JPH08510903A

JPH08510903A - 蛭ヒルド・メディシナリスの組換えｘａ因子インヒビターの作製

Info

Publication number: JPH08510903A
Application number: JP6523353A
Authority: JP
Inventors: ワーバー、モシェ・エム; ジーロン、エリシャ・ピー; レバノン、アビグドア; ガイ、レイチェル; ゴールドラスト、アリー; リグビ、メイアー; パネット、アモス; フィシャー、メイアー
Original assignee: バイオ − テクノロジー・ジェネラル・コーポレーション; イッサム・リサーチ・デベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブリュー・ユニバーシティー・オブ・エルサレム
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1994-04-08
Publication date: 1996-11-19
Also published as: WO1994023709A1; EP0693925B1; US5801017A; AU6630294A; EP0693925A1; DE69429858D1; ATE213155T1; EP0693925A4; IL109258A0

Abstract

(57)【要約】この発明は、ｔｒｙ²⁶−ｇｌｙ¹¹⁰が図10に示される配列と同一であるアミノ酸配列Ｘ−ｔｒｙ²⁶−ｇｌｙ¹¹⁰を包含する組換えポリペプチドであって、Ｘがメチオニンであるか、もしくは存在せず、およびａｓｎ⁷²がｐｒｏによって置換されていてもよい組換えポリペプチドを提供する。この発明はさらに、このポリペプチドの作製方法であって、このポリペプチドをコードする発現プラスミドでホスト細胞を形質転換し、この形質転換されたホスト細胞を、このホスト細胞がプラスミドによってコードされるポリペプチドを産生するように培養することを包含する作製方法、および産生されたポリペプチドを回収する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】蛭ヒルド・メディシナリスの組換えＸＡ因子インヒビターの作製発明の背景止血は、哺乳類血管系を含む閉じた高圧の循環系を通しての適切な血流を確保することを目的とした、複雑な一連のプロセスの相互作用である。止血の一つの側面は、損傷後の血管の一体性維持に関与する凝血カスケードである。この凝血カスケードは、血管損傷部位でのフィブリン塊の形成に至る複雑な一連のプロセスである。凝血塊の異常形成は、血栓および塞栓のような病理学的症状の原因である。凝血カスケードは、内因性経路（全てのタンパク成分が血液中に存在している）または外因性経路（組織因子、細胞膜タンパクが重要な役割を果たす）の何れかを介して開始され得る。凝血塊の形成に至る凝血カスケードの最後の二つのステップは、両方の経路に共通している。これら二つのステップのうちの最初のステップは、血小板膜表面上のプロトロンビン（トロンビンの酵素前駆体）、Ｘａ因子（ＦＸａ）およびＶａ因子で構成される「プロトロンビナーゼ複合体」の形成である。ＦＸａは、プロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する酵素である。続いて、トロンビンはフィブリノーゲンのフィブリン（凝血塊の主成分である不溶性ポリマー）への変換を触媒する。例えば深静脈血栓症（ＤＶＴ；venous thrombosis）のような血栓症、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、並びに心臓血管系および脳血管系疾患のような広範の臨床症状において、抗凝血剤を用いた治療が指示されている。他の適用症には、術後トラウマに伴う病態生理学的症状、肥満、妊娠、経口避妊薬の副作用、特に老齢者における持続性運動抑制［prolonged immobilization］、並びに血液凝固を含む他の公知の臨床症状が含まれる。種々の参照文献が、括弧内のアラビア数字によって参照される。これらの参照文献は請求の範囲の前の明細書末尾に数字の順序で列記されており、その内容は、本件出願に関連する技術の状態を更に説明するための参考として、本願明細書に組み込まれる。抗凝血剤の使用は、ＤＶＴおよびＤＩＣにおいて生じるような静脈血栓症（14 ）、および血栓溶解後の再閉塞の際に生じるような動脈血栓症（15）の治療に有益であり得る。急性冠動脈血栓症における抗凝血剤の使用は、血小板に富む動脈性血栓においても、凝血カスケードが血栓発生の主要な原因であるという確立された事実（16）に基づいている。過剰な凝血塊形成の病的症状において、凝血は、ヘパリン（その作用は血漿性インヒビターの抗トロンビンIII、すなわちヒルジンに媒介される）によりトロンビンの触媒活性をブロックすること、或いは凝血カスケードの初期ステップを阻害することによって阻害され得る。例えば、ヘパリノイド類（ヘパリンの低分子量誘導体）は、トロンビンに先立つ工程の選択的インヒビターであること、即ち、これらはＦＸａへの抗トロンビンIIIの結合を優先的に高めて、ＦＸａに触媒されたプロトロンビンのトロンビンへの変換を阻害することが知られている。Ｘ因子の血中濃度はプロトロンビンの血中濃度よりも略１０倍低いので、凝血を阻害するために必要とされるＦＸａインヒビターの量は、トロンビンインヒビターよりも著しく少量である。しかしながら、ＦＸａは通常はプロトロンビナーゼ複合体中に存在し、その活性は該複合体中で阻害されなければならないであろう。これら抗トロンビンのヘパリン誘導体との複合体による阻害は、血漿中の遊離のＦＸａに対してのみ有効であり、ＦＸａがプロトロンビナーゼ複合体中に組み込まれているとき（これは血栓形成の際のＦＸａの存在部位である）には有効でないように思える。これは、プロトロンビナーゼ複合体中のＦＸａがヘパリン／抗トロンビンIII複合体による阻害に影響され得ないとの開示（６）と類似している。現在のところ、ヘパリンは最も広範に使用されている抗凝血剤および抗血栓性薬剤であるが、これには二つの欠点がある、第一は、これがトロンビン阻害のレベルで作用するので、比較的大量のインヒビターの投与を必要とすることである。また、第二には、正常な止血に必要なトロンビンの全身的な阻害による過剰出血を生じ易いことである（７）。ヒルジンおよびその低分子量類縁体（ヒルローグ）の使用には、おそらく同様の欠点が伴う。これらの欠点によって、治療的使用に適した新たな抗凝血剤および抗血栓性物質についての研究が促進された。ＦＸａの選択的インヒビターの抗凝血剤としての使用は、ヘパリン、ヒルジンおよびその類縁体のような、現在使用されている抗血栓性薬剤により生じる出血の問題を軽減するかもしれない。この予想される利点は、ＦＸａインヒビターは既に存在するトロンビンには影響せず、従って正常な止血を完全には中和しないため、凝血の調節因子として作用するとの事実に起因するものである。これは、現存するトロンビンはフィブリン塊中に活性形でトラップされ、血栓溶解の際に放出されるからである（17）。メキシコ蛭のヘメンテリア・オフィシナリス［Haementeria officinalis］（アンチスタシン［antistasin］−参照文献１および２）およびジャイアントアマゾン蛭［giant Amazonian leech］のヘメンテリア・ジリアーニ［Haementeria g hiliani］（３，４）から、二つの密接に関連したＸａインヒビターが単離された。ダニのオルニトドラス・ムバタ［Ornithodorous moubata］から単離された、ダニ抗凝血剤ペプチドと称する第三のＦＸａインヒビター（５，９）がクローン化され、発現され、精製され、特性が調べられた（10）。黒蠅のシムリウム・ビッタツム［Simulium vittatum］から単離された、第四の強力なＦＸａインヒビターもまた特徴が調べられている（11）。イン・ビトロでの研究およびイン・ビボでの研究の両者によって、これら二つのインヒビター（アンチスタシンおよびＴＡＰ）を用いたＦＸａ媒介性の凝血阻害は、静脈血栓症の予防においてヘパリンと同様に有効であることが示されている（12）。リグビ［Rigbi］等（13）は、ヨーロッパ蛭のヒルド・メディシナリス［Hirud o medicinalis］の唾液から単離されたＸａ因子インヒビターを開示している。しかしながら、リグビ等はこのＦＸａインヒビターのアミノ酸およびＤＮＡ配列は開示していない。さらに、リグビ等は、生物学的に活性なポリペプチドを得るために、バクテリア中で、ヨーロッパ蛭ヒルド・メディシナリスの唾液から単離されたＦＸａインヒビターをクローニングし、発現させることは教示も示唆もしていない。この出願は、ヒルド・メディシナリス由来のＦＸａインヒビター（ここでは“ ＦＸａＩ”）をコードするＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を開示する。この発明はまた、バクテリア中で組換えＦＸａＩをクローニングし、かつ発現させ、生物学的に活性な組換えポリペプチドを得ることを開示する。発明の概要この発明は、ｔｙｒ²⁶−ｇｌｙ¹¹⁰が図10に示される配列と同一であるアミノ酸配列Ｘ−ｔｙｒ²⁶−ｇｌｙ¹¹⁰を有する組換えポリペプチドであって、Ｘがメチオニンであるか、もしくは存在せず、およびａｓｎ⁷²がｐｒｏによって置換されていてもよい組換えポリペプチドを提供する。この発明は、さらに、前記ポリペプチドをコードする発現プラスミドで細胞を形質転換し、この形質転換された細胞を、細胞がプラスミドによってコードされるポリペプチドを産生するように培養することを包含する前記組換えポリペプチドの作製方法、およびそのように作製されたポリペプチドの回収方法を提供する。さらなる側面において、この発明は、前記ポリペプチドに対する抗体を提供する図面の簡単な説明図１：ＦＸａＩの精製および同定この図は、ＤＬＳからアミノ酸配列決定のためのＦＸａインヒビター（ここでは“ＦＸａＩ”）の精製に用いられる２つの異なるプロトコル、並びに得られた調製品の同一性および均一性を確認するために行われる種々の実験を要約する。ランIIにおいては、Ｑ−セファロースの代わりにモノ−Ｑ［Mono-Q］を用いた。図２：ＦＸａＩイソフォームの説明この図面は、モノ−ＳカラムでのＤＬＳのクロマトグラフィーによるＦＸａＩのイソフォームの精製を示す。ＤＬＳ（100ｍｌ）を等量のカラム等張バッファー（20ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ7.0）で希釈し、室温において1ｍｌ／分の流速で5ｘ50ｍｍモノ−Ｓカラムにかけた。このカラムを、同じバッファーで形成したＮａＣｌの0-1Ｍ直線勾配（60ｍｌ）で溶出させ、さらに同じバッファーの1ＭＮａＣｌ溶液10ｍｌで洗浄した。溶出液の吸光度を280ｎｍでモニターし、1ｍｌの画分を集め、（例２に記述した通りに）ＦXａ阻害活性について検定した。このクロマトグラムは集められた画分におけるＦＸａＩ（ｐｍｏｌ／ｍｌ）の濃度を示し、明らかに２つのイソフォームの存在を示している。図３：活性アッセイにおけるＦＸａＩの用量応答効果この図は、例２に記述される色素原アッセイにおける、部分的に精製されたＦＸａＩによるＦＸａ阻害の用量応答を示す。量が増加した、モノ−Ｑで精製されたＦＸａＩを、２ｐｍｏｌのウシＦＸａと共に1ｍｌキュベット中で３分間プレインキュベートした。基質ＣＨＧの加水分解の初期速度を405ｎｍでモニターした（例２を参照）。画分47は、特定の精製実験のピーク画分であった。図４：ＡＰＴＴアッセイにおけるＦＸａＩの用量応答効果新鮮なネズミもしくはヒト血漿のＡＰＴＴ（活性化された部分的なトロンボプラスチン時間［activated partial thromboplastin time］）を、様々な量のＦＸａＩの存在もしくは不在下におけるその凝血の視覚的な評価によりモニターした。簡単に述べると、（50μｌまでの）ＦＸａＩ、血漿100μｌおよび部分的なトロンボプラスチン（アクチン−ＦＳ）を37℃で３分間インキュベートした。10 0μｌの20ｍＭＣａＣｌ₂を添加することにより凝血カスケードを活性化した。横軸のＦＸａＩ濃度は、１ｍｕ＝1ｐｍｏｌであるという仮定に基づいている。ネズミ血清−●；ヒト血清＝◆。矢印は、ＡＰＴＴが２倍となるＦＸａＩ濃度を示す。図５：マウスにおけるＦＸａＩの薬物動力学メスのマウスの血液に由来するＦＸａＩのクリアランスを、示された時点で半ビボ［ex vivo］ＡＰＴＴを評価する（図４を参照）ことにより、30分間にわたってモニターした。ＦＸａＩの量はμｇＦＸａＩで表わされ［ Macart and Gerbaut，Clin．Chem．ACta 122:93-101（1982）］、添付の図面に示されるようにイン・ビトロＡＰＴＴ時間対インヒビター濃度からなる検量線より決定される。図６：ＦＸａＩ単一離体およびアンチスタシンのアミノ酸配列の比較この図は、ｃＤＮＡであるクローンＰＣＲ４によって表わされる天然のＦＸａＩとアンチスタシンとのアミノ酸配列を比較する。これらの配列は、“Simplifi cation of Progressive Alignment Method”、Feng & Doolittle，J．Mol．Evol ．35:351-360（1987）に基づく整列プログラム、パイルアップ［Pileup］により並べた。ＰＣＲ４は、ＤＬＳ中に存在するＦＸａインヒビターをコードするＰＣＲ誘導ＤＮＡ配列の配列であり、天然のＦＸａインヒビターの配列に相当する。（４位のメチオニンは明らかにＰＣＲ反応の誤りであり、これが、どうして天然の蛋白質について得られたＮ−末端アミノ酸配列の４位のイソロイシンと異なるのかを説明している）。ＰＣＲ４は、例３に記述されるように、ＰＣＲ−誘導クローンと蛭の唾液から単離された天然ＦＸａインヒビターの最初の９個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列とをハイブリダイズさせることにより得た。11はｃＤＮＡライブラリーに由来するクローン11の配列を表わし、リーダーおよびシグナルペプチドを誘発する（例４を参照）。ＡＳはアンチスタシンの配列を表わす。“＜Ｅ”はピログルタメート［pyroglutamate］を表わす。番号付けはＰＣＲ４の配列に従う。最良の並び方を得るために、ギャップが導入された。並べられたシステイン残基は強調されている。図７：ＰＣＲによるＦＸａＩｃＤＮＡのクローニング例３に記述されるように、ポリＡ⁺ｍＲＮＡを、120匹の蛭から抽出された全ＲＮＡより単離した。このようにして得られたポリＡ⁺ｍＲＮＡのアリコート（5μ ｇ）を、合成プライマーＡおよび４種のｄＮＴＰの存在下における逆転写酵素反応において、テンプレートとして用いた。一本鎖相補ＤＮＡ（ｓｓ−ｃＤＮＡ）の合成に続いて、0.3ＭＮａＯＨを含むオーバーナイト・アルカリ処理により室温でｍＲＮＡを分解した。中和したｓｓ−ｃＤＮＡに、Ｔａｑポリメラーゼ、４種のｄＮＴＰおよび、逆転写プライマーとして、合成し、分解したＤＮＡオリゴマーＢを用いるＰＣＲ増幅を施した。ＰＣＲ増幅産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。その後、ゲル精製断片をプラスミドｐＳＰ65のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII大断片にサブクローニングした。その結合体混合物［ligation mixture］を大腸菌［E.coli］ＭＣ1061の形質転換に用いた。得られた形質転換体を、天然ＦＸａＩのＮ−末端アミノ酸14ないし19に相当する放射標識合成プローブＣ（例３に記載）を用いる、本来の位置でのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。