JPH07509229A - ウシ膵トリプシン阻害因子から誘導される因子Ｘａの阻害因子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ラン膵トリプシン阻害因子から誘導される因子Ｘａの阻害因子発明の分野 この発明は、ウシ膵トリプシン阻害因子から誘導される因子Ｘａの阻害因子およ びこれらの調製法と治療的使用法に関する。

発明の背景 ラン膵トリプシン阻害因子（ＢＰＴｒまたはアプロチニンとも呼ばれる）は、３ 個のジスルフィド橋による内部架橋を伴った５８個のアミノ酸残基を有するポリ ペプチドであるしフリッブ（Ｆｒｉｔｚ、　Ｈ）およびブンデラー（Ｗｕｎｄｅ ｒｅｒ、　Ｇ　）、Ａｒｚｎｅｉｍ、　−Ｆｏｒｓｃｈ／Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓ、　 、第３３巻、第４７９頁〜第４９４頁参照］。

成熟野生型ＢＰＴＩのアミノ酸配列は次の配列（１）で表される。

Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＰｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　ｌ ｉｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ、Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＧｌｙＧｌ ｙ　Ｃｙｓ　、Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌ ｙｓ　Ｓｅｒ　ＡｌａＧｌｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｃｙ ｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ成熟折りたたみタンパク質においては、ジスルフィ ド結合は、次のシスティン対の間に形成される：５〜５５．１４〜３８および３ ０〜５１゜ＢＰＴＩもしくはトリプシンと複合化したＢＰＴＩ変異体、カリクレ イン、トリプシノーゲンおよび無水トリプシンの結晶構造においては、阻害因子 の２つのループが、残基１１〜１９および３４〜３９において、セリンプロテア ーゼと界面を形成する［ボード（Ｂｏｄｅ、　Ｗ、　）ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　、第１４４巻、第１８５頁〜第１９０頁（１９８４年）参照］。こ れらの残基は、標的プロテアーゼに対する阻害因子の特異性を規定する主要な原 因であると考えられている。セリンプロテアーゼの配列との組合せにおいては、 プロテアーゼ阻害因子の親和性と特異性が、プロテアーゼと阻害因子の界面の両 側での配列変異に起因するとＬｌうことが提案されている［クレイトン（Ｃｒｅ ｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、Ｅ、　）およびダービー（Ｄａｒｂｙ、　Ｎ、Ｊ、　）、 ＴｌＢ５、第１４巻、第３１９頁〜第３２５頁参照］。

当該分野においては、セリンプロテアーゼの阻害因子または基質の配列は、・・ ・−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−ＰＬ−ＰＩｏ−Ｐ２°−Ｐ３’−Ｐ４°−・・・で表さ れることが多い（ＰおよびＰ″はアミノ酸を示す）。基質の場合、タンノ（り質 分解による開裂部位は、残基Ｐ１とＰｌｏの間で発生するものとして規定される ［シエヒタ−（ＳｃｈｅｃｈｔｅｒＳＩ）およびベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ、　Ａ ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍ＋ｍｕｎ　第２７巻、 第１５７頁（１９６７年）参照］。基質中のＰ−カルボニル窒素原子間の結合は 開裂性結合と呼ばれることが多い。

セリンプロテアーゼの主要な特異性は、開裂性結合の前に直接結合する残基の特 性によって規定される。残基Ｐ１は、野生型または天然のＢＰＴＴ配列のりシン １５に対応する。残基Ｐ１と共に開裂性結合を包囲する残基は、次の配列（ＩＩ ）で表されるＢＰＴＩの「活性部位ループ（ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ　ｌｏｏｐ ）Ｊと呼１ｆれることが多い［ラスコラスキー（Ｌａｓｋｏｖｓｋｉ，　Ｍ．　 Ｊｒ．　）およびカトウ（Ｋａｔｏ、■）、Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、第４９巻、箪５９３頁〜第６２６頁（１９８０年）参照］。

Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　１ｉｅＰ４　Ｐ３ 　Ｐ２　Ｐｉ　ＰＩ’　Ｐ２’　Ｐ３’　Ｐ４゜（Ｉ　Ｉ） Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐｌｏ、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４゛は、異なるセリンプロ テアーゼを差別化する阻害因子に対して二次的な特異性を伝える。ＢＰＴＩにお いては、残基３４〜３９から成る第二のループは、特定のセリンプロテアーゼの 活性部位を有する接触領域も形成し、特異性に寄与する。

特定のセリンプロテアーゼに対してより特異的な阻害効果をもたらすＢＰＴＩの 組換え類似体が報告されている。一つの類似体においては１５位と４２位のアミ ノ酸を変え、また、別の類似体においては１５位、１７位および４２位のアミノ 酸を変えたＢＰＴＩの残基３〜５８から成るポリペプチドが、他のセリンプロテ アーゼのなかでも、因子Ｘａを阻害することが報告されている。この場合の阻害 定数は比較的小さく、１８００ｎＭおよび１５０ｎＭである［ノリス（Ｎｏｒｒ ｉｓｓＫ　）およびベーターセン（ＰｅｔｅｒｓｅｎＳＬ、Ｃ，）、「アプロチ ニン類似体とその製造法」、ＥＰ３３９．９２４号（１９８９年１１月２日発行 ）参照］。

発明の概要 この発明は、従来から報告されている因子Ｘａに対するＢＰＴＩ−類似阻害因子 の場合に比べて、実質的に大きな効力と特異性を伴う因子Ｘａに対する強力な阻 害活性を有するように処理されたＢＰＴＩの誘導体に関する（該処理法について は後述する）。第一の観点によれば、本発明は、５ＱｎＭ以下、好ましくは２０ ｎＭ以下、より好ましくは５ｎＭ以下の阻害定数（Ｋ１）を示す程度で因子Ｘａ を阻害するＢＰＴＩから誘導される化合物によって特徴づけられる。

「化合物」という用語は、天然に存在するＢＰＴＩとその類似体の場合のように 、５８個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖に関するだけ でなく、因子Ｘａの阻害因子としての活性とは関係のない位置が置換した１個も しくはそれ以上のこれらのアミノ酸を有する化合物も意味する。例えば、このよ うな置換には、グリノンによるバリンの置換、１個もしくはそれ以上の荷電アミ ノ酸による同一もしくは反対荷電アミノ酸の置換、および１個もしくはそれ以上 のアミノ酸の欠失等が含まれる。さらに、ＢＰＴＩ誘導体の因子Ｘａに対する阻 害活性にほとんどもしくは全（影響を与えないようにして、１個もしくはそれ以 上のアミノ酸をＢＰＴＩ−類似体のポリペプチド鎖中に導入してもよい。このよ うな置換は、天然に存在するアミノ酸のいずれを用いておこなってもよく、ある いは、当該分野で既知の標準的な方法によって製造される合成アミノ酸を用いて おこなってもよい。本発明の特に好ましい観点においては、特別に選択された部 位において、最終的に得られるコード化ＢＰＴＩ−１ｍ似体に因子Ｘａに対する 阻害活性を付与するような変化をもたらすＢＰＴＩ−類似体の所望のアミノ酸配 列をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を合成することによ って当該化合物は誘導される。このような誘導法の一例を以下に説明する。この 場合、遺伝子工学的な方法によって突然変異体ＢＰＴＩ化合物を調製した。

「類似体」という用語は、ＢＰＴＩに類似し、ＢＰＴＩと同じ塩基性の５８個の アミノ酸構造と阻害活性を有するウシ以外の動物中に存在する化合物を意味する 。

特に、ＢＰＴＩ−類似体であって、因子Ｘａに対する阻害活性を有する化合物に は次の構造を有する化合物が含まれる：Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒ ｏ　Ｔｙｒ　Ｘ目　Ｇｌｙ　ＸＩ３　Ｘ１４　Ｘ１８　ＸＩｅ　Ｘ１７　ＸＩｅ 　Ｘ１Ｘ２０　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　ＴｈｒＰｈｅ　Ｘ３４　Ｘ３１　ｃｔｙ　Ｇｌ ｙＸ３＠　Ｘ３＠　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｋ４６　ｘ４＠ Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓこ の場合、 ｘｌｌはアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸 、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、リジン、プロリン、セリン、トレオニ ン、トリプトファン、チロノンまたはバリンを示し、Ｘ　ｌ　３はアラニン、ア スパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイノ ン、ロイノン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン 、トリプトファン、チロノンまたはバリンを示し、Ｘ　１４はアラニン、セリン またはシスティンを示しく但し、Ｘ１４がシスティンのときは、Ｘ３ｇはシステ ィンでなければならない）、Ｘ　１５はアルギニンを示し、 Ｘ１６はアラニンまたはグリノンを示し、Ｘ、フはアラニン、アスパラギン、ア スパラギン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイノン、ロイシン、メチオニン 、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロノ ンまたはバリンを示し、ＸＩｅ、Ｘ１９およびＫ２゜はいずれかの天然のアミノ 酸を示し、Ｘ３１はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シ スティン、グルタミン酸、グルタミン、グリノン、ヒスチジン、イソロイノン、 ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、ト リプトファン、チロノンまたはバリンを示し、 Ｋ３．はフェニルアラニンまたはチロノンを示し、ｘ３ｇはアラニン、グリノン またはセリンを示し、Ｘｓｓはアラニン、セリンまたは／スティンを示しく但し 、ｘ３ｇがシスティンのときは、ＸＩｅはシスティンでなければならない）、Ｋ ３．はグルタミン、グリノン、ヒスチジン、イソロイノン、ロイシン、リジン、 メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファ ン、チロノンまたはバリンを示し、 Ｘ、５はフェニルアラニンまたはチロノンを示し、Ｘ４６はいずれかの天然のア ミノ酸を示す。

特に好ましい呼種においては、誘導化合物としては次の構造を有する化合物が含 まれる Ｘ、Ｐｒｏ、へｓｐ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｙ ｒ　Ｘ目　Ｇｌｙ　Ｘ’３　Ｘ１４　Ｘ＋５Ｘ１ｓ　Ｘ１７　Ｘｌｓ　Ｘ１９　 Ｘ２０　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　、Ａｌａ　Ｇｌｙ 　Ｌｅｕ　ＣｙｓＧｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｋ３．Ｋ３５　ＧＩＹ　ＧＩＹ　Ｌ ＠　Ｘ３９　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｘ４５Ｌ＠Ｓｅｒ　Ａ ｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｙ　Ａｌａこの場合、 刈はアラニンまたはアルギニンを示し、Ｘ１１はアラニン、アルギニン、アスパ ラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、プロリン、セリン、トレオニ ンまたはバリンを示し、Ｘ１３はアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、 イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプト ファン、チロシンまたはバリンを示し、 Ｘ、４はシスティンを示し、 Ｘ、５はアルギニンを示し、 Ｘ　ｌ　６はアラニンまたはグリシンを示し、Ｘ１７はアラニン、アスパラギン 、ヒスチジン、インロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリ ン、トリプトファンまたはチロシンを示し、Ｘ　ｌ　８はアスパラギン、ヒスチ ジン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロノンまたはバリンを示 し、 ＸＩＧはアルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、 ロイシン、リジン、プロリン、トレオニンまたはバリンを示し、Ｘ２０はアルギ ニン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、トレオニンまたはバ リンを示し、 Ｘ３４はアラニン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチ オニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンま たはバリンを示し、 Ｘ　３５はフェニルアラニンまたはチロノンを示し、Ｘ３６はグリノンを示し、 Ｘ３Ｍはシスティンを示し、 Ｘ３Ｑはグルタミン、グリノン、ヒスチジン、イソロイノン、ロイシン、メチオ ニン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、チロノンまたはバリンを示 Ｘ４５はフェニルアラニンを示し、 Ｘイ、はグルタミン酸、リジンまたはチロシンを示す。

第二の観点によれば、本発明は、前記の化合物をコード化する単離された核酸セ グメントによって特徴づけられる。

「単離された」という用語は、核酸が天然では自然に発生せず、好ましくは宿主 細胞ゲノム内、発現ベクター内または池のベクター内において、複製され、転写 され、本発明による所望の阻害因子を形成するように翻訳されるような状態で存 在することを意味し、一般的には、核酸の均質調製を意味する。

好ましい態様においては、核酸セグメントは少なくとも１５０個の塩基を含んで おり、核酸セグメントの転写を調整するプロモーター領域を有するベクター、例 えば、プラスミド、ファスミド、コスミドまたはファージ内で提供される。これ に関連する観点においては、本発明は、このようなベクターを含有する宿主細胞 によって特徴づけられる。

「プロモーター領域」および「転写」という用語は、当該分野において認識され ている意味で使用する。

さらに別の観点によれば、本発明は、ベクターが宿主細胞内において前記化合物 を発現させる条件下において、該化合物をコード化する該ベクターを含有する該 宿主細胞を増殖させることによる該化合物の調製法によって特徴づけられる。

好ましくは、該化合物は、これを培養上澄み中へ分泌させる分泌シグナル配列に 結合させる。

該化合物の調製法の好ましい態様には、次の工程（ａ）〜（Ｃ）が含まれる：（ ａ）該化合物をコード化する発現ベクターを用いて形質転換された宿生細胞の栄 養培地内での培養を開始させ、 （ｂ）該化合物が生産されるのに十分長い時間にわたって培養をおこない、次い で、 （Ｃ）該化合物を培地から回収する。

さらに別の観点によれば、本発明は、前述のＢＰＴＩがら誘導される因子Ｘａの 阻害因子を発現する核酸分子の同定法によって特徴づけられる。この方法におい ては、因子Ｘａに対する強力な阻害因子をファージの表面で発現させ、該ファー ジを、因子Ｘａが該阻害因子と結合できる条件下で因子Ｘａと接触させる。因子 Ｘａに対して有効な阻害因子を発現するこれらのファージは同定した後、因子Ｘ ａに対する阻害因子との結合に関係する活性部位に結合しない因子Ｘａに対する 抗体を、ファージに結合した因子Ｘａと接触させることによりて単離する。阻害 因子をコード化するファージＤＮＡのこの部分のＤＮＡ配列を決定した後、阻害 因子をコード化するファージＤＮＡの該部分を単離する。

さらにまた別の観点によれば、本発明は、ファージコートタンパク質との融合タ ンパク質として本発明による所望の化合物を発現するファージによって特徴づけ られる。ＢＰＴＩから誘導された因子Ｘａに対する阻害因子であって、ファージ コートタンパク質に組込まれた阻害因子を有するファージは、前述のようにして 同定される。このようなファージは、本発明による因子Ｘａに対する阻害因子を コード化する核酸セグメントを前述の方法によって単離する工程における中間物 として有用である。

また、別の観点によれば、本発明は、因子Ｘａを５０ｎＭ以下の阻害定数で阻害 　。

する有用なりＰＴＩ誘導体の同定法によって特徴づけられる。最も好ましくは、 該方法には、プラスミンをｉｎＭ以上のＫｉで阻害する阻害因子の同定法が含ま れる。

本発明には、貯蔵後に投与される薬学的に許容される組成物であって、薬学的に 許容されるキャリヤーまたは希釈剤と共に前記の化合物を薬学的に有効な量含有 する組成物が包含される。

