【発明の詳細な説明】
腫瘍壊死因子受容体 ５
発明の分野
本発明は、TNFレセプターファミリーのメンバーであるポリペプチドをコード
し、かつ現在TRAILに結合することが見出されている新規のヒト遺伝子に関連す
る。より詳細には、腫瘍壊死因子レセプター-５と言われ、時として、「TNFR-5
」または「TR5」と言われ、そして現在、本明細書では以下「細胞内ドメインを
欠くTRAILレセプター」または「TRID」呼ばれる、ヒトポリペプチドをコードす
る単離された核酸分子が提供される。TRIDポリペプチドはまた、ベクター、宿主
細胞、およびこれらを作製するための組換え方法として提供される。さらに本発
明は、TRIDポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するため
のスクリーニング方法に関する。このような組成物を利用するための診断方法お
よび治療方法もまた提供される。
関連分野
多くの生物学的作用（例えば、特定の刺激および天然の生物学的プロセスに対
する応答）は、サイトカインのような因子により制御される。多くのサイトカイ
ンは、レセプターと連動し、そして細胞内応答を生じることにより、レセプター
を介して作用する。
例えば、腫瘍壊死因子（TNF）αおよび腫瘍壊死因子βは、多数の生物学的プ
ロセス（ショックおよび炎症性疾患の感染および誘発に対する防御を含む）を制
御するためのTNFレセプターを介して作用するサイトカインである。TNF分子は「
TNFリガンド」スーパーファミリーに属し、そしてこれらのレセプターまたは対
のリガンド（「TNFレセプター」スーパーファミリー）と共に作用する。現在ま
でに、TNFリガンドスーパーファミリーの９個のメンバーが同定されており、そ
してTNFレセプタースーパーファミリーの10個のメンバーが特徴付けられている
。
リガンドには、TNF-α、リンホトキシン-α(TNF-βとしてまた公知であるLT-
α)、LT-β（複合体ヘテロトリマーLT-α2-β中に見出される）、FasL、CD40L、
CD27L、CD30L、4-IBBL、OX40L、および神経成長因子(NGF)が含まれる。TNFレセ
プターのスーパーファミリーは、p55TNFレセプター、p75TNFレセプター、TNFレ
セプター関連タンパク質、FAS抗原またはAPO-1、CD40、CD27、CD30、4-1BB、OX4
0、低親和性p75、およびNGFレセプターを含む(Meager，A.，Biologicals，22:29
1-295(1994))。
TNFリガンドスーパーファミリーの多くのメンバーは、活性化Ｔ細胞により発
現される。これは、これらが細胞個体発生および機能の根底にある他の細胞型と
のＴ細胞の相互作用に必要であることを意味する(Meager，A.、前出)。
TNFレセプターファミリーのいくつかのメンバーの不可欠な機能についてのか
なりの洞察が、これらのタンパク質の発現を消滅させる変異体の同定および作製
により得られている。例えば、FAS抗原およびそのリガンド中の天然に存在する
変異は、リンパ球増殖疾患を生じ(Watanabe-Fukunaga，R.ら、Nature 356:314(1
992))、これはおそらく、プログラムされた細胞死の失敗を反映する。CD40リガ
ンドの変異は、血漿中の高レベルの免疫グロブリンＭおよび低レベルの免疫グロ
ブリンＧにより特徴付けされるＸ連鎖免疫不全状態を生じる。これは、不完全な
Ｔ細胞依存性Ｂ細胞活性化を意味する(Allen，R.C.ら、Science 259:990(1993))
。低親和性神経成長因子レセプターの標的化された変異は、末梢構造の不完全な
知覚神経支配(innovation)により特徴付けられた障害を生じる(Lee，K.F.ら、Ce
ll 69:737(1992))。
TNFおよびLT-αは、２つのTNFレセプター(55kdおよび75kdのTNFレセプター)へ
結合し得る。それらのレセプターを通して作用するTNFおよびLT-αにより誘発さ
れる多くの生物学的効果は、移植された腫瘍の出血性壊死、細胞傷害性、エンド
トキシンショックにおける役割、炎症、免疫調節、増殖および抗ウイルス応答、
ならびに電離放射線の有害な効果に対する防御を含む。TNFおよびLT-αは、エン
ドトキシンショック、大脳マラリア、腫瘍、自己免疫疾患、エイズ、および移植
片宿主拒絶を含む広範囲な疾患の病因に関与する(Beutler，B.およびVon Huffel
，C.，Science 264:667-668(1994))。p55レセプター中の変異は、微生物感染に
対して増加された感受性を生じる。
さらに、TNFR１(p55)およびFasのC-末端付近の約80アミノ酸ドメインが、プロ
グラムされた細胞死についてのシグナルを伝達する原因である「死ドメイン(dea
th domein)」として報告された(Tartagliaら、Cell 74:845(1993))。
アポトーシスすなわちプログラムされた細胞死は、多細胞生物の正常な発達ま
たはホメオスタシスに不可欠である生理学的プロセスである(H．Steller，Scien
ce 267，1445-1449(1995))。アポトーシスの撹乱は、ガン、神経変性障害、およ
び後天性免疫不全症候群を含むいくつかのヒト疾患の病因に寄与する(C.B.Thomp
son，Science 267，1456-1462(1995))。１つの機構の免疫媒介性殺傷が死のレセ
プターに関与する、最近、多くの注目が、シグナル伝達および２つの細胞表面の
死レセプター（Fas/APO-1およびTNFR-1)の生物学的機能に集中している(J.L．Cl
evelandら、Cell 81，479-482(1995);A．Fraserら、Cell 85，781-784(1996);S
．Nagataら、Science 267，1449-56(1995))。両方とも、とりわけTNFR-2、低親
和性NGFR、CD40、およびCD30もまた含むTNFレセプターファミリーのメンバーで
ある(C.A.Smithら、Science 248，1019-23(1990);M.Tewariら、Modular Texts i
n Molecular and Cell Biology M．Purton，Heldin，Carl編(Chapman and Hall
，London，1995)。ファミリーのメンバーはこれらの細胞外ドメイン中のシステ
インリッチ反復の存在により定義されるが、Fas/APO-1およびTNFR-1はまた、シ
ョウジョウバエ自殺遺伝子reaper(P．Golsteinら、Cell 81，185-6(1995);K．Wh
iteら、Science 264，677-83(1994))の遠縁にあたる、細胞内相同性の領域であ
る、適切に命名された「アポトーシスのシグナル伝達に必須の領域(death domai
n)」を共有する。この共有された死ドメインは、両レセプターが、最近まで未同
定のままであった関連する対のシグナル伝達分子と相互作用することを示唆する
。Fas/APO-1の活性化は、死ドメインを含むアダプター分子FADD/MORT1(A.M．Chi
nnaiyanら、Cell 81，505-12(1995);M.P.Boldinら、J．Biol Chem 270，7795-8(
1995);F.C．Kischkelら、EMBO 14，5579-5588(1995))を補強し、死ドメインを含
むアダプター分子FADD/MORT1は次いで、プロアポトーシスプロテアーゼのICE/CE
D-3ファミリーのメンバーであるFLICE/MACH1へ結合し、そしておそらく活性化す
る(M.Muzioら、Cell 85，817-827(1996)；M.P.Boldinら、Cell
85，803-815(1996))。Fas/APO-1の中心的役割は細胞死を誘発することである
が、TNFR-1は、整然とした多様な生物学的活性（その多くは、NF-kBを活性化す
る能力に由来する）の信号を送り得る(L.A．Tartagliaら、Immunol Today 13，1
51-3(1992))。従って、TNFR-1は、多価アダプター分子TRADD（FADDを好む）を補
強し、また死ドメインを含む(H．Hsuら、Cell 81，495-504(1995);H．Hsuら、Ce
ll 84，299-308(1996))。FADD、TRAF2、およびRIPを含む多くのシグナル伝達分
子との会合を通して、TRADDは、アポトーシスおよびNF-kB活性化の両方へ信号を
送り得る(H．Hsuら、Cell 84，299-308(1996);H．Hsuら、Immunity 4，387-396(
1996))。
最近、新規のアポトーシスを誘導するTNFリガンドが発見された。S.R.Wileyら
(Immunity 3,673-682(1995))は、この分子を「TNF関連アポトーシス誘導リガン
ド」または簡潔に「TRAIL」と命名した。この分子はまた、「Apo-2リガンド」ま
たは「Apo-2L」とも呼ばれている(R.M.Pittら、J.Biol.Chem.271,12687-12690(1
996))。この分子はまた、同時継続出願の米国暫定出願第60/013,405でも開示さ
れた。便宜上、この分子はTRAILとして本明細書中では呼ぶことにする。
FASリガンド（この転写物は、刺激されたT-細胞に大部分が制限されているよ
うである）とは異なり、有意なレベルのTRAILは多くのヒトの組織中で検出され
る（例えば、脾臓、肺、前立腺、胸腺、卵巣、小腸、大腸、末梢血リンパ球、胎
盤、腎臓）、そしていくつかの細胞株により恒常的に転写される。TRAILは、FAS
リガンド(Wileyら、前出)から独立して作用することが示されている。TRAILは、
Fas/Apo-1Lによる死のシグナル伝達に類似する時間枠内で、しかしTNF誘導性ア
ポトーシスよりも非常に早くアポトーシスを急速に活性化させることもまた示さ
れている。S.A.Marstersら、Current Biology 6,750-752(1996)。TNFR-1、Fasま
たは最近同定されたDR3に対するTRAILの結合の不可能さは、TRAILは独特のレセ
プターと相互作用し得ることを示唆する。
TRAILについての幾つかの独特なレセプターは、同時継続出願の米国暫定出願
第60/035,722において既に同定されており、TRAILについての新規な死ドメイン
を含むレセプターであるDR4が開示された。Panら、Science 276,111-113(1997年
４月)を参照のこと。同時継続出願の米国暫定的特許出願第60/040,846の対象で
あるDR5レセプターは、TRAILに結合することが最近見出された。同時継続出願の
米国暫定的特許出願第60/050,936では、DR4との配列相同性から、TR10レセプタ
ーもまたTRAILに結合することが予測された。
TNFファミリーリガンドおよびTNFファミリーレセプターの効果は変化し、哺乳
動物システムの生物学的プロセス中で、正常および異常の両方の多数の機能に影
響を与える。従って、正常状態および疾患状態の両方の生物活性に影響を与える
ようなレセプターおよびリガンドの同定ならびに特徴付けについての明確な必要
性が存在する。詳細には、TRAILに結合するさらなる新規のレセプターの単離お
よび特徴付けする必要性がある。
発明の要旨
本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはATCC受託番号97798(19
96年11月20日)に寄託されたcDNAクローン化物によりコードされるアミノ酸配列
を有するTRIDポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核
酸分子を提供する。寄託されたTRIDクローン化物の配列決定により決定されたヌ
クレオチド配列（配列番号１で示される）は、およそ26アミノ酸のリーダー配列
を有する、およそ259アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープンリーデ
ィングフレームを含む。
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクターに関連し、
そして組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主
細胞を作製する方法、ならびに組換え技術によるTRIDポリペプチドまたはTRIDペ
プチドの産生のためにそれらを使用する方法に関連する。
本発明は、本明細書中で記載されるポリヌクレオチドによりコードされるアミ
ノ酸配列を有する単離されたTRIDポリペプチドをさらに提供する。
本発明はまた、診断アッセイ（例えば、検出レベルのTRIDタンパク質について
の定量的アッセイ、および診断的なアッセイ）を提供する。従って、例えば、TR
IDまたはその可溶性形態の発現を検出するため本発明に従う診断アッセイは、TR
AILの有害な影響（例えば、TRAIL誘導性アポトーシス）に抵抗するための正常な
組織の能力を検出するために使用され得るか、またはこれから保護され得る。
腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーのリガンドは、多くの細胞性応答（細胞障害
、抗ウイルス活性、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む）
を誘導する最も多面的なサイトカインであることが公知である。TNFファミリー
のリガンドに対する細胞性応答は、正常な生理的な応答だけではなく、アポトー
シスの増加またはアポトーシスの阻害に関連する疾患をも含む。アポトーシス−
プログラムされた細胞死−は、免疫系の末梢性Tリンパ球の欠失に関連する生理
学的な機構であり、そしてその調節不全は多くの異なる病原性のプロセスを誘導
し得る。細胞生存の増加またはアポトーシスの阻害に関連する疾患は、ガン、自
己免疫障害、ウイルス感染、炎症、移植片対宿主の疾患、急性移植片拒絶、およ
び慢性移植片拒絶を含む。アポトーシス増加に関連する疾患は、AIDS、神経変性
障害、脊髄形成異常症候群、虚血性傷害、毒物誘導性肝臓疾患、敗血症性ショッ
ク、悪液質、および摂食障害を含む。
従って、本発明は、TNFファミリーのリガンド（例えば、TRAIL）により誘導さ
れるアポトーシスを増強させる方法をさらに提案し、これはTRIDポリペプチドを
発現している細胞に対して、TRAILを結合するTRIDの能力を減少させ得る有効量
のアンタゴニストを投与することを含む。好ましくは、TRIDの結合は疾患の処置
のために減少され、ここでアポトーシスの減少が示される。
さらなる局面において、本発明は、TNFファミリーのリガンド(例えば、TRAIL)
のより誘導されるアポトーシスの増強のための方法に指向され、これは有効量の
TRIDまたはTRID活性を増加させ得るアゴニストの細胞への投与を含む。好ましく
は、TRID活性は疾患の処置のために増加され、ここでアポトーシスの減少が示さ
れる。
本発明の、「アゴニスト」または「アンタゴニスト」のいずれの候補がアポト
ーシスを増強し得るか、または阻害し得るかどうかは、当該分野で公知であるTN
Fファミリーのリガンド／レセプター細胞性応答アッセイ（以下により詳細に記
載されるものを含む）を使用して決定され得る。従って、さらなる局面において
、スクリーニングの方法は、候補のアゴニストまたはアンタゴニストがTNFファ
ミリーのリガンド(例えば、TRAIL)に対する細胞性応答を増強し得るか、または
阻害し得るかどうかを決定するために提供される。この方法は、TRIDポリペプチ
ド、
および第２のTNFRを同時発現する細胞と、候補の化合物およびTNFRファミリーの
リガンド(例えば、TRAIL)とを接触させること、細胞応答をアッセイすること、
ならびに標準的な細胞応答に対して細胞応答を比較すること(標準は、接触が、
候補の化合物の不在下でリガンドと行われる場合にアッセイされる)を含み、そ
れによって、標準を超える増加した細胞性応答は、候補の化合物がTRIDのアンタ
ゴニストであることを示し、そして標準と比較して減少した細胞応答は、候補の
化合物がTRIDのアゴニストであることを示す。本発明により、TNFRポリペプチド
を発現する細胞は、内因性または外因性の投与されたTNFファミリーのリガンド(
例えば、TRAIL)のいずれかと接触され得る。
図面の簡単な説明
図１は、TRIDのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配
列番号２）を示す。
図２は、TNFR-5(「TRID」と現在では呼ばれる)のアミノ酸配列と以下に示す他
のTNFレセプターとの比較に適切なDNAstarにおけるメガライン(Megaline)プログ
ラムを使用してClustal法により作成したアラインメントを示す：TNFR１（配列
番号３）；TNFR２（配列番号４）；NGFR（配列番号５）LTbR（配列番号６）；FA
S（配列番号７）；CD27（配列番号８）；CD30（配列番号９）；CD40（配列番号1
0）；4-1BB（配列番号11）；OX40（配列番号12）；VC22（配列番号13）；および
CRMB（配列番号14）。
図３は、TRIDアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイル領域
；親水性および疎水性；両親媒性領域；可変性領域；抗原性指標、および表面の
可能性が示されている。「抗原性指標−Jameson-Wolf」のグラフでは、タンパク
質の高い抗原性の領域の示す位置（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチド
からの領域）が得られ得る。
図４は、本発明のTRID遺伝子に関連する遺伝子フラグメントのヌクレオチド配
列を示し、以下を含む：HPRC54R（配列番号15）、HSJAU57RA（配列番号16）、HE
LBP70R（配列番号17）、およびHUSCB54R(配列番号18)、これらは全て配列番号１
に関連する。
図５Aは、TRID-Fc（ならびにDR4およびDR5）のTRAILへの特異的な結合を示す
イムノブロットであるが、細胞傷害性のリガンドであるTNFαとは関連しない。
図５Ａの下部のパネルは、結合アッセイでのFc融合物の存在のインプットを示す
。図５Ｂは、TRAILが、TRID-Fcのアポトーシスを誘導する能力をブロックするこ
とを示す棒グラフである。図５Ｂに示されるデータ（平均値±ＳＤ）は、カウン
トした核全体の間でのアポトーシスの核の百分率である(ｎ＝４)。図５Ｃは、TN
FR1-FcがTNFαの殺傷を完全に無くす条件下では、TRID-FcがTNFα誘導性のアポ
トーシスに影響を及ぼさないことを示す棒グラフである。
図６は、TRIDを発現するMCF7細胞が、ウイルス性にコードされたカスパーゼイ
ンヒビターであるCrmAを発現する細胞である場合、TRAIL誘導性のアポトーシス
から保護されることを示す捧グラフである。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、クローン化されたcDNAを配列決定することにより決定された、図１
（配列番号２）で示されるアミノ酸配列を有するTRIDポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図１（配列番号１）で
示されるヌクレオチド配列は、HPRCB54クローン（アメリカンタイプカルチャー
コレクション12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852に1996年11月
20日に寄託され、そして、ATCC 97798の受託番号が与えられた）を配列決定する
ことにより得られた。寄託されたクローンは、pBluescript SK(-)プラスミド(St
ratagene，La Jolla，CA)に挿入される。
本発明のTRIDタンパク質は、図２で示されるヒト神経成長因子(hNGF)のmRNA（
配列番号５）の翻訳産物と21.7％同一であり、そして複数の保存性システインリ
ッチドメインを共有するアミノ酸配列を有する。hNGFは、発生、生存、アポトー
シスおよび神経機能(Lee,F.K．ら、Cell 69;737)およびリンパ球(Torcia,Mら、C
ell 85:3369(1996))において重要な役割を果たすと考えられている。
配列のアライメントおよび比較は、TRIDの細胞外システインリッチドメインは
、DR4およびDR5の両者の対応するドメインに対してそれぞれ69％および52％のア
ミノ酸の同一性で驚くほど類似することを明らかにする。さらには、DR4およびD
R5
のように、TRIDもまた、CAR1(42〜48％の範囲のアミノ酸の同一性を有する、ニ
ワトリのTNFレセプターファミリーのメンバー)のシステインリッチドメインに対
して相同性であることが見出された(J.Brojatshら、Cell 87:1(1996))。TRIDに
ついての強力な保護的役割は、その転写産物が多くの正常なヒト組織において検
出可能であるが、形質転換された細胞株の大部分では検出されないという知見に
より示唆された。
TRIDは、細胞外TRAIL結合ドメインおよび膜貫通ドメインを有するが、驚くこ
とに、このレセプターがリガンド結合に続いてシグナル伝達をしないという可能
性と一致して、推定される細胞内シグナリングドメインを欠く。細胞内ドメイン
を有さない、このレセプターは細胞内ドメインが無いTRAILレセプターであるこ
とから「TRID」と名付けられた。
核酸分子
他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定
されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機（例えば、Applied B
iosystems，Inc.，Foster City，CAのModel 373）を用いて決定され、そして本
明細書中で決定されるDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのア
ミノ酸配列は、上記のように決定されるDNA配列の翻訳によって推定された。従
って、この自動化アプローチによって決定された任意のDNA配列について当該分
野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はい
くつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列
決定されるDNA分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも
約90％同一、より代表的には少なくとも約95％から少なくとも約99.9％同一であ
る。実際の配列は、当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のア
プローチによってさらに正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のよう
に、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入ま
たは欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、そ
の結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は
、配列決定されるDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に
異
なり、このような挿入または欠失の点にて始まる。
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、DNA分子
またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そして
RNA分子またはポリヌクレオチドについてはリボヌクレオチド(A，G，C，およびU
)の対応する配列（ここで、特定されるデオキシリボヌクレオチド配列における
各チミジンデオキシリボヌクレオチド(T)は、リボヌクレオチドのウリジン(U)に
よって置き換えられる）が意図される。
配列番号１のヌクレオチド配列のような、本明細書中で提供される情報を使用
して、TRIDポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、出発物質としてmRNA
を使用してcDNAをクローニングするための手順のような標準的なクローニングお
よびスクリーニング手順を使用して得られ得る。本発明の実例となる、配列番号
１に記載されるTRID核酸分子は、前立腺組織由来のcDNAライブラリーから発見さ
れた。同じ遺伝子のさらなるクローン化物もまた、以下の組織に由来するcDNAラ
イブラリーから同定された：内皮細胞、刺激された単核、およびケラチノサイト
。
配列番号１のTRID cDNAの決定されたヌクレオチド配列は、図１（配列番号１
）中のヌクレオチド配列のヌクレオチド183〜185位に開始コドンを有する、約25
9アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む
。
TRID遺伝子のオープンリーディングフレームは、NGFR（以下の保存性ドメイン