図８：クローンｐＳＰ65−ＸａＩ−４のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列放射標識プローブＣを用いる本来の位置でのハイブリダイゼーションによって同定された陽性クローンから、プラスミドＤＮＡを調製した。クローンｐＳＰ65 −ＸａＩ−４の精製プラスミドＤＮＡの配列を、ザンガー・ジデオキシ法［Sang er dideoxy method］により決定した。得られた配列を、ＬＫＢ 2020 ＤＮＡＳＩＳソフトウェアシステムを用いて処理した。図９：ｃＤＮＡライブラリーからのＦＸａＩｃＤＮＡのクローニング例４に記述されるように、120匹の蛭から抽出した全ＲＮＡより得られたポリＡ⁺ｍＲＮＡを、ストラタジーンＺＡＰ^TM ｃＤＮＡ合成キット［Stratagene ZAP^TM cDNA synthesis kit］を用いる二本鎖相補ＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）の合成に用いた。そのようにして得られたｄｓ−ｃＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、ピーブルースクリプトＳＫ［pBluescript］と呼ばれる、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ消化ユニＺＡＰ［Uni-ZAP］ベクターにサブクローニングした。得られたｃＤＮＡライブラリーを、高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下において、プローブとしてプラスミドｐＳＰ65−ＸａＩ−４の放射標識ＤＮＡを用いて、ＦＸａＩｃＤＮＡクローンについてスクリーニングした。高ストリンジェンンーには、フィルターを、６ｘＳＳＣ（1ｘＳＳＣ：0.15ＭＮａＣｌ、0.015Ｍクエン酸ナトリウム）、0.1％ＳＤＳ、５ｘデンハルト［Denhardt］（0.1％フィコール400［Ficoll 400］、0. 1％ポリビニルピロリドン、0.1％ＢＳＡ、0.5％ＳＤＳ）および100μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中において60℃で８時間プレハイブリダイズし、次いで、60℃で48 時間放射性プローブとハイブリダイズさせることが含まれる。一つの陽性クローンのプラスミドをｐＳＫ−ＸａＩ−11と命名した。図10 ：ｃＤＮＡクローンｐＳＰ65−ＸａＩ−11のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列プラスミドｐＳＰ65−ＸａＩ−４に由来する放射標識ＤＮＡ断片を用いるハイブリダイゼーションによって同定された陽性ｃＤＮＡクローンから、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドｐＳＰ65−ＸａＩ−11の精製ＤＮＡの配列を、ザンガー・ジデオキシ法によって決定した。得られた配列をＬＫＢ 2020 ＤＮＡＳＩＳソフトウェアシステムを用いて処理した。図11 ：ＦＸａＩをコードするｃＤＮＡのサブクローニングこの図は、プラスミドｐＳＰ65由来のベクターへのＦＸａＩをコードするｃＤＮＡのサブクローニングを示す。プラスミドｐＳＫ−ＸａＩ−11をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ＦＸａＩコーディング領域を含むＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離し、ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐＳＰ65にサブクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＰ 65−ＸａＩ−11と命名した。図12 ：ヒトＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤの断片に融合しているＦＸａＩの発現のためのプラスミドｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−11“ｆ”の構築この図は、クローン11によって産生され、修飾Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列のＮ末端断片に融合している組換えＦＸａＩの発現のための、ｄｅｏＰ₁Ｐ₂の制御の下でのプラスミドの構築を示す。クローン11のｃＤＮＡを有するプラスミドＤＮＡｐＳＰ65−Ｘａｌ−11をＲｓａＩで消化した。ＦＸａＩをコードするＲｓａＩ−ＲｓａＩＤＮＡ断片を単離し、２組の合成リンカー：の存在下において、プラスミドｐＢＡＳＴ−ＲのＡａｔII−ＰｐｕＭＩ大断片に結合させた。得られたプラスミドは消化されたｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−11“ｆ” であり、大腸菌に入れてＡＴＣＣ受託番号69136として寄託された。図13 ：プラスミドｐＦＳＨＩ−６この図は、ＡＴＣＣ受託番号69583としてＡＴＣＣに寄託され、をコードする発現プラスミドである、プラスミドｐＦＳＨＩ−６の構造を示す。図14 ：プラスミドｐＦＳＯＨ−11 この図は、ＡＴＣＣ受託番号69582としてＡＴＣＣに寄託され、をコードする発現プラスミドである、プラスミドｐＦＳＯＨ−11の構造を示す。図15 ：プラスミドｐＭＬＫ−ＸａＩ−Ｄ−11“ｍ” この図は、ＡＴＣＣ受託番号69591としてＡＴＣＣに寄託され、ＦＸａＩダイマーをコードする発現プラスミドである、プラスミドｐＭＬＫ−ＸａＩ−Ｄ−11 “ｍ”の構造を示す。発明の詳細な説明略語以下の略語をアミノ酸の呼称として用いる。ＡＡｌａアラニンＣＣｙｓシステインＤＡｓｐアスパラギン酸ＥＧｌｕグルタミン酸ＦＰｈｅフェニルアラニンＧＧｌｙグリシンＨＨｉｓヒスチジンＩＩｌｅイソロイシンＫＬｙｓリシンＬＬｅｕロイシンＭＭｅｔメチオニンＮＡｓｎアスパラギンＰＰｒｏプロリンＱＧｌｎグルタミンＲＡｒｇアルギニンＳＳｅｒセリンＴＴｈｒトレオニンＶＶａｌバリンＷＴｒｐトリプトファンＹＴｙｒチロシンこの発明は、アミノ酸配列Ｘ−ｔｒｙ²⁶−ｇｌｙ¹¹⁰を有する組換えポリペプチド（蛋白質）であって、ｔｒｙ²⁶−ｇｌｙ¹¹⁰が図10に示される配列と同一であり、Ｘはメチオニンであるか、あるいは存在せず、かつａｓｎ⁷²がｐｒｏによって置換されていてもよい組換えポリペプチドを提供する。この組換えポリペプチドは、Ｘａ因子に対する阻害活性を示す。この主題発明の組換えポリペプチドは、上述のポリペプチドの類縁体であるポリペプチドを包含することが期待される。ここで用いられる場合には、ポリペプチドの類縁体は、そのポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列、および生物学的活性を有する。したがって、類縁体は、得られるポリペプチドがこの発明のポリペプチドの生物学的活性を保持するという条件の下で、１以上の非必須アミノ酸残基の付加、除去、または置換によってこの発明のポリペプチドと相違することがある。当該分野における熟練者は、例えば、この主題のポリペプチドのポリペプチド類縁体のバクテリア発現をコードするＤＮＡ配列を設計し、かつ作製する通常の方法、部位特異的突然変異技術によるｃＤＮＡおよびゲノム配列の修飾、組換え蛋白質および発現ベクターの構築、ポリペプチドのバクテリア発現、および通常の生化学アッセイを用いるポリペプチドの生化学的活性の決定を含む、確立された周知の手順を用いて、どのアミノ酸残基を付加し、除去し、もしくは置換することができるかを（どのアミノ酸でそのような置換ができるのかを含めて）容易に決定することが可能である。この主題発明の組換えポリペプチドの類縁体の例は、主題のポリペプチドで特定される全ての残基よりも残基が少ない欠失類縁体、特定される残基の１以上が他の残基によって置き換えられている置換類縁体、およびこの発明のポリペプチドに１以上のアミノ酸残基が加えられている付加類縁体である。これらの類縁体の全ては、この発明によって提供される組換えポリペプチドの生物学的活性を共有している。ここでは、実質的に同じアミノ酸配列を、この発明のポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端での４個未満のアミノ酸の追加または欠失を含むものと定義する。さらに、配列中に、この発明の蛋白質の生物学的活性を排除しない置換および／または欠失があってもよい。このような置換は、当業者には周知である。置換は、例えば、Lehninger，Biochemistry，2nd ed．Worth Pub.，N.Y．（1975）；Cr eighton，Protein Structure，a Practical Approach，IRL Press at Oxford Un iv．Press，Oxford，England（1989）；およびDayhoff，Atlas of Protein Sequ ence and Structure 1972，National Biomedical Research Foundation，Maryla nd（1972）に記述されている類縁体または同等群に従って、10残基まで含むことができる。さらなる面において、この主題発明は、生物学的に活性な組換えＦＸａＩを提供する。ここで用いられる場合には、生物学的に活性なＦＸａＩは、例２に記述される生化学的活性アッセイによって測定されるようなＦＸａの酵素活性に対する阻害活性を有するＦＸａＩであると定義される。阻害活性は、上記生化学的活性アッセイによって測定されるＸａ因子の酵素活性を低下させる活性であると定義される。ここで用いられる場合には、酵素活性は、上記生化学的活性アッセイによって測定されるＦＸａの蛋白質分解活性を指す。この出願は、ヒルド・メディシナリス由来のＦＸａインヒビター（ここでは“ ＦＸａＩ”）の精製、部分的な配列決定、および特徴付けを開示する。他の面において、この出願は、ヒルド・メディシナリス由来のＦＸａＩの推定アミノ酸配列の他に完全な遺伝子配列を開示する。好ましい態様において、この発明は、1992年12月1日にＡＴＣＣ受託番号69138 寄託された、ｐＳＰ65−ＸａＩ−11と命名されたＦＸａＩをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを包含する。プラスミドｐＳＰ65−ＸａＩ−11は、適切な調節要素を欠いているために、いかなる蛋白質も発現しない；しかしながら、組換えＦＸａＩの発現を獲得するために、プラスミドｐＳＰ65−ＸａＩ−11のＤＮＡをどのように操作すればよいかは、当業者には周知である。より好ましい態様において、この発明は、組換えＦＸａＩの発現のための発現プラスミドを提供する。このような発現プラスミドの構築は、以下の段落および実施例に記載されている。ポリペプチド類をコードする核酸の発現に用いることができるベクターの例は、バクテリアのウイルスのようなウイルス類、例えば（ラムダファージのような）バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、および他のベクターである。関連ポリペプチド類をコードする遺伝子は、当該分野において公知の方法によって適当なベクターに挿入される。例えば、通常の制限エンドヌクレアーゼ酵素部位を用いてインサートおよびベクターＤＮＡの両者を開裂させ、互いに対をなす相補的末端を作製し、その後、ＤＮＡリガーゼで一体に結合させることができる。あるいは、ベクターＤＮＡの制限部位に相補的な塩基配列を有する合成リンカーをインサートＤＮＡに結合させ、次いで、その部位を切断する制限酵素で消化することもできる。他の手段もまた、利用可能である。この発明のポリペプチドをコードする配列を有するベクターは、原核および真核ホスト細胞、例えば、バクテリア、真菌、酵母、昆虫、植物、または、ＣＨＯ、ニワトリ胚、線維芽細胞、腎臓および他の細胞系のような哺乳動物細胞、の範囲における発現に適合している。これらのベクターは、さらに、ホスト細胞におけるクローン化遺伝子の発現に必要な調節要素を、ポリペプチドをコードする核酸に対してポリペプチドの発現を遂行する位置に含む。発現に必要な調節要素には、プロモーターおよびオペレーター、並びにリボソーム結合部位が含まれる。例えば、バクテリア発現ベクターは、λＰ_LＯ_Lまたはｄｅｏプロモーターのようなプロモーター−オペレーター配列を有することがある。翻訳を開始するために、λＣ_TTまたはｄｅｏリボソーム結合部位が用いられることがある。このようなベクターは、市販品を購入し、あるいは記述された配列から当該分野において周知の方法、例えばλＰ_Lプロモーターに関する方法を開示する、1989年5月16日に発行された米国特許4,831,120号および1992年9月1日に発行された米国特許5,143 ,836号、並びにｄｅｏプロモーターに関する方法を開示する、1989年2月22日に公開された欧州特許出願公開303,972号、で組み立てることで得ることができる。リプレッサーおよびエンハンサーのようなさらなる適切な要素が存在してもよい。当該分野における熟練者には、種々の発現システムに適切な調節要素をいかにして用いるかは周知である。この発明の発現プラスミドは、プラスミド内で、適切なホスト細胞において当該ポリペプチドを発現させるように当該ポリペプチドをコードするＤＮＡに対して位置する適切な調節要素、例えば、プロモーターおよびオペレーター（例えば、ｄｅｏＰ₁Ｐ₂およびλＰ_L）、リボソーム結合部位（例えばｄｅｏおよびＣ_TT ）、リプレッサーおよびエンハンサーを含む。調節要素は、プラスミド内で、当該蛋白質をコードするＤＮＡに対して、適切なホスト細胞中における当該蛋白質の発現が達成されるように配置される。この発明の好ましい態様においては、調節要素は当該蛋白質をコードするＤＮＡの近傍かつ上流に位置する。他の適切な調節要素は、当該分野の熟練者には周知である。一つの態様においては、発現プラスミドは、1992年12月1日にＡＴＣＣ受託番号69136として寄託されたプラスミドｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−11“ｆ”である。他の態様においては、発現プラスミドは、1994年3月11日にＡＴＣＣ受託番号695 83として寄託されたプラスミドｐＦＳＨＩ−６である。さらに別の態様においては、発現プラスミドは、1994年3月11日にＡＴＣＣ受託番号69582として寄託されたプラスミドｐＦＳＯＨ−11である。さらにまた別の態様においては、発現プラスミドは、19 94年3月22日にＡＴＣＣ受託番号69591として寄託されたプラスミドｐＭＬＫ−ＸａＩ−Ｄ−11“ｍ”である。当該分野における熟練者は、この出願に関連して寄託されているプラスミドを、公知の技術（例えば、部位特異的突然変異もしくはリンカーの挿入）によって、関連ペプチドの発現をコードするように容易に変更できることを理解するであろう。そのような技術は、例えば、Sambrook，J.，Fritsch，E.F．およびManiat is，T．（1989）Molecular Clonning：A Laboratory Manual，2nd edition，Col d Spring Harbor Laboratory Pressに記述されている。この発明の発現プラスミドは、適切なホスト細胞、好ましくはバクテリアホスト細胞に導入することができる。しかしながら、当該分野における熟練者は、この発明の発現プラスミドを上記範囲の原核および真核ホスト細胞に導入するために適切に修飾できることを理解するであろう。好ましいバクテリアホスト細胞は大腸菌［Escherichia coli］細胞である。