JP3350549B2 - ヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体 - Google Patents
ヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体Info
- Publication number
- JP3350549B2 JP3350549B2 JP51199293A JP51199293A JP3350549B2 JP 3350549 B2 JP3350549 B2 JP 3350549B2 JP 51199293 A JP51199293 A JP 51199293A JP 51199293 A JP51199293 A JP 51199293A JP 3350549 B2 JP3350549 B2 JP 3350549B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- tfpi
- variant
- xaa
- kunitz
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Production Of Liquid Hydrocarbon Mixture For Refining Petroleum (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Amplifiers (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヒトKunitz型プロテアーゼ阻害剤ドメイン
の変異体、その変異体をエンコードしているDNA、その
変異体及びその変異体を含む医薬組成物の製造方法に関
する。
の変異体、その変異体をエンコードしているDNA、その
変異体及びその変異体を含む医薬組成物の製造方法に関
する。
発明の背景 多形核白血球（polymorphonuclear leucocytes（好中
球（neutrophils）又はPMNs））及び単核食細胞（monon
uclear phagocytes（単球（monocytes））は、組織損
傷、感染、急性及び慢性炎症及び外傷治癒において重要
な役割を演じている。これらの細胞は、血液から炎症部
位に移動し、そして適当な刺激の後、それらは、酸化化
合物（O2・、O2−、H2O2及びHOCl）並びに様々な蛋白分
解酵素を含む顆粒を放出する。この分泌顆粒は、アルカ
リ性ホスファターゼ、メタロプロテイナーゼ、例えば、
ゼラチナーゼ及びコラーゲナーゼ及びセリン・プロテア
ーゼ、例えば、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及び
プロテイナーゼ３を含む。
球（neutrophils）又はPMNs））及び単核食細胞（monon
uclear phagocytes（単球（monocytes））は、組織損
傷、感染、急性及び慢性炎症及び外傷治癒において重要
な役割を演じている。これらの細胞は、血液から炎症部
位に移動し、そして適当な刺激の後、それらは、酸化化
合物（O2・、O2−、H2O2及びHOCl）並びに様々な蛋白分
解酵素を含む顆粒を放出する。この分泌顆粒は、アルカ
リ性ホスファターゼ、メタロプロテイナーゼ、例えば、
ゼラチナーゼ及びコラーゲナーゼ及びセリン・プロテア
ーゼ、例えば、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及び
プロテイナーゼ３を含む。
潜伏性のメタロプロテイナーゼが、組織のメタロプロ
テイナーゼ阻害剤（tissue inhibitor of metalloprote
inase（TIMP））と一緒に放出される。この活性化機構
は、完全に明らかにされていないが、チオール基の酸化
及び／又はタンパク質分解がその過程に参加しているよ
うである。また、遊離のメタロプロテイナーゼ活性は、
TIMPの不活性化に依存する。
テイナーゼ阻害剤（tissue inhibitor of metalloprote
inase（TIMP））と一緒に放出される。この活性化機構
は、完全に明らかにされていないが、チオール基の酸化
及び／又はタンパク質分解がその過程に参加しているよ
うである。また、遊離のメタロプロテイナーゼ活性は、
TIMPの不活性化に依存する。
白血球のアズール性の（azurophil）顆粒において
は、セリン・プロテアーゼ好中球エラスターゼ、カテプ
シンＧ及びプロテイナーゼ−３が、グルコサミノグリカ
ンと複合体を形成する活性酵素として包まれている。こ
れらの複合体は、不活性であるが、その活性酵素を放出
するための分泌の間に解離する。このプロテアーゼ活性
を中和するために、多量の阻害剤、α１−プロテイナー
ゼ阻害剤（α１−PI）及びα１−キモトリプシン阻害剤
（α１−ChI）が、血漿中にある。しかしながら、好中
球エラスターゼの最も重要な阻害剤であるα１−PIは、
引き金を引かれたPMNsにより作られた酸素代謝により活
性中心（Met−358）において酸化を受けやすい。これ
は、約2000倍程、好中球エラスターゼについてのα１−
PIのアフィニティーを減少させる。
は、セリン・プロテアーゼ好中球エラスターゼ、カテプ
シンＧ及びプロテイナーゼ−３が、グルコサミノグリカ
ンと複合体を形成する活性酵素として包まれている。こ
れらの複合体は、不活性であるが、その活性酵素を放出
するための分泌の間に解離する。このプロテアーゼ活性
を中和するために、多量の阻害剤、α１−プロテイナー
ゼ阻害剤（α１−PI）及びα１−キモトリプシン阻害剤
（α１−ChI）が、血漿中にある。しかしながら、好中
球エラスターゼの最も重要な阻害剤であるα１−PIは、
引き金を引かれたPMNsにより作られた酸素代謝により活
性中心（Met−358）において酸化を受けやすい。これ
は、約2000倍程、好中球エラスターゼについてのα１−
PIのアフィニティーを減少させる。
α１−PIの局所的中和の後、エラスターゼは、他のタ
ンパク質分解酵素の多数の阻害剤を分解することができ
る。エラスターゼは、α１−ChIを解裂し、そしてそれ
により、カテプシンＧ活性を促進させる。また、それ
は、TIMPをも解裂させ、メタロプロテイナーゼによる組
織分解をもたらす。その上、エラスターゼは、アンチト
ロンビンIII及びヘパリン補因子II、並びに組織因子経
路阻害剤（TFPI）であって血塊形成をおそらく促進する
ものを、解裂させる。他方においては、好中球エラスタ
ーゼの血液凝固因子分解能力は、エラスターゼの全体的
な効果が明確にならなうように逆の効果をもていると推
定される。フィブリン溶解現象（fibrinolysis）に対す
る好中球エラスターゼの効果は、曖昧ではない。フィブ
リン溶解活性は、エラスターゼがプラスミノーゲン活性
物質阻害剤及びα２プラスミン阻害剤を解裂させる。な
お、これらの阻害剤の両方がO2代謝物質により酸化及び
不活性化される。
ンパク質分解酵素の多数の阻害剤を分解することができ
る。エラスターゼは、α１−ChIを解裂し、そしてそれ
により、カテプシンＧ活性を促進させる。また、それ
は、TIMPをも解裂させ、メタロプロテイナーゼによる組
織分解をもたらす。その上、エラスターゼは、アンチト
ロンビンIII及びヘパリン補因子II、並びに組織因子経
路阻害剤（TFPI）であって血塊形成をおそらく促進する
ものを、解裂させる。他方においては、好中球エラスタ
ーゼの血液凝固因子分解能力は、エラスターゼの全体的
な効果が明確にならなうように逆の効果をもていると推
定される。フィブリン溶解現象（fibrinolysis）に対す
る好中球エラスターゼの効果は、曖昧ではない。フィブ
リン溶解活性は、エラスターゼがプラスミノーゲン活性
物質阻害剤及びα２プラスミン阻害剤を解裂させる。な
お、これらの阻害剤の両方がO2代謝物質により酸化及び
不活性化される。
PMNsは、多量のセリン・プロテアーゼを含み、そして
白血球プロテアーゼのそれぞれ約200mgが体内の侵入性
剤を処理するために毎日放出されている。急性炎症は、
放出された酵素の量の多数倍の増加を導く。正常の条件
下、タンパク質分解は、多量の阻害剤α１−PI、α１−
ChI及びα２マクログロブリンにより許容される低レベ
ルにおいて保たれる。しかしながら、多くの慢性疾患が
PMNsの過剰刺激を原因とする病的なタンパク質分解によ
り引き起こされる、例えば、自己免疫応答、慢性感染、
タバコの煙又は他の刺激物等により引き起こされるとい
ういくつかの兆候がある。
白血球プロテアーゼのそれぞれ約200mgが体内の侵入性
剤を処理するために毎日放出されている。急性炎症は、
放出された酵素の量の多数倍の増加を導く。正常の条件
下、タンパク質分解は、多量の阻害剤α１−PI、α１−
ChI及びα２マクログロブリンにより許容される低レベ
ルにおいて保たれる。しかしながら、多くの慢性疾患が
PMNsの過剰刺激を原因とする病的なタンパク質分解によ
り引き起こされる、例えば、自己免疫応答、慢性感染、
タバコの煙又は他の刺激物等により引き起こされるとい
ういくつかの兆候がある。
アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤）は、トリ
プシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレイン
を含む各種のセリン・プロテアーゼを阻害することが知
られており、そおして急性膵臓塩、様々な症状のショッ
ク症候群、高フィブリン溶解性出血及び心筋梗塞（myoc
ardial infarction）の治療において治療的に使用され
る（例えば、J.E.Trapnell et al,Brit.J.Surg.61,197
4,p.177;J McMichan et al.,Circulatory Shock ９,198
2,p.107;L.M.Auer et al.,Acta Neurochir.49,1979,p.2
07;G.Sher,Am.J.Obstet.Gynecol.129,1977,p.164;及び
B.Schneider,Artzneim.−Forsch.26,1976,p.1606を参照
のこと。）。高い投与量におけるアプロチニンの投与
は、心肺バイパス手術を含む心臓外科手術に関する血液
損失を有意に減少させる（例えば、B.P.Bidstrup et a
l.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.97,1989,pp.364−372;W.
Van Oeveren et al.,Ann.Thorac.Surg.44,1987,pp.640
−645を参照のこと。）。先に証明されているが（H.R.W
enzel and H.Tschesche,Angew.Chem.Internat.Ed.20,19
81,p.295）、あるアプロチニン同族体、例えば、アプロ
チニン（１−58,Vall 5）が顆粒球エラスターゼについ
ての比較的高い選択性及びコラーゲナーゼに対する阻害
効果をもち、アプロチニン（１−58,Ala15）がエラスタ
ーゼに対する弱い効果をもち、一方、アプロチニン（３
−58,Arg15,Ala17,Ser42）が優れた血漿カリクレイン阻
害効果をもつ（WO 89/10374参照）。
プシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレイン
を含む各種のセリン・プロテアーゼを阻害することが知
られており、そおして急性膵臓塩、様々な症状のショッ
ク症候群、高フィブリン溶解性出血及び心筋梗塞（myoc
ardial infarction）の治療において治療的に使用され
る（例えば、J.E.Trapnell et al,Brit.J.Surg.61,197
4,p.177;J McMichan et al.,Circulatory Shock ９,198
2,p.107;L.M.Auer et al.,Acta Neurochir.49,1979,p.2
07;G.Sher,Am.J.Obstet.Gynecol.129,1977,p.164;及び
B.Schneider,Artzneim.−Forsch.26,1976,p.1606を参照
のこと。）。高い投与量におけるアプロチニンの投与
は、心肺バイパス手術を含む心臓外科手術に関する血液
損失を有意に減少させる（例えば、B.P.Bidstrup et a
l.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.97,1989,pp.364−372;W.
