JPH04166087A

JPH04166087A - 新規な蛋白

Info

Publication number: JPH04166087A
Application number: JP2287074A
Authority: JP
Inventors: Nobuya Kitaguchi; 暢哉北口; Satoshi Shiojiri; 塩尻　聡; Yasuyuki Takahashi; 保之高橋
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-10-26
Filing date: 1990-10-26
Publication date: 1992-06-11

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、プロテアーゼ阻害活性を有する新規、　なペ
プチドに関するものである。さらに詳しくは、ヒトアミ
ロイド前駆体蛋白内に内在されるプロテアーゼインヒビ
ター活性を持つ領域を構成するアミノ酸の一部を改変す
ることにより得られる、抗トリプシン活性、抗カリクレ
イン活性、抗ファクターＸａ活性等を有する蛋白質およ
び該蛋白質を有効成分とする蛋白分解酵素阻害剤に関す
るものである。

〔従来の技術〕

重症急性膵炎においてしはしは併発する汎発生血管内血
液凝固症（以下ＤＩＣと略す）や、感染症等によって惹
起されるＤＩＣの治療薬、及び出血性ショック、外傷性
ショック、細菌性ショック等のショックの治療薬として
は、アプロチニン（ウシ膵臓Ｉ・リプシンインヒビター
。ＢＰＴＩと略す）、ウリナスタチン等の蛋白分解酵素
阻害剤か用いられている。ＤＩＣでは血液凝固系の酵素
であるＩ・ロンビンやファクターＸａが活性化されフィ
ブリン塊か形成される。また上記ショックではカリクレ
インか活性化され、キニン遊離が促進され血圧か低下し
ショックに至る。

しかしながら、これらの酵素に対するＢＰＴＴやウリナ
スタチンの阻害活性は十分であるとは言い難い。本発明
者らか測定したところトロンビンはＢＰＴＩ、ウリナス
タチンいずれでも阻害されず、またファクターＸａはＢ
ＰＴＩでは阻害されず、ウリナスタチンでは平衡阻害定
数（Ｋｉ）２Ｘ１０−６Ｍで阻害された（特開平２−１
０１０１７、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　Ｖｏｌ、　１０３８１０５−１
１３１９９０、及び本発明参考例参照）。

血しょうカリクレインはＢＰＴＩてはＫｉ＝６Ｘ　１０
−７Ｍで阻害され、ウリナスタチンではに１＝２Ｘ１０
−６Ｍで阻害された。これらの阻害定数は十分小さいと
は言い難く、阻害活性を示さなかった組合せも含め、こ
れらの蛋白分解酵素阻害剤はＤＩＣやショックに最適の
ものであるとは言えないのが現状である。

また、これらの蛋白分解酵素阻害剤はトリプシンに対す
る強い阻害作用があるため急性膵炎の治療薬としても用
いられている。しかしながら、ＢＰＴＩはウシ由来の蛋
白であるため、抗原性か高く反復投与によりアナフィラ
キシ−ショックを引き起こす事かある（日本臨床、４４
巻　秋期臨時増刊号　ｐ７６６〜７６７　１９８８年）
。

一方、老人斑アミロイド前駆体蛋白（これを以後ＡＰＰ
と略す）中に蛋白分解酵素阻害活性をもつ部分（これを
以後ＡＰＰ　Ｉと略す）か内在される事か知られている
（特願昭６３−２０１９９８号公報、北口ほか著、神経
研究の進歩（１９９０年医学書院発行）第３４巻３号　
４０９〜４２１ページ、及び北口らネーチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）　３３］、　　ｐ５３０〜５３２．１９８８、
ポンド（Ｐ、Ｐｏｎｔｅ）らネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）　３３１ｐ５２５−５２７．１９８８、タンク（ＲＥ
　Ｔａｎｚｉ　）らネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３３
１　　ｐ５２８−５３０．１９８８、公表特許子２−５
０１７９６号公報参照。）。

Ａ、ＰＰＴとは具体的には本願明細書の第１図Ａ中のＡ
ＰＰ７５１中の斜線部、及びＡＰＰ７７０中の斜線部と
点々部分をさし、そのアミノ酸配列はそれぞれ第１図Ｃ
と第１図Ｂに示した通りである。（ＡＰＰ７５１は７５
１個のアミノ酸よりなる　ＡＰＰ、またＡＰＰ７７０は
７７０個のアミノ酸よりなるＡＰＰである。（欧州特許
公開番号０３０４１３号公報。））第１図ＢとＣに共通な配列（第１図Ｂ、Ｃの残基番号て
２８９のＧｌｕから３４４のＡｌａまで。

これを第１図りに示した。）が蛋白分解酵素阻害活性に
重要と考えられる部分で、以後ＫＰＴと呼ぶ。このＫＰ
Ｉを前述ＢＰＴＩやウリナスタチンと同様な治療薬に応
用できる可能性が考えられる。

ＫＰＴはヒト由来の蛋白であるため、反復投与によるシ
ョックを引き起こす可能性は低い。かつ、ＫＰＴはトリ
プシンを強く阻害すると共に、ファフタ−Ｘａにも阻害
活性を示しくＫｉ　＝１．２　ｘｌｏ−６Ｍ）、血しよ
うカリクレインに対してもに１−１．９　Ｘ　１０−７
Ｍと強い阻害活性をもつ（特開平２−１０１０１７号公
報、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａ　ＡｃｔａＶｏｌ、　１０３８１０５−１１３１９９
０参照）。また、ＫＰＩを含有する老人斑アミロイド前
駆体蛋白は血液凝固因子ファクターＸＩａを強く阻害す
ることか最近報告された（Ｖａｎ　Ｎｏ５ｔｒａｎｄら
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

Ｖｏｌ、　　２６５９５９１−９５９４．　１９９０．
　　Ｓｍ１ｔｈ　ら、５ｃｉｅｎｓｅＶｏ１．２４８　
；　１１２６−１１２８．１９９０．）。尚、ＫＰＩ、
ＢＰＴＩ、また蛋白分解酵素阻害剤の一つであるトリプ
スタチンの、プラスミンやファクターＸａに対する活性
の差は、活性中心付近のアミノ酸の違いで説明できる可
能性かある（Ｔｏｍａ、　Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｊ、
Ｍｏ１．Ｇｒａｐｈｉｃｓ、　Ｖｏｌ、７　２０２−２
０５．２１８．　１９８９）。

ＫＰＩは前述のＢＰＴＩやウリナスタチンに比ベファク
ターＸａやカリクレインに対してより強い阻害作用を有
しているが、−層の活性増強か望まれている。

一方、近年、天然に存在するペプチド性プロチー６＝アーゼインヒヒビターの活性中心付近のアミノ酸を蛋白
工学的手法を用いて改変し、その標的酵素に対する特異
性を変化させたり増強させることか可能になってきた。

