KR101391988B1 - 항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열 - Google Patents

항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열 Download PDF

Info

Publication number
KR101391988B1
KR101391988B1 KR1020110114376A KR20110114376A KR101391988B1 KR 101391988 B1 KR101391988 B1 KR 101391988B1 KR 1020110114376 A KR1020110114376 A KR 1020110114376A KR 20110114376 A KR20110114376 A KR 20110114376A KR 101391988 B1 KR101391988 B1 KR 101391988B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
serine protease
kunitz
kti
type serine
present
Prior art date
Application number
KR1020110114376A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130049382A (ko
Inventor
진병래
추영무
이광식
윤형주
Original Assignee
동아대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 동아대학교 산학협력단 filed Critical 동아대학교 산학협력단
Priority to KR1020110114376A priority Critical patent/KR101391988B1/ko
Publication of KR20130049382A publication Critical patent/KR20130049382A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101391988B1 publication Critical patent/KR101391988B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 호박벌(Bombus ignitus) 독액(venom) 성분으로서 플라스민(plasmin)을 특이적으로 저해하는 독액 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질(Kunits-type serine protease inhibitor)을 암호화하는 핵산분자 서열 및 이에 코딩되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질(Bi-KTI)을 암호화하는 핵산분자는 재조합 DNA 기술에 의하여 현재 이용되고 있는 곤충 베큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 도입하여 플라스민의 활성을 특이적으로 저해하는 쿠니츠 타입 저해단백질(Bi-KTI)을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 제작하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 염기서열을 재조합 베큘로바이러스 발현 벡터 시템을 이용하여 강한 항섬유소용해 기능을 가진 재조합 쿠니츠 타입 저해단백질을 발현시켜 정제함으로서 의약분야에서 수술시 국소 지혈에 이용 될 수 있는 항섬유소용해제 (antifibrinolytic agent)등의 개발에 기여할 수 있다.