Van Oeveren et al.,Ann.Thorac.Surg.44,1987,pp.640
−645を参照のこと。）。先に証明されているが（H.R.W
enzel and H.Tschesche,Angew.Chem.Internat.Ed.20,19
81,p.295）、あるアプロチニン同族体、例えば、アプロ
チニン（１−58,Vall 5）が顆粒球エラスターゼについ
ての比較的高い選択性及びコラーゲナーゼに対する阻害
効果をもち、アプロチニン（１−58,Ala15）がエラスタ
ーゼに対する弱い効果をもち、一方、アプロチニン（３
−58,Arg15,Ala17,Ser42）が優れた血漿カリクレイン阻
害効果をもつ（WO 89/10374参照）。
しかしながら、インビボにおいて投与されたとき、ア
プロチニンは、ラット、ウサギ及びイヌにおいて、比較
的高い投与量のアプロチニンの反射注射の後に、腎臓毒
性効果をもつことが見つかった（Bayer,Trasylol,Inhib
itor of proteinase;E.Glaser et al.in“Verhandlunge
n der Deutschen Gesellschaft fuer Innere medizin,7
8.Kongress",Bergmann,Muenchen,1972,pp.1612−161
4）。このアプロチニンについて観察された腎臓毒性
（すなわち、病的形態での顕れ）は、その管の負電荷表
面に結合されることを引き起こすアプロチニンの正味の
高い正電荷の結果としての腎臓の基部の管細胞内でのア
プロチニンの蓄積に起因するかもしれない。この腎臓毒
性は、アプロチニンを、臨床目的に、特に、阻害剤の多
量の投与量を投与する必要があるようなもの（例えば、
心肺バイパス手術）に、好適でないものにしている。そ
の上、アプロチニンは、ウシのタンパク質であり、これ
は、それ故、ヒトへのアプロチニンの投与の間の不所望
の免疫応答を生じさせることができる１以上のエピトー
プを含むことができる。
プロチニンは、ラット、ウサギ及びイヌにおいて、比較
的高い投与量のアプロチニンの反射注射の後に、腎臓毒
性効果をもつことが見つかった（Bayer,Trasylol,Inhib
itor of proteinase;E.Glaser et al.in“Verhandlunge
n der Deutschen Gesellschaft fuer Innere medizin,7
8.Kongress",Bergmann,Muenchen,1972,pp.1612−161
4）。このアプロチニンについて観察された腎臓毒性
（すなわち、病的形態での顕れ）は、その管の負電荷表
面に結合されることを引き起こすアプロチニンの正味の
高い正電荷の結果としての腎臓の基部の管細胞内でのア
プロチニンの蓄積に起因するかもしれない。この腎臓毒
性は、アプロチニンを、臨床目的に、特に、阻害剤の多
量の投与量を投与する必要があるようなもの（例えば、
心肺バイパス手術）に、好適でないものにしている。そ
の上、アプロチニンは、ウシのタンパク質であり、これ
は、それ故、ヒトへのアプロチニンの投与の間の不所望
の免疫応答を生じさせることができる１以上のエピトー
プを含むことができる。
それ故に、本発明の目的は、アプロチニンと同型のヒ
ト・プロテアーゼ阻害剤（すなわち、Kunitz型阻害剤）
であって同様の阻害特性をもち又は所望の阻害特性を示
すように修飾されているものを同定することである。
ト・プロテアーゼ阻害剤（すなわち、Kunitz型阻害剤）
であって同様の阻害特性をもち又は所望の阻害特性を示
すように修飾されているものを同定することである。
発明の要約 本発明は、組織因子経路阻害剤（tissue factor path
way inhibitor（TFPI））のヒトKunitz型プロテアーゼ
阻害剤ドメインIIの変異体であって、以下のアミノ酸配
列： ｛ここで、X1がＨ又はCysを除く１−５の天然アミノ酸
残基であり、X2−X14がそれぞれ独立してCysを除く天然
アミノ酸残基を表し、そしてX15がOH又はCysを除く１−
５の天然アミノ酸残基である。但し、アミノ酸残基X1−
X15の中の少なくとも１が生来配列の対応アミノ酸残基
とは異なっている。｝を含んで成る変異体に関する。
way inhibitor（TFPI））のヒトKunitz型プロテアーゼ
阻害剤ドメインIIの変異体であって、以下のアミノ酸配
列： ｛ここで、X1がＨ又はCysを除く１−５の天然アミノ酸
残基であり、X2−X14がそれぞれ独立してCysを除く天然
アミノ酸残基を表し、そしてX15がOH又はCysを除く１−
５の天然アミノ酸残基である。但し、アミノ酸残基X1−
X15の中の少なくとも１が生来配列の対応アミノ酸残基
とは異なっている。｝を含んで成る変異体に関する。
本文においては、用語“天然アミノ酸残基”は、20の
一般的に生じたアミノ酸、すなわち、Ala、Val、leu、I
le、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Try、A
sn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg及びHisの中のいずれか１
つを示していると意図されている。
一般的に生じたアミノ酸、すなわち、Ala、Val、leu、I
le、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Try、A
sn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg及びHisの中のいずれか１
つを示していると意図されている。
外因性経路阻害剤（EPI）又はリポ蛋白関連血液凝固
阻害剤（LACI）としても知られている（TFPI）は、Broz
e et al.により単離され（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,
1987,pp.1886−1890及びEP 300 988）、そしてこのタン
パク質をコードしている遺伝子がクローン化されてい
る、EP 318 451を参照のこと。このタンパク質の２次構
造の分析は、このタンパク質が、アミノ酸22からアミノ
酸79まで（Ｉ）、アミノ酸93からアミノ酸150まで（I
I）及びアミノ酸185からアミノ酸242まで（III）の３つ
のKunitz型阻害剤のドメインをもつことを示した。TFPI
のKunitz型ドメインＩは、TF/F VII aに結合することが
示され、一方、TFPIのKunitz型ドメインIIは、F X aに
結合することが示された（Girard et al.,Nature 338,1
989,pp.518−520）。
阻害剤（LACI）としても知られている（TFPI）は、Broz
e et al.により単離され（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,
1987,pp.1886−1890及びEP 300 988）、そしてこのタン
パク質をコードしている遺伝子がクローン化されてい
る、EP 318 451を参照のこと。このタンパク質の２次構
造の分析は、このタンパク質が、アミノ酸22からアミノ
酸79まで（Ｉ）、アミノ酸93からアミノ酸150まで（I
I）及びアミノ酸185からアミノ酸242まで（III）の３つ
のKunitz型阻害剤のドメインをもつことを示した。TFPI
のKunitz型ドメインＩは、TF/F VII aに結合することが
示され、一方、TFPIのKunitz型ドメインIIは、F X aに
結合することが示された（Girard et al.,Nature 338,1
989,pp.518−520）。
先に示した１以上の位置において１以上のアミノ酸を
置換することにより、それが優先的に好中球エラスター
ゼ、カテプシンＧ及び／又はプロテーナーゼ−３を阻害
するようにTFPI Kunitz型ドメインIIの阻害特性を変更
することができる。その上、血液凝固又はフィブリン溶
解現象に関連する酵素（例えば、プラスミン又は血漿カ
リクレイン）又は補体カスケードを特異的に阻害する変
異体を構築することを可能とするとができる。
置換することにより、それが優先的に好中球エラスター
ゼ、カテプシンＧ及び／又はプロテーナーゼ−３を阻害
するようにTFPI Kunitz型ドメインIIの阻害特性を変更
することができる。その上、血液凝固又はフィブリン溶
解現象に関連する酵素（例えば、プラスミン又は血漿カ
リクレイン）又は補体カスケードを特異的に阻害する変
異体を構築することを可能とするとができる。
TFPI Kunitz型ドメインIIの１つの利点は、それが、
先に示したように強い正味の正電荷をもつアプロチニン
に対して正味の負電荷をもつことである。それ故、アプ
ロチニンよりも低い正味の正電荷をもつ本発明の変異体
を構築し、これにより、その変異体の大投与量の投与の
間の腎臓損傷の危険を減少することが可能である。他の
利点は、アプロチニンに対して、それが、ヒトへの投与
に対する不所望の免疫学的応答をかなり減少させるよう
なヒトのタンパク質（断片）であるということである。
先に示したように強い正味の正電荷をもつアプロチニン
に対して正味の負電荷をもつことである。それ故、アプ
ロチニンよりも低い正味の正電荷をもつ本発明の変異体
を構築し、これにより、その変異体の大投与量の投与の
間の腎臓損傷の危険を減少することが可能である。他の
利点は、アプロチニンに対して、それが、ヒトへの投与
に対する不所望の免疫学的応答をかなり減少させるよう
なヒトのタンパク質（断片）であるということである。
発明の詳細な開示 TFPIのKunitz型ドメインIIの好ましい変異体の例は： X1がLys−Proであり；又は X2がAla、Arg、Thr、Asp、Pro、Glu、Lys、Gln、Ser、I
le及びValから成る群から選ばれたアミノ酸残基であ
り、特にX2がThr又はProであり；又は X3がPro、Thr、Leu、Arg、Val及びIleから成る群から選
ばれたアミノ酸残基であり、特にX3がPro又はIleであ
り；又は X4がLys、Arg、Val、Thr、Ile、Leu、Phe、Gly、Ser、M
et、Trp、Tyr、Gln、Asn及びAlaから成る群から選ばれ
たアミノ酸残基であり、特にX4がLys、Val、Leu、Ile、
Thr、Met、Gln又はArgであり；又は X5がAla、Gly、Thr、Arg、Phe、Gln及びAspから成る群
から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX5がAla、Thr、
Asp又はGlyであり；又は X6がArg、Ala、Lys、Leu、Gly、His、Ser、Asp、Gln、G
lu、Val、Thr、Tyr、Phe、Asn、Ile及びMetから成る群
から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX6がArg、Phe、
Ala、Leu又はTyrであり；又は X7がIle、Met、Gln、Glu、Thr、Leu、Val及びPheから成
る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX7がIleで
あり；又は X8がIle、Thr、Leu、Asn、Lys、Ser、Gln、Glu、Arg、P
ro及びPheから成る群から選ばれたアミノ酸残基であ
り、特にX8がIle又はThrであり；又は X9がArg、Ser、Ala、Gln、Lys及びLeuから成る群から選
ばれたアミノ酸残基であり、特にX9がArgであり；又は X10がGln、Pro、Phe、Ile、Lys、Trp、Ala、Thr、Leu、
Ser、Tyr、His、Asp、Met、Arg及びValから成る群から
選ばれたアミノ酸残基であり、特にX10がVal又はLysで
あり；又は X11がGly、Met、Gln、Glu、Leu、Arg、Lys、Pro及びAsn
から成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX11
がArg又はLeuであり；又は X12がAla又はGlyであり；又は X13がLys、Asn及びAspから成る群から選ばれたアミノ酸
残基であり、特にX13がLys又はAsnであり；又は X14がVal、Tyr、Asp、Glu、Thr、Gly、Leu、Ser、Ile、
Gln、His、Asn、Pro、Phe、Met、Ala、Arg、Trp及びLys
から成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX14
がLys又はGluであり；又は X15がGlyである変異体である。好ましい態様において
は、X1がLys−Proであり、そしてX15がGlyであり、一方
X2−X14が先に定めたものである。
le及びValから成る群から選ばれたアミノ酸残基であ
り、特にX2がThr又はProであり；又は X3がPro、Thr、Leu、Arg、Val及びIleから成る群から選
ばれたアミノ酸残基であり、特にX3がPro又はIleであ
り；又は X4がLys、Arg、Val、Thr、Ile、Leu、Phe、Gly、Ser、M
et、Trp、Tyr、Gln、Asn及びAlaから成る群から選ばれ
たアミノ酸残基であり、特にX4がLys、Val、Leu、Ile、
Thr、Met、Gln又はArgであり；又は X5がAla、Gly、Thr、Arg、Phe、Gln及びAspから成る群
から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX5がAla、Thr、
Asp又はGlyであり；又は X6がArg、Ala、Lys、Leu、Gly、His、Ser、Asp、Gln、G
lu、Val、Thr、Tyr、Phe、Asn、Ile及びMetから成る群
から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX6がArg、Phe、
Ala、Leu又はTyrであり；又は X7がIle、Met、Gln、Glu、Thr、Leu、Val及びPheから成
る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX7がIleで
あり；又は X8がIle、Thr、Leu、Asn、Lys、Ser、Gln、Glu、Arg、P
ro及びPheから成る群から選ばれたアミノ酸残基であ
り、特にX8がIle又はThrであり；又は X9がArg、Ser、Ala、Gln、Lys及びLeuから成る群から選
ばれたアミノ酸残基であり、特にX9がArgであり；又は X10がGln、Pro、Phe、Ile、Lys、Trp、Ala、Thr、Leu、
Ser、Tyr、His、Asp、Met、Arg及びValから成る群から
選ばれたアミノ酸残基であり、特にX10がVal又はLysで
あり；又は X11がGly、Met、Gln、Glu、Leu、Arg、Lys、Pro及びAsn
から成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX11
がArg又はLeuであり；又は X12がAla又はGlyであり；又は X13がLys、Asn及びAspから成る群から選ばれたアミノ酸
残基であり、特にX13がLys又はAsnであり；又は X14がVal、Tyr、Asp、Glu、Thr、Gly、Leu、Ser、Ile、
Gln、His、Asn、Pro、Phe、Met、Ala、Arg、Trp及びLys
から成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にX14
がLys又はGluであり；又は X15がGlyである変異体である。好ましい態様において
は、X1がLys−Proであり、そしてX15がGlyであり、一方
X2−X14が先に定めたものである。
本発明のTFPI kunitz型ドメインIIの変異体は、好ま
しくは、プロテアーゼ結合領域内にMet残基（すなわ
ち、X3−X14により提示されるアミノ酸残基）を含んで
はならない。先に記載したα１−PIへの類似性により、
これらの位置の中のいずれか１内のMet残基は、PMNsに
より作られた酸素代謝物による酸化的不活性化に感受性
のある阻害剤を作るであろうし、そして反対に、これら
の位置内のMet残基の欠如は、このような酸素代謝物の
存在中でその阻害剤をより安定にするはずである。
しくは、プロテアーゼ結合領域内にMet残基（すなわ
ち、X3−X14により提示されるアミノ酸残基）を含んで
はならない。先に記載したα１−PIへの類似性により、
これらの位置の中のいずれか１内のMet残基は、PMNsに
より作られた酸素代謝物による酸化的不活性化に感受性
のある阻害剤を作るであろうし、そして反対に、これら
の位置内のMet残基の欠如は、このような酸素代謝物の
存在中でその阻害剤をより安定にするはずである。
TFPI Kunitz型ドメインII変異体が宿主細胞により作
られたとき糖添加（glycosylated）されるところの方法
を変更することが要求されることができる。したがっ
て、ある態様においては、本発明の変異体は、以下のア
ミノ酸配列をもつことができる： ｛ここで、X1−X15が請求項１中に示すものと同じであ
り、X16がGln、Gly、Ala、Ser、Val及びPheから成る群
から選ばれたアミノ酸残基であり、特にGln又はAlaであ
り、そしてX17がThr又はAlaから成る群から選ばれたア
ミノ酸残基である。｝。
られたとき糖添加（glycosylated）されるところの方法
を変更することが要求されることができる。したがっ
て、ある態様においては、本発明の変異体は、以下のア
ミノ酸配列をもつことができる： ｛ここで、X1−X15が請求項１中に示すものと同じであ
り、X16がGln、Gly、Ala、Ser、Val及びPheから成る群
から選ばれたアミノ酸残基であり、特にGln又はAlaであ
り、そしてX17がThr又はAlaから成る群から選ばれたア
ミノ酸残基である。｝。
本発明の目下好ましい変異体は、Kunitzドメインのプ
ロテアーゼ結合部位に位置する１以上のアミノ酸残基
（すなわち、アプロチニンの13、15、16、17、18、19、
20、34、39、40、41及び46位に対応するX3−X14の中の
１以上）が生来のアプロチニンの同一位内に存在するア
ミノ酸に置換されているようなものである。このような
変異体の例は： である。
ロテアーゼ結合部位に位置する１以上のアミノ酸残基
（すなわち、アプロチニンの13、15、16、17、18、19、
20、34、39、40、41及び46位に対応するX3−X14の中の
１以上）が生来のアプロチニンの同一位内に存在するア
ミノ酸に置換されているようなものである。このような
変異体の例は： である。
他の態様においては、本発明は、本発明に係るヒトKu
nitz型阻害剤ドメイン変異体をコードしているDNA構築
物に関する。本発明のDNA構築物は、確立された標準的
な方法により、例えば、S.L.Beaucage and M.H.Caruthe
rs,Tetrahedron Letters 22,1981,pp.1859−1869により
記載されているようなホスホアミジット法、又はMatthe
s et al.,EMBO Journal ３,1984,pp.801−805により記
載されているような方法により、合成的に、製造される
ことができる。上記ホスホアミジット法に従って、オリ
ゴヌクレオチドを、例えば、自動DNA合成装置内で合成
し、精製し、アニールし、連結し、そして好適なベクタ
ー内でクローン化される。
nitz型阻害剤ドメイン変異体をコードしているDNA構築
物に関する。本発明のDNA構築物は、確立された標準的
な方法により、例えば、S.L.Beaucage and M.H.Caruthe
rs,Tetrahedron Letters 22,1981,pp.1859−1869により
記載されているようなホスホアミジット法、又はMatthe
s et al.,EMBO Journal ３,1984,pp.801−805により記
載されているような方法により、合成的に、製造される
ことができる。上記ホスホアミジット法に従って、オリ
ゴヌクレオチドを、例えば、自動DNA合成装置内で合成
し、精製し、アニールし、連結し、そして好適なベクタ
ー内でクローン化される。
あるいは、TFPI Kunitz型ドメインIIをコードしてい
るゲノム又はcDNA（例えば、合成オリゴヌクレオチド・
プローブを使用してTFPIをコーディングしているDNAに
ついてゲノム又はcDNAライブラリーをスクリーニング
し、そしてそれらからドメインIIをコーディングしてい
るDNA配列を単離することにより得られる）を使用する
ことが可能である。このDNA配列は、アミノ酸置換を、
例えば、よく知られた手順に従って相同的組換えのため
の望ましいアミノ酸配列をエンコードしている合成オリ
