JPH02273179A - 新規な血栓溶解蛋白質，その製造法および該蛋白質からなる医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は１組織プラスミノーゲン活性化因子型活性を有
する新規血栓溶解蛋白質に関するものである。より詳細
には１本発明は２組換新規血栓溶解蛋白質、該蛋白質を
コードするＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子により形質転換し
た細胞から該蛋白質を得る方法、該蛋白質を含有する医
薬組成物、および血栓溶解剤としての該物質の治療上の
使用に関するものである。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａｌａ　Ｌ−アラニン　　　　Ｌｓｕ　Ｌ−ロイシンＡ
ｒｇ　Ｌ−アルギニン　　　Ｌ７畠Ｌ−リジンＡ１１ｌ
　Ｌ−アスパラギン　　Ｍ＊ｔＬ−メチオニンＡｓｐ　
Ｌ−アスパラギン酸Ｐｈｅ　Ｌ−フェニルアラニンＣｙ
ｓ　Ｌ−システィン　　　ＰｒｏＬ−プロリンＧ１ｎＬ
−グルタミン　　　Ｓｅｒ　Ｌ−セリンＧｌｕ　Ｌ−グ
ルタミン酸　　ＴｈｒＬ−スレオニンＧＩＦグリシン　
　　　　ＴｒｐＬ−トリプトファンＨ１ｓ　Ｌ−ヒスチ
ジン　　　Ｔｙｒ　Ｌ−チロシン、Ｉｌ＠Ｌ−インロイ
シン　　Ｖａｌ　Ｌ−バリンまた。ＤＮＡの配列はそれ
を構成する各デオキシリボヌクレオチドに含まれる塩基
の種類で略記するものとし、たとえば下記の略号を用い
る。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミ　ン（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらＫｌ　　（ＨＥＮ）−及び−（Ｃ
０ＯＨ）　　はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及
びカルボキシ末端側を示すものであＬ　　（５’）及び
（３′）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末
端側を示すものである。

（従来の技術） 天然型ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（以下天然
型ヒトｔ−ＰＡと略記する）は、従来の血栓溶解剤でち
るストレプトキナーゼ（ＳＫ）およびウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ）に代わる血栓溶解剤として注目されている（松尾理
：ｔ−ＰＡとｐｒｏ−ＵＫ、学際企画、１９Ｂ？、ｐｐ
７５−１７６）。

この天然型ヒトｔ−ＰＡを構成するアミノ酸配列および
天然型ヒトｔ−ＰＡをコードするｅＤＮＡの塩基配列は
、　　Ｐｅｎｎ１ｃａらにより決定されており公知であ
る（Ｐｅｎｎ１ｃａ＋　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　３０１（１９８３）　２１４−２２１）。本
明細書中のｔ　−、Ｐ　Ａのアミノ酸配列の番号体系は
、このＰｅｎｎ％ｅｌＬ　らの論文に準じている。一方
、塩基配列の番号体系は便宜上ｔ−ＰＡの翻訳開始コド
ン（ＡＴＧ）のＡを起点に番号付けを行っている。

ｔ−ＰＡは、血管内皮細胞においてプレプロ配列を含む
ｔ−ＰＡ前駆体（５６２アミノ酸残基）として合成され
た後、細胞内の酵素によｊ）　Ａｒｇ　−（−１）と５
ｅｔ−１の結合が分解され５２７アミノ酸残基からなる
一本鎖の糖蛋白質として細胞外へ分泌される。次に、こ
の−重鎖ｔ−ＰＡは、　Ａｒｇ　−２７５とＩｔ＠−２
７６の間でプラスミンによる分解を受け、Ｎ末側のＨ（
Ａ）鎖とＣ末側のＬ　（Ｂ）鎖の二本鎖に変換する。Ｈ
鎖は４つのドメイン構造からなることが他の蛋白質との
アミノ酸配列の相同性から推定されている（Ｎｙ、　Ｔ
、、　ａｔ　ａｔ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｌ、　ＵＳＡ、
８１　（１９８４）　５３５５−５３５９　；　Ｐａｔ
ｔｈｙ、　Ｌ、ｓ　ｅ＠ｌ　１４１　（１９８５）　６
５７−６６３　）。

それらはＮ末側からフィンガーＣＦ）ドメイン。

ｇａｐ　（上皮成長因子）ドメイン、第１クリングル（
Ｋ１）ドメインおよび第２クリングル（Ｋ２）ドメイン
と呼ばれている。この２つのクリングルドメインは、ア
ミノ酸配列において約５５％の高い相同性を有している
。Ｆおよびに２ドメインは、フィブリン親和性およびフ
ィブリン依存性の蛋白分解活性の促進に関与していると
考えられている（Ｖｅｒｈｅｌｊｅｎ、　Ｊ、　Ｈ８，
ａｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、５（１９８６）３５２５
−３５３０　ｅ、　Ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ、Ａ−
Ｊ、、　ｅｔａｔ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｍ、
２６１（１９８６）１４２１４−１４２１８）。

またＥＧＦドメインは疎水性に富む領域であるが、　ｔ
−Ｐ　Ａのフィブリン溶解活性にはあｔり重要でないこ
とが知られている。一方、Ｌ鎖は、蛋白分解活性を有し
１種々のセリンプロテアーゼと高い相同性を示している
。

天然型ヒト　ｔ−ＰＡは、糖蛋白であり分子内圧は、ア
スパラギン結合製糖鎖の付加しうるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ
またはＡｓｎ−Ｘ−８ｅｒ　（Ｘは、　Ｐｒｏ以外の天
然アミノ酸）からなるアミノ酸配列が３カ所存在してい
る。実際ｔ−ＰＡのＡｓｎ−１１７、Ａｓｎ−１８４お
よびＡｓｎ−４４８に糖鎖が付加されているが。

Ａｓｎ−１８４に糖鎖な含まない分子種も存在する。

１１７．１８４および４４８０３カ所のアスパラギンに
糖鎖が付加されている分子種は通常ｔｙｐｅ　Ｉと呼ば
れ、１１７と４４８の２カ所のアスパラギンに糖鎖が付
加している分子種はｔｙｐｅ　Ｉ［と呼ばれる。両者の
分子量の差はおよそ２０００〜４０００ダルトンである
。

天然型と）ｔ−ＰＡの最も特徴的なことは、フィブリン
に対する高い親和性である。天然型ヒトｔ−ＰＡは、フ
ィブリン親和性を持たないＳＫおよびＵＫとは対照的に
、循環血中のプラスミノーゲン（Ｐｉｇ）を効率的に活
性化しないが、フィブリンと結合したＰｉｇを極めて効
率的に活性化するため、出血傾向等の副作用の少ない血
栓溶解剤でおると考えられている。また、実際の臨床試
験の報告では、静脈内投与した天然型ヒトｔ−ＰＡが心
筋梗塞の患者における閉塞冠動脈の再潅流をもたらすの
に有効であることが示されている（Ｔｈｅ　ＴＩＭＩ　
　５ｔｕｄｙ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅ
ｄ。

３１２（１９８５）　９３２−’９３６　”、　Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙＧｒ
ｏｕｐ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔ−Ｐ　Ａ
、　Ｌａｎｃｅｔ　１（１９８５）８４２−８４７〕。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、血栓性疾病の治療におけるヒト　ｔ−Ｐ
Ａの使用上の不都合は、　　ｉｎ　ｖｉｖｏでの酵素活
性の血中半減期が極端に短かいこと（３−６分）でちる
（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｔ、、　
Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｅｘｐ。

Ｔｈｅｒ、２３５（１９８５）　５０６−５１２　；　
Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、　５６　（１９８６）
　１−５　；　Ｎｇｕｙｅｎ、　Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、
。

Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、　５８（１９８７）　
４３７（Ａｂｓｔｒａｃｔ）　）。Ｉｎｖｉｖｏにおけ
るｔ−ＰＡの急速な消失は、肝でのクリアランスが主因
でおり、さらにｔ−ＰＡは、主にＨ鎖を介して肝に認識
されていることが示唆されている（　Ｒ（ｊｋｅｎ、　
Ｄ、Ｃ，ａｎｄ　Ｅｍｅｉｓ、　Ｊ、Ｊ、、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍＪ、２３Ｂ（１９８６）　６４３−６４６）。よ
りて、ヒトｔ−ＰＡによる血栓性疾病の治療では十分な
血中濃度を維持するために、持続静注投与を必要とし、
さらに多量のｔ−ＰＡ　（５５０−１Ｏ０ｆｆ１　’）
が必要でちる。

それ故、ヒト　ｔ−ＰＡによる治療は、非常に高価とな
り、また、大量投与にともなう出血傾向。

全身線溶先進も懸念される。

このような状況からフィブリン親和法およびフィブリン
依存性を維持したまま血中半減期が延長された新しいタ
イプのｔ−ＰＡの開発が望まれている。

（１１題を解決するための手段） 本発明者等は、遺伝子組換の手法を用いて新しいタイプ
のｔ−ＰＡの開発を進めてきたが、天然型ヒト　ｔ−Ｐ
ＡのＥＧＦドメイン領域内に糖鎖が付加したアミノ酸配
列を介在させることによりヒト　ｔ−ＰＡの望ましい生
物・蓼的活性を維持したまま、　　ｉｎ　ｖｉｖｏの血
中半減期が飛躍的に延長したすぐれた性質を有する血栓
溶解蛋白質が得られることを見出し１本発明を完成した
。

すなわち２本発明は、天然型ヒトｔ−ＰＡのＥＧＦドメ
イン内にアスパラギン結合型糖鎖が付加したアミノ酸配
列を持つことを％徴とする新規血栓溶解蛋白質でちる。

ここでいう「ＥＣＦドメイン」とは、天然型ヒトｔ−Ｐ
Ａのアミノ酸配列のＶａｔ−４８付近からＴｈｒ−９１
付近までの領域を意味している。また、「アスパラギン
結合型糖鎖が付加したアミノ酸配列」とは、　Ａｓｎ−
Ｘ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘ−３ｅｒ　（但し、ＸはＰｒ
ｏ以外のアミノ酸を意味し、　　Ａｓｎは糖鎖を有して
いるものとする。）で示されるアミノ酸配列である。こ
れらのアミノ酸配列を有する本発明の蛋白質としては、
天然型ヒトｔ−ＰＡのＥＧＦ　ドメイン内の一部のアミ
ノ酸を別のアミノ酸に置換したもの、該ドメイン内に他
のアミノ酸を挿入したもの、該ドメイン内の一部のアミ
ノ酸を欠失させたもの或はこれら置換、挿入、欠失の２
つ以上を同時に伴ったものを挙げることができる。