Description

항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열{Polypeptide Sequence of Kunitz-Type Serine Protease Inhibitor from Bombus ignitus Having Antifibrinolytic Function and Gene Sequences Encoding thereof}
본 발명은 호박벌(Bombus ignitus) 독액(venom)의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질 (kunitz-type serine protease inhibitor)의 폴리펩티드 서열 및 이를 코딩하는 염기서열에 관한 것이다.
벌 (bees)은 동물이나 곤충과 같은 침략자 또는 포식자로부터 그들의 집단(colony)을 보호하기 위해 효과적인 방어수단인 벌독(bee venom)을 가지고 있다. 벌독은 여러 종류의 독액 단백질 또는 펩타이드로 구성되어 있으며, 멜리친(melittin)[Gauldie et al., Eur. J. Biochem., 61:369-376(1976)], 포스포리파제 A2 (PLA2) [Six & Dennis, Biochim. Biophys. Acta 1488:1-19(2000)],아파민(apamin)[Banks et al., Nature 282:415-417(1979)], 하이알루로니다아제(hyaluronidase)[Kreil, Protein Sci., 4:1666-1669(1995)], 세린 프로테아제(serine protease)[Winningham KM et al. J Allergy Clin Immunol 2004;114:928-33] 등이 알려져 있다. 동양에서는 다양한 벌독 성분을 의약분야에 이용하기 위해 벌독의 약리효과에 대한 연구를 수행하고 있다 [Mirshafiey A. Neuropharmacology 2007;53:353-61]. 벌 중에서도 인간과 가장 밀접한 대표적인 벌은 일반적으로 양봉과 화분매개곤충으로 이용되고 있는 꿀벌(honeybee)과 호박벌(bumblebee)이다 [Velthuis HHW et al. Apidologie 2006;37:421-51].
다양한 생물에서 발견되는 세린 프로테아제와 세린 프로테아제 저해단백질은 면역반응immune response), 보체활성(complement activation), 지혈(hemostasis), 혈액응고 기작 (blood coagulation), 섬유소용해기능 (fibrinolysis), 그리고 염증 (inflammation) 제거와 같은 다양한 생리 작용을 (physiological function) 가지기 때문에 많은 관심 속에 있다 [Neurath H. et al. Science 1984;224:350-7; Krem MM. et al. Trends Biochem Sci 2002;27:67-74; van Gent D. et al. Int J Bio chem Cell Biol. 2003;35:1536-1547]. 특히, 뱀(snake) 독액(venom) 세린 프로테아제와 세린 프로테아제 저해단백질은 주요 독성분으로서 잘 알려져 있으며, 뱀 독액의 세린 프로테아제는 생체 내 지혈과 혈전기전의 응고와 섬유소 용해 등에 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며 뱀 독액의 세린 프로테아제 저해단백질은 항섬유소용해나 트립신과 키모트립신과 같은 세린 프로테아제 저해 단백질로서 잘 보고 되어 있다 [Braud S et al. Biochimie 82 (2000) 851-859; Flight S. et al., Pathophysiol Haemost Thromb. 2005; 34:188-193; Shafqat J. et al. FEBS Lett.1990;275:6-8.].
최근에 벌 독액에서 섬유소(원) 분해능을 가진 세린 프로테아제의 특성이 보고되고 있는 반면에 [Choo YM et al. PLoS ONE.2010;5:e10393; Qiu Y et al., Toxicol Appl Pharmacol.2011;doi:10.1016/j.taap.2011.06.020], 아직까지 섬유소 분해에 주요한 역할을 하는 플라스민의 활성을 저해하는 벌 독액 세린 프로테아제 저해단백질의 유전자나 기능에 대해서는 보고된 바가 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은, 혈액 중에 단백질 분해 효소로 섬유소용해효소라고도 불리는 플라스민의 활성을 저해하는 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질(Kunitz-type serine protease inhibitor;Bi-KTI) 유전자의 염기서열 분석을 위하여 연구한 결과, 호박벌 독액의 Bi-KTI를 코딩하는 유전자 서열을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 호박벌 독액의 Bi-KTI를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데 목적이 있다
또한 본 발명은 상기 핵산분자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 곤충베큘로바이러스로부터 발현된 항플라스민 기능을 갖는 재조합 Bi-KTI 단백질을 제공하는데 목적이 있다.
또한 본 발명은 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질을 약제학적 유효성분으로 포함하는 항섬유소용해제를 제공하는데 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열을 필수 아미노산 서열로 하는 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질(Kunitz-type serine protease inhibitor;Bi-KTI) 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 서열목록 제2서열의 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(i) 본 발명의 호박벌 독액의 Bi-KTI를 암호화하는 유전자 서열은 재조합 DNA 기술에 의하여 현재 이용되고 있는 곤충 베큘로바이러스에 도입되어 플라스민 작용을 억제하는 항플라스민을 가진 재조합 Bi-KTI를 발현 시키는데 사용될 수 있다.
(ii) 본 발명의 염기서열을 이용하면 효과적인 국소 지혈에 이용 될 수 있는 항섬유소용해제(antifibrinolytic agent)등의 개발에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 도 1은 호박벌 독액 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 (Bi-KTI)의 염기서열이다. 네모상자의 ATG는 개시코돈을, 밑줄 친 TAA는 종결코돈을 나타낸다. 그리고 나머지 서열은 비번역 영역 (UTR)이다.
도 2는 호박벌 독액 독액 Bi-KTI의 번역된 아미노산 서열이다.
도 3은 호박벌 독액의 Bi-KTI와 뱀 독의 KTI와 상동성을 비교한 것이며 별 표 (asterisk)는 P1 영역이며 검정색 원(solid circle)은 서로 보전되어 있는 이황화 결합을 이루는 시스테인 잔기이다.
도 4는 재조합 Bi-KTI를 정제한 전기영동 사진과 Bi-KTI 항체를 이용한 웨스턴 블랏분석 사진이다.
도 5은 트립신과 알파 키모트립신에 대한 Bi-KTI의 저해 활성을 나타내는 결과이다.
도 6은 혈액 응고인자 Xa, 트롬빈 및 조직 플라스미노겐 활성인자에 대한 Bi-KTI의 저해 능력을 나타내는 결과이다.
도 7은 플라스민에 대한 Bi-KTI와 플라스민 저해 단백질인 아프로티닌의 활성을 비교한 결과이다.
도 8은 섬유소 고체배지에서 플라스민에 대한 Bi-KTI의 저해 능력을 가시적으로 확인한 결과이다.
본 발명은 호박벌(Bombus ignitus) 독액의 Bi-KTI 폴리펩티드 및 이의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 서열목록 제2서열을 필수 아미노산 서열로 하는 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드이다.
벌 독액의 Bi-KTI 유전자는 호박벌 독액에서 처음 분리된 것으로 아직까지 그 특징이 보고되고 있지 아니한 바, 본 발명에서 최초로 상기 호박벌 독액의 Bi-KTI를 코딩하는 유전자의 서열을 밝힌 것이다.
본 명세서에서의 핵산 분자는 예컨대, RNA, DNA 또는 cDNA가 될 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 miRNA)이 될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “필수 아미노산 서열로 포함”은 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질 기능과 관련하여 언급된 서열을 최소 서열로 포함하며 다른 서열을 추가적으로 포함할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질 기능을 위하여 서열목록 제2서열로 구성된(consisting of) 펩티드 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에 추가적으로 다른 아미노산 서열이 결합된(N-말단, C-말단 또는 두 양말단에) 펩티드는 본 발명의 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드에 속하는 것이다.
상기 호박벌 독액의 Bi-KTI 유전자는 NCBI GenBank database에 승인번호 JN381496 (cDNA)을 2011년 7월 22일에 등록되었다.
본 발명의 호박벌 독액의 Bi-KTI cDNA를 분리하여 염기서열을 구성하는데, 호박벌 독샘에서 상용화된 키트를 이용하여 cDNA를 분리한 결과 얻어진 호박벌 독액의 Bi-KTI 유전자의 cDNA는 종결코돈까지 그 길이가 249 bp인 서열번호 1의 염기서열을 가지며 24개의 아미노산으로 이루어진 신호서열(signal sequence)과 58개의 아미노산으로 이루어진 성숙 펩타이드(mature peptide)로 되어있고 6380 Da의 분자량을 가진다.
상기 Bombus ignitus 호박벌 독액의 Bi-KTI 유전자로부터 연역된 아미노산은 기존에 밝혀진 Ramphotyphlops nigrescens와 Pseudonaja textilis 등의 쿠니츠 타입 트립신 저해단백질의 아미노산과 높은 상동성을 가진다.
또한 본 발명은, 상기 호박벌 독액의 Bi-KTI 유전자 서열에 의하여 코딩되는 펩타이드를 그 특징으로 한다. 상기 펩타이드는 서열번호 2와 같이 82개의 아미노산으로 이루어진다.
