【発明の詳細な説明】
組織因子経路インヒビター3
本発明は、Kunitz型プロテアーゼインヒビターファミリーのメンバーであるポ
リペプチドをコードする、新規なヒト遺伝子に関する。より詳細には、組織因子
経路インヒビター-3(本明細書中以降TFPI-3と称する)と名付けられた、ヒトポ
リペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。TFPI-3ポリペプチド
もまた提供され、同様に、ベクター、宿主細胞およびこれらを産生するための組
換え方法もまた提供される。脈管止血に関する障害を検出するための診断方法お
よびこのような障害を処置するための治療方法もまた提供される。本発明はさら
に、TFPI-3のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング
方法に関する。
発明の背景
プロテアーゼは、細胞増殖、分化および死(アポトーシス)、細胞栄養、細胞
内および細胞外タンパク質の代謝回転(ハウスキーピングおよび修復)、細胞移
動および侵襲、ならびに受精および着床を含む全ての身体的機能を、直接的また
は間接的に担っている。これらの機能は、止血および炎症のようなカスケード系
、ならびに物理学および病態生理学の全てのレベルで複雑なプロセスを作り出す
ために、細胞レベルから器官および生物体レベルへ拡大される。
脈管統合性の維持は、傷害に対する重要な宿主応答である。凝固、血小板の機
能、および線維素溶解の複雑な止血機構は、脈管傷害の有害な結果を最小にし、
そして脈管修復を促進するために存在する。これらの止血機構の多くは、血管壁
の細胞によって開始および/または調節される。
組織因子経路インヒビター(TFPI)は、組織因子が開始する血液凝固の調節に
重要な役割を果たす細胞表面関連タンパク質である。ヒトTFPIは、内皮細胞によ
り主に合成される、微量の42kDaの血漿糖タンパク質であり、そして負に荷電し
たアミノ末端領域、3つのタンデムなKunitz型インヒビタードメイン、および高
度に塩基性のカルボキシ末端テールからなる(Wun T.C.ら、J.Biol.Chem.263
:6001(1988))。成熟タンパク質は、22残基のシグナルペプチドの後に、18のシ
ステインを有する213アミノ酸を含む。TFPIは、第Xa因子との複合体を形成し、
そしてそのアミド分解活性およびタンパク質分解活性を阻害する。第Xa因子-TFP
I複合体は、迅速に第VIIa因子-組織因子複合体の活性を阻害する。
第2の組織因子経路インヒビター(TFPI-2)をコードする遺伝子のクローニン
グおよび特徴が報告された(Sprecher,C.A.ら.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
,91,3353-3357(1994))。この遺伝子は、1次配列相同性および構造的類似性に
基づいて最初に同定された。続く特徴として、プロテアーゼインヒビターとして
のその推定される活性を確認した。止血系の改変は、新生物形成および外傷のよ
うな原因から生じる。このような改変は、静脈血栓症、肺性塞栓症、心房細動、
脳血栓、および血友病のような血栓性の障害の増加した発症率を生じる。従って
、このような障害を検出、予防、寛解、または矯正する役割を果たし得る凝固経
路のインヒビターとして機能するポリペプチドの同定および特徴付けについての
必要性が存在する。
発明の要旨
本発明は、配列番号2に示される完全なアミノ酸配列または1996年11月20日に
ATCC受託番号97797として寄託されたプラスミドDNAとしてのcDNAクローンにより
コードされる完全なアミノ酸配列を有するTFPI-3ポリペプチドの少なくとも一部
をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。ヌクレオ
チド配列は、寄託されたTFPI-3クローン(これは図1(配列番号1)に示される
)を配列決定することにより決定され、ヌクレオチド361〜363位でN末端メチオ
ニンをコードする開始コドンを含む、252アミノ酸残基の完全なポリペプチドを
コードするオープンリーディングフレームおよび約28.2kDaの推定分子量を含む
。
本発明のTFPI-3タンパク質は、以下の保存されたドメインを含む組織因子経路
インヒビター(TFPI)、TFPI-2およびアプロチニンについてのヒトmRNAの翻訳産
物と配列相同性を共有する:(a)第1の推定Kunitz型ドメインの約51アミノ
酸;および(b)第2の推定Kunitz型ドメインの約51アミノ酸、この両方は、血
液凝固を調節するに重要であると考えられており、そして図1の星印を下に付し
ている。図2に示されるヒトTFPIとTFPI-2とアプロチニンとTFPI-3との間の相同
性は、TFPI-3はプロテアーゼでもあり、そして血液凝固の調節に関与し得ること
を示す。本明細書中に記載されるプロテアーゼ阻害アッセイは、プロテアーゼ活
性を阻害するTFPI-3ポリペプチドの能力を確認する。
コードされたポリペプチドは、図1で下線を付した27アミノ酸の推定リーダー
配列を有する;そして推定成熟TFPI-3タンパク質のアミノ酸配列はまた、図1に
おいてそしてアミノ酸残基1〜225(配列番号2)として示される。
従って、本発明の1つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する:(a)配
列番号2の106〜156位でのアミノ酸配列を有するTFPI-3ポリペプチドの推定され
る第2のKunitz型ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
またはATCC受託番号97797に含まれるcDNAクローンによりコードされるようなヌ
クレオチド配列;(b)配列番号28として示されるアミノ酸配列を有するコンセ
ンサスKunitz型ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;お
よび(c)上記の(a)または(b)の任意のヌクレオチド配列に相補的なヌク
レオチド配列;ここで、(a)または(b)の核酸配列は、配列番号29、配列番
号30、または配列番号31(各々11頁に示される)として示される配列を含むポリ
ペプチドをコードしない。
本発明のさらなる実施態様は、上記(a)、(b)もしくは(c)の任意のヌ
クレオチド配列に、少なくとも90%同一な、そしてより好ましくは少なくとも95
%、96%、97%、98%、または99%同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチド、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記(a)
、(b)もしくは(c)のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオ
チドを含む単離された核酸分子を含む。このハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でA残基のみまたはT
残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズ
しない。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記(a)または(b)の
アミノ酸配列を有するTFPI-3ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列
をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、および組
換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞の作
製方法および組換え技術によるTFPI-3ポリペプチドまたはペプチドの産生につい
てのそれらの使用するための方法に関する。
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離さ
れたTFPI-3ポリペプチドを提供する:(a)配列番号2の106〜156位でのアミノ
酸配列を有するTFPI-3ポリペプチドの推定される第2のKunitz型ドメインを含む
ポリペプチドまたはATCC受託番号97797に含まれるcDNAクローンによりコードさ
れるようなポリペプチドのアミノ酸配列;または(b)配列番号28のアミノ酸配
列を有するコンセンサスKunitz型ドメインを含むポリペプチドのアミノ酸配列;
ここで、上記(a)または(b)の核酸配列は、配列番号29、配列番号30、また
は配列番号31として示される配列(各々は11頁に示される)を含むポリペプチド
をコードしない。
本発明のポリペプチドはまた、上記(a)もしくは(b)に記載のアミノ酸配
列に、少なくとも80%同一な、より好ましくは少なくとも90%同一な、そしてな
おより好ましくは95%、96%、97%、98%、または99%同一なアミノ酸配列を有
するポリペプチド、ならびに上記の配列に少なくとも90%の類似性、そしてより
好ましくは少なくとも95%の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含む。
本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の(a)または(b)に記載の
アミノ酸配列を有するTFPI-3ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列
を含むペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明のTFPI-3ポリペプチドの工
ピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少な
くとも6または7のアミノ酸、好ましくは少なくとも9のアミノ酸、そしてより
好ましくは少なくとも約30アミノ酸〜約50アミノ酸を有するこのようなポリペプ
チドの部分を含むが、上記に記載の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全体を
含むまでの任意の長さのエピトープ保有ポリペプチドもまた、本発明に含まれる
。
別の実施態様において、本発明は、上記(a)または(b)に記載のアミノ酸
配列を有するTFPI-3ポリペプチドに特異的に結合する単離された核酸を提供する
。本発明はさらに、本明細書中に記載のアミノ酸配列を有するTFPI-3ポリペプチ
ドに特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。このような抗体は
、以下に記載のように診断的にまたは治療的に有用である。
本発明はまた、TFPI-3ポリペプチド、特にヒトTFPI-3ポリペプチドを含む薬学
的組成物も提供する。これは、例えば、脈管内凝固を阻害する際ならびにインビ
トロおよびインビボの両方でフィブリン凝固の形成を妨げる際に、静脈血栓症の
予防において、およびその拡大を妨げるための処置としての抗凝血治療のため、
ならびに手術後の深部静脈血栓症および肺性塞栓症の予防のため、肺塞栓症およ
び塞栓症に伴う心房細動の予防および処置のための低用量の系統化を提供するた
め、動脈および心臓手術の際の凝固を予防するため、ならびに発作が現れる際の
脳血栓の予防のため、急性の心筋梗塞に伴う冠状動脈閉塞を処置するためならび
に末梢動脈の塞栓症の予防および処置の際に、敗血症、炎症性疾患および移植片
拒絶の処置のために、過剰線維素溶解性出血および外傷性出血ショックの処置に
、ならびに膵臓エラスターゼの過剰放出(膵炎)、血清エラスターゼの過剰放出
(関節硬化症)、結合組織の損傷に伴う急性および慢性の炎症での白血球エラス
ターゼの過剰放出に関連する疾患に、血管壁の損傷に、壊死性疾患に、および肺
組織の再生に用いられ得る。TFPI-3ポリペプチドが必要な個体を処置する方法も
また提供される。
本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞に、およびインビボ
で細胞に、または多細胞性生物に投与するための、TFPI-3ポリヌクレオチドまた
はTFPI-3ポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面のある特定の
好ましい実施態様では、この組成物は、疾患の処置のために宿主生物でTFPI-3ポ
リペプチドを発現させるためのTFPI-3ポリヌクレオチドを含む。この点において
特に好ましいのは、TFPI-3の異所性の内因性活性に関する機能障害の処置のため
のヒト患者での発現である。
本発明はまた、TFPI-3ポリペプチドの生物学的活性を増強または阻害し得る化
合物を同定するためのスクリーニング方法も提供する。この方法は、TFPI-3ポリ
ペプチドにより阻害されるプロテアーゼを、TFPI-3ポリペプチドおよび選択した
プロテアーゼにより切断可能な基質の存在下で、候補化合物と接触させる工程、
候補化合物およびTFPI-3ポリペプチドの存在下で、このプロテアーゼのプロテア
ーゼ活性を阻害する活性をアッセイする工程、そして活性の標準的レベルとこの
プロテアーゼ活性を比較する工程(TFPI-3ポリペプチドの存在下および候補化合
物の非存在下で、プロテアーゼと基質との間で接触させる場合、標準がアッセイ
される)を含む。このアッセイにおいて、標準を超える阻害活性の増加は、候補
化台物がTFPI-3活性のアゴニストであることを示し、そして標準と比較した阻害
活性の減少は、その化台物がTFPI-3活性のアンタゴニストであることを示す。
TFPI-3は、いくつかの組織で異なるレベルで発現されることが発見されている
。それゆえ、本発明の核酸は、生物学的サンプルに存在する組織または細胞型の
差示的な同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。同様
に、ポリペプチドおよびそれらのポリペプチドに指向される抗体は、組織および
細胞型の差示的な同定のための免疫学的プローブを提供するために有用である。
さらに、上記組織または細胞、特に止血系の多数の障害についての有意により高
いかまたはより低いレベルのTFPI-3遺伝子発現が、「標準的な」TFPI-3遺伝子発
現レベル(すなわち、止血系障害を有さない個体由来の健常組織におけるTFPI-3
発現レベル)と比較して、このような障害を有する個体から採取した特定の組織
(例えば、ガン組織および創傷組織)または体液(例えば、血清、血漿、尿、滑
液または髄液)において検出され得る。従って、本発明は、このような障害の診
断の間に有用な診断方法を提供し、この方法は、以下を含む:(a)個体の細胞
または体液のTFPI-3遺伝子発現レベルをアッセイする工程;(b)このTFPI-3遺
伝子発現レベルを標準的なTFPI-3遺伝子発現レベルと比較する工程;これにより
、標準的発現レベルと比較して、アッセイされたTFPI-3遺伝子発現レベルの増加
または減少は、止血の障害の指標である。
本発明のさらなる局面は、治療的に有効量の、本発明の単離されたTFPI-3ポリ
ペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物を、身体のTFPI-3活性のレベルの増
加が必要な個体に投与する工程を含む、このような個体を処置するための方法に
関する。
本発明のなおさらなる局面は、治療的に有効量のTFPI-3アンタゴニストを含む
組成物を、身体のTFPI-3活性のレベルの減少が必要な個体に投与する工程を含む
、このような個体を処置するための方法に関する。本発明の使用に好ましいアン
タゴニストは、TFPI-3特異的抗体および第1または第2のKunitz型ドメインのい
ずれかのP1残基で、アルギニン(それぞれ配列番号2の21位および116位)以外
のアミノ酸残基を有するTFPI-3タンパク質である。
図面の簡単な説明
図1は、TFPI-3のヌクレオチド配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(
配列番号2)を示す。約27アミノ酸の推定リーダー配列には、下線を付している
。リーダー配列は、配列番号2の-27〜-1位である。第1のKunitz型ドメイン(K
unitz-1)は、配列番号2の11〜61位であり、そして第2のKunitz型ドメイン(K
unitz-2)は、配列番号2の106〜156位である。これらの両方は図1に星印を付
している。
図2は、DNAStarパッケージソフトのプログラムに含まれるコンピュータープ
ログラム「Megalign」を用いるClustal法により決定されたように、TFPI-3のKun
itz型ドメインのアミノ酸配列(配列番号4のKunitz-1、配列番号4のKunitz-2
)、TFPIのKunitz型ドメインのアミノ酸配列(配列番号5のKunitz-1、配列番号
6のKunitz-2、配列番号7のKunitz-3)、TFPI-2のKunitz型ドメインのアミノ酸
配列(配列番号8のKunitz-1、配列番号9のKunitz-2、配列番号10のKunitz-3)
とアプロチニンのアミノ酸配列(配列番号11)との間の同一な領域を示す。この
プログラムは、コンセンサス配列(すなわち、コンセンサスKunitz型ドメイン、
これは配列番号28として示される)を生成する。
図3は、TFPI-3アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイル領
域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数および表面確
率が示される。「抗原指数-Jameson-Wolf」グラフでは、正のピークは、TFPI-3
タンパク質の高度に抗原性の領域(すなわち、ここから本発明のエピトープ保有
部分が得られ得る領域)の位置を示す。
図4は、実施例5に記載のトリプシン阻害アッセイの結果を示す。エラーバー
は、標準偏差(n=4)を示す。TFPI-3-1は、TFPI-3の第1のKunitz型ドメインを
示す。
詳細な説明
本発明は、クローン化されたcDNAを配列決定することにより決定された、配列
番号2に示されるアミノ酸配列を有するTissue Factor Pathway Inhibltor-3(TF
RI-3)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子
を提供する。図1(配列番号1)で示されるヌクレオチド配列は、H0EBN05クロ
ーン(American Type Culture Collection,12301 Park Lawn Drive,Rockville
,Maryland 20852に1996年11月20日に寄託され、そして、受託番号ATCC 97797が
与えられた)を配列決定することにより得られた。奇託されたクローンは、pBlu
escriptSK(-)プラスミド(Stratagene,La Jolla,CA)に含まれる。
本発明のTFPI-3タンパク質は、TFPI、TFPI-2、およびアプロチニンについての
ヒトmRNAの翻訳産物と配列相同性を共有する。より詳細には、TFPI-3は、図2に
おいて見られ得るような、プロテアーゼTFPI、TFPI-2、およびアプロチニン由来
のKunitz型ドメインに対する著しい類似性を共有する(それぞれに含まれる6つ
のすべてのシステイン間のほぼ完全な保存を含む)、2つのKunitz型プロテアー
ゼインヒビタードメインを含む。TFPIおよびTFPI-2は、第Xa因子との相互作用、
および血液凝固カスケードにおける第VIIa因子−組織因子複合体の阻害を介して
、止血を媒介するように作用する、重要なプロテアーセインヒビターであると考
えられる。同様に、アプロチニンは、例えば、線維素溶解性(hyperfibrinolytic
)出血および外傷性出血ショックのような種々の疾患の処置のための有用な薬物
ーである(Fritz,Hら、Drug Res.,33:479-494(1983)、および例えば、米国特
許第4,894,439号を参照のこと)。
核酸分子
他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定
されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機(例えば、Applied B
iosystems,Inc.,Fostcr City,CAのModel 373)を用いて決定され、そして本
明細書中で決定されるDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのア
ミノ酸配列は、上記のように決定されるDNA配列の翻訳によって推定された。従
って、この自動化アプローチによって決定された任意のDNA配列について当該分
野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列は、
いくつかの誤差を含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配
列決定されるDNA分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくと
も約90%同一、より代表的には少なくとも約95%〜少なくとも約99.9%同一であ
る。実際の配列は、当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のア
プローチによって、さらに正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のよ
うに、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入
または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、
その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる予測されるアミノ
酸配列は、配列決定されるDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列と
は完全に異なり、このような挿入または欠失の点にて始まる。
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、DNA分子
またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そして
RNA分子またはポリヌクレオチドについてはリボヌクレオチト(A,G,C,およびU
)の対応する配列(ここで、特定されるデオキシリボヌクレオチド配列における
各チミジンデオキシリボヌクレオチド(T)は、リボヌクレオチドのウリジン(U)に
よって置き換えられる)が意図される。
図1(配列番号1)のヌクレオチド配列のような、本明細書中で提供される情
報を使用して、TFPI-3ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、開始物質
としてmRNAを使用してcDNAをクローニングするための手順のような標準的なクロ
ーニングおよびスクリーニング手順を使用して得られ得る。本発明の例示として
、図1(配列番号1)に記載される核酸分子は、骨芽細胞由来のcDNAライブラリ
ーにおいて発見された。同じ遺伝子のさらなるクローンはまた、以下の組織由来
のcDNAライブラリー中で同定された:ヒト胎児脳、胎児腎臓、胎盤、下垂体、精
巣、精巣腫瘍、膵臓腫瘍、およびマクロファージ。
図1(配列番号1)のTFPI-3 cDNAの決定されたヌクレオチド配列は、図1(
配列番号1)中のヌクレオチド配列のヌクレオチド361〜363位に開始コドンを有
し、約28.2kDaの推定分子量を有する、252アミノ酸残基のタンパク質をコードす
るオープンリーディングフレームを含む。配列番号2において示されるTFPI-3タ
ンパク質のアミノ酸配列は、TFPI-2についてのヒトmRNAに対して約24%同一であ
る(Sprecher,C.A.ら、PNAS USA,91:3353(1994)、これは登録番号L27624とし
てGenBankに受託され得る)。
上述のように、TFPI-3遺伝子のオープンリーディングフレームは、TFPI、TFPI
-2、およびアプロチニンについてのヒトmRNAの翻訳産物と配列相同性を共有し(
図2)、以下の保存性ドメインを含む:(a)約51アミノ酸の第1のKunitz型ドメ
イン、および(b)また約51アミノ酸の第2のKunitz型ドメイン。TFPI、TFPI-2、
アプロチニン、およびTFPI-3間の相同性は、TFPI-3がまたプロテアーゼインヒビ
ターであり得ることを示す。TFPI-3の組換え的にクローニングした第1のKunitz
型ドメイン(実施例1に示される構築物)を使用する、実施例5に記載の実施例
は、TFPI-3ポリペプチドがプロテアーゼ活性を阻害する能力を有することを示し
ている。組み合わせると、このデータは、TFPI-3が、プロテアーゼ阻害活性を有
し、そして血液凝固の調節において重要であり得ることを示す。
当業者が理解するように、上記で議論された配列決定誤差の可能性によって、
約252アミノ酸を含む寄託されたcDNAによりコードされた実際に完全なTFPI-3ポ
リペプチドは、いくらか長いかもしれないし、短いかもしれない。より一般的に
は、実際のオープンリーディングフレームは、図1(配列番号1)中に示される
N末端から最初のメチオニンコドンから予測されるオープンリーディングフレー
ムの±20アミノ酸の範囲、より好ましくは±10アミノ酸の範囲のどこかに存在し
得る。種々の機能性ドメインを同定するために使用される分析判定基準に依存し
て、TFPI-3ポリペプチドのKunitz型ドメインの正確な「アドレス」は、上記の推
定の位置とわずかに異なり得ることがさらに理解される。例えば、配列番号2中
のTFPI-3 Kunitz型ドメインの正確な位置は、ドメインを規定するために使用し
た判定基準に依存してわずかに変化し得る(例えば、このアドレスは、約1から
約10残基、より好ましくは約1から約5残基「シフト」し得る)。この場合、Ku
nitz型ドメインの末端は、TFPI-3アミノ酸配列といくつかの他の哺乳動物プロテ
アーゼの配列との間の類似性に基づいて、特に、各ドメイン内に含まれる6つの
保存性システインに基づいて推定された。
リーダー配列および成熟配列
完全なTFPI-3タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号2で示されるようなリー
ダー配列および成熟タンパク質を含む。より詳細には、本発明は、TFPI-3タンパ
ク質の成熟形態をコードする核酸分子を提供する。従って、シグナルの仮説に従
って、粗面小胞体を通して伸長しているタンパク質鎖の輸送が一旦開始されると
、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、分泌される「成熟」形態のタ
ンパク質を生成するために完全なポリペプチドから切断されるシグナルまたは分
泌リーダー配列を有する。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞もなお、同じ
特異性で分泌されるタンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合において、
分泌されるタンパク質の切断は、完全には均一ではなく、このことはタンパク質
の2つ以上の成熟種を生じる。さらに、分泌されるタンパク質の切断特異性が完
全なタンパク質の一次構造によって究極的に決定される、すなわち、切断特異性
はポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが長い間知られている。従って
、本発明は、ATCC受託番号97797として同定された宿主に含まれるcDNAクローン
によってコードされるアミノ酸配列を有する成熟TFPI-3ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を提供する。「ATCC受託番号97797におけるcDNAクローンに
よってコードされるアミノ酸配列を有する成熟TFPI-3ポリペプチド」により、寄
託された宿主中のベクターに含まれるクローンのヒトDNA配列によりコードされ
る完全なオープンリーディングフレームを哺乳動物細胞(例えば、上記のCOS細
胞)中で発現させることにより産生されるTFPI-3タンパク質の成熟形態が意味さ
れる。
さらに、タンパク質が分泌リーダーおよびそのリーダー配列のための切断点を
有するか否かを推定する方法は、利用可能である。例えば、McGeoch(Virus Res
.3:271-286(1985))の方法は、完全(切断されていない)タンパク質の短いN末
端荷電領域および続く非荷電領域からの情報を使用する。von Heinje(Nucleic A
cids Res.14:4683-4690(1986))の方法は、切断部位、代表的には残基-13〜+2(
ここで、+1は成熟タンパク質のアミノ末端を示す)の周囲の残基からの情報を使
用する。これらの各方法についての既知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点を推
定することの精度は、75〜80%の範囲である(von Heinje、前出)。しかし、2
つの方法は、所定のタンパク質について同じ推定切断点を常に生じるわけではな
い。
本発明の場合において、完全なTFPI-3ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、コ
ンピュータープログラム「PSORT」によって分析された。このプログラムは、Ins
titute for Chemical Research,Kyoto UniversityのKenta Nakai博士から入手
可能であり(K.NakaiおよびM.Kanehisa,Genomics 14:897-911(1992)を参照のこ
と)、これはアミノ酸配列に基づいてタンパク質の細胞局在を予測するための熟
練したシステムである。このコンピューターによる局在の予測の一部として、Mc
Geochおよびvon Heinjeの方法が組み込まれている。このプログラムによるTFPI
-3アミノ酸配列の分析は、図2に示される完全アミノ酸配列内の1つの切断部位
を予測した。
示されるように、本発明の核酸分子は、RNAの形態(例えば、mRNA)、またはD
NAの形態(例えば、クローニングによって得られるか、または合成的に生成され
るcDNAおよびゲノムDNAを含む)で存在し得る。DNAは、二本鎖または一本鎖であ
り得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖(センス鎖としても知られる)であり
得るか、または非コード鎖(アンチセンス鎖としても呼ばれる)であり得る。
「単離された」核酸分子によって、天然の環境から取り出された核酸分子(DN
AまたはRNA)が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分子は、
本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたDNA分子のさら
なる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えDNA分子、または溶液中の
(部分的または実質的に)精製された組換えDNA分子を含む。単離されたRNA分子
は、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物を含む。本発明
による単離された核酸分子は、そのような合成的に生成された分子をさらに含む
。
本発明の単離された核酸分子は、図1(配列番号1)に示されるヌクレオチド
配列の361〜363位に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム(ORF)を
含むDNA分子を含む。
配列番号2の442〜1116位に示される推定成熟TFPI-3タンパク質についてのコ
ード配列を含むDNA分子もまた、含まれる。
さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列とは実質的に異なる配列
を含むが、遺伝子コードの縮重に起因して、なおTFPI-3タンパク質をコードする
、DNA分子を含む。当然のことながら、遺伝子コードおよび種特異的なコドン選
択(preference)は当該分野において周知である。従って、上記の縮重型改変体を
作製すること、例えば、特定の宿主についてコドン発現を最適にすること(例え
ば、ヒトmRNA中のコドンをE.coliのような細菌宿主に好ましいコドンに変化させ
ること)は、当業者が日常的に行うことである。
別の局面においては、本発明は、ATCC受託番号97797として1996年11月20日に
寄託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸
配列を有するTFPI-3ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する
。好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたcDNAクローンによってコード
される成熟ポリペプチドまたは可溶性細胞外形態の、Kunitz型ドメインの1つま
たは両方を含む(しかし、配列番号2のアミノ酸のおよそ196〜225の、膜貫通部
分を欠く)ポリペプチドをコードする。
本発明はさらに、図1(配列番号1)に示されるヌクレオチド配列、または上
記の寄託されたクローン中に含まれるTFPI-3 cDNAのヌクレオチド配列を有する
単離された核酸分子、あるいは上記配列の1つに相補的な配列を有する核酸分子
を提供する。このような単離された分子(特にDNA分子)は、染色体とのインサ
イチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのための、および例えば
、ノーザンブロット分析によるヒト組織におけるTFPI-3遺伝子の発現を検出する
ためのプローブとして有用である。
本発明はさらに、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の部分をコードする核
酸分子、ならびに本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関す
る。詳細には、本発明は、配列番号1の442〜1116位からなる、配列番号1の部
分を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、配列番号1の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を有
する核酸分子を提供し、これは、以下の関連するcDNAクローンから決定されてい
る:HFCBP02R(配列番号12)、HKDH23F(配列番号13)、HPLBH53R(配列番号14)、H
PLBH50R(配列番号15)、HCOSD62R(配列番号16)、HEPAB48R(配列番号17)、HAU
AR79R(配列番号18)、およびHPTTL69R(配列番号19)。
配列番号2に関連するポリペプチドは、以下を含む:Ala Asp Arg Glu Arg Se
r Ile His Asp Phe Xaa Leu Val Ser Lys(配列番号29);Lys Val Val Gly Arg
Xaa Arg Ala Ser Met Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Val Thr Asp Gly Ser Xaa Gln
Leu Phe Val Tyr Gly Gly(配列番号30);およびAla Thr Val Thr Glu Asn Ala
Thr Gly Asp Leu Ala Thr Ser Arg Asn Ala Ala Asp Ser Ser Val Pro Ser Ala
Pro(配列番号31)。
さらに本発明は、ヌクレオチド361〜1116の配列番号1の少なくとも約30ヌク
レオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチドの任意の部分を含むポリヌクレ
オチドを含む。本発明は、好ましくは、ヌクレオチド442〜910の配列番号1の少
なくとも約30ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチドの任意の部分
を含むポリヌクレオチドを含む。本発明は、最も好ましくはヌクレオチド442〜6
31の配列番号1の少なくとも約30ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレ
オチドの任意の部分を含むポリヌクレオチドを含む。
より一般的には、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、あるいは図1(配列番
号1)に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメント
によって、長さが少なくとも約15nt、そしてより好ましくは少なくとも約20nt、
さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてなおさらに好ましくは、少なく
とも約40nt、のフラグメントが意図され、これらは本明細書中に議論されるよう
に診断用プローブおよび診断用プライマーとして有用である。もちろん、50〜30
0nt長のより長いフラグメントもまた、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列また
は図1(配列番号1)に示されるヌクレオチド配列の全てではないにしても、ほ
とんどに対応するフラグメントと同様に、本発明によって有用である。少なくと
も20nt長のフラグメントによって、例えば、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列
、または図1(配列番号1)に示されるようなヌクレオチド配列由来の20以上の
連続的な塩基を含むフラグメントが意図される。本発明の好ましい核酸フラグメ
ン
トは、図3で確認され、そして以下により詳細に記載されるように、TFPI-3ポリ
ペプチドのエピトープ保有部分をコードする核酸分子を含む。
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子(例えば、ATCC受託番号97797に含まれるcDNA
クローン)中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオチド
を含む単離した核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件」によって、以下:50%ホルムアミド、5×SSC(150mMNaCl、15mMクエ
ン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート液、10
%デキストラン硫酸、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNA、を含む溶液中で
の42℃にて一晩のインキュベーション、続く約65℃にて0.1×SSC中でフィルター
を洗浄することが意図される。
ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好まし
くは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさらに
より好ましくは約30〜70(例えば50)ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド
(DNAまたはRNAのいずれか)が意図される。これらは、先で、および以下でより
詳細に考察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
例えば、「少なくとも20nt長」のポリヌクレオチドの一部により、参照ポリヌ
クレオチドのヌクレオチド配列(例えば、寄託されたcDNA、または図1(配列番
号1)に示されるようなヌクレオチド配列)由来の20以上の連続したヌクレオチ
ドが意図される。当然のことながら、ポリA配列(例えば、図1(配列番号1)
に示されるTFPI-3 cDNAの3'末端ポリ(A)トラクト)にのみ、またはT(またはU
)残基の相補的なストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本
発明の核酸の一部にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレ
オチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ(A)ス
トレッチまたはその相補体(例えば、実際に任意の二本鎖cDNAクローン)を含む
任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。
示されるように、TFPI-3ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下
を含み得るが、これらに限定されない:それ自体によって、成熟ポリペプチドの
アミノ酸配列をコードする核酸分子;ならびに、成熟ポリペプチドのコード配列
およびさらなる配列(例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列ま
たはプレプロタンパク質配列のような、約27アミノ酸リーダー配列あるいは分泌
配列をコードする配列);上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まない成
熟ポリペプチドのコード配列。
本発明の核酸によって、上記のタンパク質配列とともにさらなる非コード配列
もまたコードされ、この配列は、例えば、イントロンおよび非コード5'および3'
配列(例えば、転写、mRNAプロセシング(スプライシングを含む)において役割
(例えば、リボソーム結合およびmRNAの安定性)を果たす、転写非翻訳配列、お
よびポリアデニル化シグナル);さらなる機能性を提供するようなさらなるアミ
ノ酸をコードするさらなるコード配列、を含むがこれらに限定されない。
従って、ポリペプチドをコードする配列は、融合されたポリペプチドの精製を
容易にするペプチドをコードする配列のような、マーカー配列に融合され得る。
本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は
、とりわけ、pQEベクター(QIAGEN,Inc.、9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,
91311)中に提供されるタグのような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドである。こ
れらの多くは市販されている。例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86:821-824(1989)において記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タン
パク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タ
ンパク質由来のエピトープに対応する、精製のために有用な別のペプチドであり
、それは、Wilsonら、Cell 37:767(1984)によって記載されている。以下で考察
されるように、他のそのような融合タンパク質には、N末端またはC末端にてFc
に融合されたTFPI-3が含まれる。
改変体および変異体ポリヌクレオチド
本発明はさらに、TFPI-3タンパク質の一部、アナログ、または誘導体をコード
する、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、天然の対立遺伝子改変体
のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上の
所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態の1つが意図される。
Genes II,Lewin,B.編、John Wiley&Sons,New York(1985)。天然に存在しない
改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
このような改変体には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加により産生さ
れる改変体が含まれる。この置換、欠失、または付加には1つ以上のヌクレオチ
ドが含まれ得る。改変体は、コード領域、非コード領域、または両方において変
化され得る。コード領域における変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、
欠失、または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、サイレントな置
換、付加、および欠失であり、これらはTFPI-3タンパク質またはそれらの一部の
特性および活性を変化させない。この点に関してまた特に好ましいのは、保存的
置換である。
非常に好ましいのは、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する成熟タンパ
ク質、または寄託されたcDNAクローンによってコードされる成熟TFPI-3アミノ酸
配列をコードする核酸分子である。
従って、本発明の1つの局面は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する:(a)配
列番号2中の106〜156位のアミノ酸配列を有するか、またはATCC受託番号97797
に含まれるcDNAクローンによってコードされるような、TFPI-3ポリペプチドの推
定第2Kunitz型ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(
b)配列番号28に示されるアミノ酸配列を有するコンセンサスKunitz型ドメイン
を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および(c)上記の(a)
または(b)のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列;(a
)または(b)の上記のポリヌクレオチドは、配列番号29、配列番号30、または
配列番号31(各々、11頁に示す)として示される配列を含むポリペプチドをコー
ドしないことを除く。
本発明のさらなる実施態様は、上記の(a)、(b)、または(c)中のヌク
レオチド配列のいずれかに少なくとも90%同一、そしてより好ましくは少なくと
も95%、96%、97%、98%、または99%同一であるヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチド、あるいは上記の(a)、(b)、または(c)中のポリヌクレ
オチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
るポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。このハイブリダイズする
ポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、
A残基のみまたはT残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドにはハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の(a
)または(b)中のアミノ酸配列を有するTFPI-3ポリペプチドのエピトープ保有
部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に
関する。
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、ならびに
組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を
作製する方法ならびに組換え技術によってTFPI-3ポリペプチドまたはペプチドの
産生のためにそれらを用いる方法に関する。
TFPI-3ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくと
も95%「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、そのポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列が、TFPI-3ポリペプチドをコードする参照ヌ
クレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり5つまでの点変異をポリヌクレオチ
ド配列が含み得ることを除いて、参照配列に同一であることが意図される。換言
すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における5%までのヌクレオチ
ドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照
配列において全ヌクレオチドの5%までの数のヌクレオチドが、参照配列中に挿
入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'
末端位置において、または参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしくは参照
配列内の1つ以上の連続した基中のいずれかに散在されて、これらの末端位置の
間のどこかで生じ得る。
実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、図1に示されるヌクレオチド配
列または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列に少なくとも90%、95%、
96%、97%、98%、または99%同一であるかどうかは、Bestfitプログラム(Wisc
onsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer G
roup,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)の
ような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。Best
fitは、SmithおよびWaterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(19
81)の局所的相同性アルゴリズムを用いて、2つの配列間の最も相同性のセグメ
ントを見出す。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定
の配列が、本発明による参照配列に、例えば95%同一であるか否かを決定する場
合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列の全長
にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の5%までの
相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
本出願は、TFPI-3活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、
図1(配列番号1)に示される核酸配列、または寄託されたcDNAの核酸配列と少
なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である核酸分子に関す
る。これは、特定の核酸分子がTFPI-3活性を有するポリペプチドをコードしない
場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼー
ションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして使用す
るかをなお知っているからである。TFPI-3活性を有するポリペプチドをコードし
ない、本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ(1)TFPI-3遺伝子またはその
対立遺伝子改変体をcDNAライブラリーから単離すること;(2)Vermaら,Human Ch
romosomes:A Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)に
記載の、TFPI-3遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開
物に対するインサイチュハイブリダイゼーション(例えば、「FISH」);および、
特定の組織におけるTFPI-3 mRNA発現を検出するためのノーザンブロット分析、
が挙げられる。
しかし、実のところ、TFPI-3タンパク質活性を有するポリペプチドをコードす
る図1(配列番号1)に示される核酸配列、あるいは寄託されたcDNAの核酸配列
に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を有す
る核酸分子が好ましい。「TFPI-3活性を有するポリペプチド」によって、特定の
生物学的アッセイにおいて測定される場合に、本発明の成熟型TFPI-3タンパク質
の活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドが意図される
。例えば、本発明のTFPI-3タンパク質は、トリプシンのプロテアーゼ活性および
第
VIIa因子−組織因子のアミド分解活性を阻害する。TFPI-3のトリプシン阻害活性
を測定するためのインビトロアッセイは、文献、例えば、Sprecher、C.A.ら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA、91、3353-3357(1994)に記載されている。簡単には、こ
のアッセイはTFPI-3をトリプシンとともにインキュベートする工程、および次に
発色基質の活性を測定することによって、残留プロテアーゼ活性を測定する工程
を包含する。このような活性は、血液の凝固を防ぐのに有用である。他のこのよ
うなアッセイは、例えば、米国特許第4,894,436号(これは参考として本明細書
中に援用される)中の13頁に開示されているように、当業者に公知である。
TFPI-3タンパク質は、上記のアッセイにおいて用量依存的な様式でプロテアー
ゼ活性を調節する。従って、「TFPI-3タンパク質活性を有するポリペプチド」は
、用量依存様式で上記のアッセイにおいて同じプロテアーゼ阻害活性のいずれか
もまた示すポリペプチドを含む。用量依存活性の程度がTFPI-3タンパク質の活性
と同一である必要はないが、好ましくは、「TFPI-3タンパク質活性を有するポリ
ペプチド」は、TFPI-3タンパク質と比較して、所定の活性において実質的に類似
の用量依存性を示す(すなわち、候補ポリペプチドは、参照TFPI-3タンパク質と
比較して、より大きな活性、または約25分の1以下の活性、および好ましくは約
10分の1以下の活性を示す)。TFPI-3ポリペプチドはまた、以下の実施例5に記
載されているアッセイに従って活性についてアッセイされ得る。
もちろん、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNAの核酸配
列、または図1(配列番号1)に示される核酸配列に少なくとも90%、95%、96
%、97%、98%、または99%同一である配列を有する多数の核酸分子が「TFPI-3
タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実
際に、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体の全てが同じポリペプチドをコー
ドするので、このことは、上記の比較アッセイを行うことすら必要なく、当業者
に明らかである。縮重改変体でないそのような核酸分子について、妥当な数がま
たTFPI-3タンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野で
さらに認識される。これは、当業者が、以下にさらに記載されるように、タンパ
ク質の機能に有意に影響する可能性が低いか、またはその可能性がないかのいず
れかのアミノ酸置換(例えば、1つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸
での置換)を十分に知っているからである。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクター
で遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるTFPI-3ポリペプチドまた
はそのフラグメントの産生に関する。ベクターは、例えば、ファージベクター、
プラスミドベクター、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであり得
る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。
後者の場合、一般に、ウイルス増殖は相補性宿主細胞においてのみ生じる。
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物
のような沈澱物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクタ
ーがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイ
ンビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
DNAインサートは、適切なプロモーター(例えば、少し名を挙げると、ファー
ジλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーター、phoAプロモ
ーター、およびtacプロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモータ
ー、ならびにレトロウイルスLTRのプロモーター)に作動可能に連結されるべき
である。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さら
に、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボ
ゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ま
しくは、翻訳されるべきポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを含み、そして終
わりに適切に位置された終止コドン(UAA、UGA、またはUAG)を含む。
示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも1つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、G418、またはネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細
菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝
子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例とし
ては、細菌細胞(例えば、E.coli細胞、Streptomyces細胞、およびSalmonella t
yphimurium細胞);真菌細胞(例えば酵母細胞);昆虫細胞(例えば、Drosophi
la S2細胞およびSpodoptera Sf9細胞);動物細胞(例えば、CHO細胞、COS細胞
、293細胞、およびBowes黒色腫細胞);ならびに植物細胞が挙げられるが、これ
らに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当該分
野で公知である。
細菌における使用に好ましいベクターの中には、pQE70、pQE60、およびpQE-9
(QIAGEN,Inc.前述から入手可能);pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluesc
riptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratageneから入手可能);な
らびにptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmaciaから入手可能
)が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、
pXT1、およびpSG(Stratageneから入手可能);ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、お
よびPSVL(Pharmaciaから入手可能)がある。他の適切なベクターは、当業者に
容易に明らかである。
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフエクション、DEAE
-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもた
らされ得る。このような方法は、Davisら,Basic Methods In Molecular Biolog
y(1986)のような多くの標準的な研究室マニュアルに記載されている。
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし
て分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。例えば、さ
らなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、精製の間の、または続く取り扱い
および保存の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善するために、ポ
リペプチドのN末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にする
ためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調
製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善
するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加
は、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タ
ンパク質は、タンパク質の安定化および精製のために有用な免疫グロブリン由来
の異種領域を含む。例えば、EP-A-0 464 533(カナダ対応出願第2045869号)は
、
別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種
々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のFc
部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善
された薬物動態学的特性を生じる(EP-A 0232 262)。一方、いくつかの使用につ
いては、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、そ
して精製された後に、Fc部分を欠失させ得ることが望ましい。これは、Fc部分が
、治療および診断における使用に対して障害となると判明する場合(例えば、融
合タンパク質が免疫化のための抗原として使用されるべき場合)である。薬物探
索において、例えばhIL-5のようなヒトタンパク質は、hIL-5のアンタゴニストを
同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにFc部分と融合
されている。D.Bennettら,J.Molecular Recognition 8:52-58(1995)、およびK
.Johansonら,J.Biol.Chem.270:9459-9471(1995)を参照のこと。
TFPI-3タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、
陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラ
フィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製さ
れ得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)が精製のた
めに用いられる。本発明のポリペプチドは以下を含む:直接単離されたか、また
は培養されたかにかかわらず、体液、組織、および細胞を含む天然の供給源から
の精製産物;化学合成手順の産物;および原核生物宿主または真核生物宿主(例
えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含
む)から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において用いられ
る宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていても、また
はグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、
いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改変された開始メチオニン残
基を含み得る。従って、一般的に翻訳開始コドンによってコードされるN末端メ
チオニンは、全ての真核生物細胞において、翻訳の後に任意のタンパク質から高
い効率で除去されることが、当該分野で周知である。また、ほとんどの原核生物
において、ほとんどのタンパク質上のN末端メチオニンが効率よく除去されるが
、いくつかのタンパク質にとっては、この原核生物除去プロセスは非効率的であ
り、N末端メチオニンが共有結合されているアミノ酸の性質に依存する。
ポリペプチドおよびフラグメント
本発明はさらに、寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列、または
配列番号2のアミノ酸配列を有する、単離されたTFPI-3ポリペプチド、あるいは
上記ポリペプチドの部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。
改変体および変異体ポリペプチド
TFPI-3ポリペプチドの特徴を改良または改変するために、タンパク質工学が使
用され得る。当業者に公知の組換えDNA技術は、単一もしくは複数のアミノ酸置
換、欠失、付加、または融合タンパク質を含む、新規の変異体タンパク質または
「ムテイン」を作製するために使用され得る。このような改変されたポリペプチ
ドは、例えば、増強された活性または増加した安定性を示し得る。さらに、少な
くとも特定の精製条件および保存条件のもとでは、これらはより高い収率で精製
され得、そして対応する天然のポリペプチドより良好な溶解性を示し得る。
N末端欠失変異体およびC末端欠失変異体
例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟形態
を含む多くのタンパク質について、1つ以上のアミノ酸が実質的な生物学的機能
の損失なしでN末端またはC末端から欠失され得ることは当該分野で公知である。
例えば、Holstら、Thrombosis and Haemostasis、71(2):214-19(1994)は、276ア
ミノ酸タンパク質の最初の161アミノ酸のみを含むにもかかわらず、抗血栓活性
を保持した改変されたTFPIタ冫パク質を報告した。本発明の場合、本発明のタン
パク質はTFPIポリペプチドファミリーのメンバーであることから、配列番号2の
106位のシステイン(C106)までのN末端アミノ酸の欠失は、いくつかの生物学
的活性(例えばプロテアーゼインヒビター活性)を維持し得る。配列番号2中で
のC106残基を含むさらなるN末端の欠失を有するポリペプチドは、TFPI関連ポリ
ペプチドのこの残基が第2のKunitz型ドメイン中のジスルフィド架橋を形成し、
プロテアーゼ基質との相互作用に必要とされる高次構造を提供するのに必要であ
ることが公知なので、第2のKunitz型ドメインの生物学的活性を保持することは
期待されない。
しかし、タンパク質のN末端からの1つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質
の1つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じたとしても、他の生物学的活性は