適切な大腸菌の例は、ｄｅｏプロモーターの制御の下にあるプラスミドのための73 3株およびλＰ_Lプロモーターの制御の下にあるプラスミドのための4300もしくは 4300（Ｆ）株であるが、他の適切な大腸菌株および他のバクテリアもプラスミドのホストとして用いることができる。真核細胞の例は昆虫細胞である。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現系を有するＳｆ−９細胞である。ホストとして用いられるバクテリアは、（Ａ1645のような）栄養要求株、（Ａ4255のような）原栄養株、および溶菌株；Ｆ⁺およびＦ^-株；Ａ1645およびＡ4255のようなλプロファージのｃＩ⁸⁵⁷リプレッサー配列を有する株；並びにｄｅｏリプレッサーおよび／またはｄｅｏ遺伝子を欠く株（1989年2月22日に公開された欧州特許出願公開0303972を参照）を含むいかなる株であってもよい。大腸菌Ａ4255株はＡＴＣＣ受託番号53468として寄託され、大腸菌Ｓφ930株はＡＴＣＣ受託番号6770 6として寄託されている。好ましい態様においては、λＰ_Lの制御の下にある発現プラスミドのホストとして大腸菌4300が用いられ、ｄｅｏプロモーターの制御の下にある発現プラスミドのホストとして大腸菌733が用いられる。この発明は、これらの発現プラスミドを有するバクテリア細胞を提供する。一つの態様においては、バクテリア細胞は大腸菌細胞である。好ましい態様において、この発明は、ＡＴＣＣ受託番号69136としてＡＴＣＣに寄託されているプラスミドｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−11“ｆ”を有する大腸菌733株を提供する。別の好ましい態様において、この発明は、ＡＴＣＣ受託番号69582としてＡＴＣＣに寄託されているプラスミドｐＦＳＯＨ−11を有する大腸菌4300株を提供する。さらに別の好ましい態様において、この発明は、ＡＴＣＣ受託番号69583としてＡＴＣＣに寄託されているプラスミドｐＦＳＨＩ−６を有する大腸菌4300株を提供する。上述の大腸菌ホスト株の全ては、当該分野において公知の方法、例えば、R．P ．NovickによってBacteriol．Reviews， 33:210n（1969）に記載されたエチジウムブロマイド法によって、それらが有するプラスミドを“除去［cure］”することができる。別の面において、この出願は、天然ＦＸａＩの新規かつ従来知られていないイソフォーム（ここではイソフォームＢと称する）の存在を開示する。ＦＸａＩのイソフォームＢは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびカラムクロマトグラフィーでいくらか異なる挙動を示すように思われるが、イソフォームＡ（従来開示されているＦＸａＩのイソフォーム）と同じＮ末端アミノ酸配列を有している。この出願の蛋白質は、“成熟”蛋白質、すなわち延長［extension］および融合ペプチドのない蛋白質として、延長ペプチド（例えば、リーダーペプチド）を含むプレペプチド、または他の蛋白質もしくはポリペプチドの全てもしくは一部を含む融合ペプチドとして得ることができる。。一つの態様において、ＦＸａＩおよび修飾されたＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ配列の63 Ｎ末端アミノ酸を含む融合蛋白質が作製される。Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤは、共に譲渡された［coassigned］米国特許4,742,004号に記載され、かつSteinman，H．M. ，Superoxide Dismutase，（Oberley，ed.）CRC Press，Florida，page 11-68，（1982）によって記述されている。組換えＦＸａＩの他の前駆体も、他の蛋白質と融合させることにより得ることができる（例えば、Nilsson et al.，Current Opinion in Structural Biology 2:569-575（1992）およびHopp et al.，Biotechnology 6:1204-1210（1988））。成熟蛋白質は、直接発現によって、または融合蛋白質もしくはペプチドの開裂によって得ることができる。成熟組換えＦＸａＩを得るさらなる方法は、当該分野における熟練者には周知である。加えて、この発明は、上記組換え蛋白質をコードする発現プラスミドを提供する。好ましい態様において、この発明は、1992年12月1日にＡＴＣＣ受託番号691 36として寄託された、ｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−11“ｆ”と称する発現プラスミドを提供する。別の態様においては、発現プラスミドは、1994年3月11日にＡＴＣＣ受託番号69583として寄託されたプラスミドｐＦＳＨＩ−6である。さらに別の態様においては、発現プラスミドは、1994年3月1日にＡＴＣＣ受託番号69582として寄託されたプラスミドｐＦＳＯＨ−11である。さらに別の態様においては、発現プラスミドは、1994年3月22日にＡＴＣＣ受託番号69591として寄託されたプラスミドｐＭＬＫ−ＸａＩ−Ｄ−11“ｍ”である。さらに好ましい態様において、この発明は、ホスト細胞およびＦＸａＩをコードするＤＮＡを有する発現プラスミドを含むホスト−プラスミド系を提供する。好ましい態様においては、ホスト細胞は大腸菌細胞であり、プラスミドはｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−11“ｆ”である。より好ましい態様においては、ホスト細胞は大腸菌733である。他の好ましい態様においては、ホスト細胞は大腸菌細胞であり、プラスミドはｐＦＳＨＩ−6、もしくはプラスミドｐＦＳＯＨ−11、もしくはプラスミドｐＭＬＫ−ＸａＩ−Ｄ−11“ｍ”である。より好ましい態様においては、ホスト細胞は大腸菌4300である。当該分野における熟練者には、いかにして、異なるプラスミドおよび／または遺伝子暗号の変質によって同じアミノ酸配列をコードする異なるヌクレオチド配列から、ここに開示されるポリペプチドを作製するかは周知である。当該分野における熟練者はまた、ポリペプチドの構造もしくは特定の生物学的活性に影響を及ぼすことのない小さな変化をアミノ酸配列中に有する、実質的に同等の類縁体を作製することもできる。そのような類縁体もまた、この発明に包含される。他の面において、この出願は、バクテリア中でのヒルド・メディシナリス由来のＦＸａＩの作製、および天然のＦＸａＩと同等かもしくは類似した、ＦＸａの酵素活性に対する阻害活性を有する活性蛋白質を得るためのそれらの再折り畳み［refolding］を開示する。ここで用いられる場合には、ＦＸａＩは、蛭ヒルド・メディシナリスの希釈した蛭の唾液（ＤＬＳ）から単離された蛋白質およびこれに対応する、ＦＸａを阻害する活性を有する組換え蛋白質を指す。この発明は、当該ポリペプチドをコードする発現プラスミドでホスト細胞を形質転換し、この形質転換されたホスト細胞を、この細胞がプラスミドによってコードされたポリペプチドを産生するように培養することを包含する当該ポリペプチドの作製方法、およびそのように作製されたポリペプチドの回収方法を提供する。好ましい態様において、この発明は、ホスト細胞がバクテリア細胞である精製された生物学的に活性な組換えＦＸａＩポリペプチドの作製および回収方法であって、（ａ）細胞を破壊してポリペプチドを含む溶解物を作製し、（ｂ）この溶解物を処理してポリペプチドを含む包含体を得、（ｃ）この包含体を処理して可溶性形態のポリペプチドを得、（ｄ）得られた可溶性ポリペプチドを処理して生物学的に活性なポリペプチドを形成し、（ｅ）そのように形成された生物学的に活性なポリペプチドを回収し、および（ｆ）そのように回収された生物学的に活性なポリペプチドを精製する、ことを包含する作製および回収方法を提供する。好ましい態様においては、工程（ｃ）の処理には変性剤の添加が含まれ、工程（ｄ）の処理にはポリペプチドをチオール含有化合物およびジスルフィドの混合物と接触させることが含まれ、かつ工程（ｆ）の精製にはカラムクロマトグラフィーが含まれる。より好ましい態様においては、変性剤はグアニジウムクロライドもしくは尿素であり、チオール含有化合物はグルタチオン、チオレドキシン、β−メルカプトエタノール、もしくはシステインであり、ジスルフィドは酸化グルタチオン、システイン、もしくはメルカプトエタノールの空気酸化生成物であり、カラムクロマトグラフィーにはＱ−セファロースクロマトグラフィーおよびヘパリン−セファロースクロマトグラフィーのいずれか一方もしくは両者が含まれる。一つの態様においては、工程（ａ）のポリペプチドはダイマーである。別の態様においては、工程（ｃ）に続いて、ポリペプチドを酵素的に開裂させて組換えＦＸａＩを生成させる。さらに別の態様においては、工程（ｄ）に続いて、ポリペプチドを酵素的に開裂させて組換えＦＸａＩを生成させる。好ましい態様においては、酵素的開裂はＣＮＢｒ開裂を包含する。この発明は、組換えＦＸａＩの作製方法であって、（ａ）延長ペプチドに結合したＦＸａＩをコードするＤＮＡを含むプラスミドを有するホスト細胞を処理し、ＤＮＡを発現させてＦＸａＩプレペプチドを得、（ｂ）そのように発現したＦＸａＩプレペプチドを細胞から回収し、（ｃ）ＦＸａＩプレペプチドを酵素的に開裂させて組換えＦＸａＩを生成させ、（ｄ）組換えＦＸａＩを精製する、ことを包含する作製方法をさらに提供する。好ましい態様においては、工程（ｂ）は、（ｉ）ホスト細胞を破壊して細胞残査および蛋白質上清溶液を含有する懸濁液を形成し、（ii）可溶性蛋白質上清溶液から前記細胞残査を分離し、（iii）カラムクロマトグラフィーによって上清からＦＸａＩプレペプチドを精製する、ことをさらに包含する。さらに別の態様においては、工程（ｃ）は、エンテロキナーゼもしくはヒドロキシアミンでＦＸａＩプレペプチドを開裂させることをさらに包含する。別の態様において、工程（iii）は、ＤＥＡＥ−セファロースもしくはＱ−セファロースクロマトグラフィーをさらに包含する。さらに別の態様においては、クロマトグラフィーに続いて、金属アフィニティークロマトグラフィーおよび透析が行なわれる。この発明は、さらに、その生物学的活性から生じる所望の治療効果を得るに有効なこの発明のポリペプチド、および適切な担体を含有する組成物を提供する。好ましい態様においては、好ましい治療効果は血液凝固の程度の低減である。血液凝固の程度は、ＡＴＰＰのようなイン・ビトロ凝血アッセイによって表わすことができる。この発明はまた、血液を、血液凝固の程度を低減させるに有効な量のポリペプチドと接触させることを包含する血液凝固の程度を低減させる方法をも提供する。好ましい態様においては、接触は被検体においてイン・ビボで行なわれる。より好ましい態様においては、被検体は過剰血液凝固を患っている。特定の態様において、過剰血液凝固を患う被検体は、血管障害、術後トラウマ、肥満に関連する静脈血栓塞栓症の傾向、妊娠、経口避妊薬の使用、および持続性運動抑制からなる群より選択される状態を有している。したがって、この発明は、発作もしくは他の脳血管障害のような脳血管疾患における血液凝固の程度を低減させる方法を提供する。この発明は、血栓症、より詳しくは静脈血栓症、さらに詳しくは深静脈血栓症において生じるような過剰血液凝固の状態、または播種性血管内凝固症における血液凝固の程度を低減する方法を提供する。この発明は、さらに、動脈血栓症、例えば冠状動脈の血栓症、において生じるような過剰血液凝固の状態における血液凝固の程度を低減させる方法を提供する。上述のように、血栓は血栓溶解の後にしばしば再発する。したがって、この発明は、血栓溶解の後の血液凝固の程度を低減させる方法を提供する。好ましい態様においては、血栓溶解は線維素溶解剤によって行なわれる。特定の態様においては、線維素溶解剤は組織プラスミノーゲン活性化剤もしくはストレプトキナーゼである。ポリペプチドは、線維素溶解剤の投与前、投与中、もしくは投与後に投与され、あるいは線維素溶解剤に結合させて投与される。この発明はまた、Ｘａ因子を、Ｘａ因子の活性を阻害するに有効な量のポリペプチドと接触させることを包含する、Ｘａ因子の活性を阻害する方法をも提供する。さらなる態様において、この発明のポリペプチドは、インフルエンザ感染の再発の防止に用いることができる。、インフルエンザ感染は、ウイルスによる細胞の感染および再感染を含む動的なプロセスである。Ａ型インフルエンザ感染に関連する活性化酵素は、ニワトリ血液凝固Ｘａ因子に非常に類似することが示されている（Gotoh B．et al．（1990），EMBO J．9:4185-4190およびOgasawara T． et al．（1992），EMBO J．11:467-472）。したがって、対応するヒトＦＸａがヒトに生じるインフルエンザ感染に関ることもあり得る。ＦＸａのインヒビターがインフルエンザ感染の再発の防止に有用でありうることが予想される。特定の態様において、ＦＸａインヒビターはこの発明のポリペプチドである。このポリペプチドが、さらなる治療薬と一緒に投与し得ることも期待される。特定の態様において、さらなる治療薬は酸素非含有ラジカルスカベンジャーを含む。好ましい態様においては、酸素非含有ラジカルスカベンジャーはスーパーオキサイドジスムターゼである。より好ましい態様においては、スーパージスムターゼはＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ（共に譲渡されている米国特許4,742,00 4号）もしくはＭｎＳＯＤ（1992年2月27日出願の、共に譲渡されている米国出願 842,740号、および共に譲渡されている英国特許ＧＢ 2,183,658、1990年4月25日）である。このような治療は、現在利用可能な、インフルエンザ感染を扱う治療および予防法に対して膨大な利点を有するであろう。現在利用されているインフルエンザ予防の方法は、インフルエンザウイルスに対する免疫に基づいている。この方法は、ウイルス株の多さの他に、インフルエンザウイルスの突然変異の頻度の高さのために、不確実であることが立証されている。このため、感染機構の阻害物を用いることが、ウイルス体の免疫学的特性に基づいておらず、したがって特定のウイルス株に限定されないことにより、現在利用可能なワクチンと比較して一般に有利である。さらに、インフルエンザは気管支肺疾患であるので、治療はエアロゾルとして投与されることが好ましく、それにより簡便な投与方法が提供される。さらなる面において、この発明は、当該ポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体が提供される。特定の態様において、抗体はモノクローナル抗体である。この発明はまた、この抗体の特異的な反応を競合的に阻害するポリペプチドを包含する。この出願に関連して寄託されたプラスミドおよび株特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の要求に準じ、かつこれを満足するように、この発明の方法の実施に有用な様々なプラスミドおよび大腸菌株が、1992年12月1日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、12301パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド20852に寄託された。 1992年12月1日に寄託されたプラスミドおよび株には、大腸菌ＭＣ1061中に導入されてＡＴＣＣ受託番号69138として寄託された、クローン11のＦＸａＩをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドｐＳＰ65−ＸａＩ−11；大腸菌733中に導入されてＡＴＣＣ受託番号69136として寄託され、ヒトＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤの変性配列の63Ｎ末端アミノ酸に融合したＦＸａＩをｄｅｏプロモーターの制御下において発現するプラスミドｐＤｅｏ−Ｓ− ＸａＩ−11“ｆ”；およびｄｅｏプロモーターによって制御されるプラスミドのホスト細胞であり、上記の通りＡＴＣＣ受託番号69136として寄託された大腸菌7 33が含まれる。