本発明にはまた、高い因子Ｘａ活性によって特徴づけられる哺乳類の病気の予防 法または治療法が包含される。例えば、本発明には、異常な血栓症によって特徴 づけられる哺乳類の病気の予防法または治療法が包含される。

本発明のさらにまた別の特徴や利点は、本発明の好ましい態様と請求の範囲に関 する以下の記載によって明らかにする。

好ましい態様の説明 まず第一に、図面について簡単に説明する。

図１は、ＢＰＴ■分子表面と因子Ｘａ基質結合部位との間の三次元的な相互作用 を示す模式図である。点線で示す表面は、因子Ｘａの基質結合部位と接触するこ とが予想されるＢＰＴＩ分子の部分を表す。ＢＰＴＩ分子（下方）と因子Ｘａ（ 上方）のポリペプチド鎖は黒色のリボンで表す。

図２はベクターｐＭａ５−ＰＩを示す模式図である。ｐＭａ５−ＰＩの地図は次 の（ｉ）　〜（ｖｉ）の特徴を有する＋（ｉ）Ｃｏｌ　Ｅ　ｌ型複製開始点（Ｏ Ｐｒ）、（ｉｉ）複製開始点を含む線状ファージｆ１の遺伝子開領域（ｆｌ　Ｏ Ｐｒ）、（ｉｉｉ）アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌ ａ）、（ｉｖ）アンバー停止コドンを導入する突然変異によって非機能化された クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ−ａｍ）、（ ｖ）Ｐｔａｃ／ｐｈｏＡ／　Ｂ　ＰＴ　Ｉ発現カセット、および（ｖｉ）ファー ジｆｄの中心転写ターミーネーターの２つのコピー（ｆｄＴ）。相補ベクターｐ Ｍｃ５−Ｐ■は、９叫遺伝子が機能的で（タロラムフェニコール耐性を付与する ）、ｂｌａ遺伝子がアンバー停止コドンを有するという点を除けば、ｐＭａ５− ＰＩと同一である。拡大した領域はＰ　ｔａｃプロモーターの位置、ｐｈｏＡ分 泌シグナルをコードするＤＮＡセグメント、ＢＰＴＩから誘導された遺伝子およ び関連する制限部位を示す。／−クエンノングプライマーは、図２の上部に示す ように、ＢＰＴＩコーディング領域のすぐ下流のベクター配列にアニール化され る。該プライマーは、本発明による因子Ｘａに対する有用な阻害因子をコード化 するＤＮＡ配列を決定するのに使用することができる。

図３はＢＰＴＩコーディング領域の組立に使用した４種のオリゴヌクレオチドの Ｄ　Ｎ　Ａ配列（５°〜３°）を示す。

図４はｐＭａ５−ＰＩのＰ　ｔａｃ／ｐｈｏＡ／　Ｂ　Ｐ　Ｔ　Ｉ発現モジュー ルを示す。図４ａは受容体ベクターｐＭａ／ｃ５　１９の関連部分を示す。Ｅｃ ＯＲＩ　／　Ｘ　ｂ　ａ　Ｉフラグメントは、ｐＭａ／ｃ５−８のマルチクロー ニング部位中に存在する［スタンスセンス（Ｓ　ｔａｎｓｓｅｎｓ）ら、Ｎｕｃ ｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、第１７巻、第４４４１頁〜第４４５４頁（１９ ８９年）参照］。Ｐ　ｔａｃプロモーターの−３５と−１０のボックス、ノヤイ ンーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ；ＳＤ）配列、紳遺伝子から誘 導された分泌ノブナルおよびい（つかの関連する制限部位を示す。図４ｂは４種 の化学的に合成したオリゴヌクレオチドから成る二本鎖のＢＰＴＩ−コーディン グフラグメントを示す。ＢＰＴＩ−オリゴヌクレオチドは、ＫｐｎＩによってオ ーブンにされたｐＭｃ５−１９ベクターと結合させ、ＤＮＡポリメラーゼＩ［フ レナラ（ＫｌｅｎＯｗ）フラグメント］を用いて処理した後、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　 Ｉを用いて消化させた。これによって、ＢＰＴｒコーディング領域の５′−末端 はｐｈｏＡ分泌シグナルに融合され、一方、３°−末端のＨｉｎｄｌｌＩ−接合 点はフレーム内の（ｉｎ−ｆｒａＩＩｌｅ）ＴＡＡ翻訳停止コドンを発生させる 。

図５は、ＢＰＴＩから誘導されてＰｉｌ＋コートタンパク質に融合された突然変 異タンパク質の５つのコピーをもたらす線状ファージを示す模式図である。

図６は、本発明による因子Ｘａに対する強力な阻害因子をもたらすファージのｉ 離性を示す模式図である。

図７は、ハムスターの圧迫した大腿部静脈モデルにおける４ｃ２による血栓形成 の阻害を示すグラフである。対照動物には、滅菌処理した食塩水を注入した。

ｎ回の実験の平均値は斜線部で示す。グラフの空白部は標準偏差を示す。

ＢＰＴＩ＝誘導体 特定のセリンプロテアーゼ（例えば、トリプンン、プラスミン）に対するＢＰＴ Ｉの特異性を、プロテアーゼ基質結合部位と接触するＢＰＴＩ分子の表面部分を 構成するアミノ酸の特性によって決定する。図１において点で表示する表面は、 因子Ｘａの基質結合部位と接触すると予想されるＢＰＴＴ分子の部分を示す。Ｂ ＰＴＩ分子のポリペプチド鎖は下方の黒色リボンで表示される。因子Ｘａ構造体 と形態、電荷、極性および疎水性の点で最適な相溶性が得られるように接触表面 を修飾する方法により、アミノ酸を置換するか、挿入するか、または欠失させる ことによってＢＰＴＩから化合物を誘導することがてきる。このようにしてＢＰ ＴＩから誘導される化合物は因子Ｘａに対する強力な阻害因子である（ＢＰＴＩ 自体は因子Ｘａに対しては有意な阻害効果を示さない）。接触領域の外側のアミ ノ酸の修飾または除去によっては、接触領域の構造がこのような変化により乱さ れない限り、阻害因子の結合特性は影響を受けない。図１に示すものと類似のＢ ＰＴＩモデルを考察することにより、接触領域の形態は主として（もっばらでは ない）残基１１．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９．２０．３４．３ ５．３６．３８．３９．４５および４５によって規定されるものと推定される。

従って、ＢＰＴＩから誘導される本発明による阻害因子はこれらの部位において 阻害活性を高めるように修飾されている。該阻害因子の他の部位は、このような 修飾にほとんどまたは全（影響を及ぼさないような変化を受けていてもよい。こ れらの阻害因子は、インビボおよびインビトロにおいて因子Ｘａの活性を阻害す るように最適化された塩基性ＢＰＴＩ構造を有する。このような誘導体は、以下 に説明するようにして、標準的な手順によって調製することができる。しかしな がら、ＢＰＴＩ構造における最適な変化の同定は、ランダム化突然変異法または ＢＰＴＩアミノ酸の配列もしくは構造の系統的変更法によっておこなうことがで きる。これらの方法を以下に例示するが、本発明はこれらによって限定されるも のではない。

部位特異的突然変異誘発 本発明において有用な因子Ｘａの阻害因子は、微生物の体内で発現されたＢＰＴ ｌ遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって同定できる。例えば、スタンスセン スらの報文［Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　第１７巻、第４４４１頁〜第４ ４５４頁（１９８９年）］に記載の手順により、合成遺伝子をベクター内で形成 させ、これを標準的な方法によって突然変異誘発させる。特に、ＢＰＴＩコーデ ィング領域は化学的に合成されたので、ヌクレオチド配列は、大腸菌のコドン使 用頻度に匹敵するように適合させた（即ち、合成された遺伝子は、ポリペプチド 生産に悪影響を及ぼすＡＧＡおよびＡＧＧ　Ａｒｇ−モジュレーター−コドンを 欠くように調製した）。要所要所に配置させた池の遺伝子操作を促進する制限部 位を取込んだ。Ａｒｇ−１をＡｌａで置換させることにより、大腸菌のシグナル ペブチダーゼによる適切な処理をおこなった。

固有の、適切に折りたたまれてノスルフィド結合によって結合されたＢＰＴ１誘 導体を生産する大腸菌の発現系を確証するために、ＢＰＴＩがら誘導された突然 変異タンパク質を、分泌シグナルペプチドをコード化するＤＮＡフラグメントに 遺伝子を融合させることによって、ペリブラスム間隙へ誘導した。オリゴヌクレ オチドをコード化するＢＰＴＩ誘導体はｐＭａ／ｃ５−１９と直接結合させた。

このベクター（図２参照）はＩ　ＰＴＧ−誘導Ｐ　ｔａｃプロモーター、および ＫｐｎＩに基づいて利用可能なように調製されたアルカリ性ホスファターゼ（ｐ ｈｏＡ）遺伝子の分泌／グナルをコード化する部分を有する［スタンスセンスら 、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、第１７巻、第４４４１頁〜第４４５４頁（１ ９８９年）参照］。ＢＰＴＩ誘導体−コーディング領域の組立に使用した４種の オリゴヌクレオチドの配列を図３に示す。図４には、ｐＭａ／ｃ５　１９の関連 部分および完全なりＰＴＩ誘導体−コード化核酸フラグメントを示す。ｐＭａ／ ｃ５−１９ベクター内でのＢＰＴＩ−相似遺伝子の構築については、以下の実施 例１において詳述する。

ＢＰＴＩ−誘導タンパク質の合成と分泌は、トリプシン阻害能を測定することに よって示された。精製タンパク質のアミノ末端配列は（Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ Ｐｈｅ）であり、このことは、ｐｈｏＡ−ＢＰＴＩ前駆体が適切なプロセシング を受けたことを示す。

ベクターｐＭａ５−ＰＩおよびｐＭｃ５−ＰＩは線状ファージｆ１の遺伝子開領 域に宿っているので、発現、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発およびシー クエン／レグは同じレプリコンによっておこなわれる。突然変異構築実験はスタ ンスセンスらの報文［Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、第１７巻、第４４ ４１頁〜第４４５４頁（１９８９年）コに記載の方法と実質上同一の方法によっ ておこなった。ＢＰＴｌから誘導された阻害性化合物４ｃ２および４４ｃ３をコ ード化する遺伝子の構築については以下の実施例２において説明する。

大規模生産のためには、特異的阻害因子をコード化する遺伝子を分泌生産系、例 えば、Ｐｉｃｈｉａ酵母発現系［フィリップス・ペトローレアム・カンパニ・− （Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手］へ転移 させることができる。ＢＰＴＩから誘導された１つの特定の遺伝子のＰ　１ｃｈ ｉａ発現ベクター内での構築については、以下の実施例３において説明する。組 換えタンパク質は標準的な方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよび アフィニティークロマトグラフィーによって培養培地から精製することができる 。この精製例については実施例４において説明する。

う／ダム突然変異誘発、ファージディスプレー（Ｐ　ｈａｇｅ　Ｄ　１ｓｐｌａ ｙ）注水発明による因子Ｘａに対する阻害因子をコード化する組換えＤＮＡ分子 はランダム突然変異誘発法によって同定することができる。この場合、適当なり ＮＡ上セグメント、配列（１）の残基の位（ｆ１１〜２０．３４〜３９および４ ５〜４６のすべてが個々の、または２個もしくはそれ以上の残基のブロック内の すべてのアミノ酸によって置換されるように変化させる。多数の突然変異ポリペ プチドが、細胞、微生物もしくはファージの表面上に表れる融合タンパク質とし てポリペプチドを発現させることによって生成できる。所望の結合特性を有する ポリペプチドは、「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）Ｊと呼ばれる方法によって同 定されて単離される［クヴイルラ（Ｃｗｉｒｌａ、　Ｓ、Ｅ、　）ら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、第８７巻、第６３７８頁〜第６３８２ 頁（１９９０年）参昭コ。このようにして同定された因子Ｘａに対する阻害因子 に対応するＤＮＡ分子を精製し、配列を決定し、コート化夕〉バク質の過剰生産 と精製のために適当なベクターへ転移させる。

例えば、ＢＰＴＩ遺伝子は、大腸菌の線状ファージｆｄ−ｃａｔのＰ−１１１コ ートタンパク質と融合させることができる［マ・ツカフェルティー（ＭｃＣａｆ ｆｅｒｔｙ）ら、＼ａｔｕｒｅ、第３４８巻、第５５２頁〜第５５４頁（１９９ ０年）参照］。図５は、突体変異ＢＰＴＩタンパク質がファージ表面にどのよう １＝シて出現する力邊模式的に示す。因子Ｘａに対する阻害因子を発現するファ ージの選択法（または）くンニング）の図解を図６に示す。クンケル（Ｋｕｎｋ ｅｌ）法を使用することにより、以下の構造（ＩＩＩ）で表される遺伝子Ｉ１１ 変異型をオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発による遺伝子操作処理に付した しクンケル、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、第８２巻、 第４８８頁〜第４９２頁（１９８５年）参照］。

分泌ノブナル　ＢａｐＭ　Ｉ　Ｉ　Ｋａｓ　Ｔ　成熟Ｐ−１１１ＣＡＣＴＣＣＧ ＣＴ　ＣＣＧ　ＧＡＣＡＣＴ　ＡＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＣＣＧＣＴ　Ｇ＾＾Ｈ ｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　＾ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇ ｌｕＢＰＴＩ　１　２　３　５６　５７　５８（Ｉ　Ｉ　Ｉ） この方法においては、前述のｐＭａ／ｃ５−ＰＩベクターからのＢＰＴＩ遺伝子 またはＢＰＴｒから誘導される適当な遺伝子を、ＢｓｐＭＩＩフラグメントとし て、構造（Ｉ　Ｉ　Ｅ）中に導入した。ＢＰＴＩのアミノ酸残基１５〜２０のラ ンダム突然変異誘発をおこなうため、フレームシフトと共にＰｓｔｌとＡｐａ１ 部位を有するＢＰＴＩから誘導された遺伝子を保有する新ただベクターを構築し た。以下のオリゴヌクレオチドを利用することによって、２８ｃ５突然変異遺伝 子を構築した。

Ｐｓｔ２３８：　ＧＴＴ　ＡＣＧ　ＣＴＴ　ＴＧＣＣＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣＣＡＣ ＣＰｓｔ２３９：　ＧＣＣＴＴＧ　ＣＡＧ　ＧＧＧ　ＣＣＣＧＧＴ　ＡＴＡ　Ｃ ＧＧ　ＴＧＧ２８Ｃ５突然変異遺伝子を有するファージはｆｄ−ｃａｔ２８ｃ５ と呼ばれる。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドをｆｄ−ｃａｔ２８ｃ５に挿入 したときに、フレームシフトを補正した。この方法においては、オリゴヌクレオ チドの挿入が不完全な場合には、野生型ＢＰＴＩ−発現ファージの大きなバック グラウンドの発生を防止した。

ｆｄ−ｃａｔ２８ｃ５に挿入された突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（Ｐｓｔ ２４０）は、以下の配列（ＩＶ）で表される同義コーディング配列を有する（こ の場合、ＲはＡとＧの等モル混合物を示し、ＮはＧ、ＡＳＴおよびＣのいずれか を示し、ＫはＧおよびＴのいずれかを示す）。

