KR920007666B1

KR920007666B1 - 변형된 섬유소 용해제의 제조방법

Info

Publication number: KR920007666B1
Application number: KR1019860009732A
Authority: KR
Inventors: 카우드허리 바바토쉬; 메이하크 베른트; 하임 주타; 반 오스트럼 잔
Original assignee: 시바-가이기 코퍼레이션; 카알 에프. 죠르다
Priority date: 1985-11-18
Filing date: 1986-11-18
Publication date: 1992-09-14
Also published as: AU6520086A; ATE78514T1; NO175266B; EP0225286B1; ES2043607T3; FI91160C; NO175266C; FI864654A0; FI91160B; GR3006041T3; FI864654A; AU598490B2; ZA868689B; DE3686136T2; NZ218305A; EP0225286A3; DK174977B1; KR870005094A; JPS62272976A; IE863028L

Abstract

내용 없음.

Description

변형된 섬유소 용해제의 제조방법

제1도는 헬라 세포로부터의 t-PA DNA 및 상응하는 아미노산 서열이다. 글리코실화 부위는 밑줄을 그었다. 화살표는 t-PA의 1-체인 형태로부터 2-체인 형태를 생성시키는 Arg과 Ile사이의 예상 절단 부위를 가리킨다.

제2도는 본 발명에 따른 변이 t-PA 유전자의 DNA 서열 및 변이 t-PA의 상응하는 아미노산 서열이다.

제3도는 진짜 사람 흑색종 t-PA(직선 1) 및 효모 야생형 t-PA(직선 2)와 비교한 변이 t-PAs, 즉 [Asn¹¹⁹]-t-PA(직선 3), [Asn¹¹⁹,Ala¹⁸⁶]-t-PA(직선 4) 및 [Asn¹¹⁹,Ala¹⁸⁶,Asn⁴⁵⁰]-t-PA(직선 5)의 혈병 용해력을 나타낸 도표이다.

제4도는 웨스턴 블랏(Western blot)에 의한 변이 t-PAs의 면역측정을 나타내는 도식적 도표이다.

본 발명는 변형된 섬유소 용해제 및 그러한 섬유소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 탈글리코실화 또는 부분적으로 탈글리코실화된 조직 플라스미노겐 활성화제, 그런 조직 플라스미노겐 활성화제를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 하이브리드 벡터 및 상기 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 하이브리드 벡터, 상기 형질전환된 숙주 세포 및 상기 조직 플라스미노겐 활성화제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

혈병(血餠;blood clot)은 개발도상국에서 질병 및 사망의 주요 요인이다. 혈병은 효소 트롬빈의 작용에 의해 그의 가용성 전구물질 섬유소원으로부터 형성된 섬유소로 이루어진다. 효소 및 기타 물질의 포진은 그들이 혈액의 상실을 막을 필요가 있을 경우에만 그곳에 혈병이 정상적으로 형성되도록 한다.

포유류 혈장은 혈병에서 섬유소를 용해시킬 수 있는 효소 시스템을 함유한다. 섬유소 용해 시스템의 한 성분이 플라스미노겐 활성화제라 불리는 효소그룹으로 플라스미노겐[플라스민의 불활성 프로효소(proenzyme)형태]을 단백질 분해효소 플라스민으로 전환시킨다. 이어서 플라스민은 혈병의 섬유소망을 분해하여 가용성 산물을 형성시킨다. 체내의 혈전 용해력이 혈관내 트롬빈을 제거하기에 불충분한 경우, 예를 들면 혈전색전증 또는 외과 수술후의 환자에 있어서, 외래적으로 혈전 용해제의 투여가 불가피하다.

2가지 형태의 플라스미노겐 활성화제가 사람 체액 또는 세포로부터 분리될 수 있다 : 유로키나제, 예를 들면 사람 요(尿) 및 신장 세포에서 생성되는 세린 프로테아제, 및 내피 세포 및 다수의 내분비 조직에 존재하는 조직 플라스미노겐 활성화제(이후, ＂t-PA＂라 칭함). 조직 플라스미노겐 활성화제는 그의 화학적 및 면역학적 특성면에서 섬유소의 존재하에 그의 크게 증강된 섬유소 용해작용에서 뿐만 아니라, 섬유소에 대한 그의 높은 친화도에서 유로키나제와 다르다. t-PA는 2가지 분자 형태로 존재한다 : 활성 2-체인(chain) 형태 및 전구물질 1-체인 형태(보통 ＂pro t-PA＂로 표기). 1-체인 형태는 촉매량의 플라스민과 함께, 바람직하게는 섬유소의 존재하에 배양함으로써 2-체인 형태로 전환시킬 수 있다.

사람 t-PA를 암호화하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열은 결정된 바 있고 이로 부터 아미노산 서열이 추론되었다[참조 : D.Pennica et al., Nature 301, 214(1983)]. 4개의 잠재적 N-글리코실화 부위가 확인되었으며, 그중 하나는 분명히 탄수화물 부착용으로는 사용되지 않는다[참조 : G.Pohl et al., Biochemistry 23, 3701(1984)].

사람 t-PA 공급원으로는 예를 들면 다양한 양으로 t-PA를 방출시키는 것으로 나타난 사람 조직(상업적 이용이 불가능함) 및 여러 가지 사람 종양 세포의 추출물이다. 따라서, 유럽 특허원 제 41,766호에는 t-PA를 배양한 사람 흑색종(melanoma) 세포주로부터 단리하였음을 기술하고 있다. 재조합 DNA 기술은 또한 사람 t-PA의 생산시 사용될 수 있다. 사람 종양 세포로부터 유도한 2본쇄 t-PA cDNA를 클론하고 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포 및 이.콜라이(유럽 특허원 제 93,619호) 또는 효모(S. cerevisiae) 세포(유럽 특허원 제 123,544호 및 제 143,081호)에서 발현시킨 바 있다. 배양한 사람 흑색종 세포 또는 형질전환시킨 CHO 세포로부터 수득한 t-PA는 아마도 진짜 t-PA 당단백질에 사용한다. 형질전환시킨 효모 세포로부터 단리한 t-PA는 효모에 대해 특이적인 탄수화물 체인을 갖는 것 같다. 효모 및 고등 진핵생물의 탄수화물 체인 구조에서의 차이점은 잘 기록되어 있고, 만노스 잔기의 외부 체인 첨가 및 코어(core) 탄수화물의 변형과 관계가 있다.[참조 : R.and S.Kornfeld, Ann.Rev.Biochem.54, 631(1985) ; J.C.Byrd al., J.Biol. Chem.257, 14657(1982) ; R,B.Trimble et al.,J.Biol.Chem.258, 2562(1983)]. 이.콜라이에서 발현된 t-PA는 글리코실화되지 않았으나 비록 낮은 특이 활성을 갖는다해도 섬유소 용해적으로 활성이 있다. 대부분의 단백질은 불활성 형태로 세포질에 축적하는데, 아마도 분자의 부정확한 접힘에 의한 것 같다. 정확한 접힘은 t-PA 분자내 다수의 특이적인 이황화 결합의 형성에 따른 것으로 효소 활성에 대하여 필수적이다.

t-PA의 탄수화물 잔기는 과요오드산 나트륨과 같은 산화제에 의해 화학적으로 분해될 수 있음이 밝혀졌다. (PCT 특허원 제 84/1786호 및 제 84/1960호). 생성된 t-PA 유도체는 비처리 t-PA 보다는 느린 생리학적 제거 속도를 갖는 것으로 알려졌다. 탄수화물기의 화학적 분해정도, 변형된 t-PA의 특이 활성 및 t-PA 체인의 감수성 아미노산 기상에 미치는 산화제의 해로울 수 있는 화학적 효과[예를 들면 트립토판 잔기가 과요오드산염에 의해 공격받을 수 있다; 참조 : A.S.Inglis et al., FEBS Lett.104, 115(1979)]는 기술되어 있지 않다.

문헌[S.P.Little et al., Biochemistry 23, 6191(1984)]에는 t-PA 생성 흑색종 세포에 대한 글리코실화 억제제 터니카마이신(tunicamycin)의 작용이 기술되어 있다. 그들은 글리코실화를 90%까지 억제하는 것으로 밝혀졌다. 동시에 단백질 합성도 30%까지 억제됨은 터니카마이신이 세포에서의 중대한 공정을 직접 또는 간접으로 간섭하고 있음을 나타낸다. 생성된 t-PA 단백질은 섬유소 용해 활성을 보유한다. 그러나 미량의 해로운 글리코실화 및 단백질 합성 억제제 터니카마이신의 잠재적 존재는 이 t-PA의 치료제로서의 용도를 필연적으로 제한하고 있다. 동일 문헌에 엔도-β-N-아세틸글루코사미니데이스 H(endo-β-N-acetylglucosaminidase H ; Endo H)에 의한 t-PA의 효소적 탈글리코실화가 기술되어 있다. 엔도-H처리는 t-PA 종류 혼합물로부터 탄수화물 잔기가 85 내지 90%까지 제거되도록 한다. 그러나 t-PA의 약 50%는 엔도 H처리에 의해 거의 내성적이다. 그 생성물은 진짜 t-PA의 섬유소-조절 특성을 유지한다.

탄수화물 잔기의 일부 또는 전부가 결실되는 t-PA 분자의 예상되는 장점의 관점에서 그런 혼합물 및 이들 단백질의 용이한 합성을 가능케하는 방법에 대한 필요성이 있다. 형질전환된 이.콜라이 세포로부터 단리한 생성물을 제외하고는 (그러나 치료 목적으로 큰 가치가 있을 것 같지 않음, 상기 언급), 문헌에 기술된 탈글리코실화된 t-PA 종류가 화학적으로 정의되지 않은 분자이고, 더구나 부정확한 수의 각 종류를 함유하는 복합체 혼합물로 존재한다. N-연결된 탄수화물 체인의 하나 또는 모두가 완전히 제거된 t-PA 종류는 아직 알려져 있지 않다.

모든 진핵생물은 유전 정보의 발현을 위한 공통기작을 공유하기 때문에, 진핵 유전자 발현이 이.콜라이보다는 진핵 숙주에서 더욱 효율적으로 진행될 수 있다. 이용하기에 적합한 진핵 유기체중에서 효모가 조작하기 쉽다. 효모는 미생물이기 때문에 효모 세포는 용이하게 배양된다. 배양액의 용적당 수득 가능한 세포량은 이.콜라이보다 효모가 상당히 높으며 엔도톡신도 없다. 더구나 효모의 발효 습성이 잘 이해되어 있고, 대형 발효 조건도 이미 확립되어 있다. 효모의 분비 회로는 사람 세포를 위시한 고등 세포와 비슷하다. 효모 세포는 그들 자신의 단백질 뿐만 아니라 상응하는 신호 서열을 절단함으로써 외래 단백질을 생산할 수 있음이 공지되어 있다. 더불어 진핵 숙주의 분비 회로를 통해 들어가고 통과하는 단백질이 세포질에서 합성되는 단백질과 비교해서 고도의 3차 구조를 형성하는 것처럼 보인다. 이.콜라이와 같은 원핵생물은 고차 구조의 대형 단백질을 갖지 않음을 주지해야 한다.

고등 유기체의 분비 회로와 관련이 있는 것이 글리코실화 시스템이다. 글리코실화에서의 차이점이 단백질의 분류에 영향을 주는 것이 예상된다. 따라서 단순히 13 만노스 잔기에 의해 코어-글리코실화된 효모 카복시펩티데이스 Y는 액포로 전이되는 반면, 약 100 내지 150만노스 잔기로 이루어진 외부 탄수화물 체인을 함유하는 효모 인버테이스는 분비 매개체를 통해 외질 공간으로 들어간다[L.Lehle et al., J.Bilo.Chem.254, 12209(1979) ; C.Hashimoto et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78, 2244(1981)]. 따라서 탄수화물 체인의 변화가 t-PA의 분비 습성에 영향을 줄 수 있음은 자명하다.

본 발명의 목적은 N-연결된 탄수화물 체인의 하나 또는 그 이상이 결실되나, 섬유소 용해 활성과 같이 값진 생물학적 특성, 느린 생리학적 제거 속도 및 천연 t-PA 보다 연장된 생체내 안정성을 유지하는 신규 한 사람 t-PA 단백질을 제공하기 위한 것이다. 또한 본 발명의 목적은 그런 t-PAs를 암호화하는 DNA 서열 및 상기 DNA 서열의 발현을 효과적으로 제어하는 강력한 프로모터 시스템을 함유하는 하이브리드 벡터이다.

본 발명은 천연의 N-글리코실화 부위의 하나 또는 그 이상을 글리코실화가 이 위치에서 일어날 수 없도록 하는 방법으로 변환시켜 신규한 사람 돌연변이 t-PA 단백질을 제공한다. 이 목적은 그런 t-PA 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 그런 DNA 서열을 함유하는 하이브리드 벡터 및 그런 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포를 제공하고 그런 t-PA 단백질을 발현시킴으로써 달성한다.

1. 카보하이드레이트 체인의 하나 또는 그 이상이 결실된 완전 t-PA의 제조

포유류에서 N-연결된 글리코실화를 위한 선행조건이, Asn이 수용체이고 L이 글리코실화를 막는 프롤린 또는 아스파르트산을 제외한 아미노산을 유전적으로 암호화된 20개의 아미노산중 어느 것일 수 있는 트리펩타이드 서열-Asn-L-Ser(또는 Thr)-의 존재임은 이미 밝혀졌다[참조 : D.K.Struck and W.J.Lennarz, in The Biochemistry Glycoproteins and Proteoglycans, ed.W.J.Lennarz, Plenum Press 1980,p.35 ; R.D.Marshall, Biochem.Soc.Symp.40, 17(1974)]. t-PA 분자에는 N-글라이코사이드 결합을 위한 4개의 잠재적 부위가 있다(숫자는 t-PA의 아미노산 서열에서 Asn의 위치에 해당한다. 참조 : 첨부한 도면의 제1도) : -Asn¹¹⁷-Ser-Ser-, -Asn¹⁸⁴-Gly-Ser-, -Asn²⁸⁴-Pro-Ser- 및 -Asn⁴⁴⁸-Arg-Thr-. 서열 Asn²¹⁸-Pro-Ser의 존재 때문에, Asn²¹⁸이 포유류 세포에서 탄수화물 부착을 위해 이용되지 않는다(참조 : G.Pohl et al., 상기 인용).

글리코실화를 막기 위해 N-글리코실화에 대한 신호로서 인식되는 트리펩타이드 서열을 변환시켜야 한다. 상기 트리펩타이드 서열에서 Asn 및/또는 Ser(또는 Thr)잔기의 다른 아미노산으로의 대체는 이 부위에서 글라이코사이드 결합의 형성을 붕괴시킨다. 편의상 t-PA 분자의 변형, 즉 N-글리코실화 부위의 변화는 단백질 수준에서 수행하지 않는다. 대신에 숙주에 의한 상기 변형된 유전자의 발현에 따라, 천연의 N-글리코실화 부위의 하나 또는 그 이상에 이 부위에서 글리코실화가 일어날 수 없도록 변환시킨 돌연변이 t-PA를 생산하는 방식으로 t-PA를 암호화하는 유전자를 변형시키는 것이 유리하다.

특히 본 발명은 하기 일반식을 갖는 사람 돌연변이 t-PA 단백질에 관한 것이다 :

상기 식에서, A_1-116은 완전 t-PA의 아미노산 1 내지 116으로 이루어진 N-종결 아미노산 서열을 나타내고, A_120-183은 완전 t-PA의 아미노산 120 내지 183으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내고, A_187-217은 완전 t-PA의 아미노산 187 내지 217으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내고, A_221-447은 완전 t-PA의 아미노산 221 내지 447로 이루어진 아미노산 서열을 나타내고, A_451-527은 t-PA의 아미노산 451 내지 527로 이루어진 C-종결 아미노산 서열을 나타내고, X₁,X₂,X₃및 X₄각각은 Asn 또는 유전적으로 암호화된 다른 아미노산을 나타내고, Y₁,Y₂및 Y₃각각은 Ser을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Thr이외의 아미노산을 나타내며, Y₄는 Thr을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Ser이외의 아미노산을 나타내며, 이들 모두는 1-체인 또는 2-체인 형태이나, 단, 기 X₁,X₂,X₃및 X₄중 하나 이상은 Asn이 아니고/아니거나 기 Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄중 하나 이상은 Ser 및 Thr이 아니다.

더욱 특히 본 발명은 하기 일반식의 사람 t-PA 단백질에 관한 것이다.

상기 식에서, A_1-116은 완전 t-PA의 아미노산 1 내지 116으로 이루어진 N-종결 아미노산 서열을 나타내고, A_120-183은 완전 t-PA의 아미노산 120 내지 183으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내고, A_187-217은 완전 t-PA의 아미노산 187 내지 217로 이루어진 아미노산 서열을 나타내고, A_221-447은 완전 t-PA의 아미노산 221 내지 447으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내고, A_451-527은 완전 t-PA의 아미노산 451 내지 527로 이루어진 C-종결 아미노산 서열을 나타내고, Y₁,Y₂및 Y₃각각은 Ser을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Thr이외의 아미노산을 나타내며, Y₄는 Thr을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Ser이외의 아미노산을 나타내나, 단, 기 Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄중 하나 이상은 Asn 및 Thr이 아니다.

용어＂완전 t-PA＂는 위치 1의 Ser에서 시작하는 특정 pre- 또는 pro- 서열을 제외한 t-PA에 해당한다. 완전 t-PA의 아미노산 서열을 나타내는 첨부 도면중 제1도를 참조하라.

유전적으로 암호화된 아미노산은 하기 L-아미노산이다 : Ala, Ser, Thr, Val, Len, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp 및 Pro, 또한 아미노산 Gly.