본 발명은 상기 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터(vector)"는 외부의 유전 물질을 다른 세포로 옮기는데 사용되는 전달 수단인 DNA 분자이다. 대표적으로 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 코스미드 벡터, 인공 염색체를 이용한 벡터(예컨대, YAC, BAC) 등이 존재한다. 벡터를 이용하여 원하는 유전 물질을 대량 발현하는데 있으므로 벡터로서의 기능을 하기 위해 필요한 공통 요소가 존재하는데, 복제 원점(Replication Origin), 여러 제한효소 자리(Multicloning site), 선택표지(selective marker)가 반드시 존재하여야 한다. 벡터 그 자체는 DNA 염기 서열로 이식할 유전자(transgene)과 벡터 백본(backbone)을 포함한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세린 프로테아제 저해단백질 폴리펩티드로부터 구축된 곤충베큘로바이러스로부터 발현시킨 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명에서의 용어 ‘재조합 단백질’이란 두 개 혹은 그 이상의 DNA를 유전자 재조합 기술로 이어 붙여 만든 recombinant DNA에서 만들어지는 단백질이다.
상기 recombinant DNA기술을 통해 과거 자연 상태부터 미량으로 밖에 얻을 수 없던 의료용 단백질 또는 산업용 효소 등을 박테리아(예컨대 E. coli)와 동물세포 등을 이용하여 합성할 수 있다. 박테리아(예컨대 E. coli)를 비롯한 효모(Yeast)와 동물 세포(Mammalian cell)의 발효 및 배양, 의약품 원료 수준의 정제 과정을 통하여 합성 가능하다. 재조합 단백질로 합성된 예로, hGH (Human Growth hormone), INS (Insulin), Interleukine 등이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 재조합 단백질은 약제학적 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여 (topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 호박벌 독액의 Bi - KTI 유전자 클로닝
농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부로부터 분양받은 호박벌(Bombus ignitus) 일벌의 독샘으로부터 추출한 poly(A)+mRNA를 이용하여 상용화된 키트인 Uni-ZAP XR 벡터와 Gigapack III Gold Packing Extract(Stratagene 사, 미국)에 의해 cDNA library를 제작하고 유전자 발현 꼬리표(expressed sequence tags, ESTs)를 분석하였다. DNA 추출은 상용화 키트인 Wizard mini-preparation 키트(Promega 사, 미국)를 사용하였다. DNA 염기서열은 자동화 DNA 서열분석기(Applied Biosystems 사, 미국)로 서열을 분석하였다. 그 염기서열들은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)의 BLAST 프로그램에 의해 비교하였다. 그 결과, 호박벌 독샘 ESTs 분석에 의해 82개의 아미노산을 코딩하고 있는 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질 유전자의 cDNA를 클로닝하였다 (도 1). 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질 cDNA로부터 번역한 아미노산 서열(도 2)의 데이터베이스 분석 결과, 뱀 독 유래의 Rhinoplocephalus nigrescens (GenBank accession no. B5KL37), Pseudonaja textilis (GenBank accession no.Q90W98),and Hoplocephalus stephensii (GenBank accession no.B5L5R7)과 상동성을 보이며, 3개의 이황화 결합(disulfide bond)을 이루는 시스테인(cysteine) 잔기들이 잘 보전되어 있다 (도 3).
실시예 2: 곤충세포주에서 재조합 Bi - KTI 의 발현
호박벌 독액의 Bi-KTI를 발현하기 위하여, 호박벌 독액의 Bi - KTI cDNA를 곤충 베큘로바이러스(Autographa californica nucleopolyhedrovirus) 전이벡터 pBAC9(Clontech 사, 미국)의 제한효소 BamH I과 Xho I 부위에 삽입한 뒤, 전이벡터 (100 ng)와 비에이시고자 (bAcGOZA) 바이러스 DNA (500 ng) [Je et al., Biotechnol. Lett., 23:575-582(2001)]를 함께 Lipofectin (Clonetech 사)을 이용하여 곤충세포주 Sf9(Spodoptera frugiperda 9)에 코트랜스펙숀 (co-transfection) 하였다. 5일 후 배양액을 수거하여 호박벌 독액의 Bi-KTI를 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 제작하였다. 재조합 베큘로바이러스는 Sf9 세포주에서 증식하였고, 재조합 Bi-KTI는 MagneHisTM protein purification system (Promega 사, 미국)을 이용하여 분리하였다. 분리된 재조합 Bi-KTI를 Balb/c 생쥐에 주사하여 다중클론항체를 제작하였다[Choo et al., Mol. Cell. Neurisci., 38:224-235(2008)]. 분리된 호박벌 독액의 재조합 Bi-KTI 단백질 전기영동사진과 상기 항체의 웨스턴블랏분석 (western blot analysis)의 결과를 도 4에 나타내었다.
실시예 3: 재조합 Bi - KTI 의 활성 검증
세린 프로테아제를 저해하는 단백질로서의 특성을 검증하기 위해 세린 프로테아제의 대표적인 트립신과 키모트립신을 저해하는지 확인 하기위하여 400 ng의 트립신과 알파 키모트립신에 Bi-KTT 농도별 (0~2 )로 각 tube에 처리하였다. 37℃에서 30 분간 기질 없이 반응 한 후 기질 Benzoyl-L-arginine -p-nitroanilide hydrochloride (최종 기질농도 0.4 mM in 100 mM Tris-HCl, pH 8, 20 mM CaCl2, 0.05% Triton X-100)을 첨가하여 37℃ 에서 30 분간 시킨다. O.D 405 nm에서 반응을 측정한 결과 알파 키모트립신 보다 트립신에 특이적으로 저해하는 활성을 보였다 (도 5). 거기에 더하여 혈액내 혈액 응고와 분해에 관련된 트립신 같은 세린 프로테아제인 프로트롬빈 활성인자인 혈액응고 인자 Xa (Factor Xa), 트롬빈 (thrombin) 그리고 조직 플라스미노겐 활성인자인 tPA (tissue plasminogen activator)에 대하여 Bi-KTI의 저해 능력을 알아보기 위하여 400 ng의 응고인자 Xa, 트롬빈 그리고 tPA에 Bi-KTT (0, 3.125, 6.25, 12.5,….1000 ng)를 농도별로 처리하였다. 그 결과, 트립신과 같은 활성을 가진 나머지 세린 프로테아제 대해서는 저해 능력을 확인할 수 없었다 (도 6). 그리고 플라스민 저해단백질인 아프로티닌 (Aprotinin)을 Bi-KTI와 비교하기 위해 플라스민에 아프로티닌을 Bi-KTI 조건으로 처리하여 37℃에서 30 분간 기질없이 반응 시키고 0.5 mM chromogenic substrate (S-2251 for plasmin, S-2238 for thrombin, S-2288 for tPA, S-2222 for factor Xa (Chromogenix, MA, USA) in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) 첨가 후 37℃에서 1hr 동안 반응 시켰다. O.D 405 nm에서 반응을 측정한 결과, 플라스민에 특이적으로 강한 저해 능력을 가진 아프로티닌 보다 초기 저해 능력이 다소 약하지만 플라스민에 대해서는 낮은 농도에서도 아주 강하게 반응하는 것을 확인 할 수 있었다 (도 7). 플라스민의 피브린 용해 활성을 저해 하는지를 가시적으로 확인하기 위해서 피브린 플레이트 검증 ( fibrin plate assay)을 실시하였다. 0.6 % 피브리노겐 (10 ml)에 40 unit 트롬빈을 처리하여 피브린 플레이트를 준비하고 플라스민과 플라스민 + Bi-KTI를 농도별로 처리하여 37℃에서 반응 시키고 시간별로 용해된 영역을 (white zone) 사진 촬영 하였다. 그 결과, 플라스민의 피브린 용해 능력이 Bi-KTI 농도에 따라 현저히 감소되는 것을 확인하였다 (도 8).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열목록 제2서열을 필수 아미노산 서열로 하는 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질(Kunitz-type serine protease inhibitor;Bi-KTI) 폴리펩티드.
  2. 청구항 1의 상기 서열목록 제2서열의 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
  3. 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 서열은 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 핵산 분자는 cDNA인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  5. 청구항 2 또는 3의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  6. 청구항 1의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질 폴리펩티드로부터 구축된 곤충베큘로바이러스로부터 발현시킨 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 재조합 단백질.
  7. 청구항 1의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해단백질을 약제학적 유효성분으로 포함하는 항섬유소용해제.
KR1020110114376A 2011-11-04 2011-11-04 항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열 KR101391988B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110114376A KR101391988B1 (ko) 2011-11-04 2011-11-04 항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110114376A KR101391988B1 (ko) 2011-11-04 2011-11-04 항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130049382A KR20130049382A (ko) 2013-05-14
KR101391988B1 true KR101391988B1 (ko) 2014-05-08

Family

ID=48660144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110114376A KR101391988B1 (ko) 2011-11-04 2011-11-04 항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101391988B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101374194B1 (ko) * 2013-05-16 2014-03-13 대한민국 대하로부터 분리한 쿠니츠형 세린 프로테아제 저해인자

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100278036B1 (ko) 1992-01-07 2001-01-15 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 사람 쿠니즈형 프로테아제 저해제 변이체
US20090036647A1 (en) 2005-06-06 2009-02-05 Takashi Morita BITORAN WHICH IS TRYPSIN-INHIBITOR-LIKE PROTEIN DERIVED FROM BITIS ARIETANS VENOM, AND USE THEREOF AS BLOOD COAGULATION FACTOR Xa INHIBITOR

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100278036B1 (ko) 1992-01-07 2001-01-15 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 사람 쿠니즈형 프로테아제 저해제 변이체
US20090036647A1 (en) 2005-06-06 2009-02-05 Takashi Morita BITORAN WHICH IS TRYPSIN-INHIBITOR-LIKE PROTEIN DERIVED FROM BITIS ARIETANS VENOM, AND USE THEREOF AS BLOOD COAGULATION FACTOR Xa INHIBITOR

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank # AEM68408(2011. 08. 24.)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130049382A (ko) 2013-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Georgel et al. Drosophila immune deficiency (IMD) is a death domain protein that activates antibacterial defense and can promote apoptosis
Lee et al. Purification and molecular cloning of cDNA for an inducible antibacterial protein of larvae of a coleopteran insect, Holotrichia diomphalia
Liu et al. Identification, characterization and functional analysis of a serine protease inhibitor (Lvserpin) from the Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei
Jiménez-Vega et al. Characterisation of a serine proteinase from Penaeus vannamei haemocytes
Liu et al. A serpin from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis is responsive to bacteria and WSSV challenge
Park et al. Isolation and characterization of the cDNA encoding the prophenoloxidase of fall webworm, Hyphantria cunea
Mazumdar–Leighton et al. Identification of novel serine proteinase gene transcripts in the midguts of two tropical insect pests, Scirpophaga incertulas (Wk.) and Helicoverpa armigera (Hb.)
Gaines et al. Cloning of a family of serine protease genes from the cat flea Ctenocephalides felis
KR101481902B1 (ko) 항균 및 항진균 활성을 갖는 신규 폴리펩티드
KR101391988B1 (ko) 항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열
Saito et al. Molecular cloning of cDNA for sarcocystatin A and analysis of the expression of the sarcocystatin A gene during development of Sarcophaga peregrina
JP2003313199A (ja) コラーゲン誘発血小板凝集抑制剤
Shrivastava et al. Protein purification, cDNA cloning and characterization of a protease inhibitor from the Indian tasar silkworm, Antheraea mylitta
Miyaji et al. Molecular cloning of a multidomain cysteine protease and protease inhibitor precursor gene from the tobacco hornworm (Manduca sexta) and functional expression of the cathepsin F-like cysteine protease domain
Lee et al. Gene Expression of Cotesiaplutellae Bracovlrus EP1-like Protein (CpBV-ELP1) in Parasitized Diamondback Moth, Plutellae xylostella
KR101437408B1 (ko) 플라스민 및 엘라스타아제 저해 활성을 갖는 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 억제 및 항섬유소용해용 조성물
WO2008046256A1 (fr) Hemocoagulase
KR101374757B1 (ko) 엘라스타아제 저해 활성을 갖는 토종벌 유래의 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 조성물
Arora et al. Expression, purification, and characterization of pro‐phenoloxidase‐activating serine protease from Spodoptera litura
US20110195482A1 (en) Serine protease isolated from the venom of bombus ignitus as fibrinogenolytic and fibrinolytic enzymes
JP3648548B2 (ja) 血液凝固阻害活性を有するハマダラカ由来のＡｓ−１蛋白質
Tao et al. Expression of apalbumin1 of Apis cerana cerana in the larvae of silkworm, Bombyx mori
Choo et al. A serine protease from the midgut of the bumblebee, Bombus ignitus (Hymenoptera: Apidae): cDNA cloning, gene structure, expression and enzyme activity
KR101773362B1 (ko) 머리뿔가위벌 유래 항균 및 항진균 활성을 갖는 신규 폴리펩티드
KR101963958B1 (ko) 토종벌 유래 세린 분해효소 저해 펩티드

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee