JP2002508953A - ポリぺプチド、そのｄｎａコード、その製法、及びｘｉｉ因子活性化の抑制におけるそれらの使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ポリペプチド、そのＤＮＡ記号、その投与、ＸＩＩ因子活性化の抑制における使用法 【解決手段】ここに開示するのは、ヘメンタリア属のヒルから抽出したポリペプチドで、Ｃ１エステラ−ゼ及び／又はＸＩＩ因子活性化を抑制に適当なもの、及びそのポリペプチドを記号化する核酸配列である。このポリペプチドは、製薬処方として或いは遺伝子治療において、心血管、炎症、あるいは自己免疫疾病を治療または予防するのに使われる。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヒルの組織あるいは分泌物などから抽出され、血液凝固及び補体作
用の初期工程に使用される、全く新しい反応抑制剤に関するものであり、とりわ
けポリペプチド、そのｃＤＮＡ記号化、及び心血管、自然免疫、炎症性の疾病に
おけるポリペプチドとその製法の使用に深く関わりを持つものである。

【０００１】 血液凝固システムにおいては酵素がカスケードをなし、フィブリンの形成を起
こす。フィブリンは不溶性・繊維性の重合体蛋白であり、脈管からの漏洩を防ぎ
、失血を防ぐ。この凝固システムにおける個々の酵素は、正常な状態においては
酵素原（いわゆるチモ−ゲン）として循環しており、これは普通、不活性である
。このシステムは、以下のいずれかによって活性化される。

【０００２】 （ａ）ガラスその他、人口装具の材料となる、陰電気を荷電した異物の表面と
の接触。これはいわゆる「内因性システム」である。

【０００３】 （ｂ）ＶＩＩ因子と組織因子との結合。組織因子は、多くの細胞、特に血管壁
細胞の表面に発現する被膜蛋白であり、漏出の際に血液と接触する。これは「外
因性システム」と呼ばれる。

【０００４】 内因性経路の最初の工程には、陰電気を荷電した異物表面の複合体内における
、ＸＩＩ因子、ＸＩ因子、プレカリクレイン、高分子量キニノゲンの結合が含ま
れる。複合体内で起こる事象の相互作用により、ＸＩＩ因子は、αＸＩＩａ因子
へと活性化し、またＸＩ因子はＸＩａ因子へと活性化する。更にこの過程全体が
、プレカリクレインからカリクレインへの活性化によって加速される。αＸＩＩ
因子ａ，βＸＩＩａ因子，ＸＩａ因子及びカリクレインは、全て開始複合体のセ
リンプロテア−ゼである。

【０００５】 生理的なメカニズム全般の例に漏れず、凝固のカスケードは、時に不適当に活
性化され、血管内に止血栓を形成するに至ることがある。このため、血管が詰ま
り、末端部への血液供給が制限される。この経過は血栓症として知られており、
致死率が高い。加えて、血液と接触する人工装具の使用は、凝固カスケードの活
性化、及びしばしば活性化機能を有する、人工装具の表面を覆う被膜のために、
厳しく制限されている。こうした人工装具には、血液透析器、心肺バイパス回路
、血管ステント及び内在カテ−テルなどがある。こうした器具が使われる時、表
面にフィブリンが沈殿することを防ぐため、ヘパリンのような抗凝固剤が使われ
る。しかし、患者のうちには、血小板減少症、さらに深刻な出血に至る可能性の
あるヘパリンを受け付けない者もいる。そのため、こうした問題を起こさず、問
題の患者にも使える新しいタイプの抗凝固剤が必要とされている。

【０００６】 哺乳動物の血液補体作用のシステムは、外部組織による感染に対する生体防御
の一環である。凝固システムと同様、これも複合酵素のカスケードである。活性
化されたカスケードは侵入組織の排除を行うが、これには食細胞（いわゆる免疫
付着物）として知られる蛋白質で侵入組織を覆ってしまう間接的な方法と、溶解
による直接的な方法とがある。さらにこれは局部炎症反応を起こし、白血球の活
性化と移動、血管透過性の増進、平滑筋の収縮、生体アミン類のリリースなどに
繋がる。

【０００７】 （ａ）古典的経路（ｂ）副経路のうち、一つ或いは双方を通して、補体作用の
活性化が起きる。

【０００８】 （ａ）古典的な補体経路は、その最初の部分が凝固カスケードと相似している
。活性化は、抗体で覆われた表面上、或いはその他の、陰電気を帯びた表面上で
行われ、Ｃ１エステラ−ゼであるセリ−ンプロテア−ゼを増加させるが、これは
、活性化された共因子（Ｃ４ｂ）の存在下で、カスケード内の次のプロテーゼチ
モ−ゲン（Ｃ２）を分割し、最終生成物を作り出す。この場合の最終生成物とは
、標的になった細胞を溶解する「被膜攻撃複合体」である。この経路はまた、多
くの副産物を作るが、それらは生物学的に活性を持ち、炎症性反応を強化する働
きをする。

【０００９】 （ｂ）副経路の場合、刺激剤となる物にはバクテリア性のリボ多糖、各種のポ
リアニオン、免疫グロブリンのＦＡｂ部分、陰電気を帯びたリン脂質、などがあ
り、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ４を巻き込まずにＣ３の直接的な活性化を起こす。

【００１０】 Ｃ１エストラ−ゼは、古典的な補体経路における、活性化された開始複合体で
ある。第一構成要素であるＣ１は、Ｃ１ｑの分子を一つ、及びＣ１ｒとＣ１ｓを
二つずつ有するヘテロ重合体である。Ｃ１ｑはＩｇＧ又はＩｇＭＮＯのＦｃ部分
に、或いはＤＮＡ，カラジ−ナン、ヘパリン、デクストラン硫酸塩、コンドロイ
チン硫酸塩、ある種のバクテリア性リボ多糖等、陰電気を帯びた物質に結び付く
。結合の後、Ｃｌｑは、Ｃｌｒの自触媒作用による活性化を誘導し、セリンプロ
テーゼを作らせるが、次いでそれがＣｌｓを活性化して別のセリンプロテーゼを
作る。活性化したＣｌｓは、Ｃ４とＣ２の双方を分割し、それは古典的経路全体
の活性化の要となる。

【００１１】 凝固カスケードと同様、補体カスケードもまた、不適切な活性化をすることが
あり、そのような場合、重度の炎症を起こす。このため、補体カスケードは、数
多くの炎症疾病、自己免疫性疾病に関する病理学の対象とされているのである。
従って、こうした疾病の治療を行う際、補体経路のための新しい反応抑制剤を提
供し、移植組織に対する生体組織の反発を減少させ、更に血液透析器、心肺バイ
パス回路など、異物の表面における補充活性化を抑制することが好ましい。

【００１２】 従って、本発明の目的は、内因性凝固カスケード及び／又は古典的な補体カス
ケードの開始複合体の反応抑制剤を提供し、それによって、陰電気を帯びた表面
における血液凝固の発生及び／又はは薬理学的に活発な補体成分の生成を減少さ
せることである。こうした反応抑制剤は、カスケード後期に酵素に作用する抑制
剤に勝る利点を有することが期待される。というのは、開始複合体の発生の方が
はるかに低い濃度で行われるからである。そのため、低濃度の抑制剤によって抑
制する事ができ、少量で処理し得る。結果として、カスケード後期の酵素抑制剤
と比べ、毒性を避け、費用を削減することができる。

【００１３】 凝固と補体の開始複合体におけるセリンプロテ−ゼの既知の反応抑制剤は、低
分子量のアミジンあるいはグアニジン、寄生虫から分離できる小型ポリペプチド
、そしてＣ１抑制剤である、自然発生する血液セルピン（セリンプロテーゼ抑制
剤）の、３つの範疇に分けられる。

【００１４】 ３つとも、医学的治療に使用するには、潜在的に不利な点を有している。

【００１５】 今日まで記録されている低分子量化合物は特異性を欠き、ＸＩＩａ因子とＣ１
エステラ−ゼの抑制の効力が、他のプロテア−ゼより遥かに弱い。従って、補体
を媒介とした人間の疾病の治療には向かない。

【００１６】 小型ポリペプチドはセリンプロテーゼをある程度抑制するが、古典的な補体経
路、或いは血液凝固の内因性経路のいずれかの開始複合体を抑制したという報告
は今日までない。