例えは、かび由来のプロテアーゼインヒヒビターである
スブチリシンインヒビター（以下ＳＳＩと略す）では、
活性中心（これを以後Ｐ１部位と呼ぶ）と考えられるメ
チオニン残基を、リジン残基やアルギニン残基に変換す
ることにより、トリプシンに対する阻害活性か上昇した
り、チロシン残基やトリプ１〜ファン残基に変換するこ
とで、キモトリプシンに対する阻害活性か上昇すること
か報告されている。〔小島修−ら蛋白質核酸酵素　３４
巻、ｐ９３９−１９８９）また、クニッツ型トリプシン
インヒビターであるアプロチニンを化学的に合成するこ
とが可能だが、その活性中心（Ｐｉ部位）のりジン残基
をバリンやロイシン残基なとに変換して合成することに
よって、エラスターゼに対する阻害活性が上昇すること
も報告されている。（Ｂｅｃｋｍａｎｎ　Ｊ、　ｅｔ　
ａｌ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉ−ｏｃｈｅｍ、　１７６　
ｐ６７５　（１９８８）　）更に膵臓分泌性ｌ・リプシ
ンインヒビターを遺伝子工学的に改変し抗エラスターゼ
活性を上げた例も知られている（特開昭６３−１６９９
９４号公報）。

本発明者らは、先にＫＰＩのＰ１部位（第１図り参照）
を天然型のアルギニンからイソロイシン、バリン、また
はロイシンに遺伝子工学的に変えることにより、ＫＰＩ
の好中球エラスターゼに対する阻害活性が著しく強くな
り、肺気腫治療薬や抗炎症剤等として有用なことを見い
だし先に出願した（特願平１−３３６６３０号公報）。

しかしなからＰ１部位をこのように変異させるとトリプ
シンに対する阻害活性はかなり弱まってしまう。

〔本発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、ＫＰＩのトリプシンに対する阻害活性
を維持したまま、ファクターＸａ、カリクレイン等に対
する阻害活性をより高め、抗原性が低く、ＤＩＣ、ショ
ック及び急性膵炎等の治療薬として薬学的に有用な変異
型ペプチドを提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上述の課題を解決すべく鋭意研究を重ね
た結果、上述する知見を得、該知見に基づいて更なる研
究の結果完成に至ったものである。

即ち本発明者らは、ＫＰＩに着目し、その活性中心付近
に変異を与え、種々のＫＰＩ誘導体を作成した。ＫＰＩ
誘導体をサル由来のＣＯ３−１細胞で発現させ、部分的
に目的物を精製した後に、ＫＰＩに対する抗体を用いて
目的物の含量を測定し、各プラスミン阻害活性を測定し
た。その結果、実施例に示すように、第１図り第３０３
番目のＰ２’部位のメチオニン残基に変異を与えること
で、抗Ｉ・リプシンに対する活性を維持しつつ抗ファク
ターＸａ活性、および抗カリクレイン活性か、天然型の
ＫＰＩに比較してそれぞれ４倍、１５〜２０倍高められ
ることか判明した。

従って本発明は、下記一般式（Ｉ）：Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｘ　−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈ
ｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇ］、
ｙ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ
−Ｔｈｒ−Ｇ１．ｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａで
表わされるアミノ酸配列を少なくともその一部に含む蛋
白質を提供する。（ＸはＭｅｔ以外の、非天然型のアミ
ノ酸も含む任意のアミノ酸である。）但し、後述の実施
例から明らかな通り、Ｘはアラニン、ロイシン、バリン
なとのアミノ酸が有効である。Ｘをかえてもトリプシン
に対する阻害活性は天然型とほぼ同程度である。Ｘかア
ラニンである本発明の蛋白質は、天然型に比べ、プラス
ミン阻害活性かやや増大し、ファクターＸａに対しては
約４倍、カリクレインに対しては約２０倍、活性が増加
する。Ｘかロイシンのものは天然型に比べ、ファクター
Ｘａ阻害活性はほとんど変わらないか、プラスミン阻害
活性は約３倍、カリクレインに対しては約１５倍活性が
増加する。Ｘがバリンのものは天然型に比べ、カリクレ
インに対する活性がやや増大する。さらに本発明の蛋白
質はファクターＸＴａに対する阻害活性も増大し血液凝
固阻害活性かきわめて強い。

ＫＰＩは上述のとおり一般式（Ｉ）で表わされる５６個
のアミノ酸よりなるアミノ酸配列をもつかＮ末端または
Ｃ末端側のアミノ酸を更に切り縮めても蛋白分解酵素阻
害活性をもつ可能性もある。

本発明の対象とするところは、この蛋白分解酵素阻害活
性を持つ最小単位をさすものである。

さらに本発明は、活性中心近傍のアミノ酸、例えばＸの
Ｎ末側に隣接するアラニン残基を更に他のアミノ酸に変
異させる事によって抗ファクターＸａ、抗カリクレイン
活性か増加することは十分に考えられる。従ってそのよ
うな変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質も本発明に包
含される。

更にまた本発明にかかる蛋白質の活性中心付近、例えば
ＰｌのＮ末側及びＰｌのＣ末側のそれぞれ５個のアミノ
酸からなるペプチドを、他の蛋白分解酵素阻害剤１、例
えばＢＰＴＩの対応する部分と置換したものも、本発明
の目的を達成しうろことか期待される。

本発明の蛋白質は、そのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを適当なプロモーターの下流に接続し、大腸菌、枯草
菌、動物細胞等の適当な宿主へ形質転換し、形質転換体
を培養することにより産生せしめることができる。かか
るＤＮＡは有機化学的に合成したＤＮＡを適当にアニー
リング及びライゲーションすることによって得られる。

またヒ）・脳アミロイド前駆体蛋白質である、７７０あ
るいは７５１アミノ酸からなる蛋白質（欧州特許公開番
号０３０４１３号公報。第１図ＡのＡＰＰ　７７０゜Ａ
ＰＰ　７５１　）のｃＤＮＡから、部位特異的変異導入
法（サイトダイレクティッドミュータジェネシス）ｒＴ
ａｉｌｏｒ、　Ｊ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　１３８７４９−８７６４．
８７６４−８７６５　（１９８５）　、Ｅｇｈｔｅｄａ
ｒｚａｄｅｈ。

Ｍ、に、、　ｅｔ　ａｌ、１ｂｉｄ、　５１５］　（１
９８６）なと」により欠失、点変異、挿入等を行って目
的とするＤＮＡを得ることもできる。

また、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａの上流に、分泌のためのシグナル配列を接続し、宿主
か動物細胞の時は培地中に、または宿主か大腸菌の時は
べりプラズムや培地中に本発明の蛋白質を分泌させるこ
ともできる。培地中に、本発明の蛋白質を分泌させるよ
うにしたこのようなりＮＡは、該蛋白質を効率よく精製
する点で有用である。

また、本発明の蛋白質を適当な他の蛋白質（例えばβ−
ガラクトシダーゼやその一部、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
なと）と接続した融合蛋白として産生させたのち、該接
続蛋白部分の抗原性やその他の性質を用いて、該融合蛋
白の精製、定量をすることも有効である。さらに、該融
合蛋白を適当な蛋白分解酵素やその他の切断のための薬
剤等で処理して目的とする本発明の蛋白のみを単離する
こともてきる。