加えて、λＰ_Lプロモーターを有するベクターであるプラスミドｐＭＬＫ−100 が、ＡＴＣＣ受託番号68605として1991年2月6日に寄託された。さらに、プラスミドＦＳＨＩ−6およびｐＦＳＯＨ−11が、大腸菌4300中に導入されて、それぞれＡＴＣＣ受託番号69583および69582として1994年3月11日に寄託された。加えて、プラスミドｐＭＬＫ−ＸａＩ−Ｄ−11“ｍ”が、大腸菌4300中に導入されてＡＴＣＣ受託番号69591として1994年3月22日に寄託された。以下の段落に記述されるように、天然のポリペプチドのＮ末端配列、この発明のポリペプチドをコードするクローン、バクテリア中でのポリペプチドの発現、および天然の蛋白質の生物学的活性および特異性を有する組換え蛋白質を得るために、多くの困難が解消されなければならなかった。第１に、精製および特徴付けに十分な蛋白質をヒルド・メディシナリスから得ることが、（ａ）この生物の小さなサイズ；（ｂ）この蛭が微量の蛋白質のみを必要とすることによる、蛭中の微量の蛋白質；（ｃ）大量のヘモグロビン（これは精製プロセスの大きな障害となる）によって汚染されていない十分な量のＤＬＳを得ることの困難性；および（ｄ）単離された蛋白質で観察される、アミノ酸配列の多様性、すなわちイソフォーム、および翻訳後の変性の両者の点での重大な不均一性の程度のために、非常に困難であった。この最後の面は、一部は、それらのサイズが小さいために多くの生物から蛋白質を単離する必要性があり、それにより天然の遺伝学的多様性の因子が導入されることによるものである。例えば、Ｎ末端配列決定に要する量（すなわち、約100ｐｍｏｌ）の精製ＦＸａＩを得るためには、300匹の蛭を“搾り”、僅かに約0.14μｇ／ｍｌのＦＸａＩを含有する1-2リットルの希釈蛭唾液（ＤＬＳ）を処理する（収率は10-25％）必要があった。対照的に、メキシコ蛭のヘメンテリア・オフィシナリスの唾液腺抽出物から得られた精製Ｘａ因子インヒビター（アンチスタチン）の量は、唾液腺抽出物の12 μｇ／ｍｌ（25ｍＬ当り0.3ｍｇ）のオーダーであった（１）。これは、ヒルド・メディシナリスのＤＬＳ中に存在する蛋白質の濃度よりも100倍近く多い。同様に、メキシコ蛭の少なくとも２倍の大きさのジャイアントアマゾン蛭、ヘメンテリア・ジリアーニ（３）から単離されるＸａ因子インヒビターが、僅か14個体の唾液腺抽出物から大量に得られた。第２に、粗製蛋白質を精製して配列決定し、かつ得られた蛋白質の均一性および同一性を立証しなければならなかった。第３に、アンチスタチンに対する抗体がＨ．メディシナリスからの抽出物中の交差反応性分子を認識できない（３）としても、依然としてＦＸａＩが実際にアンチスタチンとは異なるということを明白に確立しなければならなかった。最後に、“隠された”Ｎ末端がブロックされたアンチスタチン様汚染物を含まず、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でＦＸａｌと同じ位置まで移動する精製されたＦＸａ阻害画分を確立する必要があった。実施例以下の実施例はこの発明の理解を助けるために示されているが、いかなる意味においてもその範囲を制限することを意図するものではなく、そのように解釈されるべきではない。これらの実施例は、ｃＤＮＡの単離、ベクターの構築、そのようなベクターへの目的のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、またはバクテリアホストへの得られたプラスミドの導入に用いられる通常の方法の詳細な説明は含まない。そのような方法は当該分野の熟練者には公知であり、かつSambro ok，Fritsch，and Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd E dition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA，（1989）を含む多くの刊行物に記述されている。例１：Ｈ．メディシナリスのＦＸａＩの精製ヒルド・メディシナリスの希釈ヒル唾液（ＤＬＳ）よりＦＸａＩを精製した。ＤＬＳはRigbiら（Comp．Biochem．Physiol．87B:567-573，（1987））の記述に従って得た。簡単に説明すると、37℃に保持した食欲刺激性の溶液である0.001Ｍアルギニン含有生理食塩水を、両端が開放された筒に広げられた洗浄された膜（ソーセージ皮、ニッピ・ゼラチン・ケーシング［Nippi Gelatin Casing］、東京、日本より入手）の上に置いた。飢餓状態のヒルにそのうが満たされるまでその溶液を吸い込ませた。餌液は撹袢していなかったので餌液中に排出された唾液の大部分は再び吸い込まれたと仮定される。給餌を中止し、ヒルを後ろから前へ搾ることによって唾液を含む摂取溶液を口から搾り出した。希釈ヒル唾液（ＤＬＳ）と名付けられた無色の液体を集めた。ＤＬＳから蛋白質を精製する２つの方法を以下に述べる。これらの方法は類似しており、第四アミノメチルカラム（モノ−ＱまたはＱ− セファロース）上での陰イオン交換クロマトグラフィーと、それに続いて行なうスパロース12上でのゲル濾過クロマトグラフィーまたはヘパリン−セファロースでのアフィニティクロマトグラフィーとから構成されている。どちらの場合にも、調製品の同定と均一性はトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび少なくとも１つの補足法によって確認した。これらの精製プロトコルを図１にまとめた。１．モノ−Ｑとそれに続くスパロース12による精製約２５匹のヒルから調製したＤＬＳ（150ｍl）を同容量の20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.9）で希釈し、ＦＰＬＣモノ−Ｑカラム（5×50ｍｍ）に添加した。カラムは同緩衝液中0〜0.5ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配（80ｍl）、流速1ｍl/分で溶出した。280ｎｍの吸光度をモニターした。そしてカラムを同緩衝液中0.5Ｍ〜1ＭＮａＣｌ（20ｍl）の第２の直線濃度勾配、同一流速で洗浄し、さらに5ｍlの1ＭＮａＣｌにて洗浄した。溶出液は1ｍlずつ分取し、ＦＸａＩ活性およびヒルジン活性を測定した。ＦＸａＩ活性のピークは0.35ＭＮａＣｌ付近で溶出され、ヒルジン活性のピークとは分離した。ＦＸａ阻害活性を含む画分をプールし、10×900ｍｍ（３連にした10×300ｍｍカラム）のスパロース12カラムにかけた。溶出は室温で150ｍＭＮａＣｌ含有20 ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、流速0.3ｍｌ／分で行った。280ｎｍの吸光度をモニターした。ＦＸａＩはこの条件下でみかけの分子量4ｋＤの単独ピークとして溶出した。それに対して、精製されたＦＸａＩはトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分子量約14ｋＤの単一バンドを示した。例２で述べるように、この分子量決定の差異は、ＦＸａＩとスパロース12との非特異的相互作用によりＦＸａＩのカラムからの溶出が遅れることによるのであろう。精製された蛋白は以下のとおり、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）でも分析した。スパロース12で精製したＦＸａＩを水で透析し、凍結乾燥し、1ｍlの0.1％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に再溶解し、Kontron Model 420／422SＨＰＬＣに取り付けた７μRP−300カラム（Aquapore，Brownlee Labs製）に注入した。溶出は、0.01％ＴＦＡ中0〜100％のアセトニトリル直線濃度勾配（60ｍl）、流速1ｍl／分で行なった。220ｍlの吸光度をモニターした。保持時間38．51分の単一のピークが観察され、よってＦＸａＩが均一に精製されたことが示された。２．Ｑ−セファロースとそれに続くヘパリン−セファロースによる精製約50匹のヒルから得たＤＬＳ（320ｍl）を同容量の20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.9）で希釈し、Ｑ−セファロースカラム（10×50ｍｍ）に添加した。カラムは同緩衝液中0−0.5ＭＮａＣｌ直線濃度勾配（70ｍl）、流速1ｍl／分にて溶出し、280ｎｍの吸光度をモニターした。その後、カラムを1ＭＮａＣｌ含有同緩衝液で同流速にて洗浄した。溶出液は1ｍlずつ分取し、ＦＸａＩ活性とヒルジン活性を測定した。これによりＦＸａＩ活性は実際にヒルジン活性と分離していることが確認された。ＦＸａＩは0.35ＭＮａＣｌ付近に単一のピークとして溶出し、これは前述のモノ−Ｑからの溶出と似ていた。ＦＸａＩ活性を含む画分をプールし、20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.9）で透析した。そのうち7ｍlをヘパリン−セファロースカラム（10×50ｍｍ）に添加した。溶出は同緩衝液中0〜0.5ＭＮａＣｌ直線濃度勾配（70ｍl）、流速1ｍl／分にて行い、280ｎｍの吸光度をモニターした。そしてカラムを1ＭＮａＣｌ含有同緩衝液で同流速にて洗浄した。溶出液を1ｍ lずつ分取し、ＦＸａＩ活性を測定した。精製ＦＸａＩは0.30ＭＮａＣｌ付近に単一のピークとして溶出した。このプロトコルによって、ＦＸａＩは約600 倍に精製され、全体の収量は14％であった。以下に述べるように、この調製品はトリシン／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分子量14ｋＤの単一バンドを示した。この方法で精製したＦＸａＩの均一性はさらにスパロース12を用いた変性条件下でのゲル浸透クロマトグラフィーにて確認した。例２：ＤＬＳから単離された精製下ＦＸａＩの特徴付け１．分子量１．１トリシンＳＤＳＰＡＧＥ例１で述べた方法で調製された種々のＦＸａＩの調製品を、均一性の程度とこの蛋白質の分子量を評価するために分析した。用いた工程はSchaggerらの方法（ Anal．Biochem．166:368-379，（1987））の修正法を用いた。ＦＸａＩのバンドはほぼ14ｋＤに泳動し、いくつかの場合には、約12〜14ｋＤの広いバンドとなった。12〜14ｋＤのバンドの意味については以下に述べる。１．２バイオゲルＰ−60でのゲル侵透クロマトグラフィー分子量は、ＦＸａＩの粗調製品のバイオゲルＰ−60によるゲル浸透クロマトグラフィーによっても決定された。ＦＸａＩ活性は分子量14ｋＤに相当する保持時間に溶出した。前述のように、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の変性条件下での電気泳動によって決定されたＦＸａＩの分子量もまた14ｋＤであり、ＦＸａＩは14 ｋＤの単量体であることを示している。１．３変性条件下および非変性条件下におけるＦＸａＩの挙動前述のように、この精製過程において、ＦＸａＩを変性条件下、スパロース12 でのゲル浸透クロマトグラフィーにより夾雑蛋白質から精製した。これらの条件下では、ＦＸａＩ活性は、みかけの分子量4ｋＤに相当する保持時間で単一のピークとして溶出することが見出された。しかしながら、同一の試料を6Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｕＣｌ）の存在下、変性条件でスパロース12に流したところ、ＦＸａＩ活性は、約13ｋＤに相当する保持時間に単一のピークとして溶出した。透析により変性剤を除去すると、このピークが生物学的活性を回復することが見出され、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで通常の14ｋＤの単一バンドを示した。これらの結果は、非変性条件下では、カラム上で蛋白質の多少の遅滞を招くＦＸａＩとスパロース12の間の非特異的相互作用が存在することを示唆している。２．ＦＸａＩのＮ末端配列２．１精製された天然ＦＸａＩのＮ末端配列例１で述べた２つの方法で精製されたＦＸａＩの試料をさらにトリシンＳＤＳ −ＰＡＧＥで分解し、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写した。ＦＸａＩを含む膜断片を自動配列解析（Applied Biosystems製 Microsequencer，Model 475A）に20サイクルかけた。どちらの場合にも以下の配列が得られた。 * システインはこの方法のアミノ酸配列解析では検出されず、後に、ＤＮＡ配列から推定した。２．２ピログルタミン酸アミノペプチターゼで処理した天然ＦＸａＩのＮ末端配列ＦＸａＩのＮ末端配列はまたピログルタミン酸アミノペプチターゼで処理した天然蛋白質についても決定した。以下の手順でＦＸａＩにピログルタミン酸アミノペプチターゼ処理を行なった。ＦＸａＩ（20μg）をピログルタミン酸アミノペプチターゼ（2μgを、5ｍＭＤＴＴ、10ｍＭＥＤＴＡおよび5％グリセロール含有100ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ8）100μlに溶解した）と６時間、４℃に保った。その後、更にピログルタミン酸アミノペプチターゼ（2μg）を追加し、反応を更に１５時間室温で進行させた。ピログルタミン酸アミノペプチターゼ処理後に得られたＮ端末配列は、ピログルタミン酸アミノペプチターゼ処理なしで得られた結果と同一であった。これは、アンチスタチンとは異なり、ＦＸａＩにはＮ末端がピログルタミン酸で保護されたアイソフォームはないということを示している。３．ＦＸａＩ多様性３．１Ｑ−セファロースによるＦＸａＩアイソフォームの精製数リットルのＤＬＳからのＦＸａＩ大量精製の間に、Ｑ−セファロースカラムからの溶出で、活性のピークが２つ得られた。例えば、2450ｍlのＤＬＳを二倍量の20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.9）に希釈し、60ｍlのＱ−セファロースカラム（2.5×12.2 ｃｍ）にかけた。溶出は0〜0.5ＭＮａＣｌ直線濃度勾配を有する同緩衝液（360 ｍl）、流速3ｍl／分で行ない、更に0.5Ｍ〜2ＭＮａＣｌの第２の直線濃度勾配を有する同緩衝液（360ｍl）、同流速で溶出した。第１の濃度勾配（0〜0,5ＭＮａＣｌ）によって活性は広いピークとして溶出し、カラムに流した全ＦＸａＩ活性の約30％が第２の濃度勾配（0.5〜2ＭＮａＣｌ）によってより狭い活性ピークとして溶出した。それぞれのピークの活性画分を別々にプールし、低塩濃度勾配および高塩濃度勾配での溶出に相当するピークをそれぞれアイソフォームＡ、アイソフォームＢと命名した。アイソフォームＡとアイソフォームＢに相当するピークを集めたものをそれぞれ別に10ｍlのヘパリン−セファロースカラムに添加し、上記と同様の２つのＮａＣｌ直線濃度勾配（それぞれ40ｍl）によって溶出した。アイソフォームＡはヘパリン−セファロースカラムから第１の濃度勾配、すなわち0ないし0.5ＭＮａＣｌで溶出し、一方、アイソフォームＢは第２の濃度勾配、すなわち0.5ないし1ＭＮａＣｌで溶出した。これはＱ−セファロースからの溶出プロフィールと似ている。アイソフォームＡはトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でみかけの分子量13〜14ｋＤを示したが、アイソフォームＢはみかけの分子量11〜12ｋＤを示した。