ゴヌクレオチドを使用した部位指定突然変異誘発により
導入することが望ましいところの部位に対応する１以上
の部位において、修飾される。
るゲノム又はcDNA（例えば、合成オリゴヌクレオチド・
プローブを使用してTFPIをコーディングしているDNAに
ついてゲノム又はcDNAライブラリーをスクリーニング
し、そしてそれらからドメインIIをコーディングしてい
るDNA配列を単離することにより得られる）を使用する
ことが可能である。このDNA配列は、アミノ酸置換を、
例えば、よく知られた手順に従って相同的組換えのため
の望ましいアミノ酸配列をエンコードしている合成オリ
ゴヌクレオチドを使用した部位指定突然変異誘発により
導入することが望ましいところの部位に対応する１以上
の部位において、修飾される。
さらなる態様においては、本発明は、本発明のDNA構
築物を含んで成る組換え発現ベクターに関する。この組
換え発現ベクターは、便利には組換えDNA手順に供され
ることができるベクターのいずれかあることができ、そ
してベクターの選択は、しばしば、それが導入されるべ
き宿主細胞に依存することができるであろう。したがっ
て、本ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色
体外存在物として存在するベクターであり、その複製は
染色体の複製と独立しているもの、例えば、プラスミド
である。あるいは、このベクターは、宿主細胞中に導入
されたとき、その宿主のゲノム中に組み込まれ、そして
それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるもの
であることができる。
築物を含んで成る組換え発現ベクターに関する。この組
換え発現ベクターは、便利には組換えDNA手順に供され
ることができるベクターのいずれかあることができ、そ
してベクターの選択は、しばしば、それが導入されるべ
き宿主細胞に依存することができるであろう。したがっ
て、本ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色
体外存在物として存在するベクターであり、その複製は
染色体の複製と独立しているもの、例えば、プラスミド
である。あるいは、このベクターは、宿主細胞中に導入
されたとき、その宿主のゲノム中に組み込まれ、そして
それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるもの
であることができる。
ベクター内においては、本発明のTFPI Kunitz型ドメ
インII変異体をエンコードしているDNA配列は、好適な
プロモーター配列に作用可能な状態で結合されなければ
ならない。このプロモーターは、選択された宿主細胞内
で転写活性を示すDNA配列のいずれかであることがで
き、そしてその宿主細胞に同種の又は異種のいずれかで
ある蛋白をエンコードしている遺伝子から得られること
ができる。哺乳類細胞における本発明のTFPI Kunitz型
ドメインII変異体をエンコードしているDNAの転写に向
けられるための好適なプロモーターの例は、SV 40プロ
モーター（Subramani et al.,Mol.Cell Biol.１,1981,p
p.854−864）、MT−１（メタロチオネイン遺伝子）プロ
モーター（Palmiter et al.,Science 222,1983,pp.809
−814）又はアデノウイルス２主要後期プロモーターで
ある。酵母宿主細胞における使用のための好適なプロモ
ーターは、酵母の解糖遺伝子（Hitzeman et al.,J.Bio
l.Chem.225,1980,pp.12073−12080;Alber and Kawasak
i,J.Mol.Appl.Gen.１,1982,pp.419−434）又はアルコー
ル・デヒドロゲナーゼ遺伝子（Young et al.,in Geneti
c Engineering of Microorganisms for Chemicals（Hol
laender et al,eds.）,Plenum Press,New York,1982）
からのプロモーター、又はTPI1（US 4,599,311）又はAD
H2−4c（Russell et al.,Nature 304,1983,pp.652−65
4）プロモーターを含む。糸状菌宿主細胞における使用
のために好適なプロモーターは、例えば、ADH3プロモー
ター（McKnight et al.,The EMBO J.４,1985,pp.2093−
2099）又はtpiAプロモーターである。
インII変異体をエンコードしているDNA配列は、好適な
プロモーター配列に作用可能な状態で結合されなければ
ならない。このプロモーターは、選択された宿主細胞内
で転写活性を示すDNA配列のいずれかであることがで
き、そしてその宿主細胞に同種の又は異種のいずれかで
ある蛋白をエンコードしている遺伝子から得られること
ができる。哺乳類細胞における本発明のTFPI Kunitz型
ドメインII変異体をエンコードしているDNAの転写に向
けられるための好適なプロモーターの例は、SV 40プロ
モーター（Subramani et al.,Mol.Cell Biol.１,1981,p
p.854−864）、MT−１（メタロチオネイン遺伝子）プロ
モーター（Palmiter et al.,Science 222,1983,pp.809
−814）又はアデノウイルス２主要後期プロモーターで
ある。酵母宿主細胞における使用のための好適なプロモ
ーターは、酵母の解糖遺伝子（Hitzeman et al.,J.Bio
l.Chem.225,1980,pp.12073−12080;Alber and Kawasak
i,J.Mol.Appl.Gen.１,1982,pp.419−434）又はアルコー
ル・デヒドロゲナーゼ遺伝子（Young et al.,in Geneti
c Engineering of Microorganisms for Chemicals（Hol
laender et al,eds.）,Plenum Press,New York,1982）
からのプロモーター、又はTPI1（US 4,599,311）又はAD
H2−4c（Russell et al.,Nature 304,1983,pp.652−65
4）プロモーターを含む。糸状菌宿主細胞における使用
のために好適なプロモーターは、例えば、ADH3プロモー
ター（McKnight et al.,The EMBO J.４,1985,pp.2093−
2099）又はtpiAプロモーターである。
また、本発明のTFPI Kunitz型ドメインII変異体をエ
ンコードしているDNA配列は、好適なターミネーター、
例えば、ヒト成長ホルモンのターミネーター（palmiter
et al.,op.cit.）又は（真菌宿主のための）TPI1（Alb
er and Kawasaki,op.cit.）又はADH3（McKnight et a
l.,op.cit.）プロモーターに作用可能な状態で連結され
ることができる。このベクターは、さらに、ポリアデニ
ル化シグナルのような要素（例えば、SV 40又はアデノ
ウイルス5 Elb領域からのもの）、転写エンハンサー配
列（例えば、SV 40エンハンサー）及び翻訳エンハンサ
ー配列（例えば、アデノウイルスVA RNAsをエンコード
しているもの）を、含んで成ることができる。
ンコードしているDNA配列は、好適なターミネーター、
例えば、ヒト成長ホルモンのターミネーター（palmiter
et al.,op.cit.）又は（真菌宿主のための）TPI1（Alb
er and Kawasaki,op.cit.）又はADH3（McKnight et a
l.,op.cit.）プロモーターに作用可能な状態で連結され
ることができる。このベクターは、さらに、ポリアデニ
ル化シグナルのような要素（例えば、SV 40又はアデノ
ウイルス5 Elb領域からのもの）、転写エンハンサー配
列（例えば、SV 40エンハンサー）及び翻訳エンハンサ
ー配列（例えば、アデノウイルスVA RNAsをエンコード
しているもの）を、含んで成ることができる。
本発明の組換え体発現ベクターは、さらに、そのベク
ターが問題の宿主細胞内で複製できるようにするDNA配
列を含んで成ることができる。このような配列の例（そ
の宿主細胞が哺乳類細胞であるとき）は、SV 40の複製
起点、又は（その宿主細胞が酵母細胞であるとき）酵母
プラスミド２μ複製遺伝子REP1−３及び複製起点であ
る。また、このベクターは、選択マーカー、例えば、そ
の生成物が宿主細胞内で欠損を補うような遺伝子、例え
ば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコーディング
している遺伝子又は薬剤、例えば、ネオマイシン、ハイ
グロマイシン又はメトトレキサートに対する耐性を与え
る遺伝子、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosa
ccharomyces pombe）のTPI遺伝子（P.R.Russell,Gene 4
0,1985,pp.125−130により記載されているようなもの）
を、含んで成ることができる。
ターが問題の宿主細胞内で複製できるようにするDNA配
列を含んで成ることができる。このような配列の例（そ
の宿主細胞が哺乳類細胞であるとき）は、SV 40の複製
起点、又は（その宿主細胞が酵母細胞であるとき）酵母
プラスミド２μ複製遺伝子REP1−３及び複製起点であ
る。また、このベクターは、選択マーカー、例えば、そ
の生成物が宿主細胞内で欠損を補うような遺伝子、例え
ば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコーディング
している遺伝子又は薬剤、例えば、ネオマイシン、ハイ
グロマイシン又はメトトレキサートに対する耐性を与え
る遺伝子、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosa
ccharomyces pombe）のTPI遺伝子（P.R.Russell,Gene 4
0,1985,pp.125−130により記載されているようなもの）
を、含んで成ることができる。
本発明のTFPI kunitz型ドメインII変異体をコーディ
ングしているDNA配列、それぞれ、そのプロモーター及
びターミネーターを連結するために、並びに複製のため
に必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入する
ために使用される手順は、当業者によく知られている
（例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989を参
照のこと。）。
ングしているDNA配列、それぞれ、そのプロモーター及
びターミネーターを連結するために、並びに複製のため
に必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入する
ために使用される手順は、当業者によく知られている
（例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989を参
照のこと。）。
本発明の発現ベクターが導入されるところの宿主細胞
は、本発明のTFPI Kunitz型ドメインII変異体を作るこ
とができる細胞のいずれかであることができ、そして好
ましくは、真核細胞、例えば、哺乳類の、酵母の又は真
菌の細胞である。
は、本発明のTFPI Kunitz型ドメインII変異体を作るこ
とができる細胞のいずれかであることができ、そして好
ましくは、真核細胞、例えば、哺乳類の、酵母の又は真
菌の細胞である。
本発明に従って宿主として使用される酵母生物は、培
養の間、多量の本発明のTFPI Kunitz型ドメインII変異
体を作る酵母生物のいずれかであることができる。好適
な酵母生物の例は、酵母種サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・クル
イベリ（Saccharomyces kluyveri）、シゾサッカロミセ
ズ・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）又はサッカ
ロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）の株であ
る。酵母細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形
成その後のそれ自耐公知のやり方での形質転換により、
行われることができる。
養の間、多量の本発明のTFPI Kunitz型ドメインII変異
体を作る酵母生物のいずれかであることができる。好適
な酵母生物の例は、酵母種サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・クル
イベリ（Saccharomyces kluyveri）、シゾサッカロミセ
ズ・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）又はサッカ
ロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）の株であ
る。酵母細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形
成その後のそれ自耐公知のやり方での形質転換により、
行われることができる。
好適な哺乳類細胞系の例は、COS（ATCC CRL 1650）、
BHK（ATCC CRL 1632,ATCC CCL 10）又はCHO（ATCC CCL
61）細胞系である。哺乳類細胞のトランスフェクト方法
及びその細胞内に導入されたDNA配列の発現方法は、例
えば、Kaufman and Sharp,J.Mol.Biol.159,1892,pp.601
−621;Southern and Berg,J.Mol.Appl.Genet.１,1982,p
p.327−341;Loyter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
9,1982,pp.422−426;Wigler et al.,Cell 14,1978,p.72
5;Corsaro and Pearson,Somatic Cell Genetics ７,198
1,p.603,Graham and van der Eb,Virology 52,1973,p.4
56;及びNeumann et al.,EMBO J.１,1982,pp.841−845の
中に記載されている。
BHK（ATCC CRL 1632,ATCC CCL 10）又はCHO（ATCC CCL
61）細胞系である。哺乳類細胞のトランスフェクト方法
及びその細胞内に導入されたDNA配列の発現方法は、例
えば、Kaufman and Sharp,J.Mol.Biol.159,1892,pp.601
−621;Southern and Berg,J.Mol.Appl.Genet.１,1982,p
p.327−341;Loyter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
9,1982,pp.422−426;Wigler et al.,Cell 14,1978,p.72
5;Corsaro and Pearson,Somatic Cell Genetics ７,198
1,p.603,Graham and van der Eb,Virology 52,1973,p.4
56;及びNeumann et al.,EMBO J.１,1982,pp.841−845の
中に記載されている。
あるいは、真菌細胞が、本発明の宿主細胞として使用
されるとができる。好適な真菌細胞の例は、糸状菌、例
えば、アスペルギルス（Aspergillus）種又はニューロ
スポラ（Neurospora）種の細胞、特に、アスペルギルス
・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス
・ニガー（Aspergillus niger）の株である。タンパク
質の発現のためのアスペルギルス（Aspergillus）種の
使用は、例えば、EP 238 023中に記載されている。
されるとができる。好適な真菌細胞の例は、糸状菌、例
えば、アスペルギルス（Aspergillus）種又はニューロ
スポラ（Neurospora）種の細胞、特に、アスペルギルス
・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス
・ニガー（Aspergillus niger）の株である。タンパク
質の発現のためのアスペルギルス（Aspergillus）種の
使用は、例えば、EP 238 023中に記載されている。
本発明は、さらに、本発明に係るTFPI Kunitz型ドメ
インII変異体の製造方法、すなわち、その変異体の発現
を誘導する条件下で先に記載したような細胞を培養し、
そして得られた変異体をその培養物から回収することを
含んで成る方法を含んで成る。
インII変異体の製造方法、すなわち、その変異体の発現
を誘導する条件下で先に記載したような細胞を培養し、
そして得られた変異体をその培養物から回収することを
含んで成る方法を含んで成る。
細胞を培養するために使用される培地は、その宿主細
胞の選択に依存して、哺乳類の細胞又は真菌（酵母を含
む）細胞を培養するために好適な慣用培地のいずれかで
あることができる。その変異体は、宿主細胞によりその
培養培地に分泌されるであろうし、そして遠心分離又は
濾過によるその培地からの細胞分離、塩例えば硫酸アン
モニウムによる上澄液又は濾液のタンパク質成分の沈
殿、様々なクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交
換クロマトグラフィー又はアフィニティー・クロマトグ
ラフィー等による精製を含む慣用の手順により、それか
ら回収されることができる。
胞の選択に依存して、哺乳類の細胞又は真菌（酵母を含
む）細胞を培養するために好適な慣用培地のいずれかで
あることができる。その変異体は、宿主細胞によりその
培養培地に分泌されるであろうし、そして遠心分離又は
濾過によるその培地からの細胞分離、塩例えば硫酸アン
モニウムによる上澄液又は濾液のタンパク質成分の沈
殿、様々なクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交
換クロマトグラフィー又はアフィニティー・クロマトグ
ラフィー等による精製を含む慣用の手順により、それか
ら回収されることができる。
また、本発明は、医薬として許容される担体又は賦形
剤と一緒に本発明のTFPI Kunitz型ドメインII変異体を
含んで成る医薬組成物に関する。本発明の組成物中で
は、本変異体は、医薬組成物の確立された配合方法のい
ずれか、例えば、Remington's Pharmaceutical Science
s,1985中に記載されているようなものにより、配合され
ることができる。本組成物は、典型的には、全身的注射
又は注入に好適な形態に在ることができ、そして滅菌水
又は等張性生理食塩水又はグルコース溶液により、その
ように、配合されることができる。
剤と一緒に本発明のTFPI Kunitz型ドメインII変異体を
含んで成る医薬組成物に関する。本発明の組成物中で
は、本変異体は、医薬組成物の確立された配合方法のい
ずれか、例えば、Remington's Pharmaceutical Science
s,1985中に記載されているようなものにより、配合され
ることができる。本組成物は、典型的には、全身的注射
又は注入に好適な形態に在ることができ、そして滅菌水
又は等張性生理食塩水又はグルコース溶液により、その
ように、配合されることができる。
本発明のTFPI Kunitz型ドメインII変異体は、それ
故、生来のアプロチニン又は他の阻害特性をもったアプ
ロチニン同族体、特により大きなアプロチニン投与量の
使用を必要とするもののために提案された治療的用途の
ための使用に有利であるべく、もくろまれている。ヒト
・セリン・プロテアーゼ、例えば、トリプシン、プラス
ミン、カリクレイン、エラスターゼ、カテプシンＧ及び
プロテイナーゼ−３を阻害するその能力の結果として本
発明の変異体の使用が示されているところの治療的用途
は、急性膵臓炎、炎症、血小板減少症（thrombocytopen
ia）、血小板機能の保存、臓器の保存、外傷の治癒、高
フィブリン溶解性出血を含むショック（ショック肺を含
む）及び症状、気腫（emphysema）、リウマチ様関節
炎、成人呼吸不全症候群、慢性炎症性内蔵疾患及び乾癬
（psoriasis）を、言い換えれば、引き金を引かれたPMN
sから放出されたエラスターゼ、カテプシンＧ及びプロ
テイナーゼ−３による病的なタンパク質分解により引き