【００１７】 しかし、Ｃ１抑制剤である血漿セルピンは、幾分特異性は欠くものの、凝固内
因性活性化とＣ１エステラ−ゼの双方を抑制し、ＸＩＩａ因子，ＸＩａ因子，カ
リクレイン、Ｃ１ｓ，Ｃ１ｒ因子を抑制する。Ｃ１抑制剤は人間の血液から精製
され、ＤＮＡ組み替えの例も報告されている。血液を原料とするＣ１抑制剤は、
血液自体の欠乏から来る疾病である、血管神経性浮腫を治療するのに使われてい
る。ヒトを対象とした試験的臨床実験の最近の結果として、敗血症性ショック及
び毛細血管漏洩症候群の治療にも効果を挙げた事が報告されている。さらに、心
筋梗塞後の再灌流障害を持つネコ科動物のモデルにおける、Ｃ１抑制剤の適用は
、心臓収縮の回復をめざましく促し、心筋梗塞における梗塞部分を減少させてい
る。しかしながらＣ１抑制剤は、分子量１０４、０００ Ｄａの大型蛋白であり
、４７８のアミノ酸を含んでいる。ＤＮＡ組み替えをした蛋白は、結果として非
常に高価になる。医療におけるＣ１抑制剤の効果は確実だが、しかしその生成の
困難を考えると、Ｃ１抑制剤の効果を受け継ぎ、尚且つ製造が簡単で安価という
新種の化合物が必要になるのである。

【００１８】 故に、本発明の更なる目的は、薬理学的合成及び／又は治療使用により適った
、凝固及び／又は補体カスケードの開始複合体の抑制剤を提供する事にある。こ
の目的に添って、我々は、凝固及び／又は補体の開始複合物を抑制する新しいポ
リペプチドを、ヘモメンテリア属の外部性寄生虫であるヒルから分離し、それに
特徴を明らかにした。こうしたポリペプチドはＳＤＳ ＰＡＧＥ上に、２０から
２５ｋＤａの分子量と一致する電気泳動移動度を有し、下記の１０個のアミノ酸
をＮ末端に有している。

【００１９】

【式１】 Ｘ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｐ−Ｋ−Ｘ´−Ｏ−Ｋ− ［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１］ ここではアミノ酸は、一文字の記号に短縮されている。Ｘは何らかの自然のア
ミノ酸、好ましくはアラニンかＮ−アシルアラニン、Ｎ−アルキルアラニン、特
にアラニンを指す。またＸ´は、システイン［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９］あるい
はグルタミン酸［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０］，特にシステインをさす。「アシ
ル」とは、ホルミルやアセチル等、（Ｃ１−５アルコキシル基の）カルボニ−ル
をさし、「アルキル」とは真っ直ぐな或いは分岐した、Ｃ１−５ のアルキル連 鎖をさす。

【００２０】 特に、これらのポリペプチドは、以下の１０のアミノ酸をＮ末端部に有してお
り、その［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１］においては、Ｘはアラニンである。

【００２１】

【式２】 Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｘ¹−Ｑ−Ｋ［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ．１１及び １２］ そしてＸ¹ は、上記のとおり、システインかグルタミン酸、特にシステインを指
す。

【００２２】 本発明によるポリペプチドは、３７個のアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１３］を備えていることが好ましい。６０個のアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．２］であれば一層よい。

【００２３】 特に、本発明によるポリペプチドが１２２個のアミノ酸の配列［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３］を備え、計算上、約１４ｋＤａの分子量を示す事が好ましい。

【００２４】

【式３】 １ 10 20 30
ＡＫＫＫＬＰＫＣＱＫＱＥＤＣＧＳＷＤＬＫＣＮＮＶＴＫＫＣＥＣＲＮＱＶＣＧ 40 50 60 70 ＲＧＣＰＫＥＲＹＱＲＤＫＹＧＣＲＫＣＬＣＫＧＣＤＧＦＫＣＲＬＧＣＴＹＧＦ 80 90 100 ＫＴＤＫＫＧＣＥＡＦＣＴＣＮＴＫＥＴＡＣＶＮＩＷＣＴＤＰＹＫＣＮＰＥＳＧ 110 120 ＲＣＥＤＰＮＥＥＹＥＹＤＹＥ ［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：１，２及び、９乃至１３］は、［ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：３］の断片或いは配列の一部である事が理解される。

【００２５】 ゆえに本発明はポリペプチドを、特にヘメンテリア属のヒルから抽出し、分離
し、精製或いは合成したポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、Ｃ１エ
ステラ−ゼ及び／又はＸＩＩ因子活性化の抑制に適し、又以下に定義するアミノ
酸の配列を備えている。

【００２６】 本発明は更に、ここに提示された配列のいずれかと、実質上、相同あるいは相
似のポリペプチドを提供する。ここには派生物（キメラ派生物等）あるいはその
生物前駆物質（ポリペプチドがいわゆる「リーダー配列」とリンクする場所を含
む）、或いはそれらのいずれかの塩類が含まれる。

【００２７】 こうした、本発明の範囲に入るヘメンテリアから派生したポリペプチドは、以
後すべて、集合的に「ヘモスタシン」と呼ばれる。

【００２８】 ヘモスタシンは、血液凝固及び／又は補体作用に関し、開始複合体の強力な抑
制剤となる。結果として、ヒトの血漿（例８に表示）における、活性化したトロ
ンボプラスチンの一部の凝固時間を引き延ばし、及び／又は古典的なＣＨ５０分
析（以下にあげる例１０に表示）において０．０５μｌ／ｍｌの範囲の濃度で、
抗体被膜した羊の赤血球の溶血を抑制する。

【００２９】 本発明のヘモスタシンの定義においては、「相同」という言葉は、ポリペプチ
ド連鎖中、リストに上がっていないアミノ酸の含有量が２０％以下であるものを
指す。２０％という数字は、もう一つのヒル蛋白であるヒルジンに関する事実を
基に定められた。即ち、ヒルジンの多種の同族体は、ヒルド・メジチナリスの体
内に自然発生し、文献にも報告されているが、その際、派生体の多くが、ポリペ
プチド連鎖の６５のアミノ酸のうち１５において差異を呈しているのである。ヒ
ルジン同様、ヘモスタシンも多形性であり、第１６番アミノ酸がセリン（Ｓ）［
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７］でなくトレオニン（Ｔ）であり、第６０番がアスパラ
ギン酸（Ｄ）［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８］でなくアスパラギン（Ｎ）である配列
もここに含まれる。

【００３０】 「相似」という言葉は、１個又はそれ以上の付加的アミノ酸が、ヘモスタチン
の薬理学的活動を阻害しない条件で、ポリペプチド連鎖の中に挿入されているこ
とを指す。

【００３１】 従って本発明によるヘモスタシンは、ヒルジンにおいて観察されてきたチロシ
ン１１９及び／又は１２１の芳香族リングの硫酸化など、転写後の修飾を含むア
ミノ酸配列をも含有している。更に、潜在的グリコシル基化のサイトとして知ら
れる［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２］のポジション２３乃至２５において、モチーフ
ＮＶＴが発生するため、ヘモスタシンは更に、［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２］をも
包含する。［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２］においては、１０個以下の糖類と糖類派
生物とを、単独又は分岐した連鎖内に含む、Ｎリンク複合カルボヒドラ−ゼによ
って、アスパラギン２３が修飾されている。

【００３２】 ヘモスタシンは、Ｎ末端で先端を切った形態で、そのために分子量の減った上
記ポリペプチドをも含む。例として、［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１］に示された，
Ｎ末端アミノ酸削除の形態を呈する一、二のポリペプチド、またアミノ酸をＮ末
端アミノグループに添加した事によって、Ｎ末端拡張の形態を呈する一、二のポ
リペプチドが挙げられる。同様にヘモスタシンは、先端を切った、あるいは拡張
した（分子量の増減は問わない）形態を持つ、Ｃ末端における［ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ：３，７，８］のポリペプチドも含む。特に、配列が［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
：２，３，７或いは８］のアミノ酸３７（Ｒ）の後ろで分割されているポリペプ
チドもヘモスタシンに含まれ、そのため、このポリペプチドは、通常は普通のジ
スルフィド結合によって交差する、２つあるいはそれ以上のポリペプチド連鎖と
して存在しているのである。

【００３３】 「生物前駆物質」という言葉は、生体内あるいは他の使用状況で本発明による
ヘモスタシンに転換するポリペプチドを意味する。ヘモスタシンには特に、生体
内で発現する際に、「リーダー配列」が存在するポリペプチド、また特にその「
リーダー配列」が［ＭＳＦＫＩＶＬＬＬＦＬＶＶＣＶＶＡＳＬＡ］を備えている
ポリペプチドも含まれる。

【００３４】 ヘモスタシンは塩類の形を、望ましくは何らかの適当な非毒性の金属イオン、
有機酸或いは無機酸、塩基を有する薬剤学的に受け入れられる塩の形を取ること
ができるという利点を有する。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、
リン酸、及びナトリウム一水化正リン酸塩、ヒドロ硫酸カルシウムなどの酸性金
属塩が挙げられる。有機酸の例としては、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン
酸、ズルフォニック酸など、１個、２個或いは３個のカルボキシル基を有する酸
が挙げられる。塩基の例としては、アンモニア、第一級アミン、第二級アミン、
第三級アミン、あるいは第四級アンモニウムイオンが挙げられる。当業者には他
の有用な塩類も知られている。