これらの結果は、先に１．１項で述べたＦＸａＩの均一調製品の電気泳動の際に観察される、広い分子量12〜14ｋＤのバンドに対応する。アイソフォームＡとアイソフォームＢの分子量の相違は、6ＭＧｕＣｌ／20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.8）で平衡化した（1.3項に述べたように）スパロース12ゲル浸透カラムによるクロマトグラフィー（流速0.4ｍl／分）により確かめられた。２つのアイソフォームの位置は、変性剤を透析により除去した後、分画のＦＸａＩ活性を測定することにより検出した。加えて、アイソフォームＢを、これが分子量11〜12ｋＤ相当の位置まで移動するトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥでの検出を可能にするに十分な量、スバロース12カラムから分離した。これはヘパリン−セファロースから溶出したアイソフォームＢについて得られた結果と同様であった。３．２モノ−ＳによるＦＸａＩアイソフォームの精製ＤＬＳ（100ｍl）を同容量の20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7）で希釈し、ＦＰＬＣに取り付けたモノ−Ｓ陽イオン交換カラム（5×50ｍｍ）に流した。溶出は、室温で、同緩衝液中0〜１ＭＮａＣｌ直線濃度勾配（60ｍl）、流速1ｍl／分にて行い、更に10ｍlの1ＭＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄した、280ｎｍの吸光度をモニターした．溶出液を１ｍlずつ分取し、ＦＸａＩ活性を測定した。活性のピークが２つ検出され（図２）、これは先に示した結果に更に確証を与えた。３．３アイソフォームＢの特徴付けアイソフォームＢと命名したピークが実際にＦＸａＩのアイソフォームであることを確かめるために、前述（３．１項）の通りにＱ−セファロースおよびヘパリン−セファロースで精製したアイソフォームＢの一部を、モノ−Ｑカラムにかけた。ＦＸａＩ活性は、前にＱ−セファロースにおいて観察されたように、高塩濃度（約0.6ＭＮａＣｌ）で溶出した。精製された蛋白質をトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写して、９サイクルのＮ末端アミノ酸配列解析を行なった（例１、２．１項参照）。その結果得られた９個のアミノ酸の配列はアイソフォームＡで得られたものと同一であった。これはアイソフォームＡとアイソフォームＢが同一のアミノ酸配列を持つことを示すと考えられる。アイソフォームＢとアイソフォームＡが同じアミノ酸配列を持つと思われるので、カラムクロマトグラフィーとＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける両者の挙動の相違は、おそらくグリコシル化のような翻訳後修飾によるものであろう。４．グリコシル化と糖分析過ヨウ素酸修飾された糖に結合したアルカリホファターゼ−ヒドラジンの基質染色に基づく方法（Gershoniら，Anal．Biochem．146:59，（1985））を用いたドットプロット解析により、ＦＸａＩは糖蛋白質として染色されることが示された。ＦＸａＩの２つのアイソフォームのグリコシル化の差異を、既知の方法（Egge r and Jones，J.Chromat．33:123-131，（1985））に従って分析した。ＤＬＳから精製したＦＸａＩのアイソフォームＡおよびＢを、２Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて、密封容器中、105℃で８時間加水分解したその後、ＴＦＡは凍結乾燥により除去した。そして、加水分解物および糖標準品をダンシルヒドラジンにより誘導体とした。ＴＣＡの代わりに0.1Ｍ酢酸含有0 .1％ＴＦＡを溶媒として用いたので、セプパック［Sep−Pak］カートリッジによる部分精製の必要はなかった。誘導体化に引き続いて試料を凍結乾燥し、20％アセトニトリルに溶解して、スベルコ［Supelco］ＬＣ-8カラム（250×4.6ｍｍ，粒子径５μ）を用いてＨＰＬＣ分析（Beckman製，model ll0A，またはKontron製，model 420/422S）を行なった。流出液は、ＵＶ検出器（Jasco製model 875UVまたはKontron製HPLCdetector，model 430）を用い、254ｎｍの吸光度でモニターした結果は表１に示したが、アイソフォームＡとＢとではグリコシル化の程度と様式が異なっていた。これがイオン交換カラムでの両者の挙動の差異を説明するものであろう。５．ＦＸａＩの定量とアッセイ５．１生化学的活性のアッセイＦＸａ阻害活性のアッセイは、上記のＦＸａで媒介される色素産生基質メトキシカルボニル−Ｄ−シクロヘキシルグリシル−グリシルｐ−ニトロアニリド（ＣＨＧ）の阻害を基にしている。ＦＸａ活性は、ｐ−ニトロアニリンの放出に起因する４０５nm（ε_M＝９９２０Ｍ^-1cm^-1）の吸光度の増加として測定した。ＦＸａによるこの基質の加水分解の動力学的パラメータは、以下の通りである。触媒定数＝１３０sec^-1及びＫ_m＝１５μＭ。適切な基質濃度を３４２nmにおいて８２１０である分子吸光度から決定した。この反応混合物は、５０mMトリス−ＨＣｌｐＨ８．２、５mM ＣａＣｌ２、２００mM ＮａＣｌ、０．１％ＰＥＧ、４０μＭの基質、および約２nMのＦＸａを含有する。ＦＸａの濃度は、上記の動力学的データを基にした阻害の消失について、４０μＭでのＣＨＧ加水分解の初期速度（最初の２０秒）からより正確に決定した。吸光度の増加の阻害は、本発明のＦＸａのようなＦＸａ阻害剤によるＦＸａ阻害活性の存在下で測定されうる。阻害剤の濃度は、ＦＸａの濃度によって倍加される阻害剤の存在下での反応と非存在下での反応との吸光度の差である。この決定は、１：１酵素−阻害剤複合体の形成を仮定しており、更に解離定数が、阻害剤（ＦＸａＩ）を酵素（ＦＸａ）へ実質的に完全に結合することができる程度に十分低い（即ち密に結合している）ことを仮定している。実際に、投与量依存曲線の飽和形（図３）は、有限であり、無視できない阻害剤−酵素複合体の解離がこれらの条件下で起こっている証拠を表している。この投与量応答曲線は、阻害の程度とＦＸａＩ濃度の間で表され、これをセクション５．２で更に説明する。ＦＸａ−ＦＸａＩ複合体の解離の程度は、阻害定数（Ｋ_i）によって特徴づけられ、色素産生基質ＣＨＧの加水分解の阻害速度から決定されうる。これらの結果は、酵素−阻害剤複合体に対する競争的阻害の速度論的スキーム、特にDixon and Webb，Enzymes（3rd ed.），Academic Press，New York，（1979）に開示されたものに従って分析されうる。色素産生アッセイにおける天然に存在するＦＸａのＫ_iは約９nMである。従って、上記の方法で決定される阻害剤濃度の決定は、おそらく低く評価される。一定の程度の阻害、通常５０％を得るため、及びこれらの反応条件で５０％の阻害を起こす量が１ミリユニット（mu）または１pmolになるように定義するために必要なタンパク濃度（ＩＣ₅₀）としてＦＸａＩを定義することは有効であることがわかった。ＩＣ₅₀は一般にＫ_iより高く、阻害のタイプに依存して、基質濃度、Ｋ_i、Ｋ_m及び他のファクターに様々に依存することが示されうる（Segal ，Ｉ．（1974）”Enzyme Kinetics”Wiley Interscience）。実際に、ＩＣ₅₀の値の範囲は、約１０〜２０nMであると決定された。精製及び特徴付けの間に濃度を決定するために使用されるＦＸａＩ活性のアッセイを、Elisa Titertek Twin Reader， Type 380（EF LAB）によって行った。精製されたタンパクの最終活性測定もフィリップス（モデルＰＵ８７２０）ＵＶ／Ｖｉｓスキャンニング分光計で行った。５．２阻害のタイプ及び投与量−応答曲線色素産生アッセイでの阻害の程度によりほとんど完全な飽和が、部分的に精製された天然に存在するＦＸａＩの量を増加させて得られた（図３）。しかし、達成された阻害の程度は時間依存性であり、ほとんどの阻害は、室温において数分間（３〜５分）のＦＸａとＦＸａＩの予備インキュベーションがないと観測されなかった。この挙動は、ゆっくり結合する阻害剤の典型であり、アンチスタシンに対して先に開示した（参照文献８）。高い阻害剤の濃度でさえもＦＸａ活性の完全な阻害が達成されるようには思われない。これは、酵素−阻害剤複合体の解離の傍らで、複合体が、酵素、阻害剤および基質間でも混合タイプの阻害として形成されることを示している。混合タイプの阻害は、天然に存在するＦＸａＩ（１３）及びアンチスタシン（８）に対して先に報告されている。５．３凝固アッセイＦＸａＩの阻害活性もまた、活性化された部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の増加として、基本的にSpaethe，Haemostasis，AHS/Deutschland GmbH ，Munich（1984）に開示されたように試薬としてアクチンＦＳ（Actin FS）（Ｄａｄｅ）（これは、ファクターXII及びファクタXIを活性化するためのエラグ酸、並びに大豆リン脂質を含有する。）を使用してアッセイした。これらの条件化及び２０mMＣａＣｌ₂の存在下で、凝固の本来備わっている経路のみが活性化される。アイソフォーム（isoform）Ａ（ＤＬＳから単離された天然に存在するＦＸａＩの主フラクション）をこれらの実験に使用した。色素産生アッセイにおけるこの活性は、１６４mu/mlであり、これはＦＸａと阻害剤との間の密な結合を仮定すると（上記セクション５．１参照）、１６４pmol/mlと等しい。このバッチのタンパク濃度を、SDS-Bradford（Macart and Gerbaut，Clin．Chim．Acta 122:9 3-101（1982））によってアッセイし、〜２０μｇ／mlであると決定した。ＡＰＴＴをヒトおよびネズミ血漿（両方とも新鮮なものと凍結させたもの）に対して評価した。ヒト血漿において、１０mu/mlの濃度でＡＰＴＴを二倍にしたが、ネズミ血漿では、３．５mu/mlで同じ効果を達成するのに十分であった（図４）。タンパク濃度を基にして、これ価は、８７および３０nMにそれぞれ等しい。両種類の新鮮な血漿と凍結させた血漿の間で差は観測されなかった。５．４プロトロンビナーゼ複合体のＦＸａ阻害活性のアッセイＦＸａＩの阻害活性をプロトロンビナーゼ複合体のＦＸａに関するその影響でもアッセイした。使用したリン脂質は、ウサギ脳セファリン（シグマ）であった。１つのバイアルの内容物は、１ml中に懸濁された０．１５ＭのＮａＣｌを反応混合物中に１：４０（即ち２．５μｌ／１００μｌ）に希釈した。他の成分の濃度は、ＦＸａ２５０pM、プロトロンビン２．６７μＭ、ＦＶａ４．２nM及び２０ mMトリス−ＨＣｌｐＨ７．４／１５０mM ＮａＣｌ／０．１％ポリエチレングリコール６０００中のＣａ⁺⁺１mMであった。３７℃での予備インキュベーションに続いて、反応をプロトロンビンを添加することによって開始した。アリコートを種々の時間間隔で採取した。反応を１０mM ＥＤＴＡで停止し、アリコートをアッセイするまで氷上に保存した。ＦＸａ阻害剤（例えば本発明のＦＸａＩ）によるＦＸａの阻害は、３７℃でのプロトロンビンからのトロンビンの生成に関するＦＸａＩの影響として観測される。精製されたトロンビンの量は、８０μｇの合成トロンビンｐ−ニトロアニリド基質Ｓ−２２３８（Kabi-Vitrum，Sweden）を用いて２３℃でアッセイした。天然に存在するＦＸａＩに対して得られた結果は７２pMのＫ_iと１９０pMのＩＣ₅₀であった。ＩＣ₅₀は、上述したように、阻害剤−酵素複合体の解離を計算に入れていないのでより高くなる。後のいくつかの実験で、プロとろんビなせ複合体アッセイのプロトコールにいくつかの僅かな修飾を施した。即ち、アッセイ混合物には、２５０pM ＦＸａおよび２．６７μＭプロトロンビンの代わりに５０pM ＦＸａ及び１．３５μＭプロトロンビンが含まれる。６．ＦＸａＩの阻害活性（ｉ）ＦＸａの阻害天然に存在するＦＸａＩの阻害定数は、上記の色素産生アッセイ及び再構成されたプロトロンビナーゼ複合体アッセイで決定した。（ii）トリプシンの阻害天然に存在するＦＸａによるウシトリプシンの阻害を古典的な投与量応答法に従って算出した。Ｋ_i値を、阻害剤及び酵素の濃度の比に対してＦＸａＩの活性のパーセンテージ（以下に開示された比色アツセイ（colorimetric assey）によって決定した）をプロットすることによって得た。比色アッセイは、１０mMトリス−ＨＣｌ、１０mMHepes（pH7.8）、１００mM ＮａＣｌ、０．１％ＰＥＧ６０００中の基質として８０μＭのChromozyme TH（ペンタファーム、スイス）を用い、３．８３または４．２７nMのトリプリンの存在下、２５℃で行った。阻害剤及び酵素を、基質を加える前に２５℃で１０分間予備インキュベートした。このアッセイで、天然に存在するＦＸａＩのＫ_iは４７．３nMであることが見いだされた。（iii）プラスミンとトロンビンの阻害プラスミン及びトロンビンは、トリプシンに対するのと同様のアッセイで天然に存在するＦＸａＩによって阻害されない。トロンビンの場合、使用される基質は、トリプシンに対して使用されるものと同様であり、プラスミンの場合にはＳ２２５１を基質として使用した。７．ＦＸａＩ薬動力学的（Pharmacokinetic）研究予備の薬動力学的実験は、循環系からのＦＸａＩの排泄速度を評価するために行われた。メスＢａｌｂ／ｃマウス（２０〜２５gm体重）に精製したＦＸａＩ（アイソフォームＡ；０．２ml生理食塩水中５．２５μｇタンパク／マウス）を静脈内的に注射した。注射後、１、３、１０及び３０分に血液サンプルを、１／１０v/v３．８％クエン酸中に採った。各マウスから１つの血液サンプルのみを得ることができ、従って、各時間点のサンプルは、異なったマウスのものである。次に血漿を分離し、ＡＰＴＴに対してアッセイした。ＦＸａＩの濃度をＡＰＴＴとＦＸａＩ濃度（これは未処理のマウスから集めた血漿に種々の量のＦＸａＩを加えることによってin vitroで構築した。）の間の検定曲線から計算した（図５の差し込み）。 in vivo試験の結果を表２と図５にまとめた。特定の種々の時間点で測定された実際のＡＰＴＴ値は表２に示されている。図５では、これらのデータは、各時間点でのサンプル中に存在する阻害剤の量として表されている。血液の凝固の十分な阻害が、ＦＸａＩの静脈投与後すぐに観測され、阻害剤の活性の血漿レベルが迅速に低下し、薬７．５分の半減期を有していた。例３：ＰＣＲによるＦＸａＩのクローニング以下の手順は図７に概略的に示されている。全ＲＮＡを１２０のヒルから抽出した。全ＲＮＡから、３５μｇのポリＡ⁺ｍＲＮＡが単離された（Fast Track^TM ｍＲＮＡ単離キット、Invitrogenを使用）。このようにして得られたポリＡ⁺ｍＲＮＡのアリコート（５μｇ）を、以下の合成プライマーの存在下で逆転写反応のテンプレートとして使用した。１５−ｍｅｒオリゴ−ｄＴ配列は、種々のｍＲＮＡのポリＡ配列に相補性を提供する。一本鎖相補性ＤＮＡ（ｓｓ−ｃＤＮＡ）の合成に続いて、ｍＲＮＡをアルカリ処理（０．３ＭＮａＯＨ、室温で一夜）によって分解した。中和したｓｓ−ｃＤＮＡのアリコートを次に、以下の合成により切断したＤＮＡオリゴマーを逆プライマー（reverse primer）としてＰＣＲ増幅にかけた。この合成プライマーは、ＦＸａＩの最初の９つのＮ−末端アミノ酸に関して調製され（例２）、以下の配列をコードする。ＰＣＲ増幅の条件は以下の通りである。１．プライマーＡ０．２μｇ２．プライマーＢ０．２μｇ３．ｓｓ−ｃＤＮＡ５μｌ（全体の５％）４．５mM ｄＮＴＰ４μｌ５．１０ＸＰＣＲバッファー１０μｌ６．Ｔａｑポリメラーゼ０．