本願発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを
、適当なプロモーターの下流に接続し、場合によっては
、そのさらに下流に適当なｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナル
なとのターミネーションシグナルを付加し、さらに複製
可能なベクターに連結して、動物細胞へトランスフェク
トし、これを培養することにより、その細胞中または上
清中に本願発明の蛋白質を産生せしめることができる。

このようなプロモーターとしては、例えはＳＶ４０初期
、ＳＶ４０後期、ＭＭＴＶなとのウィルスプロモーター
、アクチン、チューブリン等の細胞構成蛋白のプロモー
ター、メタロチオネイン、ピー１〜シヨツク蛋白などの
誘導型プロモーターなどがあげられる。ベクターとして
はＳＶ４０、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）などの
ウィルスベクターを用いることかできるか、また、ベク
ターを用いず直接動物細胞へトランスフェクトすること
も可能である。この際、適当なマーカー、例えばネオマ
イシン耐性遺伝子を接続するかまたは同時にトランスフ
エフＩ〜（コトランスフエクト）することにより、宿主
に抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を与え、形質転換体を
効率よく選択することもてきる。

動物細胞宿主としては、先述したＣＯ８細胞、ＣＨ○細
胞、Ｃ−１２７細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ラットＰＣＩ
２細胞、ヒト腎臓由来２９３細胞などを用いることかで
きる。

さらにまた、本発明の蛋白質は、上述のＤＮＡをｔｒｐ
、　ｌａｃ、　ｔａｃ等の適当なプロモーターの下流に
接続し、場合によってはこれらの下流に適当なターミネ
ーションシグナルを付加し、さらに複製可能なベクター
を連結して、微生物宿主形質転換し、これを培養するこ
とにより産生せしめることかできる。目的とするペプチ
ドを直接発現させるためにはその遺伝子の５′末端に翻
訳開始シグナルのＡＴＧを付加することも可能である。

また、培地またはべりプラズム中に直接分泌させるため
に、シグナル配列を付加することも可能である。

低分子ペプチドは微生物中では不安定なことかあるので
、適当な担体蛋白との融合蛋白として産生ずる事も可能
である。この融合蛋白は産生後、適当な蛋白分解酵素や
切断のための薬剤（一般にはシアノジエンブロマイド等
が用いられる）等で処理して目的とする部分を切り出す
事が可能である。宿主微生物としては、例えは大腸菌、
枯草菌、カビ、酵母等が用いられる。

またさらに、本発明の蛋白質は、アミノ酸を出発原料と
して有機合成により製造することかできる。その場合の
方法としては、例えは、生化学実験講座第１巻、蛋白質
の化学ＴＶ（日本生化学全編、東京化学同人）に詳しく
記されている方法を用いることができる。また別に、ペ
プチド合成機を用いる同相合成法により製造することも
てきる。

本発明の蛋白質を微生物宿主で産生した場合や化学合成
で得た場合、システィン残基間で正しいＳ−８結合の形
成、即ち、正しい折り畳み（ｆｏｌｄ−ｉｎｇ）ができ
ないことかあるが、この場合は、Ｓ−８結合を一旦還元
してその後再酸化して自然に正しいｆｏｌｄｉｎｇを起
こさせることか必要である。

本発明の蛋白質は、蛋白質またはペプチドの精製方法と
して知られる各種の方法を組み合わせることによって精
製することかできる。そのような方法としては例えは、
高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマ１〜ク
ラフイー、ゲル　過クロマ）・グラフィー、アフィニテ
ィークロマトクラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動、等電点電気泳動、塩析、硫安沈澱などを用いるこ
とかできる。また、本発明の蛋白はトリプシンに対する
結合活性か強いので、担体に固定化したｌ・リプシンや
アンヒドロ１へリプシン等を用いたアフィニティークロ
マトクラフィーは特に有用である。

本発明の医薬組成物は、本発明にかかる蛋白質を、単独
で又は薬剤的に投与可能な担体と複合して投与される。

その組成は、該蛋白質の溶解度、投与経路、投与計画等
によって決定される。

例えは、本発明の蛋白質を非経口的に筋肉内注躬、静脈
内注射、皮下注射て投与する場合、溶液を等張にするた
めに食塩あるいはグルコース等の他の溶質を添加した無
菌容液として使用される。

また、でんぷん、乳糖等の適当な賦形剤を含む錠剤、カ
プセル剤、顆粒剤や、溶液の状態で経口投与も可能であ
る。ただし、本発明にかかる蛋白質は、分子量の比較的
大きな薬剤なので、腸管吸収性の点から非経口投与が望
ましい。経口投与の場合は、消化管内に存在している蛋
白分解酵素を阻害する作用が主になる。非経口投与では
、薬効が早くあられれる点で、静脈内注射、点滴静注な
とが好ましい。

本発明の医薬組成物の投与量は投与方法、化合物の種類
、患者の状態等によって異なり、特に限定されないが、
通常、成人−人一日当り約１〜１００ｍｇ、好ましくは
約５〜３０ｍｇを、経口もしくは非経口的に一日一回も
しくはそれ以上投与される。

〔発明の効果〕

本発明によって得られた蛋白質は、膵炎の治療薬として
重要な抗トリプシン活性を保持する一方、変異をかけな
い蛋白質と比較して、高い抗ファクターＸａ、抗カリク
レイン活性を有し、種々の基礎疾患によるＤＴＣやショ
ック、重症急性膵炎時に併発しやすいＤＩＣやショック
等に対しても治療効果か期待される。

実施例以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明は該実
施例によって限定されるものではない。

尚実施例中の基本的操作は下記の文献にしたかった。

・Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＡ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｍａｎｕａｌ、　　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｔ）ｏｒａｔｏｒｙ、　　（１９８２）−Ｄ、Ｍ
、ＧＩｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　、　　ＤＮＡ　ＣＬＯ
ＮＩＮＧ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

実施例中に記載の略号、略称で本文中に記載の無いもの
は以下の通りである。

ＳＳＣ；０．９Ｍ塩化すｌ・リウム／　９０　ｍＭクエ
ン酸ナトリウムＤＴＴ　　、ジチオスレイト−ルＦＣ３、ウシ胎児血清ＤＭＳ○ニジメチルスルホキシドＢＡＰ　　：バクテリアアルカリフォスファタ−ゼｔＰＡ　　；ヒＩ・組織型プラスミノーゲンアクチベー
ターバッファ−Ｔ：０．２Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）１０
、０２Ｍ　ＣａＣｌ２／　０．００５％ＴｒｉｔｏｎＸ
］００実施例１ＩＪ　（ＡＰＰ　Ｔ−８８）及びＭＸの作成と活性測定
（アミノ酸配列については第１図Ａ参照）〔工程１）　
　Ａ、ＰＰ７７０からのＡＰＰ　Ｔ部分の切り出し発現の母核となる部分として、後の解析のやり易さなど
を考え、プロテアーゼ阻害活性をコードする部分（ＡＰ
ＰＴ）に加えて、Ｎ未開及びＣ末側にＡＰＰ７７０由来
のアミノ酸を含むペプチド部分を発現させた。このため
にＡＰＰ７７０をコードするＤＮＡを、合成オリゴヌク
レオチドを用いたいわゆる部位特異的変異法で切り縮め
た。この反応にはＭｕｔａｎ”Ｇ　（宝酒造）システム
を用い、反応は付属されるプロトコールを一部改変して
３′側及び５′側の欠失反応を同時に行った。