Ｐｓｔ２４０・　ＴＡＴ　ＡＣＣＧＧＧ　ＣＣＣＴＧＣＡＲＧ　ＮＮＫ　ＮＮＫ 　ＮＮＫ　ＮＮＫ　ＮＮＫ　ＴＡＣＴＴＣＴＡＣ＾＾ＣＧＣＣ＾＾Ｇ　ＧＣＣＧ ＧＡ　ＣＴＣＴＧＴ（ＩＶ） これによって、ＡｒｇまたはＬｙｓによるＬｙｓ１５の置換並びに天然の２０種 のアミノ酸のいずれかによるＡｌａ１６、Ａｒｇ１７．１１ｅ１８．１１ｅ１９ およびＡｒｇ２０の置換が可能となる。

突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（Ｐｓｔ２４０）および以下の配列（Ｖ）で 表される第二の重複オリゴヌクレオチド（Ｐｓｔ２４１）は、Ｔａｇ−ポリメラ ーゼを用いて二本ｌＤＮＡフラグメントに変換された。

Ｐｓｔ２４１：　ＣＴＴ　ＴＧＣＣＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣＣＡＣＣＡＴＡ　ＴＡＣ ＾＾＾ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＡＣ＾ＧＡＧ　ＴＣＣＧＧＣＣＴＴ　ＧＧＣＧＴＴ　Ｇ ＴＡ　Ｇ＾＾ＧＴＡ（Ｖ） ＡｐａｌとＰｓｔｌを用いて消化をおこなった後、突然変異誘発性フラグメント を、ｆｄ−ｃａｔ２８ｃ５複製型ＤＮＡの大きなゲル精製Ａｐａ　Ｉ　−Ｐｓｔ 　Ｉフラグメントに結合させた。この結合試料を用いて大腸菌のＷＫ６細胞をニ レクロボレイト（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅ）　した。該細胞によって生産さ れたファージを実施例５に記載のようにしてパンニング処理に付した。パンニン グと増幅を数ラウンド（好ましくは３ラウンド）おこなった後、個々のクローン を単離した［クヴイルラら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、第８７巻、第６３７８頁〜第６３８２頁（１９９ ０年）参照］。ファージＤＮＡを標準的な方法によって精製し［サムプルツクら 、「分子クローニング−実験マニュアル」、コールド・スプリング・／　Ｘ−７ ＜−・ラボラトリ−・プレス、第４．２９頁（１９８９年）参照］、突然変異Ｂ ＰＴＩ遺伝子のＤＮＡ配列を決定した［サンが−（ＳａｎｇｅｒＳＦ）ら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、第７４巻、第５４６３頁〜 第５４６７頁（１９７７年）参照］。

因子Ｘａに対する組換え阻害因子を微生物の体内または真核生物の細胞内で発現 させるため、ＢｓｐＭＩＩとＫａｓ　Ｉを用いる消化の後、前記の構造（１１Ｉ ）で表される制限部位を用いてファージＤＮＡからＤＮＡフラグメントを単離し 、これを適当な発現ベクターに転移させた。好ましい発現ベクターは、大腸菌内 での発現用のｐＭａ／ｃ−５−１９型のベクター（図２参照）およびＰ　１ｃｈ ｉａ酵母発現系（フィリップス・ペトローレアム・カンパニー製）用のｐＨＴＬ ｓｌとｐＨＩＬＤ４ベクターである（実施例３参照）。

ＢＰＴＴから誘導される好ましい化合物本発明による好ましい化合物は、因子Ｘ ａに対するＫｉが５０ｎＭよりも小さな化合物である。このような化合物を以下 に例示する。これらの阻害因子は、括弧内に示す置換以外は、ＢＰＴＩと実質上 同じアミノ酸配列を有する。

ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　 ４６Ｇ１ｕ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｌｅｕ　４６ＧＬｕ）。

ＢＰＴＩ　（ＩＡｌａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　４６ Ｇ１ｕ）：ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９ Ｔｈｒ　３２＾ｒｇ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１１Ｇ１ｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１ ９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）。

ＢＰＴＩ　（ＩＡｌａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１３Ｐｈｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｐｈｅ）。

ＢＰＴＩ　（ＩＡｌａ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｐｈｅ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｔｙｒ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９１１ｅ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｔｒｐ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｐｈｅ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｈｉｓ）。

ＢＰＴｒ　（１＾１ａ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｓｅｒ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｖａｌ）。

ＢＰＴＩ　（１５Ａｒｇ　１６Ｇｌｙ　１７Ｔｒｐ　１８Ｐｈｅ　１９＾ｒｇ　 ２０Ｇ１ｎ）。

ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６Ｇ１ｙ　１７Ｔｒｐ　１８Ｐｈｅ　 １９＾ｒｇ　２０Ｇ１ｎ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１１Ｇｌｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６Ｇ１ｙ　１７Ｔｒｐ　 １８Ｐｈｅ　１９Ａｒｇ　２０Ｇｌｎ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１５Ａｒｇ　１６Ａ１ａ　１７Ｈｉｓ　１８１１ｅ　１９Ｔｈｒ　 ２０Ｔｈｒ）。

ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　１８１１ｅ　 １９Ｔｈｒ　２０Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　 １８１１ｅ　１９Ｔｈｒ　２０Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｅｕ　 ２０Ｖａｌ）。

ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　１８Ｈｉｓ　 １９Ｌｅｕ　２０Ｖａｌ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　 １８Ｈｉｓ　１９Ｌｅｕ　２０Ｖａｌ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴｒ　（１５＾ｒｇ　１６Ａ１ａ　１７Ｈｉｓ　１８Ｈｉｓ　１９＾ｒｇ　 ２０Ｇｌｕ）。

ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　１８Ｈｉｓ　 １９＾ｒｇ　２０Ｇ１ｕ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　 １８Ｈｉｓ　１９＾ｒｇ　２０Ｇ１ｕ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　１８Ｔ１ｅ　１９＾ｒｇ　 ２０Ｇ１ｎ）。

ＢＰＴＩ　（１３ｒｌｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　１８１１ｅ　 １９＾ｒｇ　２０Ｇ１ｎ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７ＦＩｉｓ 　１８１１ｅ　１９＾ｒｇ　２０Ｇ１ｎ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１５＾ｒｇ　１６Ｇｌｙ　１７Ｈｉｓ　１８Ｈｉｓ　１９＾ｒｇ　 ２０Ｇ１ｕ　２６＾ｓｎ）。

ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６Ｇ１ｙ　１７Ｈｉｓ　１８Ｈｉｓ　 １９＾ｒｇ　２０Ｇ１ｕ　２６＾ｓｎ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６Ｇ１ｙ　１７１（ｉｓ 　１８Ｈｉｓ　１９＾ｒｇ　２０Ｇ１ｕ　２６＾ｓｎ　３９kｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１５＾ｒｇ１６＾１ａ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ　１９＾ｓｎ　２ ０Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（＋３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ　 １９＾ｓｎ　２０Ｌｅｕ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１１Ｇｌｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｔｙｒ　 １８Ｐｈｅ　１９＾ｓｎ　２０Ｌｅｕ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　１８Ｖａｌ　１９＾ｒｇ　 ２０Ｈｉｓ）。

ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　１８ｖａｌ　 １９＾ｒｇ　２０Ｈｉｓ　３９Ｌｅｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３１１ｅ　 １５＾ｒｇ　１６＾１ａ　１７Ｈｉｓ　１８Ｖａｌ　１９＾ｒｇ　２０Ｈｉｓ　 ３９Ｌｅｕ）ＢＰＴＩ　（＋３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７＾ｓｎ　１８Ｐｈｅ　 １９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　 １７Ｓｅｒ　１８Ｐｈｅ　１９＾ｓｎ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（ １３１１ｅ　１５＾ｒｇ１７＾１ａ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４ ６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１６Ｓｅｒ　１７Ｔｙｒ　１ ８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１３丁１ｅ　１ ５＾ｒｇ　１７Ｓｅｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）Ｂ ＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７１１ｉｓ　１８Ｔｙｒ　１９Ｌｙｓ　 ３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７ｓｅｒ　 １８Ｐｈｅ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＴ　（１３１１ｅ　 １５＾ｒｇ　１７Ｓｅｒ　１８Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ） ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｓｅｒ　１８Ｔｙｒ　１９Ｌｙｓ　 ３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｖａｌ　 １８Ｐｈｅ　１９）１ｉｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ 　１５＾ｒｇ　１７１１ｅ　１８Ｔｙｒ　１９Ｖａｌ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ ）ＢＰＴＴ　（１３ｒｌｅ　１５＾ｒｇ　１７Ａｓｎ　１８Ｐｈｅ　１９＾ｓｎ 　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ 　１８Ｔｙｒ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＴ　（１３１１ｅ 　１５Ａｒｇ　１７＾１ａ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　３９Ｌｅｕ 　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７１１ｅ　１８Ｔｙｒ 　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ 　１７＾１ａ　１８Ｐｈｅ　１９＾ｓｎ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　 （１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｐｈｅ　１８Ｔｙｒ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ 　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｔｙｒ 　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ａｓｐ　１５＾ｒｇ 　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｅｕ　３４Ｔｙｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ ）ＢＰＴＩ　（１１Ｐｒｏ　１３Ｔｙｒ　１５Ａｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ 　１９Ｌｅｕ　３４Ｔｈｒ　３９Ｈｉｓ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｔｈｒ 　１３Ｐｒｏ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｈｉｓ　３４Ｐｈｅ 　３９Ｐｈｅ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＴ　（１１Ｐｒｏ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ 　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｐｒｏ　３４Ｈｉｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ ）ＢＰＴＩ　（１１Ｖａｌ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８）１ｉ ｓ　１９Ｔｈｒ　３４Ｓｅｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｓｅ ｒ　１３Ｌｅｕ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８）１ｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔ ｙｒ　３９Ｔｙｒ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｌｅｕ　１３１１ｅ　１５＾ ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｔｈｒ　３４Ｓｅｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ ｌｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｐｒｏ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８１ １ｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｈｉｓ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１１ Ｓｅｒ　１３Ｌｅｕ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４ Ｔｙｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｐｒｏ　１３１１ｅ　１５ ＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　３９Ｖａｌ　４６ Ｇ１ｕ）ＢＰＴｒ　（１１Ｇｌｕ　１３Ｖａｌ　１５＾ｒｇ　１７１１ｅ　１８ Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｈｒ　３９Ｖａｌ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１ Ｐｒｏ　１３Ｖａｌ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４ Ｓｅｒ　３９ＧＩｎ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１＾ｒｇ　１３Ｖａｌ　１５ ＾ｒｇ　１７ＩＬｅ　１８ＴＩｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｌｅｕ　３９Ｖａｌ　４ ６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｐｒｏ　１３Ｌｅｕ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１ ８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　３９Ｔｙｒ　４６Ｇ１ｕ）８ＰＴＩ　（１ １Ａ１ａ　１３Ｔｙｒ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８１（ｉｓ　１９Ｌｙｓ　 ３４Ｔｙｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ａｒｇ　１３Ｖａｌ　 １５＾ｒｇ　１７１１ｅ　１８Ｈｉｓ　１９Ｇ１ｎ　３４１１ｅ　３９Ｖａｌ　 ４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｔｈｒ　１３Ｔｙｒ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　 １８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（ ｌ］Ｔｈｒ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　 ３４Ｔｒｐ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｎ　１３１１ｅ　 １５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｍｅｔ　３９Ｌｅｕ　 ４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｐｒｏ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　 １８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　３９Ｍｅｔ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（ １１Ｇ１ｕ　１３Ｌｅｕ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１ｇ）１ｉｓ　１９Ｌｙｓ 　３４Ｔｙｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３Ｐｈｅ 　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｈｒ　３９Ｐｈｅ 　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（ｌｌｖａｌ　１３＾ｓｐ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ 　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３５Ｐｈｅ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　 （１１Ｇｌｕ　１３Ｐｈｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｈｉｓ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ 　３２Ｓｅｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（９＾１ａ　１ＩＧ１ｕ　 １３Ｔｙｒ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８１１ｅ　１９Ｌｙｓ　２３Ｐｈｅ　 ３４Ｈｉｓ　３９Ｐｈ■@４６Ｇｌｕ） ＢＰＴＩ　（１１Ｔｈｒ　１３Ｈｉｓ　１５＾ｒｇ　１７Ｐｈｅ　１８Ｐｈｅ　 １９Ｔｈｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｔｈｒ　１３Ｈｉｓ　 １５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３４１１ｅ　３９Ｐｈｅ　 ４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（９＾１ａ　１１Ｇ１ｕ　１３Ｐｈｅ　１５＾ｒｇ　１ ７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１０Ｈｉｓ　１ １Ｓｅｒ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３ ９Ｐｈｅ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇｌｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１ ７Ｌｅｕ　１８Ｐｈｅ　１９Ｔｈｒ　３４Ｈｉｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）Ｂ ＰＴＩ　（１０Ｓｅｒ　１ＩＧ１ｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１ ８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１ ３＾ｓｎ　１５＾ｒｇ　１７Ｐｈｅ　１８Ｐｈｅ　１９＾ｒｇ　３４１１ｅ　３ ９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｌｅｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１ ７Ｔｙｒ　１８Ｌｅｕ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）Ｂ ＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３＾ｓｎ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｌｅｕ　１ ９Ｌｙｓ　３４＾１ａ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（ｌ］Ｇ１ｕ　ｌ ］ｌｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３４Ｓｅｒ　３９ Ｐｈｅ　４ｇＧ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇｌｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７ Ｐｈｅ　１８＾ｓｎ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（８Ｓ ｅｒ　１１＾１ａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔ ｙｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇｌｕ　１３１１ｅ　１５＾ ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ １ｕ）ＢＰＴＩ　（１］Ｇ１ｕ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐ ｈｅ　１９Ｌｙｓ　３４Ｇ１ｕ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）より好ましい化合物 は、因子Ｘａに対するＫｉが１００Ｍよりも小さな化合物であり、次の化合物が 例示される。

ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　 ４６Ｇ１ｕ）。

ＢＰＴＩ　（ＩＡｌａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１人１ａ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　４ ６Ｇ１ｕ）；ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１ ９Ｔｈｒ　３２Ａｒｇ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　３９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１３Ｐｈｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（ＩＡｌａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｐｈｅ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｐｈｅ　１９Ｔｈｒ　３ ９Ｌｅｕ）。

ＢＰＴＩ　（ＩＡｌａ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｔｙｒ）。

ＢＰＴＩ　（１＾１ａ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｐｈｅ）。

ＢＰＴＩ　（ＩＡｌａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｌｙｓ　３ ９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（ＩＡｌａ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９ Ｔｈｒ　３９Ｔｙｒ　４６Ｔｙｒ）。

ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７＾１ａ　１８Ｐｈｅ　１９＾ｓｎ　 ３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７＾１ａ　 １８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　 １５人ｒｇ　１７Ｓｅｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ） ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｔｙｒ　１９Ｌｙｓ　 ３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｓｅｒ　 １８Ｐｈｅ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｐｒｏ　 １３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　 ３９１１ｅｔ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３Ｌｅｕ　１５＾ｒｇ 　１７Ｌｅｕ　１８）１ｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｓｅｒ　１３Ｌｅｕ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｒｉ ｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１ｓｅ ｒ　１３Ｌｅｕ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙ ｒ　３９Ｔｙｒ　４６Ｇｌｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３Ｔｒｐ　１５Ａｒ ｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ　１９Ｈｉｓ　３４１１ｅ　３９Ｇ１ｙ　４６Ｇｌ ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ｕ　１３Ｐｈｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｈｉｓ　１８Ｐｈ ｅ　１９Ｌｙｓ　３２Ｓｅｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｇ１ ｕ　１３Ｐｈｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｈ ｒ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｔｈｒ　１３Ｈｉｓ　１５＾ｒ ｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３４１１ｅ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ ｕ）ＢＰＴＩ　（１０）！ｉｓ　１１Ｓｅｒ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｔ ｙｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ）ＢＰＴＩ　（１１Ｖ ａｌ　１３Ｐｈｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｔｙｒ　１９１１ｅ　３９Ｐ ｈｅ　４６Ｇ１ｕ）血液の凝固は、セリンプロテアーゼの数種の特異的な酵素原 が限定されたタンパク質加水分解によって活性化される一連の増幅反応の最終段 階である。この活性化反応の開始と伝播は、凝固の外因性経路と内因性経路を経 ておこなわれる［マノキー（Ｍａｃｋｉｅ、１．　Ｊ、　）およびプル（Ｂｕｌ ｌ、Ｈ，Ａ、　）、「正常な止血とその調節」、Ｂ　１ｏｏｄ　Ｒｅｖｉｅｗｓ 、第３巻、第２３７頁〜第２５０頁（１９８９年）参照〕。

両方の経路は、因子Ｘａの形成において、高度に相互依存しており、また、収斂 性がある。因子Ｘａは血液凝固カスケードにおいては、トロンビンを生成する最 後から２番目の段階を触媒する。トロンビンは血漿中のフィブリノゲンを分裂さ せることによって血塊を形成させる。

凝固カスケードの初期段階の妨害によって、因子Ｘａに対して強力で選択的な阻 害因子を、因子Ｘａの高活性に関係する疾患、特に異常な止血に関係する疾患の 治療薬として使用できる。例えば、因子Ｘａの阻害因子は、血栓治療中または血 管形成手術中の血管再閉塞を防止するのに使用できる。また、該阻害因子は、敗 血性ノヨノクと関係する散在性の血管向凝固障害、特定のウィルス感染症および 癌の治療にも使用できる。

因子Ｘａに対する前記の阻害因子の特異性はこれらの化合物の重要な特徴であっ て、該化合物は、治療患者の潜在的な止血能に最小の影響しか及ぼすことなく、 病原性の血栓形成を抑制する。この結果、治療中の出血性合併症の発生率は低減 することになる。

本発明には、貯Ｍ後に投与されるように調製された薬剤組成物であって、薬学的 に有効量の前記化合物および薬学的に許容されるキャリヤーまたは希釈剤を含有 する薬剤組成物が包含される。治療用に許容されるキャリヤーまたは希釈剤は薬 学の分野においては周知であり、例えば、次の文献に記載されている。「レミン グト／（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）の薬科字」、？−，り・パブリッシング社（Ｍａ ｃｋ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ、　）、ケンナＯ（Ａ、Ｒ，Ｇｅｎｎａｒｏ） ！、１９８５年。該薬剤組成物には防腐剤、安定剤、色素および調味剤を配合し てもよい。例えば、防腐剤として、安慝香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ− ヒドロキシ安艷香酸エステル類を添加してもよい（上記文献、第１４４９頁参照 ）。さらに、抗酸化剤および沈澱防止剤を使用してもよい（上記文献参照）。

本発明による組成物は経口投与用の錠剤、カプセルまたはエリキシル、直腸投与 用全列または注射投与用滅菌溶液もしくは懸濁液等として調製して使用に供して もよい。注射用製剤は、液状の溶液もしくは懸濁液、注射前に液状の溶液もしく は懸Ｓ液に調製するのに適した固体、または乳濁液等の常套の形態に調製しても よい。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、マンニトール、ラクト ース、レノチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウムおよび塩酸システィン等 である。さらに、所望により、注射用薬剤組成物には、少量の無毒性助剤、例え ば、湿潤剤およびｐＨ緩衝剤等を配合してもよい。また、所望により、吸収促進 剤、例えばリポソーム等を用いてもよい。

本発明には、異常な血栓症によって特徴づけられる病気の予防法もしくは治療法 が包含される。投与に必要な該組成物の薬学的有効量は、投与経路および処置さ れる哺乳類のタイプや身体的な特徴によって左右される。投与量は最適な効能が 得られるように調整されるが、体重、ダイエツトおよび併用する薬剤等の要因並 びに医学の分野の当業者に認識される他の要因によって左右される。

本発明による上記方法の実施に際しては、前述の化合物もしくは組成物を単独も しくは併用して使用してもよく、あるいは他の治療剤もしくは診断剤と併用して もよい。これらの化合物はインビボ、通常は哺乳類、好ましくは人体で使用する ことができ、また、インビトロでも使用できる。インビボで使用する場合、該化 合物もしくは組成物は種々の方法（例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与 、筋肉内投与、結腸内投与、直腸内投与、鼻腔内投与または腹膜的投与等）によ り、種々の投与量で投与することができる。

当業者には容易に理解されるように、有効なインビボ投与量および特定の投与方 法は処理される哺乳類の年令、体重および種類、使用する特定の化合物、並びに これらの化合物を用いる特定の用途等によって左右される・所望の効能を得るた めに必要な有効投与量は当業者によって容易に決定できる。一般的には、該化合 物の投与を比較的少ない投与量から開始し、所期の効能が得られるまで投与量を 増大させてゆ（ことによって決定される。

本発明による化合物の投与量は所望の効能と治療上の徴候に応じて広範囲に変化 させることができる。一般的には、投与量は体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜 １１００ｆｆ１．好ましくは釣１０１μｇ〜１０票９である。好ましい投与法は 非経口投与法、例えば、日毎の静脈内投与法である。

実施例１・　Ｍｃ５−ＰＩベクターおよびｐＭａ５−ＰＩベクターの構築ＢＰＴ Ｉコーディング領域を４種の化学的に合成したオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ ｓｔ２０５．７４量体；Ｐｓｔ２０６．７８量体；Ｐｓｔ２０’７．１０２量体 ；Ｐｓｔ２０８．１０２量体二図３参照）を合いて構築した。合成後、オリゴヌ クレオチドを分取ゲル電気泳動法によって精製し、酵素によって燐酸化した。次 いで、オリゴヌクレオチドを対単位でアニールした。この場合、適当なオリゴヌ クレオチドの各々を５Ｑｐｍｏ１ｅ含有する混合物２０μｌを１００℃で３分間 加熱した後、室温（約２０°Ｃ）まで冷却した。オリゴヌクレオチドＰｓｔ２０ ５およびＰｓｔ２０６のアニーリングによって平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅ ｄ）／　Ｓ　ｔｙ　Ｉフラグメントが得られ、また、オリゴヌクレオチドＰｓｔ ２０７およびＰｓｔ２０８のアニーリングによってＳｔｙ　Ｉ　／ＨｉｎｄｎＩ フラグメントが得られた。これらのフラグメントと共に、図４Ｂに示す完全な２ 本鎖ＢＰＴＩコーディング領域が形成された。

受容体ｐＭｃ５　１９を１（ｐｎＩ制限によって開き、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ フレナラフラグメント）を用いて処理することによって３゛−突出末端を切除し 、次いで、Ｈｉｎｄｌｌｌを用いて消化した（図４Ａ参照、池の等価なベクター は容易に消化して、標準的な方法によって使用することができる）。この原料は 前記の２種のＢＰＴＩフラグメントと結合させた。ｌａｃ　Ｉ　ｑ菌株ＷＫ６は 結合混合物を用いて形質転換させた。ランダムに採取した１２個のＣ腸Ｒ形賞転 換体の制限分析に基づき、５個のクローン（Ｃ２、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０およびＣ １１）を保持した。これらのクローンの配列決定により、構築スキームから予測 されたＢＰＴＩコーディング領域とｐｈｏＡノグナル間の正確な接合点を確認し た。しかしながら、５個のクローンはいずれも１または２以上の不必要なヌクレ オチド置換を含んでいた。クローンｃ９　（Ａｓｎ４３　Ｌｙｓアミノ酸置換を もたらすＣ−＞Ａ！換を含む）およびｃｌ。

（ＬｅｕからＶａｔへの突然変異をもたらすＣ−＞Ｇ置換を含む）を使用して、 野性型ＢＰＴＩをコード化するベクターを構築した。この場合、Ｃ９の小さなＥ ｃｏＲＩ／５ｔｙｌフラグメントおよびｃｌｏの小さな３　ｔｙ　Ｉ　／　Ｈ１ ｎｄｎｌフラグメントをポリアクリルアミドゲルを用いて精製し、これらを、Ｅ ｃｏＲＩとＨｉｎｄＩ［［で消化したｐＭａ５−３に結合させた。補正された制 限パターンを示す得られたクローンの１種を保持した。配列決定によって所望の ＢＰＴＩコーディング領域を有することが確認されたこのクローンはｐＭａ５− ＰＩで示す。突然変異による構築のために、相補ｐＭｃ５−ＰＩも調製した。後 者のベクターは、ＥｃｏＲＩ　／Ｘｂａ　Ｉ発現カセットをｐＭａ５−ＰＩから ｐＭｃ５−８へ転移させることによって得た（Ｘｂａ１部位はＨｉｎｄＩｆｆ部 位のすぐ下流に存在する０図４参照）。

Ｐ　ｔａｃプロモーターの抑制解除により、ｐＭａ５−ＰＩまたはｐＭｃ５−Ｐ Ｉを宿すＷＫ５細胞が、トリプシン阻害活性の出現によって示されるように、Ｂ ＰＴＩの合成を指示することが判明した。この活性は浸透圧ショックによって解 除されるが、このことは、ＢＰＴＩがペリプラスミック間隙内に蓄積することを 証明する。この発現１度は低過ぎるため、全細胞抽出物のクマシー（Ｃｏｏｍａ ｓｓｉｅ）−染色とゲル電気泳動分画化によってタンパク質を視覚によって見る ことはできない。

活性の測定から、ＢＰＴＩタンパク質が、培養物１リツトルあたり約１■ｇにな ることが計算された（ＯＤ、。。。、＝±４）。ここで得られた生産量は類似の 発現系を用いた池の研究者によって報告されている値に匹敵するものである［マ ークスら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、第２６１巻、第７１１５頁〜第７１ １８頁（１９８６年）およびゴールデンベルク（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｂ 　１ｏｃｈｅ１１ｉｓｔｒｙ、第２７巻、第２４８１頁〜第２４８９頁（１９８ ８年）参照］。後述する精製処理に付した後、組換えＢＰＴＩをＮ−末端ンーク エンンングに付した。この結果、ｐｈｏＡ−ＢＰＴＩ前駆体が適切なプロセシン グを受けたことが判明した。

実施例２：　ＢＰＴＩから誘導される分子をコードする遺伝子の部位特異的突然 ｗ発による構築 １１本鎮ＤＮＡの調製 ブロスミドｐＭａ５−ＰＩを宿すＷＫ６細胞の一夜培養物（アンピシリン１００ μｇ７ｍｌを補充したＬＢ−培地中、３７℃で培養）を、抗生物質を含有しない 新鮮な培地を用いて１：５０に希釈した。細胞を約２Ｘ１０’／ｍｌの密度まで 増殖させた後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ？［ビエイラ（ＶｉｅｉｒａＳＪ、 　）およびメ・ノンング（Ｍｅｓｓｉｎｇ％Ｊ、　）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５３巻、第３頁〜第１１頁（１９８７年）参照コ を用いて感染の多重度２０で感染させた。インキュベーションを５〜１６時間お こなった後、上澄みからウィルス粒子およびプソイドウィルス粒子を回収し、次 の文献に記載の方法と実質上同じ方法によって一本鎖ＤＮＡを抽出した６サムブ ルソク、フリッチュおよびマニアチス、「分子クローニング−実験マニュアル」 、コールド・スプリング・／　％　−／　＜−・ラボラトリ−・プレス、第４． ２９頁（１９８９年）。収量（一般的には、培養物１ｍｌあたり１〜４μｇ）は ＵＶ−分光法によって決定した（ｅｕｏｏｚ＝　２．８６　Ｘ　１０−’ｃｍ” ／　μｇ）。

２、ＤＮＡフラグメントの調製 ｐＭｃ５−ＰＩプラスミドＤＮＡを、制限酵素５ａｃＩＩおよび５ｐｈｌ（両方 の制限部位は特有のものであり、図４に示す）を用いて完全に消化させた。大き なフラグメントは、次の文献に実質上記載されている方法により、低融点アガロ ースゲルから回収したハイスランダ−（Ｗｅｉｓｌａｎｄｅｒ、　Ｌ、　）、Ａ ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、第９８巻、第３０５頁〜第３０９頁（１９７９年 ）。フラグメントの収量１叡エチジウムブロマイドで染色したアカロースゲル上 において、既知量のＤＮＡのノくノド強度と比較することによって定量した。

３　キ＋’７ブト（ｇａｐｐｅｄ）二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｄ　Ｄ　Ｎ　Ａ　） の構築ｇｄＤＮＡは、ｐＭｃ５−Ｐ’ｌからゲルで精製した大きな５ａｃｎ／５ ｐｈＩフラグメ／トおよび相補ベクターｐＭａ５−ＰＩの一本鎖型の変性／再生 によって調製しｊ二。

フラグメント（０、１ｐｍｏｌｅ）と一本鎖ＤＮＡ（０，５ｐｍｏｌｅ）の水性 混合物（２ｍＭ以下の塩含有）３５μｌを７０℃で５分間インキュベートし、次 いで、１．５ＭＫＣｌ／１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ溶液（ｐＨ７，５；７０° Ｃ）５μｌを添加した後、混合物を室温まで冷却した。ｇｄＤＮＡの生成は、交 雑混合物のアリコートのアガロースゲル上での電気泳動法によってモニターした 。ｇｄＤＮＡの移動度は、リラックスした完全二本鎖ｐＭａ／ｃ５−ＰＩの移動 度とは区別がつかなかった。

４　突然変異誘発性オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびギャップのフィリ ング／シーリング反応 所望のアミノ酸置換は、３種のオリゴヌクレオチドを用いて導入した。即ち、１ １ｅ１３、Ａｒｇ１５、Ｔｙｒ１７およびＴｈｒ１９の組込みに対してはＰｓｔ ２１０を使用し、Ｌｅｕ３９に対してはＰｓｔ２１１を使用し、Ｇ１ｕ４６に対 してはＰｓｔ２１２を使用した。これらのオリゴヌクレオチドの配列を以下に示 す（下線を引いた残基が野性型ＢＰＴＩ配列と異なる）・オリゴヌクレオチドＰ ｓｔ２１０によって指示される突然変異の一部は制限部位、例えば、Ｎｄｅｌ（ 認識配列ＣＡＴＡＴＧ）およびＮｃｉＩ（ＣＣＣＧＧ）と関連することに注意す べきである。同様に、オリゴヌクレオチドＰｓｔ２１２の組込みによって、Ｂｓ ｔＢ１部位（ＴＴＣＧＡＡ）が出現する。