を含む：（ａ）約214アミノ酸（図１の残基27〜240）の可溶性の細胞外ドメイン
；および（ｂ）約19アミノ酸（図１の残基241〜259）の膜貫通ドメイン）につい
てのヒトmRNAの翻訳産物と配列相同性を共有する。
当業者が理解するように、上記で議論された配列決定誤差の可能性によって、
約259アミノ酸を含む寄託されたcDNAによりコードされる実際に完全なTRIDポリ
ペプチドは、いくらか長いかもしれないし、短いかもしれない。より一般的には
、実際のオープンリーディングフレームは、配列番号１で示されるN末端に由来
する最初のメチオニンコドンから予測される、およそ±20アミノ酸の範囲、より
好ましくは±10アミノ酸の範囲のいずれかにあり得、これは各それぞれの図で示
される翻訳された配列とインフレームである。種々の機能的ドメインを同定する
た
めに使用される分析基準に依存して、TNFRポリペプチドの細胞外ドメインおよび
膜貫通ドメインの正確な「位置(address)」は、上記の予測される位置と若干異
なり得ることがさらに理解される。例えば、配列番号２の細胞外ドメインの正確
な位置は、ドメインを規定するために使用される基準に依存して若干変化し得る
（例えば、位置は約1から約20残基まで、より好ましくは約1から約5残基まで「
シフト」し得る）。この場合、膜貫通ドメインの開始点および細胞外ドメインの
終結点は、図５で示されるように、上記で示される位置での疎水性アミノ酸配列
の同一性に基づいて予測された。任意の事象において、以下でさらに議論される
ように、本発明は、完全なポリペプチドのN-末端から欠失された種々の残基を有
するポリペプチドをさらに提供し、本明細書に記載される細胞外ドメインのN末
端に由来する１つ以上のアミノ酸を欠失するポリペプチドを含み、このポリペプ
チドはTRIDタンパク質の細胞外ドメインの可溶性形態を構成する。
リーダー配列および成熟配列
TRIDタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるようなリーダー配列
および成熟タンパク質を含む。より詳細には、本発明は、TRIDタンパク質の成熟
した形態をコードする核酸分子を提供する。従って、シグナルの仮説によれば、
粗面小胞体を通して成長しつつあるタンパク質鎖の輸送が一旦開始されると、哺
乳動物細胞から分泌されるタンパク質は、分泌される「成熟」した形態のタンパ
ク質を生成するために完全なポリペプチドから切断されるシグナルまたは分泌リ
ーダー配列を有する。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞もなお、同じ特異
性で分泌されるタンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合、分泌されるタ
ンパク質の切断は、完全には均一ではなく、これによってタンパク質の２つ以上
の成熟種が生じる。さらに、分泌されるタンパク質の切断特異性が完全なタンパ
ク質の一次構造によって究極的に決定される、すなわち、切断特異性はポリペプ
チドのアミノ酸配列に固有であることが長い間知られている。従って、本発明は
、ATCC受託番号第97798号として同定されたcDNAクローンによってコードされる
アミノ酸配列を有する成熟TRIDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提
供する。「ATCC受託番号第97798号中のcDNAクローンによりコードされるアミノ
酸
配列を有する成熟TRIDポリペプチド」により、寄託されるプラスミド中に含まれ
るクローンのヒトDNA配列によりコードされる完全なオープンリーディングフレ
ームを哺乳動物細胞（例えば、以下に記載されるCOS細胞）中に発現させること
により産生されるタンパク質の成熟形態が意味される。
さらに、分泌リーダーおよびそのリーダー配列のための切断点をタンパク質が
有するか否かを推定する方法が利用可能である。例えば、McGeoch(Virus Res．3
:271-286(1985))の方法は、完全（切断されていない）タンパク質の短いＮ末端
荷電領域および続く非荷電領域からの情報を使用する。von Heinje(Nucleic Aci
ds Res．14:4683-4690(1986))の方法は、切断部位、代表的には残基-13〜+2（こ
こで、+1は成熟タンパク質のアミノ末端を示す）の周囲の残基からの情報を使用
する。これらの各方法についての既知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点を推定
することの精度は、75〜80％の範囲である（von Heinje、前出）。しかし、２つ
の方法は、所定のタンパク質について常に同じ推定切断点を生じるわけではない
。
本発明の場合において、完全なTRIDポリペプチドの推定アミノ酸配列は、コン
ピュータープログラム「PSORT」によって分析された。K.NakaiおよびM.Kanehisa
，Genomics 14:897-911(1992)を参照のこと。PSORTはアミノ酸配列に基づいてタ
ンパク質の細胞性局在を予測するための熟練したシステムである。このコンピュ
ーターによる局在の予測の一部として、McGeochおよびvon Heinjeの方法が組み
込まれている。PSORTプログラムによる分析は、配列番号２におけるアミノ酸-1
〜1の間に切断部位を予測した。従って、完全なアミノ酸配列は、目視検査によ
ってさらに分析され、von Heinjeの(-1,-3)法則の簡略な形態を適用される。von
Heinje、前述。従って、TRIDタンパク質のためのリーダー配列は、図１におけ
る下線部の約１〜約26のアミノ酸残基（配列番号２における約-26〜約-1に対応
する）からなると推定され、一方、成熟TRIDタンパク質は配列番号２における約
１〜約233の残基からなると推定される。
配列決定誤差の可能性、ならびに異なる公知のタンパク質におけるリーダーの
切断部位の可変性に起因して、当業者は寄託されたcDNAによりコードされる成熟
TRIDポリペプチドが約233アミノ酸を含むが、約223〜約243アミノ酸の範囲のど
こかであり得、そしてこのタンパク質の推定リーダー配列は約26アミノ酸である
が、約16〜約36アミノ酸の範囲のどこかであり得ることを理解する。
示されるように、本発明の核酸分子は、RNA（例えば、mRNA）の形態、またはD
NA（例えば、cDNA、およびクローニングによって得られるか、または合成的に生
成されるゲノムDNAを含む）の形態で存在し得る。DNAは、二本鎖または一本鎖で
あり得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であ
り得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）であり得る。
「単離された」核酸分子によって、ネイティブな環境から取り出された核酸分
子（DNAまたはRNA）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分
子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたDNA分子
のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えDNA分子、または溶
液中の（部分的または実質的に）精製されたDNA分子を含む。単離されたRNA分子
は、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物を含む。本発明
に従う単離された核酸分子は、そのような合成的に生成された分子をさらに含む
。
本発明の単離された核酸分子は、以下：それぞれ配列番号１に示されるオープ
ンリーディングフレーム(ORF)を含むDNA分子；成熟TRIDタンパク質のためのコー
ド配列を含むDNA分子；および上記の配列とは実質的に異なる配列を含むDNA分子
、が挙げられるが、これは遺伝子コードの縮重に起因し、なおTRIDタンパク質を
コードする。もちろんのことながら、遺伝コードは当該分野において周知である
。従って、当業者にとって、このような縮重型改変体を作成することは日常的で
ある。
さらに、本発明は、配列番号１の広範な部位に関するヌクレオチド配列を有す
る核酸分子を提供し、これは以下の関連するcDNAクローン：HELBP70R（配列番号
17）、HPRCB54R（配列番号15）、HSJAU57RA（配列番号16）およびHUSCB54R（配
列番号18）から決定された。これらの遺伝子フラグメントの各々のヌクレオチド
配列は、図４に示されている。
別の局面において、ATCC受託番号第97798号として寄託されたプラスミド中に
含まれるcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するTRIDポリペプチ
ドをコードする単離された核酸分子を、本発明は提供する。さらなる実施態様に
おいて、それぞれＮ末端メチオニンを欠損した、成熟TRIDポリペプチドまたは全
長TRIDポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
本発明はさらに、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、または上記の寄託
されたクローン中に含まれるTRID cDNAのヌクレオチド配列を有する単離された
核酸分子、あるいは上記配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する
。このような単離された分子（特にDNA分子）は、染色体とのインサイチュハイ
ブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのための、および例えば、ノーザン
ブロット分析によるヒト組織におけるTRID遺伝子の発現を検出するためのプロー
ブとして有用である。
本発明はさらに本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメントに
関する。受託されたcDNAのヌクレオチド配列または配列番号１に示されるヌクレ
オチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、少なくとも約
15nt、そしてより好ましくは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくと
も約30nt、そしてさらにより好ましくは約40ntの長さのフラグメントが意図され
、これらは本明細書中に記載されるように、診断用プローブおよびプライマーと
して有用である。当然に、50〜300nt、または600ntの長さでさえある、より長い
フラグメントもまた、受託されたcDNAのヌクレオチド配列、または配列番号１に
示されるヌクレオチド配列の、全てではないにしても、そのほとんどに対応する
フラグメントと同様、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも20nt長の
フラグメントにより、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または配列番号１に示
されるヌクレオチド配列由来の20以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図
される。
本発明の好ましい核酸フラグメントには、以下をコードする核酸分子が挙げら
れる：図３に同定されるおよび以下により詳細に記載されるような、TRIDポリペ
プチドのエピトープ保有部分。
詳細には、本発明は、配列番号１の部分を表すヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチドを提供し、これは配列番号１の183〜959位からなる。アミノ末端メ
チオニンを欠損したTRIDポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた意図
される。このような好ましいポリヌクレオチドの１つは、186〜959位からなる、
配列番号１の部分を表すヌクレオチド配列を有する。このようなポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチドもまた提供され、このようなポリペプチド
は配列番号２の2〜259位のアミノ酸配列を含むか、またはアミノ末端メチオニン
を欠損した、ATCC受託番号第97798号で寄託されたクローンによってコードされ
るポリペプチド配列である。
本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：TR
ID細胞外ドメイン（図１の約27〜約240のアミノ酸残基（配列番号２の約１〜約2
14））を含むポリペプチド；およびTRID膜貫通ドメイン（図１の約241〜約259の
アミノ酸残基（配列番号２の約215〜約233））を含むポリペプチド。これらのド
メインの位置はコンピューターグラフィックにより推定されており、当業者はこ
れらのドメインを構築するアミノ酸残基が、各ドメインを規定するのに使用され
る判断基準に依存して、わずかに（例えば、約1〜15残基）変化し得ることを理
解する。
メチオニンは自然に切断されること、そしてこのような配列は一般にTRID発現
ベクターを遺伝的に操作するのに有用であり得ることが公知であるので、本発明
の好ましい核酸フラグメントは、アミノ末端メチオニンをコードするヌクレオチ
ドを欠損する全長TRIDポリペプチド（例えば、配列番号１のヌクレオチド186〜9
59）をコードする。このようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドもまた、本発明によって意図される。
本発明の好ましい核酸フラグメントは、TRIDタンパク質のエピトープ保有部分
をコードする核酸分子をさらに含む。詳細には、本発明のこのような核酸分子は
以下：図１における約Gln-42〜約Glu-52のアミノ酸残基を含むポリペプチド（配
列番号２における約Gln-16〜約Glu-26）；図１における約His-58〜約Cys-66のア
ミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号２における約His-32〜約Cys-40）；図
１における約Pro-68〜約Thr-76のアミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号２
における約Pro-42〜約Thr-50）；図１における約Ser-79〜約Cys-85のアミノ酸残
基を含むポリペプチド（配列番号２における約Ser-53〜約Cys-59）：図１におけ
る約Cys-91〜約Thr-102のアミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号２におけ
る約Cys-65〜約Thr-76）；図１における約Gln-110〜約Pro-122のアミノ酸残基を
含むポリペプチド（配列番号２における約Gln-84〜約Pro-96）；図１における約
Arg-126〜約Val-136のアミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号２における約
Arg-100〜約Val-110）；および図１における約Thr-142〜約Glu-148のアミノ酸残
基を含むポリペプチド（配列番号２における約Thr-116〜約Glu-122）をコードす
る核酸分子を含む。本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがTRIDタン
パク質の抗原性領域であることを決定した。TRIDタンパク質の他のこのようなエ
ピトープ保有部分の決定方法は、以下に詳細に記載する。
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ATCC受託番号第97798号に含まれるc
DNAクローン）中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドを含む単離した核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件」によって、以下：50％ホルムアミド、５×SSC（150mM NaCl、15m
Mクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、５×デンハート溶
液、10％硫酸デキストラン、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNA、を含む溶
液中での42℃での一晩のインキュベーション、続いて約65℃での0.1×SSC中でフ
ィルターの洗浄が意図される。
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好まし
くは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさらに
より好ましくは約30〜70（例えば、50）ntにハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド（DNAまたはRNAのいずれか）が意図される。これらは、先に議論し、そして以
下でより詳細に考察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用で
ある。
例えば、「少なくとも20nt長」のポリヌクレオチドの部分により、参照ポリヌ
クレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたcDNA、または配列番号１に
示されるようなヌクレオチド配列）由来の20以上の連続したヌクレオチドが意図
される。当然のことながら、ポリＡ配列（例えば、配列番号１に示されるTRID c
DNAの3'末端ポリ（A）トラクト）にのみ、またはT（もしくはU）残基の相補的な
ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部
分にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれ
ない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（A）ストレッチまたは
その相補体（例えば、実際には、任意の二本鎖cDNAクローン）を含む任意の核酸
分子にハイブリダイズするからである。
示されるように、TRIDポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下：
成熟ポリペプチドのコード配列自体；成熟ポリペプチドのコード配列および付加
的配列（例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロ
タンパク質配列のようなリーダー配列あるいは分泌配列をコードする配列）；上
記の付加的コード配列を含むかまたは含まない、例えば、イントロンおよび非コ
ード5'および3'配列（例えば、転写、mRNAプロセシング（スプライシングを含む
）およびポリアデニル化シグナル（例えば、mRNAのリボソーム結合および安定性
）において役割を担う転写された非翻訳配列）を含むがこれらに限定されない、
さらなる非コード配列を共に有する、成熟ポリペプチドのコード配列；さらなる
機能性を提供するような付加的アミノ酸をコードする付加的コード配列、を含み
得るがこれらに限定されない。従って、例えば、ポリペプチドは、融合されたポ
リペプチドの精製を容易にするペプチドのようなマーカー配列と融合され得る。
本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカー配列は、とりわ
け、pQEベクター（Qiagen,Inc.）中に提供されるタグのような、ヘキサ−ヒスチ
ジンペプチドであり、これらの多くは市販されている。例えば、Gentzら、Proc
．Natl．Acad．Sci．USA 86:821-824(1989)において記載されるように、ヘキサ
−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、イン
フルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する、精製のために
有用な別のペプチドであり、それは、Wilsonら、Cell 37:767-778(1984)によっ
て記載されている。以下で考察されるように、他のそのような融合タンパク質に
は、Ｎ末端またはＣ末端にてFcに融合されたTRIDレセプターが含まれる。
改変体および変異体ポリヌクレオチド
本発明は、さらに、TRIDレセプターの一部分、アナログ、または誘導体をコー
ドする、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、天然の対立遺伝子改変
体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上
の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態の１つが意図される
。Genes II，Lewin，B.編、John Wiley&Sons，New York(1985)。天然に存在しな
い改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
このような改変体には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加により産生さ
れる改変体が含まれる。この置換、欠失、または付加には１つ以上のヌクレオチ
ドが含まれ得る。改変体は、コード領域、非コード領域、または両方において変
化され得る。コード領域における変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、
欠失、または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、サイレントな置
換、付加、および欠失であり、これらはTRIDポリペプチド、またはそれらの一部
の特性および活性を変化させない。この点に関してまた特に好ましいのは、保存
的置換である。
本発明のさらなる実施態様には、以下に対して少なくとも90％同一、そしてよ
り好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる：（
ａ）配列番号２中のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列；（ｂ）配列番号２中のアミノ酸配列を有するが、アミノ末端メチオニン
を欠損したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２中の
約１〜約233位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；（ｄ）ATCC受託番号第97798号に含まれるcDNAクローンによってコードさ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）
ATCC受託番号第97798号に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸
配列を有する成熟TRIDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列
番号２中の約１〜約214位のアミノ酸配列を有するTRID細胞外ドメイン、またはA
TCC受託番号第97798号に含まれるcDNAによってコードされるTRID細胞外ドメイン
をコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号２中の約215〜約233位のアミノ
酸配列を有するTRID膜貫通ドメイン、またはATCC受託番号第97798号に含まれるc
DNAによってコードされるTRID膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列；
および（ｈ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または
（ｇ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配
列。
本発明のさらなる実施態様には、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（
ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、または（ｈ）中のポリヌクレオチドに、ストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドを含む、単離された核酸分子が含まれる。このハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、Ａ残基のみ
、またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにはハ
イブリダイズしない。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ
）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）中のアミノ酸配列を有する
TRIDポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
オチドを含む単離された核酸分子に関する。
TRIDポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも
95％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、そのポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列が、TRIDポリペプチドをコードする参照ヌクレ
オチド配列の各100ヌクレオチドあたり５つまでの点変異をポリヌクレオチド配
列が含み得ることを除いて、参照配列に同一であることが意図される。言い換え
れば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチド
が欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配
列において全ヌクレオチドの５％までのある数のヌクレオチドが、参照配列中に
挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは
3'末端位置において、または参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしくは参
照配列内の１つ以上の連続した基中のいずれかに散在されて、これらの末端位置
の間のどこかで生じ得る。
実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示されるヌクレオ
チド配列または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列に少なくとも90％、
95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかどうかは、Bestfitプログラ
ム(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Com
puter Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 5
3711)のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得
る。Bestfitは、SmithおよびWaterman，Advances in Applied Mathematics 2:48
2-489(1981)の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も相同性
のセグメントを見出す。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを使用し
て、特定の配列が、本発明による参照配列に例えば95％同一であるか否かを決定
する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列
の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の５％
までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
本出願は、TRID活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、配
列番号１に示される核酸配列、または寄託されたcDNAの核酸配列と少なくとも90
％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である核酸分子に関する。これは
、特定の核酸分子がTRID活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、
当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼーションプロー
ブ、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして使用するかをなお知
るからである。TRID活性を有するポリペプチドをコードしない、本発明の核酸分
子の使用としては、とりわけ(1)TRID遺伝子またはその対立遺伝子改変体をcDNA
ライブラリーから単離すること；(2)Vermaら，Human Chromosomes:A Manual of
Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)に記載の、TRID遺伝子の正
確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハ
イブリダイゼーション(例えば、「FISH」)；および、特定の組織におけるTRID m
RNA発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられる。
しかし、実のところ、TRIDレセプター活性を有するポリペプチドをコードする
配列番号１に示される核酸配列、あるいは寄託されたcDNAの核酸配列に少なくと
も90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する核酸分子
が好ましい。「TRIDレセプター活性を有するポリペプチド」によって、特定の生
物学的アッセイにおいて測定される場合に、本発明のTRIDレセプター活性に類似
するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドが意図される（全長タンパ
ク質もしくは好ましくは成熟型タンパク質のいずれか、または細胞外ドメイン単
独）。TNFファミリーリガンド（TRAILを含む）は、本発明のTRIDを含むTNF-ファ
ミリーレセプターに結合することによって、種々の細胞性応答を誘導する。TRID
を発現する細胞は、TRAILを含むリガンドに対して強力な細胞性応答を有すると
考えられる。「TNF-ファミリーリガンドに対する細胞性応答」によって、細胞、
細胞株、組織、組織培養物、または患者に対する任意の遺伝子型、表現型、およ
び／または形態学的変化が意図され、これはTNF-ファミリーリガンドによって誘
導される。示されるように、このような細胞性応答には、TNF-ファミリーリガン
ドに対する正常な生理学的応答だけではなく、増加した細胞増殖、または増加し
た細胞増殖の阻害（例えば、アポトーシスの阻害による）に関連した疾患もまた
、含まれる。
もちろん、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNAの核酸配
列、または配列番号１に示される核酸配列に少なくとも90％、95％、96％、97％
、98％、または99％同一である配列を有する多数の核酸分子が「TRIDタンパク質
活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際に、これ
らのヌクレオチド配列の縮重改変体の全てが同じポリペプチドをコードするので
、このことは、上記の比較アッセイを行うことすら必要なく、当業者に明らかで
ある。縮重改変体でないそのような核酸分子について、妥当な数がTRIDタンパク
質活性を有するポリペプチドをコードすることもまた、当該分野でさらに認識さ
れる。これは、当業者が、以下にさらに記載されるように、タンパク質の機能に
有意に影響する可能性が低いか、またはその可能性がないかのいずれかのアミノ
酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸での置換）を十
分に知っているからである。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、本発明の組換え
ベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるTRIDポリペプチ
ドまたはそのフラグメントの産生に関する。
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物
のような沈澱物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクタ
ーがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイ
ンビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
DNAインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファー
ジλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーター、およびtacプ
ロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウ
イルスLTRのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプ
ロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終
結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む
。構築物によって発現される成熟型転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳さ
れるべきポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを含み、そして終わりに適切に位
置される終止コドン(UAA、UGA、またはUAG)を含む。
示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌にお
ける培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝
子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、E.coli
細胞、Streptomyces細胞、およびSalmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（例
えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2細胞およびSpodoptera Sf9
細胞）；動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、およびBowes黒色腫細胞）；な
らびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のため
の適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
細菌における使用に好ましいベクターの中には、pQE70、pQE60、およびpQE-9(
Qiagenから入手可能);pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター
、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratageneから入手可能）;ならびにptrc99
a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaから入手可能）が含まれる
。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、および
pSG（Stratageneから入手可能）;ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL（Pha
rmaciaから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかで
ある。
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE
-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもた
らされ得る。このような方法は、Davisら，Basic Methods In Molecular Biolog
y(1986)のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし
て分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。従って、例
えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、精製の間の、または続く
取り扱いおよび保存の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善するた
めに、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容
易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチド
の最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定
性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチド
への付加は、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好まし
い融合タンパク質は、タンパク質の可溶化のために有用な免疫グロブリン由来の
異種領域を含む。例えば、EP-A-0 464 533（カナダ対応出願第2045869号）は、
別のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の
種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中の
Fc部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改
善された薬物動態学的特性を生じる(EP-A 0232 262)。一方、いくつかの使用に
ついて、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、そ
して精製された後に、Fc部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Fc部分が
、治療および診断における使用に対して障害となると判明する場合（例えば、融
合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索
において、例えばhIL-5−レセプターのようなヒトタンパク質は、hIL-5のアンタ
ゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的でFc部分と
融合されている。D.Bennettら，Journal of Molecular Recognition 8:52-58(19
95)、およびK.Johansonら，The Journal of Biological Chemistry 270：16:945
9-9471(1995)を参照のこと。
TRIDレセプターは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰
イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ
フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフ
ィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され
得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）が精製のため
に用いられる。
本発明のポリペプチドは以下を含む：天然の供給源からの精製産物；化学合成
手順の産物；および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母
細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術に
よって産生された産物。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本
発明のポリペプチドは、グリコシル化されていても、またはグリコシル化されて
いなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主
媒介プロセスの結果として、改変された開始メチオニン残基を含み得る。
TRIDレセプターポリヌクレオチドおよびポリペプチドは本発明に従って、種々
の適用、特にTRIDの化学的および生物学的特性を利用する適用のために使用され
得る。とりわけこれらは腫瘍の処置、寄生虫、細菌およびウイルスに対する耐性
における、アゴニストによるTRIDでの刺激後の、Ｔ細胞、内皮細胞、および特定
の造血細胞の増殖の誘導、再狭窄、対宿主移植片疾患の処置、抗ウイルス応答の
制御、および特定の自己免疫疾患の予防のための適用である。さらなる適用は、
細胞、組織、および生物の障害の診断または処置に関する。本発明のこれらの局
面は、さらに以下において議論される。
ポリペプチドおよびフラグメント
本発明はさらに、寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列、または
配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離されたTRIDポリペプチド、あるいは上
記ポリペプチドの部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。
改変体および変異体ポリペプチド
TRIDポリペプチドの特徴を改良または改変するために、タンパク質工学が使用
され得る。当業者に公知の組換えDNA技術は、単一もしくは複数のアミノ酸置換
、欠失、付加、もしくは融合タンパク質を含む、新規の変異体タンパク質または
「ムテイン」を作成するために使用され得る。このような改変されたポリペプチ
ドは、例えば、増強された活性または増加した安定性を示し得る。さらに、少な
くとも特定の精製条件および保存条件のもとでは、これらはより高い収率で精製
され得、そして対応する天然のポリペプチドより良好な溶解性を示し得る。
N末端欠失変異体およびC末端欠失変異体
例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟形態
を含む多くのタンパク質について、１つ以上のアミノ酸が実質的な生物学的機能
の損失なしでN末端またはC末端から欠失され得ることは当該分野で公知である。
例えば、Ronら、J.Biol.Chem.,268:2984-2988(1993)では、３個、８個または27
個のアミノ末端のアミノ酸残基を失ってもヘパリン結合活性を有する改変KGFタ
ンパク質を報告している。本発明の場合、本発明のタンパク質はTNFRポリペプチ
ドファミリーのメンバーであることから、図１のC-53位（配列番号２のC-27）の
システインまでのN末端アミノ酸の欠失は、いくつかの生物学的活性（例えば、
リンパ球の増殖およびアポトーシスの調節）を維持し得る。図１のC53残基（配
列番号２のC-27）を含むさらなるN末端欠失を有するポリペプチドは、TRID関連
ポリペプチドのこれらの残基が、リガンド結合で必要とされる構造安定性を提供
するためのジスルフィド架橋の形成に必要であることが公知であるので、このよ
うな生物学的活性を維持することは期待されない。
しかし、タンパク質のN末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質
の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じ得るとはいえ、他の生物学的
活性はそれでも維持され得る。従って、TRIDタンパク質の完全形態または成熟形
態を認識する抗体を誘発し、そして／または抗体に結合する短縮型タンパク質の
能力は、一般に、完全タンパク質または細胞外ドメインの大部分ではない残基が
N末端から除去される場合、維持される。完全タンパク質のN末端残基を欠く特定
のポリペプチドが、このような免疫的活性を維持するかどうかは、本明細書に記
載されている日常的な方法およびそうでなければ当該分野で公知である日常的な
方法により容易に決定され得る。
従って、本発明は、各々において、53番目の位置に存在するシステイン残基ま
での、図１に示される、１つ以上の残基がアミノ末端から欠失されたアミノ酸配
列を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌク
レオリドをさらに提供する。詳細には、本発明は、図１のm-259残基のアミノ酸
配列を含むTRIDポリペプチドを提供する。ここで、mは、1-53の範囲の整数であ
り、この53は、完全なTRIDポリペプチド（図１に示される）のN末端から最初の
システイン残基の位置であり、これはTRIDタンパク質の活性に必要であると考え
られる。
より詳細には、本発明は以下の残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを提供する：図１の1-259、2-259、3-259、4-259、5-
259、6-259、7-259、8-259、9-259、10-259、11-259、12-259、13-259、14-259
、15-259、16-259、17-259、18-259、19-259、20-259、21-259、22-259、23-259
、24-259、25-259、26-259、27-259、28-259、29-259、30-259、31-259、32-259
、33-259、34-259、35-259、36-259、37-259、38-259、39-259、40-259、41-259
、42-259、43-259、44-259、45-259、46-259、47-259、48-259、49-259、50-259
、51-259、52-259、および53-259。これらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドもまた提供される。
同様に、生物学的に機能的なC末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例
えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端からの8-10アミノ酸
echnology7:199-216(1988))。本発明の場合では、本発明のタンパク質はTNFRポ
リペプチドファミリーのメンバーであることから、図１の149位（配列番号２の1
23位）のシステインまでのC末端アミノ酸の欠失は、いくらかの生物学的活性（
例えば、リンパ球の増殖およびアポトーシスの調節）を維持し得る。図１の149
位のシステインを含むC末端欠失をさらに有するポリペプチドは、TNFレセプター
関連ポリペプチドのこれらの残基が、リガンド結合に必要とされる構造的安定性
を提供するためのジスルフィド架橋の形成に必要であることが公知であるので、
このような生物学的活性を維持することは期待されない。
しかし、タンパク質のC末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質
の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場合でさえ、他の生物学的
活性はそれでも維持され得る。従って、短縮型のタンパク質の完全または成熟形
態のタンパク質を認識する抗体を誘発および／または結合する能力は一般に、完
全または成熟な形態のタンパク質の決して大部分ではない残基がC末端から除去
されている場合、維持される。完全なタンパク質のC末端残基を欠失した特定の
ポリペプチドがこのような免疫活性を維持するかどうかは、本明細書で記載され
る日常的な方法およびそうでなければ当該分野で公知の日常的な方法により容易
に決定され得る。
従って、本発明は図１の149位のシステインまでの、図１で示されるTRIDのア
ミノ酸配列のカルボキシル末端に由来する１つ以上の残基を有するポリペプチド
、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供す
る。詳細には、本発明は図１のアミノ酸配列の1-x残基のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを提供し、ここでxは149-259の範囲での任意の整数である。これら
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