대체시 대체할 아미노산과 유사한 크기 및 극성을 갖는 아미노산이 바람직하다. Asn, Thr 및/또는 Ser잔기의 가능한 치환체 수는 주어진 뉴클레오타이드 서열 및 가능한 코돈에 의해 한정된다(참조; 상기 단락). 따라서 위치 X₁,X₂,X₃및/또는 X₄에서 Asn의 대체시에는 아미노산 Thr 및 Ser이 바람직하다. Y₁,Y₂및/또는 Y₃의 Ser 대체시 및 Y₄의 Thr 대체시는 아미노산 Ala 및 Asn이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 한 태양에서는 기 X₁및 Y₁중 단 하나 및/또는 X₂및 Y₂중 단 하나 및/또는 X₄및 Y₄중 단 하나를 다른 아미노산으로 대체한다.

특히 바람직한 태양에서는 기 Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄의 Ser 또는 Thr중 단지 하나 또는 그 이상을 다른 아미노산으로 대체한다.

특히 본 발명은 A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상술한 바와같고, 기 X₁,X₂,X₃및 X₄중 1개, 2개 또는 3개가 Asn을 나타내며, 다른 것(들)은 Thr 및 Ser중에서 선택한 아미노산 잔기를 나타내고, Y₁,Y₂및 Y₃각각은 Ser을 나타내며, Y₄는 Thr을 나타내거나, 또는 X₁,X₂,X₃및 X₄각각이 Asn을 나타내는 경우, 기 Y₁,Y₂및 Y₃중 하나 또는 둘이 Ser을 나타내고, 다른 것(들)은 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택하며, Y₄가 Thr을 나타내거나, 또는 X₁,X₂,X₃및 X₄각각이 Asn을 나타내는 경우, Y₁,Y₂및 Y₃각각은 Ser을 나타내고, Y₄가 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 일반식(I)의 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 특히 A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같고, X₁,X₂,X₃및 X₄각각이 Asn을 나타내며, 기 Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄중 적어도 하나가 Ala 또는 Asn이고, 다른 것(들)은 Ser(Y₁,Y₂및 Y₃) 또는 Thr(Y₄)인 일반식(I)의 화합물에 관한 것이다.

본래의 t-PA N-글리코실화 부위중 적어도 하나가 유지된, 예를 들면 트리펩타이드 잔기-X₁-Ser-Y₁이 Asn-Ser-Ser을 나타내고/내거나, -X₂-Gly-Y₂가 Asn-Gly-Ser을 나타내고/내거나, -X₄-Arg-Y₄가 Asn-Arg-Thr을 나타내는 일반식(I)의 화합물을 N-글리코실화한다. 본래의 t-PA글리코실화 부위중 한군데도 유지되지 않은 일반식(I)의 화합물은 특정 N-연결된 글리코실화를 피한다.

본 발명에 따른 t-PA 변이체의 1-체인 형태는 상술한 일반식(I)에 상응한다. 2-체인 형태는 Arg²⁷⁵Ile²⁷⁶펜타이드 결합의 절단에 의해 생성된다(참조 : 제1도). 두 체인은 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 본 발명에 사용되는 것은 달리 정의하지 않는 한, 용어＂t-PA＂가 본 발명에 따른 t-PAs의 바람직한 형태인 1-체인 형태에 해당한다.

일반식(I)의 화합물은 바람직하게는 생물공학적 방법에 의해 제조한다.

본 발명에 따른 변이 t-PA 단백질의 제조방법은 천연 N-글리코실화 부위의 하나 또는 그 이상을 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 변화시킨, 변이 t-PA 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 형질전환된 진핵 숙주 유기체 또는 상기 숙주 균주의 변이체를 적당한 영양 조건하에서 배양하고 상기 변이 t-PA 단백질을 단리하며, 경우에 따라, 수득한 변이 t-PA의 1-체인 및 2-체인 형태 혼합물을 각 성분으로 분리하고, 1-체인 형태가 없는 2-체인 형태의 제조시, 수득한 t-PA 변이체의 1-체인 형태를 2-체인 형태로 전환시킴을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 t-PA 유전자 발현의 1차 생성물은 t-PA의 1-체인 형태이다. 그러나 프로테이스가 숙주 세포 또는 배양액에 존재할 경우, 1차적으로 발현된 1-체인 t-PA는 적어도 부분적으로 2-체인 t-PA로 전환된다. 실제로 단리한 생성물은 변이 1-체인 t-PA, 변이 2-체인 t-PA 또는 그의 혼합물로 구성되어 있다.

적당한 진핵 세포 유기체는 고등 유기체, 특히 포유류의 세포, 특히 사람 바우어스(Bowes) 세포주 또는 헬라 세포와 같은 사람 또는 동물 세포, 또는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포주, 및 사카로마이세스 세리비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모이다. 본 발명에 따른 바람직한 숙주 유기체는 사카로마이세스 세리비지에이다.

상기 DNA 서열을 함유하는 진핵 숙주 미생물, 특히 효모를 당분야 공지의 방법으로 배양한다. 따라서 본 발명에 따른 형질전환 효모 균주를 탄소, 질소 및 무기염의 동화원을 함유하는 액체 배지에 배양한다.

여러 가지 탄소원을 사용할 수 있다. 바람직한 탄소원의 실례는 글루코스, 말토스, 만니톨 또는 락토스 또는 나트륨 아세테이트와 같은 아세테이트 등의 동화성 탄수화물이며 단독 또는 적당한 혼합물로 사용할 수 있다. 적당한 질소원은 카사미노산과 같은 아미노산, 펩타이드 및 단백질과 그들의 분해산물, 예를 들면 트립톤, 펜톤 또는 고기 추출물, 또한 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(steep liquor), 뿐만 아니라 암모늄염, 예를 들면 암모늄 클로라이드, 설페이트 또는 나이트라이트 등이며, 단독 또는 적당한 혼합물로 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 무기염은 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 황산염, 염산염, 인산염, 및 탄산염이다. 그밖에 영양배지는 또한 성장 촉진물질을 함유한다. 성장 촉진 물질은 철, 아연, 망간 등의 미량 원소 또는 각각의 아미노산이다.

자율 복제성 플라스미드, 예를 들면 효모 2μ 플라스미드 DNA(하기 언급)을 함유하는 플라스미드로 형질전환된 효모 세포는 유도된 하이브리드 플라스미드를 여러 가지 정도로 상실한다. 이런 이유로 효모 세포는 선택적 조건, 즉 성장을 위한 유전자를 암호화한 플라스미드의 발현을 필요로 하는 조건하에 생육해야 한다.

최근 사용하고 있고 또 본 발명에 따른 하이브리드 벡터에 존재하는 대부분의 선택성 마커는 아미노산 또는 퓨린(purine)생합성의 효소를 암호화하는 유전자이다.

이것은 상응하는 아미노산 또는 퓨린 염기가 결핍된 합성 최소 배지를 사용할 필요가 있다. 그러나 적당한 살균제에 대한 내성을 부여하는 몇몇 유전자를 사용할 수도 있다[예 : 사이클로헥시미드, 아미노-글라이코사이드 G418, 중금속 등에 내성을 부여하는 유전자]. 항생물질 내성 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환시킨 효모 세포는 상응하는 항생물질을 함유하는 복합 배지에서 생육하여 신속한 성장속도 및 고도의 세포밀도에 달하도록 한다.

DNA가 염색체로 삽입된 형질전환 숙주 세포는 선택적 생육조건이 필요하지 않다. 이들 형질전환된 세포는 선택적 기호없이 생육할 정도로 충분히 안정하다. 상기 이유로 하여 이들 세포는 복합 배지에 생육하는 것이 유리하다.

구성분인 프로모터(예 : ADHI,GAPDH)가 있는 하이브리드 플라스미드를 함유하는 세포는 유도없이 상기 프로모터에 부착된 t-PA유전자를 발현시킨다. 그러나 t-PA유전자가 조절된 프로모터(예 : PGK 또는 PHO5)의 통제하에 있는 경우, 성장 배지의 조성은 mRNA전사물이 최대로 수득되도록, 즉 PHO5 프로모터를 사용할 경우 성장 배지는 이 프로모터의 탈억제를 위해 낮은 농도의 무기 인산염을 함유해야 한다.

배양은 종래 기술을 사용하여 수행한다. 온도, 배지의 pH 및 발효 시간과 같은 배양 조건은 t-PA가 최대로 생산되도록 선택한다. 선정 효모 균주를 바람직하게는 수중 배양중에서 약 25℃내지 35℃, 바람직하게는 약 30℃의 온도로, pH 4 내지 8, 예를 들면 약 pH 7에서, 진탕 또는 교반하면서 호기성 조건하에 약 4 내지 20시간 동안, 바람직하게는 단백질이 최대 수율에 달할때까지 생육한다.

생성된 t-PA단백질은 효모 세포내에 축적 또는 외질 공간으로 또는 배양 배지로 분비된다. t-PA단백질이 세포내에 축적된 경우, t-PA단백질 회수의 첫단계는 세포 내부로부터 단백질의 방출이다. 대부분의 방법에서 세포벽은 글루코시데이스로의 효소적 분해로 제거한다(참조 : 단락 4). 후속적으로, 생성된 스피로플래스트(spheroplast)를 Triton

X-100과 같은 세척제로 처리한다. 또한 전단 응력(예 : X-press, French-press) 또는 유리 비드와의 진탕과 같은 기계적 힘도 세포를 파괴하는데 적합하다. 생성된 혼합물은 폴리에틸렌이민 처리로 대부분의 비단백질성 물질 제거, 황산 암모늄 또는 트리클로로아세트산 사용으로 단백질의 침전, 겔전기영동, 투석, 크로마토그래피, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피, 크기별 제거(size-exclusion) 크로마토그래피, HPLC 또는 역상 HPLC, 적당한 Sephadex

컬럼상의 분자 크기 구별등 종래의 방법에 의해 변이 t-PA를 증강시킨다. 정제 이전 생성물의 최종 정제는 친화성 크로마토그래피, 예를 들면 항체 친화성 크로마토그래피, 특히 당 분야 공지방법으로 불용성 매트릭스상에 고정한 모노클로날 항-t-PA항체를 사용한 친화성 크로마토그래피 등으로 수행한다.

또한 배양액으로부터 변이 t-PA를 단리하는 바람직한 방법은 불용성 매트릭스, 예를 들면 덱스트란 또는 특히 DE-3 Sepharose

상에 공유적으로 고정된 가용성 섬유소 단편의 특이 친화성 지지체상에 그것을 흡착시키는 것이다. DE-3는 콩과식물 에리트리나 라티시마(Erythrina latissima)의 종자에 함유된 트립된 액제물이다(유럽특허원 제112,122호). ED-3는 또한 t-PA활성을 억제할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 정제된 DE-3억제제는 불용성 매트릭스, 예를 들면 BrCN활성화된 세파로스에 표준방법을 사용해서 연결시킬 수 있다. t-PA단백질은 억제제 매트릭스에 흡착되고 혼돈제 함유 완충액에 의해 용출된다.

본 발명의 바람직한 태양에서, 임의로 상술한 정제단계 하나 이상을 통해 통과한 배양 배지를 실온에서 컬럼을 통해 통과시키거나, 회분 공정(batch procedure)에서 DE-3억제제가 결합된 BrCN활성화된 세파로스

로 처리한다. 세파로스

지지체를 세척한 후, 흡착된 조직 플라스미노겐 활성화제를 완충액, 예를 들면 pH 약 5.5 내지 6.0의 NH₄SCN과 같은 혼돈제를 함유하는 인산염 완충 염수 약 1.0 내지 약 2.0몰, 바람직하게는 1.2몰로 처리하여 용출시킨다. 달리 벤즈아미딘 또는 아르기닌을 방출제로서 선택할 수 있다. 유리하게는 세척제, 특히 X-100

또는 트윈 80

과 같은 비이온성 세척제를 정제단계에서 사용할 모든 완충액에 가하여 조직 플라스미노겐 활성화제가 용기 표면에 흡착되는 것을 방지하고 안정성을 증진시킨다. 세척제는 최종 농도 0.01 내지 0.1%로 가한다.

조직 플라스미노겐 활성화제가 효모 세포에 의해 외질 공간으로 분비되는 경우, 단순화된 원인을 사용할 수 있다 : 단백질을 세포벽의 효소적 제거 또는 세포벽에 손상을 주어 생성된 변이 t-PA가 방출되는 티올시약 또는 EDTA와 같은 화학적 제제로의 처리에 의해 세포를 용해하지 않고 수거한다. 변이 t-PA가 배양 브로쓰(broth)에 분비되는 경우, 그로부터 직접 수거할 수 있다.

염색체상에 결합된 t-PA유전자를 함유하는 효모 세포의 배양 및 발현된 t-PA의 단리 및 정제는 하기에 설명하는 바와 같이 수행한다.

본 발명에 따른 바람직한 효모 숙주, 즉 단백질 분해효소-결핍 효모 균주를 사용할 경우, 분리한 변이 t-PA는 거의 1-체인 형태이다. 단백질 분해력을 보이는 효모 균주를 사용할 경우, 1-체인 및 2-체인 형태의 t-PA변이체를 함유하는 생성 혼합물이 다양한 비율로 수득된다.

1-체인 형태가 거의 없는 2-체인 형태의 t-PA변이체를 제조하기 위해서는 1-체인 형태를 Arg²⁷⁵-Ile²⁷⁶펩타이드 결합 절단에 의해, 예를 들면 플라스민 또는 1-체인 형태의 t-PA에 동일한 효과를 나타내는 효소의 작용에 의해 2-체인 형태로 효소적 전환시킨다.

2-체인 형태가 거의 없는 1-체인 형태의 변이 t-PA를 용이하게 제조하기 위해서는, 아프로티닌(Trasylol

) 또는 염기성 췌장 트립신 억제제와 같은 단백질 분해 억제제를 정제과정에서 사용하여 상존할 수 있어 1-체인 형태가 2-체인 형태로(부분적) 전환되도록 할 수 있는 미량의 단백질 분해효소를 억제시킨다. 이어서 회종 정제는 DE-3와 같은 선택적 친화성 시약을 함유하는 컬럼상에 크로마토그래피하여 수행한다.

본 발명에 따른 형질전환 숙주 유기체는 하기 단계들을 포함하는 재조합 DNA기술에 의해 제조할 수 있다.

-본 발명에 따른 변이 t-PA단백질을 암호화하는 구조 유전자를 제조하고,

-수득한 구조 유전자를 적절한 벡터에 도입하며,

-적합한 숙주 유기체를 제조한 하이브리드 벡터로 형질전환하고,

-비형질전환 숙주로부터 형질전환 숙주를 선별한다.

2. N-연결된 탄수화물 체인 적어도 하나가 결실된 변이 t-PA단백질을 암호화하는 DNA서열

본 발명은 또한 천연 N-글리코실화 부위중 하나 또는 그 이상이 글리코실화가 이 부위에 일어날 수 없도록 하는 방법으로 변화시킨 사람 변이 t-PA단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 DNA에 관한 것이다.

특히 본 발명은 t-PA단백질의 n-글리코실화에 필수적인 아미노산을 암호화하는 코돈 적어도 하나를, N-글리코실화의 인식 부위를 파괴하는 다른 아미노산을 암호화하는 다른 코돈으로 대체시킴을 특징으로 하여, 변이 t-PA를 암호화하는 서열을 함유하는 DNA에 관한 것이다.

특히 본 발명은 하기 일반식(II)의 서열을 갖는 DNA에 관한 것이다.

상기식에서, N_1-348은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 1 내지 348로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내고, N_358-549은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 358 내지 549로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내며, N_559-651은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 559 내지 651로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내고, N_661-1341은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 661 내지 1341로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내며, N_1351-1581은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 1351 내지 1581로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내고, Z₁,Z₂,Z₃및 Z₄각각은 Asn 또는 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 나타내며, W₁, W₂및 W₃각각은 Ser을 암호화하거나 Thr이 아닌 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 나타내며, W₁, W₂, 및 W₃각각은 Ser을 암호화하거나 Thr이 아닌 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 나타내고, W₄는 Thr을 암호화하거나 Ser이 아닌 다른 아미노산을 암호화하는 코돈이나, 단, 코돈 Z₁, Z₂, Z₃및 Z₄중 적어도 하나는 Asn이 아닌 다른 아미노산을 암호화하고/하거나, W₁,W₂,W₃및 W₄중 적어도 하나가 Ser 및 Thr이 아닌 다른 아미노산을 암호화한다.

더욱 특히 본 발명은 일반식(II')의 서열을 갖는 DNA에 관한 것이다.

상기 식에서, N_1-348은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 1 내지 348로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내고, N_358-549은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 358 내지 549로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내며, N_559-651은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 559 내지 651로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내고, N_661-1341은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 661 내지 1341로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내며, N_1351-1581은 완전 t-PA유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 1351 내지 1581로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내고, W₁,W₂및 W₃각각은 Ser을 암호화하거나 Thr이 아닌 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 나타내며, W₄는 Thr을 암호화하거나 Ser이 아닌 다른 아미노산을 암호화하는 코돈이나, 단, 코돈 W₁,W₂,W₃및 W₄중 적어도 하나는 Ser 및 Thr이 아닌 다른 아미노산을 암호화한다.

사람 완전 t-PA를 암호화하는 유전자는 공지되어 있으며, t-PA를 생성할 수 있는 사람 세포로부터 유도한다. 그런 세포는 암 또는 암이 아닌 기원을 갖고 있으며, 바람직하게는 확립된 세포주로부터 유도한다. 본 발명의 바람직한 태양에서는 t-PA의 유전자를 헬라세포로부터 유도하였다. Ser을 첫 번째 아미노산으로 암호화하는 TCT로 출발하여 데옥시리보뉴클레오타이드에 번호를 먹인, 헬라 세포에서 발생한 완전 t-PA의 DNA서열이 나와 있는 첨부 도면의 제1도를 참조하라.

야생형 완전 t-PA에서, Z₁은 AAC, Z₂는 AAT, Z₃는 AAC, Z₄는 AAC, W₁은 AAC, W₂는 TCA, W₃는 AGT이고 W₄는 ACA이다. 일반식(II)의 화합물에서 이들 본래의 코돈 중 적어도 하나가 생성된 코돈이 N-글리코실화의 인식 부위를 파괴하는 아미노산을 암호화 하도록 하는 방법으로 변화시킨다. 코돈 Z₁,Z₂,Z₃,Z₄,W₁,W₂,W₃및/또는 W₄는 넌센스(nonsense)코돈이 아닌 다른 코돈에 의해 대체될 수 있다. 상기에 자세히 설명한 바람직한 아미노산을 암호화하고 하나 또는 대부분의 경우 2개의 데옥시리보뉴클레오타이드가 본래의 코돈과 다른 변화 코돈이 바람직하다.

일반식(II)의 화합물에서, 코돈 Z₁,Z₂,Z₃,Z₄,W₁,W₂,W₃및/또는 W₄는 하기와 같이 바람직하게 변형된다 :

AAC(Asn을 암호화하는 Z₁,Z₃및 Z₄)는 ATC(Ile암호화), ACC(Thr) 또는 AGC(Ser)로 변경시키고, AAT(Z₂,Asn암호화)는 ATT(Ile), ACT(Thr) 또는 AGT(Ser)로 변경하며, AGC(W₁,Ser암호화)는 ATC(Ile) 또는 AAC(Asn)으로 변경하고, TCA(W₂,Ser암호화)는 GCA(Ala) 또는 TTA(Leu)로 변경하며, AGT(W₃,Ser암호화)는 AAT(Asn) 또는 ATT(Ile)으로 변경하고, ACA(W₄,Thr암호화)는 ATA(Ile), GCA(Ala), AAC 또는 AAT(둘다 Asn)으로 변경시킨다.

본 발명의 바람직한 태양에서는 코돈 Z₁및 W₁중 단지 하나 및/또는 코돈 Z₂및 W₂중 단지 하나 및/또는 코돈 Z₃및 W₃중 단지 하나 및/또는 코돈 Z₄및 W₄중 단지 하나를 다른 코돈으로 대체한다.

또 다른 바람직한 태양에서는 W₁및/또는 코돈 W₂및/또는 코돈 W₃및/또는 코돈 W₄를 다른 코돈으로 대체한다.

일반식(II)의 DNA서열을 특히 바람직한 것으로 하기에 기술하는 변이 t-PA단백질을 암호화하는 것들이 바람직하다.

일반식(II)의 서열을 갖는 DNAs는 당 분야 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 이들 DNA의 제조방법은 화학적으로 DNA를 합성하고, 목적하지 않는 아미노산 잔기의 코돈을 함유하는 DNA부분을 어버이 완전t-PA로부터 절제하며, 그것을 상기 코돈이 목적 단백질 잔기를 암호화하는 데옥시리보뉴클레오타이드로 치환된 DNA절편으로 대체하거나, 또는 부위-유도된 돌연변이(site-directed mutagenesis)방법에 의해 데옥시리보뉴클레오타이드 치환을 수행하는 것을 포함한다.

DNA의 화학적 합성은 당 분야에 공지되어 있으며, 종래의 기술을 사용한다. 적합한 기술이 문헌[S.A.Narang, Tetrahedron 39, 3(1983)]에 수록되어 있다.

특히 유럽 특허원 제146,785호에 기술된 방법을 사용할 수 있으며 여기에 참고문헌으로 인용된다.

완전 t-PA DNA부분의 절제는 제한효소를 사용하여 수행한다. 이 방법의 선행조건은 변경할 코돈 근처에 적당한 제한 부위가 있어야 한다는 것이다. 원치않는 아미노산의 코돈을 함유하는 소형 제한 단편을 엔도뉴클리에이스 절단에 의해 제거한다. 상응하는 2본쇄 DNA서열을, 예를 들면 화학적 합성에 의해 목적 아미노산을 암호화하는 삼중자(triplet)를 사용하여 제조한다. DNA단편을 잔여 대형 단편에 적합한 배향으로 연결시켜 변이 t-PA를 암호화하는 2본쇄 DNA서열을 산출한다. 용이함 및 T-PA유전자를 용이하게 조작하기 위해서 후자는 클로닝 벡터에 절편을 삽입 및 클로닝할 수 있는 적당한 링커를 갖는 보다 큰 DNA 절편에 함유된다.

본 발명의 바람직한 태양에서 일반식(II)의 DNA서열을 갖는 DNA의 제조는 부위-유도된 돌연변이에 의해 수행한다. 이 방법은 클론된 DNA영역내에 특정 부위를 변경시킬 수 있는 시험관내 돌연변이 법이다[참조 : M.J.Zoller and M.Smith, Methods Enzymol.100, 468(1983); D.Botstein and D.Shortle, Science 229, 1193(1985)].

야생형 t-PA유전자를 변이시키는 방법은 1본쇄 야생형 t-PA유전자 또는 야생형 t-PA유전자를 함유하는 1본쇄 DNA를, 돌연변이를 유도하는 잘못 짝지음(들)을 제외하고는, 돌연변이시킬 t-PA 유전자에 상보적인 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 프라이머(primer)와 하이브리드화 시킴을 특징으로 한다. 하이브리드된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 상보적인 DNA본쇄 합성을 개시하게 하고, 생성된(부분적) 2본쇄 DNA를 수용체 미생물 균주에 형질전환시키며, 미생물 균주를 배양하고, 변형된 t-PA유전자의 DNA를 함유하는 형질전환체를 선별한다.

야생형 t-PA유전자는 바람직하게는 플라스미드, 예를 들면 유럽 특허원 제143,081호에 기술된 플라스미드에 함유된다. 돌연변이를 위해 t-PA유전자를 플라스미드로부터, 예를 들면 t-PA유전자 및 임의로 거기에 연결된 다른 작용부, 예를 들면 프라이머, 신호 펩타이드 DNA등을 함유하는 2본쇄 DNA에 점성 말단을 생성하는 제한효소 분해에 의해 분리하고, 페이지(phage) M 13의 유도체, 예를 들면 M 13mp 8 또는 M 13 mp9과 같은 1본쇄 DNA페이지의 복제형(RF)인 적당한 제한단편에 연결한다. 캄피턴트한(competent)미생물, 예를 들면 이.콜라이 균주의 Ca-처리한 세포를 하이브리드 페이지 벡터로 형질감염시키고, 삽입된 t-PA유전자를 함유하는 1본쇄 페이지 DNA를 배양 세포의 상등액으로부터 단리한다. 이 주형에 잘못 짝지워진(돌연변이) 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 프라이머를 하이브리드화 한다.

문헌에 기술된 몇몇 방법은 결찰에 이어 원형주형을 따라 돌연변이 프라이머의 효소적 연장에 의존하여 새로 합성된 본쇄 중에 변이를 갖는 공유적으로 밀봉된 2본쇄 원형 분자를 생성한다. 이 방법의 통상 낮은 효율로 인하여 2차 프라이머를 사용하는 변형된 방법이 개발되었다[문헌 : K.Norris et al., Nucl.Acids Res.11, 5103(1983)]. M 13페이지 벡터의 경우 융통성 있는 M13 서열화 프라이머를 사용한다.

따라서, 인산화 돌연변이 프라이머 및 M 13서열화 프라이머를 동시에 원형 1본쇄 t-PA 주형 DNA에 어닐(anneal)시킨다. 어닐링은 55℃에서 5분, 실온에서 5분 동안 신속히 수행한다. 유리하게는 프라이머-주형 몰비가 약 20 : 1이다. 두 프라이머의 연장은 이.콜라이 DNA폴리머레이스(클레나우 단편)로 수행한다. 서열화 프라이머로부터 새로 합성된 DNA 본쇄는 돌연변이 프라이머의 5'인산화 말단에 T₄DNA리게이스에 의해 결찰시킨다. 이 방법은 목적하는 잘못 짝지움(들)을 함유하는 부분적으로 2본쇄인 분자를 형성한다.

돌연변이 프라이머 및 M13 서열화 프라이머는 화학적 합성할 수 있다(상기 인용). 실온 이상에서 선행 DNA합성을 충분히 하기 위해 길이 약 14 내지 22뉴클레오타이드의 올리고데옥시리보뉴클레오타이드를 사용하는 것이 바람직하다. 게다가 그런 올리고데옥시리보뉴클레오타이드가 독특한 표적 부위를 인식하기 쉽다.

특히, 하나의 잘못 짝지움을 갖는 돌연변이 올리고데옥시리보뉴클레오타이드는 길이가 14 내지 18뉴클레오타이드인 반면, 2개의 잘못 짝지움을갖는 돌연변이 올리고데옥시리보뉴클레오타이드는 약 17 내지 30뉴클레오타이드 범위이다. 돌연변이 프라이머는 잘못 짝지움이 분자의 중간쯤에 있도록 고안한다. 이것은 완전히 짝지은 2본쇄 및 잘못 짝지은 2본쇄 사이에 커다란 결합 자리를 산출한다(하기 언급).

본 발명의 바람직한 태양에서, 돌연변이 올리고데옥시리보뉴클레오타이드는 글리코실화를 방지하는 아미노산을 암호화하는 하나 또는 2개의 잘못 짝지은 삼중자를 함유하며, 이후 특히 바람직한 것으로 기술되고 있다.

목적하는 잘못 짝지은 것(mismatch)을 함유하는 부분적 2본쇄 DNA는 수용체 미생물, 특히 이.콜라이 균주를 형질감염시키는데 직접 사용할 수 있다. DNA로의 형질감염은 각각 야생형 t-PA유전자 및 변이 t-PA유전자를 함유하는 페이지의 혼합물을 산출한다. 생성된 플라그는 변이 t-PA유전자를 함유하는 페이지 DNA에 대해 선별한다.

야생형 또는 변이 t-PA를 갖는 페이지의 생성 혼합물로부터 변이된 t-PA유전자를 함유하는 페이지 DNA를 선별하는 바람직한 방법은 이른바, 도트 블랏 하이브리드화(do blot hybridization)이다 (참조 : M.J.Zoller and M.Smith, 상기 언급). 이 방법은 완전히 짝지은 DNA 2본쇄 및 하나 이상의 잘못 짝지은 DNA 2본쇄의 열안정성 차이에 근거한 것이다. 1본쇄 페이지 DNA를 필터 페이퍼 또는 나이트로셀룰로오스 시트와 같은 고체 지지체상에 승온으로, 예를 들면 80℃로 가열하고,³²P표지된 돌연변이 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 프라이머에 하이브리드화하여 고정한다(상기 언급). 낮은 온도에서는 돌연변이 및 야생형 t-PA DNA가 2본쇄를 형성하면서 상호작용한다. 후속적으로 세척은 점진적으로 높은 온도(예 : 10℃ 간격으로)에서 수행하여 단지 완전 짝지은 변이 분자만이 하이브리드화되어 있을 때까지 프라이머를 야생형 t-PA DNA로부터 선택적으로 분해한다. 변이 분자는 자동방사선 사진으로 확인한다. 필요한 최종 온도는 이론적으로 계산할 수 있다. 바람직하게는, 융점 To(프라이머의 50% 분해점)를 4 내지 8℃ 초과하는 온도를 선택한다. 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 프라이머 및 변이된 t-PA유전자 사이의 완전히 염기-짝지은 프라이머-변이된 t-PA유전자 이본쇄의 각 AT염기쌍에 대해서는 2℃ 증가, 각 GC염기쌍에 대해서는 4℃ 증가시켜 To온도를 계산한다.

이.콜라이 균주와 같은 수용체 미생물을 동일한 1차 변이 페이지로 재형질 감염시키고, 다시 상기 변이 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 프라이머(³²P표지)를 사용한 도트 블랏 하이브리드화에 의해, 변이 t-PA유전자를 함유하는 페이지 DNA의 플라그를 선별함으로써 순수한 변이 페이지를 수득한다.

변이된 t-PA유전자를 적당한 제한효소 방법으로 페이지의 복제형으로부터 절제해서 하이브리드 벡터에 클로닝시 사용한다.

3. 돌연변이체 t-PA단백질을 코드화하는 DNA서열을 함유하는 하이브리드 벡터

본 발명은 프로모터와 인체 돌연변이체 t-PA단백질을 코드화하는 DNA서열을 함유하는 하이브리드 벡터에 관한 것으로, 천연의 하나 또는 그 이상의 N-글리코실화 부위가 이 부위에서 글리코실화가 일어날 수 없는 방법으로 변환되며, 상기 DNA는 상기 프로모터의 전사 조정하에 존재한다.

본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 하이브리드 플라스미드 및 선형 DNA벡터로 구성되는 군에서 선택되며 형질전환에 직면한 숙주 유기체에 따라 선택한다.

포유류 세포의 프로모터는 예를 들어, 비루스성 프로모터, 즉 HTLV, SV40, 바시니아(Vaccinia) 프로모터 등이다.

본 발명의 가장 바람직한 숙주 유기체인 효모에 대한 프로모터는 효모, 특히 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 게놈성 DNA로부터 유래한다. 바람직하게, 고도로 발현된 효모 유전자의 프로모터가 t-PA돌연변이체의 발현에 사용된다. 즉, TRP1유전자, ADHI 또는 ADHII유전자, 산 포스파타제(PHO5)유전자, 이소시토크롬 C유전자, 또는 글리콜리틱 효소를 코드화하는 유전자의 프로모터[예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스파타제 데하이드로게나제(GAPDH), 3-포스포글리세레이트키나제(PGK), 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프록토기나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트무타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 인버타제 및 글루코키나제 유전자의 프로모터 또는 a- 또는 α-인자를 코드화하는 효모 교배페로몬(pheromone)유전자의 프로모터를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 벡터는 전사 조정을 하는 프로모터를 함유한다.

상기 형태의 프로모터, 즉, PHO5유전자의 프로모터는 성장회로의 변화에 의해 작용할 수 있거나 할 수 없다. 예를 들어, PHO5프로모터는 단지 배지의 무기 인산염의 농도를 증가시키거나 감소시킴에 의해 원하는 대로 억압시킬 수 있다. 즉, 프로모터는 효모의 지수적 성장 상태에서 억압될 수 있으며, PHO5프로모터에 의해 조정된 유전자의 발현을 허용하는 최대 세포 밀도에서의 이른 정체 상태에서 결정(억압)될 수 있다. 높은 수준의 전사와 결합된 상기의 성질은 본 발명에서 바람직한 PHO5프로모터를 제조하게 한다.

본 발명의 하이브리드 벡터에 있어서, 프로모터가 돌연변이체 t-PA암호의 영역에 적절히 결합되어, 돌연변이체 t-PA의 효과적인 발현을 확실하게 한다. 본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 프로모터는 접합부에 삽입된 영역 개시 시그널(ATG)를 함유하는 성숙 t-PA돌연변이체의 암호화 영역에 직접 결합된다. 본 발명의 다른 바람직한 태양에 있어서, 특히, 효모가 숙주 세포로 사용되는 경우, 시그널 서열이 구조에 포함된다. 적절한 시그널 서열은 사용된 프로모터, 특히 PHO5 또는 전환효소(invertase)시그널 서열, 또는 t-PA시그널 서열에 천연적으로 연결된다. 다른 시그널 서열 즉, 효모 전환 효소 또는 α-인자 유전자의 시그널 서열도 사용될 수 있다. 이와 달리, 융합된 시그널은 사용된 프로모터에 천연적으로 결합된 유전자의 시그널 서열 부분과 t-PA 시그널 서열 부분을 결찰시킴으로 구성될 수 있다. 상기의 조합은 시그널 서열과 성숙 t-PA 아미노산 서열 사이의 정말한 절단이 허락되도록 하는 것이 바람직하다. 추가의 서열 즉, 특이 프로세싱(processing) 시그널을 갖거나 갖지 않는 프로- 또는 공간-서열이 전구체 분자의 정확한 프로세싱을 촉진시키기 위해 구성체에 포함될 수도 있다. 이와 달리, 융합된 단백질은 생체내 또는 시험관내에서 적당한 돌연변이를 허용하는 내부의 프로세싱 시그널을 함유하도록 생성될 수 있다. 바람직하게, 프로세싱 시그널은 골기막(Golgi membranes)에 위치한 효모 엔도펩티다제에 의해 확인되는 Lys-Arg 잔기를 함유한다. 돌연변이 t-PA 유전자가 발현되면, 유전자 생성물은 분비 경로로 들어가, 외질 공간으로 이동된다. 세포벽을 통해 배양 배지로 추가로 배출될 수 있는 경우, 수율이 상당히 증가될 수 있어야 할 것이다. 또한 회수 과정은 세포가 파괴됨이 없이 단순화될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 전사 말단 및 폴리아데닐화에 적절한 시그널을 함유하는 유전자의 3'-측면 서열을 함유한다. 적절한 3'-측면 서열은, 예를 들어, PHO5유전자의 효모 특별한 측면화 설영의 경우 프로모터에 천연적으로 연결된 유전자의 서열이다.

본 발명은 특히 인체 돌연변이형 t-PA 단백질을 코드화하는 DNA 서열로 구성되는 선형 DNA 벡터에 관한 것으로, 이의 하나 또는 그 이상의 천연 N-글리코실화 부위를, 시그널 서열을 임의로 포함하는 상기 부위에서 글리코실화가 일어날 수 없는 방법으로 변환시키고, 크로모솜의 유전자에서 천연의 서열, 예를 들어, 5'-말단에서 숙주 크로모솜의 유전자의 프로모터 영역 및 3'-말단에서 상기 유전자의 3'-측면 영역(이의 일부)로 측면화 시킨다. 특히, 본 발명은 효모 PHO5프로모터, 돌연변이체 t-PA 암호화 영역 및 PHO5 3'-측면 영역을 함유하는 선형 DNA에 관한 것이다.

동종 3' 및 5' 측면 서열에 의해 돌연변이 t-PA 유전자를 포함하는 전체 선형 DNA 벡터는 즉 효모 프로모솜 II내의 PHO5 궤적에서 효모 PHO5 효모 PHO5 유전자의 효모 PHO5 프로모터 및 3'-측면 서열의 경우 대표적인 숙주 크로모솜 내로 안정되게 혼입시킨다.

본 발명은 또한 환상 하이브리드 플라스미드에 관한 것으로 프로모터와는 별도로, 하나 또는 그 이상의 천연 N-글리코실화 부위는 시그널 서열, 및 프로모터의 기능 즉 변형된 t-PA 암호화 영역의 발현에는 불필수적이거나 덜 중요하지만 상기의 하이브리드 플라스미드로 형질전환된 세포의 증식에 중요한 기능을 수행하는 추가의 DNA 서열을 함유하는 3'-측면 서열을 임의로 포함하는 부위에서 글리코실화가 일어날 수 없는 방법으로 변하게 된다. 추가의 DNA 서열은 원핵 및/또는 진핵 세포로부터 유래될 수 있으며 크로모솜 및/또는 디-크로모솜 DNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 DNA 서열은 플라스미드 DNA, 즉, 박테리아성 또는 진핵 플라스미드 DNA, 비루스 DNA 및/또는 염색체 DNA, 즉 박테리아성, 효모 또는 고등한 진핵성 염색체 DNA로 구성되는 스템(Stem)이다. 바람직한 하이브리드 플라스미드는 박테리아성 플라스미드, 특히 에세리키아 콜라이 플라스미드 pBR 322 또는 관련된 플라스미드, 벡테리오파지 λ, 효모 2μ 플라스미드, 및/또는 효모 염색체 DNA로부터 유도된다.

본 발명의 바람직한 하이브리드 플라스미드에서, 추가의 DNA 서열은 효모 복제 기원부(Origin) 및 효모에 대한 선택적 유전성 마커를 함유한다. 효모 복제 기원부, 즉, 자율적으로 복사하는 분절을 함유하는 하이브리드 플라스미드는 형질전환 후 효모 세포내에 염색체적으로 유지되며, 유사분열시 자동적으로 복제된다. 효모 2μ 플라스미드 DNA에 대해 동종의 서열을 함유하는 하이브리드 플라스미드도 사용될 수 있다. 상기의 하이브리드 플라스미드는 재조합에 의해 세포내에 이미 존재하는 2μ 플라스미드에 통합되거나, 자동적으로 복제될 것이다. 2μ 서열은 많은 빈도로 형질전환 플라스미드에 특히 적절하며 복사체의 수를 많게 한다.

또한, 본 발명에 따른 바람직한 하이브리드 플라스미드는 숙주 효모 염색체(예를 들어, 돌연변이체 t-PA 암호화 영역에 연결된 PHO5 유전자 또는 이의 프로모터)에 존재하는 유전자의 일부로서 DNA 서열을 포함할 수 있다. 약 20 내지 100의 직선 데옥시누클레오티드에 달하는 동종 서열에 의해 전체 플라스미드 또는 이의 선형 단편을 재조합에 의해 숙주 염색체에 안정하게 혼입시킬 수 있다. 즉, 증식시, 자세포는 선택적 압력없이도 도입된 유전적 물질을 보유할 것이다.

효모에 대한 선택적 유전자 마커에 대해, 마커의 표현형 발현에 기인한 형질전환체의 선택을 촉진하는 어떠한 마커 유전자를 사용할 수도 있다. 효모에 적절한 마커는 특히 항생물질 내성을 발현하는 유전자 또는 향 영양 효모 돌연변이체의 경우 숙주 장해에 상보적인 유전자이다. 상응하는 유전자는 예를 들어, 항생물질 시클로 헥시미드에 대해 내성을 갖거나 향 영양 효모 돌연변이체, 예를 들어, URA3, LEU2, HIS3 또는 TRP1 유전자에 프로토트로피를 제공한다. 마커로서 형질전환시킬 숙주가 마커에 의해 발현된 생성물에 대해 향 영양성을 제공하는 자동적으로 복사되는 분절과 연합된 구조 유전자를 사용할 수도 있다.

유리하게, 본 발명의 하이브리드 플라스미드에 존재하는 추가의 DNA 서열은 또한 복제 기원부 및 박테리아 상숙주, 특히 에세리키아 콜라이에 대해 선택적인 유전적 마커를 포함한다. 효모 하이브리드 플라스미드에 이.콜라이 복제 기원부 및 이.콜라이 마커가 존재하는 특징을 갖는 것이 유용하다. 첫째로, 다량의 하이브리드 플라스미드 DNA가 이.콜라이 내에서 성장 및 증식에 의해 수득될 수 있고, 둘째로, 하이브리드 플라스미드의 구성이 이.콜라이를 기본으로 하는 전체적인 클로닝 기법을 사용하여 이.콜라이에서 수행한다. 이.콜라이 플라스미드, 즉 pBR 322, 등은 이.콜라이 복제 기원부 및 항생물질, 예를 들어, 테트라사이클린 및 암피실린에 대해 내성을 나타내는 이.콜라이 유전적 마커를 모두 함유하며, 유리하게 효모 하이브리드 벡터의 일부로서 사용된다.

예를 들어, 복제 기원부 및, 효모 및 벡테리아성 숙주에 대한 유전적 마커를 함유하는 추가의 DNA 서열(상기 참조)은 효모 프로모터와 함께 ＂벡터 DNA＂로 후술하며, 돌연변이체 t-PA 암호화 영역은 본 발명에 따라 하이브리드 플라스미드를 형성한다.

바람직한 태양에 있어서, 본 발명은 효모 숙주 균주에서 자동적으로 복제가능하며 선택적 마커를 갖는 하이브리드 플라스미드 및, 하나 또는 그 이상의 천연 N-글리코실화 부위가 이 부위에서 글리코실화가 일어날 수 없도록 변화된 인체 돌연변이체 t-PA 단백질을 암호화하는 DNA 서열 및 효모 프로모터를 함유하는 숙주 염색체에 통합되는 선형 DNA에 관한 것으로, 상기 DNA 서열은 상기 프로모터의 조정하에 상기 하이브리드 벡터내에 전사 개시부 및 종결 시그널 뿐만 아니라 코드화 번역 개시부 및 중단 시그널과 함께 위치하여 형질전환된 숙주 균주에서 상기의 돌연변이체 조직 플라스미노겐 활성화제를 발현 생성시킨다.

본 발명의 바람직한 하이브리드 벡터는 본 기술의 공지 방법, 예를 들어, 효모 프로모터, 돌연변이체 t-PA 암호화 영역, 효모 유전자의 3-측면 서열 및 임의의 벡터 DNA을 연결시켜 제조한다.

하이브리드 플라스미드를 제조하기 위해, 적어도 하나의 제한부위, 바람직하게는 2 또는 그 이상의 제한 부위를 갖는 편리하게 지도화되는 환형 벡터 DNA, 예를 들어 박테리아성 DNA 등(상기 참조)을 사용할 수 있다. 유리하게, 벡터 DNA는 이미 복제 기원부 및 효모 및/또는 박테리아성 숙주에 대한 유전자 마커를 함유한다. 이 벡터 DNA는 적절한 제한 엔도누클레아제로 절단된다. 제한 절단된 DNA를 효모 프로모터를 함유하는 DNA 단편 및 돌연변이체 t-PA를 암호화하는 DNA 단편에 결찰시킨다. 프로모터와 돌연변이체 t-PA 암호와 영역의 연결 전후(또는 거의 동시에), 복제 기원부 및/또는 효모 또는 박테리아성 숙주에 대한 마커를 도입시킬 수도 있다. 좌우간, 제한 및 결찰 조건은 백터 DNA 및 프로모터의 필수적은 기능을 갖는데 방해되지 않는 방법으로 선택된다. 하이브리드 백터는 서열화를 수행하거나 모든 삽입물 서열을 함유하는 두 DNA 분절을 결찰시켜 제조한다.

시험관내에서 DNA 분절을 결합시키는 데에는 여러가지 방법이 사용될 수 있다. 특정의 제한 엔도누클레아제에 의해 생성된 평활 말단(완전한 염기쌍 DNA 이본쇄)는 T4 DNA 리가제로 직접 결찰시킬 수 있다. 또한, DNA 분절은 이의 일본쇄 접착말단을 통해 연결하고 DNA 리가제, 즉 T4 DNA 리가제에 의해 공유적으로 폐환시킨다. 상기의 일본쇄 ＂접착 말단＂은 DNA를 접착 말단을 생성하는 다른 부류의 엔도누클레아제로 절단하여 생성할 수 있다(DNA 이본쇄의 두 가닥은 몇 개의 누클레오티드 차이를 갖고 서로 다른 위치에서 절단된다). 일본쇄는 평활 말단 또는 접착 말단에 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 누클레오티드를 가하거나(＂호모 폴리머성 테일링＂), 평활 말단의 DNA 분절의 한가닥을 적절한 엑소누클레아제 즉, λ 엑소누클레아제로 간단히 절단하여 형성시킬 수도 있다. 접착 말단을 생성시키는 추가의 방법은 평활 말단화 DNA 분절에 접착 말단 생성 엔도누클레아제에 대한 인식 부위를 함유하는 화학적 합성 링커 DNA를 연결 시키고, 적당한 엔도누클레아제로 생성 DNA를 분해하는 것으로 구성된다.

본 발명의 하이브리드 벡터, 예를 들어, 효모 프로모터, 시그널 서열을 임의로 함유하는 돌연변이체 t-PA에 대한 구조 유전자, 전사 종결부, 복제 시스템 등의 성분은 예측되는 순서로 연결하여 적당한 기능을 나타내도록 한다. 각 성분들은 통상 제한 부위를 통하거나, 합성 링커 분자에 의해 연결하여 적당한 배향 및 성분의 순서가 이루어지도록 한다.

선형 DNA 벡터는 예를 들어, 돌연변이체 t-PA 암호화 영역을 상기 프로모터에 의해 조절하는 방법으로 상기의 효모 프로모터를 돌연변이체 t-PA 암호화 영역에 연결하고, 생성되는 DNA를 효모 유전자로부터 유래된 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA 분절과 함께 공급하는 본 기술분야의 공지방법에 의해 제조된다.

DNA 분절들의 결합은 접착 말단 또는 화학적으로 합성된 링커 DNA를 통한 평활 말단 결찰에 의해 전술한 바와 같이 수행할 수 있다.

특히, 효과적으로 발현시키기 위해, 돌연변이체 t-PA 유전자는 전사(효모 프로모터) 및 번역 기능(리보소옴 결합 부위)을 함유하는 서열에 대해 적당히 위치하여야 한다. 첫째로, 변이 t-PA 암호화 영역과 함께 프로모터를 함유하는 DNA 분절의 결찰은 적절한 배향으로 성취되어야 한다. 두가지 배향이 가능한 경우, 통상의 제한 분석으로 정확한 배향을 가려낸다. 부정확하게 배향된 변이 t-PA 유전자 삽입물을 함유하는 하이브리드 벡터는 적절한 제한 엔도누클레아제로 유전자 삽입물을 절단하고 이 유전자를 하이브리드 벡터 단편과 다시 결찰시켜 재배향시킨다. 어떠한 경우에도 이의 말단에 따른 제한 부위를 갖는 두 개의 DNA 분절을 연결시켜 부적절한 배향은 피하여야 한다. 더욱이, 하이브리드 벡터의 구성은 옳은 전사 개시 및 종결이 이루어지는 방법으로 수행된다. 후자의 관점에 대해 전사는 바람직하게 염색체 DNA 또는 효모 2μ 플라스미드로부터 유도된 DNA 서열에서 말단화된다. 둘째로, 적당한 판독 프레임도 확립되어야 한다. 통상, 프로모터 영역의 누클레오티드 서열 및 돌연변이체 t-PA 암호화 영역은 연결하기 전에 공지되어 있으며 용이하게 측정할 수 있어 옳은 판독 프레임을 제조하기에는 문제점이 없다. 세포질에 축적시키기 위해 성숙 돌연변이체 t-PA의 발현이 바람직한 경우, 임의로 프로모터 영역에 이어지고/지거나 임의로 성숙 돌연변이체 t-PA 코딩 영역 앞부분의 시그널 서열 또는 이의 부분을 예를 들어 엑소누클레아제 즉 Bal 31로 분해하여 제거하여야 한다. 효모 프로모터를 돌연변이체 t-PA 암호화 서열에 직접 결합시키기에 바람직한 영역은 주 mRNA 출발부위 및 효모 프로모터에 천연적으로 결합된 유전자의 ATG 코돈 사이이다.

상기 영역의 접합을 위해 돌연변이체 t-PA 암호화 서열은 번역 개시용 자체의 ATG 코돈을 가져야 하거나, 추가의 합성 올리고누클레오티드를 제공하여야 한다. 효모 프로모터는 연결 분자로서 합성 올리고데옥시누클리보레오티드를 사용하여 돌연변이체 t-PA 암호화 서열에 연결될 수도 있다. 즉, 가능한 경우, 프로모터 영역은 이의 3'-말단 근처에서 제한될 수 있어서 예측된 번호의 염기쌍이 결핍되도록 한다. 유사하게, 돌연변이체 t-PA 암호화 서열은 이의 5'-말단 근처에서 제한될 수 있다. 합성 올리고데옥시누클레오티드를 상기 방법으로 구성할 수 있으며, 효모 프로모터와 돌연변이체 t-PA 암호화 서열의 연결 올리고데옥시누클레오티드에 의해 연결되는 경우, 빠진 염기쌍은 ATG 번역 개시 시그널을 포함하여 복원되며, 돌연변이체 t-PA 암호화 서열은 ATG 개시 코돈에 비하여 적당한 판독 프레임에 존재한다.

4. 돌연변이체 t-PA 암호화 서열을 함유하는 하이브리드 벡터에 의한 숙주 유기체의 형질전환

본 발명의 다른 양태는 하나 또는 그 이상의 천연 N-글리코실화 부위가 이 부위에서 글리코실화가 일어날 수 없도록 변화된 돌연변이체 t-PA 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 형질전환된 진핵 숙주 유기체 및 이의 돌연변이체를 포함한다.

적절한 진핵 숙주 유기체는 전술한 것 이외에 특히, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 토롤로프시스(Torulopsis) 속 및 관련된 속(참조, J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam, 1971)의 종, 특히 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는 효모이다.

하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위를 형질전환시킨 진핵 숙주 유기체는 글리코실화가 일어날 수 없도록 변화시킨 인체 돌연변이체 t-PA 단백질을 암호화하는 DNA 서열 및 프로모터를 함유하는 하이브리드 플라스미드로 형질전환된 숙주 유기체로부터 선택되며, 상기 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체는 숙주 염색체에 안정하게 통합되고 염색체 숙주 프로모터의 전사 조정하에 놓이게 된다.

상기의 형질전환된 진핵 숙주 세포의 제조방법은 프로모터와, 하나 또는 그 이상의 천연 N-글리코실화 부위가 글리코실화가 일어날 수 없도록 변화된 인체 돌연변이체 t-PA 단백질을 암호화하며 상기 프로모터의 전사 조정하에 존재하는 DNA 서열을 함유하는 하이브리드 벡터로 진핵 숙주세포를 형질전환시키는 것이다.

진핵 숙주 세포의 형질전환은 공지의 방법으로 수행한다. 예를 들어, 하이브리드 벡터를 사용하는 효모의 형질전환은 힌넨 등의 방법에 따라 수행할 수 있다[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75; 1929(1978)]. 상기 방법은 세 단계로 나뉠 수 있다 :

(1) 효모 세포벽 또는 이의 일부를 제거한다.

(2) ＂드러난(naked)＂ 효모 세포(스페로플라스트 ; Spheroplast)를 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 및 Ca²⁺이온 존재하에 형질전환 DNA로 처리한다.

(3) 세포벽을 재생시키고, 고체 아가 층에서 형질전환된 세포를 선택한다.

바람직한 방법 :

(1) 삼투압적으로 안정된 용액(예 : 1M 소르비톨)중에서 달팽이 소화관 쥬스(예 : Glusulase

또는 Helicase

또는 미생물로부터 수득한 효소 혼합물(예 : Zymolyase

)과 같은 여러 가지 제제의 글루코시다제를 사용하여 효모 세포벽을 효소적으로 제거한다.

(2) 효모 스피로플라스트를 PEG 존재하에 응집시키고 세포질막의 부분적 융합을 유도한다. ＂융합형＂조건의 생성은 중요하며 많은 형질전환 세포들이 형질전환 공정도중 2배체 또는 심지어 32배체가 된다. 융합된 스피로플라스트의 선별법을 사용하여 형질전환체를 증강시키는데, 형질전환된 세포는 미리 선별한 융합 생성물중에서 손쉽게 선별할 수 있다.

(3) 세포벽이 없는 효모 세포는 분열하지 않기 때문에 세포벽을 재생시켜야 한다. 이 재생을 스피로플라스트를 한천에 담가 용이하게 수행한다. 예를 들면 용융한천(약 50℃)을 스피로플라스트와 함께 혼합한다. 용액을 효모 생성 온도로 냉각시킴에 따라(약 30℃) 고체층이 수득된다. 이 한천층은 스피로플라스트로부터 필수적 거대분자의 신속한 확산 및 상실을 막아 세포벽의 재생을 가능하게 한다. 그러나 세포벽 재생은 또한 스피로플라스트를 이미 형성된 한천층의 표면에 놓아서(비록 낮은 효율이지만) 수득할 수도 있다.