起こされると推定される病気を含む（がこれに限定され
ない）。
故、生来のアプロチニン又は他の阻害特性をもったアプ
ロチニン同族体、特により大きなアプロチニン投与量の
使用を必要とするもののために提案された治療的用途の
ための使用に有利であるべく、もくろまれている。ヒト
・セリン・プロテアーゼ、例えば、トリプシン、プラス
ミン、カリクレイン、エラスターゼ、カテプシンＧ及び
プロテイナーゼ−３を阻害するその能力の結果として本
発明の変異体の使用が示されているところの治療的用途
は、急性膵臓炎、炎症、血小板減少症（thrombocytopen
ia）、血小板機能の保存、臓器の保存、外傷の治癒、高
フィブリン溶解性出血を含むショック（ショック肺を含
む）及び症状、気腫（emphysema）、リウマチ様関節
炎、成人呼吸不全症候群、慢性炎症性内蔵疾患及び乾癬
（psoriasis）を、言い換えれば、引き金を引かれたPMN
sから放出されたエラスターゼ、カテプシンＧ及びプロ
テイナーゼ−３による病的なタンパク質分解により引き
起こされると推定される病気を含む（がこれに限定され
ない）。
その上、本発明は、過剰刺激されたPMNsから放出され
たプロテアーゼによる病的なタンパク質分解と関連した
疾患又は症状の防止又は治療のための医薬の製造のため
に、先に記載したようなTFPI Kunitz型阻害剤ドメインI
I又はその変異体を使用することに関する。先に示した
ように、TFPI Kunitz型阻害剤ドメインII又は変異体と
同時にヘパリンを投与することが有利であることができ
る。
たプロテアーゼによる病的なタンパク質分解と関連した
疾患又は症状の防止又は治療のための医薬の製造のため
に、先に記載したようなTFPI Kunitz型阻害剤ドメインI
I又はその変異体を使用することに関する。先に示した
ように、TFPI Kunitz型阻害剤ドメインII又は変異体と
同時にヘパリンを投与することが有利であることができ
る。
先に示した医薬用途とは別に、先に特定したTFPI Kun
itz型ドメインII又はその変異体は、有用な天然物質、
例えば、ヒト材料からのプロテアーゼ又はレセプタであ
って例えばスクリーニング検定又はアフィニティー・ク
ロマトグラフィーによりTFPI Kunitz型ドメインIIに直
接又は間接的に結合するものを、単離するために使用さ
れることができる。
itz型ドメインII又はその変異体は、有用な天然物質、
例えば、ヒト材料からのプロテアーゼ又はレセプタであ
って例えばスクリーニング検定又はアフィニティー・ク
ロマトグラフィーによりTFPI Kunitz型ドメインIIに直
接又は間接的に結合するものを、単離するために使用さ
れることができる。
実施例 一般的方法 標準的なDNA技術を記載されているように行った（Sam
brook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.（1989）Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbo
r Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY）。合成オ
リゴヌクレオチドを、制御された細孔ガラス支持体上の
ホスホアミヂット化学を使用して自動DNA合成装置（380
B,Applied Biosystems）上で合成した（beaucage,S.L.,
and Caruthers,M.H.,Tetrahedron Letters 22，（198
1）1859−1869）。DNA配列決定を、ジデオキシ鎖停止技
術（sanger,F.,Micklen,S.,and Coulson,A.R.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 74（1977）5463−5467）により行っ
た。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、DNA Thermal Cyc
ler（Perkin Elmer Cetus）上で行った。
brook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.（1989）Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbo
r Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY）。合成オ
リゴヌクレオチドを、制御された細孔ガラス支持体上の
ホスホアミヂット化学を使用して自動DNA合成装置（380
B,Applied Biosystems）上で合成した（beaucage,S.L.,
and Caruthers,M.H.,Tetrahedron Letters 22，（198
1）1859−1869）。DNA配列決定を、ジデオキシ鎖停止技
術（sanger,F.,Micklen,S.,and Coulson,A.R.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 74（1977）5463−5467）により行っ
た。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、DNA Thermal Cyc
ler（Perkin Elmer Cetus）上で行った。
アミノ酸分析を、6M HCl中の110℃における加水分解
後、24時間真空シール・チューブ内で行った。分析を、
マイクロボア操作（microbore operation）について変
更されたBeckman 121MB自動アミノ酸分析装置上で行っ
た。
後、24時間真空シール・チューブ内で行った。分析を、
マイクロボア操作（microbore operation）について変
更されたBeckman 121MB自動アミノ酸分析装置上で行っ
た。
Ｎ−末端アミノ酸配列分析を、Applied Biosystems 4
70A気相シーケンサーを使用して自動エドマン分解によ
り得た。オンライン逆相HPLCによる分析を、それぞれの
シーケンサー・サイクルからの解放されたPTHアミノ酸
の検出及び定量化のために行った。
70A気相シーケンサーを使用して自動エドマン分解によ
り得た。オンライン逆相HPLCによる分析を、それぞれの
シーケンサー・サイクルからの解放されたPTHアミノ酸
の検出及び定量化のために行った。
分子量測定値を、約15cmのフライト・チューブを備
え、そしてポジティブ・モードにおいて操作されたBIO
−ION 20プラズマ脱着質量分析計（PDMS）上で得た。５
μｌのアリコットを、15kVまでの加速電圧設定において
分析し、そしてイオンを５ミリオンの分裂事象の間に回
収した。指定した分子イオンに対する確かさは、よい形
のピークについては、他の状態ではいくぶんより少ない
が、約0.1％であった。
え、そしてポジティブ・モードにおいて操作されたBIO
−ION 20プラズマ脱着質量分析計（PDMS）上で得た。５
μｌのアリコットを、15kVまでの加速電圧設定において
分析し、そしてイオンを５ミリオンの分裂事象の間に回
収した。指定した分子イオンに対する確かさは、よい形
のピークについては、他の状態ではいくぶんより少ない
が、約0.1％であった。
実施例１ 酵母株KEN−1593からの、組織因子経路阻害剤、TFPI−
２の第二Kunitzドメインの調製 完全長TFPIをエンコードしているcDNAを、ヒト肝臓由
来の細胞系HepG2（ATCC HB 8065）から単離し、そして
0.9kb BamH I−Xba I断片として哺乳類の発現ベクタ
ー、pKFN−1168中に、先に記載したように挿入した（Pe
dersen,A.H.,Nordfang,0.,Norris,F.,Wiberg,F.C.,Chri
stensen,P.M.,Moeller,K.B.,Meidahl−Pedersen,J.,Bec
k,T.C.,Norris,K.,Hedner,U.,and Kisiel,W.1990,J.Bio
l.Chem.265,16786−16793）。この挿入物のDNA配列を、
配列番号７中に与える。TFPI−２は、示されるように、
ヌクレオチド365−538によりエンコードされている。
２の第二Kunitzドメインの調製 完全長TFPIをエンコードしているcDNAを、ヒト肝臓由
来の細胞系HepG2（ATCC HB 8065）から単離し、そして
0.9kb BamH I−Xba I断片として哺乳類の発現ベクタ
ー、pKFN−1168中に、先に記載したように挿入した（Pe
dersen,A.H.,Nordfang,0.,Norris,F.,Wiberg,F.C.,Chri
stensen,P.M.,Moeller,K.B.,Meidahl−Pedersen,J.,Bec
k,T.C.,Norris,K.,Hedner,U.,and Kisiel,W.1990,J.Bio
l.Chem.265,16786−16793）。この挿入物のDNA配列を、
配列番号７中に与える。TFPI−２は、示されるように、
ヌクレオチド365−538によりエンコードされている。
TFPI−2:pKFN−1168からの0.9kbのBamH I−Xba I断片
の0.1μｇを、プライマーNOR−2526（GCTGAGAGATTGGAGA
AGAGAAAGCCAGATTTCTGCTT）及びNOR−2528（CTGGAATCTAG
ATTAACCATCTTCACAAATGTT）のそれぞれ100pモルを含むPC
R反応液中のテンプレートとして使用した。NOR−2526の
17の3'末端塩基は、配列番号７内のTFPI−２遺伝子内の
塩基365〜381と同一であり、そしてその21の5'末端塩基
は、以下に記載するpKFN−1000由来の合成リーダー遺伝
子内の塩基215〜235（図２を参照のこと。）と同一であ
る。プライマーNOR−2528は、配列番号７内の塩基521〜
540に相補的であり、そして翻訳終止コドンその後のXba
I部位を含む5'伸長をもつ。
の0.1μｇを、プライマーNOR−2526（GCTGAGAGATTGGAGA
AGAGAAAGCCAGATTTCTGCTT）及びNOR−2528（CTGGAATCTAG
ATTAACCATCTTCACAAATGTT）のそれぞれ100pモルを含むPC
R反応液中のテンプレートとして使用した。NOR−2526の
17の3'末端塩基は、配列番号７内のTFPI−２遺伝子内の
塩基365〜381と同一であり、そしてその21の5'末端塩基
は、以下に記載するpKFN−1000由来の合成リーダー遺伝
子内の塩基215〜235（図２を参照のこと。）と同一であ
る。プライマーNOR−2528は、配列番号７内の塩基521〜
540に相補的であり、そして翻訳終止コドンその後のXba
I部位を含む5'伸長をもつ。
PCR反応を、商業的キット（GeneAmp,Perkin Elmer Ce
tus）及び以下のサイクル:94℃において20秒間、50℃に
おいて20秒間、及び72℃において30秒間、を使用して10
0μｌの容量において行った。19サイクルの後、最終サ
イクルを行った。ここで、72℃の停止を10分間維持し
た。PCR生成物、すなわち、210塩基対の断片を、２％ア
ガロース・ゲル上の電気泳動により単離した。
tus）及び以下のサイクル:94℃において20秒間、50℃に
おいて20秒間、及び72℃において30秒間、を使用して10
0μｌの容量において行った。19サイクルの後、最終サ
イクルを行った。ここで、72℃の停止を10分間維持し
た。PCR生成物、すなわち、210塩基対の断片を、２％ア
ガロース・ゲル上の電気泳動により単離した。
シグナル−リーダー：以下に記載するpKEN−1000から
の0.7kb Pvu II断片の0.1μｇを、プライマーNOR−1478
（GTAAAACGACGGCCAGT）及びNOR−2523（TCTCTTCTCCAATC
TCTCAGC）のそれぞれ100pモルを含むPCR反応液中のテン
プレートとして使用した。NOR−1478は、配列番号９内
のEcoR I部位の直上流の配列にマッチングする。プライ
マーNOR−2523は、pKFN−1000の合成リーダー遺伝子の1
7の3'末端の塩基に相補的である。配列番号９を参照の
こと。PCR反応を、先に記載するように行い、257塩基対
の断片をもたらした。
の0.7kb Pvu II断片の0.1μｇを、プライマーNOR−1478
（GTAAAACGACGGCCAGT）及びNOR−2523（TCTCTTCTCCAATC
TCTCAGC）のそれぞれ100pモルを含むPCR反応液中のテン
プレートとして使用した。NOR−1478は、配列番号９内
のEcoR I部位の直上流の配列にマッチングする。プライ
マーNOR−2523は、pKFN−1000の合成リーダー遺伝子の1
7の3'末端の塩基に相補的である。配列番号９を参照の
こと。PCR反応を、先に記載するように行い、257塩基対
の断片をもたらした。
プラスミドpKFN−1000は、合成酵母シグナル−リーダ
ー・ペプチドをエンコードしているDNAを含むプラスミ
ドpTZ19Rの誘導体（Mead,D.A.,Szczesna−Skorupa,E.an
d Kemper,B.,Prot.Engin.１（1986）67−74）である。
プラスミドpKEN−1000は、WO 90/10075中に記載されて
いる。pKFN−1000のEcoR I部位から235塩基下流のDNA配
列及び合成酵母シグナル−リーダーのエンコードされた
アミノ酸配列を、配列番号９内に与えた。
ー・ペプチドをエンコードしているDNAを含むプラスミ
ドpTZ19Rの誘導体（Mead,D.A.,Szczesna−Skorupa,E.an
d Kemper,B.,Prot.Engin.１（1986）67−74）である。
プラスミドpKEN−1000は、WO 90/10075中に記載されて
いる。pKFN−1000のEcoR I部位から235塩基下流のDNA配
列及び合成酵母シグナル−リーダーのエンコードされた
アミノ酸配列を、配列番号９内に与えた。
シグナル−リーダー−TFPI−2:先に記載したような２
つのPCR断片のそれぞれ0.1μｇを、混合した、PCR反応
を、プライマーNOR−1478及びNOR−2528のそれぞれ100p
モルを、そして以下のサイクル:94℃において１分間、5
0℃において２分間、及び72℃において３分間を使用し
て行った。16サイクル後、最終サイクルを行った。ここ
で、72℃の段階を、10分間維持した。
つのPCR断片のそれぞれ0.1μｇを、混合した、PCR反応
を、プライマーNOR−1478及びNOR−2528のそれぞれ100p
モルを、そして以下のサイクル:94℃において１分間、5
0℃において２分間、及び72℃において３分間を使用し
て行った。16サイクル後、最終サイクルを行った。ここ
で、72℃の段階を、10分間維持した。
得られた422塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、pMT636か
らの9.5kb Nco I−Xba I断片及びpMT636からの1.4kb Nc
o I−EcoR I断片に連結した。プラスミドpMT636は、国
際特許出願第PCT/DK88/00138中に記載されている。
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、pMT636か
らの9.5kb Nco I−Xba I断片及びpMT636からの1.4kb Nc
o I−EcoR I断片に連結した。プラスミドpMT636は、国
際特許出願第PCT/DK88/00138中に記載されている。
pMT636は、シゾサッカロミセス・ポンベTPI遺伝子（P
OT）を含む大腸菌（E.coli）−サッカロミセス・セレビ
シエのシャトル・ベクター（Russell,P.R.,Gene 40（19
85）125−130）、サッカロミセス・セレビシエのトリオ
ースホスフェート・イソメラーゼのプロモーター及びタ
ーミネーター、TPIP及びTPIT（Alber,T.,and Kawasaki,
G.J.Mol.Appl.Gen.１（1982）,419−434）である。
OT）を含む大腸菌（E.coli）−サッカロミセス・セレビ
シエのシャトル・ベクター（Russell,P.R.,Gene 40（19
85）125−130）、サッカロミセス・セレビシエのトリオ
ースホスフェート・イソメラーゼのプロモーター及びタ
ーミネーター、TPIP及びTPIT（Alber,T.,and Kawasaki,
G.J.Mol.Appl.Gen.１（1982）,419−434）である。
この連結混合物を、コンピテント大腸菌株（r-,m+）
を形質転換するために使用し、アンピシリン耐性につい
て選択した。DNA配列決定は、得られたコロニーからの
プラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に正確
に融合されたTFPI−２のための正しいDNA配列を含んで
いたことを示した。
を形質転換するために使用し、アンピシリン耐性につい
て選択した。DNA配列決定は、得られたコロニーからの
プラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に正確
に融合されたTFPI−２のための正しいDNA配列を含んで
いたことを示した。
１つのプラスミドpKFN−1605を、さらなる使用のため
に選択した。プラスミドpKFN−1605の構築を、図１中に
説明する。
に選択した。プラスミドpKFN−1605の構築を、図１中に
説明する。
プラスミドpKFN−1605の発現カセットは、以下の配
列： TPIP−KFN1000シグナル−リーダー−TFPI2−TPIT を含む。
列： TPIP−KFN1000シグナル−リーダー−TFPI2−TPIT を含む。
pKFN−1605からの412塩基対のEcoR I−Xba I断片のDN
A配列を、配列表11中に示す。
A配列を、配列表11中に示す。
酵母の形質転換：サッカロミセス・セレビシエ株MT66
3（E2−7B XE11−36a/α，Δtpi/Δtpi,pep 4−3/pep 4
−３）を、YPGaL（１％ Bacto酵母エキス、２％Bactoペ
プトン、２％ガラクトース、１％ラクトース）上で600n
mにおける0.6の吸光度まで増殖させた。
3（E2−7B XE11−36a/α，Δtpi/Δtpi,pep 4−3/pep 4
−３）を、YPGaL（１％ Bacto酵母エキス、２％Bactoペ
プトン、２％ガラクトース、１％ラクトース）上で600n
mにおける0.6の吸光度まで増殖させた。
100mlの培養物を、遠心分離により収穫し、10mlの水
により洗浄し、再遠心分離し、そして1.2Mソルビトー
ル、25mM Na2EDTA pH＝8.0及び6.7mg/mlジチオトレイト
ールを含む溶液の10ml中に、再懸濁させた。この懸濁液
を、30℃において15分間インキュベートし、遠心分離
し、そして細胞を、1.2Mソルビトール、10mM Na2EDTA、
0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH＝5.8及び2mg Novozym
234を含む溶液の10ml中に、再懸濁させた。この懸濁液
を、30℃において10分間インキュベートし、遠心分離
し、その細胞を、遠心分離により回収し、10mlの1.2Mソ
ルビトール及び10mlのCAS（1.2Mソルビトール,10ml CaC
l2,10mM Tris HCl（Tris＝Tris（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン）pH＝7.5）中で洗浄し、そして2mlのCAS中
に再懸濁させた。形質転換のために、0.1mlのCAS−再懸
濁細胞を、約１μｇのプラスミドpKFN−1605と混合し、
そして室温において15分間放置した。1mlの（20％ポリ
エチレン・グリコール4000,20mM CaCl2,10mM CaCl2,10m
M Tris HCl,pH＝7.5）を、添加し、そしてその混合物を
さらに30分間室温において放置した。この混合物を遠心
分離し、そしてそのペレットを、0.1mlのSOS（1.2M ソ
ルビトール,33v/v％ YPD,6.7mM CaCl2,14μg/mlロイシ
ン）中に再懸濁させ、そして30℃において２時間インキ
ュベートした。次にこの懸濁液を遠心分離し、そしてそ
のペレットを0.5mlの1.2Mソルビトール中に再懸濁させ
た。次に、52℃における6mlの頂上寒天（Sherman et a
l.,（Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor
Laboratory（1982））のSC培地であって1.2Mソルビトー
ルに加え2.5％寒天を含むもの）を添加し、そして懸濁
液を、同一寒天固化のソルビトール含有培地を含むプレ
ート上に注いだ。
により洗浄し、再遠心分離し、そして1.2Mソルビトー
ル、25mM Na2EDTA pH＝8.0及び6.7mg/mlジチオトレイト
ールを含む溶液の10ml中に、再懸濁させた。この懸濁液
を、30℃において15分間インキュベートし、遠心分離
し、そして細胞を、1.2Mソルビトール、10mM Na2EDTA、
0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH＝5.8及び2mg Novozym
234を含む溶液の10ml中に、再懸濁させた。この懸濁液
を、30℃において10分間インキュベートし、遠心分離
し、その細胞を、遠心分離により回収し、10mlの1.2Mソ
ルビトール及び10mlのCAS（1.2Mソルビトール,10ml CaC
l2,10mM Tris HCl（Tris＝Tris（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン）pH＝7.5）中で洗浄し、そして2mlのCAS中
に再懸濁させた。形質転換のために、0.1mlのCAS−再懸
濁細胞を、約１μｇのプラスミドpKFN−1605と混合し、
そして室温において15分間放置した。1mlの（20％ポリ
エチレン・グリコール4000,20mM CaCl2,10mM CaCl2,10m
M Tris HCl,pH＝7.5）を、添加し、そしてその混合物を
さらに30分間室温において放置した。この混合物を遠心
分離し、そしてそのペレットを、0.1mlのSOS（1.2M ソ
ルビトール,33v/v％ YPD,6.7mM CaCl2,14μg/mlロイシ
ン）中に再懸濁させ、そして30℃において２時間インキ
ュベートした。次にこの懸濁液を遠心分離し、そしてそ
のペレットを0.5mlの1.2Mソルビトール中に再懸濁させ
た。次に、52℃における6mlの頂上寒天（Sherman et a
l.,（Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor
Laboratory（1982））のSC培地であって1.2Mソルビトー
ルに加え2.5％寒天を含むもの）を添加し、そして懸濁
液を、同一寒天固化のソルビトール含有培地を含むプレ
ート上に注いだ。
形質転換体コロニーを、30℃において３日間後、拾い
上げ、再単離し、そして液体培養を開始するために使用
した。１つのこのような形質転換体KFN−1593をさらな
る特徴付けのために選択した。
上げ、再単離し、そして液体培養を開始するために使用
した。１つのこのような形質転換体KFN−1593をさらな
る特徴付けのために選択した。
発酵：酵母株KFN−1593を、YPD培地（１％酵母エキ
ス、２％ペプトン（Difco Laboratoriesからのもの）、
及び３％グルコース）上で増殖させた。この株の１リッ
ター培養物を、24の650nmにおける吸光度まで30℃にお
いて振とうした。遠心分離後、その上澄液を単離した。
ス、２％ペプトン（Difco Laboratoriesからのもの）、
及び３％グルコース）上で増殖させた。この株の１リッ
ター培養物を、24の650nmにおける吸光度まで30℃にお
いて振とうした。遠心分離後、その上澄液を単離した。
精製：リン酸によりpH3.0に調整した酵母上澄（1000m
l）を、25mMのリン酸２水素ナトリウムにより平衡化し
たＳ−Sepharose fast Flowのカラム（Pharmacia,2.6 x
3.6cm）上に適用した。平衡化バッファーによる洗浄の
後、トリプシン阻害活性として検定されたTFPI−２を、
1M塩化ナトリウムを含むバッファー（40ml）により溶出
させた。脱塩を、炭酸水素アンモニウム,pH＝7.5により
平衡化され且つ溶出されたSephadex G−25カラム（Phar
macia,2.6 x 34cm）上で得た。さらなる精製を、25mMリ
ン酸２水素ナトリウム、10w/v％アセトニトリル、pH＝
3.5中の０から0.43Mまでの塩化ナトリウムの1ml/分にお
ける23分間にわたるグラジエント溶出により、Mono Sカ
ラム（Pharmacia,0.5 x 5cm）上で行った。Ｎ−グリコ
シル化TFPI−２及び非グリコシル化TFPI−２は、それぞ
れ、0.20M及び0.26Mにおける塩化ナトリウムにより溶出
した。非グリコシル化TFPI−２の最終精製を、０から50
％までのアセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸の1ml
/分において30分間にわたりグラジエント溶出によりC18
カラム（Novo Nordisk A/S,0.4 x 25cm）上の逆相HPLC
により行った。
l）を、25mMのリン酸２水素ナトリウムにより平衡化し
たＳ−Sepharose fast Flowのカラム（Pharmacia,2.6 x
3.6cm）上に適用した。平衡化バッファーによる洗浄の
後、トリプシン阻害活性として検定されたTFPI−２を、
1M塩化ナトリウムを含むバッファー（40ml）により溶出
させた。脱塩を、炭酸水素アンモニウム,pH＝7.5により
平衡化され且つ溶出されたSephadex G−25カラム（Phar
macia,2.6 x 34cm）上で得た。さらなる精製を、25mMリ
ン酸２水素ナトリウム、10w/v％アセトニトリル、pH＝
3.5中の０から0.43Mまでの塩化ナトリウムの1ml/分にお
ける23分間にわたるグラジエント溶出により、Mono Sカ
ラム（Pharmacia,0.5 x 5cm）上で行った。Ｎ−グリコ
シル化TFPI−２及び非グリコシル化TFPI−２は、それぞ
れ、0.20M及び0.26Mにおける塩化ナトリウムにより溶出
した。非グリコシル化TFPI−２の最終精製を、０から50
％までのアセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸の1ml
/分において30分間にわたりグラジエント溶出によりC18
カラム（Novo Nordisk A/S,0.4 x 25cm）上の逆相HPLC
により行った。
TFPI−２は、40％アセトニトリルにおいて溶出した。
精製生成物を、凍結乾燥させ、そして約200nMの濃度ま
で水中に再溶解させた。この溶液のアリコット・サンプ
ルを、アミノ酸組成（表１）、アミノ酸配列、分子量
（PDMS、実測:MW 6840.8、計算:6840.6）及びプロテア
ーゼ阻害活性について分析した。
精製生成物を、凍結乾燥させ、そして約200nMの濃度ま
で水中に再溶解させた。この溶液のアリコット・サンプ
ルを、アミノ酸組成（表１）、アミノ酸配列、分子量
（PDMS、実測:MW 6840.8、計算:6840.6）及びプロテア
ーゼ阻害活性について分析した。
実施例２ 酵母株KFN−1811からの［R15K,G16A,Y17R,T19I］−TFPI
−２の生産 プラスミドpKFN−1605からのTFPI−２をエンコードし
ている1.3kb Sph I−BamH I断片の0.1μｇを、２つのPC
R反応においてテンプレートとして使用した。第一PCR反
応においては、プライマーNOR−2022（GGAGTTTAGTGAACT
TGC）及びＭ−460（GTTATAAAAATACCTGATAATACGAGCTTTAC
ATATTCCAGGATC）のそれぞれ100pモルを使用した。第二P
CR反応においては、プライマーNOR−1495（TAAGTGGCTCA
GAATGA）及びＭ−459（GATCCTGGAATATGTAAAGCTCGTATTAT
CAGGTATTTTTATAAC）のそれぞれ100pモルを使用した。
−２の生産 プラスミドpKFN−1605からのTFPI−２をエンコードし
ている1.3kb Sph I−BamH I断片の0.1μｇを、２つのPC
R反応においてテンプレートとして使用した。第一PCR反
応においては、プライマーNOR−2022（GGAGTTTAGTGAACT
TGC）及びＭ−460（GTTATAAAAATACCTGATAATACGAGCTTTAC
ATATTCCAGGATC）のそれぞれ100pモルを使用した。第二P
CR反応においては、プライマーNOR−1495（TAAGTGGCTCA
GAATGA）及びＭ−459（GATCCTGGAATATGTAAAGCTCGTATTAT
CAGGTATTTTTATAAC）のそれぞれ100pモルを使用した。
NOR−2022は、Sph I部位の94塩基対下流の位置でプラ
イムする。Ｍ−460は、TFPI−2 DNA配列の263−307位
（配列番号11）に、６つのミスマッチを除き、相補的で
ある。NOR−1495は、BamH I部位から561塩基対上流の位
置でプライムする。Ｍ−459は、Ｍ−460に相補的であ
る。
イムする。Ｍ−460は、TFPI−2 DNA配列の263−307位
（配列番号11）に、６つのミスマッチを除き、相補的で
ある。NOR−1495は、BamH I部位から561塩基対上流の位
置でプライムする。Ｍ−459は、Ｍ−460に相補的であ
る。
PCR反応を、商業的キット（GeneAmp,Perkin Elmer Ce
tus）及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃に
おいて１分間、及び72℃において２分間、を使用して10
0μｌ容量において行った。24サイクル後、最終サイク
ルを行った。そこでは、その72℃段階が10分間維持され
た。このPCR生成物、すなわち、第一PCRからの444塩基
対断片及び第二からの285塩基対断片を、２％アガロー
ス・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２
つのPCR断片のそれぞれ約0.1μｇを、混合した。PCR反
応を、プライマーNOR−2022及びNOR−1495のそれぞれ10
0pモル及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃
において２分間及び72℃において３分間、を使用して行
った。22サイクルの後、最終サイクルを行った。そこ
で、72℃段階を10分間維持した。
tus）及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃に
おいて１分間、及び72℃において２分間、を使用して10
0μｌ容量において行った。24サイクル後、最終サイク
ルを行った。そこでは、その72℃段階が10分間維持され
た。このPCR生成物、すなわち、第一PCRからの444塩基
対断片及び第二からの285塩基対断片を、２％アガロー
ス・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２
つのPCR断片のそれぞれ約0.1μｇを、混合した。PCR反
応を、プライマーNOR−2022及びNOR−1495のそれぞれ10
0pモル及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃
において２分間及び72℃において３分間、を使用して行
った。22サイクルの後、最終サイクルを行った。そこ
で、72℃段階を10分間維持した。
得られた687塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、pMT636か
らの9.5kb Nco I−Xba I断片及びpMT636からの1.4kb Nc
o I−EcoR I断片に連結した。
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、pMT636か
らの9.5kb Nco I−Xba I断片及びpMT636からの1.4kb Nc
o I−EcoR I断片に連結した。
連結混合物を、コンピテント大腸菌（E.coli）株
（r-,m+）を形質転換するために使用し、アンピシリン
耐性について選択した。DNA配列は、得られたコロニー
からのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子
に融合された［R15K,G16A,Y17R,T19I］−TFPI−２のた
めの正しいDNA配列を含んでいたことを示した。
（r-,m+）を形質転換するために使用し、アンピシリン
耐性について選択した。DNA配列は、得られたコロニー
からのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子
に融合された［R15K,G16A,Y17R,T19I］−TFPI−２のた
めの正しいDNA配列を含んでいたことを示した。
１つのプラスミドpKFN−1798を、さらなる使用のため
に選択した。pKFN−1798からの412塩基対のEcoR I−Xba
I断片のDNA配列を、配列番号13中に示す。
に選択した。pKFN−1798からの412塩基対のEcoR I−Xba
I断片のDNA配列を、配列番号13中に示す。
プラスミドpKFN−1798を、実施例１中に記載したよう
な酵母株MT663内に形質転換し、酵母株KFN−1811を作っ
た。
な酵母株MT663内に形質転換し、酵母株KFN−1811を作っ
た。
YPD培地中での形質転換株KFN−1811の培養、上澄中の
［R15K,G16A,Y17R,T19I］−TFPI−２の分析、及び精製
を、実施例１中に記載したように行った。
［R15K,G16A,Y17R,T19I］−TFPI−２の分析、及び精製
を、実施例１中に記載したように行った。
実施例３ TFPI（ドメインII）KFN 1593によるセリン・プロテアー
ゼの阻害 KFN 1593を、実施例１中に記載したように酵母培養基
から精製した。KFN 1593の濃度を、１％ E280nm＝8.3及
びMw＝6500を使用して測定した。ブタ・トリプシンは、
Novo Nordisk（Bagsvaerd,Denmark）からのものであ
り、カリクレインは、Sigma Chemical Co（St.Louis,M
O,USA）からのものであり、ヒト・プラスミン及びヒト
・血漿カリクレインは、Kabi（Stockholm,Sweden）から
のものであった。
ゼの阻害 KFN 1593を、実施例１中に記載したように酵母培養基
から精製した。KFN 1593の濃度を、１％ E280nm＝8.3及
びMw＝6500を使用して測定した。ブタ・トリプシンは、
Novo Nordisk（Bagsvaerd,Denmark）からのものであ
り、カリクレインは、Sigma Chemical Co（St.Louis,M
O,USA）からのものであり、ヒト・プラスミン及びヒト
・血漿カリクレインは、Kabi（Stockholm,Sweden）から
のものであった。
ヒト好中球エラスターゼ及びカテプシンＧを、Baugh
and Travis（Biochemistry 15（1976）836−843）によ
り記載されているような方法に従ってPMNsの抽出物から
精製した。ペプチジル・ニトロアニリド基質、S2251、S
2586、S2266、S2302は、Kabi（Stockholm,Sweden）から
のものであった。M4765及びS7388は、Sigma Chemical C
o（St.Louis,MO,USA）からのものであり、そして及びFX
a−１は、NycoMed（Oslo,Norway）からのものである。
and Travis（Biochemistry 15（1976）836−843）によ
り記載されているような方法に従ってPMNsの抽出物から
精製した。ペプチジル・ニトロアニリド基質、S2251、S
2586、S2266、S2302は、Kabi（Stockholm,Sweden）から
のものであった。M4765及びS7388は、Sigma Chemical C
o（St.Louis,MO,USA）からのものであり、そして及びFX
a−１は、NycoMed（Oslo,Norway）からのものである。
セリン・プロテアーゼを、様々な濃度のKFN 1593と共
に30分間インキュベートした。次に、基質を添加し、そ
して残存プロテイナーゼ活性を、405nmにおいて測定し
た。この結果を、図２及び図３中に示す。
に30分間インキュベートした。次に、基質を添加し、そ
して残存プロテイナーゼ活性を、405nmにおいて測定し
た。この結果を、図２及び図３中に示す。
非修飾TFPI KunitzドメインII（KFN 1593）は、トリ
プシン（K1≒5 x 10-9M）及び因子Ｘ（K1＝150nM）の阻
害剤である。KFN 1593は、プラスミン及び好中球エラス
ターゼの中程度の阻害示すが、カテプシンＧ及びカリク
レインの阻害は、本質的に存在しない。
プシン（K1≒5 x 10-9M）及び因子Ｘ（K1＝150nM）の阻
害剤である。KFN 1593は、プラスミン及び好中球エラス
ターゼの中程度の阻害示すが、カテプシンＧ及びカリク
レインの阻害は、本質的に存在しない。
実施例４ 酵母株KFN−1867からの［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R］
−TFPI−２の生産 プラスミドpKFN−1798からの［R15K,G16A,Y17R,T19
I］−TFPI−２をエンコードしている1.3kb Sph I−BamH
I断片の0.1μｇを、２つのPCR反応においてテンプレー
トとして使用した。第一PCR反応においては、プライマ
ーNOR−2022（GGAGTTTAGTGAACTTGC）及びＭ−462（CCAG
TGTCTCAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC）のそれぞれ10
0pモルを使用した。第二PCR反応においては、プライマ
ーNOR−1495（TAAGTGGCTCAGAATGA）及びＭ−461（GGTGG
ATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTGAGACACTGG）のそれぞれ100
pモルを使用した。NOR−2022は、Sph I部位の94塩基対
下流の位置でプライムする。Ｍ−462は、TFPI−2 DNA配
列の341−380位（配列番号11）に、２つのミスマッチを
除き、相補的である。NOR−1495は、BamH I部位から561
塩基対上流の位置でプライムする。Ｍ−461は、Ｍ−462
に相補的である。
−TFPI−２の生産 プラスミドpKFN−1798からの［R15K,G16A,Y17R,T19
I］−TFPI−２をエンコードしている1.3kb Sph I−BamH
I断片の0.1μｇを、２つのPCR反応においてテンプレー
トとして使用した。第一PCR反応においては、プライマ
ーNOR−2022（GGAGTTTAGTGAACTTGC）及びＭ−462（CCAG
TGTCTCAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC）のそれぞれ10
0pモルを使用した。第二PCR反応においては、プライマ
ーNOR−1495（TAAGTGGCTCAGAATGA）及びＭ−461（GGTGG
ATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTGAGACACTGG）のそれぞれ100
pモルを使用した。NOR−2022は、Sph I部位の94塩基対
下流の位置でプライムする。Ｍ−462は、TFPI−2 DNA配
列の341−380位（配列番号11）に、２つのミスマッチを
除き、相補的である。NOR−1495は、BamH I部位から561
塩基対上流の位置でプライムする。Ｍ−461は、Ｍ−462
に相補的である。
PCR反応を、商業的キット（GeneAmp,Perkin Elmer Ce
tus）及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃に
おいて１分間、及び72℃において２分間、を使用して10
0μｌ容量において行った。24サイクル後、最終サイク
ルを行った。そこでは、その72℃段階が10分間維持され
た。このPCR生成物、すなわち、第一PCRからの518塩基
対断片及び第二からの209塩基対断片を、２％アガロー
ス・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２
つのPCR断片のそれぞれ約0.1μｇを、混合した。PCR反
応を、プライマーNOR−2022及びNOR−1495のそれぞれ10
0pモル及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃
において２分間及び72℃において３分間、を使用して行
った。22サイクルの後、最終サイクルを行った。そこ
で、72℃段階を10分間維持した。
tus）及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃に
おいて１分間、及び72℃において２分間、を使用して10
0μｌ容量において行った。24サイクル後、最終サイク
ルを行った。そこでは、その72℃段階が10分間維持され
た。このPCR生成物、すなわち、第一PCRからの518塩基
対断片及び第二からの209塩基対断片を、２％アガロー
ス・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２
つのPCR断片のそれぞれ約0.1μｇを、混合した。PCR反
応を、プライマーNOR−2022及びNOR−1495のそれぞれ10
0pモル及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃
において２分間及び72℃において３分間、を使用して行
った。22サイクルの後、最終サイクルを行った。そこ
で、72℃段階を10分間維持した。
得られた687塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、pMT636か
らの9.5kb Nco I−Xba I断片及びpMT636からの1.4kb Nc
o I−EcoR I断片に連結した。プラスミドpMT636は、実
施例１中に記載されている。
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、pMT636か
らの9.5kb Nco I−Xba I断片及びpMT636からの1.4kb Nc
o I−EcoR I断片に連結した。プラスミドpMT636は、実
施例１中に記載されている。
連結混合物を、コンピテント大腸菌（E.coli）株
（r-,m+）を形質転換するために使用し、アンピシリン
耐性について選択した。DNA配列は、得られたコロニー
からのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子
に融合された［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R］−TFPI−２
のための正しいDNA配列を含んでいたことを示した。
（r-,m+）を形質転換するために使用し、アンピシリン
耐性について選択した。DNA配列は、得られたコロニー
からのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子
に融合された［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R］−TFPI−２
のための正しいDNA配列を含んでいたことを示した。
１つのプラスミドpKFN−1861を、さらなる使用のため
に選択した。pKFN−1861からの412塩基対のEcoR I−Xba
I断片のDNA配列を、配列番号15中に示す。
に選択した。pKFN−1861からの412塩基対のEcoR I−Xba
I断片のDNA配列を、配列番号15中に示す。
プラスミドpKFN−1861を、実施例１中に記載したよう
な酵母株MT663内に形質転換し、酵母株KFN−1867を作っ
た。
な酵母株MT663内に形質転換し、酵母株KFN−1867を作っ
た。
YPD培地中での形質転換株KFN−1867の培養、上澄中の
［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R］−TFPI−２の分析、及び
精製を、実施例１中に記載したように行った。
［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R］−TFPI−２の分析、及び
精製を、実施例１中に記載したように行った。
実施例５ 酵母株KFN−1868からの［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R,E4
6K］−TFPI−２の生産 プラスミドpKFN−1798からの［R15K,G16A,Y17R,T19
I］−TFPI−２をエンコードしている1.3kb Sph I−BamH
I断片の0.1μｇを、２つのPCR反応においてテンプレー
トとして使用した。第一PCR反応においては、プライマ
ーNOR−2022（GGAGTTTAGTGAACTTGC）及びＭ−464（CCAG
TGTCTTAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC）のそれぞれ10
0pモルを使用した。第二PCR反応においては、プライマ
ーNOR−1495（TAAGTGGCTCAGAATGA）及びＭ−463（GGTGG
ATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTAAGACACTGG）のそれぞれ100
pモルを使用した。NOR−2022は、Sph I部位の94塩基対
下流の位置でプライムする。Ｍ−464は、TFPI−2 DNA配
列の341−380位（配列番号11）に、３つのミスマッチを
除き、相補的である。NOR−1495は、BamH I部位から561
塩基対上流の位置でプライムする。Ｍ−463は、Ｍ−464
に相補的である。
6K］−TFPI−２の生産 プラスミドpKFN−1798からの［R15K,G16A,Y17R,T19
I］−TFPI−２をエンコードしている1.3kb Sph I−BamH
I断片の0.1μｇを、２つのPCR反応においてテンプレー
トとして使用した。第一PCR反応においては、プライマ
ーNOR−2022（GGAGTTTAGTGAACTTGC）及びＭ−464（CCAG
TGTCTTAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC）のそれぞれ10
0pモルを使用した。第二PCR反応においては、プライマ
ーNOR−1495（TAAGTGGCTCAGAATGA）及びＭ−463（GGTGG
ATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTAAGACACTGG）のそれぞれ100
pモルを使用した。NOR−2022は、Sph I部位の94塩基対
下流の位置でプライムする。Ｍ−464は、TFPI−2 DNA配
列の341−380位（配列番号11）に、３つのミスマッチを
除き、相補的である。NOR−1495は、BamH I部位から561
塩基対上流の位置でプライムする。Ｍ−463は、Ｍ−464
に相補的である。
PCR反応を、商業的キット（GeneAmp,Perkin Elmer Ce
tus）及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃に
おいて１分間、及び72℃において２分間、を使用して10
0μｌ容量において行った。24サイクル後、最終サイク
ルを行った。そこでは、その72℃段階が10分間維持され
た。このPCR生成物、すなわち、第一PCRからの518塩基
対断片及び第二からの209塩基対断片を、２％アガロー
ス・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２
つのPCR断片のそれぞれ約0.1μｇを、混合した。PCR反
応を、プライマーNOR−2022及びNOR−1495のそれぞれ10
0pモル及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃
において２分間及び72℃において３分間、を使用して行
った。22サイクルの後、最終サイクルを行った。そこ
で、72℃段階を10分間維持した。
tus）及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃に
おいて１分間、及び72℃において２分間、を使用して10
0μｌ容量において行った。24サイクル後、最終サイク
ルを行った。そこでは、その72℃段階が10分間維持され
た。このPCR生成物、すなわち、第一PCRからの518塩基
対断片及び第二からの209塩基対断片を、２％アガロー
ス・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２
つのPCR断片のそれぞれ約0.1μｇを、混合した。PCR反
応を、プライマーNOR−2022及びNOR−1495のそれぞれ10
0pモル及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃
において２分間及び72℃において３分間、を使用して行
った。22サイクルの後、最終サイクルを行った。そこ
で、72℃段階を10分間維持した。
得られた687塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、pMT636か
らの9.5kb Nco I−Xba I断片及びpMT636からの1.4kb Nc
o I−EcoR I断片に連結した。プラスミドpMT636は、実
施例１中に記載されている。
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、pMT636か
らの9.5kb Nco I−Xba I断片及びpMT636からの1.4kb Nc
o I−EcoR I断片に連結した。プラスミドpMT636は、実
施例１中に記載されている。
連結混合物を、コンピテント大腸菌（E.coli）株
（r-,m+）を形質転換するために使用し、アンピシリン
耐性について選択した。DNA配列は、得られたコロニー
からのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子
に融合された［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R,E46K］−TFP
I−２のための正しいDNA配列を含んでいたことを示し
た。
（r-,m+）を形質転換するために使用し、アンピシリン
耐性について選択した。DNA配列は、得られたコロニー
からのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子
に融合された［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R,E46K］−TFP
I−２のための正しいDNA配列を含んでいたことを示し
た。
１つのプラスミドpKFN−1862を、さらなる使用のため
に選択した。pKFN−1862からの412塩基対のEcoR I−Xba
I断片のDNA配列を、配列番号17中に示す。
に選択した。pKFN−1862からの412塩基対のEcoR I−Xba
I断片のDNA配列を、配列番号17中に示す。
プラスミドpKFN−1862を、実施例１中に記載したよう
な酵母株MT663内に形質転換し、酵母株KFN−1868を作っ
た。
な酵母株MT663内に形質転換し、酵母株KFN−1868を作っ
た。
YPD培地中での形質転換株KFN−1868の培養、上澄中の
［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R,E46K］−TFPI−２の分
析、及び精製を、実施例１中に記載したように行った。
［R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R,E46K］−TFPI−２の分
析、及び精製を、実施例１中に記載したように行った。
実施例６ 15及び16位におけるTFPI−２の多突然変異 プラスミドpKFN−1605からのTFPI−２をエンコードし
ている1.3kb Sph I−BamH I断片の0.1μｇを、２つのPC
R反応においてテンプレートとして使用した。第一PCR反
応においては、プライマーNOR−2022（GGAGTTTAGTGAACT
TGC）及びＭ−749（AATACCTGGTAATATAA（C/G）Ｃ（C/
G）Ａ（A/C）ACATATTCCAGGATC）のそれぞれ100pモルを
使用した。第二PCR反応においては、プライマーNOR−14
95（TAAGTGGCTCAGAATGA）及びＭ−750（GATCCTGGAATATG
T（T/G）Ｔ（C/G）Ｇ（C/G）TTATATTACCAGGTATT）のそ
れぞれ100pモルを使用した。NOR−2022は、Sph I部位の
94塩基対下流の位置でプライムする。Ｍ−749は、TFPI
−2 DNA配列の263−299位（配列番号11）に、４つのミ
スマッチを除き、相補的である。NOR−1495は、BamH I
部位から561塩基対上流の位置でプライムする。Ｍ−750
は、Ｍ−749に相補的である。
ている1.3kb Sph I−BamH I断片の0.1μｇを、２つのPC
R反応においてテンプレートとして使用した。第一PCR反
応においては、プライマーNOR−2022（GGAGTTTAGTGAACT
TGC）及びＭ−749（AATACCTGGTAATATAA（C/G）Ｃ（C/
G）Ａ（A/C）ACATATTCCAGGATC）のそれぞれ100pモルを
使用した。第二PCR反応においては、プライマーNOR−14
95（TAAGTGGCTCAGAATGA）及びＭ−750（GATCCTGGAATATG
T（T/G）Ｔ（C/G）Ｇ（C/G）TTATATTACCAGGTATT）のそ
れぞれ100pモルを使用した。NOR−2022は、Sph I部位の
94塩基対下流の位置でプライムする。Ｍ−749は、TFPI
−2 DNA配列の263−299位（配列番号11）に、４つのミ
スマッチを除き、相補的である。NOR−1495は、BamH I
部位から561塩基対上流の位置でプライムする。Ｍ−750
は、Ｍ−749に相補的である。
PCR反応を、商業的キット（GeneAmp,Perkin Elmer Ce
tus）及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃に
おいて１分間、及び72℃において２分間、を使用して10
0μｌ容量において行った。24サイクル後、最終サイク
ルを行った。そこでは、その72℃段階が10分間維持され
た。このPCR生成物、すなわち、第一PCRからの439塩基
対断片及び第二からの285塩基対断片を、２％アガロー
ス・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２
つのPCR断片のそれぞれ約0.1μｇを、混合した。PCR反
応を、プライマーNOR−2022及びNOR−1495のそれぞれ10
0pモル及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃
において２分間及び72℃において３分間、を使用して行
った。22サイクルの後、最終サイクルを行った。そこ
で、72℃段階を10分間維持した。
tus）及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃に
おいて１分間、及び72℃において２分間、を使用して10
0μｌ容量において行った。24サイクル後、最終サイク
ルを行った。そこでは、その72℃段階が10分間維持され
た。このPCR生成物、すなわち、第一PCRからの439塩基
対断片及び第二からの285塩基対断片を、２％アガロー
ス・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２
つのPCR断片のそれぞれ約0.1μｇを、混合した。PCR反
応を、プライマーNOR−2022及びNOR−1495のそれぞれ10
0pモル及び以下のサイクル:95℃において１分間、50℃
において２分間及び72℃において３分間、を使用して行
った。22サイクルの後、最終サイクルを行った。そこ
で、72℃段階を10分間維持した。
得られた687塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、プラスミ
ドpTZ19R（Mead,D.A.,Szczesna−Skopura,E.,and Kempe
r,B.Port.Engin.１（1986）67−74）からの2.8kb EcoR
I−Xba I断片に連結した。
の電気泳動により精製し、そして次に、EcoR I及びXba
Iにより消化した。得られた412塩基対断片を、プラスミ
ドpTZ19R（Mead,D.A.,Szczesna−Skopura,E.,and Kempe
r,B.Port.Engin.１（1986）67−74）からの2.8kb EcoR
I−Xba I断片に連結した。
連結混合物を、コンピテント大腸菌（E.coli）株
（r-,m+）を形質転換するために使用し、アンピシリン
耐性について選択した。DNA配列決定により、合成酵母
シグナル−リーダー遺伝子に融合された表示TFPI−２同
族体をエンコードしている以下の６つのプラスミドを、
同定した： プラスミド 同族体 pKFN−1885 ［R15F］−TFPI−２ pKFN−1883 ［R15F,G16A］−TFPI−２ pKFN−1905 ［R15L］−TFPI−２ pKFN−1882 ［R15L,G16A］−TFPI−２ pKFN−1887 ［R15V］−TFPI−２ pKFN−1886 ［R15V,G16A］−TFPI−２ これらのプラスミドからの412塩基対のEcoR I−Xba I
断片を、実施例１中に記載した発現プラスミドの構築の
ために使用した。
（r-,m+）を形質転換するために使用し、アンピシリン
耐性について選択した。DNA配列決定により、合成酵母
シグナル−リーダー遺伝子に融合された表示TFPI−２同
族体をエンコードしている以下の６つのプラスミドを、
同定した： プラスミド 同族体 pKFN−1885 ［R15F］−TFPI−２ pKFN−1883 ［R15F,G16A］−TFPI−２ pKFN−1905 ［R15L］−TFPI−２ pKFN−1882 ［R15L,G16A］−TFPI−２ pKFN−1887 ［R15V］−TFPI−２ pKFN−1886 ［R15V,G16A］−TFPI−２ これらのプラスミドからの412塩基対のEcoR I−Xba I
断片を、実施例１中に記載した発現プラスミドの構築の
ために使用した。
実施例１中に記載したような酵母株MT663の形質転換
は、以下の酵母株をもたらした： 酵母株 同族体 KFN−1896 ［R15F］−TFPI−２ KFN−1894 ［R15F,G16A］−TFPI−２ KFN−1928 ［R15L］−TFPI−２ KFN−1893 ［R15L,G16A］−TFPI−２ KFN−1898 ［R15V］−TFPI−２ KFN−1897 ［R15V,G16A］−TFPI−２ YPD培地中での形質転換酵母株の培養、上澄中のTFPI
−２同族体についての分析、及び精製を、実施例１中に
記載したように行った。
は、以下の酵母株をもたらした： 酵母株 同族体 KFN−1896 ［R15F］−TFPI−２ KFN−1894 ［R15F,G16A］−TFPI−２ KFN−1928 ［R15L］−TFPI−２ KFN−1893 ［R15L,G16A］−TFPI−２ KFN−1898 ［R15V］−TFPI−２ KFN−1897 ［R15V,G16A］−TFPI−２ YPD培地中での形質転換酵母株の培養、上澄中のTFPI
−２同族体についての分析、及び精製を、実施例１中に
記載したように行った。
実施例８ TFPI（ドメインII）KFN 1811、1867及び1868によるセリ
ン・プロテアーゼの阻害 ３つのTFPI（ドメインII）変異体を、酵母培養基から
精製した。これらの濃度を、標準としてBPTIを使用して
214nmにおける吸光度から測定した。最終濃度を、トリ
プシンによる滴定により測定した。ブタ・トリプシン及
びヒト組換えタンパク質、因子VII a、活性化プロテイ
ンＣ（ACP）、及びtPAを、Novo Nordisk A/S（Bagsvaer
d,Denmark）から得た。ヒト・トロンビンも同様であっ
た。ウシ・キモトリプシン及び顆粒カリクレインを、Si
gma Chemical Co.（St.Louis,MO,USA）から得た。切り
詰められたヒト組換え組織因子を、Corvas（San Diego,
CA,USA）から得た。ヒト好中球カテプシンＧを、Baugh
and Travisにより記載されている方法（Biochemistry 1
5（1976）836−843）に従ってPMNsの抽出物から精製し
た。ヒト・プラスミンはKabi（Stockholm,Sweden）から
のものであり、uPAは、Serono（Milan,Italy）からのも
のであり、ヒト因子Xaは、Dr.W.Kisiel（Albuquerque,N
M,USA）からの贈り物であり、そしてヒト血漿カリクレ
インは、Dr.I Schousboe（Copenhagen,Denmark）からの
贈り物であった。
ン・プロテアーゼの阻害 ３つのTFPI（ドメインII）変異体を、酵母培養基から
精製した。これらの濃度を、標準としてBPTIを使用して
214nmにおける吸光度から測定した。最終濃度を、トリ
プシンによる滴定により測定した。ブタ・トリプシン及
びヒト組換えタンパク質、因子VII a、活性化プロテイ
ンＣ（ACP）、及びtPAを、Novo Nordisk A/S（Bagsvaer