なお維持され得る。従って、完全な形態またはKunitz型ドメイン含有形熊のタン
パク質を認識する抗体を誘導し、そして/またはこれに結合する、短縮型タンパ
ク質の能力は、一般に、完全な形態またはKunitz型ドメイン含有形態のタンパク
質の残基の過半数未満がN末端から除去される場合、維持される。完全タンパク
質のN末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を維持す
るかどうかは、本明細書に記載されているかそうでなければ当該分野で公知であ
る日常的な方法により容易に決定され得る。
従って、本発明は、配列番号2に示されるTFPI-3のアミノ酸配列のアミノ末端
から106番目の位置のシステイン残基までの欠失される1つ以上の残基を有する
ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
さらに提供する。詳細には、本発明は、配列番号2のn〜225残基のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを提供する。ここで、nは99〜106の範囲での整数である。C1
06は、完全なTFPI-3タンパク質の第2のKunitz型ドメインのプロテアーゼ阻害活
性のために必要とされると考えられている、完全なTFPI-3ポリペプチド(配列番
号2で示される)のN末端からの最初の残基の位置である。
より詳細には、本発明は、配列番号2の99〜225、100〜225、101〜225、102〜
225、103〜225、104〜225、105〜225、および106〜225の残基のアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
同様に、生物学的に機能的なC末端欠失ムテインの多くの例が知られている。
本発明の場合では、本発明のタンパク質はTFPIポリペプチドファミリーのメンバ
ーであることから、配列番号2の156位のシステイン(C156)までのC末端アミ
ノ酸の欠失は、いくつかの生物学的活性(例えば、抗血栓活性/プロテアーゼイ
ンヒビター活性)を維持し得る。配列番号2のC156を含むさらなるC末端欠失を
有するポリペプチドは、TFPI関連ポリペプチドのこの残基が、第2のKunitz型ド
メイン(これは第Xa因子との相互作用(ならびにそのタンパク質分解活性および
アミド分解活性の阻害)のために必要なコンフォメショーンを提供する)中のジ
スルフィド架橋の形成に必要であることが公知であるので、このような生物学的
活性を維持することは期待されない。
しかし、タンパク質のC末端からの1つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質
の1つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でさえ、他の生物学的活性
はなお維持され得る。従って、完全な形態またはKunitz型ドメイン含有形態のタ
ンパク質を認識する抗体を誘導し、そして/またはこれに結合する短縮型タンパ
ク質の能力は、一般に、完全な形態またはKunitz型ドメイン含有形態のタンパク
質の残基の過半数未満がC末端から除去される場合、維持される。完全タンパク
質のC末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を維持す
るかどうかは、本明細書に記載されているか、そうでなければ当該分野で公知で
ある日常的な方法により容易に決定され得る。
従って、本発明はさらに、配列番号2に示されるTFPI-3のアミノ酸配列のカル
ボキシ末端から配列番号2のC156までの1つ以上の残基を有するポリペプチド、
およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する
。特に、本発明は配列番号2のアミノ酸配列の残基99〜mのアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを提供する。ここでmは156〜225の範囲の任意の整数であり、そ
して残基C156は、完全なTFPI-3タンパク質の第2のKunitz型ドメインのアミド分
解阻害活性およびタンパク質分解阻害活性に必要とされると考えられている、完
全なTFPI-3ポリペプチド(配列番号2に示される)のC末端からの最初の残基の
位置である。
より詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを提供する:配列番号2の残基99〜156、99〜157、
99〜158、99〜159、99〜160、99〜161、99〜162、99〜163、99〜164、99〜165、
99〜166、99〜167、99〜168、99〜169、99〜170、99〜171、99〜172、99〜173、
99〜174、99〜175、99〜176、99〜177、99〜178、99〜179、99〜180、99〜181、
99〜182、99〜183、99〜184、99〜185、99〜186、99〜187、99〜188、99〜189、
99〜190、99〜191、99〜192、99〜193、99〜194、99〜195、99〜196、99〜197、
99〜198、99〜199、99〜200、99〜201、99〜202、99〜203、99〜204、99〜205、
99〜206、99〜207、99〜208、99〜209、99〜210、99〜211、99〜212、99〜213、
99〜214、99〜215、99〜216、99〜217、99〜218、99〜219、99〜220、99〜221、
99〜222、99〜223、99〜224、および99〜225。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた提供される。
本発明はまた、アミノ末端とカルボキシル末端の両方から欠失した1つ以上の
アミノ酸を有するポリペプチドを提供し、これらは一般には、配列番号2の残基
n〜mを有するとして記載され得、ここでnおよびmは上記のような整数である
。
ATCC受託番号97797に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全TFPI-3ア
ミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もまた含
まれ、ここで、この部分は、ATCC受託番号97797に含まれるcDNAクローンにより
コードされる完全アミノ酸配列のアミノ末端由来の126位から約132位までのアミ
ノ酸;またはカルボキシル末端由来の1位から約69位アミノ酸、あるいはATCC受
託番号97797に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全アミノ酸配列の上
記のアミノ末端およびカルボキシ末端欠失の任意の組合せを除外する。上記の欠
失変異ポリペプチド形態の全てをコードするポリヌクレオチドもまた提供される
。
他の変異体
上記で議論されたタンパク質の末端欠失形態に加えて、TFPI-3ポリペプチドの
いくつかのアミノ酸配列がタンパク質の構造または機能の有意な影響なしに変化
され得ることもまた、当業者により認識される。配列中でのこのような差違を考
察する場合、活性を決定するタンパク質の決定的な領域があることに留意すべき
である。
従って、本発明は、実質的なTFPI-3ポリペプチド活性を示すTFPI-3ポリペプチ
ドの変型または以下で議論されるタンパク質部分のようなTFPI-3タンパク質の領
域を含むTFPI-3ポリペプチドの変型をさらに含む。このような変異体は、当該分
野で公知である一般的な規則に従って、活性にほとんど影響しないように選択さ
れる欠失、挿入、転移、反復、および、型置換を含む。例えば、表現型的にサイ
レントなアミノ酸置換をいかにして作製するかに関するガイダンスが、Bowie,J.
U.ら、「Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino
Acid Substitutions,」Science 247:1306-1310(1990)で提供され、ここで著者ら
は、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための2つの主だったアプロ
ーチが存在すると示している。最初の方法は進化のプロセスに依存し、ここで変
異は天然の選択により受け入れられるか、または拒絶されるかのどちらかである
。第2のアプローチは、クローン化された遺伝子の特定部位でのアミノ酸変化な
らびに機能的に維持する配列を同定するための選択もしくはスクリーンを導入す
るために遺伝子工学を使用する。
著者らが述べるように、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほ
ど寛容性であることを明らかにしてきた。著者らは、タンパク質の特定の部位で
どのアミノ酸変化が許容性であると思われるかをさらに示している。例えば、ほ
とんどの包理したアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、一方で表面側鎖のほと
んどの特徴は一般に保存されない。他のこのような表現型的にサイレントな置換
は、Bowie,J.U.ら(前出)およびその中で引用される参考文献に記載される。代
表的には、保存的置換としてみられるのは、それぞれ脂肪性アミノ酸のAla、Val
、Leu、およびIleの間の置き換え;ヒドロキシル残基SerおよびThrの交換、酸性
残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGln間の置換、塩基性残基Lysお
よびArgの交換、ならびに芳香族残基Phe、Tyrの間の置き換えである。
従って、配列番号2のポリペプチド、または奇託されたcDNAによりコードされ
るポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(i)1つ以上のア
ミノ酸残基が、保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基(好ましくは、
保存されたアミノ酸残基)で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残
基が遺伝コードによりコードされたものであってもなくてもよいもの、または(
ii)1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または(iii)Kunitz型
ドメイン含有ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させるための化合物
(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物と融合したもの、また
は(iv)さらなるアミノ酸(例えば、IgG Fc融合領域ペプチド配列もしくは
リーダー配列もしくは分泌配列または上記の形態のポリペプチドもしくはプロタ
ンパク質配列の精製について使用される配列)が上記の形態のポリペプチドと融
合したものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本
明細書の教示より当業者の範囲内であると見なされる。
従って、本発明のTFPI-3は、天然の変異もしくは人工操作のいずれかに由来す
る1つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含み得る。示されるように、
タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換のよう
な、小さな性質の変化が好ましい(表1を参照のこと)。
表1。保存的アミノ酸置換。 本発明のTFPI-3タンパク質の機能上必須のアミノ酸は、当該分野で公知の方法
(例えば、部位特異的変異誘発またはアラニン走査型(alanine-Scanning)変異誘
発)により同定され得る(CunninghamおよびWells,Science 244:1081-1085(1989)
)。後者の手順は、分子中のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入する。次
いで、得られた変異体分子は生物学的活性(例えば、レセプター結合またはイン
ビボもしくはインビトロでの増殖活性)について試験される。
荷電したアミノ酸を、高度に望ましい改善された特徴(例えば、凝集しにくい
)を有するタンパク質を産生し得る他の荷電したアミノ酸または中性アミノ酸と
置換することが特に興味深い。凝集は活性を減少させ得るだけではなく、薬学的
処方物を調製する場合にも問題であり得る。なぜなら凝集体は免疫原性であり得
るからである(Pinckardら、Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967);Robbinsら、Di
abetes 36:838-845(1987);Clelandら、Crit.ReV.Therapeutic Drug Carrier Sys
tems 10:307-377(1993))。
図2は、9個のKunitz型ドメインのアラインメントを示す。Kunitzコンセンサ
ス配列である配列番号28に示されるような、強く保存されたアミノ酸を有するTF
PI-3ポリペプチドが好ましい。TFPI-3ポリペプチドがコンセンサス配列中の同じ
位置のアミノ酸に同一ではないアミノ酸残基を有する場合、TFPI-3ポリペプチド
ムテイン中のアミノ酸は、好ましくは、コンセンサス配列中に示されているアミ
ノ酸と置換されている。最も非常に好ましいTFPI-3ムテインは、コンセンサス配
列(配列番号28)のように示されるアミノ酸配列を有するムテインである。この
ようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。このよ
うなポリペプチドは、当業者に公知の方法によって、例えば固相合成法によって
容易に生成され得る。
アミノ酸の置き換えはまた、細胞表面レセプターに対するリガンドの結合選択
性を変化させ得る。例えば、Ostadeら、Nature 361:266-268(1993)は、TNFレセ
プターの2つの公知の型の1つのみに対するTNF-αの選択的な結合を生じる特定
の変異体を記載する。リガンド−レセプター結合について決定的である部位はま
た、構造解析(例えば、結晶化、核磁気共鳴法または光親和性標識)により決定
され得る(Smlthら、J.Mol.Biol.224:899-904(1992)およびdeVosら、Science 25
5:306-312(1992))。
TFPI-3はTFPI関連タンパク質ファミリーのメンバーであるので、TFPI-3の生物
学的活性を完全に排除するのではなく調整するために、好ましくは、変異は、TF
PI-3の保存されたKunitz型ドメイン(すなわち、配列番号2の11〜61位および10
6〜156位)中のアミノ酸をコードする配列で、より好ましくは他のプロテアーゼ
インヒビター間の類似のKunitz型ドメイン中に保存されていないこの領域内の残
基中で行われる(図3を参照のこと)。より詳細には、第VIIa因子−組織因子は
、P1アルギニン残基を有する合成基質に動力学的選好性を示す(Kam、Ch.M.ら、
Thromb.Haemostas.、64:133〜137(1990))。従って、配列番号2の21位もしく
は116位のアルギニンの、任意の他のアミノ酸での置換は、コンフォメーション
整合性を有するが活性が減少したTFPI-3変異体、すなわちアンタゴニストを生じ
る。従って、本発明の一部を形成するのは、完全長TFPI-3、成熟型TFPI-3、また
はKunitz型ドメイン含有形態のTFPI-3のアミノ酸配列を含むポリペプチドである
が、ここで配列番号2の21位および/もしくは116位のアミノ酸はアルギニン以
外である。上記のTFPI-3変異体をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌク
レオチドもまた、本発明の一部を形成する。
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ま
しくは実質的に精製される。TFPI-3ポリペプチドの組換え産生バージョンは、Sm
ithおよびJohnson,Gene 67:31-40(1988)に記載される一工程法により実質的に精
製され得る。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質精製の分野で周知である
方法で、本発明の抗TFPI-3抗体を使用して天然または組換えの供給源から精製さ
れ得る。
本発明は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたTF
PI-3ポリペプチドをさらに提供する:(a)配列番号28で示されるアミノ酸配列
を有するコンセンサスなKunitzドメインのアミノ酸配列、;および(b)配列番
号2の106位〜156位のアミノ酸配列、またはATCC受託番号97797に含まれるcDNA
クローンによりコードされるアミノ酸配列、を有するTFPI-3の第二のKunitz型ド
メインを含むポリペプチドのアミノ酸配列;ここで、(a)または(b)のポリ
ペプチドは、配列番号29、配列番号30、または配列番号31で示される配列を含ま
ない。
本発明のさらなるポリペプチドは、上記のポリペプチドに対して少なくとも約
90%の類似性、より好ましくは少なくとも95%の類似性、そしてなおより好まし
くは少なくとも96%、97%、98%または99%の類似性を有するポリペプチドを含
む。本発明のポリペプチドはまた、寄託されたcDNAによりコードされるポリペプ
チドに対して、または配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも80%の同一
性、より好ましくは少なくとも90%または95%の同一性、なおより好ましくは少
なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を含み、そして少なくとも30ア
ミノ酸およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸のこのようなポリペプチドの
部分をも含む。
2つのポリペプチドについての「%の類似性」とは、類似性の決定のためのBe
stfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,G
enetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madiso
n,WI 53711)およびデフォルト設定を使用して2つのポリペプチドのアミノ酸配
列を比較することにより算出された類似性スコアを意図する。BestfitはSmithお
よびWaterman(Advances in Applied Mathematics 2:482-489,1981)の局所的相同
性アルゴリズムを使用し、2つの配列間の類似性が最良のセグメントを見つけだ
す。
例えば、TFPI-3ポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、95%「同一の
」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、そのポリペプチド配列が、TFPI-3
ポリペプチドの参照アミノ酸の各100アミノ酸毎に5つまでのアミノ酸変化を含
み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一である
ことが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも95%同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列において5%ま
でのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは別のアミノ酸で置換され得、または
参照配列における総アミノ酸残基の5%までの多数のアミノ酸が参照配列に挿入
され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もし
くはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、もしくは参照配
列内で1つ以上の隣接した基内のいずれかに散在した、これらの末端位置の間の
どこかで起こり得る。
実際に、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号2に示されるアミノ
酸配列、または寄託されたcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列に対し
て、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるかどうか
は、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,version 8 for
Unix、Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Dr
ive,Madison,WI 53711)のような公知のコンピュータープログラムを使用して
従来通りに決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列に95%同一
であるかどうかを決定するために、Bestfitまたは任意の他の配列アラインメン
トプログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性のパーセンテージが参
照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の
総数の5%までの相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターが設
定される。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるSDS-PAGEゲル、または
分子ふるいゲル濾過カラム上で分子量マーカーとして使用され得た。
下記に詳細に示すように、本発明のポリペプチドはまた、ポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。これらは、下記のよ
うにTFPI-3タンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて有用であるか、ま
たはTFPI-3タンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴ
ニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、本発明の候補ア
ゴニストおよびアンタゴニストでもあるTFPI-3タンパク質結合タンパク質を「捕
獲する」ための酵母2−ハイブリッドシステムにおいて使用され得る。酵母2−
ハイブリッドシステムは、FieldsおよびSong,Nature 340:245-246(1989)に記
載されている。
エピトープ保有部分
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトー
プは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫
原性エピトープ」は、全てのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発す
るタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質
分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピ
トープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysen
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983)を参照のこと。
抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド(すなわち、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域を含む)の選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Sutcli
ffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green,N.およびLearner,R.A.(1983)「Antibodies that
react with predetermined sites on proteins」,Science 219:660-666を参照の
こと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で
頻繁に示され、そして簡単な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そして
インタクトなタンパク質の免疫優性領域(すなわち、免疫原性エピトープ)に
も、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。それゆえ本発明の
抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに
特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、抗体を惹起するために有用である
。例えば、Wilsonら、Cell 37:767-778(1984)の777頁を参照のこと。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列内部に含まれるアミノ酸を、好ましくは少なくとも7個
、より好ましくは少なくとも9個、そして最も好ましくは約15〜約30個のアミノ
酸の配列を含む。TFPI-3特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペ
プチドまたはペプチドの制限されない実施例は、以下を含む:配列番号2での約
Asn-47から約Cys-61までのアミノ酸残基を含むポリペプチド;約Asp-71から約Th
r-107までのアミノ酸残基を含むポリペプチド;約Glu-127から約Asn-133までのア
ミノ酸残基を含むポリペプチド;および約Asn-142から約Glu-150までのアミノ酸
残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドのフラグメントは、上記の、図
3で示されるJamson-Wolf抗原指数の分析によりTFPI-3タンパク質の抗原性エピ
トープを保有するために決定された。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
より産生され得る。例えば、Houghten,R.A(1985)「General method for the rap
id solid-phase synthesis of large numbers of peptides:specificity of ant
igen-antibody interaction at the level of individual amino acids.」Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135を参照のこと;この「Simultaneous Multiple
Peptide Synthesis(SMPS)」プロセスは、Houghtenらの米国特許第4,631,211号(1
986)でさらに記載される。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、抗体を誘導するため
に当該分野で周知の方法に従って使用される。例えば、Sutcliffeら(前出);Wi
lsonら(前出);Chow,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914;およびBittl
e,F.J.ら、J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)を参照のこと。本発明の免疫原性の
エピトープ保有ペプチド(すなわち、全てのタンパク質が免疫原である場合に、
抗体応答を誘導するタンパク質の部分)は、当該分野で公知の方法に従って同定
される。例えば、Geysenら(前出)を参照のこと。さらになお、Geysen(1990)の
米国特許第5,194,392号は、目的の抗体の特定のパラトープ(抗原結合部位)に
対して相補的なエピトープ(すなわち「ミモトープ」)の位相幾何学的等価物で
あるモノマー(アミノ酸または他の化合物)の配列を検出または決定する一般的
な方法を記載する。より一般的には、Geysen(1989)の米国特許第4,433,092号
は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相
幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同
様に、Peralkylated Oligopeptide Mixturesに関するHoughten,R.A.ら(1996
)の米国特許第5,480,971号は、直鎖Cl-C7-アルキル過アルキル化(peralkylate
d)オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、
ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過アルキル化オリゴペプ
チドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラ
リーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非
ペプチドアナログはまた、これらの方法により日常的に作成され得る。
融合タンパク質
当業者が理解するように、上記の本発明のTFPI-3ポリペプチドおよびそのエピ
トープ保有フラグメントは、免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの一部と結
合し得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易
にし、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトCD4-ポリペ
プチドの最初の2つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖
の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている(
EP A394,827;Trauneckerら、Nature 331:84-86(1988))。IgG部分によるジスル
フィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体TFPI-3タンパク質
またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和において
効率的であり得る(Fountoulakisら、J.Biochem.270:3958-3964(1995))。
抗体
本発明で使用されるTFPI-3タンパク質特異的抗体は、完全なTFPI-3タンパク質
またはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹起され得、これはキャリ
アタンパク質(例えば、アルブミン)を用いて、あるいは十分に長い(少なくと
もおよそ25アミノ酸)場合ではキャリアを用いずに、動物の系(例えば、ウサギ
またはマウス)に供され得る。
本明細書で使用される用語「抗体(Ab)」または「モノクローナル抗体(Mab)」
は、完全な分子ならびにTFPI-3タンパク質に対し特異的に結合し得る抗体フラグ
メント(例えば、FabおよびF(ab')2フラグメント)を含むことを意味する。Fab
およびF(ab')2フラグメントは完全な抗体のFcフラグメントを欠落し、そして循
環からより迅速に除去され、完全な抗体の非特異的な組織への結合をより少なく
有し得る(Wahlら、J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。従って、これらのフラグメ
ントは好ましい。
本発明の抗体は、任意の種々の方法により調製され得る。例えば、TFPI-3タン
パク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を
含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法では、TFPI
-3タンパク質の調製物は、それを実質的に天然の混入物を皆無にするために調製
および精製される。次いで、このような調製物は、より特異的な活性のポリクロ
ーナル抗血清を産生するために動物に導入される。
最も好ましい方法においては、本発明の抗体はモノクローナル抗体(またはそ
のTFRI-3タンパク質結合フラグメント)である。このようなモノクローナル抗体
lonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,(1981)563-681頁)を
使用して調製され得る。一般には、このような手順はTFPI-3タンパク質抗原,ま
たはより好ましくはTFPI-3タンパク質発現細胞での動物(好ましくはマウス)の
免疫化を含む。適切な細胞は、抗TFPI-3タンパク質抗体に結合するそれらの能力
により認識され得る。このような細胞は任意の適切な組織培養培地で培養され得
るが;10%ウシ胎仔血清(約56℃で不活化)を補充し、ならびに約10g/lの非必
須アミノ酸、約1,000U/mlのペニシリン、および約100μg/mlのストレプトマイシ
ンを補充したEarle改変Eagle培地中で細胞を培養することが好ましい。このよう
なマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合される。任
意の適切なミエローマ細胞株が本発明に従って使用され得るが;ミエローマ細胞
の親細胞株(SP20)(アメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville,Maryla
nd)より入手可能)を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ
細胞はHAT培地中で選択的に維持され、次いで、Wandsら(Gastroenterology 80:
225-232(1981))により記載される限界希釈によりクローン化される。次いで、こ
のような選択を通じて入手されたハイブリドーマ細胞は、TFPI-3タンパク質抗原
に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
あるいは、TFPI-3タンパク質抗原に結合し得るさらなる抗体は、抗イディオタ
イプの抗体の使用を通じて2工程の手順で産生され得る。このような方法は、抗
体がそれ自身の抗原であるという事実を使用し、しかもそれゆえに、第2の抗体
に結合する抗体を入手することが可能である。この方法に従って、TFPI-3タンパ
ク質特異的抗体は、動物(好ましくはマウス)を免疫化するために使用される。
次いで、このような動物の牌細胞は、ハイブリドーマ細胞を産生するために使用
され、そしてハイブリドーマ細胞は、そのTFPI-3タンパク質特異的抗体に結合す
る能力が、TFPI-3タンパク質抗原によりブロックされ得る抗体を産生するクロー
ンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、TFPI-3タンパク
質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるTFPI-3タン
パク質特異的抗体の形成を誘導するために、動物の免疫化に使用され得る。
本発明のFabおよびF(ab')2ならびに他の抗体のフラグメントは、本明細書で開
示される方法に従って使用され得ることが理解される。代表的には、このような
フラグメントは、パパイン(Fabフラグメントを産生するため)またはペプシン
(F(ab')2フラグメントを産生するため)のような酵素を使用して、タンパク質
分解性切断により産生される。あるいは、TFPI-3タンパク質結合フラグメントは
、組換えDNA技術の適用を通じて、または合成化学を通して産生され得る。
ヒトにおける、インビボでの抗TFPI-3の使用については、「ヒト化」キメラモ
ノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上述
されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築
物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公
知である。総説については、Morrison,Science 229:1202(1985);Oiら、BioTechn
iques 4:214(1986);Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Taniguchiら、EP 1714
96;Morrisonら、EP 173494;Neubergerら、WO8601533;Robinsonら、WO870267l;Bo
ulianneら、Nature 312:643(1984);Neubergerら、Nature 314:268(1985)を参照
のこと。
止血系関連障害
診断
多くの止血系関連障害については、TFPI-3遺伝子発現の実質的に変化した(上
昇したまたは減少した)レベルは、「標準的」なTFPI-3遺伝子発現レベル(すな
わち、止血系疾患を有さない個体から得られた内皮組織、または体液でのTFPI-3
発現レベル)と比較して、このような障害を有する個体から得られた内皮組織ま
たは他の細胞、または体液(例えば、血清、血漿、尿、滑液、または髄液)から
検出され得る。従って、本発明は、止血性疾患の診断において有用である診断方
法を提供し、これは個体から得られた内皮組織または他の細胞、または体液での
TFPI-3タンパタ質をコードする遺伝子の発現レベルの測定を含み、そして標準的
なTFPI-3遺伝子発現レベルと測定した遺伝子発現レベルとを比較し、それにより
標準と比較した遺伝子発現レベルの上昇または減少は止血系障害指標である。
従って、本発明は、止血系障害の診断中に有用な診断方法を提供し、この方法
は、個体からの内皮細胞組織またはその他の細胞または体液でのTFPI-3タンパク
質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および、測定された遺伝子
発現レベルを標準TFPI-3遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、そのことに
より、標準と比較された遺伝子発現レベルの増加または減少が、止血系障害の指
標となる。
止血系における障害の診断が、すでに従来方法に従って実施されたときに、本
発明は、予後指標として有用である。予後指標によりされたか増強または低下さ
れたかのいずれかのTFPI-3遺伝子発現を示す患者は、標準レベルにより近いレベ
ルで遺伝子を発現する患者に比較して、より悪い臨床結果を経験する。
「TFPI-3タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイすること」に
よって、TFPI-3タンパク質のレベル、またはTFPI-3タンパク質をコードするmRNA
レベルを、第一の生物学的サンプルで、直接的(例えば、絶対タンパク質レベル
またはmRNAレベルの決定または評価によって)または相対的(例えば、第二の生
物学的サンプル中のTFPI-3タンパク質レベルまたはmRNAレベルとの比較による)
に、定性または定量的に測定または評価することが意図される。好ましくは、第
一の生物学的サンプル中のTFPI-3タンパク質レベルまたはmRNAレベルは、測定ま
たは評価され、そして標準TFPI-3タンパク質レベルまたはmRNAレベルと比較され
る。この標準は、障害を有さない個体から得た第二の生物学的サンプルから得ら
れるか、または止血系の障害を有さない個体集団からのレベルを平均して決定さ
れる。当該分野で理解されるように、一旦標準TFPI-3タンパク質レベルまたはmR
NAレベルが判明すると、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
「生物学的サンプル」によって、TFPI-3タンパク質またはmRNAを含有する、個
体、体液、細胞株、組織培養物、またはその他の供給源から得られた、任意の生
物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、遊離TFPI
-3タンパク質を含有する体液(血清、血漿、尿、滑液、および髄液のような)、
内皮組織、およびTFPI-3の完全もしくは成熟(!もしくは「細胞外ドメイン」、
またはTFPI-3レセプターを発現することが認められているその他の組織供給源を
包含する。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該分野で周知であ
る。生物学的サンプルが、mRNAを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの種々の止血系関連障害の診断または処
置に有用である。このような障害は、血管性血栓症(詳細には、脳卒中および狭
心症の手術後の患者における)、フィブリノーゲン過剰性出血、外傷性出血性シ
ョック、および血友病などの病的素因を含む。
全細胞RNAは、任意の適切な技術(例えば、ChomczynskiおよびSacchi,Anal.Bi
ochem.162;156-159(1987)に記載される単一工程であるグアニジニウム−チオシ
アネート−フェノール−クロロホルム法)を使用して生物学的試料から単離され
得る。次いで、TFPI-3タンパク質をコードするmRNAのレベルは、任意の適切な方
法を使用してアッセイされる。これらはノーザンブロット分析、Slヌクレアーゼ
マッピング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ポリメラーゼ連鎖反応を組み合わせ
た逆転写(RT-PCR)、およびリガーゼ連鎖反応を組み合わせた逆転写(RT-LCR)を
含む。
生物学的試料中でのTFPI-3タンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づく技術
を使用して考案され得る。例えば、組織でのTFPI-3タンパク質発現は、古典的な
免疫組織学的方法(Jalkanen,Mら、J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen,M
ら、J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987))を使用して研究され得る。TFPI-3タンパ
ク質遺伝子発現を検出するために有用である他の抗体に基づく方法は、イムノア
ッセイ(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)およびラジオイムノアッセイ
(RIA))を含む。適切な抗体アッセイ標識は当該分野で公知であり、酵素標識(例
えば、グルコースオキシダーゼおよびラジオアイソトープ(例えば、ヨウ素(125I
、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(112In)、および
テクネチウム(99mTc))、および蛍光標識(例えば、フルオレセインおよびローダ
ミン)およびビオチン)を含む。
個体から得た生物学的サンプル中のTFPI-3タンパク質レベルのアッセイに加え
て、TFPI-3タンパク質はまた、画像診断によってインビボで検出され得る。TFPI
-3タンパク質のインビボ画像診断のための抗体標識またはマーカーは、X線撮影
、NMR、またはESRによって検出可能なものを包含する。X線撮影については、適
切な標識は、バリウムまたはセシウムのようなラジオアイソトープを包含し、こ
れは検出可能な放射線を放射するが、被検体に対して明らかに有害ではない。NM
RおよびESRに適切なマーカーは、重水素のような検出可能な特徴的なスピンを有
するもの(これは、関連ハイブリドーマを栄養物(neutrient)で標識することによ
って、抗体へ組み込まれ得る)を含む。
TFPI-3タンパク質特異的抗体、またはラジオアイソトープ(例えば、131I、11 2
In、99mTc)、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質
のような、適切な検出可能な画像診断部分で標識された抗体フラグメントは、免
疫系障害について試験されるべき哺乳動物へ導入される(例えば、非経口的、皮
下的または腹腔内に)。被検体の大きさおよび使用される画像診断システムが、
診断画像を作成するために必要な画像診断部分の量を決定することは、当該分野
で理解される。ラジオアイソープ部分の場合には、ヒト被検体について、注入さ
れる放射活性の量は、通常、99mTcの約5〜20ミリキュリーの範囲である。次に、
標
識抗体または抗体フラグメントは、TFPI-3タンパク質を含有する細胞の位置に、
優先的に蓄積する。インビボ腫瘍画像診断は、S.W.Burchielら、"Immunopharmac
okinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments"(Tumor Imaging
の第13章:The Radiochemical Detection of Cancer,S.W.BurchielおよびB.A.