これらのオリゴヌクレオチドは酵素によって燐酸化した後、分取ゲル電気泳動法 によって精製したウー（Ｗｕ、　Ｒ，）、ウー（Ｗｕ、　Ｎ、　−Ｈ，）、ノ１ ンナ（Ｈａｎｎａ。

Ｚ、）、ゲオルゲス（ＧｅｏｒｇｅｓＳＦ、）およびナラング（Ｎａｒａｎｇ、 　Ｓ、）、「オリゴヌクレオチド合成−実用的アプローチ」、ゲイト（Ｇａｉｔ 、　Ｍ、　Ｊ　、　）編、ＩＲＬブレス、オノクスフォードおよびワンントンＤ Ｃ，第１３５頁〜第１５１頁（１９８４年）参照。

３種のオリゴヌクレオチドの各々ｌ　ＱｐｍｏｌｅをｇｄＤＮＡ含有交雑混合物 ８μ！に添加した。この混合物を６５℃で５分間加熱した後、室温まで冷却した 。この混合物を４μｌずつ１０回にわけて緩衝液［６２５ｍＭＫ（Ｊ、２７５１ １Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、２０ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ ｍＭ　ＡＴＰおよび４種のｄＮＴＰの各々を０．２５ｍＭ含有する緩衝液（ｐＨ ７，５）］に添加し、水を用いて全容積を４０μハニ調整した後、ＤＮＡポリメ ラーゼ！（フレナラフラグメント）１ユニツトおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼ５ユ ニツトを添加した。得られた混合物を室温で４５分間インキュベートした。

５、形質転換および分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）ポリメラーゼ／リガーゼ反 応混合物（５μｌ）を用いて菌株ＷＫ６ｍｕｔＳを形質転換させた［ツェル（Ｚ ｅｌｌ、Ｒ，）およびフリック（Ｆｒｉｔｚ、　Ｈ，−Ｊ、）、ＴｈｅＥＭＢＯ Ｊ　ｏｕｒｎａｌ、第６巻、第１８０９頁〜第１８１５頁（１９８７年）参照］ 。形質転換混合物のアリコート（１／１０）を選択培地（２５μｇ／ｌａｎクロ ルアンフェニコール）上に散布して形質転換効率を決定した。約２５０の形質転 換体が得られた。

形質転換混合物の残部を、クロルアンフェニコール２５μｇ／ｍｌを補充したＬ Ｂ培地ＩＱｍ／に接種した。−夜増殖をおこなった後、プラスミドＤＮＡを単離 し、コレを用いてｓｕ−菌株ＷＫ６を形質転換させ［ツェルおよびフリック、Ｔ ｈｅ　ＥＭＢ　ＯＪ　ｏｕｒｎａｌ、第６巻、第１８０９頁−１８１５頁（１９ ８７年）参照］、次いで、クロルアンフェニコール耐性に対する選択処理に付し た。

６　所望の突然変異体の同定 ８つのランダムに採取したクローンのプラスミドＤＮＡを調製し、Ｎｄｅ　１部 位の存在を分析した。このようなＮｄｅ　＋　クローンの一本鎖ＤＮＡ（段階１ に記載のようにして調製した）の配列を決定したところ、全ての所望の突然変異 遺伝子で組込まれたことが判明した。このクローンはｐＭｃ５−Ｐ　Ｉ　４ｃ２ で表す。全ての突然変異体のコーディング領域の配列決定は、ノブオキシ鎖終止 法によっておこなった［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、）ニツクレン（Ｎｉｃ ｋｌｅｎ、　Ｓ、）およびクールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ、−ＡｙＲ，）、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、第７４巻、第５４６３ 頁〜第５４６７頁（１９７７年）参照］。この場合Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼお よび突然変異体ＢＰＴＩコーディング領域のすぐ下流のベクター配列にアニール 化されるノングルプライマーを使用した（図２参照）。

４４ｃ３の構築 突然変異体４４ｃ３は、４ｃ２に存在する全ての置換のほかに、Ｔｈｒｌｌから Ｇ１ｕアミノ酸置換を有する。４４ｃ３を構築するために、ｐＭｃ５−ＰＩ４ｃ ２一本鎖鋳型およびｐＭｃ５−ＰＩからゲル精製した大きな５ａｃｌｌ／５ｐｈ Ｉフラグメントから成るギャップト二本鎖ＤＮＡ分子を使用した。Ｇｆｕｌｌを 、以下の配列（下線を引いた残基は４　ｃ　２鋳型配列とは異なる）を有するオ リゴヌクレオチドＰｓｔ２８９と共に導入した Ｐｓｔ２８９：　５°−ＣＣＧＧＣＡＴＡＴＧ　ＣＣＣＴＣＡＴＡＣＧ　ＧＴ、 ＧＧにの特別な実験においては、ＷＫ６ｍｕｔＳとＷＫ５形質転換体を１００μ ｇ／■ｌアンピンリン上で選択した。Ｐｓｔ２８９によって指示された突然変異 によって特有のＡｃｅ　Ｉ制限部位（野生型ＢＰＴＩと４ｃ２コーデイング領域 のいずれにも存在する図４参照）が除去されるので、ＷＫ６ａ＋ｕｔＳ形質転換 体から単離されたプラスミドＤＮＡは、ＷＫ５細胞の形質転換に先だって、Ａｃ ｃＩ酵素を用いて消化した。これらのＷＫ６形質転換体から単離したプラスミド ＤＮＡの分析によって、Ａｃｅ　Ｉ部位の消失が確認された。１クローン（ｐＭ ａ５−ＰＩ　４４ｃ３）が適正なコーディング領域を有することは配列決定によ って確認された。

ピキア・バストリスのメタノール利用経路の第一酵素であるアルコールオキシダ ーゼは、細胞のメタノール中での増殖中において、該細胞の可溶性タンパク質の ３０％程度を構成する。これに対して、この酵母を、過剰の抑制炭素源、例えば 、グルコースまたはグリセロール等の存在下で増殖させる場合には、アルコール オキシダーゼは存在しない。メタノール利用経路のいくつかの遺伝子をクローン 化して確認した。これらのメタノール誘導性プロモーター領域の配列を決定し、 種々の発現ベクターの構築に使用した。

ピキア菌株ＧＴＳ　１１５（ｈｉｓ４）および大腸菌−ピキアンヤトルベクター （以下、ｐＨＩＬｓｌおよびｐＨＩＤ４という）は、フイリ・ソブス・ベトロー レアム・カンパニーから専売されているピキア酵母発現系の一部を成す。

エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マルチコピー構 成要素のスフ１ノーニング、メタノール利用（Ｍｕｔ）表現型および発酵を含む 全ての酵母操作（まフィリップス・ベトローレアム・カンノくニーの操作マニュ アル；二従っておこなった。

ｐＨＩＬｓ１プラスミドは、次のピキア・Ｉくストリス要素を有する：１）５’ ＡＯＸ１（ＰＨＯＩシグナルペプチドと融合したアルコールオキシダーゼプロモ ーター ＳａｍＩおよびＢａＩＩＨエクローニング部位を有する）２）３’．へＯＸＩ（ アルコールオキ／ダーゼ終止配列の約２５６ｂｐセグメント）、３）宿主ＧＴｓ 　１　１　５中の欠損ｈｉｓ４遺伝子を補足する２，４ｋｂフラグメント上に含 まれるピキア・パストリスのヒスチノノールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＨＩ５４、 ４）５゛Ａｏｘ１領域と共に、部位特異的組込みに必要な３°ＡＯＸＩＤＮＡ領 域。

このベクターにおいては、ＰＨＯＩ分泌シグナルのＡＴＧ出発コドン＋ｔＡＯＸ １遺伝子のＡ　Ｔ　Ｇの場合と同じ位置であるＡＯＸＩプロモーターの下流１こ 位置する。

ＰＨＯＩノグナル配列および５°ＡＯＸ１と３’ＡＯＸ１配Ｗｌ＋との間の接合 （よ次の通りである ５°ＡＯＸＩ　ＰＨＯ１シグナル配列　ＸｈｏＩＴＴＡ　ＴＴＣ　ＧＡＡ　ＡＣ Ｇ／ＡＴＧ　ＴＴＣ　ＴＣＴ，　、、、。

ＧＴＣ　ＴＴＣ　ＧＣＴ／ＣＧＡ　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＣＣＣＭｅｔ　Ｐｈｅ　Ｓ ｅｒ．　、　、　、　、　、　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　ＡｌａＢａｍＨＩ　３°ＡＯＸ 　１ ＧＧＧ　ＡＴＣ　ＣＴＴ／ＡＧＡ　ＣＡＴ．、、、。

篤二の残基（プロリン）から出発する４ｃ２コーディング配列を有するＢｓｐ量 ■−Ｈｉｎｄｌ［［フラグメントをｐＭｃ５−Ｐ　Ｉ　４ｃ２ベクターから抽出 し、次いで、結合端をＤＮＡポリメラーゼＩ（フレナラフラグメント）で補充し た後、Ｘｈｏｌ−ＢａｍＨ■で消化された平滑末端ｐＨＩＬｓ１受容体ベクター 内へ挿入した。ｐＨＩＬｓｌのＸｈｏｌ末端のフレナラ処理により、ＰＨＯＩシ グナルペプチドの後に、余分のＡｒｇコドン（ＣＧＡ）を導入した。このアミノ 酸は、４Ｃ２の第一アミノ酸に対応する。一方、４ｃ２大腸菌構築体中のＢ　ｓ ｐａ　ＩＩ末端のフレナラ処理によって、５゛末端のＰｒｏ２コドンを的確に復 元させた。両方のフラグメントの結合により、ＰＨＯＩノグナル（（Ｐｈｅ−２ 、、６ｔ’ａ−１）と４ｃ２遺伝子（Ａｒｇ＋ｌ、Ｐｒｏ＋２、。

）を完全に融合させることができた。この結合物質は大腸菌宿主ＷＫＳ内におい て形質転換させた。適切に配向された挿入物を宿すベクターを制限分析によるス クリーニング処理に付し、これをｐＨＩＬ　Ｓ１４ｃ２で示す。

ｐＨＩＬ　Ｓ４−４ｃ２誘導体は、ＳａｃＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてのＰ Ｈ０１−４ｃ２コーディング配列を含有する発現カセットの一部をｐＨＩＬ　Ｓ ｌ−４ｃ２からｐＨＩＬＤ４へ転移させることによって構築させた。後者のベク ターは、ｐＨＩＬｓｌの他の要素のほかに、ＨＩＳ４と３°ＡＯＸ１領域の間に 挿入された細菌カナマイノン耐性遺伝子を有する。このベクターは、抗生物質Ｇ ４１８に対する耐性度を高めるスクリーニングによって、発現カセットの多重コ ピーを有するピキア形質転換体を選択するのに使用できる。

ピキア菌株ＧＴＳ　１　１　５中でのｐＨＩＬ　Ｓ４　４ｃ２の形質転換後（ス フ二ロプラスト法）、Ｈｉｓ十形質転換体を、Ｈ４１８を１０　０　ｕｇ／ｍｌ 〜２　０　０　０　μｇ／ｍｌの１度で含むプレート上での抗生物質Ｇ４１８耐 性に関する試験に供した。Ｇ４１８に対して高レベルの耐性を示すクローンにつ いて、Ｐ　ａｏｘプロモーターをメタノールと共に導入した振盪フラスコ内での ４Ｃ２生産に関して評価した結果、培養培地中でのトリプンン阻害活性の出現に よって示されるように、該クローンは４ｃ２の合成と分泌を指示することが判明 した。

クローンＧＴＳ１１５／４ｃ２＃２５（Ｍｕｔ＋表現型）を、バッチ供給方式で バイオスタット（Ｂ　１ｏｓｔａｔ）　Ｅ発酵槽（１０リツトル）中で処理した （飢餓状態になるまでグリセロールを添加した状態でバイオマスを蓄積させた後 、メタノールを唯一の炭素源とエネルギー源として導入した）。約１３０時間後 に発酵槽の運転を停止させたところ、約４４０ＷＷｇ／Ｉのバイオマスが蓄積さ れた。活性の測定から生産収量を計算したところ、培養上澄み１リツトルあたり ９０１９であった。精製後、組換え４ｃ２をＮ−末端ンークエンシングに付した ところ、ＰＨ０Ｉ−４ｃ２前駆体が適切に処理されたことが判明した。

実施例４・　大腸菌からのＢＰＴＩ誘導組換え阻害因子の精製大腸菌細胞を、ク ロルアンフェニコールまたはアンピシリンを含有するＬＢ培地２５０ｍ＋’を保 有するバッフル具有フラスコ中、３７℃で増殖させた（ｐＭａ５の場合にはアン ピンリンが必要であり、ｐＭｃ５の場合にはクロルアンフェニコールが必要であ る）。３時間後、０．１ｍＭ　Ｉ　ＰＴＧの添加によって細胞を誘発させ、−夜 増殖させた。マークス（Ｍａｒｋｓ、　Ｃ，Ｂ、）らの報文に記載の方法に従っ て大腸菌の細胞を溶解させた［　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、第２６１ 巻、第７１１５頁〜第７１１８頁（１９８６年）参１．１゜湿潤細胞的１ｇを、 スクロース２０％およびＥＤＴＡ５０ｍＭ含有する４ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐ Ｈ８）１．５ｍｌ中に懸濁させ、これに、リソチーム２５１９を添加した後、０ １％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００１，１５ｗｊ’および５Ｍ　ＮａＣｌ 　Ｑ、３■Ｉを添加した。室温で１５分間放置した後、２００ｍＭＴＥＡ緩衝液 （ｐＨ７，８）２．５ｍｆｆを添加し、次いでＬＭ　ＮａＣ１ｚ　Ｏ，１５ｍＬ 　ＩＭ　ＭｇＣｌ２０．１■ＩおよびＤＮＡ５ｅＩ　１０４ｇを添加した。この 懸濁液を２５℃で２０分間攪拌した。２％ＴＣＡの添加によって大部分のタンパ ク質を沈殿させ、該沈殿物を遠心分離によって除去した。ＴＣＡ上澄みをＮａＯ Ｈの添加によって中和した後、以下の精製処理に付した。