【００３５】 ヘモスタシンは、ヘメンテリア属のヒル実質的な全身部、あるいはその唾液腺
、吻その他の組織或いは分泌物を、適当な緩衝材の中で均質化する事によって抽
出される。第ＸＩＩ因子活性化の抑制剤、補体作用の抑制剤のいずれも、これま
でヘメンテリア属のヒルの体内に確認され、或いはそこから抽出されたことはな
かった。本発明は更に、ヘメンテリア属のヒルから抽出し得る、ＸＩＩ因子の活
性化の抑制剤及び／又はＣ１エステラ−ゼの抑制剤を提供する。更にその他或い
は加えて、本発明はヘメンテリア属のヒルから抽出したヘモスタシンを提出する
。このヘモスタシンは、ＸＩＩ因子活性化及び／又はＣ１エステラ−ゼ活動を抑
制するのに適当である。抑制剤あるいはヘモスタシンは、ＸＩＩ因子活性化及び
Ｃ１エステラ−ゼ活動の双方を抑制することが好ましい。

【００３６】 ここで使われる「抽出し得る」という言葉は、分離及び／あるいは精製その他
の方法により、直接物質を引き出す場合のほか、間接的抽出、派生物への化学的
変異、遺伝子操作を含めた化学的・生物学的方法による合成などをもさす。

【００３７】 本発明による抑制剤あるいはヘモスタシンは、一般的にはヘメンテリア属のヒ
ルから、イオン交換、ゲル瀘過、リバース・フェーズ色相分析など、既知の技術
を組み合わせて使うことによって、抽出あるいは精製される。

【００３８】 同属に、あるいは同種に属するヒル同士は、しばしば類似した生化学効果及び
高度に相同性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドを、唾液の中に有してい
る。さらに、同種のヒルの体内には、数種の異なるイソフォームが存在するが、
それらは単に少数のアミノ酸の差異を見せるにすぎない。類似した生化学的特性
を持つ複数のヒルから取られた唾液腺成分あるいは組織分泌物の多くが、ポリペ
プチドの同族メンバ−であり、上に説明したように、本発明もやはりこうした、
ヘメンテリア属のヒルから抽出されたイソフォームとの相同物を備えている。

【００３９】 本発明はさらに、血液凝固の内因性経路の抑制剤を提供する。この抑制剤は、
ヘメンテリア属リンコブデリダ目のヒルの中で、特にギリア−ニ或いはオフィシ
ナリス種、中でも特にＨ．ギリア−ニ種に属する、ヒル組織或いは分泌物から抽
出される。こうした抑制剤は、活性化部分トロンボプラスチン凝固時間を延長す
るが、プロトロンビン時間とトロンビン時間は延長しないため、抗凝固効果を血
漿内に有している。この効果は恐らく、ガラス或いはデキストラン硫酸塩のよう
な物質の表面による血漿活性化を抑える、ヘモスタシンの抑制効果によって起き
たものと思われる。この効果は、酵素として活性を持つＸＩＩａ因子、ＸＩａ因
子の出現の減少によって、計測出来るものである。

【００４０】 本発明はさらに、Ｃ１エステラ−ゼの抑制剤を提供する。この抑制剤は、ヘメ
ンテリア属リンコブデリダ目のヒルの中で、特にギリア−ニ種或いはオフィシナ
リス種、中でも特にＨ．ギリア−ニ種に属するヒルが持つ、組織或いは分泌物か
ら抽出される。ヘモスタシンは精製されたＣｌによる、ｄ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−４ニトロアニリドからの４−ニトロアニリドの酵素分割と、抗体に敏感な
赤血球の補体仲介による溶血全般と、血清中で抗体結合に反応して起こる、免疫
学的に検出される被膜攻撃複合体の形成とを抑制する能力を有する。

【００４１】 これに代わる方法として、その時点及びその後、ポリペプチドが発現する状況
で、ヘモスタシンポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を有する発現ベクトル
によって、必要な場合は、こうして得たポリペプチドの分離によって、形質転換
されている宿主を提供することにより、ヘモスタシンを用意することも可能であ
る。。この方法は、一般的には、発現を望まれるポリペプチドをコード化するヌ
クレオチド配列の獲得、そして遺伝子の組み替えにおけるポリペプチドの発現に
基づいている。現在、組織の遺伝子操作による開拓により、完全な生物学的活性
を見せる、望みどおりの生成物の生成が可能になっている。従って本発明も、本
発明によるヘモスタシンポリペプチドの等価物である、遺伝子組み替え、合成、
遺伝・蛋白操作によるヘモスタシンを範囲に含める。

【００４２】 従って、本発明はさらに、核酸配列、とくに分離され、精製され、あるいは遺
伝子組み替えを施された核酸配列を提供する。これは次のものを含む。 （ａ）本発明に含まれる、ポリペプチド、特にヘモスタインを記号化した配列 （ｂ）厳しい条件下で配列（ａ）と実質的に相同であるか、（ａ）との間に雑種
を形成する配列 （ｃ）遺伝子記号の退化がなければ配列（ａ）（ｂ）と実質的に相同であるか、
それとの間に雑種を形成する配列 （ｄ）配列（ａ）（ｂ）（ｃ）のいずれかに特有なオリゴヌクレオチド。

【００４３】 特に、本発明は上に定義された核酸配列を提供する。この配列はｃＤＮＡ或い
はｍＲＮＡ等のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列である。中でも特に、本発明は［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４］によって確認されたＤＮＡ配列を提供する。この配列は、こ
こでリーダー配列を含む［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３］として確認されたポリペプ
チドと一致している。更に、上で［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：７及び８］への言及
と共に説明した多形性が与えられると、本発明はさらにここでそれぞれ［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：５及び６］として確認された類似のＤＮＡ配列を提供する。

【００４４】 従って、本発明は更に、本発明によるポリペプチドの準備方法を提供する。こ
の方法は以下の項目から成る。

【００４５】 （ａ）ヘメンテリア属のヒルから取った組織あるいは抽出物の分離及び／又は
精製。

【００４６】 （ｂ）ポリペプチドをコード化する核酸配列の発現及び任意に行うその結果と
してのポリペプチドの分離及び／又は精製。 本発明は更に、本発明による何らかの核酸配列を有する遺伝子組み替え構造、こ
うした構造を有するベクトル、こうしたベクトルによって形質変換された宿主を
提供する。

【００４７】 従って本発明はさらに、細胞、プラスミド、ウイルス、生組織ほか、遺伝的に
あるいは蛋白に操作されて、本発明によるポリペプチドやヘモスタシンを生成し
てきた担体を提供する。これら担体は、ここに提示された配列を組み入れている
。こうした細胞には哺乳類のような動物のもの、例えばヒトの細胞やヒト化細胞
が含まれ、ここで述べられた状態を治療あるいは予防する遺伝子治療に使われて
いる。従って本発明の別の態様においては、ここで述べられた体の不調を治療あ
るいは予防する手段が提供されている。そこではポリペプチドが、患者の細胞中
で発現されるように投与されるが、こうした細胞には、そのための核酸配列が組
み込まれている。本発明のヘモスタシンは、遺伝子治療に代わり、薬剤学的な製
品として投与される。

【００４８】 従って本発明は、遺伝子治療を含めた医療の場における、ここで述べたポリペ
プチド特にヘモスタシン或いはポリペプチドの使用、及びこうしたポリペプチド
の製薬における使用を提供する。

【００４９】 従って、本発明はさらに、本発明による（上記のとおり）ヘモスタシンを有す
る薬剤学的な製品と、薬剤学的に受け入れられるそのキャリアとを提供する。「
薬剤学的に受け入れられるキャリア」という用語は、不活性で毒性がない固体あ
るいは液体状の増量剤、希釈用あるいはカプセル用物質、あるいは他の賦形剤で
、活性のある原料や患者に逆反応を起こさないものをさしている。

【００５０】 こうした処方やキャリアは、当業者間では良く知られており、例えば、非経口
的、経口的、局所的な方法で、患者に組織的に施される投薬を含んでいる。

【００５１】 ここで使われる「非経口的」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、
器官内への注射と輸液の技術をさす。非経口的処方は、既知の手法に従えば、丸
剤或いは定期的な注射の形で静脈内に投与されるか、皮下に行われるのが好まし
い。好ましい液体状キャリアは、非経口的な使用法によって知られており、蒸留
水、食塩水、水性デクストロ−ゼ、糖類の溶体、エタノール、グリコール、油脂
類を含む。

【００５２】 経口投与のための錠剤やカプセルには、結合剤、増量剤、滑沢剤、保潤剤など
、従来の賦形剤を含まれる。経口的液体製剤は、水性あるいは油性の懸濁液、水
溶液、乳濁液、シロップ類、エリキシル類その他の形を取り、あるいは水あるい
は他の適当な担体と共に使う再構築用の乾燥製品として提供される。こうした液
体製剤には、懸濁剤、乳濁剤、非・水性の担体、保存薬など、従来使われてきた
混合薬も含まれ得る。

【００５３】 局所への適用に適した調剤方法は、水性又は油性の懸濁液、水溶液、乳濁液、
ゲル、或いは好ましくは乳濁液軟膏の形を取り得る。

【００５４】 本発明による製薬処方の投薬量単位は、望ましい投薬を行うために一日に求め
られるヘモスタインの量、或いはその約数を含む。定められた患者（ヒトのよう
な哺乳類が想定される）のために薬剤学上受け入れられる最適量の投薬量、及び
投薬率は、活性成分の効力、患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、食生活、
投薬の時間と経路、体内からの除去の速度、治療の目的（治療か予防かなど）、
治療される疾病の性質など、多様な因子によって決まる。

【００５５】 体重１ｋｇにつき０．００５から５０ｍｇ、好ましくは０．０５から１０ｍｇ
、更に好ましくは０．１から１ｍｇの範囲の全身的な投与は、効果を挙げること
が予想される。治療される疾病の性質によっては全身的、局所的に関わらず、一
回の投薬が体重当たり０．０５ｍｇから１０ｍｇになって構わない。経口処方は
、一日に２回から６回、できれば３回から４回に分けて、投薬されるのが好まし
い。

【００５６】 本発明は更に、補体作用及び／又は内因性の凝固とその後遺症を防ぐために、
血液に触れる人工装具或いは体外循環器の表面とヘモスタシンとの共有結合複合
体を提供する。

【００５７】 本発明は、上に説明し、以後の例で補遺する生物的活性ゆえに、Ｃ１エステラ
−ゼの開始及び／又はＸＩＩ因子の活性化に関する病気或いは不調の、治療ある
いは予防の方 法のためのポリペプチド、特にヘモスタシンの使用法、或いはその薬剤学的な処
方或いは核酸配列コードを提供する。又これに代わり、本発明は、Ｃ１エステラ
−ゼの開始及び／又はＸＩＩ因子の活性化に関する病気或いは不調の、治療或い
は予防の方法を提供する。この方法とは、患者に対して効果を挙げ、且つ抑制を
行う量のポリペプチドの投薬、或いはその薬剤学的処方から成る。この使用法あ
るいは方法は、心血管の疾病、炎症、自己免疫疾病のうち、一つあるいは複数の
病気あるいは不調に対して施行されることが好ましい。

【００５８】 ヘモスタシンは例えば、重度の静脈血栓、肺塞栓症、血管形成と動脈内膜切除
を伴う血栓症などの血栓症のうち、いずれかを病む患者について、損傷が起こす
活性化あるいは凝固を抑制するために使う事ができる。更にヘモスタシンは、補
体作用活性化と血液凝固の内因性経路の双方を抑制する能力を持っており、血液
透析、心肺バイパス、移植組織の反発、また敗血症、心筋梗塞、脳卒中、特に虚
血期間（心臓発作、脳卒中の後などに起きる）後の再灌流によって組織が損傷を
起こした場合の脳卒中、粥状動脈硬化、ショック、脈管炎、リューマチ性関節炎
、鎌状血球貧血あるいは血管浮腫などの症候群において、症状を緩和する事がで
きる。加えて、ヘモスタシンは、補体作用の活性化に伴う症状に使用できる。こ
の活性化の有無は、活性化した成分、及びその成分が体液及び／又はその病気組
織への沈着中にある自然の抑制剤と結びついた複合体の出現によって判断される
。病気組織の例としては、多様な自己免疫疾病（狼瘡関節炎など）、糸球体腎炎
、腎炎、腎障害、全身性硬化、べ−チェット症候群、大脳狼瘡、ギランバレ−症
候群、多様な硬化、重傷筋無力症、天疱瘡、水泡性類天疱瘡、光毒性反応、熱性
火傷、過敏症、喘息、皮膚反応、感染、炎症性腸疾患、甲状腺炎、不妊、アルツ
ハイマー病、発作性夜間ヘモグロビン尿病、溶血性貧血などがある。

【００５９】 本発明のヘモスタシン或いはその処方は、再灌流に続く組織損傷を減少させる
ため、又は血液透析器或いは心肺バイパス装置の表面に起きる補体作用活性化を
防ぐため、付加的な抗凝固剤あるいは血栓溶解剤と結合させて処方される。更に
、ヘモスタシンは、移植反発を緩和するために、免疫反応抑制剤と結合させて、
ステロイド系あるいは非ステロイド系の抗炎症薬と共に使用される。

【００６０】 「結合させて」という用語は、同時に或いは時を置いて、薬剤学的に活性を持
つ一つ又は複数の他成分を、ヘモスタシンと共に投与する事を指す。

【００６１】 本発明によるポリペプチドの分離及び性格解明の過程は、それに伴う配列リス
トと共に、以下の例によってのみ示される。

【００６２】 ここで、 Ｓ２３１４はＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−４−ニトロアニリド； Ｓ２２６６はＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−４−ニトロアニリド； Ｓ２３０２はＨ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−４−ニトロアニリド； Ｓ２３６６はｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−４−ニトロアニリド； 及び Ｓ２２３８はＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−ｐｉｐ−Ａｒｇ−４−ニトロアニリド を表わす。

【００６３】 実施例１ ヘメンタリア属のヒル抽出物による古典的な補体経路の抑制 ヒルの体内において古典的な補体経路抑制剤が発生することは、被膜攻撃複合
体の免疫学的検定によって証明できる。多様な種のヒルからの抽出物を、唾液複
合体あるいは個々の腺のいずれかを、ＣＡＥ（英国バ−クシャ−、ワ−キンガム
市、タウトリ−・ロ−ド、チャ−ルズ・ハウス、ダイアソリン株式会社）希釈液
内で均質化する事で用意し、ディアソリンＣＡＥテストで検出した。ＣＡＥ希釈
液（０．５ｍｌ）と，抽出物（０．０９５ｍｌ）と、正常なヒトの血清（０．０
９５ｍｌ）とを含んだサンプルを作り、うち０．１５ｍｌを、抗体コーティング
を施した窪みに入れた。３７℃で１時間培養した後、サンプルを破棄し、窪みを
洗浄緩衝液で３回洗浄した。固定した被膜攻撃複合体を、ホ−スラディッシュペ
ルオキシダ−ゼ（０．１５ｍｌ）と結合させた特異抗体により、３７度で３０分
培養して検査した。遊離抗体は、上記のように３回洗って除去し、結合した抗体
は、基質溶液を足した芳香族化合物（０．１５ｍｌ）と、室温における３０分間
の培養によって可視化した。この後、反応停止液で反応を停止させた。窪みの内
容物を清潔な微量定量プレートに移し、４５０ｎｍで解読した。抗ＣＡＥ単位の
数は、制御血清が窪みごとにＣＡＥ１００単位を含み、抑制剤１単位が１００％
の確率でＣＡＥ１単位を抑制するということを基にして計算された。抑制活動は
、ヘメンタリア・オフィシナリス種及びＨ．ギリア−ニ種双方のヒルの唾液複合
体内に明らかに見られ、唾液腺内で最も高い数値を示した（表１）。

【００６４】

【表１】

【００６５】 実施例２ ヘメンテリア属ヒルの抽出物による補体のＣ１ｓ成分の抑制 補体のＣ１ｓ成分の抑制剤の存在は、ヒル抽出物が持つ、酵素の発色検査を抑
制する能力によって実証される。ヘメンテリア・オフィシナリス種のヒル一体の
、前部腺、後部腺、吻を有する唾液複合物全体の抽出物を、リン酸塩緩衝を施し
た食塩水（０．４５ｍｌ）内での均質化によって用意した。またヘメンテリア・
ギリア−ニ種のヒル一体の、前唾液腺からの抽出物を、リン酸塩緩衝を施した食
塩水（０．５ｍｌ）内での均質化によって用意した。双方の抽出物を、１３、０
００ｒｐｍで３分間、遠心分離器にかけ、上澄みを検査に使用した。キュベット
内容物は、８ ｍＭのＳ ２３１４（０．０１ｍｌ）と，抽出物あるいはリン酸
塩緩衝を施した食塩水 （０．０４ｍｌ）と，０．１Ｍのソジウムリン酸緩衝剤 ｐＨ７．３（０．１４ｍｌ）とであった。。この中に０．０２５ｍｇ／ｍｌの
Ｃ１ｓ（カル・バイオケム社）（０．０１ｍｌ）を加えて反応を起こさせ、その
際の吸収度の増加を、ベックマンＤＵ６５０分光光度計内で、４０５ｎｍにおい
てチェックした。

【００６６】 表２は、酵素を水に置き換えた同様のキュベットでバックグラウンドを差し引
いた後の、酵素触媒反応率を示している。酵素を水に置き換えた際の反応率は、
各実験において、０．０３乃至０．１１ｍＡｂｓ／分を示した。表２は、ヘメン
テリア・オフィシナリス種、ヘメンテリア・ギリア−ニ種の双方のヒルからの抽
出物が持つ、Ｃ１ｓを抑制する能力を明らかにし、この酵素の抑制剤の存在を示
している。

【００６７】

【表２】

【００６８】 実施例３ Ｈ．ギリア−ニ種のヒルの活性分画による、古典的補体経路の抑制 ヘメンテリア・ギリア−ニ種のヒルは後唾液腺に豊富な補体抑制因子をもって
いるため、この実施例における材料に使われた。１５０の個体から取った腺を、
２０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ８．０（４ｍｌ）内で均質化し、遠心分離を行った
。ペレットをさらに２回、４ｍｌの緩衝液とともに抽出し、上澄みを保存した。
上澄みを取り出し、それまでトリス塩酸 ｐＨ８．０内で平衡を保っていたＱ−
セファロ−スの６０ ×１００ｍｍのカラムに注いだ。蛋白を開始緩衝剤から溶
離し、トリスを含んだ１Ｍの食塩水に線状勾配によって移し、２８０ｎｍにおけ
る吸収を検査した。ＣＡＥメソッドの検出（実施例１参照）に先立ち、すべての
活性分画を、２回の変化を起こす間、１０ ｍＭの塩酸ｐＨ７．０（２０ボリュ
ーム）を通して透析し、次いで水（２０ボリューム）で透析した。抑制活動は、
約０．７５Ｍの食塩水において溶離された。

【００６９】 さらに、それまで２０ｍＭのソジウムアセテ−トｐＨ ５．０内で平衡を保っ
ていたＣＭ−セファロ−スの５０×１００ｍｍのカラムで、クロマトグラフィに
よる精製を行った。Ｑ−セファロ−スから得られた活性分画を、２０ｍＭのソジ
ウムアセテ−ト ｐＨ ５．Ｏを通して透析し、カラムに戻した。次いで蛋白を
開始緩衝液から溶離し、同じ緩衝液を含んだ１Ｍの食塩水へと、線状勾配により
移した。ＣＡＥメソッドによる検出に先立って、活性分画を水で十分に透析した
。抑制活動は、約０．６Ｍの食塩水において溶離された。

【００７０】 凍結乾燥の後、活性分画を水の中で再構築し、それまでリン酸緩衝液 ｐＨ７
．４のなかで平衡を保っていたス−パ−デクス７５の１６×６００ｍｍのカラム
に注いだ。ＣＡＥメソッドによる活性分画の直接検出により、０．５２乃至０．
６６ボリュームにおいて、抑制活動のピークが溶離された。活動分画は、減少条
件において、ＳＤＳ ＰＡＧＥとの相同性を示し、見掛け上の分子量は２４．７
ｋＤａであった。

【００７１】 活性分画のサンプルを、それまで０．１％のｖ／ｖトリフルオロ酢酸の中で平
衡を保っていた、リバ−スフェ−ズのＰｒｏＲＰＣ ＨＰＬＣ（アマ−シャム・
ファ−マシア・バイオテック社、英国）の５×１０ ｍｍのカラムに注いだ。次
いでサンプルを、線状勾配を用いて、当初の緩衝液から溶離し、０．１％のｖ／
ｖトリフルオロ酢酸中にある７５％のｖ／ｖアセトニトリルへと移した。２１０
ｎｍにおける吸収度を見て抽出度をチェックした。減少条件において、ＳＤＳ
ＰＡＧＥと相同である単独のピークが溶離され、これはＣＡＥメソッドによって
溶離された補体の抑制活動を含んでいた。

【００７２】 実施例４ 部分的（Ｎ末端）アミノ酸配列 実施例３が説明する、ＰｒｏＰＲＣ ＨＰＬＣから取られ、ピークを含んだ分
画には、応用バイオシステム ４７３Ａの自動シークエンサによる、Ｎ末端から
の単位値アミノ酸配列を示す蛋白（今後、「ヘモスタシン」と名付ける）が含ま
れている。最初の１０のアミノ酸を定義した後、最初の２９のアミノ酸配列が発
見された。

【００７３】

【式４】 Ｘ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｐ−Ｋ−Ｘ´−Ｑ−Ｋ−Ｑ−Ｅ−Ｄ−Ｃ−Ｇ−Ｓ−Ｗ−
Ｄ−Ｌ−Ｋ−Ｃ−Ｎ−Ｗ−Ｖ−Ｔ−Ｋ−Ｋ−Ｃ−Ｅ− ここで、ＸとＸ´は、これ以前定義されたとおり、 それぞれ［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：１４及び１５］を表す。

【００７４】 ＰｒｏＲＰＣ ＨＰＬＣから取られ、最高値を含む分画のＬｙｓＣエンドプロ
テア−ゼによる消化、及びｐｒｏＲＰＣ ＨＰＬＣによる蛋白質分解の分画の精
製により、当ポリペプチドについて二つの内因性配列が定義された。

【００７５】 実施例５に記載したように、この配列情報は、配列のための二本鎖ＤＮＡ作成
ができるプライマ−のデザインを可能にした。

【００７６】 実施例５ ヘメンテリア．ギリア−ニ属のヒルから取ったｍＲＮＡ及び部分性ｃＤＮＡ配
列、遺伝子組み替えをしたＤＮＡベクトルとプラスミド アンビオン・ミクロ（Ａ）ピュアキット（米国テキサス州オースティン、ウッ
ドワード・ストリ−ト２１３０、アンビオン社）に説明されているグアンジュウ
ム・チオシアン酢酸溶液（８ｍｍ）内で、凍結した組織を溶かす事によって、ヘ
メンタリア・ギリア−ニ属のヒル２０体から、ｍＲＮＡを摘出した。ダウンス均
一化法に従い、希釈緩衝液（１６ｍｍ）が加えられ、撹拌され、遠心分離器にか
けて（１２０００ｇ，摂氏４度、１５分間）上澄みをすくいとった。上澄みは室
温で６０分間、オリゴｄＴ（デオキシチミジン）及びレジン（２０ｍｇ）と混ぜ
られ、遠心分離器にかけて（４０００ｇ、室温、３分間）収集された。オリゴｄ
Ｔのペレットはその後、多量の食塩と結合した緩衝液（１ｍｌ）の添加と、撹拌
と、遠心分離（４０００ｇ、室温、３分間）との３サイクルで処理された。最終
的なペレットを、撹拌カラムに加えられた洗浄用緩衝液（０．５ｍｌｓ）に再懸
濁させ、遠心分離器にかけた（５０００ｇ、室温、２０秒間）。カラムは更に３
回、同じように洗浄緩衝液（５ｍｌｓ）の添加と遠心分離によって洗浄された。
結合したポリＡ ＋ ＲＮＡ を、アンモニウム・アセテート（２０μｌ）、グ
リコーゲン（１μｌ）エタノール（５５０μｌ）の存在下で、予熱された（６５
℃）抽出緩衝剤（１００μｌ）の添加と、遠心分離と、沈積とによって収集し、
−２０℃で保存した。

【００７７】 上記のように分離したｍＲＮＡの半量を使い、逆転写によって相補性のＤＮＡ
鎖を構成した。エタノール標品（４００μｌ）を遠心分離器に掛け、ペレットを
蒸留水（８μｌ）内で溶解させた。ｍＲＮＡ（７μｌ）と，ｄＮＴＰｓ混合物（
ベイリンガ−・マンハイム社）（各２．５ｍＭ）（４μｌ）と，ランダム六量体
プライマ−（２μｌ）と，蒸留水（３μｌ）、逆転写反応生成物（ＲＴ−ＰＣＲ
）とを有するアンビオン・レトロスクリプト・キットを使用して、逆転写反応生
成物（ＲＴ−ＰＣＲ）を組み立てた。この溶液を、８５℃において３分間培養し
、ＰＴ−ＰＣＲ 緩衝剤（１０ｘ 凝縮状態で２μｌ）と、胎盤性ＲＮＡａｓｅ 抑制剤（１μｌ）と，Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（１μｌ）とを、氷上で添加した
。反応生成物を４２℃において８０分間反応させ、９２℃で１０分間培養して非
活性化した。反応生成物は−２０℃で保管された。

【００７８】 ＰＴ−ＰＣＲを使って、配列を作る二本鎖ｃＤＮＡの生成した。上で用意され
た第一鎖ｃＤＮＡ、及び実施例４に示された既知のアミノ酸配列に相当し、記号
をＡ、Ｂと縮小された二つのプライマ−を使い、反応生成物を組み立てた （ア
ンビオン・レトロスクリプト・キット使用）。使われた物は、上記の逆転写酵素
反応生成物（５μｌ）と，反応緩衝剤（１０× 凝縮状態で５μｌ）と，ｄＮＴ
Ｐｓ混合物（各２．５ｍＭ）（２．５μｌ）と，５μＭ プライマ−Ａ（２．５
μｌ）と，５μＭプライマ−Ｂ（２。５μｌ）と、ス−パ−Ｔａｑ+ ２単位（ア
ンビオン）（０．５μｌ）と、蒸留水（２２μｌ）とである。反応生成物混合物
を９４℃で２分間変性させ、テクネ・ジニアスＤＮＡサ−マルサイクラ−内で、
９４℃で３０秒と、４５℃で６０秒と、７２℃で９０秒とを１サイクルと設定し
て、３０サイクル循環させた。最終的な培養は７２℃で１０分間行われた。結果
としてできたＰＣＲサンプルは、特異性を増加させるため、実施例４に説明され
たアミノ酸配列に基く別のプライマ−類を使用したＰＣＲに、更に一過程掛けら
れた。この反応生成物混合物は、上記ＰＣＲ反応生成物（５μｌ）と，Ｔａｑ緩
衝剤（英国ペイズリ−市、インチナン・ビジネス・パ−ク、ライフ・テクノロジ
ーズ社）（１０×凝縮状態で５μ）と、ｄＮＴＰｓミックス（各２．５ｍＭ）（
２．５μｌ）と，プライマ−Ｃ（５μｌ）（２．５μｌ）と，プライマ−Ｄ（５
μｌ）（２．５μｌ）と，Ｔａｑ（ライフ・テクノロジーズ社）（１Ｕ）（０．
２５μｌ）と，蒸留水（３４．７５μｌ）とから成る。この反応生成物混合物を
、９４℃で２分間間変性させ、さらにテクネ・ジニアスＤＮＡサ−マルサイクラ
−内で、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で９０秒間を１サイクル
と設定して、３０サイクル循環させた。最終の培養は７２℃で１０分間、行われ
た。

【００７９】 １％のアガロ−ス・ゲルの電気泳動移動度を可視化した際、およそ２５０の塩
基対からなる単独のＤＮＡ帯を、ＰＣＲ反応生成物の中に確認した。このＤＮＡ
断片を、プロメガ・ウィザ−ド・プレップ・カラムで精製し、プラスミド・ベク
トルｐＣＲ２．１（インヴィトロゲンＴＡクロ−ニング・キット）に結合させた
。結果としてできた遺伝子組み替えプラスミドは、強力な大腸菌（ＩＮＶαＦ´
）と、遺伝子組み替え群生クロ−ンと、生成されたプラスミドＤＮＡとに導入さ
れた。プラスミドはＡＢＩシ−ケンサ上に配列され、有効なアミノ酸配列に対応
するｃＤＮＡ配列が［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６］と確認された。

【００８０】 実施例６ 完全ｃＤＮＡ配列 実施例５で分離されたｍＲＮＡに残りの半分を使い、新しく１処理単位のｃＤ
ＮＡを用意し、ｃＤＮＡ末端速成増幅剤（ＲＡＣＥ）を使って、配列全体から５
´末端と３´末端を次のように分離した。すなわち、ｍＲＮＡ（４００μｌ）の
エタノール溶液を遠心分離器に掛け、結果として出たペレットを、蒸留水（４μ
ｌ）内で溶解した。逆転写反応生成物は、クロ−ンテク・ｃＤＮＡ増幅キット（
英国ベイシングスト−ク市、ウェイドロ−ド、クロ−ンテク・ラボラトリ−ズ英
国社）の，ｍＲＮＡ（４μｌ）とオリゴｄＴプライマ−（１μｌ）を使って、組
み立てられた。この溶液を、７０℃で２分間培養し、続いて第１鎖緩衝剤（１０
×凝縮状態で２μ）と、ｄＮＴＰｓ混合物（各１０ｍＭ）（１μｌ）と，ＡＭＶ
逆転社酵素（２０Ｕ）（１μｌ）と，蒸留水（１μｌ）とを氷上で添加した。反
応生成物は４２℃で６０分間、反応させた。次いで、第一鎖反応生成物（１０μ
ｌ）と，蒸留水（４８．４μｌ）と、第二鎖緩衝剤（５×凝縮状態で１６μｌ）
と、ｄＮＴＰｓ混合物（各１０ｍＭ）（１．６μｌ）と、２０×第２鎖酵素カク
テル（４μｌ）とを氷上で添加した。この混合物を１６℃で９０分間培養した。
続いて、Ｔ４ＤＮＡポリメラ−ゼ（２μｌ）を加え、１６℃でさらに４５分間培
養を続けた。１０ｍＭのＥＤＴＡによって反応を停止させ、フェノール／クロロ
フォルムによって純粋なＤＮＡを抽出し、それをエタノールで沈殿させた。ペレ
ットは蒸留水（１０μｌ）内で溶解した。

【００８１】 分離を促進するため、二本鎖のｃＤＮＡ（５μｌ）と，５×結紮緩衝剤（２μ
ｌ），マラソンアダプタ−配列（１０μＭ）（２μｌ）と，Ｔ４リガ−ゼ（１Ｕ
）（Ｉμｌ）とを１６℃で１４時間培養する方法で、マラソンアダプタ配列を、
二本鎖ｃＤＮＡの端に結び付け、その後、７０℃で５分間、転写を終了させた。
次いで、トリシンＥＤＴＡ緩衝剤（１０ｍＭのトリシン−ＫＯＨ ｐＨ８．５，
０．１ｍＭのＥＤＴＡ）（２４０μｌ）を添加した。

【００８２】 実施例５で生成された配列に基き、特定のプライマ−類（プライマ−ＥとＦ）
をデザインした。配列全体から５´末端と３´末端を分離するために、ＲＡＣＥ
を使用した。ここでデザインされた培養剤は、１０×ＰＣＲ反応生成物緩衝剤（
５μｌ）と、ｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ））（１ｍｌ）と，５０ｍＭのＭｇＣｌ （１．５μｌ）と，Ｔａｑ（２Ｕ）（０．５μｌ）と，蒸留水（３５μｌ）と
である。５´末端のためにはｃＤＮＡ（５μｌ）と，ＡＰ１プライマ−（コンテ
ック社）（１μｌ）と、１０μＭのプライマ−Ｅ［ＡＧＴＧＴＴＧＣＡＡＧＴＡ
ＣＡＧＡＡ］（１μｌ）とをデザインした。また３´末端のために、ｃＤＮＡ（
５μｌ）と，ＡＰＩプライマ−（１μｌ）と、遺伝特定プライマ−Ｆ［ＡＡＧＡ
ＡＡＴＧＣＧＡＡＴＧＣＡＧＧ］（１０μＭ）とをデザインした。反応生成物混
合物を、９４℃で２分間変性させ、テクノジニアスＤＮＡサ−マルサクラ−で、
９４℃で３０秒、４５℃で６０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとして３０サイ
クル循環させ、最終培養を７２℃で１０分間行った。

【００８３】 ＤＮＡｃ断片は実施例５で説明したように精製され、配列された。この際、実
施例４に定義されたアミノ酸配列に相当する配列が定義された。この結果、ヘモ
スタシンを記号化するヌクレオチド配列がさらに２つ、解明された。完全なＤＮ
Ａ配列［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４］と、変異体ＤＮＡ配列［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
：５］である。このＤＮＡから、３つのヘモスタシン変異体［ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：３，７，８］の完全なアミノ酸配列が推定された。移動後の修飾は考えず、
アミノ酸配列に基いて計算された分子量は、およそ１４、２００Ｄａであった。
ヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：５，６］はどちらも５´末端に、リ
ーダーアミノ酸配列［ＭＳＦＫＩＶＬＬＬＦＬＶＶＣＶＶＡＳＬＡ］を備えてい
る。これは抽出された自然の蛋白のＮ末端には付着しない。

【００８４】 実施例７ ヘモスタシン１によるＸＩＩ因子活性化の抑制ＸＩＩ因子活性化についてのヘ
モスタシン１の効果（実施例３、４を参照）を、色素による検査によって調べた
。キュベットに、アセトン０．３３ボリュームを使ったヒトの血漿の処理及び１
０分間の培養によって用意されたアセトン処理の血漿の上澄み（０．０２５ｍｌ
）と、３．３６ｇ／ｌＥＤＴＡ ｐＨ７．９を含んだ５０ｍＭのトリス塩酸緩衝
液と、１０μＭのダイズトリプシン抑制剤（０．０４ｍｌ）と、抑制剤サンプル
あるいはリン酸緩衝をした食塩水（０．１ｍｌ）と、４０μｇ／ｍｌのデキスト
ラン硫酸塩（０．１ｍｌ）とを用意した。以上の物を、２０℃で１０分間培養し
、０．８７ｍＭのＳ２３０２（クアドラテク社）添加をした後、４０５ｎｍで吸
収率変化を計測したところ、βＸＩＩａ因子が、検出された。ヘモスタシン１は
、ＸＩＩ因子の活性化を抑制するが、その程度は濃度によって異なる。デキスト
ラン硫酸塩の濃度を変える事により、およその競合的反応速度が明らかになり、
Ｋｉ値が０．３１μｇ／ｍｌまで計算された。

【００８５】 実施例８ 活性化された部分的トロンボプラスチン検出−ヘモスタシン１ ヘモスタシン１の効果が、血漿凝固に基く従来の方法によって検査された。ま
ず、ヘモスタシン濃度が０．０２乃至１．２３μＭの範囲であるか、あるいはそ
れと等量の緩衝制御液を有するヒトの血漿のサンプルが作られた。このサンプル
について、組織トロンボプラスチンによる活性化が行われる際に凝固発生に掛か
る時間（１段プロトロンビン時間）、トロンビンによる活性化の際の同時間（ト
ロンビン時間）、トロンボシル（オ−ソ・ディアグノクティックス、アマ−シャ
ム、バックス）による活性化の際の同時間（活性トロンボプラスチン時間）が、
シンタックスＣＡ５０００自動凝固計によって計測された。ヘモスタシン１によ
り、活性化された部分的トロンボプラスチン時間が延長された。３．８μｌ／ｍ
ｌ濃度は、活性化トロンボプラスチン時間を、５０％延長した。ＸＩＩ因子に関
するヘモスタシン効果は、血漿の凝固を抑制するその能力に反映されていた。

【００８６】 実施例９ ＣＡＥ検査におけるヘモスタシン１の容量反応効果 実施例３のように用意されたヘモスタシン１のＩＣ_５０を、実施例１に説明し
たように、ＣＡＥ検査で調べた。検査中、ヘモスタシンの濃度を変えると、効果
は０．２４１μｇ／ｍｌのＩＣ_５０で容量反応的であった。

【００８７】 実施例１０ 古典的なＣＨ_５０検査−ヘモスタシン１ 古典的な補体経路は、抑制剤溶血検査によってを示すことができる。この検査
において抑制剤は、抗体で被膜した赤血球を溶解させる補体能力を抑制する。溶
解は、４０５ｎｍにおいてリリースされたヘモグロビンを計測する事で数量化さ
れる。実施例３において用意されたヘモスタシン１のＣＨ_５０を、標準的な溶血
（ＣＨ_５０）検査において検査した。トリエタノ−ルアミン緩衝食塩水（ＴＢＳ
−Ｇ）（１２８．３ｍＭの食塩と、１７．７ｍＭの塩酸と、２０．６ｍＭのトリ
エタノ−ルアミンと、０．５ｍＭの塩化マグネシウムと、０．１５ｍＭの塩化カ
ルシウムと、０．０５％（ｗ／ｖ）のゼラチン。ｐＨ ７．３５）の中で、２０
００ｒｐｍで１０分間の遠心分離作用と再懸濁により、ヒツジの赤血球を３回洗
浄した。ＴＢＳ−Ｇ（４ｍｌ）の中で１：２００に希釈したヘモリシン（ハ−ラ
ン・セララブ社）を、赤血球（４ｍｌ，ＴＢＳ−Ｇ内で１：４に希釈）に加え、
まず３７℃で３０分、次いで０℃でさらに３０分、定期的に撹拌しながら培養し
た。その結果、赤血球は抗体で被膜された。この赤血球を、ＴＢＳ−Ｇのなかで
２回洗浄し、２．５％（ｗ／ｖ）のグルコースと０．１％のソジウムアジドとを
補充したＴＢＳ−Ｇ内で再懸濁させ、さらにＴＢＳ−Ｇで希釈した結果、赤血球
は４０５ｎｍで完全に溶けて吸収性を示すようになった。

【００８８】 この検査においては、微量定量プレートの窪みに、ＴＢＳ−Ｇ（０．２ｍｌ）
或いは抗体で覆われた赤血球を加えた水（０．０５ｍｌ）を入れ、それぞれ溶血
度が０％乃至１００％の場合における吸収度を示した。試験用の窪みに、ＴＢＳ
−Ｇ（０．１ｍｌ）、ヘモスタシン、リン酸塩緩衝血清（ＰＢＳ）（０．０５ｍ
ｌ），ＴＢＳ−Ｇ中で希釈されて７５％の溶血（０．０５ｍｌ）を示すヒト血清
（補体）、赤血球（０．０５ｍｌ）を入れた。このプレートに蓋をし、３７℃で
１時間培養し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み（０．２ｍｌ）を
平たい窪みを持つ微量定量プレートに移し、４０５ｎｍで吸収度を読み取った。
溶解率は、ＰＢＳ（表３）と比較された。検査中、ヘモスタシンの濃度を変える
事によって、効果が０．０１９μｇ／ｍｌのＩＣ_５０に容量反応を示した。

【００８９】

【表３】

【００９０】 実施例１１ 補体作用の副経路 − ヘモスタシン１による無抑制 補体作用は、古典的な経路の他にも、カルシウムイオンのキレ−ト化とマグネ
シウムイオンの提供による副経路で行う事ができる［サ−バスＧ，ウォルマ−Ｊ
，デュカトウＪ，イムノル メス、１４０：９３−１００（１９９１）］。ウサ
ギの赤血球を、１０ｍＭのＥＧＴＡと７ｍＭの塩化マグネシウムｐＨ７．２（す
なわちＶＣＭ−ＭＥＧ）を含んだゼラチン状動脈緩衝液内で、２０００ｒｐｍで
１０分間の遠心分離と再懸濁によって４回洗浄した。微量定量プレートの窪みに
、ＶＣＭ−ＭＥＧ（０．１５ｍｌ）と，テストサンプル（０．０７５ｍｌ）と、
ＶＣＭ−ＭＥＧで１：４に希釈したヒトの血漿と、１％ ｖ／ｖ の洗浄ずみの
赤血球（０．０７５ｍｌ）とを入れた。プレートに蓋をして３７℃で４５分間培
養し、その後、０．２ＭのＥＤＴＡ（０．０２２５ｍｌ）の添加と、１０００ｒ
ｐｍでの３分間の遠心分離と、新しい、平底の微量定量プレートへの上澄み（０
．１ｍｌ）の移動とを行い、４０５ｎｍで吸収度を読み取った。溶血率を、ＰＢ
Ｓ緩衝液の対照と、血漿を除いたサンプル（０％溶血）と、水（０．０１５ｍｌ
）をＶＣＭ−ＭＥＧ緩衝剤（１００％溶血）に代えた例とに比較した。２０μｇ
／ｍｌまで、ヘモスタシン１によって副経路が大きく抑制されている例は見られ
なかった。

【００９１】 実施例１２ 補体Ｃ１ｓのためのヘモスタシンの選択 多様なセリン・プロテア−ゼのためのヘモスタイン１の選択を、色素を使った
基質検査の中で行った。この検査においては、公表されたＫｍか、それに近い濃
度を持つ市販の基質を使った。多様な濃度のヘモスタシン１を入れたキュベット
において、４つのニトロアニリドの基質からのリリースを４０５ｎｍで行い、酵
素率グラフを分光光度計でチェックした。組織カリクレインは、パデュティン（
ドイツ、リバ−ク−セン市、バイエルＡＧ社）であり、血漿カリクレインはクア
ドラテク社（英国、サリ−州、エプソン）の製品であった。 βＸＩＩａ因子は、正常なヒトの血漿から、０．３３ボリュームのアセトンによ
る血漿処理、次いで遠心分離によって、活性化された。アセトン処理をした血漿
（０．０２５ｍｌ），３．３６ｇ／ｌ ＥＤＴＡ ｐＨ（０．０７５ｍｌ）を含
む５０ｍＭのトリス塩酸、リン酸塩緩衝食塩水（０．１ｍｌ），１０μＭのダイ
ズトリプシン抑制剤（シグマ社）（０．０４ｍｌ）及び４０μｇ／ｍｌデクスト
ラン硫酸塩（０．１ｍｌ）を１０分間、３７℃で培養し、次いでヘモスタシン１
或いはその担体であるリン酸塩処理をした食塩水（０．１ｍｌ）のいずれかの存
在下で、２２ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．９（０．４６ｍｌ）内の塩基Ｓ２３０２
を、０．８７ｍＭ，加えた。

【００９２】 ＸＩａ因子を、同様に、正常なヒトの血漿から活性化し、２．５μｌ／ｍｌの
トウモロコシトリプシン抑制剤（英国バックス市、ジェランズクロス、ロ−・リ
エージェント社）の存在下で、Ｓ２３６６を使った検査を行い、βＸＩＩ因子に
よる基質排除を抑制した。

【００９３】 ヒトのトロンビンをＮＩＢＳ社（英国ポッタ−ズ・バ−、ブランシュ・レ−ン
）から購入した。その酵素、Ｃ１ｒ（シグマ社）、Ｃｌｓ（カル・バイオケム社
）を３７℃で１時間培養し、次いでその活性化を許す使用をした。補体因子Ｄは
、シグマ・ケミカル社から購入した。 表４は、ヘモスタイン１は、以上の酵素すべてのＣｌｓ補体因子を抑制するにと
どまり、他のものについては７．４ｇ／ｌまで効果を示さない事を示している。

【００９４】

【表４】

【００９５】 実施例１３ ヘモスタイン１によるＸＩ因子活性の抑制 ＸＩ因子の活性はαＸＩＩａ因子の生成によって決まるため、その活性化もま
た、ヘモスタシンで抑制される事が予想される。血漿は、アセトン処理をした血
漿（０．０２５ｍｌ）と，３．３６ｇ／ｌ ＥＤＴＡ ｐＨ７．９（０．０７５
ｍｌ）を含む５０ｍＭのトリス塩酸と，１０μＭのダイズトリプシン抑制剤（０
．０４ｍｌ）と，２０℃で１０分間培養された抑制剤サンプルあるいはリン酸塩
緩衝した食塩水（０．１ｍｌ）を入れたガラス製キュベット内における、多様な
濃度の存在下或いは不在下で活性化された。Ａ ０．３ｍｌサンプルを、５０ｍ
Ｍのトリス塩酸ｐＨ ７．９（０．２６ｍｌ）と，５０μｇ／ｍｌトウモロコシ
トリプシン抑制剤（０．０４ｍｌ）と，４ｍＭのｓ２３６６（０．２ｍｌ）とを
入れたキュベット内での撹拌によって、ＸＩ因子ａの活性化について検査した。
ＸＩ因子のガラスによる活性化は、７．４μｇ／ｍｌのＩＣ_５０によって抑制さ
れた。

【００９６】

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１月２７日（２０００．１．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 37/02 ４Ｈ０４５ 9/10 43/00 29/00 Ｃ０７Ｋ 14/815 37/02 Ｃ１２Ｎ 1/21 43/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/815 Ａ６１Ｋ 35/62 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ａ６１Ｋ 35/62 37/64 (72)発明者 フィニー，サラ イギリス国 ミッド グラモルガン シー エフ32 ９ディーユー ブリジェンド ト ンドゥ グラン−ワイ−ナント 122 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA19 CA04 EA04 GA11 HA03 HA17 4B064 AG21 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 BA02 BA07 BA22 BA23 CA51 CA53 DC32 DC41 NA14 ZA022 ZA152 ZA162 ZA362 ZA402 ZA512 ZA542 ZA552 ZA662 ZA812 ZA842 ZA892 ZA942 ZA962 ZB072 ZB082 ZB112 ZB132 ZB152 ZB322 ZB352 ZC062 ZC542 4C087 AA01 AA02 BB12 NA14 ZA02 ZA15 ZA16 ZA36 ZA40 ZA51 ZA54 ZA55 ZA66 ZA81 ZA84 ZA89 ZA94 ZA96 ZB07 ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB32 ZB35 ZC06 ZC54 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA50 DA56 EA20 EA24 FA72 FA73 FA74

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘメンテリア属のヒルから抽出され、ＣＬエステラ−ゼ及び
   ／又は第ＸＩＩ因子活性化の抑制に適したポリペプチド。
2. 【請求項２】 Ｎ末端に［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１］を有する請求項１記載
   のポリペプチド。或いは実質的にそれと相同或いは相似であるポリペプチド、ま
   たはこれらのいずれかの派生物、生物的前駆物質、塩類。
3. 【請求項３】 ＳＤＳ ＰＡＧＥ上に、２０から２５ ｋＤａ の間の分子
   量と一致する電気泳動移動度を有する、請求項２記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 ［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：２ 或いは１１乃至１５］のいず
   れかを有する請求項２記載のポリポプチド。
5. 【請求項５】 ［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：３，７，８］のいずれかを有する
   請求項３記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 Ｎ末端に端を切った形態の［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１］を有
   する請求項１記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】 例えば［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３］を有するポリペプチド
   など、Ｃ末端に端を切った形態の［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３，７，８］を有する
   請求項１記載のポリペプチド。
8. 【請求項８】 ヘメンテリア・ギリア−ニ種、あるいはヘメンテリア・オフ
   ィシナリス種のヒルから抽出される、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチ
   ド。
9. 【請求項９】 分離、精製、あるいは遺伝子組み替えをされた、前記請求項
   のいずれかに記載のポリペプチド。
10. 【請求項１０】 ａ）請求項１から９のいずれかで定義されたポリペプチド
    を記号化する配列、 （ｂ）より厳しい条件下で、配列（ａ）と実質的に相同であるか、あるいはそ
    れとの間に雑種を成す配列、 （ｃ）遺伝記号の変異がない場合に、配列（ａ）（ｂ）と実質的に相同である
    か、それと雑種を形成する配列、及び （ｄ）（ａ）（ｂ）（ｃ）の配列のいずれかに特有のオリゴヌクレオチド、 を含む核酸配列。
11. 【請求項１１】 ＤＮＡ配列を含む、請求項１０に記載の核酸配列。
12. 【請求項１２】 ［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４］を有する請求項１０或いは請
    求項１１に記載の核酸配列。
13. 【請求項１３】 ［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ．５或いは６］のいずれかを有す
    る請求項１０或いは請求項１１に記載の核酸配列。
14. 【請求項１４】 分離、精製、あるいは遺伝子組み替えをした、請求項１０
    から１３のいずれかに記載の核酸配列。
15. 【請求項１５】 核酸配列を有する、請求項１０乃至１４のいずれかの遺伝
    子組み替え構造。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の構造を有するベクトル。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載のベクトルによって形質変換され、或い
    は核酸細胞に感染を受けた宿主。
18. 【請求項１８】 請求項１０乃至１４のいずれかに記載された核酸配列を組
    み込んだ細胞、プラスミド、ウイルス、生組織、その他の担体。
19. 【請求項１９】 請求項１乃至９のいずれかに記載のポリポプチド、あるい
    は請求項１０乃至１８のいずれかに記載の核酸配列の、遺伝子治療を含む医学的
    使用法。
20. 【請求項２０】 請求項１乃至９のいずれかに記載のポリポプチドの、薬剤
    学的処方における使用法。
21. 【請求項２１】 請求項１乃至９のいずれかに記載のポリペプチドを有する
    薬剤学的薬処方、及び薬剤学的に受け入れられるそのキャリア。
22. 【請求項２２】 静脈内など非経口的使用、経口的使用、或いは局所的使用
    における、請求項２１に記載された処方。
23. 【請求項２３】 Ｃ１エステラ−ゼ開始及び／又はＸＩＩ因子の活性化に関
    連する病状或いは不調の治療或いは予防における、請求項１から９に記載された
    ポリペプチドの使用法、あるいはその処方、あるいはその核酸配列記号。
24. 【請求項２４】 Ｃ１エストラ−ゼの開始及び／又はＸＩＩ因子の活性化に
    関連する病状或いは不調の治療或いは予防のための方法であって、請求項１乃至
    ９のいずれかに記載の効力ある抑制剤、あるいはその処方が必要な際の、患者へ
    の投与方法を含む方法。
25. 【請求項２５】 ポリポプチドが患者の細胞内への発現によって投与される
    、請求項２４に記載の方法であって、この細胞が、請求項１０乃至１４のいずれ
    かに記載の核酸配列を組み込んでいる方法。
26. 【請求項２６】 請求項１９、２０、２３乃至２５のいずれかに記載の使用
    方法であって、病状或いは不調が心血管病、炎症、自己免疫症状の一つ或いは複
    数を含む方法。
27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の使用方法であって、病状或いは不調が
    、重度の静脈血栓、肺塞栓症、血管形成と動脈内膜切除に関係する血栓症、血液
    透析、心肺バイパス、移植器官あるいは組織の反発、敗血症、心筋梗塞、卒中、
    虚血期後の再灌流による組織の損傷、ショック、脈管炎、リューマチ性関節炎、
    鎌状血球貧血、血管浮腫、狼瘡関節炎などの自己免疫性疾病、糸球体腎炎、腎炎
    、腎障害、全身硬化、べ−チェット症候群、大脳狼瘡、ギランバレ−症候群、多
    種の硬化、重症筋無力症、天疱瘡、水泡性天疱瘡、光毒性反応、熱性火傷、過敏
    症、喘息、皮膚反応、感染、炎症性腸疾病、甲状腺障害、不妊、アルツハイマー
    病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、溶血性貧血のうち一つ或いは複数である使用
    方法。
28. 【請求項２８】 請求項１から９のいずれかに記載されたポリピプチドの準
    備方法であって、 （ａ）ヘメンテリア属のヒルからの組織或いは抽出物の分離及び／又は精製、或
    いは （ｂ）ポリペプチドを記号化する核酸配列の発現及び結果として生まれるポリポ
    プチドの任意による分離及び／又は精製、 を含む方法。
29. 【請求項２９】 これまで説明されたものと実質を同じくし、特に実施例に
    関わるポリペプチド、核酸配列、処方、組み入れ、方法或いは使用法。