d,Denmark）から得た。ヒト・トロンビンも同様であっ
た。ウシ・キモトリプシン及び顆粒カリクレインを、Si
gma Chemical Co.（St.Louis,MO,USA）から得た。切り
詰められたヒト組換え組織因子を、Corvas（San Diego,
CA,USA）から得た。ヒト好中球カテプシンＧを、Baugh
and Travisにより記載されている方法（Biochemistry 1
5（1976）836−843）に従ってPMNsの抽出物から精製し
た。ヒト・プラスミンはKabi（Stockholm,Sweden）から
のものであり、uPAは、Serono（Milan,Italy）からのも
のであり、ヒト因子Xaは、Dr.W.Kisiel（Albuquerque,N
M,USA）からの贈り物であり、そしてヒト血漿カリクレ
インは、Dr.I Schousboe（Copenhagen,Denmark）からの
贈り物であった。
ペプチジル・ニトロアニリド基質、S2251、S2302、S2
266、S2586、S2288、S2444、S2366、及びS2238は、Kabi
（Stockholm,Sweden）からのものであった。S7388及びM
4765はSigma Chemical Co.（St.Louis,MO,USA）からの
ものであり、そしてFXa−１はNycomed（Oslo,Norway）
からのものであった。
266、S2586、S2288、S2444、S2366、及びS2238は、Kabi
（Stockholm,Sweden）からのものであった。S7388及びM
4765はSigma Chemical Co.（St.Louis,MO,USA）からの
ものであり、そしてFXa−１はNycomed（Oslo,Norway）
からのものであった。
セリン・プロテイナーゼを、様々な濃度のKunitzドメ
イン変異体と共に30分間インキュベートした。次に基質
（0.6mM）を添加し、そして残存プロテイナーゼ活性
を、405nmにおいて測定した。結果を表１中に示す。
イン変異体と共に30分間インキュベートした。次に基質
（0.6mM）を添加し、そして残存プロテイナーゼ活性
を、405nmにおいて測定した。結果を表１中に示す。
３つの変異体が、強い特異的プラスミン阻害剤であ
り、テストされた血漿からの他のプロテイナーゼの有意
な阻害はなかった。
り、テストされた血漿からの他のプロテイナーゼの有意
な阻害はなかった。
実施例９ TFPI（ドメインII）KFN 1893、1897、1898及び1928によ
るセリン・プロテアーゼの阻害 ４つの変異体を、酵母培養基から精製した。これらの
濃度を、標準としてBTPIを使用して214nmにおける吸光
度から測定した。ブタ・トリプシンを、Novo Nordisk A
/S（Bagsvaerd,Denmark）から得、ウシ・キモトリプシ
ン（TLCK処理）を、Sigma Chemical Co.（St.Louis,MO,
USA）から得た。切り詰められたヒト組換え組織因子
を、Corvas（San Diego,CA,USA）から得た。ヒト・プラ
スミンはKabi（Stockholm,Sweden）からのものである。
ヒト好中球カテプシンＧ及びアラスターゼを、Baugh an
d Travisにより記載されている方法（Biochemistry 15
（1976）836−843）に従ってPMNsの抽出物から精製し
た。
るセリン・プロテアーゼの阻害 ４つの変異体を、酵母培養基から精製した。これらの
濃度を、標準としてBTPIを使用して214nmにおける吸光
度から測定した。ブタ・トリプシンを、Novo Nordisk A
/S（Bagsvaerd,Denmark）から得、ウシ・キモトリプシ
ン（TLCK処理）を、Sigma Chemical Co.（St.Louis,MO,
USA）から得た。切り詰められたヒト組換え組織因子
を、Corvas（San Diego,CA,USA）から得た。ヒト・プラ
スミンはKabi（Stockholm,Sweden）からのものである。
ヒト好中球カテプシンＧ及びアラスターゼを、Baugh an
d Travisにより記載されている方法（Biochemistry 15
（1976）836−843）に従ってPMNsの抽出物から精製し
た。
ペプチジル・ニトロアニリド基質、S2251、S2586は、
Kabi（Stockholm,Sweden）からのものであった。S7388
及びM4765はSigma Chemical Co.（St.Louis,MO,USA）か
らのものであった。
Kabi（Stockholm,Sweden）からのものであった。S7388
及びM4765はSigma Chemical Co.（St.Louis,MO,USA）か
らのものであった。
セリン・プロテイナーゼを、様々な濃度の変異体と共
に30分間インキュベートした。次に基質（0.6nM）を添
加し、そして残存プロテイナーゼ活性を、405nmにおい
て測定した。結果を表２中に示す。
に30分間インキュベートした。次に基質（0.6nM）を添
加し、そして残存プロテイナーゼ活性を、405nmにおい
て測定した。結果を表２中に示す。
４つのTFPI KunitzドメインII変異体（KFN 1893,189
7,1898,1928）が、好中球エラスターゼの強い阻害剤で
あることが分かった。
7,1898,1928）が、好中球エラスターゼの強い阻害剤で
あることが分かった。
配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ノボ ノルディスク アクティーゼル
スカブ （Ｂ）番地：ノボ アレ（Novo Alle） （Ｃ）市:DK−2880 バグスバード（Bagsvaerd） （Ｅ）国：デンマーク（Denmark） （Ｆ）郵便番号（ZIP）:DK−2880 （Ｇ）電話：＋45 4444 8888 （Ｈ）ファックス：＋45 4449 3256 （Ｉ）テレックス:37304 （ii）発明の名称：ヒトKunitz型プロテアーゼ阻害剤
変異体 （iii）配列数:18 （iv）コンピューター読込形態： （Ａ）媒体形式：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェアー:PatentIn Release ＃1.0,Ve
rsion ＃1.25（EPO） （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:57アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:57アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:945塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモ・サピエンス （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:365..538 （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:235塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..235 （xi）配列：配列番号9: （２）配列番号10に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:53アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号10: （２）配列番号11に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:418塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成／ヒト （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..409 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:sig peptide （Ｂ）位置:77..235 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:mat peptide （Ｂ）位置:236..409 （xi）配列：配列番号11: （２）配列番号12に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:111アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号12: （２）配列番号13に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:418塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..409 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:sig peptide （Ｂ）位置:77..235 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:mat peptide （Ｂ）位置:236..409 （xi）配列：配列番号13: （２）配列番号14に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:111アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号14: （２）配列番号15に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:418塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..409 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:sig peptide （Ｂ）位置:77..235 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:mat peptide （Ｂ）位置:236..409 （xi）配列：配列番号15: （２）配列番号16に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:111アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号16: （２）配列番号17に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:418塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..409 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:sig peptide （Ｂ）位置:77..235 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:mat peptide （Ｂ）位置:236..409 （xi）配列：配列番号17: （２）配列番号18に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:111アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号18:
スカブ （Ｂ）番地：ノボ アレ（Novo Alle） （Ｃ）市:DK−2880 バグスバード（Bagsvaerd） （Ｅ）国：デンマーク（Denmark） （Ｆ）郵便番号（ZIP）:DK−2880 （Ｇ）電話：＋45 4444 8888 （Ｈ）ファックス：＋45 4449 3256 （Ｉ）テレックス:37304 （ii）発明の名称：ヒトKunitz型プロテアーゼ阻害剤
変異体 （iii）配列数:18 （iv）コンピューター読込形態： （Ａ）媒体形式：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェアー:PatentIn Release ＃1.0,Ve
rsion ＃1.25（EPO） （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:57アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:57アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:945塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモ・サピエンス （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:365..538 （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:58アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:235塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..235 （xi）配列：配列番号9: （２）配列番号10に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:53アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号10: （２）配列番号11に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:418塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成／ヒト （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..409 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:sig peptide （Ｂ）位置:77..235 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:mat peptide （Ｂ）位置:236..409 （xi）配列：配列番号11: （２）配列番号12に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:111アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号12: （２）配列番号13に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:418塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..409 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:sig peptide （Ｂ）位置:77..235 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:mat peptide （Ｂ）位置:236..409 （xi）配列：配列番号13: （２）配列番号14に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:111アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号14: （２）配列番号15に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:418塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..409 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:sig peptide （Ｂ）位置:77..235 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:mat peptide （Ｂ）位置:236..409 （xi）配列：配列番号15: （２）配列番号16に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:111アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号16: （２）配列番号17に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:418塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：合成 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:77..409 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:sig peptide （Ｂ）位置:77..235 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:mat peptide （Ｂ）位置:236..409 （xi）配列：配列番号17: （２）配列番号18に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:111アミノ酸 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号18:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ビョルン，セーレン エリク デンマーク国，デーコー―2800 リング ビー，マリエ グルベス アレ 47 (72)発明者 ペテルセン，ラルス クリスティアン デンマーク国，デーコー―2970 ヘール スホルム，ハベバイ ４ (72)発明者 オルセン，オレ フビルステズ デンマーク国，デーコー―2700 ブレー ンスヘーイ ベクケスコウバイ 38 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，338，518−520 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，263 （13），6001−6004 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/81 C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/99
Claims (12)
- 【請求項１】組織因子経路阻害剤（TFPI）のヒトKunitz
型プロテアーゼ阻害剤ドメインIIの変異体であって、下
記のアミノ酸配列： （配列中、 15位のXaaは、Arg、Lys、Val、Thr、Leu、Phe、Trp又は
Tyrであり； 16位のXaaは、Gly又はAlaであり； 17位のXaaは、Tyr、Arg又はLysであり； 19位のXaaは、Thr、Ile又はLeuであり； 34位のXaaは、Lys、Val、Ile、Thr又はLeuであり； 39位のXaaは、Leu、Arg又はLysであり；そして 46位のXaaは、Glu、Lys、Asp、Gln、Asn又はArgであ
り； 但し、Xaaで示されるアミノ酸の少なくとも１個は、生
来に配列における対応する位置のアミノ酸とは異なる） により表されるアミノ酸配列を含んでなる、セリンプロ
テアーゼ阻害活性を有する変異体。 - 【請求項２】組織因子経路阻害剤（TFPI）のヒトKunitz
型プロテアーゼ阻害剤ドメインIIの変異体であって、下
記のアミノ酸配列： により表されるアミノ酸配列を含んでなる、セリンプロ
テアーゼ阻害活性を有する変異体。 - 【請求項３】組織因子経路阻害剤（TFPI）のヒトKunitz
型プロテアーゼ阻害剤ドメインIIの変異体であって、下
記のアミノ酸配列： により表されるアミノ酸配列を含んでなる、セリンプロ
テアーゼ阻害活性を有する変異体。 - 【請求項４】組織因子経路阻害剤（TFPI）のヒトKunitz
型プロテアーゼ阻害剤ドメインIIの変異体であって、下
記のアミノ酸配列： により表されるアミノ酸配列を含んでなる、セリンプロ
テアーゼ阻害活性を有する変異体。 - 【請求項５】組織因子経路阻害剤（TFPI）のヒトKunitz
型プロテアーゼ阻害剤ドメインIIの変異体であって、下
記のアミノ酸配列： により表されるアミノ酸配列を含んでなる、セリンプロ
テアーゼ阻害活性を有する変異体。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒト
Kunitz型プロテアーゼ阻害剤の変異体をコードするDNA
構成物。 - 【請求項７】請求項６に記載のDNA構成物を含んでなる
組換え発現ベクター。 - 【請求項８】請求項６に記載のDNA構成物を含む細胞。
- 【請求項９】請求項７に記載の発現ベクターを含む細
胞。 - 【請求項１０】請求項８に記載の細胞を培養し、そして
培養物からヒトKunitz型プロテアーゼ阻害剤の変異体蛋
白質を採取することを含んでなる、ヒトKunitz型プロテ
アーゼ阻害剤の変異体の製造方法。 - 【請求項１１】請求項９に記載の細胞を培養し、そして
培養物からヒトKunitz型プロテアーゼ阻害剤の変異体蛋
白質を採取することを含んでなる、ヒトKunitz型プロテ
アーゼ阻害剤の変異体の製造方法。 - 【請求項１２】キモトリプシン、トリプシン、プラスミ
ン、カテプシンＧ、カリクレイン類及びエラスターゼか
ら成る群から選択されるプロテアーゼの少なくとも１種
を阻害する、請求項１に記載のセリンプロテアーゼ阻害
活性を有する変異体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK9200001 | 1992-01-07 | ||
| PCT/DK1993/000004 WO1993014121A1 (en) | 1992-01-07 | 1993-01-07 | A human kunitz-type protease inhibitor variant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07506335A JPH07506335A (ja) | 1995-07-13 |
| JP3350549B2 true JP3350549B2 (ja) | 2002-11-25 |
Family
ID=8153770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51199293A Expired - Fee Related JP3350549B2 (ja) | 1992-01-07 | 1993-01-07 | ヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5576294A (ja) |
| EP (1) | EP0621871B1 (ja) |
| JP (1) | JP3350549B2 (ja) |
| KR (1) | KR100278036B1 (ja) |
| AT (1) | ATE154938T1 (ja) |
| AU (1) | AU676145B2 (ja) |
| CA (1) | CA2127249A1 (ja) |
| CZ (1) | CZ284911B6 (ja) |
| DE (1) | DE69311893T2 (ja) |
| ES (1) | ES2104121T3 (ja) |
| FI (1) | FI943233A0 (ja) |
| HU (1) | HU218104B (ja) |
| IL (1) | IL104325A (ja) |
| NO (1) | NO942550L (ja) |
| NZ (1) | NZ246569A (ja) |
| PL (1) | PL175422B1 (ja) |
| WO (1) | WO1993014121A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA9395B (ja) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060134087A1 (en) * | 1988-09-02 | 2006-06-22 | Dyax Corp. | ITI-D1 Kunitz domain mutants as hNE inhibitors |
| US5455338A (en) | 1993-11-05 | 1995-10-03 | Zymogenetics, Inc. | DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto |
| ATE529444T1 (de) * | 1994-01-11 | 2011-11-15 | Dyax Corp | Inhibitoren des humanplasmins, die sich von den kunitz domänen ableiten |
| WO1995021601A2 (en) * | 1994-01-11 | 1995-08-17 | Protein Engineering Corporation | Kallikrein-inhibiting 'kunitz domain' proteins and analogues thereof |
| US6057287A (en) | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
| US5795954A (en) * | 1994-03-04 | 1998-08-18 | Genentech, Inc. | Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins |
| DE69528591T2 (de) * | 1994-08-05 | 2003-02-20 | Chiron Corp | Herstellung des inhibitors fuer die komplexbildung des gewebefaktors |
| US5589359A (en) | 1994-08-05 | 1996-12-31 | Chiron Corporation | Chimeric proteins |
| US5786328A (en) * | 1995-06-05 | 1998-07-28 | Genentech, Inc. | Use of kunitz type plasma kallikrein inhibitors |
| US5780265A (en) * | 1995-06-05 | 1998-07-14 | Genentech, Inc. | Kunitz type plasma kallikrein inhibitors |
| US6242414B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-06-05 | Chiron Corporation | Regulation of cytokine synthesis and release |
| US20030199450A1 (en) * | 2001-04-27 | 2003-10-23 | Chiron Corporation | Regulation of cytokine synthesis and release |
| US6346510B1 (en) | 1995-10-23 | 2002-02-12 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions |
| HU226419B1 (en) * | 1996-03-11 | 2008-12-29 | Aerovance | Human bikunin |
| EP1140150B1 (en) * | 1998-12-22 | 2003-11-19 | Bayer Aktiengesellschaft | Method for accelerating the rate of mucociliary clearance by using a kunitz-type serine protease inhibitor |
| US20070140979A1 (en) * | 1998-12-22 | 2007-06-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Method for accelerating the rate of mucociliary clearance |
| GB9916913D0 (en) * | 1999-07-19 | 1999-09-22 | Natural Enviromental Research | Inhibitor proteins |
| US20040054082A1 (en) * | 2001-12-03 | 2004-03-18 | Bank David H | Toughened polymer blends with improved surface properties |
| US7153829B2 (en) | 2002-06-07 | 2006-12-26 | Dyax Corp. | Kallikrein-inhibitor therapies |
| PT2311432E (pt) | 2002-06-07 | 2015-02-09 | Dyax Corp | Polipeptídeos de domínio kunitz modificado e sua utilização para a redução de isquemia ou aparecimento de uma resposta inflamatória sistémica associada a um procedimento cirúrgico |
| DK1542710T3 (da) * | 2002-08-28 | 2012-10-15 | Dyax Corp | Fremgangsmåde til konservering af organer og væv |
| AU2004204095B2 (en) * | 2003-01-07 | 2009-07-30 | Dyax Corporation | Kunitz domain library |
| US6989369B2 (en) | 2003-02-07 | 2006-01-24 | Dyax Corp. | Kunitz domain peptides |
| WO2005021557A2 (en) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Dyax Corp. | Poly-pegylated protease inhibitors |
| US7235530B2 (en) * | 2004-09-27 | 2007-06-26 | Dyax Corporation | Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof |
| US7276480B1 (en) | 2005-12-30 | 2007-10-02 | Dyax Corp. | Prevention and reduction of blood loss |
| WO2007106746A2 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Dyax Corp. | Formulations for ecallantide |
| ES2773766T3 (es) | 2008-12-19 | 2020-07-14 | Baxalta GmbH | Inhibidores de TFPI y métodos de uso |
| AU2010203712A1 (en) | 2009-01-06 | 2010-07-15 | Dyax Corp. | Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors |
| CN101798346B (zh) * | 2009-02-06 | 2013-05-29 | 复旦大学 | 一种酵母表达的长效重组人组织因子途径抑制物 |
| LT2521568T (lt) | 2010-01-06 | 2018-12-10 | Dyax Corp. | Plazmos kalikreiną surišantys baltymai |
| AU2011227714B2 (en) | 2010-03-19 | 2014-09-04 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | TFPI inhibitors and methods of use |
| CN105713092B (zh) | 2011-01-06 | 2019-09-10 | 戴埃克斯有限公司 | 血浆前激肽释放酶结合蛋白 |
| KR101391988B1 (ko) | 2011-11-04 | 2014-05-08 | 동아대학교 산학협력단 | 항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열 |
| CA2867363C (en) | 2012-03-21 | 2023-02-28 | Baxter International Inc. | Tfpi inhibitors and methods of use |
| KR102555955B1 (ko) | 2014-03-27 | 2023-07-18 | 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 | 당뇨병성 황반 부종의 치료를 위한 조성물 및 방법 |
| AU2016366557B2 (en) | 2015-12-11 | 2024-01-25 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating hereditary angioedema attack |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5106833A (en) * | 1987-07-23 | 1992-04-21 | Washington University | Coagulation inhibitors |
| DK408089D0 (da) * | 1989-08-18 | 1989-08-18 | Novo Nordisk As | Proteiner |
-
1993
- 1993-01-06 IL IL10432593A patent/IL104325A/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-01-07 AT AT93902105T patent/ATE154938T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-01-07 WO PCT/DK1993/000004 patent/WO1993014121A1/en active IP Right Grant
- 1993-01-07 AU AU33459/93A patent/AU676145B2/en not_active Ceased
- 1993-01-07 CA CA002127249A patent/CA2127249A1/en not_active Abandoned
- 1993-01-07 HU HU9401991A patent/HU218104B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-01-07 EP EP93902105A patent/EP0621871B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-01-07 PL PL93304468A patent/PL175422B1/pl unknown
- 1993-01-07 JP JP51199293A patent/JP3350549B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-01-07 ZA ZA9395A patent/ZA9395B/xx unknown
- 1993-01-07 KR KR1019940702351A patent/KR100278036B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-01-07 ES ES93902105T patent/ES2104121T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-01-07 NZ NZ246569A patent/NZ246569A/en unknown
- 1993-01-07 CZ CZ941649A patent/CZ284911B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-01-07 DE DE69311893T patent/DE69311893T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-07-06 NO NO942550A patent/NO942550L/no not_active Application Discontinuation
- 1994-07-06 FI FI943233A patent/FI943233A0/fi unknown
- 1994-10-12 US US08/321,658 patent/US5576294A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（１３），６００１−６００４ |
| Ｎａｔｕｒｅ，３３８，５１８−５２０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69311893T2 (de) | 1998-02-05 |
| US5576294A (en) | 1996-11-19 |
| KR100278036B1 (ko) | 2001-01-15 |
| HU9401991D0 (en) | 1994-09-28 |
| HU218104B (hu) | 2000-06-28 |
| NO942550L (no) | 1994-09-07 |
| HUT70295A (en) | 1995-09-28 |
| JPH07506335A (ja) | 1995-07-13 |
| NZ246569A (en) | 1996-05-28 |
| AU3345993A (en) | 1993-08-03 |
| ZA9395B (en) | 1993-08-20 |
| ES2104121T3 (es) | 1997-10-01 |
| EP0621871B1 (en) | 1997-07-02 |
| IL104325A0 (en) | 1993-05-13 |
| CZ284911B6 (cs) | 1999-04-14 |
| KR940703854A (ko) | 1994-12-12 |
| WO1993014121A1 (en) | 1993-07-22 |
| NO942550D0 (no) | 1994-07-06 |
| DE69311893D1 (de) | 1997-08-07 |
| FI943233A (fi) | 1994-07-06 |
| EP0621871A1 (en) | 1994-11-02 |
| ATE154938T1 (de) | 1997-07-15 |
| FI943233A0 (fi) | 1994-07-06 |
| CA2127249A1 (en) | 1993-07-22 |
| IL104325A (en) | 2000-10-31 |
| AU676145B2 (en) | 1997-03-06 |
| CZ164994A3 (en) | 1994-12-15 |
| PL175422B1 (pl) | 1998-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3350549B2 (ja) | ヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体 | |
| AU675926B2 (en) | A human kunitz-type protease inhibitor variant | |
| JP3345420B2 (ja) | 新規のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター及びその変異体 | |
| US5629176A (en) | Human Kunitz-type protease inhibitor variants | |
| AU675925B2 (en) | A human kunitz-type protease inhibitor variant |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080913 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |