KR101374194B1

KR101374194B1 - 대하로부터 분리한 쿠니츠형 세린 프로테아제 저해인자

Info

Publication number: KR101374194B1
Application number: KR1020130055554A
Authority: KR
Inventors: 공희정; 김영옥; 남보혜; 김우진; 김형수; 김봉석; 안철민
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2014-03-13

Abstract

본 발명은 대하(Fenneropenaeus chinensis)로부터 최초로 분리한 세린 프로테아제 억제 활성을 나타내는 펩타이드에 관한 것으로서, 항트립신 활성 및 항응고 활성을 입증하였다.

Description

대하로부터 분리한 쿠니츠형 세린 프로테아제 저해인자{Kunitz―type serine protease inhibitor peptide from Fenneropenaeus chinensis}

본 발명은 세린 프로테아제 억제활성을 나타내는 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 대하로부터 분리한 신규한 세린 프로테아제 억제활성을 나타내는 펩타이드에 관한 것이다.

세린 프로테아제는 혈장 응고인자를 활성화 시켜, 혈장 응고를 유발한다고 알려져 있으며, 이에 따라 세린 프로테아제 억제제를 혈장 응고 억제제로서 연구되고 있으며, 이외에도 최근에는 암 치료(Messina M, Barnes S, J. Natl. Cancer Institute, 1991) 및 면역력 증가(Philip G. Ashton-Rickardt, International Scholarly Research Network, Volume 2012, 15 pages)와 관련되어 연구되고 있다.

쿠니츠형 세린 프로테아제 억제제(Kunitz-type serine protease inhibitor)는 Kunitz가 최초로 정제하고 결정화한 것으로서, 대표적으로 대두트립신억제제(STI, soybean trypsin inhibitor)가 알려져 있다. 상기 STI는 아미노산잔기수 181, 분자량이 22,000인 단순단백질이며 반응부위는 Arg(63번)-Ile(64번)이고 트립신 외에 사람의 플라스민이나 칼리크레인, 소의 키모트립신α등을 저해한다고 알려져 있다(Rawlings ND, et al., Biochem. J., 378 (Pt 3): 705-16, 2004).

무척추 동물에서 쿠니츠형 세린 프로테아제 억제제가 동정되고, 이의 특성에 대하여 연구된 바 있다. 예를 들어 투구게(Tachypleus tridentatus, GenBank accession no. P16044), 말미잘(Stichodactyla helianthus, P31713), 맛조개(Solen grandis, JQ730814), 산왕거미(Araneus ventricosus, JX844659), 참진드기(Haemaphysalis longicornis, AB690579), 땅뒤영벌(Bombus terrestris, JX273646)로부터 분리한 세린 프로테아제 억제제에 대하여 알려진 바 있다(Nakamura T, et al., J. Biochem., 101:1297-306, 1987; Antuch W, et al., Eur. J. Biochem., 212:675-84, 1993; Wei X, et al., Fish Shellfish Immunol., 33:1276-84, 2012; Wan H, et al., PLoS One, 8:e53343, 2013; Alim MA, et al., Insect Biochem. Mol. Biol., 42:925-34, 2012; Qiu Y, et al., Toxicon, 63:1-6, 2013).

그러나 대하(Fenneropenaeus chinensis)로부터 동정된 쿠니츠형 세린 프로테아제의 특성에 대해서는 알려진 바가 전무한 실정이다.

본 발명은 대하(Fenneropenaeus chinensis)로부터 최초로 분리한 쿠니츠형 세린 프로테아제 억제제에 관한 것으로, 세린 프로테아제에 억제 효과 및 우수한 항응고 효과를 나타내는 바, 프로테아제 억제제 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항응고용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 세린 프로테아제 억제 활성을 나타내고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 암호화하는 유전자가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자를 포함하는 발현벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항응고제가 제공된다.

상기 항응고제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 대하(Fenneropenaeus chinensis)로부터 유래될 수 있으며, 항트립신 활성 및 항응고 활성을 나타내는 바, 이를 항응고제의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.