以下にその概略を述へる。

欧州特許公開番号０３０４１３号公報記載のヒトアミロ
イド前駆体遺伝子ｃＤＮＡを含むプラスミドｐ　Ｇ　Ｂ
　Ｐ　２　（ＡＴＣＣ−’６７５０２の番号で寄託）を
制限酵素ＢａｍＨＩ消化後ア消化−アガロースゲル電気
泳動、ＡＰＰ１部分を含む、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を
回収した。この断片をＢａｍＨＩ切断後ＢＡＰ処理した
ベクターＴｖ１８（宝酒造）に接続し、目的の方向に組
み込まれたクローンＴｖＢＢｌを得た。（第２図参照）
。

５′末側、及び３′末側の欠失のため、第３図に示す２
本のオリゴヌクレオチドＤ５、Ｄ３をアプライドバイオ
システムダＤＮＡ合成機３８０Ａにて合成し、反応に使
用した。Ｄ５による欠失反応か起こると、ＢａｍＨＩ切
断後、ｔＰＡのシグナル配列中に存在するＢｇｌＩＩ部
位と接続した時、ｔＰＡシグナル配列の後にＡＰＰ７７
０由来の６アミノ酸に続き上記の一般式（Ｉ）に記した
ペプチドかつながる構造を持つ（第４図参照）。さらに
Ｄ３による欠失が起こると、上記一般式（Ｉ）に記した
部分に続きＡＰＰ　７７０由来のＣ未開２５アミノ酸と
それに続く停止コドンとＢａｍＨ１部位が導入される。

すなわちＤ３を用いた反応は欠失反応と同時に２塩基の
置換を行うものである。

（第３図、第４図参照）。まず１重鎖ＴｖＢＢＩ　ＤＮ
Ａ０．５μｇにキラ１〜に付属するｍｐ１８Ｐ　　ＤＮ
Ａを０．２μｇ加え、１０μｍの（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
Ｃｌ（ｐＨ８，０）、１０　ｍＭ　ＭｇＣ１□、５０　
ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ’　ＤＴＴ）中で１００’Ｃ３
分、６５°ＣＩＯ分、３７°ＣＩＯ分インキュベートし
てアニールさせた。このアニールさせたＤＮＡ溶液４５
μｍに燐酸化したＤ３、Ｄ５をそれぞれ１６ｎｇ加え、
６５°Ｃ１５分、３７°Ｃ１５分インキュベートしアニ
ールさせた。ここに３０μｍの５０　ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ
１（ｐＨ８，０）、６０　ｍＭ’　ＮＨ４０ΔＣ１５ｍ
Ｍ　Ｍｇｃ１２．５ｍＭ　ＤＴＴ、　１ｍＭ　　ＮΔＤ
）及び６０Ｌ：ｙ　ｈのＥ、ｃｏｌｉ　リガーゼ、１ユ
ニツトのＴ４ポリメラーゼをくわえ、２５°Ｃで２時間
反応させた。

この反応物を大腸菌ＢＭＨ７１−１８株にトランスフェ
クトし、１時間培養液ファージ粒子を含む培養液を大腸
菌ＭＶ１．１８４株にインフェク）・シ、プラークを形
成させた（使用した大腸菌及びバッファー、酵素はすべ
て宝酒造）。このプラーりに対して３２Ｐで標識したＤ
５とＤ３を用いてスクリーニングした。Ｄ５、Ｄ３とも
にポジティブなシグナルを与えるプラークのうち４つを
選定し、Ｍ１３シークエンスキット（宝酒造）を用いて
欠失部位の塩基配列を決定した。Ｄ３の欠失は、キット
に付属のユニバーサルプライマーを、Ｄ５の欠失にはカ
スタムメイドのプライマー（５’　ＡＣＴＴＴＧＧＧＡ
ＣＡＴＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡ　３　’　）を用いた
。目的の欠失か起こっているクローンを、ＴｖｌＪと命
名した。

〔工程２〕　分泌シグナルを持つ動物ベクターへの組み
込み上記の欧州特許公開番号０３０４’１３号公報に記載の
ヒ１−ｔＰＡを発現するプラスミドベクターｐＳＶＭＴ
ｔＰＡを制限酵素ＢｇｌＩＩで完全消化後、ＢａｍＨＩ
で部分消化し、得られる約３．８ｋｂの断片をＴｖＩＪ
のプラスミドをＢａｍＨＴを消化して得られる約３００
ｂｐの断片と連結し、目的の方向に組み込まれたクロー
ンを選択した。これによりｔＰＡのシグナル配列に続＜
ＡＰＰ■部分をＳＶ４０およびマウスメタロチオネイン
プロモーターにて発現させるベクターｐｌＪを得た（第
５図参照）。

〔工程３〕変異体の作成とベクタ〜への紹み込みｐＩＪ
をＢａｍＨＴ消化後、切り出される断片をｍｐ１８（宝
酒造）に組み込み、目的の方向に組み込まれたクローン
ｍｐＴＪを得た（第５図）。

以下にＰ２’２’のメチオニン残基に変異を与える変異
体の作成方法を記すが、主として先述のＴａ１ｌｏｒ　
Ｊ、Ｗ、らの方法にしたかった。なお使用した１本鎖Ｄ
ＮＡは野生型であるｍｐＴＪのＤＮＡを利用した。変異
をかけるために合成した（すへて（−）鎖）オリゴヌク
レオチドミューチーターを以下に示す。以後変異をかけ
たミューチーターをｎＭＸと総称する（このＸはＡ、Ｖ
、Ｌ、、Ｆのいずれかを意味し、またＡはアラニン、■
はバリン、Ｌはロイシン、Ｆはフェニルアラニンを意味
する。）Ｔ　Ｊ　、　　５’　−ＡＧＣＧＧＧＡＧＡＴ　ＣＡ　
Ｔ　ＴＧＣＴＣＧＧＣＡ−３’変異用のｎ　Ｍ　Ｘｎ　ＭＡ、　；　　５’　−ＡＧＣＧＧＧＡＧＡＴ　Ｇ
　Ｇ　ＣＴＧＣＴＣＧＧＣＡ−３’ｎ　ＭＶ　；　　５
’　−ＡＧＣＧＧＧＡＧＡＴ　Ｇ　Ａ　ＣＴＧＣＴＣＧ
ＧＣＡ−３’ｎ　ＭＬ　；　　５’　−ＡＧＣＧＧＧＡ
ＧＡＴ　Ｇ　Ａ　Ｇ　ＴＧＣＴＣＧＧＣＡ−３’ｎ　Ｍ
Ｆ　；　　５′−ＡＧＣＧＧＧＡＧＡＴ　Ｇ　Ａ　Ａ　
ＴＧＣＴＣＧＧＣＡ−３’合成したオリゴヌクレオチド
ミューチーターｎＭＸ　３５　ｐｍｏｌ及び塩基配列決
定に用いるユニバーサルプライマーＭｌ　（宝酒造）１
０ｐｍｏｌをリン酸化し、ｍｐＩＪの１本鎖ＤＮＡ　０
．５μｇを加え、９５°Ｃ５分間インキュベー１・後、
徐冷しリン酸化したオリゴヌクレオチドとアニールさせ
た。この反応物を、最終的に２５０　μＭ　ｄＮＴＰ、
　０．５　ｍＭ　ＡＴＰ、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１
（ｐＨ７，５）、６０　ｍＭ　ＮａＣ１、］、　ｍＭＤ
ＴＴ（）−タル５０μｍ）になるように調製し、Ｅｃｏ
ｌｉ　　：ＤＮＡポリメラ−ゼクレノウフラグメン１へ
４ユニツト、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ１０ユニツト（宝
酒造）を加え、３７°Ｃて３０分間インキュベートした
のち、５μｍの０．５ＭＥＤＴＡを加えて反応を停止さ
せた。この反応物を大腸菌ＪＭ１０５に１〜ランスフエ
クトし、プラークを形成させた。このプラークに対し、
反応に用いたオリゴヌクレオチドミューチーターを３２
ｐで標識したものをプローブとしてスクリーニングした
。ポジティブなシグナルを与えるプラークについて塩基
配列を決定し目的の変異かおこっている事を確認し、ｍ
ｐＭＸと命名した。確認したクローンｍｐＭＸの２重鎖
Ｄ　Ｎ　ＡをＢａｍＨＪて切１新して得られる断片を、
ＢａｍＨＩ切断後ＢＡＰ処理をしたｐＩＪに挿入し目的
の方向に組み込まれたクローンを選択した（第５図参照
）。更に確認のために、スクリーニングに使用したのと
同じプローブを用いて常法に従いサザン解析を行って、
目的の変異を各クローンか持っていることを確認した。

こうして得られたクローンをｐＳＶＭＸと命名した。

〔工程４〕　ＩＪおよびＡＰＰ　Ｉ変異体の動物細胞で
の発現と粗精製液の調整ｐＭＸシリーズまたはｐＩＪのプラスミドＤＮＡ各２０
μｇを、各１×１０６個のサル由来細胞株Ｃ０３−Ｉ　
　ＣグルラマンＹ、　Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１．］、
。

２３１７５　（１９８１）　、大日本製薬〕へ、シュー
クロース含有Ｐ　Ｂ　Ｓ　（２７２ｍＭ、シュークロー
ス、７ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，４）　１　ｍＭ　
ＭｇＣｌ□）中で導入した。

導入はバイオランド社のシーンパルサーを用い、電圧４
００Ｖ、キャパシター３μＦ、タイムコンスタンド　１
．０〜１．３ｍ秒で、３０秒の間をおいて２回パルスを
与えることにより行った。導入後の細胞を、１０％ＦＣ
３を含むダルベツコ変法最小基本培地中で３７°Ｃ１５
％ＣＯ２の条件下で２４時間培養後、血清を含まない培
地で洗浄し、血清を含まない培地１０艷を加えて、４８
時間培養したのち培地を回収した。さらに培地を加え、
４８時間後ごとに計３回培養上清を回収した。この導入
を各々の構築プラスミドに対して３回行い、各構築プラ
スミド当り９０艷の培養上清を得た。

各培養上清に対して、アセトンを終濃度３０％になるよ
うに加え、−２０°Ｃにて１時間放置後、５０００ｒｐ
ｍ　、−１０°Ｃにて２０分間遠心分離後、上清を回収
した。さらに、この上清に終濃度７０％になるようにア
セ１〜ンを加えて、−２０°Ｃ１時間放置後、５０００
　ｒｐｍ、　−１０°Ｃにて２０分間遠心分離後、沈澱
を回収した。

得られた沈澱を、５扁の２０　ｍＭ　ｌ□　’）ス塩酸
（ｐＨ８，０）に懸濁し、５０００　ｒｐｍ、　　４°
Ｃにて１０分間遠心分離し、上清を粗精製液として回収
した。この上清に含まれる目的とするＡＰＰ　Ｉ変異蛋
白をそれぞれＭＸ　（ＸはＡ、　Ｖ、　Ｌ、　Ｆのいず
れかを示す）と呼ぶ。また変異のかかっていない蛋白を
ＩＪとよぶ。

〔工程５〕　抗体による生産物の定量工程４で得たＭＸ及びＴＪの粗精製液の一部を、上述の
一般式（１）に記した部分につづ＜　ＡＰＰ７７０由来
の配列（第１図８３４５−３６４のアミノ酸）を認識す
るモノクローナル抗体（特開平２−１３８９９５号公報
に記載のＡＤＪ−５−３−７、および特願昭２−２４２
４６９号公報に記載の７Ｅ１１、その産生株はＦＥＲＭ
Ｐ−１６３３の寄託番号で微生物工業技術研究所に寄託
）を用い、酵素免疫測定法第３版（石川栄治他編集、医
学書院出版（１９８７）　）記載の方法に従って、各Ａ
Ｐ　Ｐ　、Ｉ誘導物の含量を測定した。標準物質として
は欧州特許公開番号０３０４１３号公報記載のトリプシ
ン結合アガロースビーズを利用したアフィニティカラム
によって精製した精製ＴＪ蛋白を使用した。

〔工程６〕Ｉ・リプシン阻害活性のＩＣ５０の測定トリ
プシンの阻害活性のＩＣ５０は次のような方法で測定し
た。９０μｍのバッファーＴに１０μｍのサンプルを加
え、同じくバッファーＴを用いて９６穴プレート上で２
〜１０２４倍希釈し、サンプル波谷５０μｍを調製した
。これに同バッファーで４Ｘ１０−９Ｍに調製したブタ
膵臓トリプシン液（シグマ）を５０μｍ加え、１時間室
温にて放置後、蛍光基質として同バッファーで調製した
（０．４％ＤＭＳ○を含む）　０．２　ｍＭ　Ｂｅｎｚ
ｏｙｌ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（シグマ）を１００μｍ加え、
３０°Ｃて０時間後及び２時間後、３６５ｎｍで励起し
た時の４５０１ｍの蛍光をＰａｎｄｅｘ社製ＦＣＡで測
定した。測定値を縦軸に希釈率を横軸にとりグラフをか
き、バックグラウンドをひいた最大吸光度の半分の値を
与える希釈率からＩＣ５０を求めた。結果を以下の第１
表に示す。