精製処理は次の工程から成る・ １）　トリプシンーセフ７０−ス上でのアフィニティークロマトグラフィー［１ ００ｍＭ　ＴＥＡ（ｐＨ７，８）および３００ｍＭ　ＮａＣ１を用いて平衡化さ せ、カラム体積の５倍量の１００ｍＭ　ＴＥＡ（ｐＨ７，８）、３００ｍＭ　Ｎ ａＣ１゜１０ｍＭＴＥＡ（ｐＨ７，８）および５ＱａＭＮａＣ１を用いて洗浄し 、２０１ＭＨＣｌおよび５０ｍＭ　Ｎａ（：１（ｐＨ１，８）を用いて溶離した 。］２　）　Ｍｏｎｏ　−５上でのカチオン交換クロマトグラフィー［カラム体 積の１０倍量の１０〜５００■Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５）の直線勾配溶出法 を使用した。コ ３）ＨＰＬＣＣ４カラム上での逆相クロマトグラフィー（０，１％ＴＦＡ中のイ ソプロパツールの勾配を０〜３５％にして溶離をおこなった）４）凍結乾燥 実施例５：　ファージのバンニング法 突然変異体ＢＰＴＩ−ファーンを、該ファージを感染させたプレートから約５ｏ ｏ、ｏｏｏのコロニーをかき取った後、ＬＢ−培地に再懸濁させることによって 単離した。この懸濁液を遠心分離による透明化処理に２回付した後、ＰＥＧ沈殿 によって上澄みからファージを回収した。ペレット状のファージをＴ　Ｂ　Ｓ　 ［Ｔｒｉｓで緩衝化した食塩水（ｐＨ７，４）］に再督濁させた。約１０１０個 の感染粒子（、１１ｍ１）を、１ｍＭＣａ”　の存在下において、１０ｎＭ／１ １００ｎ因子Ｘａを用いて１〜２時間インキュベートした。この混合物を、セフ ァロースＣＬ−４Ｂ（０，１■Ｉ）上に固定した非中和抗−Ｘａモノクローナル 抗体上において、少なくとも３０分間のパンニング処理に付した。この種の抗体 は、次の文献の実施例６に記載の標準的な方法によって得ることができ、該記載 内容も本明細書の一部を成すものである。ホード（Ｈｏａｄ）およびゲクジー（ Ｇｅｃｚｙ）、Ｊ　、　Ｉ　ｉｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１３６巻、第２６９頁 （１９９１年）。ゲルは、ＴＢＳｌｏ、５％Ｔｗｅｅｎ２０を用い、室ａで６０ 分間かけて徹底的に洗浄した（１０Ｘ１ｍ／）。結合ファージを、０．１ＭＨＣ ｌ−グリシン（ｐＨ２）を添加して溶離させた（２　Ｘ　０．５ａ／）。溶出液 を除去し、ＩＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）の添加によって中和した。溶出したファー ジを、菌株ＷＫ６の感染後、テトラサイクリン耐性コロニーについて平板培養す ることによって増幅させた［クヴイルラら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ／、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ、第８７巻、第６３７８頁〜第６３８２頁（１９９０年）参照］。

ファージを前述のようにして回収した後、バンニング処理と増幅処理を２回以上 繰返した。

実施例６　因子Ｘａに対する非中和モノクローナル抗体の同定および精製ハイブ リドーマの調製と所望のモノクローナル抗体の同定は、例えば次の報文に記載の 標準的な方法を用いることによっておこなうことができる；バーロウ（Ｈａｒｌ ｏｖＳＥ、）およびレーン（Ｌａｎｅ、　Ｄ、）、「抗体実験マニュアル」、コ ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８８年。貯留したヒト血漿 から単離した精製ヒト因子Ｘａを用いて雌のｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化させた 。完全フロインドアジュバントを用いて一次免疫化をおこない、不完全フロイン ドアジュバントを用いて促進免疫化をおこなった。免疫化の経路は腹腔内および 皮下である。融合前二日間は、精製因子Ｘａを含有する食塩水を静脈から潅流ブ ースト（ｂｏｏｓｔ）によってマウスに投与した。膵臓を摘出し、膵臓細胞を、 標準的なハイブリドーマ法に従って、Ｓ　Ｐ　２１０骨髄腫に融合させた。スク リーニングによって、因子Ｘａの酵素活性を抑制することなく因子Ｘａ抗原と反 応するハイブリドーマ抗体を同定しｊこ。

手短かに言えば、次の通りである。９６個のウェルを有するポリビニルクロライ ド製マイクロタイター板上に、アフィニティー精製したヤギの抗−マウスＩｇＧ ［例えば、ノグマ・ケミカル・カンパニー（セントルイス、ミズーリ）の市販品 ］を塗布した。抗体塗布プレートをウノアルブミンを用いてブロックし、培養上 澄み（少なくとも１５０に希釈）を該プレートに塗布した。プレートを洗浄する ことによって未結合抗体を除去し、因子Ｘａを添加後、インキュベンーヨンをお こなった。プレートを洗浄することによって未結合因子Ｘａを除去した。負の対 照は、無関係なモノクローナル抗体を分泌する細胞系からのハイブリドーマの培 養上澄み、滅菌培養培地および緩衝液を含有する。結合活性因子Ｘａは、色素産 生性物質の溶液を添加しく実施例７参照）、室温で４時間インキュベートし、４ ０５ｎ１における吸光度をマイクロタイター板読み取り装置を用いて決定するこ とによって検出することができた。

イムノグロブリンＩｇＧは、問題となるマウスハイブリドーマ細胞系を含有する マウスの腹水から、バイオラード・ラボラトリーズ製ＭＡ　Ｐ　Ｓ　ｎシステム をその使用説明書に従って使用することにより調製した。精製モノクローナル抗 体による因子Ｘａの阻害欠如は、実施例７に記載の色素アッセイによって確認し た。

モノクローナル抗体は、ファーマシア製のＣＮＢｒ−活性化セファロースＣＬ４ Ｂ上にその使用説明書に従って固定化した。

以下に説明するアッセイは、本発明による有用な阻害因子、即ち、因子Ｘａに対 しては低いＫｉを示し、他の酵素活性に対しては比較的高いＫｉを示す阻害因子 を確認するのに有効である。簡単に言えば、次の通りである。下記の成分をマイ クロタイター板の９６個のウェル内に入れた（以下の表参照）：５０ｕｌ　ＴＢ ＳＡ［１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）、１４０ｍＭ　ＮａＣ１，Ｑ、１％ Ｂ５Ａｌ、 ５０μｌ　阻害因子（所望により、ＴＢＳＡを用いて種々の濃度に希釈する）、 ５０μｌ　プロテアーゼ（ＴＢＳＡを用いて最適濃度に調！する）。

マイクロタイター板は室温において３０分間または２時間インキュベートした（ 因子Ｘａ）。

色素産生性物ｉｆ（所望により、水を用いて希釈する）５０μｌ添加する。

初期速度は、４０５〜６５０ｎＭの濃度において、室温で１０〜３０分間測定し た。

阻害定数を決定するために、種々の阻害因子の濃度（［Ｉｔ］）と基質の濃度に おける初期速度（ｖｌ）を測定し、また、見掛は阻害定数（Ｋ１）は、個々の基 質１度にオイて得られたデータを次式を用いて適合させることによって決定した ・Ｖｉ／　ｖｏ＝　ｉ（［Ｅ　ｔ］　−［１ｔ］　−Ｋｉ　＊）＋　［（［Ｉ　 ｔ］＋Ｋｉ　＊−［Ｅｔ］）２＋　４　Ｋｉ　＊［Ｅｔ］−コ　’　”ｌ　／　 ２　［Ｅ　ｔ］ 式中、Ｖｏは非阻害初期速度を示し、［Ｅｔ］は全酵素濃度を示す。Ｋ４＊値を 基賀１度ゼロまで外挿することによって、実際の阻害定数の値が得られる。

ｒｐＮＡＪはｐ−ニトロフェニルアニリドを示す。

ｒｃｂｏＪはベンジルオキシカルボニルを示す。

ｒＢｚＪはベンゾイルを基す。

等容量の因子ＶＩＩａ（０，８％ＢＳＡおよＵ２０ｍＭ　ＣａＣ１！を含有する １０ｎＭＴＢＳ溶液）および組織因子（０，０３％トリトンＸ−１００を含有す る４ＱｎＭＴＢＳ溶液）を混合し、室温で３０分間インキュベートした。Ｖｌｌ ａ／ＴＦ複合体１００μｌを阻害因子５０μｌと混合し、３０分間インキュベー トした。反応は基層、一般的には、Ｓ−２２８８（Ｈ−Ｄ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａ ｒｇ−ｐＮＡ）を０．４ｍＭ添加することによって開始させ、生成物の初期生成 速度を決定した。全阻害因子濃度（［Ｉ　ｔ］）が全酵素濃度を越えたとき、阻 害定数（Ｋｉ）を次式から決定した：Ｖｉ／Ｖｏ＝　１　＋［Ｉ　ｔコ）／Ｋｉ 一般的な阻害因子濃度は０．２〜２μＭの範囲で変化させた。

活性化タンパク質Ｃに対するアミトールアッセイタンパク質Ｃ源としては、凍結 乾燥したヒト正常血漿を元に戻して使用した。

タンパク質Ｃ活性化酵素（Ｋａｂｉ社製）を希釈した血漿中に添加することによ って、活性化タンパク賀Ｃの濃度を約５ｎＭに調整した。活性化タンパク質Ｃ溶 液５０μＥをＴＢＳＡまたは阻害因子のＴＢＳＡ希釈液１ｏｏｌｉｌと混合し、 ３７℃で３０分間インキュベートした。２ｆｆｉＭ　Ｓ　−２３６６（＜　Ｇｌ ｕ　−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）５０μｌを添加し、生成物の初期生成速度を、 マイクロタイター板読み取り装置を使用し、４０５止で測定した。全阻害因子濃 度（［Ｉｔ］）が全酵素濃度を越えたとき、阻害定数（Ｋｉ）を次式から計算し た。

Ｖｉ／Ｖｏ＝１＋［Ｉｔ］／Ｋｉ 一般的な阻害因子１度は１５〜５μＭの範囲で変化させた。

実施例８：　因子Ｘａに対する選択された阻害因子の阻害定数いくつかの突然変 異体ＢＰＴＫ因子Ｘａ阻害因子を、実施例２に記載の方法により、部位特異的突 然変異誘発によって調製した。これらの突然変異体ＢＰＴＩ因子Ｘａ阻害因子は 大腸菌内で生産さ也実施例４に記載の方法によって精製した。実施例７に記載し た酵素的方法を使用することによって、因子Ｘａを含むいくつかのセリンプロテ アーゼに対するこれらの阻害因子の阻害定数を決定した。

選択された阻害因子の因子Ｘａに対する阻害定数を以下に示す。

阻害因子　ＢＰＴＩにおけるアミノ酸置換　Ｋｉ　（ｎＭ）４ｃ２　１Ａ１ａ　 １３ｒｌｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ　 ３４ｃｌＯ１＾１ａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９ Ｌｅｕ　２３２ｃ３　１＾１ａ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌ ｅｕ　４６Ｇ１ｕ　８３７ｃｌ　１１Ａ１ａ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｔ ｙｒ　１９Ｔｈｒ　３２Ａｒｇ　３９Ｌｅｕ　２６Ｇ１ｕ ４４ｃ３　１＾１ａ　１１Ｇｌｕ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９ Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　１１６Ｇ１ｕ ５７ｃｌ　１＾１ａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　２５ ９ｃ４　１＾１ａ　１３Ｐｈｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌ ｅｕ　８６２ｃ３　１＾１ａ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈ ｒ　３９Ｐｈｅ　６６０ｃｌ　ＩＡｌａ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｐｈｅ 　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　ｆ３５２ｃ１９１＾１ａ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ 　１９Ｔｈｒ　３９Ｔｙｒ　８５４ｃ３　１＾１ａ１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１ ９Ｔｈｒ　３９１１ｅ　１３５５ｃｌＯ１＾１ａ１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９ Ｔｈｒ　３９Ｔｒｐ　１４５６ｃｌ　１＾１ａ１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔ ｈｒ　３９Ｐｈｅ　９４３ｃ５　１＾１ａ　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙ ｒ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ　１．６８８ｃｌ　１＾１ａ　１５＾ ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｔｙｒ　４６Ｔｙｒ　５３　Ｌ　５５　１ ３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ａ１ａ　１８Ｐｈｅ　１９Ａｓｎ　３９Ｌｅｕ　４ ６Ｇ１ｕ　５３Ｌ３９　１３１１ｅ１５＾ｒｇ１７＾１ａ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌ ｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇｌｕ　５３　Ｌ　４１　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１ ７Ｓｅｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ　６３Ｌ６０　１ ３１１ｅ１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｔｙｒ　１９Ｌｙｓ　３９Ｌｅｕ　４６ Ｇ１ｕ　４３　Ｌ　４４　１３１１ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｓｅｒ　１８Ｐｈｅ　 １９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ　４５　Ｌ　６９　１１Ｐｒｏ　１３１１ ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８１１ｉｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　５３９ Ｍｅｔ　４６Ｇ１ｕ ５　Ｌ　８４　１１Ｇ１ｕ　１３Ｌｅｕ　１５Ａｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ 　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　２３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ ５　Ｌ　６８　１１Ｓｅｒ　１３Ｌｅｕ　１５Ａｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ 　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　１．５３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ ５　Ｌ　６５　１１Ｓｅｒ　１３Ｌｅｕ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８ＦＩｉ ｓ　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｙｒ　５３９Ｔｙｒ　４６Ｇ１ｕ ５　Ｌ　４８　１１Ｇ１ｕ　１３Ｔｒｐ　１５＾ｒｇ　１７Ｌｅｕ　１８Ｈｉｓ 　１９Ｈｉｓ　３４１１ｅ　４３９Ｇｌｙ　４６Ｇｌｕ ７　Ｌ　６０　１１Ｇｌｕ　１３Ｐｈｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｈｉｓ　１８Ｐｈｅ 　１９Ｌｙｓ　３２Ｓｅｒ　８３４Ｖａｌ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇｌｕ ７　Ｌ　２２　１１Ｇ１ｕ　１３Ｐｈｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈｅ 　１９Ｌｙｓ　３４Ｔｈｒ　０．５３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ ７　Ｌ　６７　１１Ｔｈｒ　１３１（ｉｓ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｐｈ ｅ　１９Ｌｙｓ　３４１１ｅ　５３９Ｐｈｅ　４６Ｇｌｕ ７　Ｌ　７１　１０）１ｉｓ　１１Ｓｅｒ　１３１１ｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙ ｒ　１８Ｐｈｅ　１９Ｌｙｓ　４３４Ｖａｌ　３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ ７　Ｌ　７３　１１Ｖａｌ　１３Ｐｈｅ　１５＾ｒｇ　１７Ｔｙｒ　１８Ｔｙｒ 　１９１１ｅ　３４Ｖａｌ　６３９Ｐｈｅ　４６Ｇ１ｕ 因子Ｘａに対する前記の阻害因子の特異性は、治療患者の止血能に最少限の効果 しか及ぼすことなく、病原性血栓形成を抑制する点で、これらの化合物の重要な 特徴である。これによって、治療中の出血性合併症の発生率が低下する。本明細 書において具体的に開示した化合物について説明したように、トロンビンに対す る因子Ｘａを特異的に阻害することの重要性は、因子Ｘａの１分子がトロンビン ２００．０００分子の生成をもたらす血液の凝固カスケードの増幅特性を考察す れば明らかである。従って、臨床的に有意な抗血栓効果を得るのに必要な因子Ｘ ａに対する選択性阻害因子の投与量は、同等の効果をもたらすトロンビン阻害因 子またはこのような特異性を欠く他の因子Ｘａに対する阻害因子の投与量よりも かなり少ない。ｔＰＡに対する前述の因子Ｘａの阻害因子の特異性は、これらの 化合物をこの血栓溶解剤と共に、梗塞性冠状動脈の再潅流に使用するときに必ず 必要となる。全体的には、血液凝固カスケードにおける個々の酵素に対する阻害 因子が特異的であればあるほど、治療中に起こる望ましくない副作用の発生率は より低くなる。