Rhodes編、Masson Publishing Inc.(1982))に記載されている。
処置
上記で述べたように、TFPI-3ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、TFPI-3
活性の異常な高い発現または低い発現を含む症状の診断に有用である。TFPI-3に
より調節される活性により、標準または「正常な」レベルと比較して、個体にお
けるTFPI-3の実質的に変化(上昇または減少)した発現レベルが、TFPI-3が発現
されているか、そして/または活性である体内系に関連する病理学的な状態を生
じることは、容易に明らかである。
当業者により、本発明のTFPI-3タンパク質はTFPI-ファミリーのメンバーであ
るので、このタンパク質の成熟型がタンパク分解性の切断によりTFPI-3を発現す
る細胞から可溶性型で放出され得ることもまた、理解される。したがって、可溶
性TFPI-3が、外来供給源から個体の細胞、組織または身体へ添加された場合、そ
のタンパク質は、その個体の標的細胞においてその生理活性を発揮する。
したがって、個体における標準または正常なTFPI-3活性レベルの減少により引
き起こされる状態(特に、止血系の障害)は、TFPI-3ポリペプチドの形態を(可
溶性型で)含む成熟またはKunitz型のドメインの投与により処置され得ることが
理解される。したがって、本発明はまた、このような個体においてTFPI-3の活性
レベルを上昇させるのに有効な量の本発明の単離されたTFPI-3ポリペプチドを含
む薬学的組成物をこのような個体に対して投与することを包含する、TFPI-3活性
のレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。
血栓性障害の発生率の増加を生じる止血系の変化は、よくある新形成の結果で
ある。TFPIを用いた動物モデルにおける研究は、TFPIの注入がTFにより誘発され
る散在性血管内凝固を抑止し、そして血管傷害により誘発されるクロットの血栓
崩壊後の動脈再閉塞を防止することを示した。血管内凝固はまた、エンドトキシ
ンにより引き起こされることが公知である(Bronze,Jr.,G.J.,Seminars in Hema
tology,29(3):159(1992))。
したがって、TFPI-3は、インビトロおよびインビボの両方における血管内凝固
の阻害およびフィブリンのクロット形成の防止に有用である。本発明のポリペプ
チドは、特に、静脈内血栓症の予防における抗凝固療法のために有用であり、そ
してその拡大防止のための処置として有用であり、ならびに主腹胸(maior abod
ominothoratic)手術を経験した患者(特に、血栓塞栓性疾患を進展させる危険
のある患者)における手術後の深度の静脈血栓症および肺塞栓症の防止のための
低用量養生法を提供するために有用である。TFPI-3はまた、肺塞栓症および塞栓
症を伴う心房細動の予防および処置のために使用され得る。例えば、肺塞栓症は
、分娩後死亡の主な非産科的な原因を示す。したがって、TFPI-3は、妊娠期およ
び分娩後の女性の処置のために使用され得る。さらに、TFPI-3は、動脈手術およ
び心臓手術中の凝固の予防ならびに進展中の脳卒中の脳血栓症の予防のために使
用され得る。TFPI-3は、急性心筋梗塞を伴う冠状動脈の閉塞症の処置ならびに末
梢動脈塞栓症の予防および処置の両方に使用され得る。TFPI-3はまた、敗血症、
炎症性疾患および移植片拒絶の処置において使用され得る。TFPI-3はまた、輸血
、体外循環、および透析手順において抗凝固剤として使用され得、そして研究目
的の血液サンプルにおいて使用され得る。
アプロチニンと同様に、TFPI-3ポリペプチド(特に、コンセンサスKunitz型ド
メインのポリペプチドを含むKunitz型ドメインの1つだけを含むポリペプチド)
は、特に、線溶亢進性出血および外傷性出血ショックの処置、ならびに結合組織
への損傷、血管壁への損傷、壊死性疾患および肺組織の変性を伴う急性および慢
性の炎症における膵臓エラスターゼ(膵炎)、血清エラスターゼ(関節硬化)、
白血球エラスターゼの過剰放出に関係する疾患において有用であり得る。
処方物
TFPI-3ポリペプチド組成物は処方され、個々の患者の臨床状態(特に、TFPI-3
ポリペプチド単独での治療の副作用)、TFPI-3ポリペプチド組成物の送達部位、
投与方法、投与計画、および当業者に公知のその他の要因を考慮して、良好な医
療治療と一致した様式で処方および投薬される。従って、本明細書での目的のた
めのTFPI-3ポリペプチドの「有効量」は、このような考慮によって決定される。
一般的な問題として、1用量あたりの非経口的に投与されるTFPI-3ポリペプチ
ドの薬学的に有効な全体量は、患者の体重あたり約1μg/kg/日〜10mg/kg/日の範
囲であるが、上記に示されているように、これは治療上の裁量を受ける。より好
ましくは、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日、そして最も好ましくは、ヒト
に対して、ホルモンについては約0.01mg/kg/日と1mg/kg/日との間の範囲である
。継続的に投与される場合、TFPI-3ポリペプチドは、代表的には、約1μg/kg/時
間〜約50μg/kg/時間の用量速度で、1日あたり1〜4回注入によって、または、例
えば、ミニポンプを使用した継続的皮下注入によってのいずれかで投与される。
静脈内点滴用バッグ溶液もまた使用され得る。変化の観察に必要な処置の長さは
、および応答が生じるまでの処置後の間隔は、所望の効果に依存して変化するよ
うである。
本発明のTFPI-3を含有する薬学的組成物は、経口的、直腸、非経口的、槽内(i
ntracistemally)、腟内、腹腔内、局所(粉末、軟膏、点滴剤、または経皮パッ
チによるように)、口腔に(bucally)、または経口または経鼻スプレーとして、
投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」によって、非毒性の固体、半固
体、または液状の充填剤、希釈物、カプセル化材料、または任意の型の処方補助
剤が意味される。本明細書で使用されているように、用語「非経口」は、静脈内
、筋肉内、腹腔内、胸骨下(intrasternal)、皮下、および関節内の注射および注
入を包含する、投与態様をいう。
TFPI-3ポリペプチドはまた、持続放出システムにより適切に投与される。持続
放出組成物の適切な例は、成形物品(例えば、フィルムまたはマイクロカプセル
(mirocapsule))の形態での半透過性ポリマーマトリックスを包含する。持続放
出マトリックスは、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP 58,481)、L-グ
ルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー(Sidman,U.ら、Biop
olymers 22:547-556(1983))、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(R.L
angerら、J.Biomed.Mater.Res.15:167-277(1981)、およびR.Langer,Chem
.Tech.12:98-105(1982))、エチレンビニルアセテート(R.Langerら、同
書)またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)を包含する。持続放出T
FPI-3ポリペプチド組成物はまた、リポソーム封入TFPI-3ポリペプチドを包含す
る。TFPI-3ポリペプチド含有リポソームは、それ自体既知の方法によって調製さ
れる:DE 3,218,121;Epsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:3688-3692(1
985);Hwangら、Proc.Natl.Acad Sci.(USA)77:4030-4034(1980);EP 52,322;E
P 36,676;EP 88,046:EP 143,949;EP 142,641;日本国特許出願83-118008;米国特
許第4,485,045号および第4,544,545号;および、EP 102,324。通常、リポソーム
は、脂質含有量が約30モル%コレステロールより多い、小さな(約200〜800オン
グストローム)単ラメラ型であり、選択される割合は、最適なTFPI-3ポリペプチ
ド治療について調整される。
非経口投与については、1つの実施態様で、TFPI-3ポリペプチドは、一般的に
、単位投薬量を注入可能な形態(溶液、懸濁液、またはエマルジョン)の所望の
純度のTFPI-3ポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリア(すなわち、使用さ
れる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、かつ処方物のその
他の成分と適合性であるもの)と混合することにより、処方される。例えば、処
方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害なことが知られ
ているその他の化合物を含有しない。
一般的に、処方物は、TFPI-3ポリペプチドを、液体キャリアもしくは細分割さ
れた固体キャリアまたは両方と均質および密接に接触させることによって、調製
される。次いで、必要に応じて、製品は、所望の処方物に成形される。好ましく
は、キャリアは、非経口キャリアであり、より好ましくはレシピエントの血液と
等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、
リンゲル液、およびデキストロース溶液を包含する。固定油およびオレイン酸エ
チルのような、非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に、本明細書において
有用である。
キャリアは、等張性および化学安定性を増強する物質のような、微量の添加物
を適切に含有する。このような材料は、使用される投薬量および濃度でレシピエ
ントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および
その他の有機酸またはその塩類のような、緩衝剤;アスコルビン酸のような、抗
酸化剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまた
はトリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような、
タンパク質;ポリビニルピロリドンのような、親水性ポリマー;グリシン、グル
タミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのような、アミノ酸;セルロース
またはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および、その他の炭水化物;EDTAのような、キレート剤;マンニト
ールまたはソルビトールのような、糖アルコール;ナトリウムのような、対イオ
ン;ならびに/あるいはポリソルベート、ポリオキサマー(poloxamers)、また
はPEGのような、非イオン界面活性剤を包含する。
TFPI-3ポリペプチドは、代表的には、約0.1mg/ml〜100mg/ml、好ましくは1〜1
0mg/mlの濃度で、pH約3〜8でこのようなビヒクル中に処方される。特定の前記賦
形剤、キャリア、または安定剤の使用が、TFPI-3ポリペプチド塩の形成をもたら
すことは、理解される。
治療投与に使用されるTFPI-3ポリペプチドは、無菌でなければならない。無菌
化は、滅菌濾過膜(例えば、0.2ミクロン膜)を通す濾過によって、容易に達成
される。治療TFPI-3ポリペプチド組成物は、一般的に、無菌出入口を有する容器
(例えば、皮下注射針によって刺し通し得る栓を有する静脈内点滴用溶液バッグ
またはバイアル)へ入れられる。
通常、TFPI-3ポリペプチドは、単位または多数回用量容器(例えば、密封アン
プルまたはバイアル)中に、水溶液または再構成用の凍結乾燥処方物として、貯
蔵される。凍結乾燥処方物の例として、10mlバイアルは、滅菌濾過された1%(w/
v)TFPI-3ポリペプチド水溶液(5ml)で満たされ、得られた混合物は、凍結乾燥
される。注入溶液は、注射用静菌蒸留水を用いて、凍結乾燥TFPI-3ポリペプチド
を再構成することによって、調製される。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の1つ以上の成分で満たされた、1つ以
上の容器を含む、薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器に関し
ては、医薬または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関に
よって規定された形式の通知が伴われ得、この通知は、ヒト投与に対する製造、
使用または販売の機関による認可を示す。さらに、本発明のポリペプチドは、そ
の他の治療化合物と併用して使用され得る。
アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよび分子
本発明はまた、細胞におけるTFPI-3の作用(例えば、レセプター分子のような
TFPI-3結合分子との相互作用)を増強またはブロックする化合物を同定するため
の化合物のスクリーニング方法を提供する。アゴニストは、TFPI-3の天然の生物
学的機能を増強する化合物またはTFPI-3に類似する様式で機能する化合物であり
、一方アンタゴニストはこれらの機能を低減または消去する。
この実施態様の別の局面において、本発明はTFPI-3ポリペプチドに特異的に結
合する、レセプタータンパク質または他のリガンド結合タンパク質を同定するた
めの方法を提供する。例えば、膜またはその調製物のような細胞コンパートメン
トが、TFPI-3に結合する分子を発現する細胞から調製され得る。その調製物は、
標識TFPI-3とインキュベートされ、そしてレセプターまたは他の結合タンパク質
に結合したTFPI-3の複合体は、当該分野で公知の日常的な方法にしたがって単離
され、そして特徴付けられる。あるいは、TFPI-3ポリペプチドは固体支持体に結
合され得、その結果、細胞から可溶化された結合分子がカラムに結合され、次い
で溶出され、そして日常的な方法にしたがって特徴付けられる。
アゴニストまたはアンタゴニストについての本発明のアッセイにおいて、細胞
コンパートメント(例えば、膜またはその調製物)は、TFPI-3に結合する分子(
例えば、TFPI-3により調節されるシグナル伝達分子または調節経路における分子
)を発現する細胞から調製され得る。その調製物は、TFPI-3のアゴニストまたは
アンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下において、標識TFPI
-3とともにインキュベートされる。その結合分子に結合するための候補分子の能
力は、標識リガンドの結合の減少に反映される。無償に(すなわち、TFPI-3結合
分子へのTFPI-3の結合に影響を誘導することなしに)結合する分子は、良いアン
タゴニストである可能性が最も高い。良好に結合し、そしてTFPI-3と同じ効果ま
たはTFPI-3に密接に関連する効果を誘発する分子はアゴニストである。
潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのTFPI-3様の効果は、例えば、候補
分子の細胞または適切な細胞調製物との相互作用の後の第2メッセンジャー系の
活性を決定し、そしてその効果をTFPI-3の効果またはTFPI-3と同じ効果を誘発す
る分子の効果と比較することにより測定され得る。この点に関して有用であり得
る第2メッセンジャーとしては、AMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル
またはホスホイノシチド加水分解の第2メッセンジャー系が挙げられるがこれら
には限定されない。
TFPI-3のアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、競合的な阻害アッセ
イのために適切な条件下で、TFPI-3および潜在的なアンタゴニストをTFPI-3の基
質と合わせる競合的なアッセイである。その基質は、潜在的アンタゴニストの効
果を評価するために、TFPI-3の活性が正確に決定され得るように測定され得る。
潜在的なアンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、そしてこ
れによりそのポリペプチド活性を阻害または消去する、有機低分子、ペプチド、
ポリペプチドおよび抗体が挙げられる。潜在的なアンタゴニストはまた、TFPI-3
誘導性活性を誘導せずにレセプター分子のような結合分子上の同じ部位に結合し
、これによりその結合からTFPI-3を排除することによりTFPI-3の作用を防止する
有機低分子、ペプチド、ポリペプチド(例えば、密接に関連するタンパク質)ま
たは抗体であり得る。
その他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス分子を包含する。アンチセ
ンス技術は、アンチセンスDNAまたはRNAを介して、または三重ヘリックス形成を
介して、遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例え
ば、Okano,J.Neurochem.56:560(1991);「Oligodeoxynucleotides as Antisen
se Inhibitors of Gene Expression」,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)に考察
されている。三重ヘリックス形成は、例えば、Leeら、Nucleic Acids Research
6:3073(1979);Cooneyら、Science 241:456(1988);および、Dervanら、Science 2
51:1360(1991)に考察されている。その方法は、相補的DNAまたはRNAへのポリヌ
クレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドの5'コード部分は、長さ約10塩基対から約40塩基対のアンチセン
スRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。DNAオリゴヌクレオチ
ドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、これによっ
て、転写およびTFPI-3産生を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオ
チドは、インビボにおいてmRNAにハイブリダイズし、TFPI-3ポリペプチドへのmR
NA分子の翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンス
RNAまたはDNAが、TFPI-3タンパク質の産生を阻害するために、インビボで発現さ
れ得るように、細胞へ送達され得る。
アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、上記の薬学的に受容可能なキャ
リアを伴う組成物において使用され得る。
アンタゴニストは、例えば、血友病の処置において凝固を促進するために使用
され得る。TFPI-3に対する抗体は、血友病の処置のためにTFPI-3活性に結合し、
そして阻害するために使用され得る。同様に、特に好ましいアンタゴニストは、
1つだけのKunitz型ドメインを含むTFPI-3ポリペプチドであり、ここでP1位の残
基は上記のようにアルギニン以外である。このようなポリペプチドは、TFPI-3と
同じ基質に結合するべきであるが、減少した阻害活性を有する。上記のアンタゴ
ニストのいずれもが、例えば、本明細書中の後に記載の薬学的に受容可能なキャ
リアを伴う組成物において使用され得る。
遺伝子マッピング
本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト
染色体における特定の位置に特異的に標的化され、そしてそこにハイブリダイズ
し得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現時点
では、実際の配列データ(反復多型)に基づく染色体マーカー試薬のほとんどが
、染色体位置をマーカーづけするために利用可能ではない。本発明による染色体
へのDNAのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づける
ことにおいて重要な第一歩である。
この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中で開示されるcD
NAは、TFPI-3タンパク質遺伝子のゲノムDNAをクローニングするために用いられ
る。これは、一般的に市販される、種々の周知の技術およびライブラリーを用い
て達成され得る。次いで、この目的のために周知の技術を用いて、インサイチュ
染色体マッピングのためにゲノムDNAが用られる。
さらに、いくつかの場合において、配列は、cDNAからPCRプライマー(好まし
くは、15〜25bp)を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子
の3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムDNAにおいて1つを超え
るエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、従って、増幅プロセスを
複雑化する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細
胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために用いられる。中期染色体展開物へ
のcDNAクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(「FISH」)は、一
工程で、正確な染色体位置を提供するために用いられ得る。この技術は、50また
は60bp程度の短さのcDNA由来のプローブと共に用いられ得る。この技術の概説に
ついては、Vermaら、Human Chromosomes:A Manual Of Basic Techniques,Perga
mon Press,New York(1988)を参照のこと。
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
学的な位置は、遺伝地図データと相関づけられ得る。このようなデータは、例え
ば、V.McKusick,Mendelian Inheritance In Man(Johns Hopkins University
,Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)に見出される。次
いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関連が、連鎖分
析(物理学的に隣接した遺伝子の同時遺伝)によって同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間でのcDNAまたはゲノム配列における差異を
決定することが必要である。変異が罹患個体のいくらかまたは全てにおいて認め
られるが、いずれの正常個体でも認められない場合、変異は、疾患の原因因子の
ようである。
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによ
り、より容易に理解される。以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定する
ことを意図しない。
実施例
実施例1(a):E.coliにおける「Hisタグ」TFPI Kunitz型ドメイン1および2
の発現および精製
細菌性発現ベクターpQE9(pD10)を、本実施例の細菌性発現のために使用する
(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)。pQE9はアンピシ
リン抗生物質耐性(「Ampr」)をコードし、そして細菌の複製起点(「ori」)、IPT
G誘導性プロモーター、リボソーム結合部位(「RBS」)、QIAGEN Inc.(前出)
から販売されているニッケル-ニトリロ-三酢酸(「Ni-NTA」)アフィニティー樹脂
を用いてアフィニティー精製を可能にする、ヒスチジン残基をコードする6つの
コドン、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントを、
ポリペプチドをコードする挿入DNAフラグメントが、このポリペプチドのアミノ
末端に共有結合した6つのHis残基(すなわち、「6×Hisタグ」)を有するこの
ポリペプチドを発現するように、配置する。
TFPI-3のアミノ酸配列の第1のKunitz型ドメインを含むTFPI-3タンパク質の所
望の部分をコードするDNA配列を、PCRオリゴヌクレオチドプライマー(TFPI-3 c
DNAにおける所望の部分の5'配列、およびcDNAコード配列に対して3'側の寄託さ
れた構築物における配列にアニールする)を用いて寄託されたcDNAクローンから
増幅した。pQE9ベクターにおけるクローニングを容易にするために制限部位を含
むさらなるヌクレオチドを、それぞれ、3'および5'プライマー配列に付加した。
TFPI-3タンパク質の第1のKunitz型ドメインをクローニングするために、5'プ
ライマーは、下線を付したBglII制限部位を含む、配列5'CGCAGATCTCGCAGCATCCAC
GACTTCTGCC3'(配列番号20)を有していた。3'プライマーは、下線を付したHind
III制限部位を含む、配列5'CGCAAGCTTTTAGGCATTCTCTGTGACAGTGGCA3'(配列番号2
1)を有していた。
TFPI-3タンパク質の第2のKunitz型ドメインをクローニングするために、5'プ
ライマーは、下線を付したBamHI制限部位を含む、配列5'CCCCGGATCCAGCGATATGTT
CAACTATGAAGAATAC3'(配列番号22)を有していた。3'プライマーは、下線を付し
たHindIII制限部位を含む、配列5'CCCCAAGCTTTTAATTCTCCTGCTGGCGGAAGCA3'(配
列番号23)を有していた。
当業者は、当然、プライマーがアニールする、タンパク質コード配列における
点は、本明細書中に記載のタンパク質型より短いかまたは長い完全なTFPI-3タン
パク質の所望の任意の部分をコードするDNAセグメントを増幅するために変動さ
れ得ることを理解する。
増幅したTFPI-3 DNAフラグメントおよびpQE9ベクターを、認識配列をプライマ
ーに組み込んだ適切な酵素を用いて消化し、次いで、消化したDNAをお互いに結
合した。制限したpQE9ベクターへのTFPI-3D NAの挿入により、TFPI-3タンパク質
コード領域をIPTG誘導性プロモーターから下流、そして開始AUGおよび6つのヒ
スチジンコドンとインフレームに配置する。
連結混合物を、Sambrookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual、第2
版;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)に
記載されるような標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coli細胞に形質転換
した。複数のコピーのプラスミドpREP4(これは、lacリプレッサーを発現し、そ
してカナマイシン耐性(「Kanr」)を付与する)を含有するE.coli株15/rep4を
本明細書中に記載の実施例を行うにあたって使用した。この株(これは、TFPI-3
タンパク質を発現するために適切である多くの株の内の唯一の株である)は、QI
AGEN Inc.,(前出)から市販される。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマ
イシンの存在下でLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定した。プラス
ミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングされたDNAの同定を、制
限分析、PCRおよびDNA配列決定により確認した。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン(100μg/ml)およびカナマイ
シン(25μg/ml)の両方を補充したLB培地を含む液体培地で、一晩(「O/N」)
培養した。O/N培養を使用し、約1:25から1:250の希釈で大規模培養物に接種した
。600nmにおける光学密度(「OD600」)が0.4と0.6との間になるまで、細胞を培
養した。次にイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(「IPTG」)を最終濃
度1mMになるように加えて、lacIリプレッサーを不活化することによってlacリプ
レッサー感受性プロモーターからの転写を誘導した。続いて細胞をさらに3〜4
時間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離によって採取した。
次いで細胞を3〜4時間4℃で6MグアニジンHCl、pH8中で撹拌した。細胞片を
遠心分離によって除き、そしてTFPI-3を含有する上清を、ニッケル-ニトリル-三
酢酸(「Ni-NTA」)アフィニティー樹脂カラム(QIAGEN,Inc.,前出より入手可
能)にのせた。6×Hisタグを有するタンパク質を、Ni-NTA樹脂に高いアフィニテ
ィーで結合させ、そして単純な一段階の手順で精製し得る(詳細についてはQIAe
xpressionist,1995,QIAGEN,Inc.,前出を参照のこと)。手短に言えば、
上清を6MグアニジンHCl、pH8に満たしたカラムにのせ、カラムをまず10容量の6M
グアニジンHCl、pH8で洗浄し、次に10容量の6MグアニジンHCl、pH6で洗浄し、最
後に6MグアニジンHCl、pH5あるいはpH2でTFPI-3種を溶出させた。
次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化食塩水(PBS)または50mM酢酸
ナトリウムpH5緩衝液および200mM NaClで透析することにより、再生させた。あ
るいは、Ni-NTAカラム上に固定化している間に、タンパク質を首尾よく再生し得
る。推奨する条件は次の通りである:プロテアーゼインヒビターを含む500mMNaC
l、20%グリセロール、20mM Tris/HCl pH7.4中での6M-1 Mの尿素勾配を用いて再
生する。再生は1.5時間以上の時間をかけて行うべきである。再生後、タンパク
質を250mMイミダゾールの添加によって溶出させ得る。イミダゾールを、PBSある
いは200mM NaClを有する50mM酢酸ナトリウムpH6緩衝液に対する最終の透析工程
によって除去する。精製したタンパク質は4℃に保存するか、あるいは-80℃で
凍結する。
実施例2:バキュロウイルス発現系におけるTFPI-3のクローニングと発現
この実施例において、プラスミドシャトルベクターpA2 GPを使用して、バキュ
ロウイルスリーダーおよびSummersら、A Manual of Methods for Baculovirus V
ectors and Insect Cell Culture Procedures、Texas Agricultural Experiment
al Station Bulletin No.1555(1987)による標準的な方法を用いて、天然では
結合している分泌シグナル(リーダー)配列を欠いている、TFPT-3タンパク質の
Kunitz型ドメインをコードしている、クローニングしたDNAを、発現のためにバ
キュロウイルスに挿入した。この発現ベクターは、Autographa Californica核多
核体ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリン(poryhedrin)プロモーター、続
いてバキュロウィルスgp67タンパク質の分泌シグナル配列(リーダー)ならびに
BamHI、XbaIおよびAsp718といった好都合な制限酵素部位を含む。サルウイルス4
0(「SV40」)のポリアデニル化部位を効果的なポリアデニル化のために使用す
る。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、同方向にある弱いDr
osophilaプロモーターの制御下にあるE.coli由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子
、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺
伝子の両側には、細胞によって仲介される、野性型ウイルスDNAとの相同組換え
のためのウイルスの配列が隣接し、それによってクローニングしたポリヌクレオ
チドを発現する、増殖可能なウイルスを生み出す。
当該分野において容易に理解されるように、構築物が、必要に応じて、適切な
位置に転写、翻訳、分泌、あるいは、シグナルペプチドおよびインフレームなAU
Gを含む、その類のものを有する限り、pAc373、pVL941およびpAcIM1といった多
くの他のバキュロウイルスベクターが上で述べたベクターの代わりに使用され得
る。このようなベクターは、例えば、Luckowら、Virology 170:31-39(19989)
において記述されている。
寄託されたクローン中のKunitz型ドメインをコードするcDNA配列は、図1に示
すように、AUG開始コドンおよび天然では結合しているリーダー配列を欠いてお
り、遺伝子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用
いて増幅した。5'プライマーは、下線を付したBglII制限酵素部位、続いて配列
番号2に示した成熟TFPI-3タンパク質の配列の24ヌクレオチドを含有し、TFPI-3
タンパク質のKunitz型ドメイン含有形式のN末端で開始する配列5' CCCCAGATCTCG
AACGCAGCATCCACGACTTCTGC 3'(配列番号24)を有する。3'プライマーは、下線を
付したXbaI制限酵素部位、続いて人工の相補的な停止コドンTTA、および図1の3
'コード配列に相補的な23ヌクレオチドを含有する配列5' CCCCTCTAGATTAATTCTCC
TGCTGGCGGAAGCAGC 3'(配列番号25)を有する。得られたフラグメントは、最初
のKunitz型ドメインのTFPI-3のアミノ末端側の7つのアミノ酸および図1で示し
た2番目のKunitz型ドメインのTFPI-3のカルボキシル末端側の6つのアミノ酸を
コードする。
市販のキット(「Geneclean」,BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca)を使い、増幅
したフラグメントを1%アガロースゲルから単離した。次にフラグメントをBglII
およびXbaIで消化し、再び1%ゲル上で精製した。
プラスミドを、当該分野に公知の、日常的な手順を使って、制限酵素BglIIお
よびXbaIで消化、および仔ウシ腸ホスファターゼを使って脱リン酸化した。次い
で市販のキット(「Geneclean」,BI0 101 Inc.,La Jolla,Ca)を使い、DNAを
1%アガロースゲルから単離した。
フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、T4DNAリガーゼを用いて一
緒に連結した。大腸菌HB101およびXL-1 Blue(Stratagene Cloning Systems,La
Jolla,CA)細胞を連結混合液で形質転換し、そして培地プレート上に広げた。
個々のコロニー由来のDNAをBglIIおよびXbaIを用いて消化し、次にゲル電気泳動
によって消化産物を分析することにより、ヒトTFPI-3遺伝子を持つプラスミドを
含む細菌を同定した。クローニングしたフラグメントの配列をDNA配列決定によ
って確認した。このプラスミドは本明細書中ではpA2TFPI-3と称する。
Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417(1987)によって記載
されたリポフェクション法を用いて、プラスミドpA2TFPI-3の5μgを、市販の直
鎖状のバキュロウイルスDNA(「BaculoGoldTMbaculovirus DNA」,Pharmingen,
San Diego,CA)1.0μgで同時トランスフェクトした。1μgのBaculoGoldTMウイ
ルスDNAおよび5μgのプラスミドpA2TFPI-3は、50μlの無血清グレース培地(Li
fe Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)を含むマイクロタイタープレートの
滅菌ウェル中で混合した。その後、10μl Lipofectinおよび90μlグレース培地
を加え、混合し、そして室温で15分間インキュベートした。次に、血清を含まな
いグレース培地1mlを有する35mm組織培養プレート中に播種した、Sf9昆虫細胞(
ATCC CRL 1711)にトランスフェクション混合液を滴下して加えた。その後プレ
ートを5時間27℃でインキュベートした。次にトランスフェクション溶液をプレ
ートから除き、そして10%仔ウシ胎血清で補充したグレース昆虫培地1mlを添加し
た。培養を27℃で4日間継続した。
4日後上清を収集し、SummersおよびSmith、前出によって記載されたように、
プラークアッセイを行う。そして、「Blue Gal」(Life Technologies Inc.,Ga
ithersburg)を有するアガロースゲルを、gal発現しているクローン(青色に染
まったプラークをつくる)の容易な同定および単離を可能にするために使用した
。(この種のプラークアッセイの詳細な記述はまた、Life Technologies Inc.,
Gaithersburgによって配布されている、昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学
に関する使用者のための手引き9-10頁にも見いだされ得る)。適切なインキュベ
ーションの後、青色に染まったプラークをマイクロピペッター(例えばエッペン
ドルフ製)のチップで拾い上げた。次に組換えウイルスを含む寒天を、200μlの
グ
レース培地を含むマイクロ遠心チューブに再懸濁し、そして組換えバキュロウイ
ルスを含む懸濁液を使用して、35mmディッシュ中に播種したSf9細胞に感染させ
た。4日後これらの培養ディッシュの上清を採取し、その後4℃で保存した。こ
の組換えウイルスはV-TFPI-3と称する。
TFPI-3遺伝子の発現を確認するために、10%の熱処理で非働化したFBSで補充し
たグレース培地中で、Sf9細胞を増殖した。感染多重度(multiplicity of infec
tion,「MOI」)約2で、細胞に組変えバキュロウイルスV-TFPI-3を感染させた
。上清中のタンパク質および細胞内タンパク質を、SDS-PAGEで分析した。
実施例3:哺乳動物細胞におけるTFPI-3のクローニングおよび発現
代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント(mRNAの転写の開
始を媒介する)、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ
リアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハン
サー、Kozak配列、ならびにRNAスプライシングのためのドナー部位およびアクセ
プター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写を、SV40由来
の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復(LTR)(例え
ば、RSV、HTLVI、HIVI)ならびにサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモー
ターを用いて達成し得る。しかし、細胞性エレメントもまた使用され得る(例え
ば、ヒトアクチンプロモーター)。本発明の実施における使用に適切な発現ベク
ターとしては、例えば、pSVLおよびpMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pRSV
cat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、ならびにpBC12MI(ATCC 67109)
のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒト
Hela細胞、293細胞、H9細胞およびJurkat細胞、マウスNIH3T3細胞およびC127細
胞、Cos1細胞、Cos7細胞およびCV1細胞、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、なら
びにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。
あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれたその遺伝子を含む安定な細胞株に
おいて発現され得る。選択マーカー(例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイ
グロマイシン)との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞
の同定および単離を可能にする。
トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされたタンパ
ク質を発現し得る。DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)マーカーは、目的の遺伝
子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。別の
有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ(GS)である(Murphyら、Bi
ochem J.227:277-279(1991);Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169-175(1992
))。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ
、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組み
込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞お
よびNSO細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター(LT
R)(Cullenら、Molecular and Cellular Biology,438-447(1985年3月))お
よびCMV-エンハンサーのフラグメント(Boshartら、Cell 41:521-530(1985))
を含む。複数のクローニング部位(例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、お
よびAsp718を有する)は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクター
はさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロン、ポリアデニル化
、および終結シグナルを含む。
実施例3(a):COS細胞におけるクローニングおよび発現
この例示的な実施例における発現プラスミドpTFPI-3HAを、完全なTFPI-3タン
パク質をコードするcDNAを発現ベクターpcDNAI/AmpまたはpcDNAIII(これは、Inv
itrogen,Inc.から入手し得る)へクローニングすることによって作製する。
発現ベクターpcDNAI/ampは以下を含む:(1)E.coliおよび他の原核生物細胞
における増殖に有効なE.coli複製起点;(2)プラスミド含有原核生物細胞の選
択のためのアンピシリン耐性遺伝子;(3)真核生物細胞における増殖のための
SV40複製起点;(4)CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン;(5
)cDNAが都合良くCMVプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカー
における制限部位によってSV40イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動
可能に連結され得るように配置された、赤血球凝集素フラグメント(すなわち、
精製を容易にするための「HA」タグ)をコードするいくつかのコドン、続
いて終止コドン、およびポリアデニル化シグナル。HAタグは、Wilsonら、Cell 3
7:767(1984)によって記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来
するエピトープに対応する。標的タンパク質へのHAタグの融合は、HAエピトープ
を認識する抗体を用いる、組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にす
る。pcDNAIIIはさらに、ネオマイシン選択マーカーを含む。
完全なTFPI-3ポリペプチドをコードするDNAフラグメントを、組換えタンパク
質発現がCMVプロモーターによって導かれるように、ベクターのポリリンカー領
域にクローン化する。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託さ
れたクローンのTFPI-3 cDNAを、E.coliにおけるTFPI-3の発現のためのベクター
の構築について先に記載されるのとほとんど同じように、都合の良い制限部位を
含むプライマーを用いて増幅する。適切なプライマーは、本実施例中で使用する
、以下のプライマーを含む。5'プライマーは、下線を付したBglII部位、Kozak配
列、AUG開始コドン、および完全なTFPI-3ポリペプチドの5'コード領域を含み、
次の配列を有する:
5' CCC CAG ATC TGC CAT CAT GGC GCA GCT GTG CGG GCT GA 3'(配列番号26)
。
3'プライマーは、下線を付したXbaI制限部位を含み、次の配列を有する:
5' CGC TCT AGA TCA CAG GAC ATA TGT GTT CTT 3'(配列番号27)。
PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、BglIIおよびXbaIで消
化し、次いで連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning Syst
ems,11099 North Torrey Pines Road,La Jolla,CA 92037より入手可能)へ形
質転換し、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐
性コロニーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする
。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そして完全なTFPI-3ポリペプチト
をコードするフラグメントの存在について制限分析または他の手段によって試験
する。
組換えTFPI-3の発現のために、COS細胞を、例えば、Sambrookら,Molecular C
loning:a Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,Cold Spring Ha
rbor,New York(1989)に記載のようにDEAE-DEXTRANを用いて、上記のように発現
ベクターでトランスフェクトする。細胞を、ベクターによるTFPI-3の発現のた
めの条件下でインキュベートする。
TFPI-3-HA融合タンパク質の発現を、例えば、Harlowら,Antibodies:A Labora
tory Manual,第2版;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harb
or,New York(1988)に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって
検出する。この目的のため、トランスフェクションの2日後に、細胞を、35S-シ
ステインを含む培地中で8時間インキュベートすることによって標識する。細胞
および培地を採取し、そして細胞を洗浄し、そしてWilsonら(上記に引用される
)に記載されるように界面活性剤含有RIPA緩衝液:150mM NaCl、1% NP-40、0.
1% SDS、1% NP-40、0.5% DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパク質を
、HA特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する
。次いで、沈降されたタンパク質を、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーに
よって分析する。期待されるサイズの発現産物は、細胞溶解物において観察され
、これはネガティブコントロールにおいては見られない。
実施例3(b):CHO細胞におけるクローニングおよび発現
ベクターpC4を、TFPI-3ポリペプチドの発現のために使用する。プラスミドpC4
は、プラスミドpSV2-dhfr(ATCC受託番号37146)の誘導体である。このプラスミ
ドは、SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらのプ
ラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選
択培地(αマイナスMEM、Life Technologies)中で細胞を増殖させることによっ
て選択され得る。メトトレキサート(MTX)に耐性である細胞におけるDHFR遺伝
子の増幅は、よく考証されている(例えば、Alt,F.W.,Kellems,R.M.,Bertin
o,J.R.およびSchimke,R.T.,1978,J.Biol.Chem.253:1357-1370、Hamlin,
J.L.およびMa,C.1990,Biochem.et Biophys.Acta,1097:107-143、Page,M.J
.およびSydenham,M.A.,Biotechnology 9:64-68(1991)を参照のこと)。漸増
濃度のMTXにおける細胞増殖は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的酵素DHFR
を過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第2の遺伝子がDHFR遺伝子
に連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝
子の1,000を超えるコピーを有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使
用し得ることは、当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートが取
り除かれる場合、宿主細胞の1つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む
細胞株が得られる。
プラスミドpC4は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス(Culle
nら、Molecular and Cellular Biology,1985年3月:438-447)の長末端反復(
LTR)の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス(CMV)(Boshar
tら、Cell 41:521-530(1985))の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフ
ラグメントを含む。プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にする以
下の単一の制限酵素切断部位が存在する:BamHI、XbaIおよびAsp718。プラスミ
ドは、これらのクローニング部位の後ろに、ラットプレプロインスリン遺伝子の
3'イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた
、発現のために使用され得る(例えば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期
もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス(例えば、HIVおよびHTL
VI)由来の長末端反復)。ClontechのTet-OffおよびTet-On遺伝子発現系および
同様の系は、哺乳動物細胞において調節された方法でTFPI-3ポリペプチドを発現
するために使用され得る(Gossen,M.,およびBujard,H.1992,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 89:5547-5551)。mRNAのポリアデニル化のために、他のシグナル
(例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来)は、同様に使用され得
る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を含む安定な細胞株もまた、選択マーカ
ー(例えば、gpt、G418、またはハイグロマイシン)との同時トランスフェクシ
ョンに際して選択され得る。最初は、1つより多い選択マーカー(例えば、G418
およびメトトレキサート)を使用することは、有利である。
プラスミドpC4を、制限酵素BglIIおよびXbaIで消化し、次いでウシ腸ホスファ
ターゼ(phosphate)を用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。
次いで、ベクターを、1%アガロースゲルから単離する。
完全なTFPI-3ポリペプチドをコードするDNA配列を、遺伝子の所望の部分の5'
および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。5
'プライマーは、下線を付したBglII部位、Kozak配列、およびAUG開始コドンを含
み、以下の配列を有する:
5' CCC CAG ATC TGC CAT CAT GGC GCA GCT GTG CGG GCT GA 3'(配列番号26)
。
3'プライマーは、下線を付したXbal制限部位を含み、次の配列を有する:
5' CGC TCT AGA TCA CAG GAC ATA TGT GTT CTT 3'(配列番号27)。
増幅させたフラグメントを、エンドヌクレアーゼBglIIおよびXbaIで消化し、
次いで1%アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよ
び脱リン酸化ベクターをT4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.coli HB101また
はXL-1 Blue細胞を形質転換し、そして例えば制限酵素分析を用いてプラスミドp
C4に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
活性なDHFR酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェ
クションのために使用する。5μgの発現プラスミドpC4を、リポフェクチン(Fe
lgnerら、前出)を用いて、0.5μgのプラスミドpSVneoとともに同時トランスフ
ェクトする。プラスミドpSV2-neoは、優性選択マーカー(G418を含む一群の抗生
物質に対する耐性を与える酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子)を含む。細胞
を、1mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。2日後、細胞をトリプ
シン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび1mg/mlG41
8を補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプレート(Greiner
,Germany)に播種する。約10〜14日後、単一のクローンをトリプシン処理し、
次いで異なる濃度のメトトレキサート(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)を
用いて、6ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最高濃度の
メトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート(1
μM、2μM、5μM、10μM、20μM)を含む新たな6ウェルプレートに移す。同
じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所
望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって
、または逆相HPLC分析によって分析する。
実施例4:TFPI-3mRNA発現の組織分布
ノーザンブロット分析を行って、とりわけSambrookら(上記に引用される)に
よって記載される方法を用いて、脾臓、胸腺、小腸、結腸、末梢血白血球、前立
腺、および精巣を含む、ヒト組織におけるTFPI-3遺伝子の発現を調べた。TFPI-3
タンパク質のヌクレオチド配列(配列番号1)全体を含むcDNAプローブを、redi
prlmeTMDNA標識系(Amersham Life Science)を製造者の説明書に従って用いて32P
で標識した。標識後、プローブを、CHROMA SPIN-100TMカラム(Clontech Labora
tories,Inc.)を製造者のプロトコル番号PT1200-1に従って用いて精製した。次
いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をTFPI-3mRNAについて調
べた。
種々のヒト組織(H)またはヒト免疫系組織(IM)を含むMultiple Tissue No
rthern(MTN)ブロットを、Clontechから入手し、そしてExpressHybTMハイブリ
ダイゼーション溶液(Clontech)を製造者のプロトコル番号PT1190-1に従って用
いて標識プローブを用いて調べる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロ
ットをマウントし、そして−70℃にて一晩フィルムに曝し、そしてフィルムを標
準的な手順に従って現像する。
TFPI-3の発現は試験した全ての組織中で見られたが、最も発現が高かったのは
前立腺と精巣においてであった。
実施例5:TFPI-3トリプシン阻害アッセイ
E.coliにおけるTFPI-3タンパク質(TFPI-3-1)の1番目のKunitz型ドメインの
発現、精製、および再生は実施例1に記載されている。再折り畳みされたサンプ
ルは、15,000gで10分間遠心分離し、不溶性の物質を除去した。精製したタンパ
ク質は、SDS-PAGEによる観察から、90%以上の純度を有することが明らかとなっ
た。タンパク質の濃度は、Bradfordアッセイにより測定したところ、1mg/mlで
あった。
本実施例中で記述するアッセイは、トリプシンの基質としてp-トルエンスルホ
ニル-L-アルギニンメチルエステル(TAME)の使用を含み、これはHummel,B.C.W
.(Can J.Biochem.Physil.,37:1393(1959))によって最初に記述された。凍
結乾燥したTAME(製造者の推奨する手順に従って再溶解した場合、0.04M Tris緩
衝液、pH7.8〜8.2中の0.001M TAMEおよび0.01Mカルシウムを含む)のアリコート
を、Worthington Biochemical Corporation(Freehold,NJ)から購入した。
トリプシン(Sigma)を、50mM Tris緩衝液、pH8.0中で10mg/mlの濃度に調製した
。1.25μg、2.50μg、5.0μg、10.0μg、および20.0μgの精製した1番目のKuni
tzドメインを含む、酢酸緩衝液(50mM Na-酢酸、pH5.0、200mM NaCl)に10mlの
トリプシンを加え、総量100mlとして、そして10分間室温でインキュベートした
。インキュベーション後、サンプルを1mlのTAME試薬に加え、Worthingtonの手
順に従って30分間、37℃で247nmの吸光度をモニターした。Hisタグ化Cripto(TG
F-aファミリーメンバー)を、TFPI-3-1と同様にして精製し、負の対照として用
いた。
結果
結果を図5に示す。見て取れるように、TFPI-3-1(TFPI-3の1番目のKunitz型
ドメイン)は、1.25mgおよび2.50mg分量においてはトリプシン活性の阻害を示さ
なかった。5.00mgのTFPI-3-1を含む場合では、約60%のトリプシン活性が阻害さ
れた。10.00mgの場合では、トリプシン活性は、緩衝液のみのコントロールと比
較して、13%に減少した。トリプシン活性は、20.00mgTFPI-3-1ではほぼ完全に消
滅した。同じ濃度のCriptoをコントロールとして使用した場合では、トリプシン
の阻害活性は見られなかった。
単一の実験で2等分したサンプルを測定することにより、TFPI-3-1のトリプシ
ン阻害活性をさらに確認した。トリプシン(100ng)を緩衝液のみ、10mg Cript
または10mg TFPI-3-1と共にインキュベートした。TAME基質の添加後、247nmにお
ける吸光度を測定した。緩衝液のみのサンプルと比較して、約7%のトリプシン活
性がTFPI-3-1サンプル中に残存した。
表2:TFPI-3-1およびCriptコントロールのトリプシン活性の阻害に対する効果
。緩衝液のみ TFPI-3-1 (10μg) Cript コントロール(10μg)
85±3.5 6±8.5 105±0.7
数字はトリプシン活性を示す(10-4*ΔA/min)、n=2。
本発明が、前述の説明および実施例に詳細に記載される以外の方法で実施され
得ることは明白である。本発明の多くの改変および変更が、上記の教示を考慮し
て可能であり、それゆえ添付の請求の範囲の範囲内である。
本明細書中に参考として援用される全ての刊行物(特許、特許出願、学術論文
、実験室マニュアル、書籍、または他の文書を含む)の開示の全体が、これによ
って本明細書によって参考として援用される。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C07K 14/81 C12N 1/15
C12N 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 C12P 21/02 C
5/10 C12N 5/00 A
C12P 21/02 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M
W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY
,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM
,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,
CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,E
S,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU,ID
,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,
LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M
G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT
,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,
TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,V
N,YU,ZW
(72)発明者 フス,ツ−アン
アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19446,
ランズデイル,ブルックサイド ドライブ
38
(72)発明者 ニ,ジアン
アメリカ合衆国 メリーランド 20853,
ロックビル,マノーフィールド ロード
5502
(72)発明者 ローゼン,クレイグ エイ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20882,
レイトンズビル,ローリング ヒル ロー
ド 22400
【要約の続き】