상기 항응고제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량% 로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

상기 항응고제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 유효 투여량은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 항응고제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대하로부터 분리된 신규한 세린 프로테아제 억제제를 분리 및 동정하였으며, 이의 항트립신 효과 및 항응고 효과를 입증한 바, 이를 항응고제 유효성분으로 유효하게 적용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 대하로부터 분리한 FcKuSPI(F. chinensis Kunitz-type serine protease inhibitor)의 상동성 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 대하의 조직 내의 FcKuSPI mRNA 발현 분포를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 rFcKuSPI 펩타이드를 정제한 후, SP-Sepharose FF 이온 교환 크로마토그래피를 수행한 결과(3a) 및 이온 교환 크로마토 그래피 중 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타내는 결과이다:
LS: 로딩 샘플(loading sample);
FT: 용출물(flow-through);
2: 분획물 2번;
3: 분획물 3번;
4: 분획물 4번;
W: NaOH 워싱(washing with NaOH); 및
M: 마커(markers).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 rFcKuSPI 펩타이드의 항트립신 활성(도 4a) 및 억제율(도 4b)을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 rFcKuSPI 펩타이드의 시험관 내(in vitro) 항응고 활성을 확인한 결과이다.

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 문서에서 사용되는 “세린 프로테아제 억제제(Serine protease inhibitors, SPIs)”는 척추 및 무척추 동물에서 혈액응고, 섬유소용해 및 면역 방어와 같은 생물학적 과정에 있어서 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다( Heutinck KM, et al., Mol Immunol. 47(11-12):1943-55, 2010; Kanost MR. Developmental and Comparative Immunology 23;291-301, 1999). SPI는 구조에 따라서 다양한 패밀리고 구분되며, 예를 들어 10 Kda 이하의 억제 도메인을 가지고 있는 쿠니즈(Kunitz) 및 카잘(Kazal)형 패밀리가 알려져 있다(Laskowski M, et al., Annu. Rev. Biochem., 49:593-626, 1980; Silverman GA, et al., J. Biol. Chem., 2001;276:33293-6).

본 문서에서 사용되는 “쿠니츠형 세린 프로테아제 억제제(Kunitz-type serine protease inhibitor)”는 인간, 식물, 곤충 및 미생물을 포함하는 다양한 미생물에 존재하며(Laskowski M, et al., Annu. Rev. Biochem., 49:593-626, 1980; Kazal L., et al., J. Am. Chem. Soc., 70:3034-40, 1948; van de Locht A, et al., EMBO J., 14:5149-59, 1995; Gao X, et al., J. Insect. Physiol., 57:339-43, 2011), 하나 또는 둘 이상의 쿠니츠(Kunitz) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 쿠니츠 도메인은 50 내지 60개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 3개의 보존된 이황화 결합에 의하여 안정화되어 있다고 알려져 있다(Berndt KD, et al., J. Mol. Biol., 227:757-75, 1992). 또한, 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 트롬민(thrombin)과 같은 세린 프로테아제 특이적으로 활성을 억제한다고 알려져 있다(Laskowski M, et al., Biochim. Biophys. Acta., 1477:324-37, 2000). 반응 부위의 P1 잔기는 쿠니츠형 세린 프로테아제 억제제의 표적 인식 특이성 및 역학(energetics)을 결정한다고 알려져 있으며(Schrechter I, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 27:157-62, 1967; Krowarsch D, et al., J. Mol. Biol., 289:175-86; 1999), 일반적인 트립신 억제제의 P1 잔기는 아르기닌(arginine) 또는 라이신(lysine)이라고 알려져 있으며, 키모트립신 억제제의 경우 류신(leucine) 또는 메티오닌(methionine)으로 알려져 있으며(Grzesiak A, et al., J. Mol. Biol., 301:205-17, 2000), 최초의 쿠니츠형 세린 프로테아제 억제제인 BPTI(bovine basic pancreatic trypsin inhibitor)은 P1 잔기 위치에 라이신 잔기를 가지고 있으나, 트립신, 키모트립신, 및 엘라스티-유사 세린 (전)효소 등과 같은 다양한 세린 프로테아제에 대하여 억제 활성을 나타낸다고 알려져 있다(Kunitz M, et al., J. Gen. Physiol., 19:991-1007, 1996; Ascenzi P., et al., Curr Protein Pept Sci., 4:231-51, 2003)

본 문서에서 사용되는 “항응고제”는 혈액응고 및 이로 인하여 유발되는 질환의 예방, 개선 및 치료용 목적으로 이용되는 조성물을 의미하며, 예를 들어 혈소판 응집물 및/또는 피브린 응괴에 의한 유발되는 혈관 폐색, 허혈 및 기관 손상; 동맥 혈전 및 이로 인하여 유발되는 허혈성 괴사; 관상 동맥 및 이로 인하여 유발되는 심근 경색 또는 심장 발작; 정맥에 생성되는 혈전 및 이로 인하여 발생되는 부종 및 염증; 심부 정맥의 혈전 및 이로 인한 폐색전 및 합병증 등에 대하여 예방, 개선 및 치료 효과를 제공할 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 대하( Fenneropenaeus chinensis )의 준비

대하(Fenneropenaeus chinensis)는 대한민국, 충남, 태안군의 채석포에서 채집하였다. 상기 대하의 무게는 54.94 g 내지 63.70 g이었으며, 0.5 mL 혈림프(Hemolymph)를 대하의 배쪽의 부비강(sinus)으로부터 추출하였으며, 이때 추출은 0.7 mL 항응고제[30 mM 시트르산삼나트륨(trisodium citrate), 0.34 M 염화나트륨(sodium chloride), 10 mM EDTA, 0.115 M 글루코오스 (pH 7.55, 삼투압 780 mOsmkg^-1)]를 포함하는 1 mL 멸균 주사기(25 게이지)를 이용하여 수행하였다.

혈액세포를 원심분리하여 분리하였으며(800 × g, 10 분, 10℃), 전체 RNA를 TRIzol (Invitrogen) 시약을 이용하여 분리하였다. 담췌(Hepatopancreatic) 및 근육 조직을 대하로부터 분리하였으며(n=5), TRIzol 시약 및 균질기를 이용하여 분쇄하였다.

실시예 2: 재조합 FcKuSPI 단백질 발현 플라스미드의 제조

FcKuSPI (16-80 아미노산)의 ORF(open reading frame) 및 융합 파트너(His 및 ubiquitin 태그)를 각각 Vent DNA polymerase (New England Biolabs)를 이용하여 증폭하였다. 활성화된 His- 및 ubiquitin-태그된 FcKuSPI DNA가 5' 및 3' 말단에 각각 NdeI 및 BamHI 제한 효소 자리를 포함하도록 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머는 하기와 같다:

F-H6Ub-NdeI(서열번호 2): 5'- AGA TAT ACA TAT GCA CCA CCA CCA CCA CCA CCA GAT TTT CGT CAA-3';

F-Ub-FcKuSPI(서열번호 3): 5’-CTA AGA GGT GGC TTC CTC CGC CCG CTC GGA-3’; and

R-FcKuSPI-BamHI(서열번호 4): 5'-TCA GCC GGA TCC TTA CCG ACC GCA AAG AGA-3'.

증폭된 cDNA 단편은 박테리아 발현을 위하여, pAPTH6Ub 벡터(AP Biotechnology)의 NdeI 및 BamHI 제한효소에 삽입하였다(Choi SP, et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 35:255-63, 2012). 상기 컨스트럭트의 서열은 시퀀싱하여 확인하였다.

실시예 3: 재조합 FcKuSPI 단백질의 발현 및 정제

재조합 FcKuSPI 단백질은 봉입체(inclusion body) 내에서 N-말단에 His 태그가 연결된 융합 단백질로, E.coli 세포에서는 Ubiquitin 태그가 연결된 융합 단백질의 형태로 발현하였다. 상기 세포는 원심분리에 의하여 수득하였으며, 용해 버퍼[30 mM NaPi (pH 7.0), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100] 내에서 현탁하였다. 상기 봉합체는 8 M 요소에서 가용화하였으며, 0.4 M 효소에서 희석시켜 리폴드(refold)시켰다. 상기 과정을 통하여 수득된 추출물은 UBP 단백질에 의하여 가수분해하였으며, Ni-킬레이팅 친화성 컬럼에 적용하여 융합 파트너를 제거하였다. 그 후, 수득된 관류액을 30 mM 인산나트륨(sodium phosphate, pH 7.0)을 이용하여 평형화된 이온 교환 크로마토그래피 컬럼(SP-Sepharose Fast Flow, HiTrap 5 mL, GE Healthcare)에 적용하였으며, 그 후 30 mM 인산나트륨 및 1 M NaCl(pH 7.0)을 이용하여 용출시켰다. 마지막 정제 단계에서 수득된 샘플을 표준 단백질 크기 마커(Bio-Rad)와 함께 4-12% SDS-PAGE (KOMA Biotech) 젤을 이용하여 분석하였다.

실험예 1: FcKuSPI cDNA의 특성 분석

F. chinensis 혈액을 이용하여 제조된 cDNA 라이브러리로부터 Plasmid Miniprep Kit (Qiagen)를 이용하여 EST (Expressed sequence tag) 클론을 분리하였으며, 이를 T7 정방향 및 SP6 역방향 프라이머 및 ABI3730xl automatic sequencer (Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 서열을 분석하였다(Promega). 핵산 서열을 분석하였으며, GenBank의 BLASTX 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용하여 상동성을 분석하였다. 추론되는 FcKuSPI 단백질의 등전점(isoelectric point, pI) 및 분자량(molecular weight, Mw)은 ExPASy website (http://web.expasy.org/compute_pi/)에서 계산하였다. 2개(Pair-wise) 및 3개 이상의 서열은 CLUSTALW (http://www.genome.jp/tools/clustalw/)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 유추된 FcKuSPI 아미노산 서열은 80개의 잔기로 구성되어 있으며, Kunitz 도메인을 포함하고 있었다. SignalP 3.0에 의하여 분석된 신호 펩타이드는 글리이신(glycine) 15번 및 페닐알라닌(phenylalanine) 16번 사이에서 분리되었으며, 이에 따라 65개 잔기의 성숙 단백질(mature protein)을 수득하였다. 약 7.66 kDa 크기의 분자량이 예상되었으며, pI는 8,84로 나타났으며, 서열은 GenBank accession number KC819410로 제출되었다.

BLASTX 프로그램(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 상동성 있는 서열을 검색한 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 FcKuSPI의 유추된 아미노산 서열은 다른 종의 세린 단백질 분해효소 억제제의 BPTI/Kunitz 패밀리에 속하는 유사한 분자와 상동성을 나타냈다. 보리새우(Marsupenaeus japonicus, AAR92097), 소의 BPTI(Bos taurus, NP_001001554), 갈색독뱀 textilinin-2 (Pseudonaja textilis, ACC77787), 및 점핑 개미(Harpegnathos saltator, EFN87117)에 대하여 각각 53%, 52%, 47%, 및 44% 상동성을 나타냈다(도 1 참조). 또한, 서열 정렬을 통하여 분석한 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 FcKuSPI가 6개의 보존된 시스테인(cystein) 잔기를 포함하는 Kunitz 도메인을 포함하고 있으며, 이는 3개의 이황화결합(C1-C6, C2-C4, 및 C3-C5)을 형성할 것으로 예상되었다(도 1 참조). FcKuSPI의 반응 위치로 추정되는 부위의 P1 잔기는 라이신(lysine)인 것으로 예상되었으며, FcKuSPI가 트립신 억제제로 기능을 수행할 수 있는 가능성을 제시하였다.

실험예 2: FcKuSPI mRNA의 발현 분석

FcKuSPI mRNA의 조직 내 발현 양상을 분석하기 위하여, 정량적 실시간 PCR을 정상 대하의 조직(간췌장(Hp, hepatopancreas); 근육(M, muscle); 혈액세포(Hm, hemocytes))을 이용하여 수행하였다.

구체적으로, 전체 RNA는 TRizol 시약을 이용하여 추출하였다. 전체 RNA 농도를 정량하고, 1 μg RNA를 역방향 전사에 이용하였다. 첫 번째 가닥 cDNA는 Advantage RT-for-PCR kit(BD Biosciences)를 이용하여 합성하였다. 정량적 실시간 PCR은 Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 수행하였으며, 이때 정방향 및 역방향 프라이머는 하기와 같다:

FcKuSPI-RT-F(서열번호 5): 5'-CGC CCG CTC GGA GAT AT-3';

FcKuSPI-RT-R(서열번호 6): 5'-GCA AGG CCC AGT CAC CTT AG-3';

β-actin-RT-F(서열번호 7): 5'-TCA CCG AGC GTG GCT ACA-3'; 및

β-actin-RT-R(서열번호 8): 5'-TCC TTG ATG TCA CGC ACG AT-3'.

95℃, 10분 동안 Taq 활성화를 시킨 후, 95℃ 10초, 60℃ 15초를 40 사이클동안 반복하였으며, SDS 7500 system(Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 형광 수준을 측정하였다. 전사 수준은 β-actin 전사 수준에 대비하여 정량화하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, FcKuSPI mRNA는 모든 조직에서 발현되었으며, 조직 가운데에서는 혈액세포에서 높은 발현수준을 나타냈다. 혈액 세포 및 근육에서의 발현 수준은 각각 34배 및 4.8배로 나타났으며, 간췌장(hepatopancreas) 조직에 비하여 현저하게 높은 치를 나타냈다.

실험예 3: 재조합 FcKuSPI 단백질의 정제

본 발명의 일 실시예에 따른 FcKuSPI 단백질의 기능을 시험관 내(in vitro)에서 분석하기 위하여, 재조합 FcKuSPI의 N 말단에 His 및 ubiquitin 태그 단백질이 융합된 형태로 제작하였다(실시예 2 참조). E. coli 에서 FcKuSPI 단백질을 IPTG 유도에 의해서 과발현시켰으며, 니켈 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하고, UBP 단백질을 처리하여 His 및 ubiquitin 태그를 제거하고, 이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다(도 3a 참조).

정제된 재조합 FcKuSPI 단백질은 분획물 3번에서 검출되었다(도 3b 참조).

실험예 4: FcKuSPI 단백질의 항-트립신 활성 분석

FcKuSPI에서 PI 부위의 라이신(lysine) 잔기는 FcKuSPI가 트립신의 활성을 억제하는 역할을 수행하는지 확인한다고 추정되었다. 이에, 본 발명자는 시험관 내(in vitro) 내에서 트립신에 대한 rFcKuSPI의 억제 효과를 분석하기 위하여, rFcKuSPI의 존재 하에 발색 합성 기질(synthetic chromogenic substrate)의 가수분해 정도를 측정하였다.

구체적으로, 트립신 활성 억제효과는 돼지 췌장 트립신(최종 농도 100 μM, Sigma)과 FcKuSPI (최종 농도 130 nM 내지 1.08 μM) 또는 버퍼(대조군)을 포함하는 반응 혼합물(400 L) 내에서 잔여 트립신의 활성을 측정함으로써 분석하였다. 상기 반응은 100 μL 0.2% (w/v) 아조카세인(azocasein, Sigma)를 상기 혼합 용액에 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 반응시키며 시작하였다. 상기 반응은 200 μL 15% 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 첨가하여 종료하였으며, 그 후 15분 동안 얼음 위에서 냉각시켰다. 상기 침전물은 원심분리에 의하여 분리하였으며, 분광광도계를 이용하여 440 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, rFcKuSPI 단백질 농도 0.13, 0.52, 및 1.08 μM에서 트립신(100 μM)의 활성을 28.3%, 49.1%, 및 59.6%로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 rFcKuSPI 단백질이 세린 단백질 분해효소인 트립신의 억제제로 기능을 수행한다는 것을 입증한 것이다. (<-도 4a 및 도 4b 참조)

실험예 5: FcKuSPI 단백질의 항응고 활성 분석

본 발명의 일 실시예에 따른 rFcKuSPI 단백질의 항응고 활성을 분석하기 위하여, 본 발명자는 rFcKuSPI의 존재 하에 구연산염을 처리한 인간 혈장으로 APTT(activated partial thromboplastin time) 분석을 수행하며 응고 시간을 측정하였다. 구체적으로, 응고 대조 플라즈마 수준 1(90 μL) (Pacific Hemostasis/Thermo Scientific)을 다양한 농도의 rFcKuSPI(8.5 μg, 17 μg)와 혼합한 후, 37℃에서 1분 동안 반응시켰다. 그 후, 100 μL APTT 분석 시약(Pacific Hemostasis/Thermo Scientific)을 상기 혼합물에 첨가하고 37℃에서 5분 동안 반응시켰다. 그 후, 100 μL 0.025 mM CaCl2을 첨가하고, 응고 시간을 Dualchannel clot-2 코어귤로미터(coagulometer, EAC, Italy)를 이용하여 기록하였다. 버퍼를 대조군으로 이용하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 rFcKuSPI 단백질은 대조군에 비하여, 8 μg 및 16 μg 농도에서 응고 시간을 1.73 배 및 2.63 배 증가시켰다(도 5 참조). 이러한 결과는 rFcKuSPI의 항응고 활성을 입증하는 것이다.

종합하면, 본 발명은 신규한 대하(F. chinensis) 혈액 세포로부터 분리한 세린 단백질 분해효소 억제제 BPTI/Kunitz 패밀리의 Kunitz-type 세린 단백질 분해효소 억제제(Kunitz-type serine proteinase inhibitor, FcKuSPI)를 규명한 것으로, 서열 및 상동성 분석 결과 FcKuSPI의 추론된 아미노산 서열이 진화시 보존된 것을 의미한다. 재조합 FcKuSPI는 트립신 활성 및 응집을 농도 의존적인 방식으로 억제하는 것을 확인하였으며, 이를 종합하면 본 발명의 FcKuSPI는 대하의 세린 단백질 분해효소 신호전달 및 응집에 있어서 기능을 수행한다는 것을 의미한다.

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

세린 프로테아제 억제 활성을 나타내고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 암호화하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
제7항의 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항응고제.