲル電気泳動法に
よつて行うことができる。アニーリングおよび結
びを行うには、マニアテイスに記載されている一
般法も用いられる。 合成TPA遺伝子用の開始コードンを用意する
必要があるであろう。イー・コリ（E.coli）系の
目的には、Fmetについてコード付けする開始コ
ードンATGが必要である。該開始コードンは合
成遺伝子中に取り込むことができるか、あるいは
所望の発現プラスミドによつて供給できる。開始
コードンに加え、イー・コリ（E.coli）用には、
シヤイン・ダルガノ領域と開始コードン間に適当
な間隔を付与する配列をTPAの合成遺伝子中に
取り込むのが便利である。 配列の適当な選択は、さもなければ転写および
翻訳を防害する二次構造を最小化し、最適なコー
ドン使用法を併合する（グロスジーン・エイチお
よびフイエルズ・ダブリユー（Grosjean H.and
Fiers、W.）、ジーン（Gene）、18：199〜209、
1982）；およびリボソーム結合部位あたりの配列
に見い出される統計的偏りを満足させる（ゴル
ド・エルら（Gold、L.、et al.）、アニユアル・
レビユー・オブ・ミクロバイオロジー（Ann.
Rev.Microbiol.）、35：365〜403、1981）。本発明
についての具体的な配列はその実際の配列により
本明細書中に記載する。しかしながら、異なる宿
主細胞におけるTPA同族体の発現を最適化する
のに別法配列を用いることができることを理解さ
れたい。 Ｅ cDNAおよびTPA遺伝子の合成部分のクロ
ーニング cDNAおよびTPAの部分についてコード付け
する組換体フラグメントの複製用のTPAの合成
部分をクローンするのに用いる方法は当該分野で
公知の標準方法である。ひき続いて記載するすべ
てのクローニングを実行するのに十分な方法を含
有するマニアテイスマニユアル。すべてのクロー
ニングは、十分に特徴づけされたいずれの株も有
用である形質転換イー・コリ（E.coli）において
行つた。特に断わらない限り、株HB101が好ま
しい。 イー・コリ（E.coli）を形質転換するのに有用
なクローニングベクターはpBR322およびpKC7
を包含する。 Ｆ ユニーク制限部位のDNA−コーデイング
TPA中への挿入 TPAのインタードメイン領域について選択し
た具体的な制限部位はチヤート10および11に示
す。これらが本発明において有用である唯一の制
限部位ではない。制限部位はそれらがTPA
cDNAにおいてユニークである塩基に基づいて選
択する。インタードメイン領域に最小のアミノ酸
変化を導入する部位が好ましく、アミノ酸変化に
関してサイレントである部位が最も好ましい（第
１図および第２図参照）。インタードメイン内に
異なる解読フレームを有する多重部位は、発現の
目的で他のドメインに結んだ後ドメインが同相で
あるのを保証するために有用である。重複制限部
位は、単に該部位を消化し、末端を平滑末端とし
た後結ぶことによつて除去できる。ユニーク部位
の導入は、化学的合成、商業的に入手可能なリン
カーによつて、または単一部位突然変異によつて
実現できる。 天然TPA cDNAはチヤート10および11に示し
たTPAの２の始原型cDNA中に入れられた部位
以外に、以下のエンドヌクレアーゼ制限酵素によ
つて認識される部位を含有しない：

【表】 Ｇ イー・コリ（E.coli）におけるTPA同族体の
発現 原核系においてクローンした遺伝子、例えば修
飾したTPA遺伝子の高いレベルの発現を得るに
は、最小限、mRNA転写を方向づける強力なプ
ロモーター、翻訳開始用のリボソーム結合部位お
よび転写ターミネーターを含有する発現ベクター
を組立てることが必須である。多量の遺伝子産生
物の蓄積はしばしば細胞増殖を抑制ししかも時々
細胞死をひき起こすので、産生物の合成を方向づ
けるのに選択したプロモーターは、プロモーター
の誘導前に細胞増殖が高密度に達することができ
るように調節されなければならない。この目的に
対して適当な調節領域の例は、ヤノフスキイ・シ
イ、ケリイ・アール・エルおよびホーン・ブイ
（Yanofsky、C.、Kelley、R.L.and Horn、V.）、
ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー（J.
Bacteriol.）、158：1018〜1024（1984）によつて
記載されている如きイー・コリ（E.coli）トリプ
トフアン生合成経路のプロモーターおよびオペレ
ーターならびにヘルスコビイツツ・アイおよびハ
ーゲン・デイ（Herskowitz、I.and Hagen D.）、
アヌ・レブ・ジエネト（Ann・Rev.Genet.）、
14：399〜445（1980）によつて記載されている如
きフアージラムダ（P_L）の左方プロモーターで
ある。イー・コリ（E.coli）中で産生されたTPA
は多数のシステイン残基のために正しく折りたた
まれていない。該イー・コリ（E.coli）産生TPA
はまず変性し、次いで天然状態に戻さなくてはな
らない。これは、イー・コリ（E.coli）産生TPA
をグアニジンHClに溶解し、すべてのシステイン
残基をβ−メルカプトエタノールで還元すること
によつて達成できる。次いで、ゆつくりとした透
析またはゲル過のいずれかによつて該蛋白質を
天然状態に戻す。米国特許第4511503号。 Ｈ 酵母におけるTPA同族体の発現 酵母における異種蛋白質の発現はよく知られて
いる。メソツズ・イン・イースト・ジエネテイツ
クス（Methods in Yeast Genetics）、シヤーマ
ン・エフら（Sherman、F.、et al.）、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）、（1982）は
酵母におけるTPA同族体を産生するのに有用な
各種方法を記載しているよく知られた研究であ
る。 酵母における遺伝子の高レベル発現のために
は、原核生物における如く遺伝子を強力なプロモ
ーター系に連結すること、および酵母遺伝子から
効果的な転写終止／ポリアデニレーシヨン配列も
供給することが必須である。有用なプロモーター
の例はGAL1、10（ジヨンストン・エムおよびデ
イビス・アール・ダブリユー（Johnston M.、
and Davis、R.W.）、モレキユラー・アンド・セ
リユラー・バイオロジー（Mol.and Cell.Biol.）、
４：1440〜48、1984）、ADH2（ラツセル・デイら
（Russel、D.、et al.）、ジヤーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、
258：2674〜2682、1983）、PHO5（ヨーロピア
ン・モレキユラー・バイオロジー・オーガナイゼ
イシヨン・ジヤーナル（EMMOJ.）、６：675〜
680、1982）、およびMF〓１である。Lue−２、
URA−３、Trp−１、およびHis−３の如き選択
マーカーを有するマルチコピー（multicopy）プ
ラスミドもまた望ましいものである。 細胞をグルコース上で増殖させる場合、CAL
およびADH2プロモーターは抑制され、かくして
細胞が高密度まで増殖することが可能となる。
GALプロモーターは細胞をガラクトース培地に
移すことによつて作動できるが、ADH2はすべて
のグルコースが細胞によつて利用されてしまつた
後作動する。PHO5プロモーターは培地中のリン
酸塩濃度を操作することによつて作動または作動
停止できる。α接合型の宿主におけるMF〓１プロ
モーターは終始作動状態にあるが、二倍体または
ａ接合型を有する細胞中では作動停止の状態であ
る。しかし、それは１のSIR座にts突然変異を有
する宿主中で温度を上げ下げすることによつて調
節できる。35℃におけるかかる突然変異のα型細
胞に対する効果はａ接合型についてコード付けす
る正常なサイレント遺伝子を作動させることにあ
る。一方、サイレントａ接合型遺伝子の発現は
MF〓１プロモーターを作動停止する。増殖の温度
を27℃まで下げると該過程を逆に進行させ、ａ接
合型を作動停止し、MF〓１を作動させる（ヘルス
コビイツツ・アイおよびオーシマ・ワイ
（Herskowitz、I.＆ Oshima、Y.（1982）、ザ・
モレキユラー・バイオロジー・オブ・ザ・イース
ト・サツカロミセス（in The molecular
biology of the yeast saccharomyces）、ストラ
ザン・ジエイ・エヌ・ジヨーンズ・イー・ダブリ
ユーおよびブローチ・ジエイ・アール
（Strathern、J.N.、Jones、E.W.、＆Broach、J.
R.）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Lab.）、コー
ルド・スプリング・ハーバー（Cold Spring
Harbor）、ニユーヨーク、181〜209頁）。 ポリアデニレーシヨン配列はADH1、MF〓₁、
またはTPIのような高度に発現された遺伝子のい
ずれの3′−末端配列によつても供給される（アル
バート・テイおよびカワサキ・ジイ（Albert、
T.and Kawasaki、G.）、ジヤーナル・オブ・モ
レキユラー・アンド・アプライド・ジエネテイツ
クス（J.of Mol.＆Appl.Genet.）、１：419〜434、
1982）。 YEp6、YEp13、YEp24のような数多くの酵母
発現プラスミドをベクターとして使用できる。
TPAの如き注目する遺伝子を前記のいずれのプ
ロモーターにも融合することができ、次いで各種
酵母宿主中での発現のためのプラスミドに結ぶこ
とができる。前記プラスミドは文献中に細胞に記
載されている（ブロステインら（Brostein、et
al.）、ジーン（Gene）、８：17〜24、1979；ブロ
ーチら（Broach、et al.）、ジーン（Gene）、
８：121〜133、1979）。 前記プラスミドは酵母において外来性遺伝子を
発現するのに用いることができかつ用いられたこ
とがあるが、本明細書中にて開示するのは発現ベ
クターの各種成分の挿入および／または切除に関
して大いなる融通性を可能とするベクターであ
る。かかる例の１つは、チヤート１８に示すベク
ターpα1−ADHtである。 酵母細胞を形質転換するのに２つの方法を用い
る。 １の場合、ザイモリアーゼ、リチカーゼまたは
グルスラーゼを用いて酵母細胞をまずプロトプラ
ストに変換し、続いてDNAおよびポリエチレン
グリコール（PEG）を添加する。該PEG処理プ
ロトプラストを次いで選択した条件下、３％アガ
ール培地中で再生する。この方法の詳細は、ジエ
イ・デイ・ベグズ（J.D.Beggs）、ネイチヤー
（Nature）（ロンドン（London））、275：104〜
109（1978）；およびヒネン・エイら（Hinnen、
A.、et al.）、プロシーデイングズ・オブ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、75：1929〜1933
（1978）による報告文中に記載されている。第２
の方法は、細胞壁の除去を含まない。その代り
に、細胞を塩化もしくは酢酸リチウムおよび
PEGで処理し、選択したプレート上に置く（イ
トー・エイチら（Ito、H.、et al.）、ジヤーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（J.Bact.）、153：
163〜163、1983）。 TPA同族体は、細胞を溶解し、次いで標準的
な蛋白質単離法を溶解物に適用することによつて
単離できる。TPA同族体は、ウエスタンブロツ
ト法またはラジオイムノアツセイを用いることに
よつて検出できる。 Ｉ 細胞培養物における発現 TPA同族体をコード付けするDNAは宿主細胞
養体を形質転換するのに用いる各種発現ベクター
に結ぶことができる。該ベクターはすべて、形質
転換されるべき宿主細胞に受容可能なTPA同族
体の転写および翻訳を開始する遺伝子配列を含有
する。宿主細胞が高等動物細胞、例えば哺乳動物
細胞である場合、TPA遺伝子の天然に生じる転
写および翻訳遺伝子配列を用いることができる
か、あるいは天然に生じる遺伝子配列を異種プロ
モーター配列と共に用いることができる。加え
て、該ベクターは好ましくは、マーカーを含有し
て形質転換宿主細胞の選択のための表現型特性を
提供する。さらに、複製ベクターはレプリコンを
含有してもよい。 TPA同族体の産生に有用な細胞培養物の例は
昆虫もしくは哺乳動物源の細胞である。哺乳動物
細胞浮遊液も用いることができるが、哺乳動物細
胞系はしばしば細胞の単層形態である。哺乳動物
細胞系の例はベロ（VERO）およびヘラ
（HeLa）細胞、チヤイニーズハムスター卵巣
（CHO）細胞系、WI38、BHK、COS−７または
MDCK細胞系である。混虫細胞系の例はスポド
プテラ・フルギペルダ（Spodoptera
frugiperda）（行列毛虫ヨトウガ幼虫）およびボ
ンビツクス・モリ（Bombyxmori）（カイコ）を
包含する。 前記の如く、ベクター、例えば宿主細胞を形質
転換するのに用いるプラスミドは好ましくは
TPA遺伝子配列の転写および翻訳を開始する遺
伝子配列を含有する。これらの配列を発現制御配
列という。宿主細胞が昆虫もしくは哺乳動物源の
ものである場合、例えば有用な発現制御配列は町
SV−40 プロモーター（サイエンス（Science）、
222、524〜527、（1983））、CMV I.E.プロモータ
ー（プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.
Acad.Sci.）、81：659〜663、1984）またはメタロ
チオネインプロモーター（ネイチヤー
（Nature））、296、39〜42（1982））から得られる。
前記の如く、宿主細胞が哺乳動物のものである場
合、TPA遺伝子用発現制御配列を用いることが
できるが、TPA同族体を異種転写開始部位と組
合せるのが好ましい。発現制御配列を含有するプ
ラスミドまたは複製もしくは統合DNA物質は制
限酵素を用いて切断し、要すればあるいは所望に
より大きさを調節し、当該分野でよく知られた方
法によつてTPA同族体についてコード付けする
cDNAで結ぶ。 酵母の場合の如く、高等動物宿主細胞を用いる
場合、公知哺乳動物遺伝子からのポリアデニレー
シヨンまたはターミネーター配列はベクター中に
取り込まれている必要がある。ターミネーター配
列の例はウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデ
ニレーシヨン配列である。 さらに、宿主細胞における複製を制御する遺伝
子配列を、ウシ乳頭腫ウイルス型ベクター中で見
い出されるものの如きベクター中に取り込んでよ
い。サベリア−カンポ・エム（Saveria−
Campo、M.）、「ウシ乳頭腫ウイルスDNA：真核
性クローニングベクター」、デイ・エヌ・エイ・
クローニング（DNA Cloning）巻ア・プラク
テイカル・アプローチ（ａ practical
approach）、デイ・エム・グローバー（D.M.
Glover）編、アイ・アール・エル・プレス
（LRL Press）、アーリントン（Arlington）、バ
ージニア州、213〜238頁（1985）。 宿主細胞は形質転換について適格であるかまた
は各種方法によつて適格とされる。DNAを動物
細胞に導入するいくつかのよく知られた方法があ
る。これらは：リン酸カルシウム沈殿、DNAを
含有する細菌プロトプラストでの受容体細胞の融
合、DNAを含有するリポソームでの受容体細胞
の処理、DNAの細胞中への直接マイクロインジ
エクシヨンを包含する。 形質転換した細胞は当該分野でよく知られた方
法により増殖させ、バイオケミカル・メソツズ・
イン・セル・カルチヤー・アンド・バイロロジー
（Biochemical Methods in Cell Culture and
Virology）、クチラー・アール・ジエイ、ドウデ
ン（Kuchler、R.J.、Dowden）、ハツチンソン・
アンド・ロス・インコーポレイテイツド
（Hutchinson and Ross、Inc.）、（1977）、例えば
当該分野でよく知られた機械的もしくは酵素的方
法によつて宿主細胞系を破壊した後、宿主細胞ま
たは細胞浮遊液から蛋白質を排出する系におい
て、発現されたTPA同族体を細胞培地から収穫
する。 Ｊ TPA同族体の評価 TPAおよびその同族体は２つの方法のうちい
ずれかで評価できる。プラスミノーゲンを切断し
てプラスミンとする相対能力を評価することがで
き、およびプラスミンの産生を阻止する抑制物質
の相対能力を評価することができる。かかる評価
についての手順を以下に詳しく記載する。 アミドールアツセイ。TPA同族体の機能活性
は、ベルヘイジエン・ジエイ・エイチら
（Verheijen、J.H.、et al.）、「血漿中の測定に適
用できる外来性（組織タイプ）プラスミノーゲン
アクチベーターについての簡単で鋭敏な分光光度
計アツセイ」、スロンボウシス・アンド・ヘモス
タシス（Thromb.Haemostas.）、48：266〜269
（1982）によつて記載されているアミドールアツ
セイを用いることによつて測定される。略言すれ
ば、TPA同族体を含有する試料をプラスミノー
ゲンおよびCNBr消化フイブリノーゲンフラグメ
ントと混合する。かくして形成されたプラスミン
は、次いで、系外から加えた色素生成基質、Ｓ−
2251（Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジ
ン−ｐ−ニトロアニリド二塩酸塩；KABI、スト
ツクホルム、スウエーデン）を切断し、分光光度
計によりモニターされる着色生成物を生じる。プ
ロテアーゼ抑制物質のTPA同族体に対する効果
は、ベルヘイジエン・ジエイ・エイチら
（Verheijen、J.H.、et al.）、「ヒト血漿中の組織
タイププラスミノーゲンアクチベーターについて
の速作用抑制物質の出現の証拠」、スロンボウシ
ス・アンド・ヘモスタシス（Thromb.
Haemostas.）、51：392〜395（1984）によつて記
載されている本アツセイの修正法を用いることに
よつて評価される。添加した抑制物質はTPAに
結合し、不可逆的な複合体を形成し、それによつ
てTPAがプラスミノーゲンを活性化するのを阻
止する。例えば、精製された天然TPAは増加し
た量の抑制物質含有試料で力価測定され、残余
TPA活性は前記で概説した如くに測定される。
次いで、残余TPA活性を添加した抑制物質含有
試料の量の関係としてグラフに表わすことによつ
て標準曲線を描く。同様に、TPA同族体を抑制
物質で力価測定する。得られた曲線をTPA標準
のものと比較する。曲線間の類似度が個々の同族
体の抑制に対する感受性に直接関係する。 フイブリンオートグラフイー。TPA同族体の
分子量は、該同族体を含有する試料をドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）に付し、次いでアクリルアミド
ゲルをプラスミノーゲン含有フインブリンの指示
薬フイルム上に置くことによつて見積られる。同
族体蛋白質がアクリルアミドゲルから指示薬フイ
ルムに拡散するに従い、それはプラスミノーゲン
をプラスミンに変換し、他の場合には不透明なフ
イブリン指示薬中にフイブリン溶解現象の清澄な
ゾーンの形成をひき起こす。このゾーンの出現は
アクリルアミドゲル中の対応する位置に活性な
TPA同族体が存在することを示す。この方法は、
TPA同族体とプロテアーゼ抑制物質間の相互作
用を評価するのにも用いられる。前記の如く、こ
の相互作用の結果、同族体自身よりも大きな分子
量を有する酵素−抑制物質複合体が形成される。
SDS−PAGEの後、該複合体はフイブリン指示薬
フイルム中で可視化される残余TPA活性を呈す
る。この方法の詳細は、最初、グラネリ・ピペル
ノ・エイおよびイー・ライチ（Granelli
Piperno、A.and E.Reich）、「生物学的流体にお
けるプロテアーゼおよびプロテアーゼ−抑制物質
複合体の研究」、ジヤーナル・オブ・エクスペリ
メンタル・メデイシン（J.Exp.Med.）、148：223
〜234（1978）によつて記載された。 TPA同族体の抗原性の評価 サイドイツチ型酵素免疫測定法（Ｓ−エライサ
法）。TPA同族体の抗原性は２つの異なるＳ−エ
ライサ法により免疫学的に測定される。第１のも
のは、ヒト子宮TPAについて特異的なヤギ多ク
ローン抗体を用いる。第２のものは、マウス単ク
ローン抗体を用いる。この単クローン抗体は
TPAの活性について必要なエピトープに対して
特異的に定方向化される。TPAの活性部位ドメ
インに対して特異的な抗体の使用により、その主
要構造がドメインにおいて活性部位以外のものに
変化してしまつたいずれのTPA同族体の抗原性
も測定する効果的な方法が提供される。このアツ
セイは、コルニンガー・シイら（Korninger、
C.、et al.）によつて記載された方法、単クロー
ン抗体を使用するTPA抗原性についてのサンド
イツチエライサ（Sandwich ELISA）法と同様
のものである。スロンボウシス・リサーチ
（Thromb.Res.）、41：527〜535（1986）。両アツ
セイについての感度限界は１ml当たりTPA約1ng
である。 ウエスタンイムノブロツテイング法。抑制物資
と共に複合体を形成するTPAの能力もまた、最
初トウビン・エイチら（Towbjn、H.et al.）、
「蛋白質のポリアクリルアミドゲルからニトロセ
ルロースシートへの電気泳動的移動：方法および
くつかの応用」、プロシーデイングズ・オブ・ナ
シヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、76：4350〜4354
（1979）によつて記載された如く、SDS−PAGE
およびウエスタンイムノブロツテイング法を用い
ることによつて評価できる。簡単に述べると、
TPA同族体を抑制物質と相互作用をさせ、混合
物をSDS−PAGEに付し、蛋白質をニトロセルロ
ースペーパーへ電気的に移動させる。複合体化し
てない遊離のTPAおよび抑制物質との複合状態
にあるTPAの双方を、TPAに対して特異的な精
製した多クローンヤギIgGおよびヤギIgGに対し
て定方向化されたウサギ抗血清を用いることによ
つて検出する。次いで、I¹²⁵−ラベル蛋白質Ａお
よびオートラジオグラフイーを用いることによつ
てTPA含有免疫複合体を可視化する。 定義 「細胞培養物」なる語はもとの植物または動物
の体外で細胞が生存を維持するのを可能とする、
多細胞植物もしくは動物のいずれか由来の増殖し
ている細胞の容器をいう。 「ドメイン」なる語は特定の機能に一致し得る
アミノ酸配列の別々の連続部分をいう。TPAに
関しては、前記引用文献がドメイン領域を定義し
ており、本明細書中の第４図はドメイン間に存在
するインタードメイン領域の中央地点のおおよそ
の位置を開示する。 「下流」なる語は発現の方向においてさらに進
行する配列に同一であり；例えば、コーデイング
領域は開始コードンより下流にある。 「インタードメイン」なる語はドメイン間に存
在する蛋白質のアミノ酸配列の領域をいう。この
適用において、インタードメイン領域は第４図に
示した中央地点からプラスもしくはマイナスの５
個のアミノ酸残基である。かくしてフインガー
（finger）および発育因子ドメイン間のインター
ドメイン領域はアミノ酸44〜アミノ酸55間に存在
しかつそれらを包含し；発育因子およびクリング
ル（kringle）１ドメイン間のインタードメイン
はアミノ酸86〜アミノ酸97間に存在しかつそれら
を包含し；クリングル（kringle）１およびクリ
ングル（kringle）２間のインタードメインはア
ミノ酸169〜アミノ酸180間に存在しかつそれらを
包含し；クリングル（kringle）２および活性部
位間のインタードメインはアミノ酸257〜アミノ
酸268間に存在しかつそれらを包含する。 「維持された」なる語はプラスミドが自律複製
体としてまたは宿主のゲノムの統合部分として存
在する、形質転換宿主内のプラスミドの安定な存
在をいう。 「微生物」なる語は細菌、放線菌および酵母の
如き単細胞の原核生物および真核生物を共に包含
する。 「非天然エンドヌクレアーゼ制限部位」なる語
句は天然cDNA配列の同等位置に見い出されない
エンドヌクレアーゼ制限部位をいう。これらはユ
ニークおよび非ユニーク部位を共に包含する。 「オペロン」なる語は遺伝子発現および調節の
完全な単位であり、構造遺伝子、調節遺伝子、お
よび調節遺伝子産生物によつて認識されるDNA
中の制御要素を包含する。 「プラスミド」なる語は自律的に自己複製する
染色体外環状DNAをいい、発現型および非発現
型を共に包含する。組換体微生物または細胞培養
物が発現プラスミドを宿すと記載される場合、
「発現プラスミド」なる語は染色体外環状DNAお
よび宿主染色体中に取り込まれたDNAを共に包
含する。 「プロモーター」なる語はRNAポリメラーゼ
が結合して転写を開始するのに係るDNA領域で
ある。 「DNA配列」なる語はヌクレオチド塩基、ア
デノシン、チミジン、シトシンおよびグアノシン
よりなる一本鎖または二本鎖DNA分子をいう。 「適当な宿主」なる語は組換体プラスミドを受
容することができ、該プラスミドが複製し、その
ゲノム中に取り込まれるかまたは発現されること
を可能とする細胞培養物または微生物をいう。 「上流」なる語は発現から逆の方向に進行する
配列に同一であり；例えば、細菌プロモーターは
転写単位から上流にあり、開始コードンはコーデ
イング領域から上流にある。 本願にとつては特別であるが、チヤート１〜27
においてプラスミドおよびフラグメントを表わす
のに用いる約束はプラスミドおよびそれらのフラ
グメントの常用表現と同意義であることを意味す
る。常用環状図とは異なり、チヤート上の単一線
の図は翻訳または転写が左から右に（５′から
３′に）起こる環状および直線状二本鎖DNAを共
に表わす。星印（＊）はプラスミドの環状形を完
成するヌクレオチドの架橋を表わす。フラグメン
トは二本鎖DNAの直線片であるから、星印を有
しない。エンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上
方に示す。遺伝子マーカーは直線の下方に示す。
プラスミドまたはフラグメントを表わす図表の下
方の棒線はDNA上の２つの地点間の塩基対の数
を示すのに用いる。マーカー間の相対的間隔は実
際の距離を示すものではなく、示したDNA配列
上のそれらの相対的位置を示すことを単に意味す
る。 調製例 調製例１ベクター−pSK4−チヤート１〜３ プラスミドpSK4はイー・コリ（E.coli）にお
いて異種蛋白質の発現を定方向化できる発現ベク
ターである。それは転写を伝達するための強力
な、調節可能なプロモーターおよび翻訳開始につ
いての強力なリボソーム結合部位を有する。具体
的には、pSK４はトリプトフアン（trp）オペロ
ンからのプロモーターおよびリボソーム結合部位
（RSB）を用いる。RBSから直ぐの下流のユニー
クCla 部位はTPAの如き望ましい遺伝子の挿
入に利用できる（チヤート３）。 プラスミドpSK4を作製するには、公知の
pKC7（チヤート２）で新規なpTRZ1（チヤート
１）をクローンする必要がある。ラオ・アール・
エヌおよびロジヤーズ・エス・ジイ（Rao、R.
N.and Rogers、S.G.）、ジーン（Gene）、７：79
〜82（1979）。プラスミドpTRZ1はプロモータ
ー／オペレーター領域、リボソーム結合部位、お
よびtrpLE融合△LE1413ならびにガラクトシダ
ーゼ（lacZ）およびラクトースペルメアーゼ
（lacY）についての構造遺伝子を包含するtrpオ
ペロンの部分を含有する。プラスミドpKC7はア
ンピシリンおよびカナマイシンに対する耐性を特
異化し、多くのユニーク制限エンドヌクレアーゼ
部位を有するpBR322の誘導体である。 pTRZ1およびpKC7の組換体プラスミドはtrp
プロモーター、RBS、およびpKC7内のLEを有
するpSK3を生じる。次いで融合ペプチド配列
trpLEを除去するためにプラスミドpSK3を修飾
して一般的な発現ベクターpSK4を得る。 (1) pTRZ1の組立て−チヤート１ プラスミドpTRZ1は公知プラスミドpMC1403
およびpVV1のクローンである。 プラスミドpMC1403はpTRZ1からＮ末端の８
個のアミノ酸を除いたpTRZ1のlacZ遺伝子を供
給するものであり、それはカサダバン・エム・ジ
エイら（Casadaban、M.J.、et al.）、ジヤーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、
1980、143：971〜980によつて詳細に記載されて
いる。プラスミドpMC1403は３つのユニーク制
限酵素切断部位を有する。それをEcoRで切断
し、細菌アルカリ性ホスフアターゼで脱ホスホリ
ル化し、イー・コリ（E.coli）DNAポリメラー
ゼのクレノーフラグメントで末端を平滑とす
る。プラスミドpVV1はtrpプロモーターおよび
オペレーター配列を供給し、それはニコルズ・ビ
イ・ピイおよびヤノフスキイ・シイ（Nicols、
B.P.and Yanofsky、C.）、1983、メソツズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）、エル・グロスマンおよびケイ・
モルデイブ（L.Grossman and K.Moldave）編、
101：155〜165、アカデミツク・プレス
（Academic Press）、ニユーヨークによつて詳細
に記載されている。プラスミドpVV1はtrp先導
配列をtrpLEを形成するtrp Ｅ遺伝子に融合する
952塩基対欠失を有するtrpオペロン（△LE1413）
を含有する。プラスミドPVV1をPvuおよび
Bg1 で切断してフラグメント２（323bp）を
得、これを調製アガロース電気泳動で単離する。
Bg1 部位をクレノー酵素で満たす。次いでフ
ラグメント２をpMC1403で結んでpTRZ1を得る。 (2) pSK3の組立て pTRZ1の構造遺伝子LacYおよびLacZはpSK4
の組立てには不要であり、それらの欠失はより多
くのクローニング部位を有するより小さいプラス
ミドを供給する。さらに、LacYの欠失は膜結合
蛋白質の過剰産生の有害効果を回避する。チヤー
ト２に示す如く、trp配列（フラグメント３）を
EcoRI／BamHI消化によつてpTRZ1から切り出
し、アルカリ性ホスフアターゼで処理して再挿入
を最小化し、次いでpKC7のEcoR／BamH
領域、フラグメント４、に挿入するが、それは消
化の結果もはやカナマイシンに対する耐性を特異
化しない。アンピシリン耐性（AmpR）および
カナマイシン感受性（KanS）を有するクローン
をtrpプロモーター／オペレーター配列の挿入に
ついて期待される制限フラグメントについてスク
リーニングを行う。このプラスミドをpSK３で示
し、その均等体はチヤート２に記載されていると
おりである。 (3) pSK4の組立て psK3のtrpプロモーターは、直接発現ベクター
の組立には不要なtrp LEペプチドをなお保持し
ている。trpLEセグメントを以下の方法によつて
切り出す。チヤート３に記載した如く、trp配列
を有するEcoR／BamHフラグメント５を
pSK3から切断し、ポリアクリルアミドゲルから
の電気溶出によつて精製する。示した如く、この
フラグメントは３つのTaq部位を含有し、その
うちの１つはプロモーター／オペレーター領域に
あり（Taq″）、そのうちの１つはリボソーム結
合部位とTrpLE翻訳の開始間にある（Taq″）。
該フラグメントをTaq によつて部分的に消化
し、フラグメントの全集合物を先にEcoRおよ
びCla の双方で切断したpBR322との結び反
応に用いる。 TaqはＴ↓CGAを認識し（矢印は鎖切点を
示す）、一方Cla はAT↓CGATを認識する。
これらの２の酵素は適合する付着末端を産生し、
塩基5′ないしリボソーム結合部位およびtrpLE間
のTaqまではＡであるので（ジヤーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（J.of Bact.）、133：1457
〜1466）、このTaq末端のCla末端への結びは
Cla部位を再生する。このクローニング機構は
単一のTaq切断について選択することに注意さ
れたい。また、プロモーターからの転写は時計回
り方向であることを確認されたい。
278bpEcoRI／ClaI挿入を表示するクローン、お
よびtrpプロモーターの制限パターン特性を選択
するが、それはpSK４に同等であろう。ClaI部位
に挿入した場合、該クローンは翻訳開始が可能な
蛋白質配列の発現に有用である。 調製例２ ヒト組織プラスミノーゲンアクチベー
ターについてコード付けする完全長cDNAの単
離 Ａ材料および方法 (1) ボウエス（Bowes）黒色腫細胞の増殖 ボウエス（Bowes）はヒト自然発生黒色腫由
来の株化細胞系を表わし、これはニユーヨーク医
科大学のダニエル・リフキン（Daniel Rifkin）
博士から贈られたものである。95％空気／５％
CO₂を用い、37℃における湿潤雰囲気中、10％胎
児ウシ血清（Gibco）および50μｇ／mlゲンタマ
イシン（Sigma）を補足したダルベツコウの修正
イーグル培地（Gibco）中で細胞を培養する。
RNA調製用に収穫した細胞をフアルコン
（Falcon）150cm²フラスコ中、接触し合うまで増
殖させる。 (2) TPAmRNAの調製 ボウエス（Bowes）黒色腫細胞からのRNAを
実質的にリザルデイら（Lizardi、et al.）、アナ
リテイカル・バイオケミストリー（Anal.
Biochem）、98巻、116〜122頁（1979）によつて
記載されている如くに単離する。 DNAは、アビブ・エイチら（Aviv、H.et
al.）、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Nat.
Acad.Sci.）、69巻、1408〜12頁（1972）によつて
記載されている如く、オリゴデオキシチミジン‐
セルロース（OdT‐セルロース‐コル（Col）研
究所）カラムを通過させることによつてポリA⁺
豊富とする。別々のOdTカラム上で２回選択し
た10〜150cm²フラスコからの典型的収率は約50μ
ｇポリA⁺mRNAである。 15〜30％直線スクロースグラジエントによる遠
心によつてポリA⁺mRNAを分画する。滅菌蒸留
水200〜400μlに溶解したポリA⁺mRNA（〜300μ
ｇ）をグラジエント上に重ね、35000rpmにてベ
ツクマン（Beckman）SW41Tiローター中で18
時間遠心し、ブチラー・オート・デンシーフロー
（Buchler Auto Densi‐Flow）モデルＣを用
いて0.5mlずつの画分を収集してトツプからボト
ムに収穫し、ギルソン・マイクロ（Gilson
Micro）分画器（モデルFC80‐Ｋ）に連結する。
各画分からの一部をクセノプス（Xenopus）卵母
細胞に注入し、ミスキン・アールら（Miskin、
R.、et al.）、ヌクレイツク・アシツズ・リサー
チ（Nuc.Acids Res.）、９巻、3355〜63頁によつ
て記載されているのに類似のカゼイン−寒天プレ
ート法によつて、翻訳産生物をプラスミノーゲン
アクチベーター活性について検定する。TPA活
性は約19秒において移動するmRNAによつて表
わす。 具体的には、組織プラスミノーゲンアクチベー
ターTPAを、プラスミノーゲンのプラスミン、
カゼインを消化する非特異的プロテアーゼへの変
換を観察することによつて検定する。該アツセイ
は以下の如くに行う。煮沸した８％カゼイン0.5
mlを２×MBS1mlと混合し、50℃まで加熱する。
３％アガロースを融解し、50℃まで冷却する。３
％アガロース0.5mlをカゼイン／MBSに添加し、
ピペツトによつて混合する。混合しながら１mg／
mlヒトプラスミノーゲン100μlを添加し（終濃度
は50μg／ml）、該物質を直径3.5cmのプラスチツク
製ペトリ皿に注入する。アガロース溶液を室温ま
で冷却する（約30分）。アガロース中の直径２mm
孔をバイオラド（Biorad）カツター・ゲル・パ
ンチで切断する。該孔を使用直前に作成し、ウエ
ルをMBSで満たす。アツセイの少くとも６時間
前にTPA RNAを注入した１または２の卵母胞
を各ウエルに加える。インキユベーシヨンは湿ら
せた皿の中で12〜24時間行う。カゼイン加水分解
の明瞭なゾーンが容易に観察される。 ２倍容量のエタノールを添加し、ドライアイス
上で１時間インキユベートすることによつて
TPA mRNAに富む画分を沈殿させる。エペン
ドルフ（Eppendorf）卓上マイクロヒユージ
（microfuge）中、室温における遠心により沈殿
を収集し、滅菌蒸留水に溶解し、プールし、再沈
殿させる。このTPAポリA⁺豊富化mRNAはクロ
ーニング用cDNAを生成するのに用いる。 (3) cDNAの合成 すべてのこれらの反応物は氷上で組立てる。 (A) OdT_12-18プライマーを用いる第一鎖の合成 豊富化した、ポリＡ＋選択したボウエス
（Bowes）mRNA（H₂O 1μl中）の10μｇを10mM
MeHgOH（アルフア（Alfa））の存在において室
温で10分間インキユベートして二次構造のときほ
ぐれを補助する。続いて、以下の成分を加える；
β−メルカプトエタノール〜28mM；RNasin（バ
イオテク・インコーポレイテイツド（Biotec
Inc）１単位／μl最終反応容量；75mMトリス塩
基PH8.3；6mM MgCl₂；50mM KCl；10μgオリ
ゴデオキシチミジン（OdT_12-18コル（Col）研究
所；100μCi α−³²P−dCTP（アメルスハム
（Amersham））；dGTP、dTTPおよびdATP各
〜500μm；dCTP〜250μm（すべてのヌクレオチ
ドはピイ・エル・バイオケミカルズ（P.L.
Biochemicas）から入手、100mMトリス塩基PH
８中に〜20mM溶解し、1.0M NaClで中和）お
よび逆転写酵素（ライフ・サイエンシズ・インコ
ーポレイテイツド（Life Sciences Inc.）１単
位／μgインプツト（input）RNA、最終反応容量
50μl。反応物を42℃にて60分間インキユベートす
る。 (B) プライマーとして特異的15−体オリゴヌクレ
オチドを用いる第一鎖の合成（ほぼ類似の方法
についてはパナビエレス・エフら
（Panabieres、F.et al.）、ジーン（Gene）、19
巻、321〜６（1982）参照） 3′ポリＡテイル部を合成始点とするmRNAか
らのTPAについてコード付けする完全なcDNA
鎖を得るのは、前記方法を用いて常には可能でな
い。恐らくポリＡテイル部から上流の配列を合成
始点とすることによつて、ポリＡテイル配列で開
始した不完全cDNAに連結できる5′TPAコーデ
イングcDNAの配列が得られる。 cDNA合成用のプローブまたはプライマーのい
ずれかとして用いるには、３種の15体が好まし
い。それらの配列： 3′TPA位置に対して相補的 １ T⁵′_CＡ CGG TCG CAT G³′_TＴ 1759〜1773 ２ GGG GTT TGA GTC TCG 634〜648 ３ CCC ATC AGG ATT CCG 886〜900 それらは前記方法によつて合成され、精製され
る。 ポリＡ＋選択したRNAの25μgをプライマー
（鋳型に対して５〜10倍ピコモル過剰のプライマ
ー）1μgおよび58μl中の1.5mM EDTAと共に90
℃にてインキユベートする。最初90℃まで加熱し
た５ml水浴中に浸漬することによつて、混合物を
ゆつくりと室温まで平衡化する。RNA鋳型に対
する該15体をアニールした後、以下の試薬を加え
る：ジチオスレイトール（DTT）〜2mM；
RNasin1単位／μl最終反応容量；100mMトリス
塩基、PH8.3；11mM MgCl₂；50mM KCl；
100μCi α−³²P−dCTP；各500μmのdGTP、
dTTP、およびdATP；250μM dCTP；逆転写
酵素（ライフ・サイエンス・インコーポレイテイ
ツド（Life Science、Inc.））〜１単位／μg
RNA。20℃にて３時間インキユベーシヨンを行
ない、その時点で等量の逆転写酵素をさらに加
え、50゜にて30分間反応を継続する。フエノール
抽出によつて反応を停止し、マニアテイス中に詳
細に記載されている如く、アルカリ加水分解によ
つてRNA鋳型を除去する。 (c) 第二鎖の合成 最終容量100μlで、40mM KPO₄（Ｋ−ホスフエ
ート）PH7.5；6.6mM MgCl₂；1mM DTT；各
500μmのdGTP、dTTP、dATA；250μm
dCTP；100μCi ³H−dCTP（アメルスハム
（Amersham））およびDNAポリメラーゼクレノ
ーフラグメント（BRL）の１単位／μgインプツ
ト（input）RNAよりなる反応にて第二鎖を合成
する。反応物を15℃にて４時間インキユベートす
るが、続いて³H−dCTPの取込みをモニターする
こともできる。フエノール抽出によつて反応を停
止し、第一エタノール沈殿の代りに（NaCl〜
0.3Mよりむしろ）NH₄Acを2.5M加える以外は第
一鎖の合成について前記した如く二本鎖cDNAを
沈殿させる。 S₁を用いてヘアピン構造を除去する。該S₁反応
はマニアテイスにより行う。TCA可溶カウント
の増加によりヘアピンの除去が成功したことが測
定される。沈殿を省略してフエノール抽出によつ
て反応を停止する。水性相をプールし、直接ポリ
A⁺mRNAの分画に用いたのと同一のスクロース
グラジエントに付す。画分を収集し、、5μl分をア
クアフルオール（Aquafluor）シンチレーシヨン
流体（ニユー・イングランド・ヌクレア（New
England Nuclear））10ml中に溶解し、³²Pおよび
³Hを共に測定することによつて検定する。２倍
容量のエタノールを加え、ドライアイス上で30分
間インキユベートすることによつて関連画分から
のcDNAを沈殿させる。エペンドルフ
（Eppendorf）マイクロヒユージ（microfuge）
中、室温にて15分間遠心することによつて沈殿物
をペレツト化する。ペレツトを滅菌0.3M NaCl
に溶解し、プールし、再沈殿させる。沈殿物をペ
レツト化し、乾燥する。 (D) cDNAのベクターDNAへのテイリング
（tailing）およびアニーリング マニアテイス（Maniatis）によつて記載され
ている方法によつて、dCTPのホモポリマー系を
cDNA分子の3′末端に酵素的に加える。理想的に
は、dCTPの10〜30残基を加えてクローニング効
率を最大化すべきである。 （pBR322を消化してPst1で完成し、dGTP残
基のホモポリマー系を添加することによつて調製
した）ベクターDNAはニユー・イングランド・
ヌクレア（New England Nuclear）から商業的
に入手可能である。該ベクターDNAはマニアテ
イスによつて記載されている方法によつても調製
できる。ベクターDNAと共にcDNAをアニール
する方法もマニアテイスによつて記載されてい
る。簡単に述べると、10mMトリスPH7.4；0.4M
NACl；1mM EDTAを含有する50μlの反応にお
いて、テイリングを行つたcDNAを１：１のモル
比でベクターと混合する。最終DNA濃度は20〜
60μｇ／ml間で変化する。アニーリングは、１）
65°／10分；42°／60分；37°／２時間、および次い
で室温での２時間よりなる定義したインキユベー
シヨン処理に付すか、または２）水浴を閉じて
65°／10分にてインキユベートし、次いでゆつく
りと一晩で室温まで平衡化させるかのいずれかに
よつて行う。 (E) 完全長TPAcDNAのクローニングおよび配
列確認チヤート４〜５ 既に記載した形質転換法を用いて、cDNA含有
ベクターをイ・コリ（E.coli）中に導入する。前
記したハイブリダイゼーシヨン法を用いて該細菌
をインシテユ（in situ）スクリーニングする。 本明細書中に記載するコロニーハイブリダイゼ
ーシヨンはプローブとして同様に前記した15体を
用いる。ハイブリダイゼーシヨンプローブとして
用いるには、70mMトリス塩基（PH7.6）、
100mM KCl；10mM MgCl₂、5mMジチオスレ
イトール、および50μCir³²P dATP（ピイ・エ
ル・バイオケミカルズ（P.L.Biochemicals））、
ならびにポリヌクレオチドキナーゼ（ニユー・イ
ングランド・バイオラブズ（New England
Biolabs））1Uよりなる50μl反応容量中で、15−
体1μｇをホスホリル化する。インキユベーシヨ
ンは37°において60分間行う。このようにして、
15−体を1μgにつき１×10⁸cpmの特異的活性にラ
ベルすることができる。 クローンのPst1制限分析を用い、プローブに対
して相補性配列を示すクローンを第二のスクリー
ニングについて選択して、消化産物が、第１図に
示すまたはペニカら（Pennica et al.）、「イー・
コリ（E.coli）におけるヒト組織タイププラスミ
ノーゲンアクチベータ−cDNAのクローニングお
よび発現」、ネイチヤー（Nature）、301巻、214
〜21頁（1983年１月20日）により示された配列か
ら得ることができるPst1制限マツプと合致するか
どうかを決定する。望ましいクローンはTPA
cDNAの3′部の大きな部分である。消化により４
種のフラグメント：元のpBR322ベクター、
1150bpフラグメント、80bpフラグメントおよび
78bpフラグメントを得る。これらの結果は、遺
伝子の3′末端の約1300bpの挿入大きさ（ヌクレオ
チド1250〜2550）を示唆する。この仮定を確認す
るために、クローンをPst1およびDde1で二重消
化する。後者の酵素は1150bpフラグメントを切
断して926bpフラグメントと229bpフラグメント
とし、一方78または80bpフラグメントを無傷で
残すべきである。かかる二重消化の結果は、クロ
ーンが事実TPA遺伝子の3′末端を示すという結
論を支持するであろう。 最後の証拠として、DNAのミニ調製物をクロ
ーンから単離し、ジデオキシ鎖停止によつて配列
する。一般法の節に記載した如くにプラスミド
DNAのミニプレプを調製する。20：１モル過剰
の鋳型中、15体＃１をプライマーとして用いて、
一般法の節に記載した如くにジデオキシ配列決定
を行う。pTPA Ｈで示すこのクローンから得ら
れた配列データは、ヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーターについてのペニカら（Pennica et
al.）、ネイチヤー（Nature）、301巻、214〜21頁
（1983）によつて示された配列データと同一であ
る（チヤート４）。 これより、遺伝子の5′末端の単離に焦点をあて
る。これを行うには、OdT_12-18からよりもむし
ろ15体＃１からプライマー伸長させることによつ
て、cDNAを２回選択ポリＡ＋mRNAから合成
する。この方法によつて得られる利点は２つあ
る。まず、プライマー伸長がTPAに対して特異
的であるので、生成したcDNAの高パーセンテー
ジがTPAの特異的配列によつて示される。第２
に、プライマー伸長がポリＡテイル部の約
800bp5′であり、該部位は第一鎖合成をプライマ
ー伸長させるOdT_12-18によつて利用される。こ
れによつて、この方法から得られたcDNAは
pTPA Ｈよりもさらに5′を伸長させる転写を包
含することがほぼ確認される。 このTPA−プライマー伸長のcDNAでの形質
転換効率はcDNA 1μgにつき2.5×10⁵形質転換体
である。合計25000の形質転換体の２のバンクが
生成する。ジーン−ウオーキング（gene−
walking）の概念を適用して故意にスクリーニン
グを偏らせる。pTPA H5′末端80bp Pst1フラグ
メントをゲル単離し、プライマー伸長バンクから
得られた28000コロニーをプローブするのに用い
る。これにより少くともpTPA Ｈと同様に5′ま
で伸びるクローン、およびプライマー伸長試行の
結果、さらに5′配列を含有するクローンも同様に
特異的に選択される。 インシテユ・ハイブリダイゼーシヨンによるス
クリーニングは多くの陽性体を生成する。最も長
いTPA挿入はPst1およびDde1での第２のスクリ
ーニングにおいて検知される。本発明において
は、pTPA80−１で示すクローンはヌクレオチド
550〜1600の挿入大きさを包含していた（チヤー
ト４）。 制限データは3′末端の位置をかなり正確に
（＋／〜10％）決定することを可能とする。プラ
イマー伸長がヌクレオチド1759で開始し、および
pTPA80−１が約1600位置に3′末端を有するなら
ば、クローニングの間にどこかの位置にて約160
個の塩基対の損失が起こることになる。S₁エンド
ヌクレアーゼが最も可能性のある損失原因であ
る。 pTPAHおよびpTPA80−１の配位を決定す
る。プラスミドpTPAHおよびpTPH80−１を
SacおよびPvuで切断して各々フラグメント
７（1251bp）および８（5.1kb）を得、これをゲル
単離する。該フラグメントを細菌アルカリ性ホス
フアターゼで処理し、T4ポリメラーゼを用いて
結んでTPA cDNAの位置550〜2230塩基を有す
るpTPA3′ cDNA（6.3kb）を得る。新しい組立
体をPst1消化によつて確認する。 pTPA80−１は第一のプライマー伸長バンクに
おいて検知される陽性体の中で最も長いTPA挿
入を示すので、アミノ酸残基233〜237のコーデイ
ング配列に対して相補的な第二のオリゴヌクレオ
チド（ヌクレオチド886〜900；15−体＃２）を用
いてもう１つのcDNAライブラリーを生成し、
5′末端を完成する。もしS₁が転写の3′末端から
200bpまでも除去するならば、pTPA3′cDNAで
の十分な重複がなお存在してフラグメントの組立
が可能となるように遺伝子のこの特定領域を選択
する。 5′塩基を含有するcDNAをPst切断pBR322に
結び、前記の如くにイー・コリ（E.coli）中に形
質転換した。このcDNAでの形質転換効率は3.6
×10⁴形質転換体／μg cDNAの桁である。ヌクレ
オチド645〜660（15−体＃３）から伸長するコー
デイング配列に対して相補的なオリゴヌクレオチ
ドでこのラリブラリーからのコロニーをスクリー
ニングし、明らかな陽性体を選択する。Pst1およ
びBg消化によつて第二のスクリーニングを行
い、pTPA5′ cDNAで示す１のクローンは残存
する5′配列１〜750を含有することが示された。
再び、S₁の挿入長に対する影響は
pTPA5′ cDNAに関して明らかである。プライ
マー伸長はヌクレオチド886にて開始するが、
pTPA5′ cDNAはヌクレオチド約750個しか伸長
しない；発明者らの実験は約136bpの損失を示し
た。 ２のクローン（pTPA3′ cDNAおよび
pTPA5′ cDNA）について利用可能な完全な
TPA配列に関し、最後の組立作業が残る。方法
はチヤート５に示す。 プラスミドpTPA5′ cDNAをTaqで切断し
てフラグメント９（2194bp）を得る。
pTPA5′ cDNAのTPA配列内の１のTaq部位
（位置634）は高度に酵素耐性である。フラグメン
ト９をBg1およびHgaで切断して蛋白質の成
熟部分を表わすTPAcDNAの塩基188〜593を有
するフラグメント10（405kb）を得る。 TPAcDNAの中央部分は、まずpTPA3′cDNA
をPuvで切断し、フラグメント11（1748bp）を
EcoR分離することによつて得られる。次いで
フラグメント11をHgaで切断して塩基594〜802
を含有するフラグメント12（209bp）を得る。 cDNAの3′部分を得るには、pTPA3′cDNAを
Pvuで消化し、6.5kbフラグメントを単離し、
T4ポリメラーゼで処理し、EcoRで部分的に消
化して塩基802〜2230を含有するフラグメント13
（187bp）を得る。 cDNAの３つの部分の結びは、公に入手でき、
かつラオ・アール・エヌおよびロジヤーズ・エ
ス・ジイ（Rao、R.N.and Rogers、S.G.）、プラ
スミドpKC7：DNAセグメントをクローンする
のに適当な10の制限部位を含有するベクター、ジ
ーン（Gene）７：79〜82（1979）に詳細に記載さ
れているpKC7の使用を含む。プラスミドpKC7
をBg1およびSmaで消化し、細菌アルカリ性
ホスフアターゼで処理してフラグメント14
（4.8kb）を得、これをゲル単離する。 フラグメント10、12、13および14を単一の結び
プールにおいて結ぶ。この方法の１の注目すべき
態様は、それにより内部フラグメントのアルカリ
性ホスフアターゼ処理の必要性が排除される方法
である。 典型的には、多数片（４フラグメント）結び
はフラグメントのコンカテメリゼーシヨン
（concatemerization）のため非常に低い効率で
所望の組立を実現する。適当な方法にてのアルカ
リ性ホスフアターゼでの処理はこの問題を最小限
とし、その結果正しい多数片組立ての効率が劇的
に増加する。TPAフラグメントを組立てるにお
いて、発明者らは、制限エンドヌクレアーゼHga
がDNAを切断する特別な方法を利用した。酵
素の認識（結合）配列はGACGCであるが、該酵
素はその認識部位を超えた地点で切断を行う。そ
の結果、Hgaで切断されたフラグメントはそれ
らの元々隣接していた反対部分でのみ結ばれる。
Hga突出部分によつて促進される自己結びは起
こり得ない。該４片TPA結びはHga末端を有
する２のフラグメントを含有する。（自己閉鎖を
最小化するために）ベクターをアルカリ性ホスフ
アターゼで処理することをつけ加えることによ
り、その結果ほとんどの形質転換体が正しく組立
てられたTPA遺伝子を有することになる。正し
い組立ては制限的消化によつて証明される。
TPAについての完全なcDNA配列を含有するプ
ラスミドをpTPAcDNA（7.4kb）で示す。 実施例 実施例１ 合成オリゴヌクレオチドの調製 前記した方法により87種の別々のオリゴヌクレ
オチド（第３図）を合成した。記載した方法によ
り、位置187におけるBg1 部位および位置
1287におけるEcoR部位間の合成DNAの1084塩
基対を組立ててpTPA−B1、２、３に入れる
（チヤート９）。インタードメイン領域への挿入の
ために選択した特異的制限部位はチヤート10およ
び11に示す。各ブロツクをイー・コリ（E.coli）
における複製用のおよび配列証明用の適当なクロ
ーニングベクターと再び組合せる。用いたすべて
の結びおよびクローニング方法はマニアテイスら
（Maniatis et al.）、前掲、によつて記載された
とおりである。すべてのクローンした配列をサン
ガー（Sanger）ジデオキシ配列決定法を用いて
配列して配列を証明する。 ブロツク１ オリゴヌクレオチドP1−P4、P8
−P11をアニールし、結んで二本鎖セグメントを
得、これをオリゴヌクレオチドP5−P7および
P12−P14よりなる第２のセグメントに結ぶ。得
られたブロツク１はフインガー（finger）ドメイ
ンについてコード付けする配列を含有する。ブロ
ツク１をクローンして調製例１に記載したpSK4
のBg1 およびSph部位に入れる。 ブロツク２ フインガー（finger）ドメインに
ついてコード付けする配列を含有するオリゴヌク
レオチドP15−P18およびP19−P23を単一工程の
アニーリングおよび結びにおいて一緒に結んでブ
ロツク２を得、クローンしてpBR322のSphお
よびCla 部位に入れる。 ブロツク３ オリゴヌクレオチドP24−P28、
P34−P38をアニールし、結んで二本鎖セグメン
トを得、これをオリゴヌクレオチドP29−P33お
よびP39−P43よりなる第２のセグメントに結ぶ。
得られたブロツク３はクリングル（kringle）１
ドメインについてコード付けする配列を含有す
る。ブロツク３をクローンしてpBR322のCla
およびBamH部位に入れる。 ブロツク４ オリゴヌクレオチドP44−P47お
よびP67−P70；P48−P51およびP71−P74；
P52、P53、P92、P93および、P75、P76、P94、
P95；P57−P61およびP80−P84；ならびにP62
−P66およびP85−P89を各々５個の別の試験管
中でアニールして二本鎖セグメントとし、次いで
これらをプールし、結んでブロツク４を得る。ブ
ロツク４はクリングル（kringle）２ドメインに
ついてコード付けするDNA配列を含有する。ブ
ロツク４をクローンしてpBR322のBamHおよ
びEcoR部位に入れる。 実施例 ２ TPA cDNAの活性部位を用いてのブロツク１
−４の組立て、チヤート６〜11 以下の実施例は、実施例１の各種合成ブロツク
を組立てて生物学的に活性なTPAについてコー
ド付けすることができる遺伝子に入れるのに必要
な工程の要約を提供する。２の始原型遺伝子を記
載する。プラスミドpTPA−B1、２、３、４(a)
はクリングル（kringle）２ドメインおよび活性
部位間に人工的に導入されたエンドヌクレアーゼ
部位を有しないTPAをコード付けする遺伝子を
有する。プラスミドpTPA−B1、２、３、４は
クリングル（kringle）２および活性部位間に人
工的に導入されたエンドヌクレアーゼ制限部位を
有するTPAをコード付けする遺伝子を有する。 Ａ pTPA−B1の組立て−チヤート６ プラスミドpSK4をClaおよびSphで消化
し、大きな4.1kbフラグメント15を単離し、Cla
／Xbaリンカーを用いてブロツク１フラグメ
ントに結ぶ。マニアテイスによつて記載された塩
化カルシウム形質転換法を用いて、結んだ混合物
を形質転換してHB101に入れる。マニアテイス
ら（Maniatis et al.）によつて記載されたニツ
クトランスレーシヨン法を用いて、形質転換体を
ニツクトランスレーシヨンを行つたブロツク１フ
ラグメントでスクリーニングを行う。次いで、サ
ンガー（Sanger）ジデオキシ配列決定法を用い
て、プローブに対しハイブリダイゼーシヨンされ
た形質転換体を配列して正しい配列および配位を
確認する。この新しい形質転換体をpTPA−B1
（4.25kb）で示す。 Ｂ pTPA−B1、２の組立て−チヤート７ プラスミドpTPA−B1をEcoRおよびSph
で消化し、フラグメント16（450bp）を単離する。
プラスミドpBR322をEcoRおよびClaで消化
し、大きなフラグメント17（4.35kb）をゲル単離
する。次いでフラグメント16および17を合成した
Sph／Claブロツク２に結ぶ。結んだ混合物
を形質転換してHB101に入れ、形質転換体をニ
ツクトランスレーシヨンを行つたブロツク２でス
クリーニングを行う。プローブに対してハイブリ
ダイゼーシヨンされた形質転換体を配列してそれ
らがその正しい配位にあるブロツク２を含有する
ことを確認する。この組立体をpTPA−B1、２
（4.8kb）で示す。 Ｃ pTPA−B1、２(a)の組立て−チヤート８ プラスミドpTPA−B1、２(a)はフインガー
（finger）および発育因子ドメインから上流に
HindおよびBg1制限部位を含有する。プラ
スミドpTPA−B1、２をXbaおよびEcoRで
消化し、大きな4.5kbフラグメント18をゲル単離
し、HindおよびBal部位を含有するオリゴヌ
クレオチドリンカーに結ぶ。結んだ混合物を形質
転換してHB101に入れ、形質転換体をHind／
Bg1部位の存在についてスクリーニングする。
新しい組立体をpTPA−B1、２(a)（4.5kb）で示
す。 Ｄ pTPA−B1、２、３の組立て−チヤート９ プラスミドpTPA−B1、２(a)をClaおよび
BamHで消化し、大きな4.0kbフラグメント19
を単離する。このフラグメントをブロツク３
（270bp）よりなる合成したCla／BamHクリ
ングル（kringle）１領域に結び、形質転換して
HB101に入れる。形質転換体をニツクトランス
レーシヨンを行つたブロツク３でスクリーニング
した。ブロツク３に対してハイブリダイゼーシヨ
ンした形質転換体を配列して配列および配位を確
認した。この新しい組立体をpTPA−B1、２、
３（4.3kb）で示す。 Ｅ pTPA−B1、２、３、4aの組立て−チヤー
ト10 このプラスミドは酵素活性を有するTPA同族
体についてコード付けする全始原型TPA遺伝子
を含有する。この遺伝子には、クリングル
（kringle）２および活性部位間のインタードメイ
ン領域に対する変化はない。pTPA−B1、２、
３、4a（4.2kb）の組立てにはいくつかの工程を必
要とする。プラスミドpTPA cDNA（チヤート
５）をScaで切断し、TPA遺伝子の3′端部につ
いてコード付けするフラグメント20（6.0bp）をゲ
ル単離する。プラスミドpTPA−B1、２、３（チ
ヤート９）をScaおよびBamHで切断してフ
インガー（finger）、発育因子およびクリングル
（kringle）１ドメインを含有するフラグメント21
（1100bp）を得る。ブロツク４をBamHおよび
Scaで切断することによつて第３のフラグメン
ト4a（230bp）を得る。T4リガーゼを用いて３つ
のフラグメントを結んでpTPA−B1、２、３、
４＊を得る。HindおよびAatを用いてTPA
遺伝子をpBr322から切断して2.2kbフラグメント
を得、これを継代クローンしてpUC−19に入れ
る。プラスミドpUC−19は種々の源から商業的
に入手可能であり、TPAドメインの操作を面倒
でなくする選択した制限部位をそのDNA配列中
に含有する。 Ｆ pTPA−B1、２、３、４の組立て−チヤー
ト11 このプラスミドは酵素的に活性なTPA同族体
についてコード付けする全始原型TPA遺伝子を
含有する。この同族体において、すべての４のド
メインおよび活性部位はユニーク制限部位がクリ
ングル（kringle）２および活性部位間の領域を
包含するすべてのインタードメイン領域中に入れ
られた状態で存在する。まずpTPA−B1、２、
３、4aをEcoRおよびBam Ｈで切断し、フ
インガー（finger）、発育因子およびクリングル
（kringle）１ドメインを含有する大きな3.7kbフ
ラグメントを単離することによつてプラスミドを
組立てる。合成により生成したブロツク４を、
BamHでの消化およびEcoRでの部分的消化
によりそのクローンから得て560kbを有する無傷
のブロツク４を得る。T4リガーゼを用いて２つ
のフラグメントを結んでpTPA−B1、２、３、
４を得る。 プラスミドpTPA−B1、２、３、4aおよび
pTPA−B1、２、３、４は種々の合成TPA同族
体を組立てるのに用いることができる。 実施例３ TPA同族体の組立て Ａ pFK1K2Aの組立て（発育因子ドメインの欠
失） プラスミドpTPA−B1、２、３、4aをEcoRV
で、およびHpaで部分的に消化して724ではな
く334における部位を消化する。大きなフラグメ
ント（4.1kb）を単離し、再び結んでpFK1K2A
を得る。次いでプラスミドpFK1K2Aを形質転換
してHB101またはいくつかの他の適当な宿主に
入れる。次いで正しい配位および配列について該
プラスミドをスクリーニングする。 Ｂ pFK2Aの組立て（発育因子およびクリング
ル（Kringle）１ドメインの欠失） プラスミドpTPA−B1、２、３、４をHpa
で消化する。大きな6.5kbフラグメントを単離し、
再び結んでpFK2Aを得る。該プラスミドを形質
転換してHB101またはいくつかの他の適当な宿
主に入れ、正しい配位および配列についてスクリ
ーニングする。 Ｃ pFK2K2Aの組立て−チヤート12（発育因子
およびクリングル（kringle）１の欠失ならび
にクリングル（kringle）２の複製 プラスミドpTPA−B1、２、３、４（チヤート
11）をHpaで消化してフラグメント22（3.9kb）
を得、これを単離する。pTPA−B1、２、３、
４の第２の試料をHpaおよびMstで消化し、
クリングル（kringle）２ドメインを含有する得
られた560bpフラグメント23を単離する。Hpa
消化のFK2Aフラグメントを平滑末端でHpa／
Mstフラグメントに結んでpFK2K2A（4.1kb）
を得る。次いでプラスミドpFK2K2Aを形質転換
してHB101に入れ、正しい配位および正しい配
列についてスクリーニングする。 Ｄ イー・コリ（E.coli）プラスミドpTPA
Exp1における発現−チヤート13 TPA同族体の発現は、チヤート７に示す発現
プラスミドpTPA−B1、２、チヤート６に示す
pTPA−B1、またはそれらの均等体を用いるこ
とによつてイー・コリ（E.coli）中で達成でき
る。いずれの同族体も発現用のXbaおよび
BamH部位内に置くことができる。イー・コ
リ（E.coli）においてpFK2K2Aを発現するには、
pTPA−B1、２（チヤート７）およびpFK2K2A
（チヤート12）をXbaおよびBamHで切断
し、フラグメント24（4.2kb）および25（2.0kb）を
ゲル単離する。フラグメント24および25を結んで
発現プラスミドpTPAExp1（6.2kb）を得る。 プラスミドpTPAExp1はTrpプロモーターお
よびオペレーターを含有し、発現は構成的であ
る。イー・コリ（E.coli）の培養はマニアテイス
（前掲）による。該イー・コリ（E.coli）培養は
活性なTPAを産生しないであろう。イー・コリ
（E.coli）によつて産生されたTPAは再び折りた
たんで天然状態としなければならない。公知のシ
ステイン再シヤフリング（shuffling）法によつ
て活性TPAを得ることができる。米国特許第
4511502号。 実施例４ 真核生物における発現 Ａ 酵母におけるヒトTPAの発現 本実施例は、MFα1プロモーターおよびpre−
pro配列を有する酵母発現プラスミドpα1−
FK2K2Aの組立てを説明する。酵母における
TPA同族体の発現用の培養条件および好ましい
宿主株も提供する。 (1) pα1−ADHt、酵母発現ベクターの組立て プラスミド、pα1−ADHt、は酵母についての
多目的発現ベクターである。都合よい地点の制限
部位がその構造中に組込まれており、MFα1プロ
モーター下の制御は一般に高レベルの発現に適合
する。以下の工程はpα1−ADHtの組立てを記載
する。（チヤート14〜18） ａ pYRep3′Bの組立て−チヤート14 REPおよび2μプラスミドの複製開始点配列
をpYIP31のURA3遺伝子のSam部位に入れて
都合よいカセツトを得ることによつてプラスミド
pYRep3′Bを組立てる。プラスミド、2μおよび
pYIP31は共に公に入手可能であり、文献中に詳
細に記載されている。該2μプラスミドは、「酵母
サツカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）」〔ライフ・サイクル・アンド・イン
ヘリタンス（Life cycle and inheritance）〕、
445〜470頁においてジエイ・アール・ブローチ
（J.R.Broach）によつて詳細に記載され、Rep
領域はセル（Cell）34：95〜104（1983）およびセ
ル（Cell）35：487〜493（1983）に記載されてい
る。プラスミドpYIP31はジーン（Gene）、18：
17〜24（1979）に記載されていた。 プラスミドpYIP31をまずSamで切断し、細
菌アルカリ性ホスフアターゼで処理してフラグメ
ント26（5.4kb）を得、これを単離する。酵母の2μ
プラスミドをPstおよびXbaで切断し、クレ
ノーで満たし、フラグメント27（1.3kb）を単離す
る。T4DNAリガーゼを用いてフラグメント26お
よび27を結んでpYRep3′B（6.7kb）を得る。 ｂ pADHtの組立て−チヤート15〜16 プラスミドpADHt（3.86kb）は酵母発現ベクタ
ーを組立てるのに有用な制限部位を供給するので
有用である。 pADHtの組立用の出発プラスミドはpGG400
（4.0kb）である。プラスミドpGG400を公に入手
容易なプラスミドpBR322およびpML21から組立
てる。ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー（J.
Bacter.）、126：447〜453（1976）。具体的には、
テトラサイクリン耐性についてコード付けする
pBR322の遺伝子をカナマイシン耐性についてコ
ード付けするpML21の一部で置換える。プラス
ミドpBR322をまずEcoRおよびPvuで切断
し、クレノー酵素でEcoR突出部を満たし、ア
ガロースゲルから単離してフラグメント28
（2.3kb）を得る。プラスミドpML21をPuvで切
断してカナマイシンに対する耐性用の遺伝子を有
するフラグメント29（1.7kb）を得る。満たした
EcoR部位を用いてPuv切断部を結ぶことに
より、結んだ後EcoR部位が再生する。フラグ
メント28および29を結んでpGG400を得、これを
pADHtを組立てるのに用いる（チヤート15）。 pGG400をPvuおよびXhoで切断し、クレ
ノー酵素で処理してフラグメント30（3.5kb）を
得、これを単離することによつてプラスミド
pADHtを組立てる。まずHincおよびBamH
で切断し、T4ポリメラーゼで処理し、フラグメ
ント31（0.36kb）を単離することによつて酵母ア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）の3′端
部をpADHBCから得る。プラスミドpADHBCは
公に入手可能であり、ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）257：
3018〜1025（1982）に詳細に記載されている。フ
ラグメント30および31を結んで特にpADHtを得、
形質転換してイー・コリ（E.coli）に入れる。
pADHtを有するそれらの形質転換体はそれらの
プラスミドにおいてBamHおよびXho部位
を再生するであろう。これらの形質転換体を選択
し、制限酵素分析法および配列決定法によつてク
ローンしたADH3′端部の正しいことを確認す
る（チヤート16）。 ｃ pADHt−REPの組立て−チヤート17 プラスミドpADHt−REP（6.2kb）は、
URA3−REP−複製開始点カセツトをpADHt
に入れて酵母における発現および複製を容易とす
るpADHtおよびpYRep31の組立体である。
EcoR−HindまたはEcoR−Smaフラグ
メントは適当な酵母プロモーターを有する所望の
DNAフラグメントで置換えることができる、あ
るいはそれは複製開始点、選択可能なマーカーお
よび酵母URA3遺伝子の3′端部を有するSal−
Xhoフラグメントを供給するのに用いることが
できるので、プラスミドpADHt−REPは発現
ベクターの組立てに有用である。 BamHで切断し、端部をクレノー酵素で満
たし、８−体Salリンカーを満たしたBamH
部位に挿入することによつてプラスミドpADHt
を修飾する。（修飾した）プラスミドpADHtを
Sphで切断し、端部をT4ポリメラーゼで満た
してフラグメント32（3.8kb）を得る。プラスミド
pYRep31BをHindで切断し、URA3の3′端部お
よび安定性を増大させると考えられる2μRep領
域ならびに複製開始点を含有させてフラグメント
33（2.4kb）を単離する。フラグメント32および33
を結び、時計回りの転写を可能とする配位の
URA3遺伝子を持つプラスミドを有するイー・コ
リ（E.coli）形質転換体をスクリーニングして
pADHt−REPを得る。 ｄ pα1−ADHtの組立て−チヤート18 pADHt−REPのEcoR−Hindフラグメ
ントをプロモーターおよびMFα1遺伝子のpre−
pro配列を含有するpα1からのEcoR−Hind
フラグメントで置き換えることによつてpα1−
ADHt（6.5kb）の組立てを完成する。プラスミド
pα1はエイ・シンら（A.Singh、et al.）、ヌクレ
イツク・アシツド・リサーチ（Nucleic Acid
Research）、11：4049〜63（1983）およびジエ
イ・クルヤンら（J.Kurjan、et al.）セル
（Cell）、30：933〜943（1983）によつて詳細に記
載されている。プラスミドpADHt−REPをま
ずEcoRおよびHindで切断してフラグメント
34（5.3kb）を得、これを単離する。また、プラス
ミドpα1をEcoRおよびHindを切断してフラ
グメント35（1.2kb）を得、これを単離する。次い
でフラグメント34および35をT4DNAリガーゼを
用いて結んでpα1−ADHtを得る。 (2) pα1−FK2K2Aの組立て、TPA同族体
cDNAの酵母発現ベクターへの挿入−チヤート
19 酵母中でTPA同族体を産生するための好まし
い発現ベクターをMFα1プロモーターを有する
pα1−FK2K2Aで示す。プラスミドpFK2K2A
（チヤート12）をBg1で切断してフラグメント
36（2.0kb）を得、これをゲル単離する。プラスミ
ドpα1−ADHtをHindおよびXhoで切断して
フラグメント37（5.6kb）を得、転写、ポリアデニ
レーシヨンおよび翻訳部位を供給する。本明細書
中で記載する系は成熟TPA蛋白質より下流で停
止し、得られた産生物は酵母起源の少しのアミノ
酸をさらに有するであろう。TPA遺伝子の正確
な端部で翻訳を停止するために、停止コードンを
供給することができる。 同族体がMFα pre−pro配列の解読フレームと
同相であることを確認するには、同族体の5′およ
び3′端部を変化させない。もう１つのリンカーを
挿入するかあるいはクレノー（Po1）およびマ
ングビーン（Mung Bean）ヌクレアーゼと組合
せるのいずれかによつて5′端部におけるBgl部
位を操作して解読フレームをMFα1“pre−pro”
配列と同相に維持しつつHind部位を得ること
ができる。本実施例については、アデノシンおよ
びグアノシンと共にクレノーを用いてフラグメン
ト37のBgl部位を部分的に満たす。次いで部分
的に満たした部分をマングビーン（Mung
Bean）ヌクレアーゼで平滑末端とし、pα1−
ADHtのHind部位に結ぶ。（端部を部分的に満
たした）フラグメント36および37を結んで
pFK2K2A（7.6kb）を得る。解読フレームが酵母
配列と同相に維持される限り、他の同族TPA遺
伝子を平滑末端として発現ベクターに挿入するこ
ともできる。 (3) 酵母におけるプラスミドpα1−FK2K2Aから
のTPA同族体の発現 酵母体YNN227（α、ura3−52 trp1−289）を
pα1−FK2K2Aで形質転換する。グルコース最小
培地（２％グルコース、0.7％酵母窒素ベース、
１％カザミノ酸、40μg／mlアデニン、50μg／ml
トリプトフアン）中で形質転換体を10時間増殖さ
せる。次いで遠心により細胞をペレツト化する。
ガラスビーズで攪拌することによつて細胞を溶解
する。TPA量はウエスタンブロツテイング法ま
たはラジオイムノアツセイ法あるいはクセノプス
（Xenopus）卵母細胞について前記したアガール
中のカゼイン酵素アツセイ法を用いて検知するこ
とができる。 まず0.5mmガラスビーズで溶解し、続いてアフ
イニテイカラム上で精製することによつてTPA
酵母細胞から単離することができる。標準的な蛋
白質精製法を適用してさらに精製を行うことがで
きる。 Ｂ チヤイニーズハムスター卵巣細胞における
TPA同族体の発現−チヤート20〜22 以下の実施例はチヤイニーズハムスター卵巣
（CHO）細胞においてpFK2K2Aを発現する好ま
しい方法を示すものである。要約すると、各々イ
ー・コリ（E.coli）およびCHO細胞においてアン
ピシリン耐性およびジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
をマーカーとして用いてCHOおよびイー・コリ
（E.coli）の両細胞において複製するシヤトルベ
クターpSVCOW7をここに開示する。プラスミド
pSVCOW7は、また、CHO細胞における発現に
必要なウシ成長ホルモンからのポリアデニレーシ
ヨン配列を供給するものである。プラスミド
pSVCOW7をまず切断し、細菌プロモーターおよ
びTPA同族体を挿入する。CHO細胞において発
現されるTPAについての形質転換培養条件およ
び抽出方法も以下に記載する。 (1) pSVCOW7の組立て−チヤート20 （アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨン（American Type Culture Collection）か
ら入手可能な、あるいはエス・スブラマニら（S.
Subramani、et al.）、「シミアン（Simian）ウイ
ルス40におけるマウスジヒドロ葉酸還元酵素相補
性デオキシリボ核酸の発現」、モレキユラー・ア
ンド・セリユラー・バイオロジー（Molecular
and Cellular Biology）２：854〜864（1981年９
月）の方法により調製した）出発プラスミド
pSV2dhfrをBamHおよびEcoRで消化して
アンピシリン耐性遺伝子、SV40複製開始点、お
よびdhfr遺伝子を含有するフラグメント38
（5.0kb）を得る。pSVCOW7の第２の部分は、
pSV2dhfrを切断するのに用いたのと同一の制限
エンドヌクレアーゼで消化してゲノムウシ成長ホ
ルモン遺伝子、すなわち、BGH gDNAの3′端部
を含有するフラグメント39を得るプラスミド
pλGH2R2から得られる。プラスミドpλGH2R2
は、イリノイ州、ペオリア（Peoria）のノーザ
ン・リージヨナル・リサーチ・ラボラトリーズ
（Northern Regional Research Laboratories）
に寄託した（NRRL Ｂ−15154）イー・コリ
（E.coli）HB101宿主から公に入手可能である。
フラグメント38および39を結んでpSVCOW7
（7.1kb）を得る。 (2) pTPA−cDNA、BamHの組立て−チヤー
ト21 TPA同族体をpSVCOW7に都合よく挿入する
ためには、都合よいBamH部位を成熟蛋白質
配列から上流にあるTPAの先導配列内に挿入す
る必要がある。これを達成するには、
pTPA5′cDNA（チヤート５）をHgaで切断し、
塩基78〜593を含有するフラグメント40（517bp）
をクレノー酵素で平滑にする。平滑末端を10−体
BamHリンカーに結び、フラグメント40をNar
で切断してTPA cDNAの塩基68〜521を有す
るフラグメント41を得る。 プラスミドpTPA−cDNA（チヤート５）を
NarおよびBgl で切断し、TPA cDNAの
3′部分を含有するフラグメント42（1644bp）をゲ
ル単離する。フラグメント41および42をpKC7の
BamHおよびBgl消化の結果得られたフラグ
メント43（4.3kb）に結んでpTPA−cDNA、
BamH（6.5kb）を得る。 (3) pTPA−IE−PAの組立て−チヤート22 TPAドメインの天然配置を有するTPA修飾
cDNAを含有するプラスミドpTPA−IE−PAは
CHO細胞によつて発現されることが可能である、
あるいはTPA同族体を含有する別法発現プラス
ミドの組立を容易とするのに用いることができ
る。pTPA−IE−PAの組立は２つの工程で達成
される。まずpTPA−cDNAからのTPA cDNA
をpSVCOW7に挿入し、次いでサイトメガロウイ
ルスの即時型プロモーターを挿入してTPA同族
体の転写を開始する。 工程１ プラスミドpSVCOW7をEcoRおよび
Puvで切断し、BGH遺伝子の3′ほとんどのエ
クソンにおけるPuv部位から3′末端より下流
のEcoR部位まで伸びるウシ成長ホルモンの
ポリアデニレーシヨン配列を含有するフラグメ
ント44（600bp）を得る。BGHポリアデニレー
シヨン配列の完全な記載については、以下の文
献を参照昭されたい：(1)bGHゲノムDNAの同
定および特徴づけが開示されている1984年６月
27日出願のヨーロツパ特許出願0112012号；(2)
ウオイチツク・アール・ピイら（Woychik、
R.P.et al.）、「正確なポリアデニレーシヨンの
ためのウシ成長ホルモン遺伝子の3′フランキン
グ領域の要件」、プロシーデイングズ・オブ・
ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA81：3944〜3948
（1984年７月）；および、デイ・アール・ヒツグ
ズら（D.R.Higgs、et al.）、ネイチヤー
（Nature）306：398〜400（1983年11月24日）お
よびそこに引用されている文献。 pSVCOW7の第２の試料をEcoRおよび
BamHで切断してフラグメント45を得る。別
法として、フラグメント45はベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ（Bethesda Research
Laboratories）から入手可能な親プラスミド
pSV2dhfrからのEcoR／BamHフラグメン
トから得られる。フラグメント45はpBR322から
の複製開始点およびイー・コリ（E.coli）におい
てプラスミドの選択を可能とするイー・コリ（E.
coli）において発現されたアンピシリン耐性遺伝
子を含有する。該フラグメントは、また、哺乳動
物細胞において発現を可能とする組立体中にマウ
スジヒドロ葉酸還元酵素cDNAを含有する。スブ
ラマニら（Subramani、et al.）、モレキユラ
ー・アンド・セリユラー・バイオロジー（Mol.
Cell.Biol.）１：854−864（1981）。 TPAcDNAは、pTPA−cDNA、BamHを
BamHおよびBal で切断することから得ら
れるフラグメント46（1.9kb）から得られる。フラ
グメント46はtPAcDNAからの全コーデイング領
域を含有する。BamH切断はmRNAの5′末翻
訳配列についてコード付けするcDNAにおけるも
のであり、Bal切断はcDNAの3′未翻訳領域に
ついてコード付けするcDNAにおけるものであ
る。 フラグメント44，45および46を結んでイー・コ
リ（E.coli）およびCHO細胞間を行き来できる複
製ベクターであるpTPA−PA（8.4kb）を得る。
プラスミドpTPA−PAを形質転換してイー・コ
リ（E.coli）に入れる。 工程２ 工程２においては、ヒトサイトメガロウ
イルスからの即時型遺伝子プロモーター
（CMV I.E.プロモーター）を挿入することに
よつて、pTPA−PAを発現プラスミドpTPA
−IE−PAに変換する。CMV.I.E.プロモーター
はCMVゲノムのPst消化から得られる。主た
る即時型遺伝子を含有するヒトサイトメガロウ
イルスゲノム（CMV I.E.）の領域の制限エン
ドヌクレアーゼ切断マツプは詳細に記載されて
いる（ステインスキイら（Stinsti、et al.）、
ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）
46：１〜14、1983；ステンベルグら
（Stenberg、et al.）、ジヤーナル・オブ・バイ
ロロジー（J.Virol.）49：190〜199、1984；お
よび、トムセンら（Thomsen、et al.）、プロ
シーデイングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.
Sci.）USA、81：659〜663、1984）。 これらの文献は、その配列の中に主要な即時型
遺伝子についてのプロモーターを含有する2.0キ
ロベースのPstフラグメントを記載している。
それにより所望の760塩基対フラグメントが産生
物の中に得られるこの2.0kb Pstフラグメント
のSau3Aでの単離消化によつてCMV I.E.プロ
モーターをさらに単離することができる。この
760塩基対フラグメントは、その大きさならびに
フラグメント内のSca切断部位およびBal切
断部位の存在によつて他の産生物から区別でき
る。その便利な同定のため、このSau3Aフラ
グメントの利用は本明細書中に記載するCMV I.
E.プロモーターを用いる好ましい方法である。 工程１で組立てたプラスミドpTPA−PAを
BamHで切断し、CMV即時型プロモーターを
含有するSau3AフラグメントをBamH部位
に結ぶ。プロモーターからの転写がTPAについ
てのmRNAを合成するような配位でCMVプロモ
ーターフラグメントを含有するプラスミドは、プ
ラスミドをSacで切断することによつて同定さ
れる。得られたプラスミドを、TPA cDNAの
5′端部にCMV I.E.プロモーターを有し、および
その3′端部にbGHポリアデニレーシヨンシグナル
を有するpTPA−IE−PAで示す。 (4) pTPA−IE−FK2K2Aの組立て−チヤート
23 pTPA−IE−FK2K2Aの組立ては２段工程で
ある。工程１は所望のTPA同族体、BGHからの
ポリアデニレーシヨンシグナル配列ならびに
pSVCOW7の選択可能なマーカーおよびレプリコ
ンを含有するpTPA−FK2K2Aの生成を含み、
工程２は前記CMV I.E.プロモーターの挿入を含
む。以下の実施例はTPA同族体FK2K2Aの挿入
を記載するが、同一の酵素および方法を用いて他
の同族体を挿入することもできる。 工程１ プラスミドpTPA−IE−PA（チヤート
22）をBamHおよびBglで切断してTPA先
導配列塩基１〜188を含有するフラグメント47を
得る。pSVCOW7（チヤート20）をEcoRおよび
Pvuで切断してフラグメント48（600bp）を得る
ことによつて、BGHのポリアデニレーシヨンシ
グナル配列が得られる。TPA同族体配列は
pFK2K2A（チヤート12）をBglおよびBalで
切断してフラグメント49（2.0kb）を得ることより
得られる。pSVCOW7の第２の試料をEcoRお
よびBamHで切断してpSVCOW7のマーカー
およびレプリコンを含有するフラグメント50
（5.8kb）を得る。４種のフラグメントをゲル単離
し、T4リガーゼを用いて結んでpTPA−
FK2K2A（8.3kb）を得る。 工程２ プラスミドpTPA−FK2K2Aを
BamHで切断し、Sau3A消化のCMV−IEプロ
モーター配列を挿入してpTPA−IE−FK2K2A
を得、これをCHO細胞中へのトランスフエクシ
ヨンまでイー・コリ（E.coli）中で維持する。 (5) CHO細胞のトランスフエクシヨンおよび培
養 グラハムら（Graham、et al.）（イントロダク
シヨン・オブ・マクロモレキユールズ・イント
ウ・バイアブル・ママリアン・セルズ
（Introduction of Macromolecules into Viable
Mammalian Cells）、アラン・アール・リス・イ
ンコーポレイテイツド（Alan R.Liss Inc.）、ニ
ユーヨーク、1980、３〜25頁）によつて詳細に記
載されているDNAの細胞中へのトランスフエク
シヨンのためのリン酸カルシウム法を用いて、プ
ラスミドpTPA−IE−FK2K2Aをジヒドロ葉酸
還元酵素（dhfr）を欠くチヤイニーズハムスター
卵巣（CHO）細胞中にトランスフエクトする。
用いる細胞系は元来コロンビア大学のエル・チエ
イシン（L.Chasin）から入手可能な突然変異体
DXB−11であり、プロシーデイングズ・オブ・
ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA77：4216〜4220、
1980にすべて記載されている。前記トランスフエ
クシヨン法は、トランスフエクトされたプラスミ
ドを一体化する細胞はもはやdhfrを欠くものでは
なくてダルベツコウの修正イーグル培地＋プロリ
ン中で増殖するという事実に基づくものである。 pTPA−IE−FK2K2Aでトランスフエクトし
た細胞からクローンを単離するが、それは、単層
で２日間増殖させた場合、百万細胞当たり少くと
も10ngのTPAを合成する。pIETPA−IPA−
dhfrを有する細胞からクローンを単離するが、そ
れは、百万細胞当たり少くとも100ngのTPAを合
成する。TPA同族体の発現はラジオイムノアツ
セイ、またはウエスタンブロツト法によつて検知
できる。 リジケンおよびコレン（Rijken and Collen）、
ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Journal of Biological Chemistry）256：
7035〜7041（1979）の方法によりTPA同族体を精
製する。組換体TPA同族体を含有するCHO細胞
を血清の無い培地中で増殖させる。72時間後培地
を収穫し、1.0M NaClおよび0.01％ツイーン
（Tween）80を含有する0.02Mトリス−HClPH7.5
で平衡化した亜鉛−キレートアガロースカラムに
付す。カラムを同一の緩衝液で洗浄し、同一の緩
衝液中で０〜0.05Mイミダゾールの直線グラジエ
ントでTPA同族体を溶出する。TPA同族体を含
有する画分をプールし、1.0M NaClおよび0.01％
ツイーン（Tween）80を含有する0.01Mリン酸緩
衝液PH7.5で平衡化したコンカナバリンＡ−アガ
ロースカラムに付す。同一緩衝液でカラムを洗浄
した後、平衡化緩衝液〜0.01％ツイーン
（Tween）80、0.4MD−メチルマンノシドおよび
2Mチオシアン酸カリウムを含有する0.01Mリン
酸緩衝液PH7.5の直線グラジエントで溶出する。
TPA活性を有する画分をプールし、固体KSCN
を加えてKSCN濃度を1.6Mまで増加させる。画
分を約10倍の濃度とし、1.6M KSCNおよび0.01
％ツイーン（Tween）80を含有する0.01Mリン酸
緩衝液PH7.5で平衝化したセフアデツクスＧ−150
カラムに付す。TPA活性を有する画分をプール
し、0.15M NaClおよび0.01％ツイーン
（Tween）80に対して透析し、−80℃にて保存す
る。 Ｃ スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera
frugiperda）における発現 以下の実施例は昆虫細胞培養におけるTPAの
発現に関する。すべての手順はサマーズ・エム・
デイおよびスミス・ジイ・イー（Summers、M.
D.and Smith、G.E.）、テキサス州、カレツジ・
ステーシヨン（College Station）、テキサス・ア
グリカルチユラル・イクステンシヨン・サービス
（Texas Agricultural Extension Service）、テ
キサス・アグリカルチユラル・エクスペリメン
ト・ステーシヨン（Texas Agricultural
Experiment Station）、農業単科大学によつて発
行されたバクロウイルスベクター取扱法および昆
虫細胞培養手順に詳細に記載されている。出発プ
ラスミドpAc373（7.1kb）は、アウトグラフア・
カリホルニカ・ヌクレア・ポリヘドロシス・ウイ
ルス（Autographa californica nuclear
polyhedrosis virus）（AcNPV）についての多角
体プロモーターから直ぐ下流にユニークBamH
部位を有する一般的なバクロウイルス発現ベク
ターである。多角体蛋白質はウイルス感染および
in vitro複製には必須でないマトリツクス蛋白質
である。該プラスミドはテキサス77843、カレツ
ジ・ステーシヨン（College Station）、テキサス
Ａ＆Ｍ大学、昆虫学部門のマツクス・サマーズ
（Max Summers）教授より入手可能であり、モ
レキユラー・アンド・セリユラー・バイオロジー
（Molecular and Cell.Biology）、３(12)：2156〜
2165（1983）に詳細に記載されている。 (1) pAcTPAの組立て−チヤート24 ユニークBamH部位をやはりユニークであ
るBal部位を挿入することによつて、出発プラ
スミドpAc373を修飾してTPA同族体を受容する
ようにする。プラスミドpAc373をまずBamH
で切断し、次いでマング・ビーン（Mung bean）
ヌクレアーゼで処理して平滑末端を得る。次いで
Bglリンカーを該末端に結び、該末端を再び結
合してpAc373、Bglを得る。チヤート21から
のプラスミドpTPAcDNA、BamHをBamH
で十分に消化し、Bglで部分的に消化して無傷
TPAcDNAについてコード付けするフラグメン
ト51（1.95kb）を得る。フラグメント51をゲル単
離し、pAc373、BglのBgl部位に挿入してエ
ス・フルギペルダ（S.frugiperda）において天然
TPAを発現できるpAcTPAを得る。 (2) pAcFK2K2Aの組立て−チヤート25 この発現プラスミドについては、Bglを用い
てTPA同族体FK2K2AをpFK2K2A（チヤート
12）から切り出し、TPA同族体をコード付けす
るcDNAをフラグメント53（2.0kb）としてゲル単
離する。プラスミドpAcTPA（チヤート24）を
Bglで切断してフラグメント52（7.15kb）を得
る。フラグメント52および53を結んで
pAcFK2K2A（9.15kb）を得、これをエス・フル
ギペルダ（S.frugiperda）中にトランスフエクト
するまでイー・コリ（E.coli）中で維持する。 (3) エス・フルギペルダ（S.frugiperda）のトラ
ンスフエクシヨンおよび培養 エス・フルギペルダ（S.frugiperda）における
共トランスフエクシヨンによつてTPA同族体を
天然ACNPV DNAと再び組合せる。エス・フル
ギペルダ（S.frugiperda）（SF9；ATCC CRL
1711）はデイフコ（Difco）ラクトアルブミン加
水分解物および酵母分解物を補足したグレイス
（Grace）培地（ジブコ・ラブ（Gibco Lab.）、
リボニア（Livonia）、ミシガン州48150）、10％
胎児ウシ血清中で培養する。細胞を各々1μ／ml
および2μ／mlにてAcNPV DNAおよび
pAcTPAFK2K2Aで共トランスフエクトする。
得られたウイルス粒子は、培地を収集し、低速遠
心によつて細胞物質を除去することにより得られ
る。次いでウイルス含有培地を用いてエス・フル
ギペルダ（S.frugiperda）を感染する。天然ウイ
ルスDNAおよびFK2K2A TPA同族体について
コード付けするcDNAと再び組合せたDNAを共
に包含するこれらのウイルス粒子を用いるひき続
いてのエス・フルギペルダ（S.frugiperda）の感
染の結果、多角体蛋白質の代りにTPA同族体を
発現するいくらかの細胞が得られる。TPA同族
体を産生する感染細胞コロニーの検出は、系統的
に希釈した（10^-1〜10^-6）培地を含有するウイル
スであらかじめ１時間感染したエス・フルギ ペ
ルダ（S.frugiperda）の単層を重ねることによつ
て決定する。次いで、６mg／mlフイブリノーゲン
および0.5単位トロンビンを含有する0.7％低融点
アガールを有するグレース（Grace）培地を細胞
に重ねる。活性TPAを産生する細胞は感染の中
心付近に明瞭なプラークを形成する。 実施例 ５ 以下の同族体をCHO細胞から単離し、活性お
よび抗原性について評価した：FGK1K2A、
FK1K2AおよびFK2A。 第１表は２つの異なるin vitroテスト、活性お
よび抗体認識の結果を要約する。同族体
FGK1K2AおよびFK2Aは血小板からのプラスミ
ノーゲンアクチベーター抑制物質と共に複合体を
形成する（トロンビン誘導血小板放出体）。同族
体の分子量は各々約62000および40000ダルトンで
ある。酵素抑制物質複合体の分子量は各々約
110000および85000ダルトンである。 実施例６ TPA同族体の治療応用 TPAは血栓を溶解し、治療的に有用であるこ
とは公知である。ザ・ランセツト（The
Lancet）、1018〜20頁（1981年、11月７日）；サ
イエンス（Science）、220：1181（1983）；および
ニユー・イングランド・ジヤーナル・オブ・メデ
イシン（N.Eng.J.Med.）、310：609（1984）。冠血
栓を有する患者へのTPA同族体の投与は、前記
２つの文献に記載された一般法により、歯冠内も
しくは静脈内経路を介して行うことができる。

【表】 第４図 TPAドメイン ドメイン天然TPA フインガーセリン＃１→リジン＃49 （Finger）ヌクレオチド190→336 発育因子セリン＃50→スレオニン＃91 ヌクレオチド337→462 クリングル１システイン＃92→セリン＃174 （Kringle）ヌクレオチド463→711 クリングル２グルタミン酸＃175 →セリン＃262 （Kringle）ヌクレオチド712→975 活性部位スレオニン＃263 →プロリン＃527 ヌクレオチド976→1770 TPA同族体（チヤート11） フインガーセリン＃１→バリン＃49 （Finger）ヌクレオチド190→342 発育因子アラニン＃51→アラニン＃91 ヌクレオチド343→456 クリングル１スレオニン92 →システイン＃175 （Kringle）ヌクレオチド457→726 クリングル２グルタミン酸＃176 →アラニン＃266 （Kringle）ヌクレオチド727→999 活性部位システイン＃267 →プロリン＃530 ヌクレオチド1000→1782

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 ｜
BglII

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】