本発明はまた、１つ以上のアミノ酸をアミノ末端およびカルボキシル末端の両
方から欠失させたポリペプチドを提供し、これらは一般には、図１のm-x残基（
ｍおよびxは上述した整数）を有するポリペプチドとして記載され得る。
ATCC受託番号97798に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全TRIDアミ
ノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もまた含ま
れ、ここで、この部分はATCC受託番号97798に含まれるcDNAクローンによりコー
ドされる完全アミノ酸配列のアミノ末端由来の１位から約49位までのアミノ酸、
またはATCC受託番号97798に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全アミ
ノ酸配列のカルボキシル末端由来の１位から約110位までのアミノ酸、あるいはA
TCC受託番号97798に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全アミノ酸配列
の上記のアミノ末端およびカルボキシル末端欠失の任意の組合せを含まない。上
記の欠失変異ポリペプチド形態の全てをコードするポリヌクレオチドもまた提供
される。
他の変異体
上記で議論されたタンパク質の末端欠失形態に加えて、TRIDポリペプチドの幾
つかのアミノ酸配列がタンパク質の構造または機能に有意な影響なしに変化し得
ることもまた、当事者により認識される。配列中でのこのような差違を考察する
場合、活性を決定するタンパク質の決定的な領域があることに留意すべきである
。従って、本発明は、実質的なTRIDポリペプチド活性を示すTRIDポリペプチド改
変体または以下で議論されるタンパク質部分のようなTRIDタンパク質の領域を含
むTRIDポリペプチド改変体をさらに含む。このような変異体は、欠失、挿入、転
移、反復、および、型置換を含む。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントで
あるようであるかに関するガイダンスは、Bowie,J.U．ら、「Deciphering the M
essage in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions,」Scie
nce 247:1306-1310(1990)で見い出され得る。
従って、配列番号２のポリペプチドまたは寄託されたcDNAによりコードされる
ポリペプチドの、フラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のア
ミノ酸残基が、保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保
存されたアミノ酸、およびより好ましくは、少なくとも１つであるが10個未満の
保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が遺
伝コードによりコードされてもよくされていなくてもよいもの；または（ｉｉ）
１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟または可溶
性の細胞外ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させるための化合物（
例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合したもの、または
（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチド（例えば、IgG Fc融合領域ペプチ
ド配列もしくはリーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチドもしくは
プロタンパク質配列の精製のために使用される配列）と融合したものであり得る
。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示より当業
者の範囲内であると見なされる。
従って、本発明のTRIDは、天然の変異もしくは人工操作のいずれかに由来する
１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。示されるように、タン
パク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、
小さな性質の変化が好ましい（表１を参照のこと）。
表１。保存的アミノ酸置換 本発明のTRIDタンパク質の機能に必須のアミノ酸は、当該分野で公知の方法（
例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発(Cunninghamおよ
びWells,Science 244:1081-1085(1989))により同定され得る。後者の手順は、分
子のすべての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分
子は生物学活性（例えば、レセプター結合またはインビトロでの増殖活性）につ
いて試験される。
特に興味深いのは、荷電した別のアミノ酸および中性もしくは陰性に荷電した
アミノ酸での荷電したアミノ酸の置換である。後者は、TRIDタンパク質の特性を
改善するように陽性電荷が減少したタンパク質を生じる。凝集の予防は非常に望
ましい。タンパク質の凝集は活性を減少させるだけではなく、薬学的処方物を調
製する場合にも問題であり得る。なぜなら、凝集体が免疫原性であり得るからで
ある(Pinckardら、Clin.Exp．Immunol.2:331-340(1967);Robbinsら、Diabetes 3
6:838-845(1987);Clelandら、Crit.ReV.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:
307-377(1993))。
アミノ酸の置き換えはまた、細胞表面のレセプターに対するリガンドの結合選
択性を変化させ得る。例えば、Ostadeら、Nature 361:266-268(1993)は、TNFレ
セプターの２つの公知の型の１つのみに対するTNF-αの選択的な結合を生じる特
定の変異体を記載する。リガンド−レセプター結合について決定的である部位は
また、構造解析（例えば、結晶化、核磁気共鳴法または光親和性標識）により決
定され得る(Smithら、J.Mol.Biol.224:899-904(1992)およびde Vosら、Science
255:306-312(1992))。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離
されたポリペプチド」とは、その天然環境から取り出されたポリペプチドを意図
する。従って、組換え宿主細胞内で産生されおよび／または含まれるポリペプチ
ドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。「単離されたポリペプチ
ド」として意図されるのはまた、組換え宿主細胞から、部分的または実質的に精
製されたポリペプチドである。例えば、TRIDポリペプチドの組換え産生版は、Sm
ithおよびJohnson,Gene 67:31-40(1988)に記載されるワンステップ法により実質
的に精製され得る。
本発明者らは、TRIDポリペプチドが２つの主要な構造ドメインを示す259残基
タンパク質であることを見いだした。第１に、細胞外TRAILリガンド結合ドメイ
ンが配列番号２のほぼ１〜ほぼ214残基内に同定された。第２に、膜貫通ドメイ
ンが、配列番号２のほぼ215〜ほぼ233残基内に同定された。しかし、上記のよう
に、TRIDは、驚くべきことに、推定細胞内シグナルドメインを欠き、従って、「
TRID」（細胞内ドメインを欠くTRAILレセプター」）と命名される。
本発明のポリペプチドは、寄託されたcDNAによってコードされるポリペプチド
を含む。これには、リーダー；成熟ポリペプチド（これは、リーダーを除いた寄
託されたcDNAによってコードされる）（すなわち、成熟タンパク質）；配列番号
２のアミノ酸ほぼ26〜ほぼ233を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸ほぼ
−25〜ほぼ233を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸ほぼ１〜ほぼ233を含
むポリペプチド；細胞外ドメインを含むポリペプチド；および膜貫通ドメインを
含むポリペプチド；ならびに上記のポリペプチドに対して少なくとも80％同一、
より好ましくは、少なくとも90％または95％同一、なおより好ましくは少なくと
も96％、97％、98％、または99％同一であるポリペプチドが含まれ、そしてまた
、少なくとも30アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を有する
このようなポリペプチドの部分が含まれる。
例えば、TRIDポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、95％「同一の」
アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、そのポリペプチド配列が、TRIDポリ
ペプチドの参照アミノ酸配列の各100アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を含
み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一である
ことが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも95％同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列において５％ま
でのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは別のアミノ酸で置換され得、または
参照配列における総アミノ酸残基の５％までの多数のアミノ酸が参照配列に挿入
され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もし
くはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、もしくは参照配
列内で１つ以上の隣接した基内のいずれかに散在した、これらの末端位置の間の
どこかで起こり得る。
実際に、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２に示されるアミノ
酸配列、または寄託されたcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列に対し
て、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかどうか
は、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 fo
r Unix、Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science D
rive，Madison，WI 53711）のような公知のコンピュータープログラムを使用し
て従来通りに決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列に95％同
一であるかどうかを決定するために、Bestfitまたは任意の他の配列アラインメ
ントプログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性のパーセンテージが
参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基
の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターが
設定される。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるSDS-PAGEゲル、または
分子ふるいゲル濾過カラム上で分子量マーカーとして使用され得る。
エピトープ保有部分
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトー
プは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫
原性エピトープ」は、全てのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発す
るタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質
分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピ
トープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysen
ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3998-4002（1983）を参照のこと。
抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Sutcli
ffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green,N.およびLearner,R.A．(1983)「Antibodies That
React With Predetermined Sites on Proteins」,Science 219:660-666を参照の
こと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で
頻繁に示され、一連の単純な化学的法則により特徴付けられ得、そしてインタク
トなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ
末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。それゆえ本発明の抗原性エピ
トープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結
合するモノクローナル抗体を含む、抗体を惹起するために有用である。例えば、
Wilsonら、Cell 37:767-778(1984)の777頁を参照のこと。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列中に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好まし
くは少なくとも９個、そして最も好ましくは約15〜約30個の間のアミノ酸の配列
を含む。
TRID特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたはペプ
チドの限定しない実施例は以下を含む：図１のほぼGln-42からほぼGln-52まで
（配列番号２のほぼGln-16〜ほぼGln-26）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；
図１のほぼHis-58からほぼCys-66まで（配列番号２のほぼHis-32〜ほぼCys-40）
のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１のほぼPro-68からほぼThr-76まで（配
列番号２のほぼPro-42〜ほぼThr-50）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１
のほぼSer-79からほぼCys-85まで（配列番号２のほぼSer-53〜ほぼCys-59）のア
ミノ酸残基を含むポリペプチド；図１のほぼCys-91からほぼThr-102まで（配列
番号２のほぼCys-65〜ほぼThr-76）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１の
ほぼGln-110からほぼPro-122まで（配列番号２のほぼGln-84〜ほぼPro-96）のア
ミノ酸残基を含むポリペプチド；図１のほぼArg-126からほぼVal-136まで（配列
番号２のほぼArg-100〜ほぼVal-110）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；およ
び図１のほぼThr-142からほぼGlu−148まで（配列番号２のほぼThr-116〜ほぼGl
u-122）のアミノ酸残基を含むポリペプチド。上記のように、本発明者らは、上
記のポリペプチドフラグメントがTRIDタンパク質の抗原領域であることを決定し
た。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
より産生され得る。例えば、Houghten,R.A(1985)「General method for the rapi
d solid-phase synthesis of large numbers of Peptides:Specificity of anti
gen-antibody interaction at the level of individual amino acids.」Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135を参照のこと；この「Simultaneous Multiple Pe
ptide Synthesis(SMPS)」プロセスは、Houghtenらの米国特許第4,631,211号(198
6)でさらに記載される。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、抗体を誘導するため
に当該分野で周知の方法に従って使用される。例えば、Sutcliffeら（前出）；W
ilsonら（前出）；Chow,Mら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914;およびBittl
e,F.J．ら、J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)を参照のこと。本発明の免疫原性
のエピトープ保有ペプチド（すなわち、全てのタンパク質が免疫源である場合に
、抗体応答を誘導するタンパク質の部分）は、当該分野で公知の方法に従って同
定される。例えば、Geysenら（前出）を参照のこと。さらになお、Geysen(1990)
の米国特許第5,194,392号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）
に対して相補的なエピトープ（すなわち「ミモトープ」）の位相幾何学的等価物
で
あるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的
な方法を記載する。より一般的には、Geysen（1989）の米国特許第4,433,092号
は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相
幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同
様に、Peralkylated Oligopeptide Mixturesに関するHoughten，R．A．ら（1996
）の米国特許第5,480,971号は、直鎖C1-C7-アルキル過アルキル化オリゴペプチ
ドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに目的のア
クセプター分子に、優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列を決定
するために、このようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを使用する
方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナロ
グはまた、これらの方法により日常的に作製され得る。
融合タンパク質
当業者が理解するように、本発明のTRIDレセプターポリペプチドおよびその上
記のエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（IgG）の定常ドメインの
部分と結合し得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精
製を容易にし、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトCD
4-ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖ま
たは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示され
ている（EP A 394,827；Trauneckerら、Nature331:84-86（1988））。IgG部分に
よるジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体TRIDタ
ンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和
において効率的であり得る（Fountoulakisら、J．Biochem．270:3958-3964（199
5））。
抗体
本発明で使用されるTRIDタンパク質特異的抗体は、インタクトなTRIDタンパク
質またはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹起され得、これはキャ
リアタンパク質（例えば、アルブミン）を用いて、あるいは十分に長い場合では
（少なくともほぼ25アミノ酸）キャリアを用いずに動物の系（例えば、ウサギま
たはマウス）に提示され得る。
本明細書で使用される用語「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(Mab)
は、インタクトな分子ならびにTNFRタンパク質に対し特異的に結合し得る抗体フ
ラグメント（例えば、FabおよびF(ab')2フラグメント）を含むことを意味する。
FabおよびF(ab')2フラグメントはインタクトな抗体のFcフラグメントを欠落し、
循環からより迅速に除去され、そしてインタクトな抗体の非特異的な組織へのよ
り少ない結合を有し得る(Wahlら、J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。従って、こ
れらのフラグメントは好ましい。
本発明の抗体は、種々の方法のいずれかにより調製され得る。例えば、TRIDタ
ンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体
を含む血清の産生を誘導するために動物に対して投与され得る。好ましい方法で
は、TRIDタンパク質の調製は、それを天然の混入物を実質的に皆無にするために
調製および精製される。次いで、このような調製物は、より特異的な活性のポリ
クローナル抗血清を産生するために動物に導入される。
最も好ましい方法においては、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。こ
(1976);Hammerlingら：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,Elsevie
r,N.Y.,(1981)563-681頁中）を使用して調製され得る。一般には、このような手
順はTRIDタンパク質抗原、またはより好ましくはTRIDタンパク質発現細胞での動
物（好ましくはマウス）の免疫化を含む。適切な細胞は、抗TRIDタンパク質抗体
に結合するそれらの能力により認識され得る。このような細胞は任意の適切な組
織培養培地で培養され得るが、10％のウシ胎仔血清（約56℃で非働化）を補充し
、ならびに約10g/lの非必須アミノ酸、約1,000U/mlのペニシリン、および約100
μg/mlのストレプトマイシンを補充したEagle改変Eagle培地中で細胞を培養する
ことが好ましい。このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエロー
マ細胞株と融合される。任意の適切なミエローマ細胞株が本発明に従って使用さ
れ得る。しかし、ミエローマ細胞の親細胞株(SP20)(アメリカンタイプカルチャ
ー
コレクション(Rockville Maryland)より入手可能)を使用することが好ましい。
融合後、得られたハイブリドーマ細胞はHAT培地中で選択的に維持され、次いで
、Wandsら(Gastroenterology 80:225-232(1981))により記載される限界希釈によ
りクローン化される。次いで、このような選択を通じて得られたハイブリドーマ
細胞は、所望のTRID抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するために
アッセイされる。
あるいは、TRID抗原に結合し得るさらなる抗体は、抗イディオタイプの抗体の
使用を通じて２ステップの手順で産生され得る。このような方法は、抗体がそれ
自身の抗原であるという事実を使用し、しかもそれゆえに、第２の抗体に結合す
る抗体を入手することが可能である。この方法に従って、TRIDタンパク質特異的
抗体は、動物（好ましくはマウス）を免疫化するために使用される。次いで、こ
のような動物の脾細胞は、ハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そし
てハイブリドーマ細胞は、そのTRIDタンパク質特異的抗体に結合する能力が、TR
IDタンパク質抗原によりブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するた
めにスクリーニングされる。このような抗体は、TRIDタンパク質特異的抗体に対
する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるTRIDタンパク質特異的抗体の
形成を誘導するための、動物の免疫化に使用され得る。
本発明のFabおよびF(ab')2ならびに他の抗体のフラグメントは、本明細書で開
示される方法に従って使用され得る。代表的には、このようなフラグメントは、
パパイン（Fabフラグメントを産生するため）またはペプシン（F(ab')2フラグメ
ントを産生するため）のような酵素を使用して、タンパク質分解切断により産生
される。あるいは、TRIDタンパク質結合フラグメントは、組換えDNA技術の適用
によって、または合成化学によって産生され得る。
ヒトにおける、インビボでの抗TRIDの使用については、「ヒト化」キメラモノ
クローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上述さ
れたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物
を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知
である。総説については、Morrison，Science 229:1202(1985);Oiら、BioTechni
ques 4:214(1986);Cabillyら、米国特許第4,816,567号；Taniguchiら、EP 17149
6;Morrisonら、EP 173494;Neubergerら、WO860l533;Robinsonら、WO8702671;Bou
lianneら、Nature 312:643(1984);Neubergerら、Nature 314:268(1985)を参照の
こと。
免疫系関連障害
診断法
本発明者らは、TRIDが、造血組織および他の正常ヒト組織で発現されることを
、見いだした。多数の免疫系関連障害について、TRID遺伝子発現の実質的に変化
された（増加または減少された）レベルが、このような障害を有する個体から得
た免疫系組織またはその他の細胞または体液（例えば、血清および血漿）で、「
標準」TRID遺伝子発現レベル、すなわち、免疫系障害を有さない個体から得た免
疫系組織または体液中のTRID発現レベルと比較して、検出され得る。従って、本
発明は、免疫系障害の診断中に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体から
の免疫系組織またはその他の細胞または体液でのTRIDタンパク質をコードする遺
伝子の発現レベルを測定する工程、および、測定された遺伝子発現レベルを標準
的なTRID遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、そのことにより、標準と比
較される遺伝子発現レベルの増加または減少が、免疫系障害の指標となる。
特に、ガンを有する哺乳動物の特定の組織は、対応する「標準」レベルと比較
した場合、TRIDタンパク質およびTRIDをコードするmRNAの有意に増強されたレベ
ルを発現すると考えられる。さらに、TRIDタンパク質の増強レベルは、ガンを有
さない同種の哺乳動物からの血清に比較した場合、このようなガンを有する哺乳
動物からの特定体液（例えば、血清および血漿）で、検出され得ると考えられる
。
従って、本発明は、ガンを含む免疫系障害の診断中に有用な診断方法を提供し
、この方法は、個体からの免疫系組織またはその他の細胞または体液でのTRIDタ
ンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および、測定された
遺伝子発現レベルを標準的なTRID遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、そ
のことにより、標準と比較された遺伝子発現レベルの増加または減少が、免疫系
障害の指標となる。
腫瘍の診断を含む免疫系における障害の診断が、すでに従来方法に従って実施
されている場合、本発明は、予後指標として有用である。予後指標により、改変
された（特に、増強された）遺伝子発現を示す患者は、標準レベルにより近いレ
ベルで遺伝子を発現する患者に比較して、より悪い臨床結果を経験する。
「TRIDタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」とは、TR
IDのレベル、またはTRIDタンパク質をコードするmRNAレベルを、第１の生物学的
サンプルで、直接（例えば、タンパク質の絶対レベルまたはmRNAの絶対レベルの
決定または評価によって）または相対的（例えば、第２の生物学的サンプルのTR
IDタンパク質レベルまたはmRNAレベルに対する比較による）のいずれかで、定性
または定量的に決定または評価することを意図する。好ましくは、第１の生物学
的サンプル中のTRIDタンパク質レベルまたはmRNAレベルは、測定および評価され
、そして標準的なTRIDタンパク質レベルまたはmRNAレベルと比較され、この標準
は、障害を有さない個体から得た第２の生物学的サンプルから得られるか、また
は免疫系の障害を有さない個体集団からのレベルを平均して決定される。当該分
野で評価されるように、一旦標準TRIDタンパク質レベルまたはmRNAレベルが判明
すると、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
「生物学的サンプル」によって、TRIDタンパク質またはmRNAを含有する、個体
、体液、細胞株、組織培養物、またはその他の供給源から得られた、任意の生物
学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、TRIDタンパ
ク質の遊離細胞外ドメイン（または可溶性型）を含有する体液（例えば、血清、
血漿、尿、滑液、および髄液）、免疫系組織、およびTRIDの完全または細胞外ド
メインを発現することが認められているその他の組織供給源を含む。哺乳動物か
ら組織生検および体液を得る方法は、当該分野で周知である。生物学的サンプル
が、mRNAを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
本発明はまた、TRID遺伝子中の変異を診断するための、本発明の遺伝子の使用
を意図する。例えば、本発明の遺伝子の１つに変異が存在するときは、症状は、
本発明のレセプターポリペプチド産生の欠如から生じる。さらに、レセプターポ
リペプチド活性を増強する変異が、レセプターポリペプチドの過剰発現に関連す
る疾患、例えば、内毒素ショックを導く。遺伝子中の変異は、欠損遺伝子の配列
を正常遺伝子の配列と比較することによって検出され得る。次に、変異遺伝子が
、疾患症状または疾患症状に対する感受性に関連することを確証し得る。すなわ
ち、TRIDの過剰発現を導く変異遺伝子は、TRAILが腫瘍増殖を阻害できないこと
と関連する。
前出アッセイによって診断され得るその他の免疫系障害は、過敏症、アレルギ
ー、感染性疾患、対宿主性移植片病（graft-host disease）、免疫不全、自己免
疫疾患などを包含する。
本発明の遺伝子に変異を有する個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出
され得る。診断に使用される核酸は、血液、尿、唾液、およびその他の組織から
の組織生検からのような、患者の細胞から得られ得る。ゲノムDNAが、検出のた
めに直接使用され得るか、または、分析の前に、PCR（Saikiら、Nature，324:16
3-166（1986））を用いて酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAもまた、同じ目
的に使用され得る。例として、本発明の核酸に相補的なPCRプライマーが、本発
明のヒト遺伝子での変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠
失および挿入が、正常遺伝子型との比較での増幅産物の大きさの変化によって検
出され得る。点変異は、増幅DNAを、放射標識RNAと、あるいは本発明の放射標識
アンチセンスDNA配列とハイブリダイズさせることによって同定され得る。完全
にマッチした配列は、RNase A消化または融解温度差によって、ミスマッチ二重
鎖から区別され得る。このような診断は、特に、出生前テストまたは新生児テス
トにもなお有用である。
参照遺伝子と「変異体」との間の配列の相違は、直接DNA配列決定法によって
明らかにされ得る。さらに、クローン化DNAセグメントが、特定DNAセグメントを
検出するためのプローブとして使用され得る。この方法の感度は、PCRと組み合
わされたときに大きく増強される。例えば、配列決定プライマー（primary）は
、二本鎖PCR産物または改変PCR産物によって生成された一本鎖鋳型分子と共に使
用される。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを使用した従来の手順、または蛍
光タグを使用した自動配列決定手順によって実施される。
特定の位置での配列の変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNaseお
よびS1保護または化学切断法（例えば、Cottonら、PNAS，85:4397-4401（198
5）））によって明らかにされ得る。
生物学的サンプル中のTRIDタンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づく技術
を用いて実施され得る。例えば、組織でのTRIDタンパク質発現は、古典的な免疫
組織学的方法によって研究され得る(Jalkanen，M．ら、J．Cell．Biol．101:976
-985（1985）；Jalkanen，M．ら、J．Cell．Biol．105:3087-3096（1987））。T
RID遺伝子発現を検出するために有用なその他の抗体に基づく方法は、イムノア
ッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）およびラジオイムノアッセ
イ（RIA））を包含する。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、
グルコースオキシダーゼのような酵素標識、およびヨウ素（125I、121I）、炭素
（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）、およびテ
クニチウム（99mTc）のようなラジオアイソトープ、およびフルオレセインおよ
びローダミンのような蛍光標識、およびビオチンを包含する。
個体から得た生物学的サンプル中のTRIDタンパク質レベルのアッセイに加えて
、TRIDタンパク質はまた、画像診断によってインビボで検出され得る。TRIDタン
パク質のインビボ画像診断のための抗体標識またはマーカーは、Ｘ線撮影、NMR
、またはESRによって検出可能なものを包含する。Ｘ線撮影については、適切な
標識は、バリウムまたはセシウムのようなラジオアイソトープを包含し、これは
検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。NMRお
よびESRのための適切なマーカーは、ジュウテリウムのような検出可能な特徴的
なスピンを有するものを包含し、関連ハイブリドーマに対する栄養物の標識によ
って、抗体へ組み込まれ得る。
ラジオアイソトープ（例えば、131I、112In、99mTc）、放射線不透過性物質、
または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような、適切な検出可能イメージン
グ部分で標識された、TRID特異的抗体または抗体フラグメントが、免疫系障害に
ついて試験されるべき哺乳動物へ導入される（例えば、非経口的、皮下的または
腹腔内に）。被験体の大きさおよび使用される画像診断システムが、診断画像を
作製するために必要な画像部分の量を決定することは、当該分野で理解される。
ラジオアイソープ部分の場合には、ヒト被験体について、注入される放射活性の
量は、通常、約5〜20ミリキュリーの99mTcの範囲である。次に、標識抗体または
抗
体フラグメントは、TRIDタンパク質を含有する細胞の位置に、優先的に蓄積する
。インビボ腫瘍画像診断は、S.W.Burchielら、「Immunopharmacokinetics of Ra
diolabeled Antibodies and Their Fragments」（Tumor Imagingの第13章:The R
adiochemical Detection of Cancer，S.W．BurchielおよびB.A．Rhodes編、Mass
on Publishing Inc．（1982））に記載されている。
処置
腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーリガンドが、細胞傷害性、抗ウイルス活性、
免疫調節活性、および数種の遺伝子の転写制御を含む、多くの細胞応答を誘導す
る、最も多面的なサイトカインに属することは、公知である(Goeddel，D.V．ら
、「Tumor Necrosis Factors:Gene Structure and Biological Activities,」Sy
mp．Quant．Biol．51:597-609（1986），Cold Spring Harbor;Beutler，B.,およ
びCerami，A.，Annu．Rev．Biochem．57:505-518（1988）；Old，L.J.，Sci．Am
．258:59-75（1988）；Fiers，W.，FEBS Lett．285:199-224（1991））。TNF-フ
ァミリーリガンドは、TNF-ファミリーレセプターと結合することによって、この
ような種々の細胞応答を誘導する。TRIDポリペプチドを発現し、TNFRリガンドに
対する有力な細胞応答を有する細胞は、リンパ球、内皮細胞、ケラチノサイト、
および前立腺組織を包含する。「TNF-ファミリーリガンドに対する細胞応答」に
よって、TNF−ファミリーリガンドによって誘導される、細胞、細胞株、組織、
組織培養物、または患者に対する、あらゆる遺伝子型、表現型、および／または
形態学的変化が意図される。示されているように、このような細胞応答は、TNF-
ファミリーリガンドに対する正常な生理学的応答のみならず、増大されたアポト
ーシスまたはアポトーシス阻害に関連する疾患も包含する。
増大された細胞生存性、またはアポトーシス阻害に関連する疾患は、ガン（例
えば、濾胞性リンパ腫、p53変異による癌腫、および、乳ガン、前立腺ガン、カ
ポジ肉腫、および卵巣ガンのようなホルモン依存性腫瘍）；自己免疫障害（例え
ば、全身紅斑性狼瘡、および免疫関連糸球体腎炎、慢性関節リウマチ）および、
ウイルス感染症（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノ
ウイルス）、宿主対情報移植片病(information graft v．host disease)、急性
移植片拒絶、および慢性移植片拒絶を包含する。増大アポトーシス関連疾患は、
AIDS；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮側索
硬化症、網膜色素変性、小脳変性）；脊髄異形成症候群（例えば、再生不良性貧
血）、虚血損傷（例えば、心筋梗塞、発作、および再灌流損傷に起因するもの）
、毒素誘発肝疾患（例えば、アルコールに起因するもの）、敗血症性ショック、
悪液質、および摂食障害を包含する。
従って、１つの局面で、本発明は、TNF-ファミリーリガンドにより誘導される
アポトーシスを増強するための方法に関し、この方法は、TNFRポリペプチドを発
現する細胞への、TRID発現またはそのリガンド結合能力（例えば、TRAILに対す
る）を阻害し得るTRIDポリプチドのアンタゴニストの有効量の投与を包含する。
好ましくは、TNFR媒介シグナリングは、減少されたアポトーシスが示される疾患
を処置するために増大される。アンタゴニストは、TRIDポリペプチドに対するモ
ノクローナル抗体を包含し得る。
「アンタゴニスト」によって、アポトーシスを増強または可能にし得る、天然
に存在する化合物および合成化合物が意図される。「アゴニスト」によって、ア
ポトーシスを阻害し得る、天然に存在する化合物および合成化合物が意図される
。本発明の任意候補「アンタゴニスト」または「アゴニスト」が、アポトーシス
を増強または阻害し得るかどうかは、下記により詳細に記載されているものを含
む、当該分野で公知のTNF-ファミリーリガンド／レセプター細胞応答アッセイを
用いて決定され得る。
このようなスクリーニング手順の１つは、本明細書中の他で記載されるDR4ま
たはDR5のようなTRAILを結合するTNFRレセプター、および本発明のTRIDレセプタ
ーを同時発現するためにトランスフェクトされた、メラニン保有細胞の使用を包
含する。このようなスクリーニング技術は、1992年2月6日に公開されたPCT WO 9
2/01810に記載されている。このようなアッセイは、例えば、レセプターをコー
ドするメラニン保有細胞の、TNF-ファミリーリガンドおよび候補アンタゴニスト
（またはアゴニスト）の両方との接触による、本発明のレセプターポリペプチド
の活性化を阻害する（または増強する）化合物についてスクリーニングするため
に使用され得る。リガンドによって生成されたシグナルの阻害または増強は、そ
の化合物が、TRID活性のアンタゴニストまたはアゴニストであることを示す。TR
IDポリペプチドおよびそのアゴニストは、TNFRレセプター（例えば、TRAILレセ
プター）の活性化を阻害する一方で、アンタゴニストは、活性化を増強する。
その他のスクリーニング方法は、例えば、Science 246:181-296（1989年10月
）に記載されているような、レセプター活性化によって引き起こされる、細胞外
pH変化を測定するシステムでの、TRAILレセプターおよびTRIDを発現する細胞（
例えば、トランスフェクトCHO細胞）の使用を包含する。例えば、化合物は、本
発明のTRAILレセプターポリペプチドおよびTRIDを発現する細胞と接触され得、
そして、第二メッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはpH変化）が測定
されて、潜在的な化合物が、TRA住レセプターを活性化するかまたは阻害するか
が決定され得る。
別のこのようなスクリーニング技術は、TRIDおよびTRAILレセプターを一時的
に発現するために、レセプターをコードするRNAのXenopus卵母細胞への導入を包
含する。次に、レセプター卵母細胞は、レセプターリガンドおよびスクリーニン
グされるべき化合物と接触させられ、その後、レセプターの活性化を阻害すると
考えられる化合物についてのスクリーニングの場合には、カルシウムシグナルの
阻害または活性化が検出され得る。
別のスクリーニング技術は、TRAILレセプターがホスフォリパーゼCまたはDに
連結されている構築物の、細胞での発現を包含する。このような細胞は、内皮細
胞、平滑筋細胞、胚腎細胞などを包含する。スクリーニングは、候補化合物とと
もに可溶性形態で同時発現されたかまたは添加されたTRIDの存在下で、ホスフォ
リパーゼシグナルから、レセプターの活性化またはレセプターの活性化阻害を検
出することによって、上記のように達成され得る。
別の方法は、同時発現されたかまたは可溶化形態の本発明のTRIDポリペプチド
の存在下でTRAILレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物についての
スクリーニングを包含する。本発明のアゴニストは、細胞表面上にTRAILレセプ
ターを有する細胞への標識リガンドの結合の阻害を決定することによって同定さ
れる。このような方法は、細胞がその表面上でレセプターを発現するように、TR
AIL結合レセプターをコードするDNAで真核生物細胞をトランスフェクトする工程
、
および標識TRAILおよびTRIDの存在下で細胞を化合物と接触させる工程を包含す
る。TRAILは、例えば、放射活性によって標識され得る。レセプターに結合され
た標識TRAIL量が、例えば、レセプターの放射活性を測定することによって、測
定される。その化合物が、TRAILレセプターに結合する標識TRAILの増加によって
決定されるように、TRIDレセプターに結合する場合、その化合物はTRIDアンタゴ
ニストである。
本発明のアゴニストおよびアンタゴニストについてのさらなるスクリーニング
アッセイは、Tartaglia，L.A.およびGoeddel，D.V.，J．Biol．Chem．267（7）
：4304-4307（1992）に記載されている。
従って、さらなる局面では、スクリーニング方法は、候補TRIDアンタゴニスト
またはアゴニストが、TNF-ファミリーリガンドに対する細胞応答（例えばTRAIL
により誘導されるアポトーシス）を増強し得るかまたは阻害し得るかを決定する
ために提供される。その方法は、TNFRポリペプチドを発現する細胞と、候補化合
物であるTRIDおよびTNF-ファミリーリガンドとを接触させる工程、細胞応答をア
ッセイする工程、および、その細胞応答を標準細胞応答と比較する工程を包含し
、標準は、リガンドとの接触をTRIDの存在下であるが候補化合物の非存在下で実
施したときにアッセイされ、そのことによって、標準と比較して増大された細胞
応答は、候補化合物がアンタゴニストであることを示し、そして、標準と比較し
て減少された細胞応答は、候補化合物がアゴニストであることを示す。「細胞応
答をアッセイする」ことによって、候補化合物および／またはTNF-ファミリーリ
ガンドに対する細胞応答を定性的または定量的に測定すること（例えば、T細胞
増殖またはトリチウム化チミジン標識の増加または減少の決定または評価）が意
図される。本発明によって、TNFRポリペプチドを発現する細胞は、内因性または
外因的に投与されたTNF-ファミリーリガンドのいずれかと接触され得る。
本発明によるアンタゴニストは、例えば、TNFファミリーリガンドペプチドフ
ラグメント、形質転換増殖因子、神経伝達物質（例えば、グルタメート、ドーパ
ミン、N-メチル-D-アスパルテート）、腫瘍抑制物質（p53）、細胞溶解T細胞、
および抗代謝拮抗物質のような、天然に存在する化合物および合成化合物を包含
する。好ましいアゴニストは、例えば、シスプラチン（cisplatin）、ドキソル
ビシン（doxorubicin）、ブレオマイシン（bleomycin）、シトシンアラビノシド
、ナイトロジェンマスタード、メトトレキセート、およびビンクリスチンのよう
な化学療法薬を包含する。その他は、エタノールおよびアミロイドペプチドを包
含する（Science 267:1457-1458（1995））。さらに好ましいアンタゴニストは
、TRIDポリペプチドに対して惹起されたポリクローナルおよびモノクローナル抗
体、またはそのフラグメントを包含する。
本発明のアゴニストは、例えば、CD40リガンド、中性アミノ酸、亜鉛、エスト
ロゲン、アンドロゲン、ウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルスE1B、バキュ
ロウイルスp35およびIAP、ウシポックスウイルスcrmA、エプスタイバーウイルス
BHRF1、LMP-1、アフリカブタ熱ウイルスLMW5-HL、およびヘルペスウイルスyl 34
.5）、カルパインインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、および
腫瘍プロモーター（例えば、PMA、フェノバルビタール、および-ヘキサクロロシ
クロヘキサン）のような、天然に存在する化合物および合成化合物を包含する。
その他のアゴニストは、TRAILポリペプチドまたはそのフラグメントに対して惹
起されたポリクローナルアンタゴニスト抗体およびモノクローナルアンタゴニス
ト抗体を包含する。
その他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス分子を包含する。アンチセ
ンス技術は、アンチセンスDNAまたはRNAを介して、または三重ヘリックス形成を
介して、遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例え
ば、Okano，J．Neurochem．56:560（1991）；Oligodeoxynucleotides as Antise
nse Inhibitors of Gene Expression，CRC Press,Boca Raton，FL（1988）に考
察されている。三重ヘリックス形成は、例えば、Leeら、Nucleic Acids Researc
h 6:3073（1979）；Cooneyら、Science 241:456（1988）;および、Dervanら、Sc
ience 251:1360（1991）に考察されている。その方法は、ポリヌクレオチドの相
補的DNAまたはRNAへの結合に基づく。
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5'コード
部分は、長さ約10塩基対から40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを
設計するために使用され得る。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝
子の領域に相補的であるように設計され、そのことによって、転写およびレセプ
ター産生を阻む。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmRN
Aにハイブリダイズし、mRNA分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAまたはDNAが、レセプ
ター産生を阻害するために、インビボで発現され得るように、細胞へ送達され得
る。
本発明によるさらなるアゴニストは、TRIDの可溶性形態（すなわち、全長レセ
プターの細胞外領域からのリガンド結合ドメインを含むTRIDフラグメント）を包
含する。レセプターのこのような可溶性形態（天然に存在するか、または合成で
あり得る）は、TNF-ファミリーリガンドへの結合について細胞表面TNFRと競合す
ることによって、TNFR媒介シグナリングに拮抗作用をなす。従って、リガンド結
合ドメインを含むTRIDレセプターの可溶性形態は、TNF-ファミリーリガンドによ
って誘導されるアポトーシスを阻害し得る、新規サイトカインである。その他の
このようなサイトカインは当該分野で公知であり、Fasリガンドによって誘導さ
れるアポトーシスを制限するように生理学的に作用する、Fas B（マウスFasレセ
プターの可溶性形態）を包含する（Hughes，D.P.およびCrispe，I.N.，J．Exp．
Med．182:1395−1401（1995））。
示されているように、本発明のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
のアゴニストまたはアンタゴニストは、Tartaglia，L.A.およびGoeddel，D.V.，
J．Biol．Chem．267（7）:4304-4307（1992）:Tartaglia，L.A．ら、Cell 73:21
3-216（1993）、およびPCT出願WO 94/09137に開示されている方法に従って惹起
され得る。本明細書で使用されているように、用語「抗体」（Ab）または「モノ
クローナル抗体」（mAb）は、インタクトな分子、ならびに、抗原に結合し得る
そのフラグメント（例えば、FabおよびF（ab'）2フラグメントのような）を包含
することが意図される。FabおよびF（ab'）2フラグメントは、インタクトな抗体
のFcフラグメントを欠損し、より迅速に循環から排除され、インタクトな抗体の
非特異的組織結合をより少なく有し得る（Wahlら、J．Nucl．Med．24:316-325（
1983））。
本発明による抗体は、上記および当該分野で公知の種々の任意の方法によって
、調製され得る。
細胞外ドメインに結合するタンパク質およびその他の化合物もまた、本発明に
よる候補アゴニストおよびアンタゴニストである。このような結合化合物は、酵
母ツーハイブリッドシステムを用いて「捕捉され」得る（FieldsおよびSong，Na
ture 340:245-246（1989））。酵母ツーハイブリッドシステムの改変型は、Roge
r Brentおよび彼の共同研究者らによって記載された（Gyuris，J．ら、Cell 75:
791−803（1993）；Zervos，A.S．ら、Cell 72:223-232（1993））。
「TNF-ファミリーリガンド」によって、TNFレセプターファミリーのメンバー
に結合し、リガンド／レセプターシグナリング経路を誘導し得る、天然に存在す
る、組換え、および合成のリガンドが意図される。TNFリガンドファミリーのメ
ンバーは、TRIDリガンド、TRAIL、TNF-α、リンホトキシン-α（LT-α、TNF-β
としても公知である）、LT-β、FasL、CD40、CD27、CD30、4-IBB、OX40、および
神経成長因子（NGF）を包含するが、これらに限定されない。TRAILを結合するTR
IDの能力に関する実験は以下の実施例５に記載される。
本発明の代表的な治療適用は、下記により詳細に考察される。AIDSを定義する
免疫不全の状態は、CD4+Tリンパ球の数および機能の減少に副次的である。最近
の報告は、CD4+T細胞の日々の減少が、3.5×107および2×109細胞の間であると
評価している（Wei X．ら、Nature 373:117-122（1995））。HIV感染の環境下で
のCD4+T細胞枯渇の１つの原因は、HIV誘導アポトーシスであると考えられている
。事実、HIV誘導アポトーシス細胞死は、インビトロだけでなく、より重要なこ
とに、感染個体でも実証された（Ameisen，J.C.，AIDS 8:1197-1213（1994）；F
inkel，T.H.，およびBanda，N.K.，Curr．Opin．Immunol．6:605-615（1995）；
Muro-Cacho，C.A．ら、J．Immunol．154:5555-5566（1995））。さらに、アポト
ーシスおよびCD4+T-リンパ球枯渇は、AIDSの異なる動物モデルで密接に相関し（
Brunner，T．ら、Nature 373:441-444（1995）；Gougeon，M.L．ら、AIDS Res．
Hum．Retroviruses 9:553-563（1993））、アポトーシスは、ウイルス複製がAID
Sをもたらさないこれらの動物モデルでは認められない（Gougeon，M.L.ら、AIDS
Res．Hum．Retroviruses 9:553-563（1993））。さらなるデータは、HIV感染個
体からの非感染だが感作または活性化されたTリンパ球が、TNF-ファミリーリガ
ンドFasLと遭遇後に、アポトーシスを経ることを示す。HIV感染後に死
をもたらす単球細胞株を使用して、U937細胞のHIVによる感染が、FasLの新規発
現をもたらすこと、およびFasLが、HIV誘導アポトーシスを媒介することが実証
されている(Badley，A.D．ら、J．Virol．70:199-206（1996））。さらに、TNF-
ファミリーリガンドは、非感染マクロファージで検出可能であり、その発現は、
HIV感染後にアップレギュレートされ、非感染CD4 Tリンパ球の選択的殺傷をもた
らした（Badley，A.D．ら、J．Virol．70:199-206（1996））。従って、本発明
によって、HIV+個体を処置するための方法が提供され、この方法は、本発明の可
溶性TRID（例えば、細胞外ドメイン）またはアゴニストを、CD4 Tリンパ球の選
択的殺傷を減少させるために投与することを包含する。投与様式および投与量は
、下記に詳細に考察されている。
同種移植片拒絶では、レシピエント動物の免疫系は、免疫系はほとんどの場合
周囲抗原によってのみ感作されるので、応答するように前もって感作されていな
い。同種のその他のメンバーからの組織は、例えば、ウイルスおよび細菌が提示
されるのと同じようには、提示されていない。同種移植片拒絶の場合、免疫抑制
養生法は、免疫系がエフェクター期に到達することを阻むように設計される。し
かし、異種移植片拒絶の免疫プロフィールは、同種移植片拒絶よりも疾患再発に
より類似し得る。疾患再発の場合、免疫系は、天然の島細胞の破壊によって示さ
れるように、すでに活性化されている。従って、疾患再発では、免疫系はすでに
エフェクター期にある。活性化され、エフェクター細胞へ分化されたリンパ球は
、TNFRポリペプチドを発現するので、本発明のアンタゴニストは、同種移植片お
よび異種移植片の両方に対する免疫応答を抑制し得、そのことによって、TNFR活
性を増強する化合物に感受性である。従って、本発明はさらに、免疫寛容組織を
作製するための方法を提供する。本発明のアゴニストはさらに、炎症性腸疾患の
処置に使用され得る。
処方物
TRIDポリペプチド組成物は、個々の患者の臨床状態（特に、TRIDポリペプチド
単独での処置の副作用）、TRIDポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与
計画、および当業者に公知のその他の要因を考慮して、良好な医療処置と一致し
た様式で処方されて、そして投与される。従って、本明細書での目的のためのTR
IDポリペプチドの「有効量」は、このような考慮によって決定される。
一般的な提案として、用量あたり非経口的に投与されるTRIDポリペプチドの薬
学的に有効な全体量は、患者の体重あたり約1μg/kg/日〜10mg/kg/日の範囲であ
るが、上記に示されているように、これは治療上の裁量を受ける。より好ましく
は、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日、そして最も好ましくは、ヒトに対し
て、ホルモンについて約0.01と1mg/kg/日との間の範囲である。継続的に投与さ
れる場合、TRIDポリペプチドは、代表的には、約1μg/kg/時間〜約50μg/kg/時
間の用量速度で、1日あたり1〜4回注入によって、または、例えば、ミニポンプ
を使用した継続的皮下注入によってのいずれかで投与される。静脈内点滴用バッ
グ溶液もまた使用され得る。変化を観察するのに必要な処置の長さ、および応答
が生じる処置後の間隔は、所望の効果に依存して変化するようである。
本発明のTRIDを含有する薬学的組成物は、経口、直腸内、非経口、槽内（intr
acistemally）、腟内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、液滴、または経皮パッチに
よるように）、口腔に（bucally）、または経口または経鼻スプレーとして、投
与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」によって、非毒性固体、半固体、
または液状充填剤、希釈物、カプセル化材料、または任意型の処方補助剤が意味
される。本明細書で使用されているように、用語「非経口」は、静脈内、筋肉内
、腹腔内、胸骨内（intrasternal）、皮下、および関節内注射および注入を包含
する、投与様式のことである。
TRIDポリペプチドはまた、持続放出システムにより適切に投与される。持続放
出組成物の適切な例は、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル（
mirocapsule））の形態での半透過性ポリマーマトリックスを包含する。持続放
出マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP58,481）、L-グ
ルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー（Sidman，U．ら、Bio
polymers 22:547-556（1983））、ポリ（2−ヒドロキシエチルメタクリレート）
（R．Langerら、J．Biomed．Mater．Res．15:167-277（1981）、およびR．Lange
r，Chem．Tech．12:98-105（1982））、エチレンビニルアセテート（R．Langer
ら、同書）またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）を包含す
る。持続放出TRIDポリペプチド組成物はまた、リポソーム包括TRIDポリペプチド
を包含する。TRIDポリペプチド含有リポソームは、それ自体既知の方法によって
調製される：DE 3,218,121;Epsteinら、Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）82:368
8-3692（1985）；Hwangら、Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）77:4030-4034（198
0）；EP 52,322;EP 36,676;EP 88,046:EP 143,949;EP 142,641;日本特許出願83-
118008;米国特許第4,485,045号および第4,544,545号;および、EP 102,324。一般
的に、リポソームは、脂質含有量が約30モル％コレステロールより多い、小さな
（約200〜800オングストローム）単層型であり、選択される割合は、最適なTNFR
ポリペプチド治療について調整される。
非経口投与については、１つの実施態様で、TRIDポリペプチドは、一般的に、
単位投与量注入形態（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）の所望の純度で薬学
的に受容可能なキャリア（すなわち、使用される投与量および濃度でレシピエン
トに対して非毒性であり、かつ処方物のその他の成分と適合性であるもの）と混
合することにより、処方される。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤、およ
びポリペプチドに対して有害なことが知られているその他の化合物を含有しない
。
一般的に、処方物は、TRIDポリペプチドを均一および密接に、液体キャリアま
たは細分割固体キャリアまたは両方と接触させることによって、調製される。次
いで、必要に応じて、製品は、所望の処方物に成形される。好ましくは、キャリ
アは、非経口キャリアであり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である
溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液
、およびデキストロース溶液を包含する。不揮発性油およびオレイン酸エチルの
ような、非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に、本明細書において有用で
ある。
キャリアは、等張性および化学安定性を増強する物質のような、微量の添加物
を適切に含有する。このような材料は、使用される投与量および濃度でレシピエ
ントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および
その他の有機酸またはその塩類のような、緩衝剤；アスコルビン酸のような、抗
酸化剤；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまた
はトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような、
タンパク質；ポリビニルピロリドンのような、親水性ポリマー；グリシン、グル
タミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのような、アミノ酸；単糖類、二
糖類、およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデ
キストリンを含むその他の炭水化物；EDTAのような、キレート剤；マンニトール
またはソルビトールのような、糖アルコール；ナトリウムのような、対イオン；
および／またはポリソルベート、ポロキサマー（poloxamer）、またはPEGのよう
な、非イオン界面活性剤を包含する。
TRIDポリペプチドは、代表的には、約0.1mg/ml〜100mg/ml、好ましくは1〜10m
g/mlの濃度で、pH約3〜8でこのようなビヒクル中に処方される。特定の前記賦形
剤、キャリア、または安定剤の使用が、TRIDポリペプチド塩の形成をもたらすこ
とは、理解される。
治療投与に使用されるTRIDポリペプチドは、滅菌されなければならない。滅菌
は、滅菌濾過膜（例えば、0.2ミクロン膜）を通す濾過によって、容易に達成さ
れる。治療TRIDポリペプチド組成物は、一般的に、滅菌出入口を有する容器（例
えば、皮下注射針によって刺され得る栓を有する静脈内点滴用溶液バッグまたは
バイアル）へ入れられる。
通常は、TRIDポリペプチドは、単回または多数回投与容器（例えば、密封アン
プルまたはバイアル）中に、水溶液または再構成用の凍結乾燥処方物として、貯
蔵される。凍結乾燥処方物の例として、10mlバイアルは、滅菌濾過された1%（w/
v）TRIDポリペプチド水溶液（５ml）で満たされ、得られた混合物は、凍結乾燥
される。注入溶液は、注射用静菌水を用いて、凍結乾燥TRIDポリペプチドを再構
成することによって、調製される。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた、１つ以
上の容器を含む、薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器と、薬
学的または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって
規定された形式の通知が伴われ得、この通知は、ヒト投与に対する製造、使用ま
たは販売の機関による認可を示す。さらに、本発明のポリペプチドは、その他の
治療化合物と併用して使用され得る。
染色体アッセイ
本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト
染色体における特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダ
イズし得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現
時点では、実際の配列データ（反復多型）に基づく染色体マーカー試薬のほとん
どが、染色体位置をマーカーづけするために利用可能ではない。本発明による染
色体へのDNAのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づ
けることにおいて重要な第一歩である。
この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中で開示されるcD
NAは、TRIDタンパク質遺伝子のゲノムDNAをクローニングするために用いられる
。これは、一般的に市販される、種々の周知の技術およびライブラリーを用いて
達成され得る。次いで、この目的のために周知の技術を用いて、インサイチュ染
色体マッピングのためにゲノムDNAが用られる。
さらに、いくつかの場合において、配列は、cDNAからPCRプライマー（好まし
くは、15〜25bp）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子
の3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムDNAにおいて１つを超え
るエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、従って、増幅プロセスを
複雑化する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細
胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために用いられる。中期染色体の範囲に
対するcDNAクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「FISH」）は
、一工程で、正確な染色体位置を提供するために用いられ得る。この技術は、50
または60bp程度の短さのcDNA由来のプローブと共に用いられ得る。この技術の概
説については、Vermaら、Human Chromosomes:A Manual Of Basic Techniques，P
ergamon Press，New York(1988)を参照のこと。
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例
えば、V．McKusick，Mendelian Inheritance In Man（Johns Hopkins Universit
y，Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である）に見出される。次
いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関連が、連鎖分
析（物理的に隣接した遺伝子の共同遺伝）によって同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間でのcDNAまたはゲノム配列における差異を
決定することが必要である。変異が罹患個体のいくらかまたは全てにおいて認め
られるが、いずれの正常個体でも認められない場合、変異は、疾患の原因因子の
ようである。
本発明に一般的に記載されるように、以下の実施例を参照することにより、本
発明は、より迅速に理解されるが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限
定として意図されない。
実施例
実施例１：E.coliにおけるTRIDの「Hisタグ化」細胞外形態の発現および精製
細菌性発現ベクターpQE9(pD10)を、本実施例の細菌性発現のために使用する（
QIAGEN，Inc.,9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）。pQE9はアンビシリ
ン抗生物質耐性(「Ampr」)をコードし、そして細菌の複製起点(「ori」)、IPTG
誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「RBS」）、QIAGEN Inc．（前出）
から販売されているニッケル-ニトリロ-三酢酸(「Ni-NTA」)アフィニティー樹脂
を用いてアフィニティー精製を可能にする、ヒスチジン残基をコードする６つの
コドン、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、
ポリペプチドをコードする、挿入されたDNAフラグメントが、このペプチドのカ
ルボキシル末端に共有結合した６つのHis残基（すなわち、「６×Hisタグ」）を
有するこのポリペプチドを発現するように、配置される。
TRIDアミノ酸配列の細胞外形態を含むTRIDタンパク質の所望の部分をコードす
るDNA配列は、TRIDタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列、および寄託され
たcDNA中のTRIDタンパク質の細胞外形態の所望の部分のカルボキシル末端配列を
コードする配列にアニーリングするPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
、寄託されたcDNAクローンから増幅される。pQE9ベクターにおけるクローニング
を容易にする制限部位を含むさらなるヌクレオチドは、それぞれ、5'および3'プ
ライマー配列に加えられる。
TRIDタンパク質の細胞外形態をクローニングするために、5'プライマーは、下
線を付したBamHI制限部位、続いて配列番号２の細胞外TRID配列のアミノ末端コ
ード配列の18ヌクレオチドを含む、配列5'CGCGGATCCACCACTGCCCGGCAGGAG3'（配
列番号19）を有する。当然のように、5'プライマーが開始させ、そして３’プラ
ーマーが終了させるタンパク質コード配列の位置は、このタンパク質の細胞外形
態より短いかまたは長い、完全なTRIDタンパク質の任意な所望の部分をコードす
るDNAセグメントを増幅するために変動され得ることを、当業者は理解する。3'
プライマーは、下線を付したXbaI制限部位、続いて図１のTRIDタンパク質の細胞
外ドメインをコードするcDNAの３’末端に相補的な18ヌクレオチドを含む、配列
5'GCGTCTAGACTAGTAATGAGAAGAGGCAGG3'（配列番号20）を有する。
増幅されたTRIDのDNAフラグメントおよびpQE9ベクターは、BamHIおよびXbaIで
消化され、次いで消化されたDNAは、一緒に連結される。制限化されたpQE9ベク
ターへTRIDのDNAを挿入することによって、IPTG誘導性プロモーターの下流およ
び開始AUGおよび6Hisコドンにインフレームに、その関連終止コドンを含むTRID
タンパク質コード領域を配置する。
連結混合物を、Sambrookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual、第２
版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．（1989
）に記載されるような標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coli細胞に形質
転換する。複数のコピーのプラスミドpREP4（これは、lacリプレッサーを発現し
、そしてカナマイシン耐性（「Kanr」）を付与する）を含有するE.coli株M15/re
p4を本明細書中に記載の例示的実施例を行うにあたって使用する。この株（これ
は、TRIDのタンパク質を発現するために適切である多くの株の内の唯一の株であ
る）は、QIAGEN Inc.，（前出）から市販されている。形質転換体を、アンピシ
リンおよびカナマイシンの存在下でLBプレート上で増殖するそれらの能力により
同定する。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングされ
たDNAの同一性を、制限分析、PCRおよびDNA配列決定により確認する。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μg/ml）とカナマイシン
（25μg/ml）の両方を補充したLB培地における液体培養物中で一晩（「O/N」）
増殖させる。O/N培養物を用いて約1:25〜1:250の希釈で大規模培養物に接種する
。細胞を、0.4と0.6との間の、600nmでの光学密度（「OD600」）にまで増殖させ
る。
次いで、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）１mMの最終濃
度で加えて、lacIリプレッサーを不活化することにより、lacリプレッサー感受
性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３時間から４時間の間引き
続きインキュベートする。次いで細胞を遠心分離により採集する。
次いで、細胞をpH8の６Ｍグアニジン-HCl中で、４℃にて３時間から４時間撹
拌する。細胞細片を遠心分離により除去し、そしてTRIDを含む上清をニッケル−
ニトロ−三酢酸（「Ni-NTA」）親和性樹脂カラム（QIAGEN，Inc．（前出）から
入手可能）へ入れる。６×His Tagを有するタンパク質は、高い親和性でNi-NTA
樹脂へ結合し、そして、単純な一工程手順で精製され得る（詳細については、Th
e QIAexpressionist，1995，QIAGEN，Inc.、（前出）を参照のこと）。簡単にい
うと、この上清を10容量のpH8の６Ｍグアニジン-HCl中のカラムへ入れる。この
カラムを、最初に10容量のpH8の６Ｍグアニジン-HClで洗浄し、次いで10容量のp
H6の６Ｍグアニジン-HClで洗浄し、そして最終的に、このTRIDをpH5の６Ｍグア
ニジン-HClで溶出する。
次いで、この精製したタンパク質を、200mM NaClを有するリン酸緩衝化生理食
塩水(PBS)またはpH6の50mM酢酸ナトリウムの緩衝液に対してタンパク質を透析す
ることにより再生する。あるいは、タンパク質をNi-NTAカラムに固定する間に、
首尾良く再び折り畳みさせ得る。推奨する条件は次のようである：プロテアーゼ
インヒビターを含む、500mM NaCl、20％グリセロール、20mMトリス/HCl pH7.4中
で、6M尿素から1M尿素への直線勾配を使用する再生。再生は1.5時間以上の期間
にわたり実施すべきである。再生後、このタンパク質を250mMのイミダゾールの
添加により溶出し得る。イミダゾールを、200mM NaClを有するPBSまたは50mM酢
酸ナトリウム(pH6)緩衝液に対して最終透析工程により除去する。精製したタン
パク質は４℃で保存するかまたは-80℃で凍結する。
実施例２：バキュロウイルス発現系におけるTRIDタンパク質のクローニングおよ
び発現
この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターpA2を用いて、その
天然に関与する分泌シグナル（リーダー）配列を含む、完全なタンパク質をコー
ドするクローニングされたDNAを、成熟TRIDタンパク質を発現するバキュロウイ
ルスに、Summerら、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect
Cell Culture Procedures、Texas Agricultural Experimental Station Bullet
in第1555号(1987)に記載のような標準的な方法を用いて挿入する。この発現ベク
ターは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘド
リンプロモーターを含み、BamHI、XbaI、およびAsp718のような都合良い制限部
位を含む。サルウイルス40（「SV40」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリ
アデニル化のために用いる。組換えウイルスの平易な選択のために、プラスミド
は、同じ方向で、弱いDrosophilaプロモーターの制御下で、E.coli由来のβガラ
クトシダーゼ遺伝子を含み、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグ
ナルを含む。挿入遺伝子は、野生型ウイルスのDNAとの細胞媒介性相同組換えの
ためにウイルス配列の両側に隣接し、クローニングされたポリヌクレオチドを発
現する生存ウイルスを産生する。
当業者に容易に理解されるように、構築物が、必要ならば、シグナルペプチド
およびインフレームAUGを含む、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置され
たシグナルを提供する限り、多くの他のバキュロウイルスベクターを、上記のベ
クター（例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1）の代わりに用い得る。このよ
うなベクターは、例えば、Luckowら、Virology 170:31〜39(1989)に記載される
。
寄託されたクローン中に、全長のTRIDタンパク質をコードするcDNA配列（AUG
開始コドン、および配列番号２に示される天然に関与するリーダー配列を含む）
を、遺伝子の5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマー
を用いて増幅する。TRIDの5'プライマーは、下線を付したXbaI制限酵素部位を含
む、配列5'CGCTCTAGACCGCCATCATGGCCCGGATCCCCAAG3'(配列番号21)を有する。上
記のプライマーは、Kozak，M.，J．Mol．Biol．196:947〜950(1987)に記載のよ
うに、真核生物細胞の翻訳を開始するための効率的なシグナルをコードする。TR
IDの3'プライマーは、下線を付したXbaI制限部位を含む、配列5'GCGTCTAGACTAGT
AATGAGAAGAGGCAGG3'（配列番号22）を有する。
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La
Jolla，Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメ
ントを、上記に特定されるように、用いられるプライマーの各々に適切な制限酵
素で消化する。そして、再度１％アガロースゲル上で精製する。
プラスミドを、同じ制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公知
の日常的な技術を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。
次いで、このDNAを市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca）
を用いて１％アガロースゲルから単離する。
このフラグメントおよび脱リン酸化プラスミドを、一緒に、T4 DNAリガーゼで
連結する。E.coli HB101またはXL-1 Blue（Statagene Cloning Systems，La Jol
la，CA）のような他の適切なE.coli宿主細胞を、連結混合物で形質転換し、そし
て培養プレートに塗布する。すぐ上記で用いられた酵素を使用して個々のコロニ
ー由来のDNAを消化すること、および次いで、ゲル電気泳動により消化産物を分
析することによって、ヒトTNFレセプター遺伝子を有するプラスミドを含む細菌
を同定する。クローニングされたフラグメントの配列を、DNA配列決定によって
確認する。このプラスミドを、本明細書中で、pA2-TRIDと称する。
５μgのプラスミドpA2-TRIDを、FelgnerらProc．Natl．Acad．Sci．USA 84:74
13-7417(1987)によって記載されるリポフェクション法を用いて、1.0μgの市販
の線状化バキュロウイルスDNA（「BaculoGoldTM baculovirus DNA」，Pharminge
n，San Diego，CA.）とともに同時トランスフェクトする。1μgのBaculoGoldTM
ウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpA2-NFRを、50μlの無血清グレース培地（
Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレート
の無菌ウェル中で混合する。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのグレ
ース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。次いで
、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１mlを有する35mm組
織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下する。次い
でプレートを、27℃で５時間インキュベートする。次いで、トランスフェクショ
ン溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグレー
ス昆虫培地を添加する。次いで、27℃で４日間培養を続ける。
４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）に記載されるよう
にプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するgal発現クロー
ンの容易な同定および単離を可能にするために、「Blue Gal」（Life Technolog
ies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いる。（このタイプの「
プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.、Gaithersbu
rg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜
10頁）においても見い出され得る）。適切なインキュベーションの後、青く染色
されたプラークをマイクロピペッターの（例えば、エッペンドルフ）チップで拾
う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含む微小遠
心管中に再懸濁する。そして、組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を用いて、
35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染させる。４日後、これらの培養ディ
ッシュの上清を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。この組換えウイルスを
V-TRIDと称する。
V-TRIDの発現を確認するために、Sf9細胞を、10％熱非働化FBSを補充したグレ
ース培地中で増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「MOI」）で組換えバキ
ュロウイルスV-TRIDを感染させる。放射性標識タンパク質が所望される場合、６
時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900
II培地（Life Technologies Inc.，Rockville，MDから入手可能）に置き換える
。42時間後、５μCiの35Ｓ-メチオニンおよび５μCiの35Ｓ-システイン（Amersh
amから入手可能）を添加する。細胞をさらに16時間インキュベートし、次いで細
胞を遠心分離により収集する。上清中のタンパク質および細胞性のタンパク質を
SDS-PAGE、続いて（放射性標識された場合）オートラジオグラフィーにより分析
する。
精製タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端の微小配列決定を用いて、成熟タ
ンパク質のアミノ末端配列を決定用し得、従って切断点および分泌シグナルペプ
チドの長さを決定し得る。
実施例３：哺乳動物細胞におけるTRIDのクローニングおよび発現
代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（mRNAの転写の開
始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ
リアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハン
サー、Kozak配列、ならびにRNAスプライシングのためのドナー部位およびアクセ
プター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写を、SV40由来
の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復（LTR）（例
えば、RSV、HTLVI、HIVI）ならびにサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモ
ーターを用いて達成し得る。しかし、細胞性エレメント（例えば、ヒトアクチン
プロモーター）もまた使用され得る。本発明の実施における使用に適切な発現ベ
クターとしては、例えば、pSVLおよびpMSG（Pharmacia，Uppsala，Sweden）、pR
SVcat（ATCC 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）、ならびにpBCl2MI（ATCC 67109
）のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒ
トHela293細胞、H9細胞およびJurkat細胞、マウスNIH3T3細胞およびC127細胞、C
os1細胞、Cos7細胞およびCV1細胞、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、ならびにチ
ャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。
あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれたその遺伝子を含む安定な細胞株に
おいて発現され得る。選択マーカー（例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイ
グロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞
の同定および単離を可能にする。
トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされたタンパ
ク質を発現し得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）マーカーは、目的の遺伝
子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。別の
有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（GS）である(Murphyら、Bio
chem J．227:277-279(1991)；Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169-175(1992)
)。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、
そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組み込
まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞およ
びNSO細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（LT
R）（Cullenら、Molecular and Cellular Biology，438-447（1985年３月））お
よびCMVエンハンサーのフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530（1985））
を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、お
よびAsp718を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクター
はさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロン、ポリアデニル化
、および終結シグナルを含む。
実施例3(a)：COS細胞におけるクローニングおよび発現
発現プラスミドpTRID-HAを、TRIDをコードするcDNAを発現ベクターpcDNAI/Amp
またはpcDNAIII（これは、Invitrogen，Inc.から入手し得る）へクローニングす
ることによって作製する。
発現ベクターpcDNAI/ampは以下を含む：(1)E.coliおよび他の原核生物細胞に
おける増殖に有効なE.coli複製起点；(2)プラスミド含有原核生物細胞の選択の
ためのアンピシリン耐性遺伝子；(3)真核生物細胞における増殖のためのSV40複
製起点；(4)CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン；(5)cDNAが都合
良くCMVプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限
部位によってSV40イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結さ
れ得るように配置された、赤血球凝集素フラグメント（すなわち、精製を容易に
するための「HA」タグ）をコードするいくつかのコドン、続いて終止コドン、お
よびポリアデニル化シグナル。HAタグは、Wilsonら、Cell 37:767(1984)によっ
て記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対
応する。標的タンパク質へのHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用
いる、組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。pcDNAIIIはさら
に、ネオマイシン選択マーカーを含む。
TRIDをコードするDNAフラグメントを、組換えタンパク質発現がCMVプロモータ
ーによって導かれるように、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。プ
ラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託されたクローンのTRID cDN
Aを、E.coliにおけるTNFレセプターの発現のためのベクターの構築について先に
記載されるのとほとんど同じように、都合の良い制限部位を含むプライマーを用
いて増幅する。適切なプライマーは、以下の本実施例に使用されたプライマーを
含む。TNFR-5の5'プライマーは、下線を付したEcoRI制限部位を含む、以下の配
列を有する：5'CGCGAATTCCGCCATCATGGCCCGGATCCCCAAG3'（配列番号23）。TNFR-5
の3'プライマーは、下線を付したXbaI制限部位を含む、以下の配列を有する：5'
GCGTCTAGAGTAATGAGAAGAGGCAGG3'（配列番号24）。
PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、XbaIおよびEcoRIで消
化し、次いで連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning Syst
ems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037より入手可能)へ形質
転換し、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性
コロニーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする。
プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてTRIDポリペプチドをコードす
るフラグメントの存在について制限分析または他の手段によって試験する。
組換えTRIDの発現のために、COS細胞を、例えば、Sambrookら，Molecular Clo
ning:a Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，Cold Spring Harb
or，New York(1989)に記載のようにDEAE-DEXTRANを用いて、上記のように発現ベ
クターでトランスフェクトする。細胞を、ベクターによるTRIDの発現のための条
件下でインキュベートする。
pTRID-HA融合タンパク質の発現を、例えば、Harlowら，Antibodies:A Laborat
ory Manual,第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harb
or，New York(1988)に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって
検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、35S-シ
ステインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識する。細胞
および培地を採取し、そして細胞を洗浄し、そしてWilsonら（上記に引用される
）に記載されるように界面活性剤含有RIPA緩衝液：150mM NaCl、１％NP-40、0.1
％SDS、１％NP-40、0.5％DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパク質を、HA
特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次
いで、沈降されたタンパク質を、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによっ
て分析する。期待されるサイズの発現産物は、細胞溶解物において観察され、こ
れはネガティブコントロールにおいては見られない。
実施例3(b)：CHO細胞におけるクローニングおよび発現
ベクターpC4を、TRIDポリペプチドの発現のために使用する。プラスミドpC4は
、
プラスミドpSV2-dhfr（ATCC受託番号37146）の誘導体である。このプラスミドは
、SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラス
ミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムス
ター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培
地（αマイナスMEM、Life Technologies）中で細胞を増殖させることによって選
択され得る。メトトレキサート（MTX）に耐性である細胞におけるDHFR遺伝子の
増幅は、よく考証されている（例えば、Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J
.R.、およびSchimke，R.T.，1978，J．Biol．Chem．253:1357-1370、Hamlin，J.