바람직하게는 재생과 형질전환 세포의 선별이 동시에 가능하도록 재생 한천을 제조한다. 아미노산 생합성경로의 효소를 암호화하는 효모 유전자가 선별 마커로 통상 이용되기 때문에(상기 언급), 재생은 바람직하게는 효모 최소 배지 한천에서 수행한다. 아주 높은 재생 효율이 필요한 경우 하기의 2단계 방법이 유리하다 : (1) 풍부한 복합 배지에서 세포벽을 재생하고, (2) 선택한천 평판상에 세포층을 복제 평판화(replicaplating)하여 형질전환 세포를 선별한다.

하이브리드 벡터가 어느 마커도 함유하지 않는 경우, 형질전환 세포는 또한 다른 방법에 의해 분류할 수 있다. 그런 방법은 예를 들면 하이브리드 벡터의 서열에 상동적인 표지된 DNA 단편과의 하이브리드화(예 : Hinnen et al., 상기 언급), 유도된 유전자 산물에 대한 항체가 가능한 경우 면역측정법, 또는 형질전환 플라스미드에 의해 암호화된 유전자 산물을 측정하는 기타의 선별법 등이다.

또한, 효모는 본 발명에 따른 하이브리드 벡터 및 효모에 대한 유전 마커를 함유하는 2차 벡터로 공동-형질전환시킬 수 있다. 2개의 상이한 벡터가 공통인 DNA 서열을 함유하면(이것은 벡터상에 존재하는 세균의 서열일 수 있음), 재조합은 융합된 선택성 하이브리드 분자를 유도한다.

효모는 또한 효모 프로모터로 이루어진 선형 DNA 벡터, 임의로 상기 프로모터로 통제되는 신호 서열 및 효모 유전자의 전자 종결신호로 이루어진 변이 t-PA 암호화 영역, 및 효모에 대한 선택성 마커를 함유하는 벡터로 공동-형질전환시킬 수 있다. 공동 형질전환은 직접 선별할 수 없는 DNA를 취한 그런 효모 세포를 증강시킨다. 캄피턴트 세포는 어느 형태의 DNA든 취하기 때문에, 선택성 벡터로 형질전환된 고백분율의 세포는 또한 가외의 DNA(상기 선형 DNA 벡터 같은)를 저장할 수 있다. 충분히 긴 상동 서열(예 : 길이가 약 20 내지 100데옥시뉴클레오타이드)로 인하여 폴리펩타이드 유전자는 효모 염색체에 안정적으로 삽입된다.

형질전환시킨 진핵 숙주 유기체, 특히 본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드를 함유하고 숙주 염색체에 안정적으로 결합된 변이-t-PA 유전자로 이루어진 선형 DNA 벡터를 함유하는 형질전환 효모 균주는 돌연변이에 의한 변이 t-PA의 생산 및 당 분야 공지의 방법을 사용한 선별면에서 크게 진보되었다. 돌연변이는 예를 들면 U.V. 조사 또는 적합한 화학시약으로 수행할 수 있다. 특히 바람직한 것은 단백질 분해효소 결실 변이체, 특히 효모 변이주의 제조로 세포내에서 생성된 변이 t-PA 단백질 분해를 예방할 수 있다.

5. 약제학적 제제

본 발명에 따라 수득 가능한, 바람직하게는 1-체인 형태의 신규의 변이 t-PA 단백질은 유용한 약리학적 특성을 나타낸다. 이들은 플라스미노겐 활성화의 기작을 통해 국소적 섬유소 용해 또든 단백질 용해활성을 제공하는 것이 바람직한 혈전증 또는 기타 증상, 예를 들면 아테롬성 동맥경화증, 심근증 및 대뇌 경색증, 정액 혈전증, 혈전색전증, 수술후의 혈전증, 혈전성 정맥염 및 식이적 혈관질환(diabetic vasculopathies) 등의 예방 또는 치료를 위하여 사람에게 공지된 플라스미노겐 활성화제와 유사하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 신규의 변이 t-PA 단백질이 완전히 글리코실화된 천연 t-PA와 맞먹거나 또는 더 나은 생물학적 활성이 있음을 발견하였다. 따라서 신규한 t-PA 변이체는 섬유소 용해 활성적이다. 독특한 섬유소-조절 특성, 즉 섬유소의 존재하에서만 플라스미노겐을 활성화 시킬 수 있는 능력을 완전히 보유한다. 또한, 신규한 단백질은 진짜 t-PA와 비교하여 연장된 생체내 안정성을 갖는다. 분명히 N-연결된 탄수화물 체인이 부분적 또는 전체적으로 결실된 신규 단백질은 완전히 글리코실화된 생성물보다 단백질 분해에 덜 수용적이다.

탄수화물 잔기가 없는 당단백질의 생물학적 활성 유지는 예견치 못했던 것으로 다양하다. 어떤 경우에 있어서는 탈글리코실화 또는 심지어 부분적 탈글리코실화가 생물학적 활성의 손상 또는 상실을 초래한다[참조 : D.R. Karp et al., J. Biol. Chem. 257, 7330(1982) ; H.T. Kentmans et al., Biochemistry22, 3067(1983) ; H.R. Gradnick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2771(1983)]. 본 발명에 따른 변이 t-PA의 놀랄 만한 특성은 화학적 또는 효소적으로 탈글리코실화된 t-PA(S.P. Little et al., 상기 언급; PCT 84/1960, 상기 언급)로부터 수득되는 이전의 결과로는 추론할 수 없다는 것인데, 이는 t-PA의 화학적 또는 효소적 처리가 N-연결된 탄수화물 체인이 완전히 부재 또는 N-연결된 탄수화물의 적어도 일부가 상실된 생성물을 명백히 유도하지 못한다는 것 때문이다.

본 발명은 또한 활성 성분(1-체인 또는 2-체인 변이 t-PA 또는 그의 혼합물, 바람직하게는 1-체인 형태)의 약제학적 유효량을, 비경구적, 즉, 근육내, 피하 또는 복강내 투여에 적합하고 활성 성분과 해로운 상호 작용을 하지 않는 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기, 고체 또는 액체 담체와 함께 함유하는 약제학적 제제에 관한 것이다.

적합한 주입 용액; 바람직하게는 수용액 또는 현탁액이 있는데, 이들은 사용하기 전 예를 들면 활성 성분 단독, 또는 만니톨, 락토스, 글루코스, 알부민 등과 같은 담체와 함께 함유하는 동결건조 제제로부터 제조할 수 있다. 약제학적 제제는 멸균하고, 경우에 따라 보조제, 예를 들면 방부제, 안정제, 유화제, 용해제, 완충액 및/또는 삼투압을 조절하는 염과 혼합한다. 멸균은 작은 구멍(직경 0.45㎛ 또는 더 작은)의 필터를 통해 무균여과를 달성하고 이후 경우에 따라 제제를 동결건조한다. 항생물질을 또한 가하여 보존성을 증강시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 제제는 단위 용량당 약제학적으로 허용되는 담체 1 내지 200mg 및 활성성분(1-체인 또는 2-체인 변이 t-PA 또는 그의 혼합물, 바람직하게는 1-체인 형태) 약 1 내지 100mg, 바람직하게는 약 3 내지 25mg을 함유하는 단위 용량 형태, 예를 들면 앰플중에 분산시킬 수 있다.

질병의 형태 및 환자의 나이와 상태에 따라, 체중 약 70kg의 환자의 치료를 위한 일일 투여 용량은 24시간당 3 내지 100mg, 바람직하게는 5 내지 50mg이다. 심근성경색증의 경우 바람직하게는 약 30 내지 80mg의 용량을 60 내지 120분내, 바람직하게는 3회 분취량으로 약 90분내 투여한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 생물학적으로 활성인 단백질을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합함을 특징으로 하여 약제학적 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

인체에 예방 및 치료적 투여를 위한 신규 단백질의 용도도 본 발명의 목적이다.

본 발명은 특히 DNA서열, 하이브리드 벡터, 형질전환된 숙주 균주, 변이 t-PA단백질 및 실시예에 기술된 바와 같은 그의 제조방법에 관한 것이다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하고 있으나 그의 제한으로서 해석되어서는 안된다.

[실험부]

하기의 약자는 실시예에서 사용된다.

BAS : 소의 혈청알부민

DTT : 1,4-디티오트레이톨(1,4-디머캅토-2,3-부탄디올)

EDTA : 에틸렌디아민테트라아세트산

PEG : 포리에틸렌글리콜 6000

SDS : 나트륨 도데실 설페이트

SSC : 150mM NaCl, 15mM 나트륨시트레이트, 05mM EDTA를 함유하며 HCl로 pH 7.2로 조절한 용액

TBE : 90mM Tris, 90mM 붕산, 2.5mM 티트리플렉스(Titriplex

)를 함유하는 용액

TE : 10mM Tris HCl(pH 8.0) 및 0.1mM EDTA(pH 8.0)을 함유하는 용액

TNE : 100mM NaCl, 10mM Tris, HCl(pH 7.5) 및 1mM EDTA를 함유하는 용액

Tris HCl : HCl로 pH 조절된 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄

[실시예 1]

M13mp8에 조직 플라스미노겐(plassminogen)활성화제 유전자를 함유하는 p31/PHO5-TPA18 BamHI-Hind III단편의 클로닝

(a) 플라스미드 p31/PH 05-TPA18(유럽 특허원 제 143,081호에 기재되어 있음)은 PHO5 프로모토 및 t-PA 구조 유전자에 프레임에 융합된 PHO5 시그널 서열을 갖는다(비교, 제1도). 플라스미드는 DH-1[F

recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17

, Sup E44,λ

을 통해, 이.콜라이의 dam

균주를 통과시킨다. 두 개의 amp

콜로니를 단리하고 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 100ml LB배지에서 성장시킨다. 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 제한효소를 t-PA유전자 삽입물의 정확한 크기를 나타내도록 BamHI 및 Hind III(Boehringer)로 분해하고 이를 Pst I(Boehringer) 분해의 제한 형태로 확인한다.

(b) 이 콜라이 균주 DH-1로부터의 3㎍의 p31/PHO5-TPA 18을 50㎕의 10mM Tris HCl pH 7.5, 6mM MgCl₂, 50mM NaCl, 6mM 머캅토 에탄올중에서 20U의 Hind III(Boehringer, 20u/㎕)와 함께 60분간 37℃에서 배양한다. 일정량을 취하여 TBE 완충액중 1%아가로스겔상에서 검사하여 완전히 분해되었는지 확인한다. 이 분해물을 65℃에서 10분간 배양한다. 그 다음 0.5㎕의 5M NaCl을 가하고 이어서 18U의 BamHI(Boehringer, 18u/㎕)를 가한다. 이를 37℃에서 60분간 배양한다. 일정량을 TBE 완충액내의 1% 아가로스겔상에서 분석하면 3.6kb 벡터 단편 이외에 2.3kb의 삽입물이 나타난다. 이 삽입물을 0.8%표본 아가로스겔 상에서 단리시킨다. 겔조각을 Micro-Colloidon

튜브(Sartorius GmbH)에 옮기고 100㎕의 TE로 덮은 다음 전기용출(90mA에서 50분간 전기영동)시킨다. 실리콘화 튜브에서 TE용액을 수거한다. DNA는 0.1 용적의 10×TNE를 가한 후 무수 에탄올 2.5용적을 사용하여 침전시킨다. DNA펠렛을 냉 80% 에탄올로 세척하고 진공중에서 건조시킨다. DNA를 20㎕의 TE(13fmoles/㎕)에 재현탁시킨다.

(c) 3㎍의 M13mp8(RF 형)을 Hind III 및 Bam HI으로 절단하고, 7.3kb 단편을 0.8%표본 아가로스겔상에서 단리한 다음 전기용출시키고 상기와 같이 침전시킨다. DNA를 20㎕의 TE(30.8fmoles/㎕)에 재현탁시킨다.

(d) 92fmoles의 M13mp8 Bam HI-Hind III 절단 벡터와 130fmoles의 Bam HI-Hind III t-PA삽입물을 20㎕의 50mM Tris HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 20㎕ ATP, 1㎍ 젤라틴 중에서 400u의 T4 DNA 리가제(New England Bio Labs, 400u/㎕)를 사용하여 15℃에서 18시간동안 결찰시킨다. 65℃에서 10분간 배양한 후, 1㎕의 결찰혼합물의 분취량을 희석(TE로 1 : 10)시킨다. 2㎕ 및 8㎕의 상기 희석된 결찰혼합물을 사용하여 문헌[참조＂M13 Cloning and Sequencing HandBook＂(published by Amersham)]의 방법에 따라 이.콜라이 JM101 Ca²⁺세포에 형질전환시킨다. 200개의 무색 반점(8㎕, 1 : 10 희석시킨 결찰혼합물)로부터, 25개를 선택하고, 일본쇄 및 복사형(RF) DNA를 제조한다[참조 : J.Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78(1983)]. RF-DNA를 분석함에 있어서, 두 개의 클론은 꼭 맞는 크기의 삽입물(2.3kb Bam HI-Hind III t-PA 유전자 단편)을 나타낸다. PHO5 프로모터 및 터미네이터를 갖는 t-PA 유전자를 함유하는 상기 두 개의 클론을 더 분석한다. Pst I, Hind III-Eco RI, Bam HI-Eco RI 분해로 2.3kb단편의 존재를 확인한다. 하나의 클론을 사용하여 구성하여 p8A-7로 명명한다.

[실시예 2]

일본쇄 p8A-7을 사용하는 Asn 117에서의 첫 번째 글리코실화 부위의 돌연변이

모든 돌연변이성 및 서열화 프라이머는 포스포르아미디트법[참조 : M. H. Caruthers Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragment(H. G. Gassen and A. Lang, Eds) Verlag Chemie, Weinheim, Federal Republic of Germany]을 사용하여 Applied Biosystem(Model 380 B)합성기로 합성된다.

다음 서열화 프라이머가 합성된다 :

서열화 프라이머 I : dGCCCAGCCTGATGGCGT

서열화 프라이머 II : dCCACGGGAGGCAGGAGG

서열화 프라이머 III : dCAGCACGTGGCACCAGG

서열화 프라이머 IV : dTGGCAGGCGTCGTGCAA

보편적인 M13 서열화 프라이머 dGTAAAACGACGGCCAGT

(a) 돌연변이성 프라이머의 포스포릴화 : 200pmoles의 돌연변이성 프라이머 I을 8U의 T4 폴리누클레오티드 키나제(Boehringer, 8U/㎕)을 사용하여 1㎕의 1mM ATP를 함유하는 20㎕의 50mM Tris. HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 5mM DTT, 0.1mM 스퍼미딘, 0.1mM EDTA중에서 포스포릴화한다. 37℃에서 45분간 배양한 후, 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다.

(b) 일본쇄 삼중쌍 p8A-7에 대한 돌연변이성 프라이머 및 보편적인 서열화 프라이머의 어닐링 : 88㎍(123fmoles)의 일본쇄 삼중쌍 p8A-7을 10㎕의 20mM Tris HCl, pH 7.5, 10mM MgCl₂, 50mM NaCl, 1mM DTT중 55℃에서 5분간 10pmoles의 보편적인 M13 서열화 프라이머 및 20pmoles의 포스포릴화된 돌연변이성 올리고데옥시리보뉴클레오티드(10pmoles/㎕)와 함께 배양한 다음 RT에서 5분간 냉각시킨다.

(c) 연장-결찰 반응 : 상기 어니일시킨 혼합물에 1㎕의 완충액(0.2M, Tris HCl pH 7.5, 0.1M MgCl₂, 0.1M DTT), 4㎕ 2.5mM dNTP 혼합물, 1㎕의 10mM r-ATP, 1.4㎕의 T4 DNA 리가제(Amersham, 2.5u/㎕), 0.6㎕의 클레노우 DNA 폴리머라제(BRL, 2.99u/㎕)을 함유하는 10㎕의 효소-(dATP, dGTP, dTTP, dCTP)용액을 가한다. 이를 15℃에서 8시간동안 배양한다. 65℃로 10분간 배양하여 반응을 종결시킨다.

(d) 결찰혼합물의 형질전환 : 결찰혼합물을 TE로 1 : 20 및 1 : 200으로 희석시킨다. 상기의 희석용액 각 1㎕ 및 5㎕를 사용하여 0.2ml의 이.콜라이 JM 101적응 세포에 형질전환시킨다[참조:J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 21-78(1983)]. 36개의 플라그를 선택하여 PEG침전에 의해 파지를 단리시키고 50㎕의 TE(0.1 내지 0.16 ㎍/㎕)에 재용해시킨다.

(e) 파지의 스크리닝 : 2㎕의 파지 DNA를 무수 셀룰로오스지 상에 찍는다(Millipore S. A., Cat. No. HAWPO 90, 기공크기 0.45㎛). 공기중에서 건조시킨 후, 이 여과지를 진공중 80℃에서 2시간동안 굽는다. 여과지를 5m㎕의 6×SSC, 10×Denhardt's(0.2% BSA, 0.2% 폴리비닐 피롤리돈, 0.2% Ficoll), 0.2% SDS를 사용하여 열차단용기에서 1시간동안 67℃의 온도에서 전혼성화시킨다. 여과지를 꺼내어 50ml의 6×SSC로 실온에서 1분동안 세척한다. 여과지를 밀봉 용기에 넣는다. 3ml의 6×SSC, 10×Denhardt's 및 10㎕³²D-표지된 돌연변이성 프라이머 I(5×10⁶cpm)을 가한다. 상기 용기를 1시간 동안 실온에 놓아둔다. 여과지를 꺼내어 실온에서 총 1시간동안 6×SSC(50ml×3)로 세척한다. 여과지를 동정스크린으로 -70℃에서 1시간동안 자동방사그래피한다. 여과지를 60℃에서 6×SSC(50ml)로 세척하고 동정스크린을 사용하여 1시간동안 -70℃에서 자동방사그래피한다. 여과지를 60℃에서 6×SSC(50ml)로 세척하고 -70℃에서 2시간동안 동정스크린으로 자동방사그래피한다. 60℃에서 여과지를 세척하면 초기의 스크리닝후 돌연변이화한 다섯 개의 클론이 발견된다.

(f) 서열화 : AAC 코든(Asn 119)에 대한 AGC 코돈(Ser 119)의 돌연변이화는 쇄 종결방법을 사용하여 서열화 프라이머 I으로 DNA서열을 측정하여 하나의 양성 클론에 대해 확인한다[참조: F. Sanger, S. Nickler and A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467(1977)]. DNA 서열에서의 돌연변이는 성숙한 t-PA의 아미노산 119위치에서 Ser→ Asn의 변화를 생성시킨다[Asn 119]-t-PA).

(g) 플라그 정제 : 양성 클론 분해된 p8A-7MO1을 플라그 정제한다 : 파지 주(Stock)를 희석시키고(1 : 10⁷, 1 : 10⁸, 1 : 10⁹), YT플레이트상에 도포한 다음 37℃에서 밤새 배양한다. 그 다음, 플라그를 선택하고 파지를 단리한 다음,³²P-돌연변이성 프라이머 I로 스크리닝한다. 10개의 파지이외의 7개로부터의 DNA는 원하는 돌연변이화가 이루어졌다(참조 : 제2도). 이들중 하나에서 p8A-7-MO1, RF-DNA를 제조하여 pJDB207에 클로닝용으로 사용한다.

[실시예 3]

일본쇄 p8A-7을 사용하여 Asn 184에서 제 2 글리코실화부위의 돌연변이

프라이머 II의 포스포릴화, 어니일링, 연장-결차 및 형질전환은 실시예 2에서와 같이 수행한다. 36개의 플라그를 선택하여, 파지를³²p-표지된 돌연변이성 프라이머 II로 스크리닝한다. 여과지를 세척하는 온도 ; 실온, 50℃ 및 60℃에서 세척한다. 60℃세척으로 4개의 돌연변이성 클론이 나타난다. 하나의 클론으로부터의 DNA를 제 2 글리코실화 부위에서 돌연변이를 확인하는 서열화 프라이머 II로 서열화한다(제2도). 상기 클론에서의 파지를 플라그 정제하고 양성 돌연변이에 대해 스크리닝한다. 양성 클론중 하나를 p8A-7MO2라 칭한다. 돌연변이는 성숙 t-PA의 186위치에서 Ser-Ala 변화를 생성하도록 코돈 TCA(Ser 186)을 GtCA(Ala 186)으로 전환시킨다([Ala 186]-t-PA).

[실시예 4]

일본쇄 돌연변이된 p8A-7MO1을 사용하는 Asn 184에서 제 2 의 글리코실화 부위의 돌연변이

일본쇄 p8A-7MO1 및 돌연변이성 프라이머 II를 사용하여 실시예 2의 과정을 반복한다. 플라그 정제 및 스크리닝한 후, 양성 클론중 하나를 p8A-7MO21로 칭한다. 이 클론의 DNA를 서열화 프라이머 I 및 II를 사용하여 서열화한다. 글리코실화 부위 117 및 184에서의 돌연변이를 확인한다(제2도). DNA에 있는 두 돌연변이의 조합은 119 및 186위치에 두 아미노산 변화를 갖는 돌연변이체 t-PA 분자를 생성시킨다([Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶]-t-PA).

[실시예 5]

일본쇄 돌연변이된 p8A-7-MO21을 사용하여 Asn 448에서 네 번째 글리코실화 부위의 돌연변이(첫번째 구성)

일본쇄 돌연변이된 p8A-7-MO21 및 돌연변이성 프라이머 IV를 사용하여 실시예 2의 과정을 반복한다. 여과지 세척온도는 실온, 50℃, 60℃ 및 68℃이다. 68℃ 세척으로 양성 클론을 확인한다. 상기 양성 클론중 하나를 플라그 정제하여 p8A-7-MO421로 칭한다. 이 클론의 DNA를 117.184 및 448 글리코실화 부위에서의 돌연변이를 확인하는 서열화 프라이머 I, II 및 IV로 서열분석한다(제2도). DNA 상에 세 개의 돌연변이를 갖는 생성 돌연변이 t-PA 분자는 119,186 및 450 위치에서 아미노산 교환을 갖는다([Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶,Asn⁴⁵⁰]-t-PA). 상기 돌연변이체에서 새로운 글리코실화 부위는 Thr⁴⁵⁰을 Asn으로 치환함에 의해 네 번째 부위로 생성된다.

[실시예 6]

일본쇄 돌연변이된 p8A-7-MO21를 사용하여 Asn 448에서 네 번째 글리코실화 부위의 돌연변이(두번째 구성)

일본쇄 p8A-7-MO21 및 돌연변이성 프라이머 IV-1을 사용하여 실시예 2의 과정을 반복한다. 여과지 세척온도는 6×SSC 중 실온, 50℃ 및 60℃이다. 프라그 정제후 양성 클론중 하나를 단리하여 p8A-7-MO421(1)으로 칭한다. 이 클론에서의 DNA는 글리코실화 부위 117,184 및 448에서 돌연변이를 확인하는 서열화 프라이머 I,II 및 IV V로 서열화된다(제2도). DNA 상에 세 개의 돌연변이를 갖는 생성 돌연변이체 t-PA 분자는 119,186 및 450위치에 세 개의 아미노산이 교환된다([Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶,Ala⁴⁵⁰]-t-PA).

[실시예 7]

일본쇄 돌연변이된 p8A-7-MO421(1)을 사용하는 Asn 218에서 세 번째 글리코실화 부위의 돌연변이

일본쇄 p8A-7-MO421(1) 및 돌연변이성 프라이머 III을 사용하여 실시예 2의 과정을 반복한다. 여과지 세척온도는 실온, 50℃ 및 60℃이다. 60℃ 세척으로 양성 클론이 확인된다. 프라그 정제후, 양성 클론 중 하나를 단리하여 p8A-7MO4321(1)로 나타낸다. 이 클론에서의 DNA를 서열화 프라이머 I 내지 IV로 서열화한다. 글리코실화 부위 117,184,218 및 448에서의 돌연변이를 확인한다(제2도). DNA 상에 네 개의 돌연변이는 119,186,220 및 450 위치에 네개의 아미노산 교환을 갖는 돌연변이 t-PA를 생성시킨다([Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶,Asn²²⁰,Ala⁴⁵⁰]-t-PA).

[실시예 8]

pJDB 207 내로 돌연변이된 t-PA 유전자 삽입물의 클로닝

(a) RF-DNA의 제조 : RF-DNA는 급속 DNA 단리법에 의해 p8A-7-MO1, p8A-7-MO2, p8A-7-MO21, p8A-7-MO421, p8A-7-MO421(1) 및 p8A-7-MO4321(1)에 대해 제조된다[참조: D.S.Holmes 및 M.Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197(1981)].

(b) 삽입물의 단리 : 여섯 개의 RF-DNAs(0.5㎍)을 50㎕의 10mM Tris. HCl pH 7.5, 6mM MgCl₂, 100mM NaCl, 6mM 머캅토 에탄올 중 37℃에서 1시간 동안 16U의 Bam HI 및 20U의 Hind III로 분해한다. 2㎕의 RNase(Serva, 1mg/ml)을 가한 후, 37℃에서 5분간 배양한다. 2.3Kb 삽입물을 0.8% 표본 아가로스겔상에서 단리한다. DNA를 전기용출로 용출시키고 침전시킨 후 5㎕의 TE(46.8fmoles/㎕)에 용해시킨다.

(c) 3㎍의 pJDB 207을 Bam HI 및 Hind III 절단하고, 6.6Kb 벡터를 단리한다. 전기용출 및 침전시킨 후, DNA을 20㎕의 TE(35fmoles/㎕)에 재용해시킨다.

(d) 140fmoles의 pJDB 207 Bam HI-Hind III 절단 벡터와, 234fmoles의 Bam HI-Hind III 돌연변이된 t-PA 삽입물을 20㎕의 50mM Tris HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 2mM ATP, 1㎍ 젤타틴 중에서 400U의 T4 DNA 리가제를 사용하여 16시간 동안 15℃에서 결찰시킨다. 10분간 65℃에서 배양하여 반응을 종결시킨다. 2㎕ 및 5㎕의 상기 결찰혼합물을 사용하여 이.콜라이 HB101 Ca⁺⁺세포에 형질전환시킨다[M.Dagert 및 S.D.Ehrlich, Gene, 6, 23-28(1979)]. 6amp^R콜로니를 여섯가지 결찰혼합물 각각으로부터 선택한다. DNA를 급속 단리법으로 제조한다. Bam HI-Hind III 및 Pst I을 사용한 DNA 분석에 의해 정확한 크기의 밴드가 관찰된다. 다섯가지 결찰물 각각으로부터의 한 클론을 100㎍/㎖의 암파실린을 함유하는 100ml LB 배지에서 성장시킨다. p8A-7-MO1, p8A-7-MO2, p8A-7-MO21, p8A-7-MO421, p8A-7-MO421(1) 및 p8A-7-MO4321(1)에서 유도된 플라스미드 DNA를 단리하고 각각 pJDB 207/PH05-TPA18-MO1, pJDB207/PH05-TPA18-MO2, pJDB207/PH05-TPA18-MO21, pJDB207/PH05-TPA18-MO421, pJDB207/PH05-TPA18-MO421(1) 및 pJDB207/PH05-TPA18-MO4321(1)로 칭한다.

[실시예 9]

pH 05프로모터, 전화효소 시그널 서열 및 tPA코딩 영역을 함유하는 효모 발현 벡터의 구성

(A) 전화효소 시그널 서열을 위한 올리고데옥시리보누클레오티드이 합성

네가지 올리고데옥시리누클레오티드 : I-1, I-2, I-3 및 I-4는 DNA 합성기(Model 38OB Applied Biosytems)로 합성한다. 탈보호시킨후, 합성단편을 8M 요소를 함유하는 12% 폴리아크릴아미드겔상에서 정제한다. Sep Pak(Waters Associates)를 사용하여 염이 없는 순수한 올리고데옥시리보누클레오티드를 수득한다. 상기 단편은 때때로 사용된 효모 코돈으로 전화효소 시그널 서열을 코드화하는 이중구조로 구성된다.

(B) 플라스미드 p31에 전화효소 시그널 서열의 서브클로닝

(a) 벡터의 제조 : 1.5㎍의 p31R/SS-TPA△2[참조, 유럽 특허원 제143,081호]를 50㎕의 10mM Tris. HCl pH 7.5, 6mM MgCl₂, 100mM NaCl, 100Mm 머캅토 에탄올 중에서 1시간 동안 37℃에서 10U의 EcoRI(Boehringer)로 분해한다. 1㎕의 2.5M NaCl을 가한 후, 10U의 XhoI(Beohringer)을 가하고 37℃에서 1시간동안 배양한다. 4.2Kb 벡터를 0.8%표본 아가로스겔상에서 단리한다. 겔조각을 마이크로 콜로이돈(Micro Colloidon) 튜브(Sartorius GmbH)로 이동시키고, 200㎕의 TE로 전환시킨 다음 전기용출(90mA에서 50분간 전기영동)시킨다. TE 용액을 수집하여 0.1 용적의 10xTEN를 가한 후, 2.5 용적의 무수에탄올중에서 침전시킨다. DNA 펠렛을 냉 80% 에탄올로 세척하고 진공중에서 건조시킨다. DNA를 6㎕ TE(40pmoles/㎕)에 재현탁시킨다.

(b) 올리고데옥시리보누클레오티드(I-1, I-2, I-3, I-4)어니일링, 활성화(Kination) 및 벡터와 결찰

10㎕의 0.5Tris HCl pH 8중의 네가지 데옥시리보누클레오티드 각각 10pmoles을 함유하는 용액을 수조에서 5분간 95℃에서 배양한다. 수조를 5시간동안 서서히 30℃까지 냉각시킨다. 상기의 어니일된 혼합물에 0.1M MgCl₂, 0.1M NaCl, 30mnM DTT, 4mM ATP 및 8U(1㎕)의 폴리누클레오티드 키나제(Beohringer) 각 2㎕를 가한다. 활성화(Kination)는 37도에서 1시간 동안 수행한다. 어니일되고 활성화된 올리고데옥시리보누클레오티드 및 60pmoles의 p31R/SS-TPA△2 EcoRI-XhOI 절단 벡터(1.5㎕)를 14℃에서 17시간 동안 400U(1㎕)의 T4 DNA 리가제(Biolabs)와 결찰시킨다. 65℃에서 10분간 배양하여 반응을 종결시킨다. 상기 결찰 혼합물 10㎕로 이.콜라이 HB101 Ca⁺⁺세포를 형질전환시킨다[M.Dagert 및 S.D.Ehrlich, Gene 56, 3-28(1979)]. 20amp^R콜로니를 선택한다. DNA는 금속 단리법에 의해 제조된다[D.S.Holmes 및 M.Quigley.Anal.Biochem 114, 193-197(1981)]. DNA를 EcoRI 및 XhoI으로 분해하고, EcoRI 말단에서 방사표지한 다음 마커로서 방사표시된 pBR322 Hae III절단 DNA를 사용하여 8M 요소를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석한다. 정확한 크기의 밴드가 모든 20클론에서 수득된 DNA에서 관찰된다. 한 클론을 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 100mlLB 배지에서 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 단리하여 p31RIT-12로 칭한다.

(C) pJDB207/PH05-I-TPA의 구성

(a) 벡터의 제조: 3㎍의 pJDB207/PH05-TPA 18(유럽 특허원 제143,081호)를 50㎕의 10mM Tris HCl pH 7.5, 6mM MgCl₂, 100mM NaCl, 6mM 머캅토 에탄올 중에서 10U의 Bam HI과 함께 37℃에서 1시간동안 배양한다. 일정량으로 TBE 완충액중 1% 아가로스겔상에서 검사하여 완전히 분해됨을 확인한다. 분해는 65℃에서 10분간 배양하여 수행된다. 그 다음 0.5㎕의 5M NaCl을 가한 다음 15U의 XhoI(Beohringer)을 가한다. 이를 37℃에서 1시간동안 배양한다. 6.8Kb 벡터를 0.8% 표본 아가로스겔상에서 단리한다. DNA를 전기 용출하여 추출하고 침전시킨 후 TE에 용해시킨다.

(b) p31/PH05-TPA 18의 XhoI 분해

30㎍의 p31/PH05-TPA 18(유럽 특허원 제143,081호)를 37℃에서 1시간 동안 200㎕의 10mM Tris HCl pH 8, 6mM MgCl₂, 150mM NaCl, 6mM 머캅토에탄올 중에서 60U의 XhoI(15U/㎕)와 함께 배양한 다음 동일 용적의 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올에서 침전시킨다.

(c) XhoI 절단 p31/PH05-TPA 18의 부분적 PstI 분해

침전된 XhoI 절단 p31/PH05-TPA 18 DNA를 250㎕의 100mM Tris HCl pH 7.5, 6mM MgCl₂, 50mM NaCl, 6mM 머캅토 에탄올, 2.5mg의 에티듐 브로마이드 중에 재현탁시키고, 37℃에서 35분간 22.5U의 PstI과 함께 배양하고, 동일 용적의 페놀로 추출한 다음 동일 용적의 클로로포름-이소아밀알코올(50 : 1)로 추출한다. 1.6Kb의 단편을 1% 표본 아가로스겔상에서 단리한다. DNA를 전기용출하여 추출하고 침전시킨다[삽입물 1]

(d) p31 RIT-12의 SalI-XhoI 분해

30㎍의 p31 RIT-12를 200㎕의 10mM Tris HCl pH8, 6mM MgCl₂, 150mM NaCl, 6mM 머캅토 에탄올 중 60U의 SalI(Beohringer 12U/㎕) 및 60U의 XhoI(15U/㎕)와 함께 1시간동안 37℃에서 배양한 다음 동일 용적의 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올에서 침전시킨다. 869bp 단편을 1.2% 표본 아가로스겔상에서 단리한다. DNA를 전기용출로 추출하고 DE-52상에서 탈염시킨 다음 에탄올에서 침전시킨다.

(e) SalI-XhoI 절단 p31 RIT-12의 분해

SalI-XhoI 절단 p31 RIT-12를 100㎕의 6mM Tris HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 50mM NaCl, 1mM 디티오트레이톨, 10mg의 소의 혈청알부민중에 재현탁시킨 다음 6U의 HgaI(Biolabs, 0.5U/㎕)와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양한다. 600bp 단편을 1.2% 아가로스겔 상에서 단리한다. DNA를 전기용출로 추출하고 에탄올에서 침전시킨다.

(f) 링커 올리고누클레오티드의 어니일링

서열을 갖는 두 개의 올리고데옥시리보누클레오티드 90pmoles을 실리콘화 에펜도르프(Eppendorf) 튜브내의 10㎕의 0.5mM Tris HCl pH 8에 현탁시킨다. 용액을 95℃에서 5분간 배양시킨 후 실온까지 밤새 서서히 냉각시킨다.

(g) 링커의 활성화(Kination)

상기 용액에 2㎕의 0.1M KCl, 2㎕의 0.1M MgCl₂, 3㎕의 30mM DTT, 1㎕의 200mM ATP, 8U의 폴리누클레오티드 키나제(80U/㎕)를 가한다. 이를 37℃에서 1시간 동안 배양한다.

(h) 활성화된 링커와 p31RIT-12의 HgaI 단편의 연결

활성화 링커용액을 건조시킨 HgaI 단편을 함유하는 튜브로 옮긴 다음 400U의 T4 DNA 리가제를 가한다. 이 용액을 실온(21 내지 22℃)에서 90분 동안 배양하고, TE 100㎕까지 희석시킨 다음, 동일 용적의 페놀-클로로포름으로 추출한다. 실온에서 수성용액에 0.6 용적의 이소프로판올 및 0.1 용적의 3M 나트륨 아세테이트를 가하여, 단편을 침전시킨다.

(i) 상기의 BamHI-PstI 분해

상기의 건조시킨 DNA를 20㎕의 10mM Tris HCl pH 7.5, 100mM MgCl₂, 6mM 머캅토에탄올 중 37℃에서 1시간 동안 10U의 BamHI 및 10U의 PstI로 분해한다. 100㎕까지 희석시킨 후, 이 용액을 동일 용적의 페놀-클로로포름으로 추출하고 수성층을 이소프로판올에서 침전시킨다.

[삽입물 2]

(j) 세가지 단편의 결찰

100pmoles의 pJDB207/PH05-TPA 18 BamHI-XhoI 절단벡터 단편과 200pmoles의 각각의 다른 두 삽입물 단편[1 및 2]를 10㎕의 50mM Tris HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 2mM ATP, 0.5㎍ 젤라틴 중에서 400U의 T4 DNA리가제를 사용하여 16시간 동안 15℃에서 결찰시킨다. 65℃에서 10분간 배양하고 반응을 종결시킨다. 5㎕의 상기 결찰혼합물을 사용하여 이.콜라이 HB 101 Ca⁺⁺세포를 형질전환시킨다. 10amp^R콜로니를 선택하여 DNA를 급속 단리법으로 제조한다. EcoRI, PstI 및 BamHI-Hind III로 분석하면 정확한 크기의 단편이 관찰된다. 하나의 콜로니를 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 100ml의 LB 배지에서 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 단리하고 pJDB207/PH05-I-TPA로 칭한다.

[실시예 10]

PH 05 프로모터, PH 05 시그널 서열 또는 전화효소 시그널 서열 및 제거된 네 번째 글리코실화 부위만을 갖는 t-PA 코딩 영역을 함유하는 효모 발현 벡터의 구성

플라스미드 pJDB207의 BamHI-Hind III 벡터 단편을 pJDB207/PH05-TPA 또는 pJDB207/PH05-TPA 18에서 수득된 BamHI-ScaI 단편 및 pJDB207/PH05-I-JPA 18-MO421(1)에서 수득된 ScaI-Hind III 단편과 연결한다.

(a) 벡터의 제조 : 3㎍의 pJDB207을 BamHI 및 Hind III로 절단하고 6.6Kb 벡터를 단리한다. 전기용출 후, DNA를 에탄올에서 침전시킨다.

(b) pJDB207/PH05-TPA-18-MO421(1)의 ScaI-Hind III 분해

1.5㎍의 플라스미드 DNA를 20㎕의 10mM Tris- HCl pH 7.5, 6mM MgCl₂, 50mM NaCl, 6mM 머캅토에탄올 중 37℃에서 1시간 동안 7U의 ScaI(Boehringer) 및 6U의 Hind III로 분해한다. 페놀화시킨 후, 에탄올중에서 침전시키고 987bp 단편을 1.2% 표본 아가로스겔상에서 단리한다(삽입물 1).

(c) pJDB207/PH05-TPA 18 및 pJDB207/PH05-I-TPA의 BamHI-ScaI 분해

1.5㎍의 두플라스미드 DNA를 20㎕의 10mM Tris HCl pH 7.5, 6mM MgCl₂, 6mM 머캅토에탄올 중 37℃에서 1시간 동안 7U의 BamHI 및 7U의 ScaI으로 분해한다. 페놀화시킨 후, 에탄올중에서 침전시키고 1300bp 단편을 1.2% 표본 아가로스 겔 상에서 단리한다(삽입물 2).

(d) 세 단편의 결찰

100pmoles의 pJDB207/PH05-TPA 18 BamHI-Hind III 절단벡터 단편과 200pmoles의 각각의 다른 두 삽입물 단편[1 및 2]를 10㎕의 50mM Tris HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 2mM ATP, 0.5㎍ 젤라틴 중에서 400U의 T4 DNA리가제로 16시간 동안 15℃에서 결찰시킨다. 65℃에서 10분간 배양하여 반응을 종결시킨다. 5㎕의 상기 결찰혼합물을 사용하여 이.콜라이 HB 101 Ca⁺⁺세포를 형질전환시킨다. 10amp^R콜로니를 선택하여 DNA를 급속 단리법에 의해 제조한다. EcoRI, pstI 및 BamHI-Hind III로 분석하면 정확한 크기의 단편이 관찰된다. 각 두 개의 구성체 중 한 클론을 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 100ml의 LB에서 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 단리하여 pJDB 207/PH O5-TPA18-MO4 및 pJDB 207/PH O5-I-TPA-MO4로 칭한다.

[실시예 11]

PH O5 프로모터 및 전화효소 시그널 서열을 함유하는 효모 발현 벡터에 돌연변이된 t-PA 유전자 삽입물의 클로닝

플라스미드 pJDB 207의 BamHI-Hind III 벡터 단편을 pJDB 207/PH O5-I-TPA로부터 수득한 BamHI-Nar I 단편 및 돌연변이된 t-PA 유전자에게 수득한 Nar I-Hind III 단편과 결찰시킨다.

(a) RF DNA의 제조

RF-DNA는 p8A-7 MO1, p8A-7-MO2, p8A-7-MO21, p8A-7-MO421, p8A-7-MO421(1) 및 p8A-7-MO24321(1)를 위해 제조한다.

(b) 돌연변이된 tPA 유전자로부터 Nar I-Hind III 삽입물의 단리

여섯가지의 RF-DNAs(1㎍)을 각각 20㎕의 10mM Tris HCl pH 7.5, 6mM MgCl₂, 6mM 머캅토에탄올 중에서 6U의 NarI(Biolabs)으로 37℃에서 1시간 동안 분해한다. 분해물을 65℃에서 10분간 배양한 다음 1㎕의 1M NaCl을 가하고 이어서 6U의 Hind III를 가한다. 15분간 37℃에서 페놀화시킨 후, DNA를 에탄올에서 침전시킨다. 1450bp DNA 단편을 1.2% 표본 아가로스 겔 상에서 단리한다. DNA를 전기용출로 추출하고 에탄올에서 침전시킨다(삽입물 1).

(c) Bam HI-Nar I삽입물의 단리

3㎍의 pJDB 207/PH O5-I-TPA를 20㎕의 10mM Tris HCl pH 7.5, 6mM MgCl₂, 6mM 머캅토에탄올 중 37℃에서 1시간 동안 6U의 Nar I으로 분해한다. 그다음 2㎕의 1M NaCl을 가하고 6U의 BamHI을 가한다. 37℃에서 1시간 동안 배양하고 페놀화시킨 후, 에탄올에서 DNA를 침전시킨다. 930 bp DNA 단편을 1.2% 표본 아가로스 겔 상에서 단리한다. DNA를 전기용출로 추출하고, 에탄올에서 침전시킨다(삽입물 2).

(d) 벡터의 제조

3㎍의 pJDB 207을 BamHI 및 Hind III로 절단하고, 6.6kb 벡터를 단리한다. 전기용출한 후, DNA를 에탄올에서 침전시킨다.

(e) 세 단편의 결찰

100pmoles의 pJDB 207/PH 05-TPA 18 BamHI-Hind III 절단벡터 단편과 각 200pmoles의 다른 두 삽입물 단편(1 및 2)를 10㎕의 50mM. Tris HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 2mM ATP, 0.5㎍ 젤라틴 중에서 400U의 T4 DNA리가제로 16시간 동안 15℃에서 결찰시킨다. 65℃에서 10분간 배양하여 반응을 종결시킨다. 5㎕의 상기 연결 혼합물을 사용하여 이.콜라이 HB 101 Ca⁺⁺세포를 형질전환시킨다. 10amp^R콜로니를 선택하여 급속 단리법에 의해 DNA를 제조한다. EcoRI, PstI 및 BamHI-Hind III로 분석하면 정확한 크기의 단편이 관찰된다. 각 가 여섯가지의 구성체로부터 한 클론을 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 100ml의 LB 배지에서 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 단리하여 각각 pJDB 207/PHO5-I-TPA_MO1, pJDB 207/PHO5-I-TPA_MO2, pJDB 207/PHO5-I-TPA-MO21, pJDB 207/PHO5-I-TPA_MO421, pJDB 207/PHO5-I-TPA-MO421(1) 및 pJDB 207/PHO5-I-TPA-MO4321(1)로 나타낸다.

[실시예 12]

사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces Cerevisiae) GRF 18의 형질전환

플라스미드 pJDB 207/PH O5-TPA 18-MO1, pJDB 207/PH O5-TPA 18-MO02, pJDB 207/PH 05-TPA 18-MO4, pJDB 207/PH 05-TPA 18-MO21, pJDB 207/PH 5-TPA 18-MO4321(1), pJDB 207/PH O5-I-TPA-MO1, pJDB 207/PH O5-I-TPA-MO2, pJDB 207/PH 05-I-TPA-MO4, pJDB 207/PH O5-I-TPA-MO21, pJDB 207/PH 05-I-TPA-MO421, pJDB 207/PH O5-I-TPA-MO421(1) 및 pJDB 207/PH 05-I-TPA-MO4321(1)를 문헌의 형질전환 방법에 따라 사카로마이세스 세레비시애 균주 GRF 18(α, his-3-11, his-3-15, lue 2-3, leu 2-211, Com^R)에 도입시킨다[Hinnen et al., Proc. Natl. Acad Scic. USA, 75, 1929(1978)]. 각 5㎍의 플라스미드 DNA를 100㎕의 스페로플라스트(spheroplast) 현탁액에 가하고, 혼합물을 폴리에틸렌 글리콜로 처리한다. 스페로플라스트를 10ml의 재생아가와 혼합하고 로이신이 결합된 효모 최소 배지 플레이트에 도포한다. 3일간 30℃에서 배양하면 약 200개의 형질전환된 세포가 발견된다.

효모 형질전환체 각각으로부터 한 콜로니를 선택한다. 이들 콜로니를 다음과 같이 나타낸다.

[실시예 13]

사카로마이세스 세레비시애 균주 HT 246의 형질전환

에스. 세레비시애 균주 HT 246은 프로테아제 B활성이 결핍된 돌연변이체 에스. 세레비시애 균주 HT232[D.H. Wolf et al., G.N. Cohen 및 H. Holzer(editors), Limited Proteolysis in Microorganism, Conference report Betheda 1978, p61] 및 에스. 세레비시애 H 423(유럽 특허원 제143,081호)의 반복된 백크로싱(backcrossing)에 의해 수득한다. 에스. 세레비시애 HT 246은 로이신 크로마토그래피를 위해 선택하는 힌넨(Hinnen)등의 형질전환 방법을 사용하여 플라스미드

pJDB207/PH O5-TPA18-MO1, pJDB207/PH O5-TPA18-MO2,

pJDB207/PH O5-TPA18-MO4, pJDB207/PH O5-TPA18-MO21,

pJDB207/PH O5-TPA18-MO421, pJDB207/PH O5-TPA18-MO421(1),

pJDB207/PH O5-TPA18-MO4321(1), pJDB207/PH O5-TPA18-MO1,

pJDB207/PH O5-TPA18-MO2, pJDB207/PH O5-TPA18-MO4,

pJDB207/PH O5-TPA18-MO1, pJDB207/PH O5-TPA18-MO4,

pJDB207/PH O5-TPA18-MO421(1) 및 pJDB207/PH O5-TPA18-MO421로 형질전환시킨다

(실시예 12와 비교) 각 하나의 클론을 선택하여 나타낸다.

[실시예 14]

효모 세포 추출물의 제조 및 t-PA활성의 측정

효모세포를 50ml들이 삼각 플라스크내에서 20ml의 HE-17 배지 [용액 1ℓ당 18.4g 효모 질소기재(Difco), 10g의 L-아스파라긴(Sigma), 1g의 L-히스티딘(Sigma), 40ml의 50% 글루코스]중 30℃에서 24시간동안 진탕시키며 밀도가 8 내지 10×10⁷세포/ml에 도달될 때까지 성장시킨다. 세포를 원심분리하고, 10ml의 0.9% NaCl에 재현탁시킨다. 2ml의 재현탁된 세포를 이용하여 250ml들이 삼각 플라스크에서 10g/l의 L-아스파라긴(Sigma), 및 10g/l의 L-히스티딘(Sigma)를 가한 50ml의 저-Pi 최소 배지(유럽특허원 제143081호에 기재되어 있음)에 접종시킨다. 30℃, 250rpm에서 배양한다.

10ml의 저 Pi 최소 배지로부터의 세포를 팔콘(falcon) 2070튜브에서 10분간 3000rpm으로 원심분리하여 24 및 48시간 후 수집한다. 세포를 10ml의 저 Pi 배지로 1회 세척하고 원심분리한다. 세포 펄렛을 용해 완충액 [66mM 인산나트륨 pH 7.4, 4mM Zwittergent (Calbiochem)]중에 현탁시킨다. 세포 현탁액에 8g의 유리비드(0.5 내지 0.75mm 직경) 및 작은 유리봉을 가하고 현탁액을 보르텍스(Vortex) 혼합기(Scientific Instrument Inc. USA)에서 어름상에 2분의 간격을 갖고 4x2분간 최대 속도로 진탕시킨다. 이 방법으로 90% 이상의 세포가 파괴된다. 4℃ 5분간 3000rpm으로 원심분리하여 세포 조작 및 유리비드를 침전시킨다. 상등액을 에펜도르프 튜브에 옭긴다.

t-PA활성은 제이. 에이취, 배르헤옌(J. H. Verheijen)등의 방법인 비색분석법으로 측정한다 [참조 : Thromb, Haemost, 48,266(1982)].

수득된 결과는 표 1에 수록하였다.

[표 1]

[실시예 15]

형질전환된 효모 균주의 3ℓ의 규모 발효

모든 형질전환체는 다음 조성(수치는 g/l이다)의 배지 중 액화질소 온도(기상)로 유지한다.

각 형질전환된 에스. 세레비시애 균주를 3ℓ규모로 발효시키기 위해, 두가지 전 배양물을 제조한다. 아가 경사상에서 신선한 성장 배지의 세포 1루프(loop)를 효모 질소 배지(Difco 0919-15) 8.4g/l, L-아스파라긴 10g/l, L-히스티딘 1g/l 및 글루코스 20g/l로 구성되는 50ml의 전배양 배지에 접종한 다음 30℃ 180rpm에서 48시간 동안 배양한다. 10%의 제 1 전배양물을 제 2 전배양물에 접종하고 24시간 동안 배양한다.

제 2 전배양물을 원심분리하고, 세포를 0.9% NaCl에 재현탁시킨 다음 다음의 조성(g/l)을 갖는 3ℓ 발효배지에 접종하여 0.2의 광학밀도(OD₆₀₀)을 수득한다.

발효는 3ℓ들이 MBR 생체반응기(MBR Bio Reactor AG, Wetzikon, Switzerland) 내에서 30℃, 500rev/분의 진탕속도 150l/h의 교반속도 조건하에 수행한다. 48시간 후, 광학밀도는 약 12에 도달한다. 배양영양배지를 4℃로 냉각시키고 원심분리하여, 세포펠렛을 50mM 인산염-완충액 pH 7.4증 4mM Zwittergent 9-14(Calbiochem)으로 구성되는 150ml의 파손 완충액에 재현탁시킨다.

150g의 유리비드(직경 0.5mm)을 가하고, 세포를 30분간 다중-튜브 보르텍서(Scientific manufacturing industris, USA)에 5회 적용시켜 파괴한다.

[실시예 16]

생성된 돌연변이체 t-PA의 정제

파괴된 세포 현탁액(실시예 14참조)를 원심분리하고 상등액에 황산 암모늄이 35% 포화될 때까지 고체 황산암모늄을 가한다. 현탁액을 원심분리하고, 이 펠렛을 0.1% 신페로닉

PE/F 68.5g를 함유하는 0.2M 암모늄 아세테이트에 용해시킨다. 세파로스

4B 비드에 커플링된 5g(젖었을 때의 무게)의 DE-3 억제제를 가하고, 현탁액을 4℃에서 밤새 약하게 진탕시킨다. 용액으로부터 비드를 제거하여, 0.1% 신페로닉

함유하는 0.2M 염화나트륨으로 2회 세척하고 직경 10mm의 컬럼에 채운 다음 0.1% 신페로닉

을 함유하는 10ml의 0.2M 염화나트륨으로 세척하고 이어서 0.1% 신페로닉

함유하는 0.2M 암모늄 아세테이트 중의 0.2M NH₄SCN 10ml로 세척한다. 그 다음, T-PA를 0.1%신페로닉

함유하는 0.2m 암모늄아세테이트 중 0.2M NH₄SC으로 30ml/h의 유속으로 용출시킨다.

가장 높은 섬유소용해(fibrinolytic) 활성을 갖는 분획을 모은다. 돌연변이 t-PA를 약 90% 이상으로 함유하는 푸울을 사용하여 특성화 연구 및 생물학적 분석을 수행한다.

[실시예 17]

돌연변이체 t-PA의 활성의 생물학적 분석

플라스미드 pJDB 207/PH O5-TPA 18-MO1, 207/PH O5-TPA 18-MO2, pJDB 207/PH O5-TPA 18-MO4, pJDB 207 /PH O5-TPA 18-MO21, pJDB 207/PH O5-TPA 18-MO421, pJDB 207/PH O5-TPA 18-MO421(1), pJDB 207/PH O5-I-TPA-MO1, pJDB 207/PH O5-I-TPA-MO2, pJDB 207/PH 05-I-TPA 18-MO421 및 pJDB 207/PH O5-I-TPA-MO421(1)를 에스. 세레비시애 균주 HT 246에서 발현시킨 결과 생물학적으로 활성인 돌연변이체 : t-PAS, 즉 [Asn¹¹⁹]-t-PA, [Ala¹⁸⁶]-t-PA, [Ala⁴⁵⁰]-t-PA, [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶]-t-PA, [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶, Asn⁴⁵⁰]-t-PA, 및 [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶, Ala⁴⁵⁰]-t-PA가 생성되며, 이의 활성은 효모 야생형 t-PA의 활성과 유사하거나 월등하다. 모든 돌연변이체 t-PA는 카세인 플레이트 및 피브린 플레이트 상에서 [참조; J. Jespersen et al., Haemostasis 18, 301(1983)] 제이. 에이취, 베르헤옌 등의 비색분석법 [Thromb. Haemost, 48,266(1982)] 및 기질로서 Cbz-Gly-Gly-Arg-AMS를 사용하는 형광분석법[참조 : M. Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,750(1978)]에 의해 활성을 나타낸다.

형광분석법에서, 모든 t-PA용액을 0.01% 트윈 80 및 0.05% HSA를 함유하는 60mM 인산염 완충액 pH 7.4중에서 20FU/ml(0.28㎍/㎖)까지 희석시킨다. 약 90%의 모든 t-PA는 일-쇄 형태로 약 10%는 이-쇄 형태로 존재함이 나타난다. 기본적으로 알.디.필로(R.D. Philo) 및 피.제이. 가프네이(P.J. Gaffney)에 따라 서로 다른 돌연변이 t-PA의 응괴용해활성을 측정하기 위해 시험한다[Thromb. Haemost 45, 107-109(1981)].

용해시간의 로그 대 t-PA농도의 로그의 그래프가 직선을 나타내며 이의 기울기는 가한 플라스미노겐 활성화제의 피브린 특이성의 척도이다. 표준 표본 응괴 용해 I.U./ml와 비교 측정한다. 다른 돌연변이 t-PA와 함께 수득한 결과는 표 3에 나타나 있다.

[Asn¹¹⁹]-t-PA (직선 3) 및 [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶]-t-PA (직선 4)는 대조용의 흑색종의 t-PA (mt-PA, 직선 1)와 거의 같은 기울기를 가지며 시험관 내에서 응괴를 용해시키는 것을 도면으로부터 알 수 있다. 측정된 모든 t-PA는 유사한 피브린 활성을 갖는다. 그러나, [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶, Asn⁴⁵⁰]-t-PA (직선 5)는 흑색종 t-PA, 효모야생형 t-PA(직선 2, 유럽특허원 제 143,081호), [Asn¹¹⁰]-t-PA 및 [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶]-t-PA 보다 약 2배 빠르게 응괴를 용해한다.

상기 분석에서 수득한 활성(I.U./ml)의 비는 표 2에 요약하였다.

[표 2]

VIU=베르예엔(Verjeijen) 등에 의한 I.U.

FU =짐머만(Zimmerman) 등에 의한 형광 측정 단위

CIU=필로(Philo) 등에 의한 응괴용해 I.U.

[실시예 18]

면역검출

t-PA를 함유하는 조 효모 추출물에서 정제한 응괴 용해 활성의 확인은 흑색종 t-PA에 대한 토끼의 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴 반점으로 나타낸다.

약 12FU의 다른 t-PA분자를 환원조건하 12.5%겔을 사용하는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리한다.

그 다음, 단백질을 제조방법에 따라 기본적으로 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴다(Schleicher Schuell, Feldbach, Switzerland). 이전은 2.5시간 동안 40V/cm에서 이전 완충액(g/ℓ : 글리신 14.4 Tris 3, 메탄올 20%)중에서 수행한다. 1시간 동안 3% BSA에서 차폐한 후, 니트로 셀룰로오스를 항체를 사용하여 밤새 배양한다(토끼 혈청, 100㎕ 내지 400ml의 BSA-완충액).

항체-t-PA 복합체를 2시간 동안¹²⁵J-단백질 A(40μci 내지 40ml BSA-완충액)으로 장식한다.

세척한 후, 니트로 셀룰로오스 막을 X-선 필름에 노출시킨다. 그 결과는 제4도를 나타내었다. 모든 돌연변이체 t-PA는 폴리클로날 항체에 의해 검출되고, 글리콜리틱 축쇄에 상응하는 크기로 환원되었다. 각각의 돌연변이체에 대해 분자량으로 약 1KD의 손실을 계수한다.

[실시예 19]

돌연변이체 t-PA의 글리코실화부위

글리코실화는 겔전기영동후¹²⁵J-콘카나발린 A 도금 분석으로 측정한다. 콘카나발린 A는 특히 만노스잔기를 확인하는 식물 레시틴이다. 다시 12FU의 각각의 돌연변이체를 12.5% PAGE에 적용한다. 그 다음, 10가지 단백질을 7% 아세트산 중에 30분 동안 고착시킨다. 그 다음 겔을 다음 조성의 레시틴 완충액에서 세척한다.

pH가 7.3에 도달할때까지 세척한다.

겔을 3mg의 헤모글로빈, 100㎍의 콘카나발린 A 및 2μCi의¹²⁵J-콘카나발린 A를 함유하는 2ml의 레시틴 완충액으로 조심스럽게 입힌다.

습한 장소에서 밤새 배양한 후, 겔을 레시틴 완충액으로 세척하고 건조시킨 다음 X-선 필름에 노출시킨다. 모든 돌연변이 t-PA를¹²⁵J-콘카나발린 A로 염색한다[Asn¹¹⁹,Aia¹⁸⁶,Asn²²⁰,Ala⁴⁵⁰]-t-PA가 레시틴과 약하게라도 반응을 하므로, 상기 돌연변이체는 잔기의 O-연결된 당잔기를 함유한다고 결론 짓는다.

[실시예 20]

비경구 투여용 약제학적 제제

전술한 바와 같이 수득한 일-쇄형, 이-쇄형 또는 이의 혼합물 형태의 [Asn¹¹⁹,Ala¹⁸⁶,Ala⁴⁵⁰]-t-PA를 함유하는 용액을 0.01% 트윈 80

함유하는 0.3M 염화나트륨에 대해 투석한 다음 -80℃에서 저장한다.

투여전, 농도를 75㎍/㎖의 총 t-PA(즉 일쇄+이쇄 t-PA) 및 0.3M NaCl로 조절한다. 이 용액을 0.22㎛막 여과지로 통해 여과시켜 멸균시킨다.

상기 언급한 t-PA 대신 전술한 실시예 설명된 다른 t-PA 즉, [Asn¹¹⁹]-t-PA, [Ala¹⁸⁶]-t-PA, [Ala⁴⁵⁰]-t-PA, [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶]-t-PA 또는 [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶, Asn⁴⁵⁰]-t-PA를 약간만 사용할 수도 있다.

상기 방법은 비경구용, 예를 들어, 정맥내 투여용의 일-쇄 또는 이-쇄형 또는 이의 혼합물 형태의 돌연변이형 t-PA의 용액을 제조하기에 적절하다.

Claims

천연의 N-글리코실화 부위중 하나 또는 그 이상을 이 부위에서 글리코실화가 일어날 수 없도록 변화시킨 돌연변이 t-PA 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 형질전환된 진핵 숙주 유기체, 또는 상기 숙주 유기체의 돌연변이주를 적절한 영양 조건하에서 배양한 다음, 상기 돌연변이 t-PA 단백질을 분리하고, 필요한 경우 수득된 돌연변이 t-PA의 1-체인(Chain) 및 2-체인 형태의 혼합물을 각각의 성분으로 분리하고, 1-체인 형태가 없는 2-체인 형태를 제조하기 위해서는 수득된 t-PA 돌연변이체의 1-체인 형태를 2-체인 형태로 전환시킴을 특징으로 하여, 천연의 N-글리코실화 부위중 하나 또는 그 이상을 이 부위에서 글리코실화가 일어날 수 없도록 변화시킨 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, N-글리코실화 부위에 존재하는 적어도 하나의 Asn 및/또는 Ser(또는 Thr) 잔기를 N-글리코실화를 방지하는 다른 아미노산으로 대체함으로써, 야생형 t-PA와는 다른 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, N-글리코실화 부위에 존재하는 적어도 하나의 Ser(또는 Thr) 잔기를 N-글리코실화를 방지하는 다른 아미노산으로 대체한 돌연변이 t-PA 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 형질전환된 진핵 숙주 유기체, 또는 상기 숙주 유기체의 돌연변이주를 적절한 영양 조건하에서 배양한 다음, 상기 돌연변이 t-PA 단백질을 분리하고, 필요한 경우 수득한 돌연변이 t-PA의 1-체인(Chain) 및 2-체인 형태의 혼합물을 각각의 성분으로 분리하고, 1-체인 형태가 없는 2-체인 형태를 제조하기 위해서는 수득된 t-PA 돌연변이체의 1-체인 형태를 2-체인 형태로 전환시킴을 특징으로 하여, N-글리코실화 부위에 존재하는 적어도 하나의 Ser(또는 Thr) 잔기를 N-글리코실화를 방지하는 다른 아미노산으로 대체함으로써, 야생형 t-PA와는 다른 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 일반식(I)의 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.

상기식에서, A_1-116은 완전 t-PA의 아미노산 1 내지 116으로 이루어진 N-종결 아미노산 서열을 나타내고, A_120-183은 완전 t-PA의 아미노산 120 내지 183으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내며, A_187-217은 완전 t-PA의 아미노산 187 내지 217로 이루어진 아미노산 서열을 나타내며, A_221-447은 완전 t-PA의 아미노산 221 내지 447로 이루어진 아미노산 서열을 나타내며, A_451-527은 완전 t-PA의 아미노산 451 내지 527로 이루어진 C-종결 아미노산 서열을 나타내고, X₁,X₂,X₃및 X₄는 각각 Asn을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 다른 아미노산을 나타내며, Y₁,Y₂및 Y₃는 각각 Ser을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Thr이외의 아미노산을 나타내고, Y₄는 Thr을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Ser이외의 아미노산을 나타내며, 이들 모두는 1-체인 또는 2-체인 형태이고, 단, 기 X₁,X₂,X₃및 X₄중 적어도 하나는 Asn은 아니고/아니거나 기 Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄중 적어도 하나는 Ser 및 Thr은 아니다.
제1항에 있어서, 일반식(I')의 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.

상기 식에서, A_1-116은 완전 t-PA의 아미노산 1 내지 116으로 이루어진 N-종결 아미노산 서열을 나타내고, A_120-183은 완전 t-PA의 아미노산 120 내지 183으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내며, A_187-217은 완전 t-PA의 아미노산 187 내지 217로 이루어진 아미노산 서열을 나타내며, A_221-447은 완전 t-PA의 아미노산 221 내지 447으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내며, A_451-527은 완전 t-PA의 아미노산 451 내지 527으로 이루어진 C-종결 아미노산 서열을 나타내고, Y₁,Y₂및 Y₃는 각각 Ser을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Thr이외의 아미노산을 나타내며 Y₄는 Thr을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Ser이외의 아미노산을 나타내며, 단, 기 Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄중 적어도 하나는 Ser 및 Thr은 아니다.
제4항에 있어서, A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같고, 기X₁,X₂,X₃및 X₄중 1개, 2개, 또는 3개는 Asn을 나타내며, 다른 것(들)은 Thr 및 Ser중에서 선택된 아미노산 잔기를 나타내고 Y₁,Y₂및 Y₃중 1개 또는 2개는 Ser을 나타내며, Y₄는 Thr을 나타내거나 ; X₁,X₂,X₃및 X₄는 각각 Asn을 나타내고, Y₁,Y₂및 Y₃는 각각 Ser을 나타내고, Y₄는 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 일반식(I)의 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
제 5 항에 있어서, A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같거나, 기Y₁,Y₂및 Y₃중 1개 또는 2개는 Ser을 나타내며 다른 것(들)은 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, Y₄는 Thr을 나타내거나, 또는 Y₁,Y₂및 Y₃는 각각 Ser을 나타내며, Y₄는 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 일반식(I)의 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
제4항에 있어서, A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같고, X₁,X₂,X₃및 X₄는 각각 Asn을 나타내며, 기 Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄중 적어도 하나는 Ala 또는 Asn을 나타내고 다른 것(들)은 Ser(Y₁,Y₂및 Y₃) 또는 Thr(Y₄)를 나타내는 일반식(I)의 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
제5항에 있어서, A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같고, 기Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄중 적어도 하나는 Ala 또는 Asn을 나타내며 다른 것(들)은 Ser(Y₁,Y₂및 Y₃) 또는 Thr(Y₄)를 나타내는 일반식(I')의 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
제4항에 있어서, A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같고, X₁,X₂,X₃및 X₄는 각각 Asn을 나타내며, Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄는 독립적으로 각각 Ala 또는 Asn으로부터 선택된 아미노산기를 나타내는 일반식(I)의 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
제5항에 있어서, A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같고, 기Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄는 독립적으로 각각 Ala 및 Asn으로 부터 선택된 아미노산기를 나타내는 일반식(I')의 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, [Asn¹¹⁹]-t-PA를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, [Ala¹⁸⁶]-t-PA를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, [Ala⁴⁵⁰]-t-PA를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, [Asn¹¹⁹,Ala¹⁸⁶]-t-PA를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, [Asn¹¹⁹,Ala¹⁸⁶,Asn⁴⁵⁰]-t-PA를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, [Asn¹¹⁹,Ala¹⁸⁶,Ala⁴⁵⁰]-t-PA를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, [Asn¹¹⁹,Ala¹⁸⁶,Asn²²⁰,Ala⁴⁵⁰]-t-PA를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 1-체인 형태의 사람 t-PA 단백질을 제조하는 방법.
N-글리코실화 부위에 존재하는 적어도 하나의 Ser(또는 Thr)잔기를 N-글리코실화를 방지하는 다른 아미노산으로 대체한, 야생형 t-PA와는 다른 사람 t-PA 단백질.
제20항에 있어서, 일반식(I')의 사람 t-PA 단백질

상기식에서, A_1-116은 완전 t-PA의 아미노산 1 내지 116으로 이루어진 N-종결 아미노산 서열을 나타내고, A_120-183은 완전 t-PA의 아미노산 120 내지 183으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내며, A_187-217은 완전 t-PA의 아미노산 187 내지 217으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내며, A_221-447은 완전 t-PA의 아미노산 221 내지 447으로 이루어진 아미노산 서열을 나타내며, A_451-527은 완전 t-PA의 아미노산 451 내지 527으로 이루어진 C-종결 아미노산 서열을 나타내고, Y₁,Y₂및 Y₃는 각각 Ser을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Thr이외의 아미노산을 나타내며 Y₄는 Thr을 나타내거나 또는 유전적으로 암호화된 Ser이외의 아미노산을 나타내며, 단, 기 Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄중 적어도 하나는 Ser 및 Thr은 아니다.
제21항에 있어서, A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같고, 기Y₁,Y₂및 Y₃중 1개 또는 2개는 Ser을 나타내며 다른 것(들)은 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, Y₄는 Thr을 나타내거나, 또는 Y₁,Y₂및 Y₃는 각각 Ser을 나타내며, Y₄는 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 일반식(I')의 사람 t-PA 단백질.
제21항에 있어서, A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같고, 기Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄중 적어도 하나는 Ala 또는 Asn을 나타내며 다른 것(들)은 Ser(Y₁,Y₂및 Y₃) 또는 Thr(Y₄)를 나타내는 일반식(I')의 사람 t-PA 단백질.
제21항에 있어서, A_1-116,A_120-183,A_187-217,A_221-447및 A_451-527이 상기 정의한 바와 같고, Y₁,Y₂,Y₃및 Y₄는 독립적으로 각각 Ala 및 Asn으로부터 선택된 아미노산기를 나타내는 일반식(I')의 사람 t-PA 단백질.
제20항에 있어서, [Asn¹¹⁹]-t-PA, [Ala¹⁸⁶]-t-PA, [Ala⁴⁵⁰]-t-PA, [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶]-t-PA, [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶, Asn⁴⁵⁰]-t-PA, [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶, Ala⁴⁵⁰]-t-PA, 및 [Asn¹¹⁹, Ala¹⁸⁶,Asn²²⁰, Ala⁴⁵⁰]-t-PA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 t-PA 단백질.
제20항에 있어서, 1-체인 형태의 사람 t-PA 단백질.
N-글리코실화를 위한 시그널로서 인지된 트리펩타이드 서열의 부분인 세린 또는 트레오닌을 암호화하는 적어도 하나의 코돈이 N-글리코실화를 위한 인식 부위를 파괴하는 다른 아미노산을 암호화하는 다른 코돈으로 대체된 돌연변이 t-PA 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 갖는 DNA.
제27항에 있어서, 일반식(II')의 서열을 갖는 DNA.

상기식에서, N_1-348은 완전 t-PA에 대한 유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 1 내지 348로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내고, N_358-549은 완전 t-PA에 대한 유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 358 내지 549로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내며, N_559-651은 완전 t-PA에 대한 유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 559 내지 651로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내고, N_661-1341은 완전 t-PA에 대한 유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 661 내지 1341로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내며, N_1351-1581은 완전 t-PA에 대한 유전자의 데옥시리보뉴클레오타이드 1351 내지 1581로 이루어진 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 나타내고, W₁, W₂및 W₃는 각각 Ser을 암호화하거나, 또는 Thr이외의 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 나타내며, W₄는 Thr을 암호호하거나 , 또는 Ser이외의 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 나타내고, 단 코돈, W₁,W₂,W₃및 W₄중 하나는 Ser 및 Thr이외의 아미노산을 암호화한다.
제20항에 따르는 돌연변이 t-PA 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 갖는 DNA.
제20항에 따르는 돌연변이 t-PA 단백질을 약제학적으로 허용하는 담체와 함께 함유하는 약제학적 조성물.
포유동물에게 제20항에 따르는 화합물의 치료적 유효량을 투여함을 특징으로 하여, 포유동물에서 플라스미노겐 활성과 기전을 통해 국소적인 섬유소분해 또는 단백질분해 활성의 생성을 필요로 하는 혈전증 또는 기타의 상태를 치료하는 방법.