因子Ｘａの阻害因子（ｐｐ４Ｃ２）はＢＰＴＩ中に次の置換を有する：１３１１ ｅ　１５Ａｒｇ　１７Ｔｙｒ　１９Ｔｈｒ　３９Ｌｅｕ　４６Ｇ１ｕ０因子Ｘａ に対するｐｐ４Ｃ２の阻害定数はｎＭのオーダーである。該阻害因子は、生理的 条件下においては、因子Ｘａに対して準不可逆的に緩慢であるが強固に結合する 阻害因子である。

重要なことには、因子Ｘ１ｌａとトロンビンは生理学的に有意な濃度（２５μＭ まで）のｐｐ４Ｃ２によっては阻害されない。ｐｐ４Ｃ２は、ｔＰＡまたはウロ キナーゼのアミトール活性も阻害しない。ｐｐ４Ｃ２は活性化タンパク質Ｃを非 常に弱く阻害するに過ぎず、その阻害定数はμＭのオーダーである。因子Ｘａを 阻害するのに必要な濃度と活性化タンパク質を阻害するのに必要な濃度との間に は１０００倍の差があるので、活性化タンパク質に影響を及ぼさないように投与 量を調整することができる。ＢＰＴＩに比較して、ブタの膵臓のカリクレインに 対するｐｐ４Ｃ２のアフィニティーは約１００倍低い。

ｐｐ４Ｃ２は、ＢＰＴＩと同様に、強力なトリブノン阻害因子であるが、このこ とは予想外のことではない。何故ならば、トリブ／ンは特異的プロテアーゼでは ないからである。その阻害プロフィルは、周辺の残基に許容される広範な可変性 を有するＰ１残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）によって生として決定される。

プラスミンは、フィブリンのクロットを崩壊させるので、血栓溶解において重要 な役割を果たす。しかしながら、プラスミンは、血栓溶解治療においてしばしば みられる出血の問題の原因と考えられている。出血は、非常に有効なプラスミン 阻害因子であるアプロチニン（ＢＰＴＩ）の投与によって減少させることができ る。ＢＰＴＩに比較して、プラスミンに対するｐｐ４Ｃ２のアフィニティーは約 １００倍低い。しかしながら、ｐｐ４Ｃ２は強力なプラスミン阻害因子であって 、その阻害定数はｎＭのオーダーである。本発明による他のＢＰＴＴ突然変異体 は、プラスミンに対しては実買的に低い活性を示すが、因子Ｘａに対しては強力 な阻害能を有する。

因子Ｘａに対する阻害因子（ｐｐ　４　ｃ　２　）の血栓に対する効果は、スト ックマンズ（Ｓｔｏｃｋｍａｎｓ）らによりラットについて開発された方法によ って調べた［Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、第６５巻 、第４２５頁〜第４３１頁（１９９１年）参照］。

この実験動物モデルにおいては、大腿静脈の標準化されたクラッシュ損傷によっ て血栓を誘発させた。血栓の出現と消失は、ビデオレコーダによるデジタル解析 と組合せた透照装置を使用して、損傷を与えた後、４０分間にわたってモニター した。損傷を与える前の３０分間にわたって、ｐｐ４ｃ２を１００μｇ／ｋｇ／ 分の流速で点滴したところ、血栓形成の抑制率は約８０％であった。これに対し て、生理的食塩水をハムスターに注入した対照実験における血栓形成の抑制率は 約５％であった。この実験の結果を図７に示す。

実施例１トピキアの培養上澄みからの因子Ｘａに対する阻害因子４Ｃ１０の精製 ピキアＧＴＳ　１１５細胞を次の培地５０１１を保有する振盪フラスコ（２５０ ｍｌ）内において、飢餓状態まで最大４８時間増殖させた。

ＢＭＧ￥：酵母抽出物１０．０ｇ／ｌ、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基１３゜ ４ｇ／ｌ、菌類ペプトン２０．０ｇ／ｌ、ビオチン０．　４ｍｇ／ｌ、ＫＨ２Ｐ ○４１３．６１ｇ／ｌ、グリセロール１０．Ｏｇ／ｌ細胞を採取し、次の誘導培 地１０＋＋＋１中の再懸濁させた。

ＢＭＭＹ、酵母抽出物１０．０ｇ／ｌ、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基１３゜ ４８／ｌ、菌類ペプトン２０．０ｇ／ｌ、ビオチン０．４ｍｇ／Ｌ　ＫＨｚＰＯ ４１３，６１ｇ／ｌ、メタノール０．　５％細胞培養は、メタノールを毎日０． 　５％供給しながら３日問おこなった。細胞を遠心分離によって除去し、因子Ｘ ａに対する阻害因子をさらに精製するために、上澄みを貯蔵した。

上澄み９■ｌのｐＨおよび伝導度をそれぞれ氷酢酸および逆浸透水（Ｍｉｌｌｉ −Ｑｗａｔｅｒ）を用いてそれぞれ４．０および５ｍＳ／ｃ１１以下に調整した 。孔径０．　２μｌの濾過器を用いて処理した後、希釈上澄みを、Ｓ−セファロ ース−ＦＦカチオン交換カラム（１０Ｘ１００ｍ＋ｍ）に流速１　ａ＋１／分で 通した。カラムは４０■１の塩直線勾配［５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０ ）、ＮａＣｌ　Ｏ〜Ｉ　ＭＦによって溶離させた。突然変異体ＢＰＴＩ４ｃｌＯ はＮａＣ１が約４５０ｍＭのところで溶離した。各々のフラクションについて、 因子Ｘａに対する阻害能を調べ、最も高い阻害活性を示すフラクションを分析用 ＲＰＣ１８カラムを用いて処理した（アセトニトリル１０％〜４５％の２０分勾 配、ＴＦＡｏ、１％、１１１＋１／分）。突然変異体ＢＰＴ　Ｉ　４ｃｌ　Ｏは 勾配の最後に溶離した（保持時間１６４３分）。

実施例１２因子Ｘａ活性の測定 血漿中の因子Ｘの濃度は約１０μｇ／　ｍ　１である［フリー（Ｆｕｒｉｅ、　 Ｂ、）およびフリー（Ｆｕｒｉｅ、　Ｂ、　）、Ｃｅ１ｌ、第５３巻、第５０５ 頁〜第５１８頁（１９８８年）４町。正常な健康人の場合、大部分が酵素原とし て循環し、活性化因子Ｘ（因子Ｘａ）の存在量は非常に少ない。血漿中の因子Ｘ の全ａ麿は血餅形成試験、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間試験（Ａ ＰＴＴ）またはプロトロンビン時間試験（ＰＴ）等によって定量できる［ｒＥＣ ＡＴアッセイ法。実験技術マニュアル」、ノエスパーセン（Ｊ　、Ｊ　ｅｓｐｅ ｒｓｅｎ）、ベルチノ（Ｒ，Ｍ、Ｂｅｒｔｉｎｏ）およびハーバ−ケート（Ｆ　 、　Ｈａｖｅｒｋａｔｅ）Ｗ、クルベル（Ｋｌｕｗｅｒ）−アカデミツク・バブ リッノヤーズ、ドレヒト、オランダ（１９９２年）コ。因子Ｘに対する特殊な色 素産生性アッセイ法も知られている（例えば、Ｋａｂｊ社のＣ０ＡＴＥＳＴ−Ｘ 参照）。しかしながら、因子Ｘと因子Ｘａの区別が必要な場合には、別のアッセ イ法を利用しなければならない。因子Ｘを認識するが因子Ｘａを認識しないモノ クローナル抗体、または、因子Ｘａを認識するが因子Ｘを認識しないモノクロー ナル抗体が知られている［ホードおよびゲクジー、Ｊ　、Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇ ｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｈｏｄｓ、第１３６巻、第２６９頁〜菓２７８頁（１９９１ 年）参照］。この種のモノクローナル抗体は、血漿中の因子Ｘａを定量するＥＬ 　Ｉ　ＳＡ試験に使用することができる。因子Ｘａの高活性を評価する別の方法 は、因子Ｘａ（例えば、トロンビン、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合 体、プロトロンビンフラグメント１＋２）の作用によって形成される生成物の量 を測定するか、または、凝固カスケードの比較的遅い段階の反応生成物（例えば 、Ｄ−ダイマーフィブリン誘導体）の量を測定する［ポニュ−（Ｂｏｎｅｕ）ら 、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　ＨａｅＩｌｌｏｓｔａｓｉｓ、第６５巻、第 ２８頁〜第３２頁（１９９１年）およびペルッｙ　（Ｐ　ｅｌｚｅｒ）ら、同書 、第１５３頁〜第１５９頁参照〕。例えば、バクスター社（Ｂ　ａｘｔｅｒ）は 、プロトロンビンフラグメントＦｌ。

２ＥＬＩＳＡ試験法を開発し、提供している。これらの試験は血漿試料を用いて おこなう。ｙと因子Ｘａ（組換えアンチスタシン）を特異的に反応させるプロー ブを、無傷組織中において因子Ｘａを発生する細胞部位を検知する免疫組織化学 的方法に利用することが知られている。このプローブを利用することによって、 例えば、生検試料中の腫瘍細胞上で増大する因子Ｘａの異常な濃度を検知できる 。アンチスタノンは因子Ｘａの活性部位に結合するので、この種の細胞上に因子 Ｘａが存在すると、因子Ｘａの異常に高い活性がもたらされることになる。因子 Ｘａの高濃度をモニターする別の方法は、酵素原の活性化によって放出される活 性ペプチドを定量する方法である。

実施例１３・ファージライブラリーの構築因子Ｘａに対する阻害因子をコード化 するクローンの３種の異なるライブラリーを以下に例示する。これらのライブラ リーは、実質上は前述したような突然変異誘発法によって構築した。

（ａ）３Ｌ−ライブラリーの構築 このライブラリーは、ＢＰＴＩ中に固定されたアミノ酸置換を有する（　Ｐ　ｒ ｏ　１３　Ｔｉｅ、Ｌｙｓ１５ＡｒｇＳＡｒｇ３９ＬｅｕおよびＬｙｓ４６　Ｇ ｌｕ）。さらに、１６〜１９位に、すべての可能なアミノ酸残基を有することが できる。新規なベクター（ｐＭａ５−ＰＩ８９）は、下記のＰｓｔ３４４を用い るｐＭｃ５−Ｐ　Ｉ　４ｃ２のオリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発によって構 築したＰ　ｓｔ　３４４　：　ＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧ　ＡＧＡＣＣＧＧＣＣＴ　 ＴＧＧＣＧＴＴＧＴＧ　ＴＣＴＴＣＧＧＴＴ＾＾ＴＴＴ＾＾ＡＴＧＣＧＣＡＧ＾ ＾ＧＡＣＣＣＧＧＴＡＴＡＣＧＧ　ＴＧＧＣＴＣＧＡＧこの新規なベクター（ｐ Ｍａ５−ＰＩ　８９）は以下のＢＰＴＩ誘導配列（Ｖｌ）を有する： Ｋａｓ工 ＧＧＣＧＣＣ Ｇｌｙ＾１ａ （■） このベクター中のＢｓｐＭ　Ｉ　Ｉ　−Ｋａｓ　Ｉフラグメントのファージゲノ ム［遺伝子操作による前記の遺伝子変異体（ＩＩＩ）］への転移によって、ｆｄ −８９が得られた。

上記の配列（Ｖｌ）は、フレームノットが存在するために、機能タンパク質をコ ードしない。ヌクレオチド３５と６５の間の配列は、突然変異誘発性オリゴヌク レオチドの挿入と親ファージ（Ｆｓｐｌ）に対するカウンター選択を容易にする ための制限部位（Ｂｂｓｌ）を提供する。このライブラリーの構築には、突然変 異誘発性オリゴヌクレオチドＰｓｔ３４５によるｆｄ−８９の小さなりｂｓ［フ ラグメントの置換が含まれる。このクローニングによって、前記の配列（Ｖｌ） においてフレームで示す２つの翻訳された領域がもたらされる。この突然変異誘 発性オリゴヌクレオチドは同義コーディング配列を有する（この場合、ＮはＧ、 Ａ、ＴおよびＣのいずれかを示し、ＫはＧまたはＴのいずれかを示す）。

以下に示すＰｓｔ３４５を２つの「半部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）Ｊオリゴヌク レオチド（以下のＰｓｔ３４６およびＰｓｔ３４７）に交雑させることによって 、配列（’ｉＮ）に示すＢｂＳＩ部位に対して相補的な結合端を形成された。２ つのＢｂｓ１部位の開裂によって非相補的な結合端が形成されるので、突然変異 誘発性フラグメントの固有の配向状態での挿入が保証される。突然変異誘発性オ リゴヌクレオチドの挿入条件としては、クヴイルラらの報文に記載された条件と 実質上同じ条件を使用した［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、第８７巻、第６３７８頁〜第６３８２頁（１９９０年）参照］。結合ＤＮＡ は、大腸菌ＷＫ６２（自発的に生成するＷＫ６のＦ−誘導体）中でのエレクトロ ポレーションによって形質転換した。この形質転換体は、テトラサイクリンを含 有するＬＢ寒天上で平板培養した。

Ｐｓｔ　３４　５　：　ＴＡＣＣＧＧＣＡＴＣ丁ＧＣＣＧＣＮＮＫＮ　ＮＫＮＮ ＫＮＮＫＣＧ　ＣＴＡＣＴＴＣＴＡＣＰ　ｓｔ　３４６　：　ＧＣＧＧＣＡＧＡ ＴＧ　ＣＣＰｓｔ３４　７　：　ＣＧＴτＧτＡＧＡＡ　Ｇτ＾ＧＣＧ（ｂ）５ Ｌ−ライブラリーの構築 ５Ｌ−ライブラリーは次の置換を有する：１１　：Ｘｘｘ（＝すべての可能な残 基）位置　１８°Ｈｉｓ １９　：　Ｌｙｓ／　Ａｓｎ／　Ｔｈｒ／Ｍｅｔ／　Ｉ　ｌｅ／　Ｇ　ｉｎ／　 Ｈｉｓ／　Ｐ　ｒｏ／　Ｌｅｕ３４　：Ｘｘｘ ３９：Ｘｘｘ ４６：Ｇｌｕ 突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（Ｐｓｔ３７４およびＰｓｔ３７５）は次の １つの文字コードによって示される同義配列を有する二ＮＡＧ、Ａ、ＴおよびＣ のいずれかを示す。

Ｈ：Ａ、ＴおよびＣのいずれかを示す。

Ｄ：Ａ、ＴおよびＧのいずれかを示す。

ＳＡＧおよびＣのいずれかを示す。

Ｍ４ＡおよびＣのいずれかを示す。

ＫＧおよびＴのいずれかを示す。

入入ＴＣ ＧＧＣ オリゴヌクレオチドＰｓｔ３７４およびＰｓｔ３７５のアニーリングにより、Ｘ ｈｏｌとＥａｇｌの結合端を有する二本鎖ＤＮＡフラグメントを得た。このフラ グメントをｆｄ−８９（Ｖｌ）の大きなゲル精製Ｘｈｏ　Ｔ　−Ｅａｇ　Ｉフラ グメントと結合させた。

結合ＤＮＡは、大腸菌ＷＫ６２中でのエレクトロポレーションによって形質転換 させた。この形質転換体を、テトラサイクリンを含有するＬＢ寒天上で平板培養 した。

（ｃ）７Ｌ−ライブラ１１−の構築 ７Ｌ−ライブラリーは次の置換を有するｌ　ｌ　：　、Ａｌａ、　Ａｓｐ、　Ａ ｓｎ、Ｇｌｕ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、　Ｍｅｔ。

Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ　および　Ｖａｎ。

１３：　Ｉｌｅ、　Ｐｈｅ、　Ｈｉｓ、　Ｌｅｕ、　Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、 　ＴｈｒおよびＴｙｒ １５：　Ａｒｇ。

位置　１７：　Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ　およびＴｙｒ１８：　Ａｓｐ、　Ｐｈ ｅ、　Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、　Ｌｅｕ、　Ａｓｎ、　ＴｙｒおよびＶａ１１９：　ｌ ｉｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、　Ｔｈｒ３４：　Ａｌａ、　Ａｓｎ、　Ａｓｐ、　Ｇｉ ｎ、　Ｇｌｕ、　Ｈｉｓ、ｌｉｅ、　Ｌｅｕ、　ＬｙｓＰｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ 、　Ｔｈｒ、　Ｔｙｒ、Ｖａ１３９：　Ｌｅｕ　および　Ｐｈｅ ４５：　Ｇｌｕ 突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（Ｐｓｔ４１０およびＰｓｔ４１１）は次の １つの文字コードで示される同義配列を有する：Ｎ：Ｇ、Ａ、ＴおよびＣのいず れかを示す。

Ｈ：Ａ、ＴおよびＣのいずれかを示す。

Ｄ：Ａ、ＴおよびＧのいずれかを示す。

ＳＡＧおよびＣのいずれかを示す。

Ｍ：ＡおよびＣのいずれかを示す。

Ｙ、ＣおよびＴのいずれかを示す。

Ｗ：ＡおよびＴのいずれかを示す。

ＴＴｒＮ’ＨＭＴＡＴＧ　ＧＴＧＧＣＴＧＣＴ’ｒ　５ＧＣＡＡＡＧＣＧＴ　Ａ ＡＣＡＡＴ？ＴＣＧ　ＡＡＴＣ突然変異誘発性オリゴヌクレオチドのアニーリン グによって、ＸｈｏｌおよびＥａｇＩ結合端を有する二本鎖ＤＮＡフラグメント を得た。このフラグメントを、Ｘｈ。

ＩとＥａｇｌ（Ｖｌ）で消化したｆｄ−８９に結合させた。結合ＤＮＡは、Ｆｓ ｐ［を用いる消化により親ファージ（Ｖｌ）にカウンター選択した後、大腸菌Ｗ Ｋ６２中でのエレクトロボレーシコンによって形質転換させた。この形質転換体 を、テトラサイクリンを含有するＬＢ寒天上で平板培養した。

実施例１４．ビオチニル化因子Ｘａを用いるファージライブラリーのパンニング 別の好ましいバンニングプロトコルにおいては、実施例１３に記載のファージを 、ビオチニル化因子Ｘａと共にインキュベートした。因子Ｘａに結合したファー ジを、ストレプタビジンで被覆した磁化性ビーズ［ダイナル社（Ｄｙｎａｌ）製 ］にビオチニル化因子Ｘａを結合させることによって分離し、低ｐＨ条件下で溶 離させた。

因子Ｘａは、カルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）製のビオチン−ＸＸ−Ｎ Ｈ３をその使用説明書に従って用いることによってビオチニル化した。

突然変異体ＢＰＴＩ−フ７−ノを、実施例１３に記載の平板培地からテトラサイ クリン耐性形質転換体をこすり取ることによって単離した。この細胞をＢＬ培地 に懸濁した懸濁液を遠心分離による透明化処理に２回付した後、ＰＥＧ沈澱処理 による上澄みからファージを回収した。このファージのペレットをＴＢＳ（２０ ＋ｎＭ　Ｔ　ｒｉｓで緩衝化した食塩水：ｐＨ７，４）に再懸濁させた。約５Ｘ １０”個の感染粒子（１ｍｌ）を１０％Ｍビオチニル化因子Ｘａ（ＴＢＳ中にＴ ｗｅｅｎ２０　０−５％含有）と共にインキュベートした。この懸濁液を室温（ 約２０〜２５℃）下で２０分間〜２時間インキュベートした。ストレプタビジン で被覆した磁化性ビーズを因子Ｘａよりも過剰に加え、インキュベーノジンをさ らに５〜３０分間続行した。ビーズを取り出し、ＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ２０　０． ５％およびＢＳＡｏ、１％含有）１ｍｌを用いて１０回洗浄した。結合したファ ージ（即ち、因子Ｘａに結合する因子Ｘａに対する強力な阻害因子としての機能 を発揮するファージ）を、０．１Ｎ　ＨＣＩ／グリノン（領　１５Ｍ　ＮａＣ１ 、領　０５％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｖｅｅｎ２０含有、ｐＨ２）を用いて溶離 させた。ＬＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）の添加によって中相した溶離ファージを、菌 株ＷＫ６による感染およびテトラサイクリン耐性コロニーの平板培養によって増 幅した［クヴイルラら、Ｐｒａｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、第８７巻、第６３７８頁〜第６３８２頁（１９９０年）参照］。前述の ようにしてファージを回収し、パンニング処理と増幅処理を、因子Ｘａの濃度を 低下させながら繰り返した（例えば、２回目のラウンドでは１％Ｍとし、３回目 のラウンドでは０．１％Ｍとし、４回目と５回目のラウンドでは０．０１％Ｍと する）。

最後の結合−選択処理をおこなった後、標準的な方法によってファージＤＮＡを 精製し、配列を決定した。選択されたファージクローンを、因子Ｘａのアミトー ル活性の阻害試験に供した。

単離したファージクローンのＢＰＴＩ−突然変異体コーディング領域を前述のよ うにしてｐＭａ５−ＰＩベクターまたはｐＭｃ５−ＰＩベクターに転移させるこ とによって、因子Ｘａに対するコード化された溶性型阻害因子（ファージに付着 した因子とは反対のタイプの因子）を発現させた。選択された阻害因子の阻害定 数を、前記のアミトールアッセイによって決定した。前述のパンニング処理をお こなうことにより、３Ｌ−ライブラリー、５Ｌ−ライブラリーおよび７Ｌ−ライ ブラリーから、Ｋｉが１０％Ｍよりも小さな因子Ｘａに対する阻害因子を同定し た。

以上説明した態様以外の他の種々の態様も吹下の請求の範囲内に包含される。

２１Ｚ父ｌ− ンークエンノングプライマー ＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴｒＡＡＧＴＧ／Ｚタ　Ｊ 〆Ｚタ　ｄｉ− ／Ｚ夕ｆ ｇ５Δ− 、Ａ′７６：ｚ− フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　８ ８２８−４８ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　９／９９　９１５２ −４ＢＣ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４Ｂ（Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：８４） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：８４） （７２）発明者　リプ力、ウィリアム・チャールズアメリカ合衆国９２１２１カ リフォルニア、サン・ディエゴ、レッド・ロック・ドライブ１０８１９番 Ｉ

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．５０ｎＭよりも小さな阻害定数で因子Ｘａを阻害する、ＢＰＴＩから誘導さ れる化合物。
2. ２．因子Ｘａに対して２０ｎＭよりも小さな阻害定数を有する請求項１記載の化 合物。
3. ３．因子Ｘａに対して５ｎＭよりも小さな阻害定数を有する請求項１記載の化合 物。
4. ４．化合物がポリペプチドである請求項１記載の化合物。
5. ５．下記の構造を含む請求項１記載の化合物：【配列があります】 上記構造において、 Ｘ１１はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸 、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、リジン、プロリン、セリン、トレオニ ン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを示し、Ｘ１３はアラニン、アスパ ラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、 ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、ト リプトファン、チロシンまたはバリンを示し、Ｘ１４はアラニン、セリンまたは システインを示し（但し、Ｘ１４がシステインのときは、Ｘ３８はシステインで なければならない）、Ｘ１５はアルギニンを示し、 Ｘ１６はアラニンまたはグリシンを示し、Ｘ１７はアラニン、アスパラギン、ア スパラギン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン 、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシ ンまたはバリンを示し、Ｘ１８、Ｘ１９およびＸ２０はいずれかの天然のアミノ 酸を示し、Ｘ３４はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シ ステイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、 ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、ト リプトファン、チロシンまたはバリンを示し、 Ｘ３５はフェニルアラニンまたはチロシンを示し、Ｘ３６はアラニン、グリシン またはセリンを示し、Ｘ３８はアラニン、セリンまたはシステインを示し（但し 、Ｘ３８がシステインのときは、Ｘ１４はシステインでなければならない）、Ｘ ３９はグルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、 メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファ ン、チロシンまたはバリンを示し、 Ｘ４５はフェニルアラニンまたはチロシンを示し、Ｘ４６はいずれかの天然のア ミノ酸を示す。
6. ６．Ｘ１１がアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニ ンまたはバリンを示し、 Ｘ１３がアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン 、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンまたは バリンを示し、 Ｘ１４がシステインを示し、 Ｘ１５がアルギニンを示し、 Ｘｌ６がアラニンまたはグリシンを示し、Ｘ１７がアラニン、アスパラギン、ヒ スチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、 トリプトファンまたはチロシンを示し、Ｘ１８がアスパラギン、ヒスチジン、イ ソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシンまたはバリンを示し、 Ｘｌ９がアルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、 トレオニンまたはバリンを示し、 Ｘ２０がアルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、トレ オニンまたはバリンを示し、 Ｘ１８、Ｘ１９およびＸ２０はいずれかの天然のアミノ酸を示し、Ｘ３４がアラ ニン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェ ニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを 示し、 Ｘ３５がフェニルアラニンまたはチロシンを示し、Ｘ３６がグリシンを示し、 Ｘ３８がシステインを示し、 Ｘ３９がグルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオ ニン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを示 し、 Ｘ４５がフェニルアラニンを示し、 Ｘ４６がグルタミン酸、リジンまたはチロシンを示す請求項５記載の化合物。
7. ７．下記の構造式を有する請求項４または５記載の化合物：【配列があります】 上記構造において、 Ｘ１はアラニンまたはアルギニンを示し、Ｘ１１はアラニン、アルギニン、アス パラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、プロリン、セリン、トレオ ニンまたはバリンを示し、Ｘ１３はアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン 、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプ トファン、チロシンまたはバリンを示し、 Ｘ１４はシステインを示し、 Ｘ１５はアルギニンを示し、 Ｘ１６はアラニンまたはグリシンを示し、Ｘ１７はアラニン、アスパラギン、ヒ スチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、 トリプトファンまたはチロシンを示し、Ｘｌ８はアスパラギン、ヒスチジン、イ ソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシンまたはバリンを示し、 Ｘｌ９はアルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、 ロイシン、リジン、プロリン、トレオニンまたはバリンを示し、Ｘ２０はアルギ ニン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、トレオニンまたはバ リンを示し、 Ｘ３４はアラニン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチ オニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンま たはバリンを示し、 Ｘ３５はフェニルアラニンまたはチロシンを示し、Ｘ３６はグリシンを示し、 Ｘ３８はシステインを示し、 Ｘ３９はグルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオ ニン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを示 し、 Ｘ４５はフェニルアラニンを示し、 Ｘ４６はグルタミン酸、リジンまたはチロシンを示す。
8. ８．下記の化合物から成る群から選択される請求項５記載の化合物：【配列があ ります】 【配列があります】
9. ９．請求項１から８いずれかに記載の化合物をコード化する単離された核酸セグ メント。
10. １０．請求項９記載の核酸セグメントおよびプロモーター領域を含み、該プロモ ーター領域が該核酸セグメントに対してその転写を調整するように位置したベク ター。
11. １１．該化合物を細胞膜を通して分泌させるアミノ酸配列をコード化する核酸セ グメントをさらに含む請求項１０記載のベクター。
12. １２．請求項１０記載のベクターを含む宿主細胞。
13. １３．宿主細胞が細菌である請求項１２記載の宿主細胞。
14. １４．宿主細胞が大腸菌である請求項１３記載の宿主細胞。
15. １５．宿主細胞が真核細胞である請求項１２記載の宿主細胞。
16. １６．宿主細胞が酵母細胞である請求項１２記載の宿主細胞。
17. １７．宿主細胞がピキア・バストリスである請求項１６記載の宿主細胞。
18. １８．ベクターが宿主細胞内で該化合物を発現させる条件下において、該化合物 をコード化する該ベクターを保有する宿主細胞を増殖させることを含む、請求項 １から８いずれかに記載の化合物の調製法。
19. １９．宿主細胞をその培養培地から分離させ、該化合物を宿主細胞から分離させ 、該化合物を物理的分離性によって精製することをさらに含む請求項１８記載の 方法。
20. ２０．シグナル配列に結合した該化合物を、該化合物が培養培地内へ分泌される 条件下においてコード化するベクターを保有する宿主細胞を増殖させることを含 む、請求項１から８いずれかに記載の化合物の調製法。
21. ２１．宿主細胞をその培養培地から分離させ、該化合物を宿主細胞から除去し、 該化合物を物理的分離性によって精製することをさらに含む請求項２０記載の方 法。
22. ２２．該化合物をコード化するベクターを調製し、該ベクターを宿主細胞内へ導 入し、該宿主細胞を培養培地へ移すことによって該化合物を発現するファージを 生産させる工程を含む、請求項１から８いずれかに記載の化合物を発現するファ ージの調製法。
23. ２３．下記の工程（ｉ）〜（ｉｖ）をさらに含む請求項２２記載の方法：（ｉ） ファージを、該ファージ上で発現された因子Ｘａ阻害因子に因子Ｘａが結合する 条件下で因子Ｘａと結合させ、 （ｉｉ）因子Ｘａが結合したファージが、因子Ｘａに対する抗体が付着した固相 上で該抗体と結合する条件下において、該ファージを該固相と接触させ、（ｉｉ ｉ）該固相に結合しないファージを該固相の洗浄によって除去し、（ｉｖ）該固 相に結合したファージを分離する。
24. ２４．請求項２２または２３記載の方法によって調製されるファージ。
25. ２５．薬学的に許容されるキャリヤーおよび薬学的に有効な量の請求項１から８ いずれかに記載の化合物を含有する薬剤組成物。
26. ２６．高レベルの因子Ｘａ活性によって特徴づけられる哺乳類の疾患の予防およ び／または治療のために使用する請求項２５記載の薬剤組成物。
27. ２７．高レベルの因子Ｘａ活性によって特徴づけられる症状の哺乳類に、請求項 １から８いずれかに記載の化合物を薬学的に許容される量で投与することを含む 該哺乳類の予防法または治療法。
28. ２８．該症状が、異常な血栓形成によって特徴づけられる請求項２７記載の方法 。
29. ２９．高レベルの因子Ｘａ活性によって特徴づけられる症状の哺乳類に、請求項 ２５記載の薬剤組成物を投与することを含む該哺乳類の予防法または治療法。
30. ３０．該症状が、異常な血栓形成によって特徴づけられる請求項２９記載の方法 。