L.およびMa，C.1990，Biochem．et Biophys．Acta，1097:107-143、Page，M.J.
およびSydenham，M.A.，Biotechnology 9:64-68（1991）を参照のこと）。漸増
濃度のMTXにおける細胞増殖は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的酵素DHFR
を過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第２の遺伝子がDHFR遺伝子
と連鎖する場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝子
のl,000を超えるコピーを有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使用
し得ることは、当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートが取り
除かれると、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む細胞
株が得られる。
プラスミドpC4は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Culle
nら、Molecular and Cellular Biology，5:438-447，(1985)）の長末端反復（LT
R）の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（CMV）（Boshart
ら、Cell41:521-530(1985)）の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラ
グメントを含む。プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にする以下
の単一の制限酵素切断部位が存在する：BamHI、XbaI、およびAsp718。プラスミ
ドは、これらのクローニング部位の後ろに、ラットプレプロインスリン遺伝子の
3'イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーター（例え
ば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーター、または
他のレトロウイルス（例えば、HIVおよびHTLVI）由来の長末端反復）もまた、発
現のために使用され得る。ClontechのTet-OffおよびTet-On遺伝子発現系および
同様の系は、哺乳動物細胞において調節された方法でTRIDレセプターポリペプ
チドを発現するために使用され得る（Gossen，M.，およびBujard，H．1992，Pro
c．Natl．Acad．Sci．USA 89：5547-5551）。mRNAのポリアデニル化のために、
他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）もまた、
使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を含む安定な細胞株もまた、
選択マーカー（例えば、gpt、G418、またはハイグロマイシン）との同時トラン
スフェクションに際して選択され得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例
えば、G418およびメトトレキサート）を使用することが、有利である。
プラスミドpC4を、以下に概説するようにTRIDを増幅するために使用される特
定のプライマーに適切な制限酵素で消化し、次いでウシ腸ホスファターゼ(phosp
hate)を用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベク
ターを、１％アガロースゲルから単離する。
TRIDポリペプチドをコードするDNA配列を、遺伝子の所望の部分の5'および3'
配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。TRIDにつ
いての5'プライマーは、下線を付したXbaI部位を含む以下の配列を有する：
5'CGCTCTAGACCGCCATCATGGCCCGGATCCCCAAG3'（配列番号25）。
TRIDについての3'プライマーは、下線を付したXbaI部位を含む以下の配列を有
する：5'GCGTCTAGACTAGTAATGAGAAGAGGCAGG3'（配列番号26）。
増幅させたフラグメントを、操作された制限部位で切断するエンドヌクレアー
ゼで消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離したフラ
グメントおよび脱リン酸化ベクターをT4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.co
li HB101またはXL-1 Blue細胞を形質転換し、そして例えば制限酵素分析を用い
てプラスミドpC4に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
活性なDHFR遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフ
ェクションのために使用する。５μgの発現プラスミドpC4を、リポフェクチン（
Felgnerら、前出）を用いて、0.5μgのプラスミドpSVneoとともに同時トランス
フェクトする。プラスミドpSV2-neoは、優性選択マーカー（G418を含む一群の抗
生物質に対する耐性を与える酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子）を含む。細
胞を、１mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。２日後、細胞をトリ
プシン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび１mg/
ml G418を補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプレート（Gr
einer，Germany）に播種する。約10〜14日後、単一のクローンをトリプシン処理
し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM
）を用いて、６ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最高濃
度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート
（１μM、２μM、５μM、10mM、20mM）を含む新たな６ウェルプレートに移す。
同じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。
所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによっ
て、または逆相HPLC分析によって分析する。
実施例４：TRID mRNA発現の組織分布
ノーザンブロット分析を、とりわけSambrookら（上記に引用される）によって
記載される方法を用いて行って、ヒト組織におけるTRID遺伝子の発現を調べた。
TRIDタンパク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むcDNAプローブを、re
diprimeTM DNA標識系(Amersham Life Science)を製造者の説明書に従って用いて32
Pで標識した。標識後、プローブを、CHROMA SPIN-100TMカラム（Clontech Lab
oratories，Inc.）を製造者のプロトコル番号PT1200-1に従って用いて精製した
。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をTRID mRNAについ
て調べた。
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（IM）を含むMultiple Tissue No
rthern（MTN）ブロットを、Clontech(Palo Alto，CA)から入手し、そしてExpres
sHybTMハイブリダイゼーション溶液（Clontech）を製造者のプロトコル番号PT11
90-1に従って用いて標識プローブを用いて調べた。ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄後、ブロットをマウントし、そして−70℃にて一晩フィルムに曝した。こ
のフィルムを標準的な手順に従って現像する。TRIDの発現を多くの正常ヒト組織
中（例えば、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、末梢血白血
球(PBL)、リンパ節、骨髄、および胎児肝臓）で検出したが、ｓほとんどの形質
転換癌細胞株では検出しなかった。
TRIDの発現をまた、以下の癌細胞株：HL60（前骨髄球性白血病）、Hela細胞S3
、
K562（慢性骨髄性白血病）、MOLT4（リンパ組織破壊白血病）Raji（バーキット
白血病）SW480（結腸直腸腺がん）、A549（肺癌）、およびG361（黒色腫）にお
けるノーザンブロットにより評価し、そしてTRIDの発現をSW480およびHela細胞S
3においてのみ検出した。
実施例５
TRIDの細胞外ドメインが細胞傷害性リガンドであるTRAILへ結合し、TRAILで誘導
されるアポトーシスを阻止する
上で議論したように、TRAIL/Apo2Lは、腫瘍壊死因子(TNF)リガンドファミリー
に属し、そして多くの形質転換細胞株の迅速な細胞死を誘導するが正常組織では
誘導しない（DR4レセプターを含む死ドメインが両方の細胞型で発現するにもか
かわらず）
細胞傷害性リガンドである。この実施例は、アンタゴニストデコイレセプター（
「細胞内ドメインのないTRAILレセプター」または「TRID」と称する）を同定す
る。このレセプターはまた、TRAILに結合し、そして正常組織の抵抗性表現型を
部分的に説明し得る。すなわち、TRIDアンタゴニストレセプターはTRAILに結合
しそしてTRAILを隔絶させるが、細胞内シグナルを伝達し得ない。
TRIDおよびDR4の細胞外リガンド結合システインリッチドメインの類似性を仮
定して、本発明者らは、TRIDがまたTRAILを結合すると理論づけた。これを確か
にするために、TRIDの可溶性細胞外リガンド結合ドメインを、ヒト免疫グロブリ
ン(IgG)のFc部分との融合体として発現させた。
図５ａに示すように、TRID-Fcは、TRAILを特異的に結合したが、関連する細胞
傷害性リガンドTNFαは結合しなかった。この実験では、TRID、DR5、DR4、また
はTNFRのFc細胞外ドメインおよびこれらに対応するリガンドを調製し、そして結
合アッセイをPanら、Science 276:111(1997)に記載されるように実施した。それ
ぞれのFc融合体をプロテインＧ-Sepharoseとともに沈澱させ，そして共沈した溶
解性リガンドを、抗Flag(Babco)または抗myc-HRP(BMB)を使用して免疫ブロット
により検出した。図５Ａの下方パネルは結合アッセイ中に存在する入力したFc融
合体を示す。
さらに、TRID-Fcは、アポトーシスを誘導する、TRAILの能力をブロックした
（図５Ｂ）。MCF7細胞を等量のFc融合体またはFc単独の存在下で、可溶性TRAIL(
200ng/ml)で処理した。６時間後、細胞を固定し、そしてPanら（前出）に記載さ
れるように試験した。図５Ｂに示されるデータ（平均±SD）は、計数（n=4）し
た全核中のアポトーシス性核のパーセンテージである。
さらに、TRID-Fcは、TNFR-FcがTNFα殺傷を完全に消滅する条件下で、TNFαで
誘導したアポトーシスに効果を有さなかった（図５Ｃ）。MCF7細胞を等量のFc融
合体またはFc単独の存在下で、TNFα(40ng/ml;Genentech，Inc.)とともに処理し
た。核を染色し、そして11時間〜15時間後に試験した。
実施例６
TRIDは、細胞を、TRAIL誘導性アポトーシスから保護する
図６に示されるように、TRIDを発現する細胞は、細胞がウイルスにコードされ
るカスパーゼインヒビターCrmAを発現するので、TRAIL誘導性アポトーシスから
保護される。
細胞内シグナルドメインの非存在を仮定すると、天然のTRIDはそれ自身が、TR
AIL誘導性細胞死を同様に弱毒化し得るようであった。これは、TRAIL感受性細胞
(MCF7)中の天然TRIDの過剰発現が、TRAIL誘導性アポトーシスからその細胞を保
護するかを問うことにより確かにした。TRIDの過剰発現は、それ自体は、アポト
ーシスを誘導しなかった。しかし、細胞をTRAILへ曝露させた場合、TRID発現細
胞は、ウイルスがコードするカスパーゼインヒビターCrmAを発現する細胞が保護
されるのと同程度、TRAIL誘導性アポトーシスから保護された（図６）。
MCF7細胞をTRID発現構築体もしくはCrmA発現構築物またはベクター単独で、b-
Galレポーター構築物とともに、トランスフェクトした。トランスフェクション
の24時間後、50ng/mlおよび100ng/mlのTRAILを添加した。６時間後、細胞を以前
に記載されたように(A.M．Chinnaiyanら、Cell 81，505-12(1995);M.P．Boldin
ら、J Biol Chem 270，7795-8(1995);F.C．Kischkelら、EMBO 14，5579-5588(19
95))、X-galで染色し、そして顕微鏡で試験した。
ひとまとめにして考えると、これらの知見は、正常組織が構成的に発現するTR
AILの潜在的に有毒な効果に耐えることを可能にするTRIDについての保護的役割
と一致している。
TRAILに対するレセプターとしてのアンタゴニストデコイレセプターTRIDの新
しい同定が、TRAILで開始するシグナル伝達の生物学へさらなる複雑さを加える
。
本発明が、前述の説明および実施例に詳細に記載される以外の方法で実施され
得ることは明白である。本発明の多くの改変および変更が、上記の教示を考慮し
て可能であり、それゆえ添付の請求の範囲の範囲内である。
本明細書中に参考として援用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術論文
、実験室マニュアル、書籍、または他の文書を含む）の開示の全体が、これによ
って本明細書によって参考として援用される。
【手続補正書】
【提出日】平成１１年８月３１日（１９９９．８．３１）
【補正内容】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 9/10
9/10 19/08
19/08 25/16
25/16 25/28
25/28 31/12
31/12 35/00
35/00 37/00
37/00 37/06
37/06 43/00 １０５
43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/705
Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28
16/28 Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
5/10 21/08
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 45/00
21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
// Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ
Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ
，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ
，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ
Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ
，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，
ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ
Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ
，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，
ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 ニ，ジアン
アメリカ合衆国 メリーランド 20853,
ロックビル，マノーフィールド ロード
5502
(72)発明者 エブナー，ラインハード
アメリカ合衆国 メリーランド 20878,
ガイザースバーグ，シェルボーン テラス
ナンバー316 9906
(72)発明者 ユ，グォ−リアン
アメリカ合衆国 メリーランド 20878,
ダーネスタウン，ストロー ベイル レー
ン 13524
(72)発明者 ルベン，スティーブン エム.
アメリカ合衆国 メリーランド 20832,
オルニー，ヘリテイジ ヒルズ ドライブ
18528
(72)発明者 ジェンツ，レイナー エル.
アメリカ合衆国 メリーランド 20904,
シルバー スプリング，フェアランド パ
ーク ドライブ 13404
(72)発明者 フェン，ピン
アメリカ合衆国 メリーランド 20878,
ガイザースバーグ，レルダ コート ４