これをさらに具体的に説明すると、つぎの通りである。

先ず、一部のアミノ酸を置換したものとしては、　Ｍａ
ｌ　−４８をＡｓｎ−４８に、　　５ｅｒ−５０をＡｓ
ｎ−５０に、　　Ｇｕｙ−６０を５ｅｔ−６０またはＴ
ｈｒ−６０に、Ｇ１３／−５９をＡｓｎ−５９に、　　
Ｔｙｒ−６７をＡｓｎ−６７に、　Ｉ　１ｅ−８６をＡ
ｓｎ−８６に、または、　Ａｒｇ−８９をＡｓｎ−８９
に置換したものである。これらの置換は、２ケ所以上で
行ったものでもよい。特に好ましいものは。

Ｔｙｒ−６７をＡ　ｓｎ　−５７に、　　ｌ１ｅ−８６
をＡｓｎ−８Ｊ５に置換したものである。

つぎに、他のアミノ酸を挿入したものとしては、たとえ
ば、　Ｖａｌ−４８とＬｙａ−４９の間にＡｓｎを挿入
したもの、　Ｇｌ）？−５９とＧｌｙ−６０の間にＳａ
ｒまたはＴｈｒまたはＡｓｎを挿入したもの、　Ｔｙｒ
−６７とＰｈｅ−６８の間にＡａｎを挿入したもの、　
ｌ１ｅ−８６とＡｓｐ−８７の間にＡｓｎを挿入したも
の、　Ａｒｇ−８９とＡｌｔ−９０の間ＫＡｓｎを挿入
したもの、などである。

これらの挿入は２ケ所以上で行なったものでもよい。

また、一部のアミノ酸を欠失させたものとしては、　Ｇ
ｕｙ−５９またはＧｕｙ−６０のいずれかのアミノ酸を
欠失させたものである。

尚９本発明の蛋白質は、上記具体例の他に。

２つ以上のアミノ酸の置換、挿入、または欠失。

およびその組み合せにより得られるものであってもよい
。

本発明の蛋白質は、これらＥＧＦ領域内の一部アミノ酸
の置換、挿入又は欠失によって得られたアミノ酸配列の
少くとも１ケ所にアスパラギン結合型糖鎖な有するもの
でちる。

以下本発明の血栓溶解蛋白質の製造法について説明する
。

（、）　　ヒトｔ−ＰＡをフードするＤＮＡ分子の作成
本発明によれば、出発物質としてヒトｔ−ＰＡｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａクローンを使用し９種々のＤＮＡ組換技術を用い
ることにより、これらの新規な血栓溶解蛋白質を生産す
ることが好ましい。ヒトｔ−ＰＡ前駆体をコードするｃ
ＤＮＡクローン（ヒト　ｔ　　ＰＡ　ｅＤＮＡ）は、　
Ｂｏｗｅｓヒト黒色腫細胞由来のｍＲＮＡを出発材料に
公知の手法により゛ｃＤＮＡバンクを作成し、それより
コロニーハイブリダイゼーションの手法を用いて単離す
ることができる（実施例１参照）。

天然型ヒトｔ−ＰＡおよび本発明の新規血栓溶解蛋白質
を発現させるために使用した動物細胞用発現ベクターｐ
ｖｙ　Ｉ　Ａは、外来遺伝子挿入のための制限酵素部位
が、ＢｇｌＩＩ部位である。一方、ヒトｔ−ＰＡ　ｃＤ
ＮＡは、プレプロ配列と成熟ｔ−ＰＡの接続部分（すな
かちＡｒｇ−（−１）と５ｅｔ−１の部分）にＢｇｌ　
Ｉｔ部位を持つが、プレプロ配列のＮ末端よシ上流Ｋ　
Ｂｇｌ■部位はない。そこで、ＤＮＡ組換技術を用いて
ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡをｐｖｙ　Ｉ　ＡのＢｇｌＩＩ部位
へ簡単に挿入できるよう改変するのが好ましい。

それにはｓ　Ａｒｇ−（−１）とＳｅｔ　−１の部分に
存在するＢｇｌＩＩ部位は、　　Ａｒｇをコードしてい
たコドンをＡＧＡからＣＧＡに変更することにより消失
させ、プレプロ配列のＮ末端の開始コドン（ＡＴＧ）の
５′上流に新たにＢｇｌ　ＩＩ部位を付ける必要がある
。また、必要以上に長い３′非翻訳領域は、　Ｘｈｏ　
Ｉｆ消化により除去することが好ましい。こうして作製
した修飾ｔ−ＰＡ　ＤＮＡは、以下の新規血栓溶解蛋白
質作製のため出発材料として用いるべく２部位特異的突
然変異誘発実験の可能な、ファージミド（たとえば、　
　ｐＴＺ１８／１９．　ｐＵｃ１１８７１１９など）ま
たはファージＤＮＡ（たとえばＭ　１３　ｍｐ　１８／
ｍｐ１９など）に挿入する。

また、前述したようにｔ−ＰＡのアミノ酸配列は公知で
あるので、上記の修飾型ｔ−ＰＡＤＮＡは、アミノ酸を
指定するいくつかのコドンの中から適当なものを選び、
それを公知の化学合成の手法により作製することができ
る。すなわちｔ−ＰＡ前駆体に対応するＤＮＡを何本か
のオリゴヌクレオケトに分けてそれらを化学合成し、各
々のオリゴヌクレオケトドを常法により連結することに
より作製することができる。各オリゴヌクレオケトの合
成は市販の全自動ＤＮＡ合成機を用いたホスファイト法
による合成が好ましい。

また１発現用に選択した宿主細胞にあわせて、ｔ−ＰＡ
前駆体のプレプロ配列をもつとも産生効率の高い他のプ
レプロ配列におきかえて修飾型ｔ−ＰＡＤＮＡを合成し
てもよい。

（ｂ）　　新規血栓溶解蛋白質をコードするＤＮＡ分子
の作製 該蛋白質をコードするＤＮＡ分子は、修飾型ｔ−ＰＡ　
Ｄ　Ｎ　Ａの特定領域のＤＮＡ配列な慣習的な部位特異
的突然変異誘発法により１部分修飾することにより作製
することができる。

この部分修飾は、ＥＧＦドメイン内における１つ以上の
アミノ酸の置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わ
せＫより、天然型ヒト　ｔ−ＰＡのＥＧＦ領域内にＡｓ
ｎ　−Ｘ　−Ｓ　ｅｒまたはＡｓｎ　−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ
はＰｒｏ以外の天然アミノ酸配列）からなるアミノ酸配
列をコードする塩基配列が生じるよう、意図してなされ
る。

（ｃ）　　新規血栓溶解蛋白質の製造方法本発明のＤＮ
Ａ分子は、新規血栓溶解蛋白質をコードしているので、
このＤＮＡ分子をアスパラギン結合型糖ｔＸの付加の可
能な宿主細胞において発現させることによりＥＧＦドメ
イン内にアスパラギン結合型糖鎖が付加したアミノ酸配
列を持つ新規血栓溶解蛋白質を生産し得る。適当な哺乳
動物宿主細胞およびその発現ベクター　形質転換方法、
培養法、および生産産物の精製方法は１本分野では既知
である。例えば、　Ｈａｙｎｅｓ。

Ｊ、　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ、　Ｃ，、Ｎｕｃｌ
、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１−１　（１９８３）６８７
−７０６　；　Ｂｅｂｂｉｎｇｓｔｏｎ、　Ｃ，Ｊ　ａ
ｎｄ　Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、　ＣＣｐ、。

Ｉｎ　Ｇｌｏｖｅｒ、　　ＤｏＭ、（ｅｄ）　ＤＮＡ　
ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｏｌｍ、　ＩＲＬＰｒｅｓｓ、　０
ｘｆｏｒｄ（１９８７）　ｐｐ１６３−１８８　；Ｆｒ
ｅｓｈｎｅｙ。

Ｒｏｌ、、　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｎｉｍａｌ　ｃ
ｅｌｌｓ、　Ａｌａｎ　Ｒ１Ｌｉ５ａ、　ＩｎｃＮＹ（
１９８７）　；　Ｇｏｒｍａｎ、　Ｃ９，Ｉｎ　Ｇｌｏ
ｖｅｒ、　ＤＪ　（ｅｄ）。

ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｏｌ　Ｕ、　ＩＲＬ　Ｐｒ
ｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ（１９８５）ｐｐ１４：３−１
９０　；　Ｐｅｒｂａｌ、　ＢＡ、、　Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ　ｇｕｉｄｅ　ｔ。

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｊｏｈｎ　Ｗ
ｉｌｅｙ＆５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、（１９８４）ｐｐ４８
７−５４３　；特公昭６２−１６９３１号（酩初６２ヰ
（１９８７）４月１５日公告）；　日本生化学会編：続
生化学実験講座８血液（下）、東京化学同人（１９８７
）　ｐｐ６０３−６１０実施例６および７では、該蛋白
質をコードするＤＮＡ分子を発現ベクターｐｖｙ　Ｉ　
Ａに挿入した。ｐｖｙ　Ｉ　Ａは、プラスミドｐＫＳＶ
１０（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ）のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ
断片約２９００塩基対（ｂＰ）部分と、プラスミドｐＡ
　ｄＤ　２６８Ｖ　（Ａ）　ｎｏ、　３　（東京大学半
田宏博士より入手）より構成される。

上記のＢａｍＨＩ−Ｋｐｎｌ断片には、ＳＶ４０の初期
遺伝子の転写ユニツ）（ＳＶ４０初期プロモータ、介在
配列およびポリＡ付加シグナルなどを含む）が含まれ１
本発明のＤＮＡ分子はこの転写ユニットを利用して発現
される。またｐＡｄＤ　２６５Ｖ（Ａ）　ｎｏ、　３は
、アデノウィルス２型主要後肌プロモーターの制御下に
マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードして
おりメトトレキセー）（ＭＴＸ）を用いた細胞内の遺伝
子増巾が可能である。また本発明の実施において使用で
きる他の哨乳動物細胞は。

ＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、　Ｉ、ＣＣ−ＭＫ、細胞
。

Ｃ０８−１およびＣ０８−７細胞、　ＨｅＬａ細胞、２
９３細胞、　　ＲＰＭＩ８２２６細胞、３Ｔ３細胞、　
ＢＨＫ細胞、ＷＩ３８細胞、　ＣＨＯ−Ｋｌ細胞等であ
る。また、該蛋白質をコードするＤＮＡは、ＳＶ４０初
期プロモーター以外に、ｔ−ＰＡやアクチンなどの細胞
内の遺伝子に由来するプロモーターやＳＶ４０後期遺伝
子、アデノウィルス主要後期遺伝子、サイトメガロウィ
ルスｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ遺伝子、各種レト
ロウィルスのＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅ−ｒｍｉｎａｌ　
ｒｅｐｅａｔ　）などのウィルス遺伝子由来のプロモー
ターの制御下に発現することができる。

また、該蛋白質は、適当な昆虫細胞または酵母において
産生させることができるが、実施する際に有用な宿主細
胞２発現ベクター形質転換方法、細胞培養法および生産
産物の精製法も本分野では知られている〔前田進。

ウィルスと（１９８６）１−１１；中尾順二、実験医学
旦（１９８７）　１３６−１４１　；　Ｃａｒｔｅｒ、
　Ｂ、Ｌ、Ａ、、　ａｔ　ａｌ、。

Ｉｎ　Ｇｌｏｖｅｒ、　ＤｏＭ、（ｅｄ）　ＤＮＡ　ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　ｖｏｌｍ、　ＩＲＬＰｒｅｓｓ、　０ｘ
ｆｏｒｄ（１９８７）　ｐｐ１４１−１６１　；地神芳
文・田中秀明、タンパク質工学実験マニュアル（池原森
男・三木敬三部編）、講談社すイエンティフィク（１９
８８）　ｐｐ９８−１２０）動物細胞中で分泌生産され
たｔ−ＰＡは、Ｎ末端の切断される位置の違いにより２
種々のＮ末端配列から始まることが知られている。

一般に知られているＮ末端配列は、５ｅｔ−１から始ま
るもの、ちるいはＮ末端側の３つのアミノ酸（Ｓａｒ　
Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　）が切断されて、Ｎ末端がＶａｔ　−
４から始まるもの、あるいは５ａｒ−１の上流に３つの
アミノ酸Ｇｌｙ　ＡｌａＡｒｇを有するもの等がある。

このように、動物細胞を宿主として、ｔ−ＰＡを分泌生
産する場合、シグナルペプチダーゼおるいはプロテアー
ゼによるプロセッシングの受は方が、細胞の種類により
異なるために、Ｎ末端の異な宿主細胞の種類によりｔ−
ＰＡに付加される糖鎖の数およびその化学構造が変化し
うろことが知られているが、糖鎖の種類および数の多少
に拘らず本発明のＤＮＡ分子の発現によって得られる蛋
白質は２本発明に含まれる。

各宿主細胞で発明した該蛋白質は、全て既知の方法によ
って１回収・精製し、物理化学的、生化学的および臨床
的要素に関して解析を行なう。

修飾のされ方に関しても、同様のことが考えられるがい
ずれのＮ末端配列を有する該蛋白質も１本発明に含まれ
る。

また、ヒトｔ−ＰＡをコードするＤＮＡを各種培養細胞
において発現した場合、使用する（発明の効果） かくして得られた１本発明の新規血栓溶解蛋白質は、天
然型ヒトｔ−ＰＡと同様、急性心筋梗塞の治療に特に有
用である。最近証明されたように、天然型ヒト　ｔ−Ｐ
Ａは、１〜３時間にわたりて５０〜１１００ｆＱ量を静
脈内投与した時、閉塞冠動脈血栓の溶解、心筋潅流の再
生。

および虚血心筋層の大部分の回復に有効である。該蛋白
質は、血液中における半減期が顕著に延長されているの
で、天然型ヒトｔ−ＰＡについて推奨される投与量を著
しく減少させ。

しかも単回（ｂｏｌｕｓ　）投与で、天然型ヒトｔ−Ｐ
Ａと同じ臨床効果をもつ６口ろ。

また２本発明の該蛋白質は、深部静脈血栓。

肺動脈塞栓、末梢動脈血栓、心臓あるいは末梢動脈由来
の塞栓、急性心筋梗塞および血栓性発作を含む、脈管向
凝固を包含する多種多様の後天性疾病の治療に有用であ
る。

以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。本発
明の実施にあたり、ＤＮＡ組換操作は、特に断わらない
限り下記の実験書に従って実施した。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　ＮＹ　（１９８２）また各
制限酵素によるＤＮＡ消化法は、特にとこに述べない限
り購入光の使用説明書に従った。合成オリゴヌクレオチ
ドは、いずれも３８０Ａ型ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａ　）によりβ−シアノホスホ
アミダイド法により合成したものである。ＤＮＡオリゴ
マーの合成、脱保護、樹脂からの切断および精製は３８
０Ａ型ＤＮＡ合成機フニュアルに従った。

実施例１．　　ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡのクローニングＢ
ｏｗｅｓヒト黒色腫細胞（米国国立癌研究所Ｒｏｂｌｉ
ｎ。

Ｒ０博士より入手）を０ｐｄｅｎａｋｋｅｒ等の方法［
０ｐｄｅｎａ−ｋｋｅｒ、　Ｇ、、　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ
、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１３１　（１９８３）　４８１
−４８７３に準じて培養した。ｔ　　ＰＡ　　ｍＲＮＡ
を誘導するため、　　Ｔ　Ｐ　Ａ　（１２−Ｏ−Ｔｅｔ
ｒａｄｅｃａｎｏｙｌ　ｐｈｏｒｂｏｌ　１３−Ａｃｅ
ｔａｔｅ　）を、最終濃度１００　ｎｇ／ｒｎｌ加え、
１６時間培養した。次に、　　Ｆｒｅｅｍａｎらの変法
［Ｏｋａｙａｍａ／ＢｅｒｇｃＤＮＡ　マニュアル、３
頁（１９８５）、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製］に従って
培養細胞から全細胞ＲＮＡの抽出を行なった。オリゴｄ
Ｔセルロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を用いて
、ボ１７　（Ａｌ＋ＲＮ　Ａを全細胞ＲＮＡより分離し
た。その結果、およそ１０　　個の細胞より約４００μ
ｇのポリ（Ａｌ＋ＲＮ　ｐ、を得た。

このポリ（Ａ）”　ＲＮ　Ａを常法に従い、シ冒糖密度
勾配遠心法により分画した。分画した各ポＩＪ　（Ａ）
＋ＲＮＡの一部をとり、ｔ−ＰＡ　　ｍＲＮＡＫ特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを用いたドツト・プロッ
ト・ハイブリダイゼーション［Ｐｅｒｂａｌ、　Ｂ、。

Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　ｅｌｏｎｉｎｇ、　ｐｐ４１０．（１９８
４）。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、　］
を行ないｔ−ＰＡ　　ｍＲＮＡ分画を推定した。この除
用いたプローブ（プローブＹ）は、５’−ＧＣＴＴＧＧ
ＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡ−３’の塩基配列を有し、前記
Ｐｅｎｎ１ｃａ等の報告した　１−ＰＡの２９１〜２９
７番目のアミノ酸配列をコードするｍ　ＲＮ　Ａ領域に
相補的な配列である。プローフＹ０５′末端の放射線標
識は、実験書１２２頁に従い。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造）および１　　
［３！ｐコＡＴＰを用いて行なった。

プローブＹは、主に２０〜３０　Ｓのポリ（Ａｌ”ＲＮ
　Ａと強くハイブリダイズした（この画分をＭ画分と呼
ぶ）。

Ｍ画分から得たボＩ）　（Ａ）”ＲＮ　ｐ、　１０μｇ
を鋳型としてＧｕｂｌｅｒ　−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｕ
ｂｌｅｒ、　Ｕ、　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｂ。

Ｊ、、　Ｇｅｎｅ　　２５　（１９８３）　２６３コに
従い逆転写酵素（生化学工業）を用いて、３μｇの二本
鎖ｃＤＮＡを合成し、この３′末端にＤｅｎｇ　−Ｗｕ
の方法［Ｄｓｎｇ。

Ｇ　−Ｒａｎｄ　Ｗｕ、　Ｒ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　（１９８１）４１７３　］を用
いてデオキシＣ鎖を付加した。次にこのデオキシＣ鎖付
加二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ヲＣＬ　４　ＢＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）にてゲルー過を行な
い、約５００ｂｐ以下の低分子量核酸を除去した後、Ｐ
８ｔ１部位にデオキシＧ鎖を付加したｐＢ　Ｒ３２２［
Ｂｅｔｈｅ−ｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、　）
と常法によりアニーリングした。

アニール後の混合物を用い、　　Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ
ＩＯＩコンピテントセル（全酒造）を形質転換した。そ
の結果、約４０，０００株の独立した形質転換体からな
るｃ　Ｄ　Ｎ　Ａバンクを得た。

このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａバンクを前述のプローブＹを用いて
、　Ｗｏｏｄｓの方法１：　Ｗｏｏｄｓ、　Ｄ、、　Ｆ
ｏｃｕｓ、　６　（３）、　１．　（１９８４）；　Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、社製コに
従い、　コロニーハイブリダイゼーションを行ない、プ
ローブＹと反応するクローンを得、そのうち、最も長い
ｔ−ＰＡｃＤＮＡ（約２５００ｂｐ　）を含むクローン
のプラスミドｐＢＲ３２２ｔＰＡ（＃４２）についてｃ
　ＤＮＡ部分の塩基配列決定を行なった。方法はＭ１３
ファージベクターを用いるジデオキシ法［Ｃａｒｌｓｏ
ｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１　（１９８４）
　２５３コおよび７−ＤＥ１３１９　］を用いて行なっ
た。その結果、プラスミドｐＢＲ３２２ｔＰＡ（＃４２
）は、ｔ−ＰＡ前駆体をコードする遺伝子の塩基配列を
完全に含むことが判明した。

実施例２．ｐＴＺ　１８　ｔＰＡＯＯ２の構築Ａ）　　
ｐＴＺ　１８ｔＰＡＯＯ２の構築ｔ−ＰＡ前駆体をコー
ドする遺伝子を発現ベクター　ｐＶＹＩＡにＢｇｌ　：
［部位で組み込むために、　ｔ　−ＰＡコード領域内、
ヌクレオチド１０３にあるＢｇｌ　［部位を欠失させ、
かつ翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直前に、新たなりｇｌ
　Ｉ［部位を付与した修飾型ｔ−ＰＡ遺伝子（ｔＰＡＯ
Ｏ２遺伝子）を構築した。ｔＰＡＯＯ２遺伝子の構築方
法を第１図に示す。

まず、プラスミドｐＢＲ３２２ｔＰＡ　（＄４２　）を
、Ｂａ１Ｔ（全酒造）１次にＢｇｌ　ＩＩ　（全酒造）
で順次消化後、１．０％のアガロースゲル上で電気泳動
を行ない、ｔ−ＰＡｃＤＮＡに由来する約１．９　ｋｂ
ｐのＢｇｌ　■Ｂａｌ　Ｉ断片（Ａ断片）を切り出し。

ＤＮＡセル（第一化学薬品）を用いた電気溶出法により
、精製した。抽出方法は、ＤＮＡセル取扱説明書に従っ
た。

次に、下記塩基配列で示されるｌａ、　ｌｂ、　２ａ。

２ｂの４本のオリゴヌクレオチドを合成した。

１ａ ｓ’　ＧＡＴ　　ＣＴＡ　　ＴＧＧ　　ＡＴＧ　　ＣＡ
Ａ　　ＴＧＡ　　ＡＧＡ　　ＧＡＧＧＧＣＴＣＴ　　Ｇ
ＣＴ　　ＧＴＧ　　ＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧ　
　ＧＡＧ　　Ｃ３’ ｂ ｓ’　ＡＡＧ　　ＡＣＴ　　ＧＣＴ　　ＣＣＡ　　ＣＡ
ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡ　　ＣＡＧ　　ＣＡＧ　　
ＡＧＣＣＣＴ　　ＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＡ　　ＴＣＣ
ＡＴＡ　　３’ ａ ｓ’　ＡＧＴ　　ＣＴＴ　　ＣＧＴ　　ＴＴＣＧＣＣＣ
ＡＧ　　ＣＣＡ　　ＧＧＡＡＡＴ　　ＣＣＡ　　ＴＧＣ
ＣＣＧ　　ＡＴＴ　　ＣＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＧＧＣＧ
ＣＣＣ３’ ｂ ５’　ＧＡＴ　　ＣＧＧ　　ＧＣＧ　　ＣＣＴ　　ＣＴ
Ｔ　　ＣＴＧ　　ＡＡＴ　　ＣＧＧＧＣＡ　　ＴＧＧ　
　ＡＴＴ　　ＴＣＣＴＧＧ　　ＣＴＧ　　ＧＧＣＧＡＡ
ＡＣＧ　　３’ Ｉ（ＰＬＣを用いて精製後、　　１　ｂ　１００　ｐｍ
ｏｌをキナーゼバッフｙ　　（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌｐ）！８．０．　１０ｍＭＭｇＣｌ、、５ｍＭＤＴＴ
、１ｍＭ　ＡＴＰ）５０μＺ中、　　Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ１０単位と、３７℃で９０分間インキエベ
ートし、　リン暖化した後、フェノール・クロロホルム
抽出を行なった。２ａも同様にして、リン酸化後、フェ
ノール・クロロホルム抽出した。リン酸化した１ｂと２
ａ　を混ぜ、これＫそれぞれ１００　ｐｍｏｌの１ａと
２ｂ、　　ｔＲＮＡ７．８μｇを加え、エタノール沈殿
した。遠心後、沈殿を４３μｌの滅菌水で溶解し、７５
℃より徐冷した後’ｌ’４　　ＤＮＡリガーゼバｙ　７
７−　（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐＨ７，６，
６，６ｍＭ　ＭｒＣＩ、、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　０．
４ｍＭＡＴＰ）の１０倍濃度溶液５μｌとＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（全酒造）７００単位を加え、１６℃で一晩イン
キユベートし、約１１０ｂｐの断片（Ｂ断片）を得た。

ｔ−ＰＡ遺伝子由来のＡ断片と、上記Ｂ断片を、’ｌ’
４　ＤＮＡリガーゼバッファー中で。

１６℃、−晩、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ３５０単位とイン
キユベートシ、連結させ、７５℃で１５分間熱処理した
のち、Ｘｈｏｎ（ベーリンガー・マンノ１イム）消化し
た。Ｂ断片は同じ粘着末端をもつため、Ａ断片に対して
ふた通りの連結形態をとる。２ａ。

２ｂは元の　ＢｇｌＩＩ（およびＸｈｏＩＩ）部位を再
生しないように塩基配列をかえているので、　　２ｍ、
　２ｂがＡ断片と連結した場合は連結部位がＸｈｏ　’
［で切断されないが、ｌａ、ＩｂがＡ断片と連結した場
合は連結部位がＸｈｏ　ＩＩで切断される。約１．７　
ｋｂｐの断片をゲルより切り出し、電気溶出法により精
製した。ここで得たＤＮＡ断片は大部分がＡ断片とＢ断
片が連結したのちＸｈｏ　Ｉｆ消化された約１．７　ｋ
ｂｐのｔ　Ｐ　Ａ　００２遺伝子断片（Ｃ断片）である
が、−部、Ａ断片がＸｈｏｌｉ消化された約１．６　ｋ
ｂｐの断片ＣＤ断片）も含む。

次に、ｔ−ＰＡ遺伝子を一重鎖形忙するために。

とのｔ　Ｐ　Ａ　００２遺伝子断片をｐＴＺ１８ＲのＢ
ａｍＨＩ部位に挿入した。構築方法を第１図に示す。

まず、Ｃ断片とＣ断片の混合物をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼによりリン酸化し、７５℃で１５分間熱処理し
た。一方、　　ｐ　Ｔ　Ｚ　１８　Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　）　６．２５μｇをｎａｍＨＩ（全酒造）消化し
、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈１１ｔ
　後、　　０．９　Ｍ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，
０）中でアルカリ性ホスファターゼ（全酒造）　０．１
３単位と６５℃で１時間インキエベートシ、さらにフェ
ノール・クロロホルム抽出後。

エタノール沈殿を行った。

このｐ’ｒｚ　１８Ｒ１ａｇと、リン酸化したＣ断片と
Ｄ断片１μｇをＴ４ＤＮＡ　！Ｊガーゼ３５０単位で連
結させ、この反応液でＥ、ｃｏｌｉ　ＮＭ　５２２コン
ピテントセル（フナコシ）ヲＨａｎａｈａｎの方法（Ｈ
ａｎａｈａｎ、　Ｄ、　：　ＪｌＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、
　１６６　（１９８３）５５７）　Ｋ従って形質転換し
た。形質転換した細胞をアンピシリン含有ＬＢプレート
（バクトドリプトン１０ｇ。

イーストエクストラクト５　ｇ　ｓ　ＮａＣ１１０ｇ　
＋バクトアガー　１５ｇ／Ｚ、　０．０１　Ｍ　Ｍｇ　
ＳＯ４，０，１ｍＭ　Ｉ　ＰＴＧ、　０．００４％Ｘ−
ｇａｌ）上、３７℃で一晩培養した。生じた白いコロニ
ーを２１１Ｉｌのアンピシリン含有２ＸＹＴ（バクトド
リプトン１６ｇ、　　イーストエクストラクト１０ｇ。

ＮａＣ１５ｇ／Ｚ　）で培養した。次に、実験書９３６
８−３６９に従い、ラビッド法（アルカリ溶解法）に・
よりプラスミドＤＮＡを得た。

次に、５ａｌＩ（全酒造）とＥｃｏ　ＲＩ　（全酒造）
の二重消化により、約２．８５　ｋｂｐ、約７４０　ｂ
ｐ、約５５０　ｂｐ。

約４７０　ｂｐのバンドが生じる。すなわちＣ断片を含
むプラスミドを選んだ。また、Ｃ断片はふた通りの向き
でｐＴ２１８Ｒに組み込まれるが、　Ｓａｃ　Ｉ　（全
酒造）消化により約４．２　ｋｂｐ、約４１０　ｂｐの
２本のバンドが生じるプラスミド（ｐＴＺ　１８　ｔＰ
ＡＯＯ２）を以下の実験に用いた。合成したＢ断片が正
しくＡ断片に連結していることは２Ｍ１３プライマ−Ｍ
４（全酒造）を用いてｐ’ｒｚ　１８　ｔＰＡＯＯ２の
塩基配列決定を行ない確認した。塩基配列の決定は、Ｍ
１３／ｐＵＣシークエンシングマニュアル（日本シーン
社製、　　１９８６．　ｐｐ　１９−２０　’）　Ｋ準
じて行なった。

Ｂ）−本鎖ｐ’ｒｚ　１８　ｔＰＡＯＯ２の調製まず、
ｐＴＺ１８　ｔＰＡＯＯ２形質転換体より１部位特異的
突然変異に用いる１本鎖ＤＮＡを調製した。

アンピシリン、００１％チアミン含有２ＸＹＴ２ｍｌで
、ｐＴＺ１８　ｔＰＡＯＯ２形質転換体を一晩培養した
。

アンピシリン、チアミン含有２ＸＹＴ１５ｍｌに、形質
転換体の一晩培養液１５０μｌを加え、３７℃で１時間
培養し、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（全酒造）２．
５　Ｘ　１０°ｐｆｕ／ｎ＋Ｚ２５０μｔを感染させ、
カナマイシン（２５ｍｇ／ｍｌ　）　４２　ｔｔｌを加
え２　さらに−晩培養した。

この培養液を遠心チューブに移し、　　１２．００Ｏｒ
ｐｍ　、　０℃、５分間遠心後、上清を他の遠心チュー
ブに移し、３ｍＺの２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　−２，５Ｍ　Ｎ
ａＣ１溶液を加え、室温で２０分間放置した。これを１
２．００Ｏｒｐｍ、　　２０°０１０分間遠心後、上清
を除き、沈殿をＴＥバッファー（ｐＨ８，０）で溶解し
、フェノール抽出を行なった。

遠心後、水層を他の遠心チューブに移し、エタノール沈
殿を行ない、−本鎖ｐＴＺ１８　ｔＰＡＯＯ２７，６μ
ｇを得た。

実施例３０発現ベクターｐＶＹＩＡの構築ｐＶＹＩＡの
構築は、第２図に示すごとく行った。

Ａ）　　ｐＡｄＤ２６ｓＶ（Ａ）ｎｏ、３（Ｎ）の構築
およびそのＥｃｏ　ＲＩ消化 先ず、ベクターｐＡｄＤ　２６５ｖ（Ａ）　ｎｏ、　３
　［東京大学半田宏博士より人手；　Ｋａｕｆｍａｎ＋
　Ｒ，Ｊ、　ａｎｄＳｈａｒｐ、　Ｐ、　Ａ、、　Ｍｏ
１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　２　（１９８２）　１
３０４　１３１９の論文で公知である］　ＤＮＡを、Ｂ
、ｌ［で切断し、フェノール・クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿後、滅菌蒸留水に溶解した。次に、　Ｋｌｅ
ｎｏｗ酵素（ベーリンガー・マンハイム）を用いて常法
により平滑末端とし、フェノール・クロロホルム抽出、
エタノール沈殿後、滅菌蒸留水に溶解した。更に、ＤＮ
Ａライゲーシヲンキット（全酒造）を用いて自己結合さ
せた後。

Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１コンピテントセルを形質
転換した。テトラサイクリン耐性を示す形質転換体より
プラスミドＤＮＡを得た。これらのＤＮＡの一部を　Ｂ
ｇｌ　■で切断後、０．７％アガロースゲルで電気泳動
を行い、Ｂｇｌ［部位を消失したクローンｐＡｄＤ　２
６３Ｖ　（Ａ）　ｎｏ、３　（Ｎ）を得た。

次に、このプラスミドＤＮＡをＥｅｏ　ＲＩ消化後、フ
ェノール・クロロホルム抽出、　エタノール沈殿後、滅
菌蒸留水に溶解し、マング・ビーンｅヌクレアーゼ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　）を用いてＥｃ。

ＲＩ切断部位を平滑末端とし、フェノール拳りロロホル
ム抽出、エタノール沈殿後、滅菌蒸留水に溶解した。

Ｂ）　　ｐ　Ｋ　Ｓ　Ｖ　１０からのＫｐｎ　Ｉ　−Ｂ
ａｍＨＩ　（約２．９　Ｋｂｐ　）断片の単離 ｐ　Ｋ　Ｓ　Ｖ　１０　（Ｐｈａｒｍａｅｉａ　）　Ｄ
　Ｎ　Ａを常法により制限酵素Ｋｐｎ　■およびＢａｍ
ＨＩで切断した後。

Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造）およびＫｌｅ−ｎＯ
Ｗ酵素により平滑末端とした（実験書３９４−３９５頁
）。次に、０．７％アガロースゲルで電気泳動を行ない
、約２．９　Ｋｂｐの断片を分離後、電気溶出法により
、ＤＮＡを回収した。

Ｃ）ｐＶＹＩＡの構築 Ａ）項で得たＤＮＡ断片とＢ）項で得たＤＮＡ断片を、
ＤＮＡライゲーシヲンキットを用いて。

結合させた後、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩコンピ
テントセルを形質転換した。

テトラサイクリン耐性を示す形質転換体の中から常法に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。

これらのプラスミドＤＮＡの一部をｐｓｔＩ（ベーリン
ガー・マンハイム）消化し１．０％アガロースゲル電気
泳動を行い、約３．６　Ｋｂｐ、約３．２５Ｋｂｐ。

約１．５　Ｋｂｐバンドを示すプラスミドｐｖｙＩＡを
得た。このクローン（Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１　
ｐＶＹＬＡ　）は微工研免寄第２６３０号として寄託さ
れている。

実施例４１部部位特異的突然変異体のためのプライマー
の合成 実施例２　Ｂ）　テ得た。−本鎖ｐ’ｒｚ　１８　ｔ　
ＰＡ　００２を部位特異的突然変異誘発に付し、天然型
ヒトｔ−ＰＡのＴｙｒ　−６７をＡｓｎに置換したｔＰ
ＡＯ２３をコードするｔ　ＰＡ　０２３遺伝子を作製し
た。突然変異誘発およびスクリーニングのために、プラ
イマー３を、また変異部位の塩基配列を決定し確認する
ためにプライマー４を合成した。

Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ天然
のヒトｔＰＡ　５’　　ＡＧ　ＧＣＣＣｒＧ　ＴＡＣＴ
ＴＣＴＣＡ　３’の配列 Ａｓｎ ｓ’　　ＡＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＡＣＴｒＣＴＣＡ　ａ
’ブ５イ？−３３’　　ＴＣＣＧＧ　ＧＡＣＴｒＧ　Ａ
ＡＧ　ＡＧｒ　５’（変異誘発用） プ５イマ−４５’ＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＡＧＣＡＣＧｒ
　　３’（塩基配列決定用） 天然型ヒト　ｔ−ＰＡのアミノ酸配列および解読鎖の遺
伝子配列は、最初の２列に記載されている。

プライマー３．およびプライマー４は、解読鎖の反射鏡
の配列である。

実施例５０部位特異的突然変異の誘発 ｐＴＺ　１８　ｔＰＡ　０２：ｌ（の構築方法を第３図
に示す。

部位特異的突然変異体の作成は、　Ｇｉｌｌａｍらの方
法［Ｇｉｌｌａｍ、　ｓ、ｌ　Ｚｏｌｌｓｒ、Ｍ、＋　
ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍ、　：　Ｍｕｔａｎｔ　ｃｏ
ｎｓｔ−ｒｕａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、　Ｉｎ　Ｄｉｌｌｏｎ、　Ｊ、
Ａ、Ｒ，、Ｎａ５１ｍ＋Ａ、＃　ａｎｄ　Ｎｅｓｔｍｍ
ｎｎ＋　Ｅ、Ｒ，（Ｅｄｓ、）、　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｏｄｏ−１ｏｇｙ、　Ｊｏｈｎ
　ｗＩｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　（１９８５）　ｐｐ、　
１５７−１８６．］ＩＣ従い。

コロニーハイプリダイゼーシ薦ンは前出（実施例１）の
Ｗｏｏｄｓの方法に準じた。

−本鎖ｐＴＺ　１８　ｔ　ＰＡ　００２０．２　ｐｍｏ
ｌをＫｌｓｎｏｗバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｍ−Ｈ
ＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ、、　５０ｍＭ
ＮａＣｌ。

１ｍＭ　ＤＴＴ　）　１０　＃Ｚ中で、　　１００℃、
１分間インキエベートした後、氷冷１．、　４０’Ｃで
３０分間インキエペートした。ライゲーション溶液（２
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍｇ
（ｔ、、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　１ｍＭずつのｄＡＴＰ
。

ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、　１ｍＭ　ＡＴ
Ｐ、　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ５２５単位）　ＩＱ、４７
．　Ｋｌｅｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔ　（宝酒造）３．５
単位を加え、プライマー延長を開始させた。１５℃で一
晩インキユペートした後１反応混合物でＥ、　ｅｏｌｉ
ＭＹ　１３０４コンピテントセルを形質転換し、アンピ
シリン含有ＬＢ寒天上で、３７℃で一晩培養した。

化シタコロニーをニトロセルロースフィルターに移し、
このフィルターを０．５Ｍ　ＮａＯＨテ１０　分、　１
．０Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ　（ｐＨ７，４）で５分、　
　１．５　Ｍ　ＮａＣｌ　−１，０Ｍ　Ｔｒｉｍ−ＨＣ
Ｉ　（ＰＨ７，４）で５分間処理して風乾した。このフ
ィルターを真空中において、７５ｔで９０分間加熱した
。次に、フィルターをプレハイブリダイゼーシ璽ン　液
　（６ｘ　　ＳＳＣ，５ｘ　　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　
　５ｏｌｕｔｉｏｎ、　　０．２％　ＳＤＳ。

０．０５％ピロリン酸ナトリウム、　　１００μｇ／ｍ
Ａ　８μ１ｍｏｎｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ　）と−緒Ｋ　５
４℃で２時間インキエペートシ１次に、５′末端をγ−
３２ｐで標識したプライマー３をプローブとして加え、
４６℃で一晩ハイブリダイゼーションを行なった。１ｘ
ＳＳＣの組成は０．１５ＭＮａＣｌ　。

０．０１５　Ｍクエン酸三ナトリウム、ｐＩ（７，０，
またＩ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’５ｓｏｌｕｔｉｏｎの
組成は０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ　ｒ　０．０２％Ｐｏ１
ｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ。

０．０２％ＢＳＡである。このフィルターを６ｘＳＳＣ
，０，０５％ピロリン酸ナトリウムで、室温で２回、４
４℃において２回、そして４９．５℃で１回洗浄した後
、風乾し。

オートラジオグラフにかけた。次に、黒く感光した（陽
性）クローンを培養し、ラピッド法によりプラスミドを
とり、５０μｌのＲＮａｓｓ　（４０μｇ／ｍＡ）溶液
中、３７℃で一晩インキユベートした。

この反応液５０１１ｔＶｃ、　３０μｍの２０％ＰＥＧ
　−２，５Ｍ　ＮａＣｌを加え、４℃で一晩放置し、遠
心後、上清を除き。

７５％エタノールで沈殿を洗い、乾燥させた。実施例４
に示したプライマー４を用い、ジデオキシ法により塩基
配列決定を行い、ｔ−ＰＡのＴｙｒ　−６７に対応する
塩基配列ＴＡＣがＡｓｎに対応するＡＡＣに変異してい
るプラスミド（ｐｒｚｔｓｔｐＡｏ２３）を選んだ。

プ５　スミ）’　ＤＮＡ　ｐＴＺ　１８　ｔ　ＰＡ　０
２３を制限酵素Ｂ３ｔＹＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｂｉｏｌｍｂｍ　）消化後、１．０％のアガロ−スゲ
ルミ気泳動を行ない、約１．７ＫｂｐのｔＰＡ　０２３
遺伝子断片（Ｅ断片）を電気溶出法により単離した。

実施例６１発現ベクターｐｖＹＩＡヘノｔＰＡｏ２３遺
伝子のサブクローニング ｔ　ＰＡ　０２３遺伝子を１発現ベクターｐＶＹＩＡに
組み込んだ。構築方法を第３図に示す。

発現ベクターｐＶＹＩＡをＢｇｌ　［消化後、フェノー
ル・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行なった。

このＤＮＡを実施例２に記載した方法でアルカリホスフ
ァターゼ処理し、フェノール・クロロホルム抽出後、エ
タノール沈殿した。次にこのホスファターゼ処理したｐ
ＶＹＩＡと、Ｅ断片を’ｌ’　４　ＤＮＡリガーゼを用
いて連結させた。

この反応液で、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１コンピ
テントセルを形質転換させ、テトラサイクリンを含むＬ
Ｂ寒天上で一晩培養した。生じたコロニーを、テトラサ
イクリンを含む２　ｘ　ＹＴで培養し、ラビッド法によ
りプラスミドを得、ＰａｔＩ消化により挿入方向を確認
した。すなわち、１．０％アガロースゲル電気泳動を行
ない。

約３．６Ｋｂｐ、約２，３　Ｋｂｐ　、約１．５　Ｋｂ
ｐ　（２本）、約６２０ｂｐ、約４１０１）Ｐ＋約８０
ｂｐ、約７０　ｂｐのバンドを生じるものが、　　ｐＶ
ＹＩＡ中のＳＶ４０プロモーターにｔＰＡＯ２３遺伝子
が正しく連結されたものである（ｐｖＹＩＡｔＰＡＯ２
３）。

ｔＰＡＯ２３遺伝子に含まれる該蛋白質の前駆体の塩基
配列を以下に示す。

ｓ’ＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴ
ＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡ
ＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴ０８０９Ｑ ＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣ
ＧＡＴＴＣｌｏｏ　　　　　　　　　１１０　　　　　
　　　１２０ＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＣＣＧＡＴＣＴＴ
ＡＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡ
ＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴ
ＣＡＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＡ
ＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＴＧ
ＧＴＧＣＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣ
ＣＡＣＴＣＡＧＴＧＣＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＴＧＣＡ
ＧＣＧＡＧＣＣＡＡＧＧＴＧＴＴＴＣＡＡＣＧＧＧＧＧ
ＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣ
ＴＣＡＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＧ
ＡＡＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡ
ＡＡＴＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣ
ＧＡＧＧＡＣ４ｏＯ４１０４２０ ＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＧＴ
ＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＧＴＧＧＣＧＣＣＧＡ
ＧＴＧＣＡＣＣＡＡＣ４６０４７０ａ ＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＡ
ＡＧＣＣＣＴＡＣＡＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡ
ＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＡＣ
ＣＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＡＴＣ
ＧＡＧＡＣＴＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＴ
ＣＴＴＴＡＡＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＡ
ＧＡＧＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴ
ＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＴＡＣＴＴ
ＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＡＧＣＣＴＡＣＣＧＴＧＧＣ
ＡＣＧＣＡＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＧＴＧ
ＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴ
ＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡ
７６０　　　　　　　　７７０　　　　　　　　７８Ｑ
ＧＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣ
ＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＴＧ
ＣＣＧＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＧＣＣＡＡＧ
ＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣ
ＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧＧＡＧＴＡＣｓｓｏ　　
　　　　　　　　８９０　　　　　　　　　９００ＴＧ
ＴＧＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣ
ＧＧＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣ
ＡＧＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＣＴＴ
ＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＧ
ＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡ
ＧＧＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＴＣＣＴ
ＧＴＧＣＧＧＧＧＧＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣ
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ＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＣＧＡＡＡＡ
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ＧＡＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＧＡＣＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧ
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ＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＣＡＴＧＴＣＡＧＡ
ＣＴＧＴＡＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＴ
ＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣＡ
ＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＴＣＧＧＧＡ
ＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＧＡＴＧ
ＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴ
ＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧ
ＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＣＣＡ
ＡＧＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴ
ＴＣＧＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡ　　３ ＡＡＧＣＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴ
ＡＴＴＣＧ実施例７．　　ｐＶＹＩＡｔＰＡＯ２４の構
築まず、実施例５と同様に、１本領ｐＴＺ　１８　ｔＰ
Ａ００２を部位特異的突然変異誘発に付し、天然型と）
ｔ−ＰＡのｌ１ｅ−８６をＡｓｎに置換したｔ　ＰＡ　
０２４をコードするｔ　ＰＡ　０２４遺伝子を作製した
。この作製方法を第４図に示す。突然変異誘発に使用し
たプライマー５は、以下の配列を有する（解読鎖の反射
鏡）。

ｓ’　Ｔ　ＧＧｒ　ＡＴＣＡＴＴ　ＴＴＣＡＣＡ　ＧＣ
ｓ’コロニニーイブリダイゼーシ冒ンによるスクリーニ
ングの際のハイブリダイゼーシ嘗ンの温度が４４℃であ
ることと、洗浄の際の最高温度が３９℃であること以外
は実質的に実施例５と同様に行なりた。最終的に、実施
例４に示したプライマー４を用いて塩基配列決定を行な
い、　ｔ−ＰＡのｌ１ｅ−８６に対応する塩基配列ＡＴ
ＡがＡａｎに対応するＡＡＴに変異しているプラスミド
（ｐＴＺ１８ｔＰＡＯ２４）を選んだ。

次に実施例５と同様にし、プラスミドＤＮＡｐＴＺ１８
　ｔ　ＰＡ　０２４より、約１．７　Ｋｂｐのｔ　ＰＡ
　０２４遺伝子断片（Ｆ断片）を得た。

次に、実施例６と同様にして２発現ベクターｐＶＹＩＡ
とＦ断片を連結させ、　　ＰＶＹＩＡ中１７）ＳＶ４０
プロモーターにｔＰＡＯ２４遺伝子が正しく連結したも
のｔｚｔ：選Ａ、り（ｐＶＹＩＡｔＰＡＯ２４）。構築
方法を第４図にを以下に示す。

ｓ’　ＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣ
ＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧ
ＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧ
ＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＴＴＣ１００、１１０
１２０ ＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＣＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧ
ＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡ
ＧＡＴＧＡＴＡＴＡＣ１６０１７０°１８０ ＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣ
ＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＧＧＴＧＧＡ
ＡＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧ
ＧＣＡＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＧＴＧＣＣＴＧＴＣＡ
ＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＧＡＧＣＣＡＡＧＧＴＧＴＴＴ
ＣＡＡＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣ
ＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＣＡＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＧＣＣ
ＡＧＴＧＣＣＣＣＧＡＡＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＧＡＡ
ＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣ
ＡＣＧＴＧＣＴＡＣＧＡＧＧＡＣａ　　　　　　　　　
　４１０　　　　　　　　　　４２０ＣＡＧＧＧＣＡＴ
ＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＡ
ＧＣＧＧＡＧＡＧＴＧＧＣＧＣＣＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡ
ＡＣａ　　　　　　　　　　４７０　　　　　　　　　
４８０ＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＴＧＧＣＣＣ
ＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣ
ＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＧ
ＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧ
ＡＴＣＧＡＧＡＣＴＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＡ
ＣＧＴＣＴＴＴＡＡＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣ
ＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＴ
ＧＣＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＴＡ
ＣＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＡＧＣＣＴＡＣＣＧＴ
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ＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣ
ＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣ
ＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧ
ＣＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＡ
ＣＴＧＣＣＧＧＡＡＴＣＣＴ８２０　　　　　　　　　
　＆３０　　　　　　　　　　８４０ＧＡＴＧＧＧＧＡ
ＴＧＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＴＧ
ＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧＧＡＧＴ
ＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣ
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ＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＧＣ
ＴＣＴＴＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣ
ＣＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧ
ＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴ
ＴＣＣＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧ
ＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣ
ＣＡＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＣＧＣ
ＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴＣＴＴＧＧＧ
ＣＡＧＡＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＣＣＴＧＧＣ
ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＣＧ
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ＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＧＡＣＡＡＴＧＡＣ
ＡＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＴＣＧＧ
ＡＴＴＣＧＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧ
ＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＣＧＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴ
ＣＣＣＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧ
ＡＣＴＧＧＡＣＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＣＴＣＣＧＧ
ＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴ
ＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＧ
ＡＧＧＣＴＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＴＡＣＣＣＡＴＣ
ＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＡＡＣＡＴ１４５
０　　　　　　　１ａ　　　　　　　　　１４７０ＴＴ
ＡＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＣ
ＡＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＣＧＧＡ
ＧＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣＡ
ＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＴＣＧＧＧＡ
ＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＧＡＴＧ
ＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴ
ＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧ
ＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＣＣＡ
ＡＧＧＴＴＡＣＣ１６６０１６７０１ｇｓ。

ＡＡＣＴＡＣＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＴＧＡＣＡ
ＡＣＡＴＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡ　　３ 実施例８．　　ｔＰＡＯ２３およびｔＰＡＯ２４のＣＨ
Ｏ細胞中での発現 プラスミドｐＶＹ　Ｉ　Ａ　ｔＰＡＯ２３およびｐＶＹ
　ＩＡ　ｔＰＡＯ２４をＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞［Ｕｒ
ｌａｕｂ、　Ｇ、ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ＋　Ｌ、Ａ−＊
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ
、　７７　（１９８０）　４２１６−４２２０　］にリ
ン酸カルシウム法によりトランスフェクトした［　Ｇｒ
ａｈａｍ、Ｆ、ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅ　Ｅｂ、Ａ、、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ　　５２　（１９７３）　　４５５−４
５７コ。

メトトレキセー）　（ＭＴＸ）存在下で１選択培地［Ｍ
ＥＭＡＬＰＨＡ（−）、ギプス（ＧＩＢＣＯ）　］より
得られた形質転換体。

クローンＳ−２３ｔ５−２３ｔ−（ｔＰＡ０２３）とＳ
−２４ｔ−ＭＩＯ−１（ｔ５−２４ｔ−はそれぞれ８０
ｕ１０Ｚおよび１００ｕ／ｒｎＬ（フィブリン／アガロ
ース平板法による測定値。

後述）のｔ−ＰＡ活性を産生ずることが見出された。

これらのクローンを以後の研究に充てた。生産培地はＧ
ＩＴ培地（和光紬薬工業）を用い、アプロチニンを２０
ＫＩＵ／ｍｔ［シグマ（ＳＩＧＭＡ）コ添加した。

実施例９．０ＨＯ細胞培養上清よりのｔ　ＰＡＯ２３お
よびｔＰＡＯ２４の精製 実施例８で得られた培養上清は抗ｔ−ＰＡ七ツクローナ
ル抗体アフィニティーカラムにより部分精製した。モノ
クローナル抗体産生ハイプリドーマは天然型ヒト黒色腫
細胞由来のｔ−ＰＡに対して常法により作成された。マ
ウスに抗体産生ハイプリドーマを接種し、腹水中に出現
したモノクローナル抗体（サブクラス：ＩｇＧ１）を回
収し、これを硫安沈殿およびイオン交換クロマトグラフ
ィーな用いて精製した。抗体はＣＮＢ　ｒ活性化セファ
ロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に、常法によりゲル１
　ｍｌ当り５Ｉｒ１ｇの割合で結合させた。

培養上清４ｔに本抗体ゲル１０ｍＺを混合し、−夜４℃
にて、ゆるやかに振と５した後、ゲルをカラム（１ｃｍ
径ｘ　ｌＱｃｍ　）に充填した。次に■２５ＫＩＵ／ｍ
ｌのアプロチニン（”クマＬ　　Ｏ，０１％（ｗ／ｖ）
　ノツウィーン８０をを含む５０ｍＭ　ト１７スー塩酸
緩衝ｇ。

ｐＨ７，４（緩衝液Ａ）、■０．５　Ｍの食塩を含む緩
衝液Ａ、■４Ｍの張索を含む緩衝ｇＡ、■緩衝液Ａ（ア
プロチニン不含）の順で、それぞれ５０ｍ７ずつでゲル
を洗浄した。ゲルに結合したｔ　ＰＡＯ２３およびｔ　
ＰＡＯ２４は０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液、　　ｐＨ
２，５（０，０１％（、／ｖ）のツウ４−７３０を含む
）で溶出された。活用のあるアラクシ１ンを回収、混合
して５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４（１００ｍＭのＮａＣ１
と０．０１％（ｗ／ｖ）のツウィーン８０を含む）忙対
して限外ｒ過膜を用い透析及び濃縮を行った。

これを以後のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの
評価に供した。最終的に１８００〜２６００倍の比活性
の上昇と５９〜７１％のｔ−ＰＡ活性（フィブリン／ア
ガロース平板法による）の回収が得られた。

コｔＬ　ラｔＰＡＯ２３およびｔ　ＰＡＯ２４の活性画
分をそれぞれ５ＤＳ−電気泳動と銀染色で分析したとこ
ろ還元状態ではともに、　６６〜６７　ＫＤａ　（キロ
ダルトン）と６３　ＫＤａ付近に主要なバンドが認めら
れた。この時、天然型ヒトｔ−ＰＡは、　６２〜６３Ｋ
Ｄａおよび５８〜５９ＫＤａ付近に主要なバンドがみと
められた。すなわち。

ｔ　ＰＡＯ２３またはｔｐＡＯ２４と天然型ヒトｔ−Ｐ
Ａとの間では数千ダルトンの分子量の差が認められた。

また電気泳動後のゲルを２．５％（ｗ／ｖ）のトリトン
Ｘ−１００で処理した後、フィブリン／アガロース平板
上に置き、３７℃にてフィブリンオートグラフィーを実
施したところｔＰＡＯ２３，ｔＰＡＯ２４ともに天然型
ヒトｔ−ＰＡに比して高分子量側にシフトした位置（６
２〜６７ＫＤａ付近）に溶解窓が認められた。

本実施例で精製された本発明の蛋白質ｔＰＡＯ２３およ
びｔＰＡＯ２４のアミノ酸配列は、前出のｔ　ＰＡＯ２
３遺伝子およびｔ　ＰＡＯ２４遺伝子の塩基配列から推
定して、以下の通りであると考えられる。

ｔＰＡＯ２３のアミノ酸配列 Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　５ｅｒ Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ ｙｓ Ｇｉｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｉｎ ｒｐ Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　５ｅｒＣｙｓ　
Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　ＡｓｎＬｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｎ　　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＡｌａＧｌｙ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＨｉｓＧｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　　Ｐｒ。

Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ Ｇｌｎ　Ａｓｎ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ ＡＳｐＶａｔ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ａｌａ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ Ａｌａ　Ｃｙｓ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ Ｔｒｐ　Ａｓｎ　５ｅｒ Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｇｉｎ Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ Ｈｌｓ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　５ｅｒ Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　５ｅｒ １１ｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ １１ｅ　　Ａｌａ　　５ｅｒ Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　Ｐｈｅ Ｐｈｅ　Ｃｙｓ Ｇｌｕ　Ｇａｙ Ｇｌｙ　Ａｓｎ Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ Ａｈａ　　Ｓｅｒ Ｍｅｔ　　ｌ１ｅ Ｔｈｒ　Ａｌａ Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　Ｃｙｓ Ａｌａ　Ｌｙｓ Ｌｙｓ　Ａｓｎ Ｔｙｒ　Ｃｙｓ Ｔｈｒ　Ｃｙｓ Ｇｌｎ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｌｅｕ Ｈｉｓ　　Ｐｒ。

Ａｌａ　Ｌｙｓ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｈｉｓ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　５ｅｒ Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　Ａｌａ Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　Ｖａｔ Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ １１ｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　　Ｇｌｕ Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　　ｌ１ｅ Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ １１ｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ｓｅｒ　５ｅｒ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　５ｅｒ Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ Ａｌａ　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｇｌｙ　Ａｓｐ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ Ｓｅｒ　Ａｌａ　　３２０ Ａｒｇ　Ｐｈｅ　　３２８ Ｖａｌ　　Ｉｌｅ　　３３６ Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　３４４ Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　　３５２ Ｖａｌ　　Ｈｉｓ　　３６０ Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　　３６８ Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　３７６ Ａｒｇ　Ｃｙｓ　　３８４ Ｖａｌ　Ａｒｇ　　３９２ Ａｌａ　Ａｓｐ　　４００ Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　４０８ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　　４１６ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　　４２４ Ａｌａ　Ｈｉｓ　　４３２ Ｓｅｒ　Ａｒｇ　　４４０ Ｌｅｕ　Ａｓｎ　　４４８ Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　４５６ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　　４６４ Ｈｉｓ　Ａｓｐ　　４７２ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　４８０ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　　４８８ １１ｅ　　Ｉｌｅ　　４９６ Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　　５０４ Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　　５１２ Ａｓｐ　Ｔｒｐ　　５２０ Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ） ｔＰＡＯ２４のアミノ酸配列 （Ｈ２Ｎ）−８ｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ
　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ９　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ
　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇ１ｎ１７　Ｇｌ
ｎ　Ｈｉｓ　Ｇｔｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ
　Ｐｒ。

２５　　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａ
ｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ３３　　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ
　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ４１　　Ａ
ｌａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒ
ｏ　Ｖａ１４９　　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　
Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ５７　　Ｐｈｅ　Ａｓ
ｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇ１ｎ
６５　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｐ　Ｐｈｅ　Ｖａ１７３　　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　
Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ８１　Ｇｌｙ
　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　
Ｔｈｒ８９　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ
　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇ１ｎ９７　Ｇｌｙ　Ｉ　ｌｅ　Ｓ
ｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ１０５
　　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ
　Ａｌａ　Ｇｌｕ１１３　　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ１２１　　Ｌ
ｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｙ１２９　　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ
　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ１３７　　Ｇｌｙ　
Ｌｅｕ　Ｇａｙ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃ
ｙｓ１８５　　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｒ
ｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　　１９２１９３　　Ｓｅ
ｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ
　Ｓｅｒ　　２００２０１　　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ
　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　　Ｉｌｅ　　２０
８Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　　５ｅｒ Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ Ａｓｐ　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　５ｅｒ Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　　ｌ１ｅ Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ｌ１ｅ Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　５ｅｒ Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　　Ｈｉｓ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　Ｍａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ｌ１ｅ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　　５ｅｒ Ｔｈｒ　Ｖａｔ　　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　５ｅｒ Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓ Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ Ａｌａ　　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　　Ｐｒ。

１１ｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　　ｌ１ｅ １１ｅ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　ＡｌａＧｉｎ　Ｇｌｕ
　Ａｒｇ　Ｐｈｅ Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　ｌ１ｅ Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｖａｌ Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ Ｔｙｒ　　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　Ｇ１ｎ ５ｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ Ｓｅｒ’、Ｖａｌ　　Ｖａｌ　Ａｒｇ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ ４１７　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐ
ｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　　４２４４２５　　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｈｉ
ｓ　　４３２４３３　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ
　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　　４４０４４１　
　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　
Ｌｅｕ　Ａｓｎ’　４４８４４９　　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　
Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　　
４５６４５７　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈ
ｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　　４６４４６５　Ｇｌｙ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　
Ａｓｐ　　４７２４７３　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　４８０４８
１　　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓ
ｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　　４８Ｂ４８９　Ａｒｇ　Ｍｅｔ
　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　
　４９６４９７　　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　　５０４５０５　　
Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔ
ｙｒ　’Ｊ’ｈｒ　　５１２５１３　　Ｌｙｓ　Ｖａｔ
　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　
　５２０５２１　１１ｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｍ
ｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）実施例１０．　　
ｔＰＡＯ２３およびｔＰＡＯ２４の比活性の測定部分精
製したｔＰＡ０２３およびｔＰＡＯ２４の蛋白量の決定
は総蛋白量をＢｒａｄｆｏｒｄの方法［Ａｎａｌ、　Ｂ
ｉｏｅｈｅｍ。

７２（１９７６）　２４８　］　Ｋより牛血清アルブミ
ンを標準蛋白として測定し、ｔ−ＰＡ抗原量の測定はＥ
ＬＩＳＡ法を用いた。ＥＬＩＳＡは前出の抗体°カラム
に用いたモノクローナル抗体とビオチン化したウサギ抗
ｔ−ＰＡ抗体（アメリカンダイアグツステイカ）とＫよ
るサンドウィッチ方式であり、ビオチン化ホースラディ
ッシュパーオキシダーゼーストレプタピジン複合体（ア
マジャム）とその基質（３，３’。

５．５′−テトラメチルペンチジン）Ｋより発色させた
。標準ｔ−ＰＡとしてはアメリカンダイアグツステイカ
社のヒト黒色腫細胞由来の２重鎖ｔ−ＰＡを用いた。

線溶活性の測定はフィブリン／アガロース平板法および
１２５工標識フイブリンフイルム溶解法を用いた。フ（
プリン／アガロース平板法は９５％凝固フィブリノーゲ
ンを原料として作製した寒天加フィブリン平板を用いた
。１２！！−フィブリンフィルム溶解法はＨｏｙｒａｅ
ｒｔｓ等の方法［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｓｍ、　２５
７゜（１９８２）　２９１２−２９１９コに従りた。す
なわち、１．８μＭのフィブリノーゲンに１ｆｌＩ標識
フイブリノーゲン（ＩＣＮバイオメディカル）を適当量
加えて９６穴ミクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　）　
Ｋ　５０μｔ／穴ずつ入れ、４０℃で一晩乾燥させた。

これＫ　１．６　ｕ／ｍｌのトロンビン（持田製薬）を
１００μｌずつ入れ、３７℃で４時間放置してフィブリ
ン化させた。このプレートを２回、０．２％ウシ血清ア
ルブミンと０．９％食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で
洗浄した後、活性測定に供した。各人５０μの２００ｎ
Ｍのプラスミノーゲンを入れ、さら１ｃ５０μｌのｔ−
ＦＡ標準品もしくは本発明の蛋白質を添加し、混合した
後３７℃で２時間反応させた。各人５０μｌを取り、ア
ロカ社製オートウェルガンマーカウンターにて溶解した
１２ｊＩ−フィブリンを測定し。

標準ｔ−ＰＡで作成した標準曲線より１本発明の蛋白質
の線溶活性を算出した。用いたｔ−ＰＡ標準品はインタ
ーナシｌナルｔ−ＰＡスタンダード［Ｇａｆ−ｆｕｅｙ
　ａｎｄ　Ｃｕｒｔｉｓ、　Ｔｈｒｏｍｂ−＆ｅｍｏｓ
ｔａｓ、＋　５：Ｌ　１３４　（１９８５）コで標準化
したバイオスコツト社製のヒト黒色腫細胞由来のｔ−Ｐ
Ａである。

１２ｓＩ−フィブリンフィルム法で測定した活性値とＥ
ＬＩＳＡによる抗原量とＫより算出した比活性値はｔ　
ＰＡＯ２３が２００，０００　ｕ／ｍｇ、　　ｔＰＡ０
２４では６０，０００ｕ／ｆｆ１ｇであった。この時天
然型ヒト　ｔ−ＰＡの比活性は８９０．０００　ｕ／ｌ
ｒＩｇであった。

実施例１１．　　ｔＰＡＯ２３およびｔＰＡＯ２４のフ
ィブリン親和性およびフィブリンによる活性化 Ｖｅｒｂｃ＋１ｊｅｎら［ＥＭＢＯＪ、　５（１９８６
）　３５２５−３５３０）コの方法に従い、フィブリン
に対する親和性を検討した。

各種濃度のフィブリノーゲンに本発明の蛋白質あるいは
天然型ヒトｔ−ＰＡ（２μｇ／＠）を加えさらに１ｕの
トロンビンを加えて室温で３分間反応させた。

形成したフィブリンクロットは１６，０００回転回転子
８分間遠心して沈降させ、上清中のフィブリ／に結合し
なかったｔ−ＰＡ量をフィブリン／アガロース平板法で
の活性測定で求めた結果、　　ｔＰＡＯ２３は天然型に
比ベフイプリンに対する親和性がわずかに低下している
のみであった。一方、　　ｔＰＡＯ２４は天然型よりも
劣っていた。フィブリンの存在下または非存在下におけ
るｔ　ＰＡＯ２３およびｔ　ＰＡＯ２４のプラスミノー
ゲン活性化速度を見るため以下の実験を行った。９６穴
マイクロタイタープレートを使用して、１ｍＭの合成パ
ラニトロアニリド・トリペプチド合成基質Ｓ　−２２５
１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−ｐＮＡ−ＭＣＩ　。

カビ社）、０．１５μＭプラスミン不含プラスミノーゲ
ン。

フィブリンの可溶性代替物質であるＤＥＳＡＦＩＢＴＭ
（アメリカンダイアグツステイカ社製）１００μｇ／ｍ
ｌもしくは緩衝液、（０，０１％ツウィーン８ｏを含む
５０ｍＭ　ト！Ｊスー塩酸緩衝液ｐＨ７，４）に天然型
ヒトｔ　−ＰＡ、　ｔＰＡＱ２３またはｔＰＡＯ２４を
加えて総容量１００μｌとし、３７℃で保温した。一定
時間後タイターチック　マルチスキャンにより、波長４
０５ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５ｎｍ）を測定した。

ｔｐＡｏ２３．　ｔＰＡ０２４とも天然型同様、フィブ
リン依存の活性化が認められた。特にｔＰＡＯ２３は天
然型ヒトｔ−ＰＡより高い活性化率（７１倍、天然型は
１０〜２１倍）を示した。

実施例１２８本発明の蛋白質のウサギの血流における線
維素溶解活性の分析 ウサギにおける天然型と）ｔ−ＰＡと本発明の蛋白質ｔ
ＰＡ０２３およびｔＰＡＯ２４の活性より見た薬効動態
をみたところ１両者とも活性値において半減期の顕著な
延長を示した。具体的に述べると、天然型ヒト　ｔ−Ｐ
Ａの半減期１〜２分に対してｔＰＡＯ２３とｔ　ＰＡＯ
２４のそれは両者とも約１０分であった。

さらに、　　ｔＰＡＯ２３・ｔＰＡ０２４は投与終了後
３０分においても活性値に３０％の残存（投与終了後３
０秒後の値を１００％とする）を認めた。一方、天然型
ヒトｔ−ＰＡは３０分後には活性値は１％以下であった
。本実験の方法は以下の通りである。

実験には１日本臼色ウサギの体重２．５ｋｇのもの一体
重、天然壓ヒトｔ−ＰＡ：０．１■／ｋｇ一体重であっ
た。続いて種々の時間間隔（０，５分から６０分）でカ
テーテルを用いて大腿動脈より２．５１ＩＩＺずつ１／
９容量のクエン酸Ｎａ　（３，８％）中に採血した。採
血後３０分以内に低速遠心を行い、血漿を分離した。分
離した血漿を用いて血中のｔ−ＰＡ活性を測定した。

■　ｔ−ＰＡ活性測定 血漿０．２　ｍｌを３ｍＭの氷酢酸で１６倍に希釈後。

低速遠心して沈殿物を得る。沈殿物を血漿に等しい容量
の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）、　１
４０ｍＭ　ＮａＣ１緩衝液に溶解してニーグロブリン分
画を得る。

ｔ−ＰＡ活性はこのニーグロブリン分画をフィブリン／
アガロース平板中に添加して求めた。

ｔ−ＰＡ活性は、平板を３７℃１６時間インキュベーシ
ョンした後、溶解斑として観察された。フィブリン／ア
ガロース平板は次のよう罠して作製した。

市販のフィブリノーゲン（コーンの分画Ｉ）をプラスミ
ノーゲンリッチフィブリノーゲンとしてフィブリン／ア
ガロース千板作裂に用いた。

プラスミノーゲンリッチフィブリノーゲンの最終濃度は
１３０　ｍＭ　ＮａＣｌと１０−’　Ｍ　ＣａＣｌ２を
含む２０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）緩衝液
中で１．５ｍｇ／ｍ７であった。

最終アガロース濃度は同緩衝液中で０．７５％であった
。１０ｎ＋Ｚフイブリノーゲン・アガロース溶液に）　
０　／ヒフ　（４ＯＮＩＨ単ｖｒｎｌ）　ｆ）　１００
ｐｌを加えて平板を作製した。フィブリン／アガロース
平板法の標準曲線は動物への投与に用いたｔ−ＰＡを０
．１〜１０．０００　ｕ、／＋Ａに希釈して得た。こう
して求めた血中ｔ−ＰＡ活性は投与終了３０秒後に採血
して得られたｔ−ＰＡ活性を１００％としてパーセント
表示した。結果を第５：図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、　　ｔＰＡＯＯ２遺伝子の構築図および該遺
伝子を含むベクターｐＴＺ１８　ｔＰＡＯＯ２の構築図
を示す。 第２図は９発現ベクターｐＶＹＩＡの構築図を示す。 第３図は、　　ｔｐＡＯＯ２遺伝子からｔＰＡＯ２３遺
伝子への改変工程およびｔ　ＰＡＯ２３遺伝予断片の発
現ベクターｐｖｙ　Ｉ　Ａへのサブクローニング工程を
示す図である。 第４図は、　　ｔＰＡＱＯ２遺伝子からｔＰＡＯ２４遺
伝子への改変工程およびｔ　ＰＡＯ２４遺伝予断片の発
現ベクターｐＶＹＩＡへのサブクローニング工程を示す
図である。 第５図は２本発明の蛋白質ｔｐＡｏｚ：３．　ｔＰＡＯ
２４のウサギの血流における線維素溶解活性の経時変化
を天然型ヒトｔ−ＰＡの活性と対比した図である。 第１図 第 図 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、天然型ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（以下
   天然型ヒトｔ−ＰＡと略記する）の上皮成長因子領域（
   以下ＥＧＦドメインと略記する）内に、アスパラギン結
   合型糖鎖が付加したアミノ酸配列を持つことを特徴とす
   る新規血栓溶解蛋白質。 ２、天然型ヒトｔ−ＰＡのアミノ酸配列において、Ｔｙ
   ｒ−６７がアスパラギン結合型糖鎖が付加したＡｓｎ−
   ６７であることを特徴とする新規血栓溶解蛋白質。 ３、天然型ヒトｔ−ＰＡのアミノ酸配列において、Ｉｌ
   ｅ−８６がアスパラギン結合型糖鎖が付加したＡｓｎ−
   ８６であることを特徴とする新規血栓溶解蛋白質。 ４、請求項１、２又は３記載の新規血栓溶解蛋白質のア
   ミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子。 ５、請求項４記載のＤＮＡ分子をアスパラギン結合型糖
   鎖付加反応の可能な宿主細胞において発現させ得る複製
   可能な発現ベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し
   て組換宿主細胞を得、該ＤＮＡ分子を発現させ得る条件
   下で培養して該ＤＮＡ分子がコードしている蛋白質を産
   生させ、培養物より該蛋白質を得ることを特徴とする該
   蛋白質の製造方法。 ６、請求項１、２又は３のいずれかに記載の蛋白質の治
   療上の有効量と薬学的に許容される担体との混合から成
   る、血栓性疾病の治療剤