２μｌ（８Ｕ／μｌ（ＵＳＢ））７．Ｈ₂Ｏ８１μｌ８．４０回×［９４℃で１’；３７℃で３’、７２℃で４’］ＰＣＲ増幅生成物を分析するために、１００μの反応物から１０μｌを１％アガロースゲルに導入した。増幅されていない対照とサイズマーカーも含まれている。約３５０ｂｐ、４５０ｂｐ及び７００ｂｐの３つの明瞭なバンドが観測された。３つのバンドをニトロセルロース紙にブロットし、次に例２で説明したＮＨ２末端配列のＮ−末端アミノ酸１４から１９に対応し、以下の配列を有する合成的に放射性標識されたＤＮＡプローブ（プローブＣ）とハイブリダイズした。３つのＰＣＲ生成物は、非常に厳重なハイブリダイズ条件下でプローブＣとハイブリダイズすることが見いだされた。しかし、７００ｂｐのフラグメントに対応するバンドは、３５０ｂｐおよび４５０ｂｐフラグメントと相対的に弱くハイブリダイズすることが見いだされた。ＰＣＲ増幅に続いて、ＤＮＡをクロロホルム及びフェノール抽出並びにＥｔＯＨ沈殿によって反応混合物から精製した。次に、このＤＮＡをEcoRI及びHindIII で消化し、ついでゲル精製を行い、フラグメントをプラスミドｐＳＰ６５の大きなEcoRI-HindIIIフラグメントにサブクローニングした（図７）。結紮混合物を使用し、E．coli 株ＭＣ１０６１を形質転換した。形質転換物を、上記の放射性標識された合成プローブＣを用いてin situでのハイブリダイズによってスクリーニングした。プラスミドＤＮＡを陽性のクローンから調製した。予想したサイズのEcoRIおよびHindIIIフラグメントを含有するこれらのプラスミドは、Sangerのジデオキシシーケンシング法を用いてＤＮＡシーケンシングにかけた。この方法で、以下の２組のクローンを得た：（Ａ）約２９０ｂｐの挿入物を有するもの（クローン３、８及び１２）及び（Ｂ）約４５０ｂｐの挿入物を有するもの（クローン１、４、５及び１６）。クローン３及び４のプラスミドは、それぞれｐＳＰ６５−ＸａＩ−３及びｐＳＰ６５−ＸａＩ−４と命名した。ｐＳＰ６５−ＸａＩ−４（クローン４）のＤＮＡ配列と推測されるアミノ酸配列を図８に示した。図８のｍｅｔ⁵は、上記のＮ−末端配列の４番目の配列であるｉｌｅ⁴とは異なっているＦＸａＩポリペプチドの第４番目のアミノ酸である（ｍｅｔ¹はバクテリアホスト細胞によって添加される開始メチオニンである。）。この差異は、ＰＣＲ反応の進行におけるＤＮＡポリメラーゼによる誤りに起因するようである。麦芽溶解物を用いたinvitroでの翻訳により、クローン４がクローン３と同じサイズのタンパクをコードすることが示された。従って、クローン３のより短いヌクレオチド配列（２９０ｂｐ）が、クローン４（これを、この例のはじめで開示された逆転写反応でテンプレートとして使用した。）の４５０ｂｐヌクレオチド配列によって例示されたＤＮＡでコードされるｍＲＮＡの３’−非翻訳領域においてポリ−Ａに富んだ配列による内部的プライミングに原因があることがあり得る。例４： Hirudo medicinalis ｃＤＮＡライブラリーからのＦＸａＩをコードするＤＮＡの単離とクローニング例３で説明したＰＣＲで誘導されたｃＤＮＡ（クローン３及び４）を精製された天然に存在するタンパクのＮ−末端配列に対応するプローブとハイブリダイズすることによって単離した。ＰＣＲ誘導された配列を更に確認及び証明するために、Hirudo medicinalisのｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたクローンを、クローン４の全ＦＸａＩコード配列をＤＮＡとして用いてスクリーニングした。手順を図９に図式的に示した。全ＲＮＡを１２０のヒルから抽出した。全ＲＮＡから、Fast Track^TMｍＲＮＡ単離キットを使用してポリＡ⁺ｍＲＮＡを単離した。このようにして得られたポリＡ⁺ｍＲＮＡのアリコートを、ZAP^TMcＤＮＡ合成キット（Stratagene）を用いるｄｓ−ｃＤＮＡ（二本鎖ｃＤＮＡ）合成に使用した。得られたｄｓ−ｃＤＮＡをXhoI及びEcoRIで消化し、XhoI及びEcoRIで消化されたUni-ZAP^TMファージ中の（phagemid）ベクターにサブクローニングした。E．co li XL1-Blue^TM（Stratagene）上の得られた組換えファージをプレート化して、約１．５×１０⁵のプラークのｃＤＮＡライブラリーを得た（図９）。このｃＤＮＡライブラリーを、厳密性の低いハイブリダイズ条件及び厳密性の高いハイブリダイズ条件の両方で、ＰＣＲ誘導されたプラスミド、ｐＳＰ６５−ＸａＩ−４（例３）から得た放射性標識されたＤＮＡをプローブとして使用して、ＦＸａＩＤＮＡを含有するクローンに対してスクリーニングした。厳密性の高い条件には、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ：０．１５ＭＮａＣｌ、０．００１５ＭＮａ−クエン酸塩）、０．１％ＳＤＳ、５Ｘ Denhardt（０．１％Ficoll400、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳＡ、０．５％ＳＤＳ）及び１００μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ中、６０℃で８時間フィルターを予備ハイブリダイズし、ついで６０℃で４８時間放射性プローブとハイブリダイズすることが含まれる。フイルターを、オートラジオグラフイーにかける前に、２ＸＳＳＣ−０．２％ＳＤＳを用いて６０℃で２時間で、数回洗浄した。陽性のプラークを選択し、単離し、同様のハイブリダイズ条件下で再スクリーニングした。次に、いくつかのよう性クローンのプラスミドを、ヘルパーファージの助けを借りて回収し、Sangerジデオキシ法によってシーケンシングした。クローンの１つのプラスミドをｐＳＫ−ＸａＩ−１１（ここでは「クローン１１」または「１１」）と命名し、更に操作と分析を行うために選別した。いくつかの他のｃＤＮＡクローンもシーケンシングしたが、全て５’−末端で切形されているか（truncated）、異なった配列を有していた。クローン１１は、先に得られたＰＣＲ誘導配列と本質的に同一であることが見いだされた６８４ｂｐＤＮＡ挿入物（図１０）を含有するが、その５’−末端で７８の追加の塩基対を含有する。この追加の配列は、リーダーペプチドの典型的成分である１３の疎水性残基と２の性に荷電した残基を有するペプチドをコードする。我々は、推定のリーダー配列の存在に対してクローン１１の生成物のＮ−末端アミノ酸配列を分析した。分析をVon Heijne（Nucleic Acids Res．14：4683-91 ，1986）のアルゴリズムを用いて行った。このアルゴリズムは、与えられたアミノ酸がリーダー配列内の特定の位置を占める蓋然性を予想し、これによってペプチド配列がリーダー配列のものと一致するか否かを決定することができる。更に、ペプチドに沿った「組み合わせアミノ酸スコア（combined amino acid score ）」を決定することによって、リーダー配列と成熟したペプチドの間の開裂部位も予想される。プラスミドｐＳＰ６５−ＸａＩ−１１の生成物のＮ−末端配列の分析に適用した場合（図１０）、このアルゴリズムで、リーダー配列のパターンと一致したアミノ酸パターン、即ちｍｅｔ¹で始まり、ｓｅｒ²⁵まで続くパターンが同定され、開裂部位がｓｅｒ²⁵とｔｙｒ²⁶の間に見いだされた。上記の分析を基にすれば、図１０に示した配列は、前ペプチド（prepeptide）をコードする。即ちｍｅｔ¹からｓｅｒ²⁵までの配列は、リーダーペプチドをコードし、ｔｙｒ²⁶からｇｌｕ¹¹⁰までの配列は天然に存在するＦＸａＩと同一の成長したペプチドをコードする。従って、クローン１１のＤＮＡは、１５のシステイン残基（この１つは２５のアミノ酸シグナルまたはリーダーペプチドに位置する。）を含有するｍｅｔ¹からｇｌｙ¹¹⁰まで広がった１１０のアミノ酸（Ｎ−末端メチオニンを含有する）の前ペプチドをコードする。これまでのパラグラフで説明したように、クローン１１の１から２５までのアミノ酸は、リーダー配列を構成するようである。この発見は、ＤＬＳから単離された天然に存在するタンパクに対して決定された公知のＮ−末端配列がｔｙｒ²⁶から始まるという事実（例２）によって更に支持される。従って、クローン１１（組換えＦＸａＩ）によってコードされる成熟したタンパクが、ｔｙｒ２６からｇｌｙ１１０まで広がった８５のアミノ酸を含有することを仮定することは妥当である。クローニングされたｃＤＮＡ内のオープンリードフレームの存在を確認するため、及びコードされたタンパクの大きさを確認するために、ｃＤＮＡ挿入物をプラスミドＳＰ６５にクローニングし、ＳＰ６ＲＮＡをStratageneのin vitroにおける翻訳キットを用いて調製した。このようにして得られた該ＲＮＡを、in vit ro での翻訳にかけ、タンパク生成物を変性条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。クローン１１によってコードされるｍＲＮＡのin vitroでの翻訳のタンパク生成物は、ゲル上で約１５ｋＤに対応する位置に移動した。先に説明したように、クローン４は天然に存在するポリペプチドのＮ−末端配列を基にして単離され、従って、天然に存在するポリペプチドをコードすると考えられる。クローン１１は、クローン４の推定アミノ酸配列は図８に、また、クローン１１の推定アミノ酸配列は図１０に示されている。クローン４及び１１のアミノ酸配列も図６に並べて示した。クローン４の配列ｔｙｒ²⁶−ｇｌｙ⁸⁶（図８）は、クローン１１の配列ｔｙｒ²⁶ −ｇｌｙ¹¹⁰（図１０）に等しい。２つの配列を比較すると、これらの間にわずか２つの違いがあることが明らかになる。クローン４のｍｅｔ⁵がクローン１１のｉｌｅ²⁹に対応し、ｓｅｒ⁶⁵がクローン１１のｐｒｏ⁸⁹に対応する。クローン４のｍｅｔ⁵は、ＤＬＳから単離される天然に存在するポリペプチドから得られるＮ−末端配列中の残基に対応するイソロイシンの代わりに、ＰＣＲ反応の誤りによって挿入されるようである。これらの差はまた、図６の位置４及び７０でより明確に観測される。従って、クローン１１でコードされるポリペプチドと天然に存在するポリペプチドの間の差は多くて僅かに１つであり、従って、これらは相同であると考えられ得る。従って、クローン１１で発現されたポリペプチドは、組換えＦＸａＩと解釈される。例５：推定アミノ酸配列の比較ＰＣＲで誘導されたＦＸａＩｃＤＮＡの推定アミノ酸配列、ライブラリーで誘導されたＦＸａＩＤＮＡ（リーダー配列を含有する）及びアンチスタシンを異なった方法、即ち最大相同性、同一相同性（identical homology）、及び整列（al igment）によって比較した。５．１相同性最大相同性（表３においてパーセントで表した）を、表３の脚注に記載した等価基（equivalence groups）を用いて、２０２０ＰＲＯＳＩＳプログラム（ＬＫＢ）、バージョン６．００（これは、Needleman and Wunsch，J．Mol．Biol.48: 443（1970）に基づく）を用いて見いだした。比較された配列はリーダーペプチドを含有する。表４は、同一相同性の程度（パーセントで表した）、即ち等価基なしでの程度を示す。５．２整列（aliment）配列の類似性を分析する他の方法は、相同性を犠牲にしてもシステイン残基を整列させることである。Feng and Doolittle，J．Mol．Evol．35:351_-360（1987 ）の仕事を基にしたコンピュータプログラムＰｉｌｅｕｐでこのような整列を行った。先に比較した同じ配列に対するギャップウエイト（gap weight）３．００及びギャップ長さウエイト（gap length weight）０．１０のパラメータを使用した結果を図６に示した。図６は３つの全ての配列の１４のシステインが、いずれの配列においても考慮されうるギャップを導入することなく整列されたことを示す。Ｐｉｌｅｕｐプログラムは、配列の類似性の程度を表す０〜１．５のスケールで価を割り当てる。得られた考慮中の配列の類似性の程度は１．５のパーセントとして表５に示した。アミノ酸配列を比較するこれら３つの方法から、アンチスタシンと、クローン４及びクローン１１の間にほんの僅かな類似性があることがわかる。アンチスタシンは、クローン４及び１１でそれぞれ僅かに５０％と４５％の最大相同性を示し、それぞれ僅かに３２％と３０％の同一相同性を示し、更に、クローン４とクローン１１に対して４１％と３２％の類似性指数をそれぞれ示した。例６：組換えFXaIの発現 E.coliの中の組換えFXaIの発現のためのプラスミドを得るために、FXaIたんぱく質をコードするDNAフラグメントのそれ以上の操作が必要であった。プラスミドpSK-XaI-11（例４）をXhoIおよびEcoRIで消化した。 FXaIをコード化する配列を含むXhoI-EcoRIフラグメントを分離し、プラスミド pSP65のSalI-EcoRI消化物にサブクローンした。結果として生じたプラスミドを、pSP65-xaI-11と命名した（図１１）。このプラスミドは適当な制御要素を欠き、それゆえにコードされた蛋白質を発現しない。しかしながら、このプラスミドは発現プラスミドの組立に使用できる。クローン１１によりコードされた組換えFXaIの細菌を使った発現を、ヒトCu/Z n-SODの63個のＮ末端アミノ酸に融合されたFXaIの発現のためのプラスミドを組み立てるためのcDNAフラグメントを使って行った。クローン１１のcDNAを含むプラスミドpSP65-XaI-11を、RsaIにより消化した。 FXaIをコードするRsaI-RsaIフラグメントを分離し、以下の合成オリゴマーの２セットの存在下でプラスミドpBAST-Rの大きなAatII-PpuMIフラグメントに結合した。 E.coli733の成長の後に来る細胞ペレットの溶解の後に得られる不溶性のフラクション中に、予想されているサイズの蛋白質が得られた。成熟したFXaIは、公知の方法により融合蛋白質を切断することにより得ることができる。例７：プラスミドpDeo-S-XaI-11”f”によって生産された組換えFXaIのリフォールディングと精製プラスミドpDeo-S-XaI-11”f”を含むE.coli 733を、deｏプロモーターの支配下の発現プラスミドに関する方法を開示する、共同譲受された欧州特許出願公開番号第303,972号（１９８９年２月２２日）に記載されたような当業者に知られている手順に従って増殖させた。増殖後、E.coliをペレット化し、蓄えられた固まりを処理まで凍らせておいた。細菌の固まりの処理および組換えFXaIポリペプチドのリフォールディングの詳細は次の通りである。１．包含体の分離上記細菌の固まりを１０倍容量のバッファー１（10mM EDTAを含有する50mMトリス塩酸PH 8)に懸濁させた。細胞の崩壊は、懸濁液にリゾチーム（2500U/ml）を添加し、時々撹拌しながら室温で２時間インキュベートして行った。次いで、懸濁液を超音波処理（3ｘ10 分）し、４℃で３０分間遠心（12,000 rpm）した。ペレットを界面活性剤と共に１％ノニデット（Nonidet）P-40（Np-40）を含む１０倍容量のバッファー１中に再び懸濁して洗浄し、時々撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。次に、懸濁液を４℃での３０分間の遠心（12,000 rpm）により浄化し、さらにペレットを蒸留水で洗浄し、時々撹拌しながら室温で１５分間インキュベートした。ペレットの洗浄の結果、たくさんのE.coli蛋白質が除去された。最後に、洗浄したペレットを４℃で４５分間遠心（15,000 rpm）した。上述の洗浄条件下では組換えFXaI融合蛋白質がペレットに残されることがSDS-PAGEにより立証された。２．可溶化および還元組換えFXaIのほとんどが、包含体の中、すなわち、細菌の超音波処理により得られた不溶性ペレットの中に現れた。