（以下余白）＝２９− 第１表　ＭＸシリースのトリプシン阻害活性のＩＣ５０値〔工程７〕フアクターＸａ阻害活性のＩＣ５０の測定ファクターＸａ阻害活性のＩＣ５０は次のような方法で
測定した。５０μｍのバッファーＴに５０μｍのサンプ
ルを加え、同バッファーＴを用いて９６穴プレート上で
２〜１０２４倍希釈し、サンプル波谷５０μｍを調製し
た。これに同バッファーで１．９　Ｘ　１０−８Ｍに調
製したファクターＸａ液（シグマ）を５０μｍ加え、２
０分室温にて放置後、蛍光基質として同バッファーで調
製した（２％ＤＭ３Ｃを含む）　０．２　ｍＭ　Ｂｏｃ
−Ｉｌｅ−ＧＩｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（フナコシ
）を１００μｍ加えた。この後は上述の工程６と同様に
してＩＣ５０を求めた。結果を以下の第２表に示す。

第２表　ＭＸシリーズのファクターＸａ阻害活性のＩＣ
５０値〔工程８〕カリクレイン阻害活性のＩＣ５０の測定カリクレイン阻害活性のＩＣ５０は次のような方法で測
定した。８０μｍのバッファーＴに２０μｍのザンプル
を加え、同バッファーＴを用いて９６穴プレート上で２
〜１０２４倍希釈し、サンプル波谷５０μｍを調製した
。これに同バッファーで６．４　Ｘ　１０−１０Ｍに調
製したヒト血しようカリクレイン液（シグマ）を５０μ
ｍ加え、２０分室温にて放置後、蛍光基質として同バッ
ファーで調製した（０．５％ＤＭＳ○を含む）　０．２
　ｍＭ　Ｚ−円］ｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（フナコシ）を１
００μｍ加えた。この後は上述の工程６と同様にしてＩ
Ｃ５０を求めた。

結果を以下の第３表に示す。

第３表　ＭＸシリーズのカリクレイン阻害活性のＩＣ５０値〔工程９〕プラスミン阻害活性のＩＣ５０の測定カリク
レインの代わりにヒト血しようプラスミン（シグマ）、
蛍光基質としてＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭ
Ｃ（フナコシ）を用いた以外は上述の工程８と同様にし
て、プラスミン阻害活性を測定した。結果を第４表に示
す。

第４表　ＭＸシリーズのプラスミン阻害活性のＩＣ５０値実施例２ｓＰＴ及びＰＩＭＸの作成と活性測定〔工程１〕　発現プラスミドの構築欧州特許公開番号０３０４１３号公報の実施例７に記載
の方法で得たｐＳＶＭＴ−ＡＰＰ［（このプラスミドは
ｔＰＡシグナル配列に続いて第１図Ａ記載のｓＰＩを動
物細胞で発現する）を、ｐＩＪの代わりに用いて、上述
の本発明実施例１工程３と同様にして、そのＢａｍＨＩ
断片をｒｎｐ１８に組み込み、目的とするｍｐＰＩを得
た。このｍｐＰＩに、上述の本発明実施例１工程３記載
の方法で変異をかけて、ｓＰＩ変異体発現プラスミドｐ
ｐ＋Ｍｘ（ＸはＡ、　　Ｌ、　Ｖ、　　Ｆのいずれかを
示す）を得た。

ｐＰＩＭＸはｓＰＩのＰ２’のメチオニンがアラニン（
Ｘ＝Ａ）　、ロイシン（Ｘ＝Ｌ）　、バリン（Ｘ＝Ｖ）
　、フェニルアラニン（Ｘ＝Ｆ）に置換された変異体で
あるＰＩＭＸをコードする。

〔工程２）ＰＩＭＸの発現上述の本願発明の実施例１工程４に記載の方法でｐＰＩ
ＭＸ、ｐＳＶＭＴ−ＡＰＰＴをＣＯ５−１細胞に導入し
、培養上清からｓＰＩ、ＰＩＭＸを粗精製した。これを
欧州特許公開番号０３０４１３号公報の実施例７に記載
の方法で、固定化トリプシンを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーを行って、ｓＰＩ及びＰＴＭＸを精製
した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の結果、これ
らのＡＰＰ　Ｉ誘導体は各々単一のものまで精製された
事がわかったので、蛋白量はブラッドフォード法とロー
リ−法で求めた値を採用した。

〔工程３〕　ＰＩＭＸの阻害活性ｓ　Ｐ　Ｉ、　　Ｐ　ＩＭＡ、　　Ｐ　ＩＭＶ、　　Ｐ
　ＩＭＬ、　　Ｐ　ＩＭＦの、トリプシン、ファクター
Ｘａ、血しょうカリクレイン、プラスミンに対する阻害
活性を上述の本願発明実施例１工程６から工程９と同様
の方法で測定した。天然型のｓＰＩに対するＰＩＭＸの
阻害活性の変化は、ＩＪに対するＭＸの阻害活性の変化
とほぼ同じであった。

実施例３上述実施例２に記載のＰＩＭＸはそのＣ末端に、ＡＰＰ
７７０のエキフン８由来のアミノ酸（第１図Ａ、３４５
のＭｅｔから３５９のＡｒｇまで）及びベクター由来の
Ａｒｇ−Ｌｅｕ配列を有する。これらＡＰＰ７７０のエ
キフン８由来およびベクター由来のアミノ酸を除去した
ＤＪＭＸを作成した。

〔工程１）　　ＤＪ型発現プラスミドの作成実施例２で
得たｐＰＩＭＸおよびｐＳＶＭＴ−ＡＰＰ　Ｉを制限酵
素ＢａｍＨＩ消化後ア消化−アガロースゲル電気泳動、
ＡＰＰＩ部分を含む、■、６ｋｂのＤＮＡ断片を回収し
た。この断片をＢａｍＨ■切断後ＢＡＰ処理したＴｖ１
８（宝酒造）に接続し、目的の方向に組み込まれたクロ
ーンＴｖＰＩＭＸ及びＴｖＰＴを得た（ＸはＡ、　　Ｌ
、　　Ｖ、　　Ｆを示す）。

一方、オリゴヌクレオチドプリーターＤＪ２（５’　Ｔ
ＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡ　３
　’　）を合成し、以下に示すプロトコールに従って、
エクソン８より下流の部分（第４図塩基番号２９５から
３６９まで）の除去をおこなった。

この反応にはＭｕ　ｔ　ａ　ｎＴＭＧ　（宝酒造）シス
テムを用い、反応は付属されるプロトコールに従った。

以下にその概略を述へる。

まずＴｖＰＩＭＸまたはＴｖＰＩから調製した一本鎖Ｄ
ＮＡ　０．５μｇにキットに付属するｍＰ１８Ｐ　　Ｄ
ＮＡを０．２μｇ加え、１０μｍの（２０ｍＭＴｒｉｓ
ＣＩ　（ｐＨ８，０）、　１０　ｍＭ　Ｍｇｃ１２．５
０　ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＤＴＴ）中で１００’Ｃ
３分、６５°ＣＩＯ分、３７°Ｃ１０分インキニーベー
トしてアニールさせた。

このアニールさせたＤＮＡ溶液４．５μｍに燐酸化した
ＤＪ２を１６ｎｇ加え６５°Ｃ１５分、３７°Ｃ１５分
インキューベートしアニールさせた。ここに３０μｍの
５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ８，０）、６０　ｍ
Ｍ　ＮＨ４０ＡＣ、５ｍＭ　ＭｇＣＬ、５　ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　１　ｍＭ　ＮＡＤ）及び６０ユニツ１〜のＥ、　
ｃｏｌｉ　リガーゼ、■ユニットのＴ４ポリメテーゼを
くわえ、２５°Ｃで２時間反応させた。この反応物を大
腸菌ＢＭＨ７１−１８株にトランスフエフ１〜し、１時
間培養後ファージ粒子を含む培養液を大腸菌ＭＶ１１８
４株にインフェクトし、プラークを形成させた（使用し
た大腸菌及びバッファー、酵素はすへて宝酒造）。この
プラークに対して３２Ｐて標識したＤＪ２を用いてスク
リーニングした。ＤＪ２にポジティブなシグナルを与え
るプラークを選定し、Ｍ１３シークエンスキット（宝酒
造）を用いて欠失部位の塩基配列を決定した。

目的の欠失か起こっているクローンを、ＴｖＤＪＭＸ（
ｐＰ　［ＭＸから出発したもの）及びＴｖＤＪ　　（ｐ
　ＳＶＭＴ−３７＝＝ＡＰＰＩから出発したもの）と命名した。

ＴｖＤＪＭＸまたはＴｖＤＪの二本鎖ＤＮＡを、　　Ｂ
ａｍＨＩで切断して得られる断片を、ＢａｍＨ■切断後
ＢＡＰ処理をしたｐｓＶＭＴ−ＡＰＰ　Ｉに挿入し目的
の方向に組み込まれたクローンを選択した。更に、確認
のために同じプローブを用いてこれをＭａｎｉａｔｉｓ
の実験書に従いサザン解析を行って、目的の変異をその
クローンか持っていることを確認した。こうして得られ
た発現ベクターをｐＤＪＭＸおよびｐＳＶＭＴ−ＤＪと
命名した。ｐＳＶＭＴ−ＤＪはｐＳＶＭＴ−Ａ、ＰＰＩ
と比較して、エクソン８（第１図Ａ参照）以下を欠失さ
せた部分のみ、即ちＤＪを発現する。またｐＤＪＭＸは
ＤＪのＰ２’のメチオニンがアラニン（Ｘ＝Ａ）　、ロ
イシン（Ｘ＝Ｌ）　、バリン（Ｘ＝ｖ）、フェニルアラ
ニン（Ｘ＝Ｆ）に置換されたＤＪＭＸをコードする。

〔工程２）　　ＤＪＭＸの発現上述実施例１工程４に記載の方法でｐ　Ｄ　ＪＭＸ。

ｐｓＶＭＴ−ＤＪをＣＯ３−］細胞に導入し、培養上清
からＤＪＭＸ、ＤＪを粗精製した。これを欧州特許公開
番号０３０４１３号公報実施例７に記載の方法、て、固
定化トリプシンを用いたアフィニティークロマトグラフ
ィーを行って、ＤＪ、　　ＤＪＭＸを精製した。ＳＤＳ
ポリアクリルアミド電気泳動の結果、これらのＡＰＰＩ
誘導体は各々単一のものまで精製された事かわかったの
で、蛋白量はブラッドフォード法とローリ−法で求めた
値を採用した。

〔工程３〕　ＤＪＭＸの阻害活性ＤＪ、ＤＪＭＡ、ＤＪＭＶ、ＤＪＭＬ、ＤＪＭＦの、ト
リプシン、ファクターＸａ、血しょうカリクレイン、プ
ラスミンに対する阻害活性を上述実施例１工程６から工
程９と同様の方法て測定した。天然型のＤＪに対するＤ
ＪＭＸの阻害活性の変化は、ＩＪに対するＭＸの阻害活
性の変化とほぼ同してあった。

実施例４ＩＮＳ５６及びｌＮ５５６ＭＸの発現と活性上述の実施
例３のＤＪＭＸは、本発明明細書本文に記載の一般式（
１）の蛋白質に比べＮ末端にＳ６ｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇが
多い。この３個のアミノ酸を除いたＩＮＳ５６ＭＸを作
成した。

〔工程１〕　発現プラスミドの構築Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇのアミノ酸配列を欠失させるた
め、以下の配列を有するプリーターＤＥＮＰ　Ｔを合成
した（アプライドバイオシステムズ社３８０Ａを用いて
合成）。

５　’　−ＴＴＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧ
ＣＴＣＣＴＣＴ−３’ＤＥＮＰ　１による欠失反応が起
こるとＤＪＭＸ中のＮ末端Ｓ　ｅｒ　−Ｍｅｔ　−Ａｒ
ｇ配列か除去され、第１図りのアミノ酸配列が直接ｔＰ
Ａのシグナル配列につながったタンパク質をコードする
プラスミドが得られる。

この欠失反応にはＭｕｔａｎ”Ｇ　（宝酒造）システム
を用い、反応は付属されるプロトコールに従った。以下
にその概略を述べる。

まず上述の実施例３工程１で得たＴｖＤＪＭＸまたはＴ
ｖＤＪから調製した一本鎖ＤＮＡ　０．５μｇにキット
に付属するｍｐ１８Ｐ　　ＤＮＡを０．２μｇ■え、１
０μｍの（２０ｍＭ　ＴｒｉｓＣＩ（ｐＨ８，０）、１
０ｍＭ　　ＭｇＣＬ、５０　ｍＭ　ＮａＣ１、１ｍＭ　
ＤＴＴ）中で１００°Ｃ３分、６５°ＣＩＯ分、３７°
ＣＩＯ分インキューベー１〜してアニールさせた。この
アニールさせたＤＮＡ溶液４．５μｍに燐酸化したＤＥ
ＮＰ■を１６ｐｇを加え６５°Ｃ１５分、３７°Ｃ１５
分インキューベートレアニールさせた。ここに３０μｍ
の５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ８，０）、６０　
ｍＭ　ＮＨ４０ＡＣ１５ｍＭ　ＭｇＣ１，２，５ｍＭ　
ＤＴＴ、１ｍＭ　ＮＡＤ）及び５　Ｑ　ユニー　ットの
Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　リガーゼ、１ユニツトのＴ４ポリメ
ラーゼをくわえ、２５°Ｃて２時間反応させた。この反
応物を大腸菌ＢＭＨ７＞１８株にトランスフェクトシ、
１時間培養後ファージ粒子を含む培養液を大腸菌ＭＶ１
１８４株にインフェクトし、プラークを形成させた（使
用した大腸菌及びバッファー、酵素はすべて宝酒造）。

このプラークに対して３２ｐで漂識したＤＥＮＰ　Ｉを
用いてスクリーニングした。ＤＥＮＰ　Ｉにポジティブ
なシグナルを与えるプラークを選定し、Ｍ１３シークエ
ンスキット（宝酒造）を用いて欠失部位の塩基配列を決
定した。目的の欠失か起こっているクローンを、Ｔｖ　
ｌＮ５５６ＭＸ　（ｐＤＪＭＸから出発したもの）及び
Ｔｖ　ｌＮ５５６　（ｐＳＶＭＴ−ＤＪから出発したも
の）と命名した。

Ｔｖ　ｌＮ５５６ＭＸまたはＴｖ　ｌＮ５５６の二本鎖
ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断して得られる断片を、Ｂａｍ
ＨＩ切断後ＢＡＰ処理したｐＳＶＭＴ−ＡＰＰＩに挿入
し目的の方向に組み込まれたクローンを選択した。更に
、確認のために同じプローブを用いてこれをＭａｎｉａ
ｔｉｓの実験書に従いサザン解析を行って、目的の変異
をそのクローンが持っていることを確認した。こうして
得られた発現ベクターをｐＴＮＳ５６ＭＸおよびｐＳＶ
ＭＴ−ＩＮＳ５６と命名した。

ｐＳＶＭＴ−ＩＮＳ　５６は第１図りの配列即ちｌＮ５
５６（第１図Ａ参照）を発現する。またｐＩＮＳ５６Ｍ
ＸはｌＮ５５６のＰ２′のメチオニンがアラニン（Ｘ＝
Ａ）　、ロイシン（Ｘ＝Ｌ）、バリン（Ｘ＝Ｖ）　、フ
ェニルアラニン（Ｘ＝Ｆ）に置換されたｌＮ５５．６Ｍ
Ｘをコードする。

〔工程２〕　　ＩＮＳ５６ＭＸの発現上述実施例１工程４に記載の方法でｐＩＮＳ５６ＭＸと
ｐＳＶＭＴ−ｌＮ５５６をそれぞれＣ０８−１細胞に導
入し、培養上清からｌＮ５５６、ＴＮＳ５６ＭＸを粗精
製した。これを欧州特許公開番号０３０４１３号公報の
実施例７に記載の方法で、固定化トリプシンを用いたア
フィニティークロマトグラフィーを行って、ＴＮＳ５６
、ＩＮＳ５６ＭＸを精製した。ＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動の結果、これらのＡＰＰＩ誘導体は各々単一
のものまで精製された事がわかったので、蛋白量はブラ
ッドフォード法とローリ−法で求めた値を採用した。ま
た、ｌＮ５５６のＮ末端アミノ酸配列をアプライドバイ
オシステムズ社気相プロティンシーケンサ−・モデル４
７０Ａを用いて決定したところ、目的のものが得られて
いることかわかった。

〔工程３）　　　ＩＮＳ５６ＭＸの阻害活性ｌＮ５５６
、ｌＮ５５６’ＭＡ、ｌＮ５５６ＭＶ、ｌＮ５５６ＭＬ
、ＩＮＳ　５６ＭＦの、トリプシン、ファクターＸａ、
血しょうカリクレイン、プラスミンに対する阻害活性を
上述の実施例１工程６から工程９と同様の方法で測定し
た。天然型のｌＮ５５６に対するＩＮＳ５６ＭＸの阻害
活性の変化は、ＩＪとＭＸの場合とほぼ同じであった。

参考例ＢＰＴＩ（アプロチニン、シグマ社）、ウリナスタチン
（ミラクリッド０Ｍ、持田製薬）及び実施例２で得たｓ
ＰＩの、血しようカリクレイン、ファクターＸａ、プラ
スミン、トロンビンに対する平衡阻害定数に１を、特開
平２−１０１０１７号公報の実施例１工程３に記載の方
法で求めた。結果を表５に示す。

（以下余白）表５実施例５注射用無菌溶液下記表に示す成分を混合して溶液とし、濾過滅菌して静
脈内注射用溶液を調整した。

ＭＸ　（ＸはＡ、　Ｖ、　　Ｌ、　　Ｆのいずれかを示
す）は本発明実施例１の工程４の方法を繰りかえし行な
って、大量に取得した。

【図面の簡単な説明】

第１図は３種の老人斑アミロイド前駆体蛋白の構造の模
式図と、種々のＡＰＰ■誘導体の構造とアミノ酸配列を
示したものである。第２図は、アミロイド前駆体蛋白をコードするプラスミ
ドｐＧＢＰ２からＭｕｔａｎｌＭＧをもちいて５′側、
３′側を欠失させてＴｖＩＪを得るまでを示したもので
ある。第３図は、ＴｖＢＢｌの１本鎖ＤＮＡか、合成したオリ
ゴヌクレオチドＤ５およびＤ３とバイブ＝４６− リダイズした様子を示したものである。ＤＮＡ配列の上
に推定されるアミノ酸配列を示し、下に制限酵素切断点
を示す。また欠失を確認するための塩基配列決定に使用
したプライマーの位置も示す。第４図は、ｐＩＪか持つｔＰＡのシグナル配列に続＜Ａ
ＰＰ　ＩをコードするＤＮＡ配列と、それから推定され
るアミノ酸配列である。ｔＰＡとＡＰＰＴ部分をつない
だ制限酵素部位を示す。第５図は、ＴｖＩＪからｐＩＪを作成後ＡＰＰ■部分に
変異を導入し、ちとのベクターに戻してｐＭＸシリーズ
を作成するまでを示したものである。特許出願人　　旭化成工業株式会社苓　ロイ　−一　　　　肯　１’）ｒ−１＊ｒ’ｓｋ＾
〉汝（）＞　　　水　（）しｌハ　七　ｄ　しＬＪ　　ｌ
−Ｉ　　　　　　ｌ−＋　　（Ｌｌ　　　　　　　ｌｊ
　　ｒ−１区　　　ムム　　イ、　　１．５ヶ匡ロ　ヤ珈ギ　ャ８０　オ冒自

Claims

【特許請求の範囲】１）一般式（ I ）；Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａで表され
るアミノ酸配列を少なくともその一部に含む蛋白質。（但し式中、Ａｌａ；アラニン、Ａｒｇ；アルギニン、
Ａｓｎ；アスパラギン、Ａｓｐ；アスパラギン酸、Ｃｙ
ｓ；システイン、Ｇｌｎ；グルタミン、Ｇｌｙ；グルタ
ミン酸、Ｇｌｙ；グリシン、Ｈｉｓ；ヒスチジン、Ｉｌ
ｅ；イソロイシン、Ｌｅｕ；ロイシン、Ｌｙｓ；リジン
、Ｍｅｔ；メチオニン、Ｐｈｅ；フェニルアラニン、Ｐ
ｒｏ；プロリン、Ｓｅｒ；セリン、Ｔｈｒ；スレオニン
、Ｔｒｐ；トリプトファン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｖａｌ
；バリン残基を各々示し、ＸはＭｅｔ以外のアミノ酸残
基を示す。）２）請求項第１項記載の蛋白質を有効成分として含有し
てなる蛋白分解酵素阻害剤。