分離および洗浄の後、包含体を４８倍容量のバッファー２（1mM EDTAおよび100mM NaClを含有する6M塩化グアニジン（GuCl ）の20mMトリス塩酸（PH８）中溶液に溶解した。還元は、窒素気流下で還元グルタチオン（GSH）を追加してから１５分後に開始し、１時間行った。次いで、蛋白質の濃度を、GSH含有バッファー２を添加して1mq/mlに調節し、さらに１〜３時間窒素下でインキュベートした。３．リフォールディング／再酸化還元された組換えFXaIを含有する得られた粗混合物を、バッファー２で１０倍まで100μｇ／ｍｌ蛋白質の蛋白質濃度に希釈した（GuClおよびGSHの最終濃度は夫々0.6Mおよび1mM）。酸化グルタチオン（GSSG）を最終濃度0.1mMまで添加し、この溶液を４℃で１６時間インキュベートした。免疫学的アッセイで阻害活性をアッセイする前に、酸化された蛋白質を、EDTAを欠いたバッファー２で３回バッファーを交換して透析した。結果として生じるプラスミドは、pDeo-S-XaI-11”f”（図12）と命名し、E.co li菌株733に導入し、ATCC受託番号69136という番号で寄託された。プラスミドPBAST-Rは、deoP₁P₂プロモーター、deo RBSおよび修飾されたCu/Zn -SOD配列のＮ末端領域を含む。SOD部分とFXaI部分の間にある合成リンカーEによってコードされた３つの追加のアミノ酸酸met-phe-valが、臭化シアン切断部位を構成する。すなわち、プラスミドpDeo-S-XaI-11”f”は、修飾されたCu/Zn-SOD配列の63 個のＮ末端アミノ酸を含む約19kD分子量の融合蛋白質、リンカーEによってコードされたトリペプチドmet-phe-valからなる２つ融合蛋白質の間の切断領域またはリンカー領域、および、図１０に示すtyr²⁶〜gly¹¹⁰の配列を有するFXaIをコード化する。この修飾されたSOD部分は、次のアミノ酸配列を有する。プラスミドpDeo-S-XaI11”f”により形質転換された４．リフォールドされた組換えFXaIの様々なバッチの阻害活性リフォールドおよび透析された蛋白質を、例２で説明した生化学・免疫学的アッセイによりFXa阻害活性についてアッセイした。この結果を、蛋白質１ｍｇあたりのミリユニット（mu/mg）として表６に示す。2nM FXaを含有するアッセイ混合物で５０％阻害を引き起こす蛋白質の量を1muと規定する。さらに、リフォールドされた蛋白質を、トロンビン、その他の凝血カスケードのタンパク質分解酵素への阻害効果についても試験した。このアッセイは、Lottenbergらの方法（En zymol．80:341-361(1981)）に従って行った。表６からわかるように、FXaIによるトロンビンの阻害の有意でないレベルが観察された（<1mu/mg）。要約すると、生化学的に活性な組換えFXaIは、クローン11”f”により生産されたFXaI融合蛋白質をリフォールディングすることにより既に生産されている。得られた組換え蛋白質は、DLSから分離された自然に生じたFXaIと同じ範囲内の比活性を有する。組換え蛋白質は、トロンビンよりも８０倍以上高いFXaに対する特異性を示す。例８：抗FXaI抗体の惹起抗体は、DLSから分離された自然に生じたFXaIについて作った。Ａ．抗原の調製免疫のための抗原は、例１に記載したようなＱ−セファロースおよびヘパリンセファロースクロマトグラフィーによりDLSから精製した。一定分量の蛋白質を同容量のSDS-PAGEサンプルバッファー（30%グリセロール、0.19Mトリス塩酸pH6. 8、10%SDS、15%β−メルカプトエタノール、および、0.004%プロムフェノールブルー）で希釈した。次いで、サンプルを15%SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜上で電子伝達し、リバーシブルポンソー染料で染料した。約14kD のみかけ上の分子量を有する蛋白質を膜から抽出し、免疫のための抗体として使用した。Ｂ．抗体の誘導 1ml DMSOに溶解し、完全フロインドアジュバントと混合した、精製された抗体（20-60μｇ）を1.8〜2.3kqの兎の足蹠に注射した。３週間後、再び兎に注射した。今回は、同量の、不完全フロインドアジュバントを混合した抗原を皮下注射した。この操作を同じ間隔で２階以上繰り返した。Ｃ．ウエスタンブロット分析による抗体の立証抗体を、12%SDS-PAGE上で減圧下にて行なわれた、種々の蛋白質のウエスタンブロットで証明した。抗血清との反応後、ウエスタンブロットを、¹²⁵Ｉ標識プロティンＡを用いて展開した。Ｄ．結果抗FXaIは、DLSから精製された自然に生じたFXaI、および、クローン11”f”により生産され、リフォールドおよび部分的に精製された組換えFXaI融合ペプチドの両方と反応した。自然に生じたFXaIおよび組換えFXaI融合ペプチド（11”f” ）は、夫々、ゲル上で16kDおよび23kDの分子量に相当する移動を行った。これらのバンドは、全く同様の分子量を有する抗FXaIとの反応の後での、同じ蛋白質のウエスタンブロットで得られた。このことは、組換えFXaIが自然に生じたFXaIと交差反応することを明らかに示している。例９：真核生物細胞での組換えFXaIの生産 FXaIのような多くのシステインを含む分子を生化学的に活性なポリペプチドを得るためにリフォールドすることの固有の複雑さのために、真核生物細胞での当該ポリペプチドの生産が、幾つかの困難を排除できることが推定される。また、大量の適当にリフォールドされた、生化学的に活性な組換え蛋白質の製造を可能にし得ることが予想される。予備実験では、成熟したFXaIポリペプチドの発現を、Sf-9昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現系を用いて得た（18）。この細胞は、11”l”蛋白質をコード化したDNA、すなわち、（プラスミドpSK-XaI-11（図９）に含まれるような）リーダー配列を含むFXaIプレペプチドをコード化したDNAで形質変換されている。ウエスタンブロット分析は、培地中に分泌された、その結果として得られたポリペプチドが、宿主細胞中での翻訳後の処理、すなわち、リーダー配列の除去、言い換えれば、リフォールドされた、生化学的に活性な成熟したFXaIポリペプチドの回復を可能にする処理を受けたことを示した。生産されたポリペプチドは例８に記載した抗FXaI抗体と反応した。例１０：組換えFXaIおよびプレペプチドを発現する追加のプラスミド組換えFXaIのE.coliでの改良された発現を得るために、FXaIをコードするDNA フラグメントの追加の操作が必要とされた。 FXaIをコード化するDNAを包含し、且つ、異なる制御要素の次の組み合わせを包含するプラスミドの系を組み立てた。この系は、FXaIの検出可能な発現を生じないか、または、ウエスタンブロット分析によってのみ検出可能なFXaIの発現を生じた。（ａ）λＰ_Lプロモーター、λＣ_IIリボソーム結合部位およびATGコドンの後ろの８つのHis残基（ｂ）λＰ_Lプロモーター、修飾されたλＣ_IIリボソーム結合部位（１２のかわりに９つのヌクレオチド）および細菌周縁質中に発現された蛋白質を分泌する試みでのDsbAリーダー配列（１９）と同等のリーダー配列（ｃ）λＰ_Lプロモーター、修飾されたλＣ_IIリボソーム結合部位（９つのヌクレオチド）、細菌周縁質中に発現された蛋白質を分泌する試みでのDsbAリーダー配列（１９）と同等のリーダー配列、T₁T₂転写端末配列およびcI⁸⁵⁷リプレッサー（ｄ）deoプロモーター、deoリボソーム結合部位、転写エンハンサー、および、DsbAリーダー配列と同等のリーダー配列（ｅ）λＰ_Lプロモーター、deoリボソーム結合部位、転写エンハンサー、細菌周縁質中に発現された蛋白質を分泌する試みでのDsbAリーダー配列（１９）と同等のリーダー配列、T₁T₂転写端末配列およびCI⁸⁵⁷リプレッサー FXaIをコード化するDNAを包含するプラスミドと、異なる制御要素の組み合わせを夫々包含するプラスミドの２つのプラスミドが、FXaIの検出可能な発現の結果として組み立てられた。Ｉ．プラスミドpFSHI-6 プラスミドpFSHI-6（図１３）に達するプラスミドの系を組み立てた。プラスミドpFSHI-6は、適当なE.coli宿主細胞の形質転換で、拡張ペプチド（FXaIプレペプチド）に付着したFXaIの検出可能な発現を可能にした。拡張ペプチドは、FXaI生産に有用な14個のアミノ酸［一つのMeT残基、６個のHis残基、一つのGly残基、一つのThr残基およびエンドプロティンナーゼ切断部位のために必要なアミノ酸（すなわち、エンテロキナーゼで認識されるAsp-Asp-Asp-Asp-Lys）］を含んでいる。 Met-His-His-His-His- His-His-Gly-Thr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-FXaIをコード化するプラスミドPFSHI-6の構造を図１３に示す。FXaIのアミノ酸配列を図１０に示す。このアミノ酸配列は２６位のアミノ酸Tyrから始まる。アンピシリン耐性を与え、且つ、Met-His-His-His-His-His-His-Gly-Thr-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys-FXaIをコード化するプラスミドpFSHI-6を、E.coli菌株4300に導入し、ATCCにATCC受託番号第69583号として1994年3月11日に寄託した。この宿主−プラスミド系を100μ／mlのアンピシリンでO.D.₆₆₀＝0.8まで懸濁したLB培地中で増殖させた。蛋白質の生産を、温度を１５分間で４２℃まで変化させることにより誘発した。次いで、この温度を４０℃まで低下させ、さらに系を２時間培養した。 SDS-PAGE分析およびウエスタンブロット分析は、プラスミドを含まないコントロールの培養株ではなかった、約17kDaの新しい蛋白質バンドを示した。細胞抽出液中でのFXaIの局在化を決定するために、誘発された培養株を集め、50mMトリス塩酸（pH8.0）、10mM EDTAで洗浄し、超音波処理を施して細胞を崩壊させた。15,000rpmで遠心（ソーバル・セントリフュージ，sorval centrifuqe）した後、上澄みをペレットから分離した。ペレットを8M 尿素に懸濁し、粒子および膜を溶解した。両フラクションのSDS-PAGE分析は、発現されたFXaIが上澄み中に存在すること、すなわち、FXaIが可溶な形であることを示した。可溶な形のプラスミドPFSHI-6により発現されたポリペプチドを次の手順で分離した。１リットルの培地から誘発された培養株を集め、50mMトリス塩酸（PH8. 0）、10mM EDTA、20μg/mlのリソゾームで最終的な容量が50mlになるまで懸濁した。細胞崩壊の後、懸濁液をH₂Oで１：１に希釈し、25mMトリス塩酸（pH8.0）で平衡化したDEAE-セファロースカラムにかけた。この工程は、Q-セファロースカラムを代えて行うこともできる。蛋白質を、同じバッファー中のNaCl溶液の0-0. 5Mの濃度勾配により溶出させた。17kDaの蛋白質を含むフラクションを蓄え、そのPHを酢酸で6.8に調節した。金属親和性カラムクロマトグラフイー（インビトロゲン、Invitorogen）を、Ni⁺⁺カラムを0.3-0.5Mの濃度のNaClの25mMトリス塩酸（pH 8.0）中溶液で平衡化することにより行った。蛋白質をカラム（3mlのベッド容量）にかけ、同じバッファーで洗浄し、結合したFXaIを、0.3Mイミダゾールの同じバッファー中溶液で溶出させた。SDS-PAGE分析は、17kDaの蛋白質バンドが、発現された主な蛋白質であることを示した。蛋白質の純度は、約70-80%であると評価された。この部分的に純粋な蛋白質を、20mM NaPiバッファー、100mM NaCl、0.1%の界面活性剤（商標；Hecameg）（Vegatec,Ville-Juife,France）,pH 6.6中で、エンテロキナーゼ（Biozyme,Great Britain）で37℃、40時間切断にかけた。蛋白質のエンテロキナーゼに対する比率は夫々200μｇ：１μｇであった。切断の効率は、SDS-PAGE分析により95%と決定した。17kDaの蛋白質バンドは、クマシンブルー染色により視覚化された約15kDの分子量に対応する新しい蛋白質バンドをカバーした。切断後、切断された蛋白質を、20mM NaPi,10OmM NaCl,pH 6.6に対して透析し、界面活性剤および切断された拡張ペプチドを除去した。 FXa阻害比活性を、エンテロキナーゼによる切断の前および後に色素生産性アッセイ（例２に記載）でアッセイした。切断前の比活性は、1000-1200 mu/mq蛋白質であり、切断後の比活性は、4000-4500 mu/mg蛋白質であった。切断された蛋白質を含む溶液から拡張ペプチドをクロマトグラフィーにより除去した後の比活性は、8000mu/mg蛋白質と同じくらい高かった。切断された蛋白質について行われたN末端アミノ酸の配列決定により、切断された蛋白質の最初の９つのアミノ酸が、図１０に示したFXaIの最初の９つのアミノ酸（Tyr²⁶からpro³⁴まで）と全く同一であることが確認された。 APTTを２倍にする原因となった成熟したFXaIの濃度は、12.2μｇ／ｍｌであった。 II．プラスミドpHSOH-11 （エンテロキナーゼに代えて）ヒドロキシルアミンを使用して成熟したFXaIを得るために、プラスミドPHSHI-6中に存在するFXaIをコード化するDNA配列を、As n-Glyをコードする２つの追加のトリプレットを拡張ペプチド中のLys残基（拡張ペプチドのC末端残基）の後ろに導入することにより操作した。引き続き、FXaI の４７位のAsn残基（図１０の７２位）をpro残基で置換し、FXaIコード領域内のヒドロキシルアミン感受性部位を除去した。さらに、以下のヌクレオチドの、FXaIのアミノ酸配列に影響しない変更を行った（図１０に示す塩基配列と比較）。結果として生じたプラスミドをプラスミドpFSOH-11と命名した（図１４）。新しく導入されたAsn-Gly部位を、ヒドロキシルアミンで切断して、Gly-Tyr¹-Glu² で始まる成熟したFXaIを得ることができる。アンピシリン耐性が確認され、Met-His-His-His-His- His-His-Gly-Thr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Asn-Gly-FXaIをコード化するpFS0H-11を、E.coli菌株4300に導入し、ATCCにATCC受託番号第69582号として1994年3月11日に寄託した。この宿主−プラスミド系を100μ／mlのアンピシリンでO.D.₆₆₀＝0.8まで懸濁したLB培地中で増殖させた。蛋白質の生産を、温度を１５分間で４２℃まで変化させることにより誘発した。次いで、この温度を４０℃まで低下させ、さらに系を９０分間培養した。 SDS-PAGE分析は、コントロールの培養株ではなかった、新しい14-16kDa新しい蛋白質バンドを示した。例１１： FxaI二量体蛋白質の発現プラスミドpMLK-XaI-D-11”m”（図１５）に達するプラスミドの系を組み立てた。プラスミドpMLK-XaI-D-11”m”は、適当なE．coli宿主細胞の形質転換で、成熟したFXaI生産に有用なFXaI二量体蛋白質の検出可能な発現を可能にした。自己相補性のために変異（または欠失）を防止することを目的として、cDNA合成（図４）により調製したFXaIフラグメント中に存在する代替のコドンを用いた合成オリゴヌクレオチドの構築により、FXaIをコード化するDNAフラグメントを組み立てた。例４で説明したように調製したFXaIフラグメントはFXaI-11”m”と命名したのに対して、この合成FXaIフラグメントをFXaI-11”m”-Syと命名した。 FXaI二量体をコード化するプラスミドpMLK-XaI-D-11”m”の構造を図１５に示す。アンピシリン耐性が確認され、且つ、FXaI二量体をコード化するプラスミドpM LK-Xal-D-11”m”を、E.coli菌株4300に導入し、ATCCにATCC受託番号第69581号として1994年3月11日に寄託した。プラスミドpMLK-XaI-D-11”m”を、易熱性リプレッサーCI⁸⁵⁷を含むE.coli菌株4300を形質転換するために使用した。42℃での誘発で、形質変換された細胞は、コントロールの培養株では見られない、約28kDの分子量を有するポリペプチドの発現により見出された。約28kDのポリペプチドは、細胞ペレットの溶解の後に得られた不溶性フラクションから得られた。この約28kDのポリペプチドは、組換え細菌の細胞抽出物中の主な蛋白質であり、クマシンブリリアントブルー染色により視覚化された。この二量体を、臭化シアン（CNBr）により切断し、成熟した FXaIを得た（例１２参照）。例１２： FxaI二量体を含む包含体からの活性な組換えFXaIの回収プラスミドpMLK-XaI-D-11”m”（図１５）はFXaIの二量体バージョンをコード化する（例１１）。この二量体からの活性なFXaIの回収には２つのルートがある。Ｉ．CNBrにより二量体を切断し、次いで得られた分子をリフォールディングする。 II．二量体をリフォールデイングし、次いで、臭化シアン（CNBr）により二量体を切断する。ルートＩＡ．CNBrによる切断濡れた包含体（IB）-0.3g-を6M塩化グアニジン（GuCl）10倍容量、100mMトリス塩酸（PH 8.5）に溶解し、１時間撹拌し、水に１：10に希釈し、遠心した（So rvall,12,000rpm,30分）。ペレットを水で洗浄し、遠心（Sorvall Hi-speed cen trifuge,12,000 rpm，30分）し、10mg/mlの蛋白質濃度で85%フマル酸6ml中に溶解させた（超音波処理を均一な溶液を得るために使用した）。100モルCNBr/モルのMet残基、すなわち、400モルCNBr/モル蛋白質を覆いの下で添加した。一晩室温でインキュベートした後、フマル酸をロトバップ（Rotovap）中でエバポレートし、乾燥された蛋白質をメタノールで５回洗浄し、再びエバポレートした。残渣を水に溶解し、凍結乾燥した。Ｂ．リフォールデイング切断した蛋白質（重量23mg）を6M GuClの20mMトリス塩酸（PH 8）中溶液2.3ml （100倍容量）、50mM NaCl、1mM EDTA（バッファーTNE）を溶解し、40mM GSHを添加し、PHを8.0に調製した。一晩インキュベートし、10mM GSHを補充し、追加のインキュベート（１時間）を行い、TNE/6M GUClに1:2.5に希釈した後、溶液をさらに0.2mM GSSGのバッファーTNE中溶液（GSH最終濃度1mM）に希釈し、リホールディング／再酸化を開始した。４℃でのインキュベーションを66時間行い、20 mMトリス塩酸（PH8.0）に対しての最後の透析の後、結果として得られた成熟したFXaI（75μｇ／ｍｌ）を、FXa阻害活性について試験した。同時に、サンプルを、SDS-PAGE分析のために減圧下でのエバポレーション（Speed-Vac concentration,Savant）により濃縮した。Ｃ．結果減圧条件下でのSDS-PAGEによれば、切断の効率は70%を超え、二量体を表す約2 8kDのバンドは２つに分かれ、約14kDのシングルバンドが得られた。その他の不純物が、ゲル上の全ての蛋白質の<10%に相当した。結果として得られた、切断され、リフォールドされた生成物を、特異的FXa阻害活性について色素生産性アッセイ（例２で説明した）で試験して、その活性を1900mU/mgと決定した。リフォールディング後の切断された二量体について行われたN末端アミノ酸の配列決定を行い、切断された生成物の最初の５つのアミノ酸が、FXaIの最初の５つのアミノ酸（図１０に示したTyr²⁶からpro³⁰まで）と全く同一であることが確認された。ルートII Ａ．リフォールディング濡れた包含体（重量100mg）を、6M GuCl（バッファーTNE）3mlに溶解した。還元のため、20mM GSHを添加し、PHを8.0に調節した。１時間のインキュベーションの後、リフォールディング／再酸化を、0.2 mM GSSGのTNEバッファー中溶液（最終濃度GSH 1mM,GuCl 0.6M）で（A）１:167または（B）１:100の希釈度に希釈して開始した。４℃で一晩インキュベートし、20mMトリス塩酸（pH8.0）、20mM NaClに対して透析し、遠心（sorvall Hi-speed centrifuge,12,000rpm，30分）した後、リフォールドされた蛋白質を上澄み中に検出した。リフォールドされた蛋白質を、例２で説明した色素生産性アッセイでFXa阻害活性についてアッセイした。リフォールドされたFXaIの蛋白質濃度は（A）15μg/mlおよび（B）32μg/mlであり、それらの特異的FXa阻害活性は（A）1720mu/mgおよび（B）1572mu/mgであった。Ｂ．CNBr切断リフォールドされた両方の蛋白質（AおよびB）を水に対して透析し、凍結乾燥した。400モルのCNBr/モル蛋白質を、85%フマル酸に溶解した135μｇのAおよび2 88μｇのBに添加した（すなわち、夫々CNBr 325μｇおよび654μｇ）。一晩室温でインキュベートした後、フマル酸をロトバップ中でエバポレートし、乾燥された蛋白質をメタノールで５回洗浄し、再びエバポレートした。残渣を水に溶解し、例２で説明した色素生産性アッセイでFXa阻害活性についてアッセイした。Ｃ．結果 FXaIの特異的活性の結果は次の通りであった。 A：2470 mu/mg；蛋白質濃度85μg/ml B：4700 mu/mg；蛋白質濃度83μg/ml

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/815 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 1/21 9152−4ＢＣ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/02 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ 21/08 9455−4Ｃ 37/54 ＡＧＡ // Ｃ１２Ｎ 9/99 9455−4Ｃ 37/52 ＡＤＹ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ワーバー、モシェ・エムイスラエル国、テル・アビブ、バーラ・ストリート 36 (72)発明者ジーロン、エリシャ・ピーイスラエル国、ベット・ダガン、ミッシュマー・ハシバ、エリヤフ・シャミア・ストリート７ (72)発明者レバノン、アビグドアイスラエル国、レホボット、モーリバー・ストリート８ (72)発明者ガイ、レイチェルイスラエル国、レホボット、ミラー・ストリート 23 (72)発明者ゴールドラスト、アリーイスラエル国、ネズ ― ジオナ、ヒミンヤン・ハリション・ストリート 21 (72)発明者リグビ、メイアーイスラエル国、レホボット、ハバロン・ハーシュ・ストリート 18 (72)発明者パネット、アモスイスラエル国、エルサレム、ハラブ・シュリム・ストリート 11 (72)発明者フィシャー、メイアーイスラエル国、レホボット、ゴロデスキ・ストリート 12

Claims

【特許請求の範囲】１．ｔｙｒ²⁶−ｇｌｙ¹¹⁰が図10に示される配列と同一であるアミノ酸配列Ｘ −ｔｙｒ²⁶−ｇｌｙ¹¹⁰を包含する組換えポリペプチドであって、Ｘがメチオニンであるか、もしくは存在せず、およびａｓｎ⁷²がｐｒｏによって置換されていてもよい組換えポリペプチド。２．請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含するＤＮＡ。３．ｐＳＰ65−ＸａＩ−11と命名され、ＡＴＣＣ受託番号69138として寄託されている、請求の範囲第２項記載のＤＮＡを包含するプラスミド。４．請求の範囲第２項記載のＤＮＡを包含する発現プラスミド。５．ｐＤｅｏ−Ｓ−ＸａＩ−11“ｆ”と命名され、ＡＴＣＣ受託番号69136として寄託されている、請求の範囲第４項記載の発現プラスミド。６．ｐＦＳＨＩ−６と命名され、ＡＴＣＣ受託番号69583として寄託されている、請求の範囲第４項記載の発現プラスミド。７．ｐＦＳＯＨ−11と命名され、ＡＴＣＣ受託番号69582として寄託されている、請求の範囲第４項記載の発現プラスミド。８．ｐＭＬＫ−ＸａＩ−Ｄ−11“ｍ”と命名され、ＡＴＣＣ受託番号69591として寄託されている、請求の範囲第４項記載の発現プラスミド。９．請求の範囲第４項、第５項、第６項、第７項または第８項に記載される発現プラスミドをホスト細胞中に包含するホスト−プラスミド系。 10．ホスト細胞がバクテリア細胞である請求の範囲第９項記載のホスト−プラスミド系。 11．バクテリア細胞が大腸菌細胞である請求の範囲第10項記載のホスト−プラスミド系。 12．請求の範囲第１項記載のポリペプチドを作製する方法であって、該ポリペプチドをコードする発現プラスミドでホスト細胞を形質転換し、形質転換されたホスト細胞を、該細胞がプラスミドによってコードされるポリペプチドを産生するように培養し、およびそのように産生されたポリペプチドを回収することを包含する作製方法。 13．ホスト細胞がバクテリア細胞であり、かつ回収工程が、（ａ）該細胞を破壊して前記ポリペプチドを含む溶解物を作製し、（ｂ）該溶解物を処理して前記ポリペプチドを含む包含体を得、（ｃ）該包含体を処理して可溶性形態のポリペプチドを得、（ｄ）得られた可溶性ポリペプチドを処理して生物学的に活性なポリペプチドを形成し、（ｅ）形成された生物学的に活性なポリペプチドを回収し、および（ｆ）回収された生物学的に活性なポリペプチドを精製する、ことを包含する請求の範囲第12項記載の方法。 14．工程（ｃ）の処理が変性剤の添加を包含する請求の範囲13項記載の方法。 15．変性剤がグアニジウムクロライドまたは尿素である請求の範囲14項記載の方法。 16．工程（ｄ）の処理が、前記ポリペプチドをチオール含有化合物とジスルフィドとの混合物に接触させることを包含する請求の範囲第13項記載の方法。 17．チオール含有化合物がグルタチオン、チオレドキシン、β−メルカプトエタノール、またはシステインであり、ジスルフィドが酸化グルタチオン、システインまたはメルカプトエタノールの空気酸化生成物である請求の範囲第16項記載の方法。 18．工程（ｆ）の精製がカラムクロマトグラフィーを包含する請求の範囲第13 項記載の方法。 19．カラムクロマトグラフィーが、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーおよびヘパリン−セファロースクロマトグラフィーのいずれか一方もしくは両者である請求の範囲第18項記載の方法。 20．工程（ａ）のポリペプチドがダイマーである請求の範囲第13項記載の方法。 21．工程（ｃ）の後に、ポリペプチドを開裂させて組換えＦＸａＩを産生させる請求の範囲第13項記載の方法。 22．工程（ｄ）の後、ポリペプチドを開裂させて組換えＦＸａＩを産生させる請求の範囲第13項記載の方法。 23．開裂がＣＮＢｒ開裂を包含する請求の範囲第21項または第22項記載の方法。 24．組換えＦＸａＩの作製方法であって、（ａ）延長ペプチドに結合したＦＸａＩをコードするＤＮＡを含むプラスミドを有するホスト細胞を処理し、ＤＮＡを発現させてＦＸａＩプレペプチドを得、（ｂ）発現したＦＸａＩプレペプチドを細胞から回収し、（ｃ）ＦＸａＩプレペプチドを酵素的に開裂させて組換えＦＸａＩを生成させ、（ｄ）組換えＦＸａＩを精製する、ことを包含する作製方法。 25．工程（ｂ）が、（ｉ）ホスト細胞を破壊して細胞残査および蛋白質上清溶液を含有する懸濁液を形成し、（ii）可溶性蛋白質上清溶液から前記細胞残査を分離し、（iii）カラムクロマトグラフィーによって上清からＦＸａＩプレペプチドを精製する、ことをさらに包含する請求の範囲第24項記載の方法。 26．工程（ｃ）がエンテロキナーゼまたはヒドロキシアミンでＦＸａＩを開裂することをさらに包含する請求の範囲第24項記載の方法。 27．工程（iii）がＤＥＡＥ−もしくはＱ−セファロースクロマトグラフィーをさらい包含する請求の範囲第25項記載の方法。 28．前記クロマトグラフィーに続いて、金属アフィニティークロマトグラフィーおよび透析を行なう請求の範囲第27項記載の方法。 29．請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを、該ポリペプチドの生物学的活性から生じる所望の治療効果を得るに有効な量、および適切な担体を含有する組成物。 30．所望の治療効果が血液凝固の程度の低減を包含する請求の範囲第29項記載の組成物。 31．血液を、血液凝固の程度を低減させるに有効な量の請求の範囲第１項記載のポリペプチドと接触させることを包含する血液凝固の程度を低減させる方法。 32．前記接触を、被検体中においてイン・ビボで行なう請求の範囲第31項記載の方法。 33．被検体が過剰血液凝固を患っている請求の範囲第32項記載の方法。 34．過剰血液凝固を患う被検体が、血管障害、術後トラウマ、肥満、妊娠、経口避妊薬の副作用、および持続性運動抑制からなる群より選択される状態を有している請求の範囲第31項記載の方法。 35．過剰血液凝固が脳血管疾患を包含する請求の範囲第33項記載の方法。 36．脳血管疾患が発作である請求の範囲第36項記載の方法。 37．過剰血液凝固が血栓症である請求の範囲第33項記載の方法。 38．血栓症が静脈血栓症である請求の範囲第37項記載の方法。 39．静脈血栓症が深静脈血栓症である請求の範囲第38項記載の方法。 40．静脈血栓症が播種性血管内凝固症である請求の範囲第38項記載の方法。 41．血栓症が動脈血栓症である請求の範囲第37項記載の方法。 42．動脈血栓症が冠状動脈の血栓症である請求の範囲第41項記載の方法。 43．血栓が血栓溶解の後に生じる請求の範囲第41項記載の方法。 44．血栓溶解を線維素溶解剤によって行なう請求の範囲第43項記載の方法。 45．線維素溶解剤が組織プラスミノーゲン活性化剤もしくはストレプトキナーゼである請求の範囲第44項記載の方法。 46．ポリペプチドを線維素溶解剤と一緒に投与する請求の範囲第44記載の方法。 47．ポリペプチドを線維素溶解剤の前もしくは後に投与する請求の範囲第44項記載の方法。 48．ポリペプチドが線維素溶解剤に結合している請求の範囲第44項記載の方法。 49．ＸａＩ因子の活性を阻害する方法であって、Ｘａ因子を、Ｘａ因子の活性を阻害するに有効な量の、請求の範囲第１項記載のポリペプチドと接触させることを包含する方法。 50．請求の範囲第１項に記載のポリペプチドのエピトープに特異的に反応する抗体。 51．請求の範囲第50項記載のモノクローナル抗体。 52．請求の範囲第50項記載の抗体の特異的反応性を競合的に阻害するポリペプチド。 53．インフルエンザを治療または予防する方法であって、インフルエンザを患い、もしくはインフルエンザに罹患する危険のある被検体に、インフルエンザの治療もしくは予防に有効な量のＦＸａインヒビターを投与することを包含する方法。 54．ＦＸａインヒビターをスーパーオキサイドジスムターゼと組み合わせて投与する請求の範囲第53項記載の方法。 55．インフルエンザを治療または予防する方法であって、インフルエンザを患い、もしくはインフルエンザに罹患する危険のある被検体に、インフルエンザの治療もしくは予防に有効な量の請求の範囲第１項記載のポリペプチドを投与することを包含する方法。 56．ポリペプチドをスーパーオキサイドジスムターゼと組み合わせて投与する請求の範囲第55項記載の方法。 57．Ｘａ因子阻害活性を有する請求の範囲第１項記載のポリペプチド。