CN100594935C - 免疫特异性结合trail受体的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫特异性结合TRAIL受体TR4的抗体和相关分子，这些抗体在例如预防和治疗癌症和其它增生性病症中有用。本发明还涉及编码抗TR4抗体的核酸分子，含有这些核酸的载体和宿主细胞，以及产生这些材料的方法。本发明涉及用于预防、检测、诊断、治疗或改善疾病或病症、特别是癌症和其它过度增殖性病症的方法和组合物，包括为动物、优选人类施用有效量的一或多种免疫特异性结合TRAIL受体TR4的抗体或其片段或变体或者相关分子。

Description

免疫特异性结合TRAIL受体的抗体
发明领域
本发明涉及免疫特异性结合TRAIL受体TR4的抗体及相关分子。这些抗体具有例如预防和治疗癌症和其它增殖性疾病的用途。本发明还涉及编码抗TR4抗体的核酸分子，含有这些核酸的载体和宿主细胞，及生产它们的方法。本发明涉及用于预防、检测、诊断、治疗或减轻疾病或病变，尤其癌症和其它过度增殖性病变的方法及组合物，包括给予动物优选人有效量的免疫特异性结合TR4的一或多种抗体或其片段或变体或者相关分子。
发明背景
许多生物学功能例如对某些刺激的应答及天然生物学过程，是由一些因子如细胞因子控制的。许多细胞因子通过结合受体并产生细胞内应答而通过受体起作用。
例如，肿瘤坏死因子(TNF)α和β是通过TNF受体起作用的细胞因子，其调节许多生物学过程，包括防止感染及诱导休克和炎性疾病。TNF分子属于“TNF-配体”超家族，并与其受体或反配体即“TNF-受体”超家族一起发挥作用。迄今为止，已经鉴别了TNF-配体超家族的至少18个成员，并且定性了TNF-受体超家族的至少19个成员(见例如Locksley等，细胞(2001)104：487-501)。
在这些配体中，包括TNF-α，淋巴毒素-α(LT-α，也已知为TNF-β)，LT-β(在复合异源三聚体LT-α2-β中发现)，FasL，CD40L，CD27L，CD30L，4-IBBL，OX40L和神经生长因子(NGF)。TNF受体的超家族包括p55TNF受体，p75TNF受体，TNF受体相关蛋白，FAS抗原或APO-1，CD40，CD27，CD30，4-1BB，OX40，低亲和性p75和NGF-受体(Meager，A.，Biologicals 22：291-295(1994))。
TNF配体超家族的许多成员由激活的T细胞表达，提示它们是T细胞与构成细胞个体发育和功能基础的其它类型细胞的相互作用所必需的(Meager，A.，如前)。
从废除这些蛋白质表达的突变体的鉴别和产生中获得了对TNF受体家族一些成员基本功能的相当多的认识。例如，在FSA抗原及其配体中天然存在的突变导致淋巴增殖性疾病(Watanabe-Fukunaga，R.等，自然356：314(1992))，这也许反映了编程性细胞死亡的失败。CD40配体的突变导致X连锁的免疫缺陷状态，其特征在于血浆中高水平免疫球蛋白M和低水平免疫球蛋白G，表明错误的(faulty)T细胞依赖性B细胞激活(Allen，R.C.等，科学259：990(1993))。低亲和性神经生长因子受体的定向突变导致特征在于周围结构的错误的感觉更新的病变(Lee，K.F.等，细胞69：737(1992))。
TNF和LT-α能结合两种TNF受体(55-kd和75-kd TNF受体)。由TNF和LT-α通过其受体作用而激发的大量生物学作用包括移植肿瘤的出血性坏死，胞毒性，在内毒性休克中的作用，炎症，免疫调节，增殖和抗病毒应答，以及抗电离辐射的有害影响的保护作用。TNF和LT-α参与许多疾病的发病机制，包括内毒性休克，脑型疟，肿瘤，自身免疫疾病，AIDS和移植物-宿主排斥(Beutler，B.和Von Huffel，C.，科学264：667-668(1994))。p55受体中的突变导致对微生物感染的易感性增加。
另外，TNFR1(p55)和Fas的C末端附近的一个大约80个氨基酸的结构域被报道为“死亡结构域”，其负责转导编程性细胞死亡的信号(Tartaglia等，细胞74：845(1993))。
编程性细胞死亡是多细胞生物体正常发育和稳态所必需的一种生理学过程(H.Steller，科学267，1445-1449(1995))。编程性细胞死亡的紊乱是一些人体疾病的发病机制，所述疾病包括癌症，神经变性病变及获得性免疫缺陷综合征(C.B.Thompson，科学267，1456-1462(1995))。最近，两种细胞表面死亡受体Fas/APO-1和TNFR-1的信号转导和生物学功能受到许多关注(J.L.Cleveland等，细胞81，479-482(1995)；A.Fraser等，细胞85，781-784(1996)；S.Nagata等，科学267，1449-56(1995))。这两者均是TNF受体家族成员，该家族还包括TNFR-2，低亲和性NGFR，CD40和CD30等(C.A.Smith等，科学248，1019-23(1990)；M.Tewari等，分子和细胞生物学中的标准教材，M.Purton，Heldin，Carl编辑(Chapman和Hall，伦敦1995)。虽然家族成员通过在胞外结构域中存在富半胱氨酸重复而鉴定，但Fas/APO-1和TNFR-1还共享一个胞内同源区域，其合适地被称为“死亡结构域”，其与果蝇自杀基因reaper远缘相关(P.Golstein等，细胞81，185-6(1995)；K.White等，科学264，677-83(1994))。这个共有的死亡结构域提示这两种受体均与直至最近仍未鉴别的一相关系列的信号转导分子相互作用。Fas/APO-1的激活募集含有死亡结构域的衔接(adapter)分子FADD/MORT1(A.M.Chinnaiyan等，细胞81，505-12(1995)；M.P.Boldin等，生物化学杂志270，7795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO 14，5579-5588(1995))，继而结合并可能激活PLICE/MACHI1，PLICE/MACHI1是促进编程性细胞死亡的蛋白酶ICE/CED-3家族的一个成员(M.Muzio等，细胞85，817-827(1996)；M.P.Boldin等，细胞85，803-815(1996))。尽管Fas/APO-1的中心作用是触发细胞死亡，但TNFR-1还可以引发一系列不同生物活性，其中许多活性是基于其激活NF-κB的能力(L.A.Tartaglia等，今日免疫学13，151-3(1992))。因此，TNFR-1募集多价衔接分子TRADD，其类似于FADD，也含有一个死亡结构域(H.Hsu等，细胞81，495-504(1995)；H.Hsu等，细胞84，299-308(1996))。通过其与许多信号分子包括FADD，TRAF2和RIP的缔合，TRADD可以引发编程性细胞死亡和NF-κB激活(H.Hsu等，细胞84，299-308(1996)；H.Hsu等，免疫性4，387-396(1996))。
一种TNF相关的编程性细胞死亡诱导配体已经由一些研究小组报道，并已经命名为编程性细胞死亡诱导分子I(AIM-I)(国际申请No.WO97/33899)及TNF相关编程性细胞死亡诱导配体或称(TRAIL)(Wiley，S.R.等，免疫性3：673-682(1995))。Pitti，R.M.等将这种新分子称为Apo-2配体或(Apo-2L)。为方便起见，本文中称为TRAIL。TRAIL的氨基酸序列示于SEQ ID NO：66。
与转录物似乎大部分限制于激活的T细胞中的FAS配体不同，在许多组织中均可见高水平的TRAIL，并且其由一些细胞系组成型转录。已经示出TRAIL不依赖于FAS配体而起作用(Wiley，S.R.等(1995)，如前)。Marsters，S.A.等的研究已经表明TRAIL迅速激活编程性细胞死亡，其时间框架与FAS/Apo-1L发出的死亡信号相似，但比TNF诱导的编程性细胞死亡快得多(Current Biology 6：750-752(1996))。
已经鉴别了5种TRAIL受体，包括TR4(也称为TRAIL受体1(TRAIL-R1)和死亡受体4(DR4)，Pan等，科学276：111-3(1997)，国际专利申请No.WO98/32856，WO00/67793，WO99/37684，WO2000/34355；WO99/02653，SEQ ID NO：1)；TR7(也称为TRAIL受体2(TRAIL-R2)，DR5和KILLER，Pan等科学277：815-8(1997)，Sheridan等，科学277：818-21(1997)，Chaudhury等，免疫性7：821-30(1997)，国际专利申请No.WO98/46643，WO99/09165，WO99/11791，WO98/41629，WO00/66156和WO98/35986，SEQ IDNO：3)；TR1(也称为Osteoprotegrin(OPG)破骨细胞发生抑制因子(OCIF)，TNFRSF11B和FTHMA-090(国际申请No.WO98/12344，WO2000/54651，WO2001/04137，WO66/26217，WO98/07840，WO2000/21554，WO99/53942和WO2001/03719，SEQ ID NO：5)；TR5(也称为TRAIL受体3(TRAIL-R3)，decoy受体1(DcR1)和TRID)(Degli-Esposti等，J.Exp.Med.186：1165-70(1997)，国际专利申请No.WO98/30693，WO00/71150，WO99/00423，EP867509，WO98/58062，SEQ ID NO：2)；和TR10(也称为TRAIL受体4(TRAIL-R4)，DcR2和TRUNDD，Pan等，FEBS通信424：41-5(1998)，Degli-Eposti等，免疫性7：813-20(1997)，国际专利申请No.WO98/54202，WO00/73321，WO2000/08155，WO99/03992，WO2000/34355和WO9910484，SEQ ID NO：4)。TR4和TR7在其胞质尾区中均含有死亡结构域，这些受体的触发引起编程性细胞死亡。另一方面，TR1，TR5和TR10可以分别抑制由胞毒性配体TRAIL诱导的编程性细胞死亡，部分是由于其不存在胞质死亡结构域或胞质死亡结构域截短所致。上述引用的所有出版物和专利在此均以其全文并入参考，特别是这些文献中所揭示的TRAIL受体的核苷酸和氨基酸序列。
在哺乳动物的生物学过程中，TNF家族配体和TNF家族受体的作用多种多样，并影响许多正常及异常功能。因此明显需要对在正常和病理状态下影响TNF受体生物学活性的组合物如抗体进行鉴别和定性，特别是需要分离和定性调节TRAIL受体生物学活性的抗体。
发明概述
本发明涵盖了免疫特异性结合TR4多肽或TR4多肽片段或TR4变体的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。本发明特别涵盖了免疫特异性结合人TR4多肽如SEQ ID NO：1所示的人TR4多肽或多肽片段或变体的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。在一些实施方案中，本发明的免疫特异性结合TR4多肽的抗体也结合TR7(例如SEQ ID NO：3)，但不结合其它蛋白质，包括TR1，TR5和TR10(SEQ ID NO：5，2和4)。
本发明涉及预防，治疗或减轻一种疾病或病变的方法和组合物，包括给予动物、优选人以有效量的免疫特异性结合TR4或其片段或变体的一或多种抗体或其片段或变体或者相关分子。在特异性实施方案中，本发明涉及预防，治疗或减轻与TR4功能或TR4配体功能或者异常TR4或TR4配体表达相关的疾病或病变的方法和组合物，包括给予动物、优选人以有效量的免疫特异性结合TR4或其片段或变体的一或多种抗体或其片段或变体或者相关分子。在特别优选的实施方案中，本发明涉及基于抗体的方法和组合物，以预防，治疗或减轻癌症及其它过度增殖性病变(例如白血病，癌和淋巴瘤)。可以用本发明抗体治疗，预防或减轻的其它疾病和病变包括但不限于神经变性病变(例如帕金森病，阿耳茨海默氏病和杭廷顿舞蹈病(Huntington，sdisease))，免疫功能失调(例如狼疮，类风湿性关节炎，多发性硬化，重症肌无力，桥本病(Hashimoto’s disease)和免疫缺陷综合征)，炎性疾病(例如哮喘，过敏性病变和类风湿性关节炎)，传染病(例如AIDS，疱疹病毒感染及其它病毒感染)及增殖性疾病。
在特别优选的实施方案中，本发明的抗体用作预防，诊断，预后，治疗或减轻以下类型癌症的方法和组合物中：乳腺癌，肺癌(包括非小细胞肺癌)，结肠癌，尿道癌，膀胱癌，肾癌，胰腺癌，肝癌，胃癌，前列腺癌，白血病，非霍奇金淋巴瘤，食管癌，脑癌，白血病，卵巢癌，睾丸癌，黑素瘤，子宫癌，富颈癌，喉癌，直肠癌，及口腔癌。在特异的实施方案中，本发明的抗体与化疗剂如紫杉醇(Taxol)，irinotecan(Camptosar，CPT-11)，irinotecan类似物及gemcitabine(GEMZARTM)组合施用。
本发明还涵盖了检测，诊断或预后疾病或病变的方法或组合物，包括给予动物、优选人以有效量的免疫特异性结合TR4或其片段或变体的一或多种抗体或其片段或变体或者相关分子。在特异性实施方案中，本发明还涵盖了检测，诊断或预后与TR4功能或TR4配体功能或者异常TR4或TR4配体表达相关的疾病或病变的方法和组合物，包括给予动物、优选人以有效量的免疫特异性结合TR4或其片段或变体的一或多种抗体或其片段或变体或者相关分子。在特别优选的实施方案中，本发明涉及基于抗体的方法和组合物，以检测，诊断或预后癌症及其它过度增殖性病变(例如白血病，癌和淋巴瘤)。可以用本发明抗体检测，诊断或预后的其它疾病和病变包括但非限于神经变性病变(例如帕金森病，阿耳茨海默氏病和杭廷顿舞蹈病)，免疫功能失调(例如狼疮，类风湿性关节炎，多发性硬化，重症肌无力，桥本病和免疫缺陷综合征)，炎性疾病(例如哮喘，过敏性病变和类风湿性关节炎)，传染病(例如AIDS，疱疹病毒感染及其它病毒感染)及增殖性疾病。
本发明的其它实施方案包括本发明抗体作为监测TR4在细胞上表达的诊断工具的应用。
本发明人产生了免疫特异性结合TR4多肽(例如SEQ ID NO：1)的单链Fv(scFv)。因此，本发明涵盖了表1中列举的这些scFv。另外，本发明还涵盖了工程细胞系，其表达相应于这些scFv的抗体，这些细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日如表1所示，ATCC保藏号也示于表1。ATCC位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号，邮编20110-2209。ATCC保藏物是根据国际认可的专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约进行保藏。
另外，本发明涵盖了编码scFv的多核苷酸以及编码scFv的氨基酸序列。本发明还涵盖了免疫特异性结合TR4或其片段或变体的包含或者由这些scFv的片段或变体(例如具有表1所示任一scFv的氨基酸序列的VH结构域，VH CDR，VL结构域或VL CDR)组成的分子，本发明还涵盖了编码这些抗体和/或分子的核酸分子。在特别优选的实施方案中，本发明涵盖了结合TR4或其片段或变体的胞外区域/结构域的抗体或其片段或变体。
本发明还提供了结合TR4多肽的抗体，其偶联于一个可检测标记如酶，荧光标记，发光标记或生物发光标记。本发明还提供了结合TR4多肽的抗体，其偶联于一治疗性或胞毒性制剂。本发明还提供了结合TR4多肽的抗体，其偶联于一种放射性物质。
本发明还提供了结合TR4多肽的抗体，其作为TR4兴奋剂或TR4拮抗剂起作用。在特异性实施方案中，本发明的抗体刺激TR4表达细胞的编程性细胞死亡。在其它特异性实施方案中，本发明的抗体抑制TRAIL结合TR4。在另外的特异性实施方案中，本发明的抗体正调节TR4表达。
本发明还提供了抑制TR4表达细胞的编程性细胞死亡的抗体。在其它特异性实施方案中，本发明的抗体负调节TR4表达。
在另外的实施方案中，本发明的抗体的解离常数(KD)为10-7M或更低。在优选的实施方案中，本发明的抗体的解离常数(KD)为10-9M或更低。
本发明还提供了在相同浓度下比TRAIL多肽刺激TR4表达编程性细胞死亡更好的刺激TR4表达编程性细胞死亡的抗体。
本发明还提供了在有或无抗体交联剂的情况下同样好地刺激TR4表达细胞编程性细胞死亡的抗体；和/或在没有交联抗体或其它交联剂的情况下与相同浓度TRAIL相比以同样或更好的强度刺激编程性细胞死亡的抗体。
在另外的实施方案中，本发明的抗体的解离速率(off rate，Koff)为10-3/秒或更低。在优选的实施方案中，本发明的抗体的解离速率(Koff)为10-4/秒或更低。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体的解离速率(Koff)为10-5/秒或更低。
本发明还提供了相对于它们结合其它蛋白质(包括TR1，TR5和TR10)的能力优先结合TR4和/或TR7的抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体的性质，如以下实施例中所述，使它们成为比先前揭示的TR4结合抗体更好的治疗剂。
本发明还提供了抗体组(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，其中组中成员相应于本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多个不同的抗体(例如完整抗体，Fabs，F(ab’)2片段，Fd片段，二硫键连接的Fvs(sdFvs)，抗独特型(抗Id)抗体和scFv)。本发明还提供了抗体的混合物，其中该混合物相应于本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多个不同的抗体(例如完整抗体，Fabs，F(ab’)2片段，Fd片段，二硫键连接的Fv(sdFv)，抗独特型(抗Id)抗体和scFv))。本发明还提供了包含或由本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多个不同的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)组成的组合物。本发明的组合物可包含或由一或多个抗体或其片段或变体的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多个氨基酸序列组成。或者，本发明的组合物可包含或由编码本发明的一或多个抗体的核酸分子组成。
本发明还提供了融合蛋白，其包含一种本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)和一种异源多肽(即与抗体或抗体结构域不相关的一种多肽)。本发明也涵盖了编码这些融合蛋白的核酸分子。本发明的组合物可包含或由本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多种融合蛋白组成。或者，本发明的组合物可包含或由编码本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多种融合蛋白的核酸分子组成。
本发明还提供了编码本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子如scFv，VH结构域或VL结构域)的一种核酸分子，其通常是分离的。本发明还提供了用本发明的核酸分子转化的一种宿主细胞及其子代。本发明还提供了生产本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)的方法。本发明进一步提供了从核酸分子中表达本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)的一种方法。本发明的这些及其它方面在下文进一步详细描述。
附图简述
图1：示出在Swiss nu/nu小鼠中有或无0.3mg/kg的Topotecan处理下，T1014A04处理对SW480肿瘤生长的作用。
图2：示出在Swiss nu/nu小鼠中有或无0.6mg/kg的Topotecan处理下，T1014A04处理对SW480肿瘤生长的作用。
图3：示出在用或不用Topotecan处理28天后，14G03处理对SW480肿瘤体内生长的作用。
发明详述
定义
本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。由此术语抗体不仅涵盖了完整抗体分子，还涵盖了抗体片段以及抗体及抗体片段的变体(包括衍生物)。在此术语“抗体”描述的分子例如包括但非限于单链Fv(scFv)，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2，二硫键连接的Fv(sdFv)，Fvs，及包含或由VL或YH结构域组成的片段。术语“单链Fv”或“scFv”是指一种多肽，其包含与抗体VH结构域连接的抗体VL结构域。免疫特异性结合TR4的抗体与其它抗原可有交叉反应性。优选地，免疫特异性结合TR4的抗体与其它抗原(例如其它TRAIL受体或肿瘤坏死因子受体超家族的其它成员)不交叉反应。免疫特异性结合TR4的抗体可以例如通过免疫分析或其它本领域已知技术鉴别，例如以下实施例中描述的免疫分析。
本发明的抗体包括但非限于单克隆抗体，多特异性抗体，人抗体或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab’)片段，抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本发明抗体的抗Id抗体)，胞内产生的抗体(即胞内抗体)，及上述任一种抗体的表位结合片段。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA，和IgY)，类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。优选地，本发明的抗体包含或由具有表1所示任一氨基酸序列的VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR、或其片段或变体组成。在一个优选的实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG1同种型。在另一个优选的实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG4同种型。免疫球蛋白可以既具有重链又具有轻链。IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY一系列重链可以与κ或λ形式的轻链成对。
本文所用术语“变体”是指一种多肽，其与TR4多肽、TR4多肽片段、抗TR4抗体或其抗体片段具有相似或相同功能，但不必需包含与TR4多肽、TR4多肽片段、抗TR4抗体或其抗体片段相似或相同的氨基酸序列，或者不是必需具有分别与TR4多肽、TR4多肽片段、抗TR4抗体或其抗体片段相似或相同的结构。具有相似氨基酸序列的变体是指满足以下至少之一项条件的多肽：(a)包含或由一种氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与本文所述的TR4多肽(SEQ ID NO：1)、其片段、抗TR4抗体或其抗体片段(包括具有表1所示任一或多个scFv的氨基酸序列的VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)的氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的相同性；(b)由一种核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列的互补序列在严格条件下与编码本文所述TR4(SEQ ID NO：1)多肽、TR4多肽片段、抗TR4抗体或其抗体片段(包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)的核苷酸序列杂交，所述多肽具有至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少125个、或至少150个氨基酸残基；及(c)由一种核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列与编码本文所述TR4多肽、TR4多肽的片段、抗TR4抗体或其抗体片段(包括具有表1所示任一或多个scFv的氨基酸序列的VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同。与本文所述TR4多肽、TR4多肽的片段、抗TR4抗体或其抗体片段具有相似结构的多肽是指一种多肽，其具有与TR4多肽、TR4多肽的片段、抗TR4抗体或其抗体片段相似的二级、三级或四级结构。多肽的结构可以通过本领域已知方法确定，包括但非限于X射线结晶学，核磁共振，及晶体学电子显微术。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分率，将序列为进行最佳对比目的而排列(例如可以在第一个氨基酸序列或核酸序列中引入一个缺口，以便与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳对比)，随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的一个位置在第二个序列中的相应位置由相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在这个位置是相同的。两个序列之间的相同性百分率是两个序列共享的相同位置数的函数(即％相同性＝相同的重叠位置数/总位置数×100％)。在一个实施方案中，两个序列等长。
确定两个序列之间的相同性百分率可以使用本领域已知的一种数学算法进行。用于对比两个序列的数学算法的一个例子是Karlin和Altschul的算法，美国科学院院报87：2264-2268(1990)，Karlin和Altschul，美国科学院院报90：5873-5877(1993)加以修改。Altschul等，分子生物学杂志215：403-410(1990)的BLASTn和BLASTx程序中已经掺入这个算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTn程序(score＝100，wordlength＝12)进行，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTx程序(score＝50，wordlength＝3)进行，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得进行对比的缺口排列，可以利用Altschul等，核酸研究25：3589-3402(1997)所述的Gapped BLAST程序。或者，可以使用PSI-BLAST以进行反复搜索，其检测分子之间的远缘关系(文献同上)。当利用BLAST，Gapped BLAST和PSI-BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTx和BLASTn)的默认参数(见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
用于序列对比的另一个数学算法例如是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。ALIGN程序(版本2.0)(其是GCG序列对比软件包的一部分)中已经掺入了这个算法。本领域已知的其它序列分析算法包括如Torellis和Robotti，计算机应用生物科学10：3-5(1994)所述的ADVANCE和ADAM；及Pearson和Lipman，美国科学院院报85：2444-8(1988)所述的FASTA。在FASTA中，ktup是设定搜索的灵敏性和速度的一个控制选项。
本文所用术语“衍生物”是指本发明的一种变体多肽，其包含或由TR4多肽、TR4多肽片段或免疫特异性结合TR4多肽的本发明的抗体的一种氨基酸序列组成，所述氨基酸序列已经通过导入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变。本文中术语“衍生物”还指已经例如通过将任何类型分子共价附着于所述多肽而修饰的TR4多肽、TR4多肽片段、免疫特异性结合TR4多肽的抗体。例如但非限制性地，TR4多肽，TR4多肽片段，或抗TR4抗体可以通过例如以下方式修饰：糖基化，乙酰化，PEG化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/阻断基团衍生化，蛋白酶解，与细胞配体或其它蛋白质连接等。TR4多肽、TR4多肽的片段或抗TR4抗体的衍生物可以使用本领域已知技术通过化学修饰加以修饰，包括但非限于特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素代谢合成等。另外，TR4多肽、TR4多肽的片段或抗TR4抗体的衍生物可以含有一或多个非典型氨基酸。多肽衍生物具有与TR4多肽、TR4多肽片段或抗TR4抗体相似或相同的功能。
本文术语“表位”是指在动物、优选哺乳动物中具有抗原性或免疫原性活性的TR4的部分。具有免疫原性活性的表位是激发动物体内的抗体应答的TR4的一部分。具有抗原性活性的表位是通过本领域已知的任何方法、例如通过本文所述免疫分析确定的与抗体免疫特异性结合的TR4的一部分。抗原性表位非必需是免疫原性的。
本文所用术语“片段”是指一种多肽，其包含TR4或抗TR4抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子如scFv)的氨基酸序列的至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个或至少250个氨基酸残基。
本文所用术语“融合蛋白”是指一种多肽，其包含或由本发明的抗TR4抗体的氨基酸序列和一种异源多肽(即与抗体或抗体结构域不相关的多肽)的氨基酸序列组成。
本文所用术语“宿主细胞”是指用一种核酸分子转染的特定细胞及这种细胞的子代或潜在子代。子代与用核酸分子转染的亲代细胞可以不同，因为在随后的传代中可能发生突变或环境影响或者核酸分子整合入宿主细胞基因组中。
本发明的抗体优选以分离形式提供，并优选是基本纯化的。“分离的”是指从其天然环境中分离的一种抗体。因此，例如在重组宿主细胞内产生或包含于重组细胞中的多肽被认为是适合是发明目的而分离的。
抗体结构
已知基本抗体结构单位包含一种四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻链”(大约25kDa)和一个“重链”(大约50-70kDa)。每个链的氨基末端部分包括一个主要负责抗原识别的大约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每个链的羧基末端部分是一个主要负责效应器功能的恒定区。人轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ，δ，γ，α，或ε重链，并由此限定抗体同种型分别为IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。见《基础免疫学》第7章(Paul，W.编辑，第二版，Raven出版社，N.Y.(1989))(以其全文并入参考)。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。
因此，一个完整的IgG抗体有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体之外，这两个结合位点是相同的。
所述链均呈现相同的一般结构，即通过三个高变区结合起来的相对保守的构架区(FR)，也称为互补决定区或CDR。来自每对重链和轻链的CDR通过构架区排列，使其能结合特异性表位。从N末端至C末端，轻链和重链均包含结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸排布符合Kabat，免疫学感兴趣的蛋白质的序列(国立卫生研究院，Bethesda，Md.(1987和1991))，或者Chothia及Lesk，分子生物学杂志196：901-917(1987)；Chothia等，自然342：878-883(1989)的定义。
双特异性或双功能抗体是一种人工杂种抗体，具有两个不同重链/轻链对和两个不同的结合位点。双特异性抗体可以通过许多方法产生，包括杂交瘤融合或Fab’片段的连接，见例如Songsivilai及Lachmann，临床实验免疫学79：315-321(1990)，Kostelny等，免疫学杂志148：1547-1553(1992)。另外，双特异性抗体可以形成为“diabodies”(Holliger等，““diabodies”：小型二价和双特异性抗体片段”，PNAS USA90：6444-6448(1993))或“Janusins”(Traunecker等，“双特异性单链分子(Janusins)定向胞毒性淋巴细胞至HIV感染的细胞上”，EMBO杂志10：3655-3659(1991)及Traunecker等“Janusin：双特异性试剂的新分子设计”，Int J CancerSuppl 7：51-52(1992))。
与生产常规抗体相比，生产双特异性抗体相对费力，而且产量和纯度通常较低。双特异性抗体不以具有单一结合位点的片段形式(例如Fab，Fab’和Fv)存在。
抗TR4抗体
使用噬菌体展示技术，本发明人鉴别了免疫特异性结合TR4(或其片段或变体)的单链抗体分子(scFv)。本发明还涵盖了包含或由这些scFv的片段或变体(例如包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH结构域，VH CDR，VL结构域或VL CDR)组成的分子，以及编码这些scFv和/或分子的核酸分子。
具体地，本发明涉及包含或由选自下表1所示SEQ ID NO：42-53、优选地SEQ ID NO：42和43的一种氨基酸序列组成的scFv。本发明还涵盖了免疫特异性结合TR4的包含或由这些scFv的片段或变体(例如包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH结构域，VH CDR，VL结构域或VL CDR)组成的分子，以及编码这些scFv和/或分子的核酸序列(例如SEQ ID NO：54-65)。
相应于SEQ ID NO：42-53的scFv根据其结合TR4的能力而被选择。
本发明提供了免疫特异性结合TR4多肽或多肽片段的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。本发明特别提供了相应于表1所示scFv的抗体。这些scFv可以通过将例如编码scFv的VH和/或VL结构域的核苷酸序列插入一个含有恒定区序列的表达载体中而常规地“转变”为免疫球蛋白分子，并工程化而指导免疫球蛋白分子表达，如以下实施例5中详细描述。
表达包含本发明scFv的VH和VL结构域的IgG1抗体的NS0细胞系保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日期示于表1，ATCC保藏号也示于表1。ATCC位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，邮编20110-2209。ATCC保藏物是根据国际认可的专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约而保藏。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明scFv的VH和VL结构域的抗体。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是由细胞系NSOαTRAIL 1985BU#81 P：156/21/01表达的抗体(见表1)。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是由细胞系TRAIL(NSO)14G03#39P：147/2/01表达的抗体(见表1)。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是由细胞系NSOanti-TRAIL 14F08#28P：11表达的抗体(见表1)。
Figure C0281490400231
本发明涵盖了免疫特异性结合TR4多肽或其片段、变体或融合蛋白的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。TR4多肽包括但非限于TR4(SEQ ID NO：1)，或者由保藏日为1997年1月21日的ATCC保藏物97853中所含的克隆HCUDS60中的cDNA编码的多肽。在一些实施方案中，本发明的抗体可以免疫特异性结合上述TR4及TR7(SEQ ID NO：3)或由保藏日为1997年3月7日的ATCC保藏物97920中所含的克隆HLYBX88中的cDNA编码的多肽。TRAIL受体可以通过编码SEQ ID NO：1-5多肽(TR4，TR5，TR7，TR10和TR1)的核酸，例如ATCC保藏号97853(TR4)，97798(TR5，于1996年11月20日保藏)，97920(TR7)或209040(TR10，于1997年5月15日保藏)中的cDNA，的重组表达而产生。
在一个实施方案中，相对于结合其它蛋白质包括TR1，TR5，TR7或TR10(SEQ ID NO：5，2，3和4)或其片段、变体或融合蛋白的能力，本发明的抗体优先结合TR4(SEQ ID NO：1)或其片段、变体或融合蛋白(例如融合于Fc结构域的TR4胞外区)。在其它优选的实施方案中，相对于结合其它蛋白质包括TR1，TR5或TR10(SEQ IDNO：5，2和4)或其片段、变体或融合蛋白的能力，本发明的抗体优先结合TR4和TR7(SEQ ID NO：1和3)或其片段、变体或融合蛋白。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合TR1，TR4，TR5，TR7和TR10(SEQ ID NO：5，1，2，3和4)。与结合另一个抗原相比，抗体优先结合一个抗原的能力可使用本领域已知的任何方法确定。
TR4多肽
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽，其片段或变体。以下章节更详细描述了可以由本发明抗体结合的TR4多肽，其片段和变体。可以由本发明抗体结合的TR4多肽，其片段和变体也见于例如国际出版物WO98/32856和WO00/67793所述，在此以其全文并入参考。
在一些实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合TR4多肽。在一些实施方案中，免疫特异性结合TR4多肽的抗体可以结合TR4的片段，变体(包括TR4的直向同源物种，多聚体或修饰形式。例如，对TR4有免疫特异性的抗体可以结合包含全部或部分TR4的一种融合蛋白中的TR4组分。
TR4蛋白可以作为单体或多聚体(即二聚体，三聚体，四聚体和更高的多聚体)形式发现。因此，本发明涉及结合呈单体或多聚体的一部分形式的TR4蛋白的抗体。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4单体，二聚体，三聚体或四聚体。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合含有一或多个TR4多肽的至少二聚体，至少三聚体或至少四聚体。
本发明的抗体可以结合TR4同聚体(homomer)或异聚体(heteromer)。本文所用术语同聚体是指只含有本发明TR4蛋白(包括本文所述TR4片段，变体和融合蛋白)的多聚体。这些同聚体可含有具有相同或不同多肽序列的TR4蛋白质。在一个特异的实施方案中，本发明的同聚体是只含有具有相同多肽序列的TR4蛋白的多聚体。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合含有具有不同多肽序列的TR4蛋白的TR4同聚体。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合一种TR4同源二聚体(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR4蛋白)。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合TR4的至少一个同源二聚体，至少一个同源三聚体或至少一个同源四聚体。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4同源三聚体(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR4蛋白)。
本文所用术语异聚体是指这样的多聚体，其除了含有本发明TR4蛋白之外，还含有异源蛋白(即含有与TR4基因编码的多肽序列不相应的多肽序列的蛋白质)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合一种异源二聚体，异源三聚体或异源四聚体。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合含有一或多个TR4多肽的至少一个同源二聚体，至少一个同源三聚体或至少一个同源四聚体。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合一种TR4异源三聚体(例如分别含有1或2个TR4蛋白及2或1个TR7蛋白)。
由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以是疏水性、亲水性、离子性和/或共价结合的，和/或可以间接通过例如脂质体形成而连接。因此，在一个实施方案中，当TR4蛋白在溶液中互相接触时，会形成由本发明的一或多个抗体结合的多聚体例如同源二聚体或同源三聚体。在另一个实施方案中，当本发明的蛋白质与TR4多肽的抗体(包括抗融合蛋白中的异源多肽序列的抗体)接触时，形成由本发明的一或多个抗体结合的异源多聚体例如异源三聚体或异源四聚体。在其它实施方案中，由本发明的一或多个抗体结合的多聚体通过与本发明TR4蛋白的共价结合和/或在本发明TR4蛋白之间的共价结合而形成。这种共价结合可以涉及所述蛋白质多肽序列(例如SEQ ID NO：1所示多肽序列，或由ATCC保藏物97853的cDNA克隆编码的多肽)中包含的一或多个氨基酸残基。在一个例子中，所述共价结合是位于蛋白质多肽序列内的在天然(即天然存在的)多肽中相互作用的半胱氨酸残基之间的交联。在另一个例子中，所述共价结合是化学或重组操作的结果。或者，这种共价结合可以涉及TR4融合蛋白中异源多肽序列中包含的一或多个氨基酸残基。在一个实施例中，共价结合发生在融合蛋白包含的异源序列之间(见例如美国专利No.5478925)。在一个特异的实施例中，共价结合发生在TR4-Fc融合蛋白(如本文所述)中包含的异源序列之间。在另一个特异的实施例中，融合蛋白的共价结合发生在异源多肽序列之间，所述异源多肽序列来自能形成共价结合的多聚体的另一个TNF家族配体/受体成员，例如oseteoprotegerin(见例如国际出版物No.WO98/49305，在此以其全文并入参考)。
可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的化学方法产生。例如，希望包含于本发明多聚体中的蛋白质可以使用本领域已知的接头分子和接头分子长度优化技术进行化学交联(见例如美国专利No.5478925，在此以其全文并入参考)。另外，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的方法产生，以在位于希望包含于多聚体中的蛋白质多肽序列内的半胱氨酸残基之间形成一或多个分子间交联(见例如美国专利No.5478925，在此以其全文并入参考)。另外，可以由本发明的一或多个抗体结合的蛋白质可以通过将半胱氨酸或生物素加入所述蛋白质多肽序列的C或N末端而常规修饰，而且可以使用本领域已知方法产生含有一或多个这些修饰的蛋白质的多聚体(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。再者，可以使用本领域已知方法产生含有希望包含于可由本发明的一或多抗体结合的多聚体中的蛋白质成分的脂质体(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。
或者，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的基因工程技术产生。在一个实施方案中，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体中包含的蛋白质是使用本文所述的融合蛋白技术或本领域已知其它技术重组产生的(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在一个特异的实施方案中，通过将编码TR4多肽的多核苷酸序列与编码接头多肽的序列连接，然后进一步与一种编码从起始C末端至N末端的反方向的该多肽翻译产物(缺失前导序列)的合成多核苷酸连接，产生编码可以由本发明的一或多个抗体结合的一种同源二聚体的多核苷酸(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在另一个实施方案中，使用本文所述重组技术或本领域已知的其它方法产生重组TR4多肽，其含有一个跨膜结构域并可以通过膜重构技术掺入脂质体中(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在另一个实施方案中，两或多个TR4多肽通过合成接头(例如肽，碳水化合物或可溶聚合物接头)连接。例子包括美国专利No.5073627(在此并入参考)中所述那些肽接头。包含由肽接头分离的多个TR4多肽的蛋白质可以使用常规重组DNA技术产生。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合包含由肽接头分离的多个TR4多肽的蛋白质。
制备多聚体TR4多肽的另一种方法涉及使用融合于亮氨酸拉链或异亮氨酸多肽序列的TR4多肽。亮氨酸拉链结构域和异亮氨酸拉链结构域是促进含有这些结构域的蛋白质多聚体化的多肽。亮氨酸拉链最初在一些DNA结合蛋白质中鉴别(Landschulz等，科学240：1759(1988))，至今已经在许多不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链是天然存在的二聚体化或三聚体化的肽及其衍生物。适于生产可溶多聚体TR4蛋白质的亮氨酸拉链结构域例如是PCT出版物WO94/10308中所述的那些，在此并入参考。将包含与在溶液中二聚体化或三聚体化的肽融合的一种可溶的TR4多肽的重组融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，使用本领域已知技术将所得可溶多聚体化TR4从培养上清中回收。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4-亮氨酸拉链融合蛋白单体和/或TR4-亮氨酸拉链融合蛋白多聚体。
据信蛋白质TNF家族的一些成员以三聚体形式存在(Beutler和Huffel，科学264：667，1994；Banner等，细胞73：431，1993)。因此，三聚体TR4可能提供生物活性增强的优势。优选的亮氨酸拉链组分是优先形成三聚体的那些组分。一个例子是衍生自肺表面活性剂蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链，如Hoppe等(FEBS通讯344：191(1994))，及美国专利申请No.08/446922所述，在此以其全文并入参考。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4-亮氨酸拉链融合蛋白三聚体。
衍生自天然存在的三聚体蛋白质的其它肽可以用于制备三聚体TR4。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4融合蛋白单体和/或TR4融合蛋白三聚体。
结合TR4受体多肽的抗体可以结合分离的或天然存在状态的多肽。“分离多肽”是指从其天然环境中分离的一种多肽。因此本发明中，在重组宿主细胞中产生的和/或包含于重组细胞中的多肽是被认为是分离的。另外，“分离的多肽”也指已经从重组宿主细胞中部分或基本纯化的多肽。例如，一种重组产生的TR4多肽通过一步方法基本纯化，所述方法如Smith和Johnson，基因67：31-40(1988)所述。因此，本发明的抗体可以结合重组产生的TR4受体多肽。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合在一种细胞表面上表达的TR4受体，该细胞包含可操纵地与控制基因表达的调节序列结合的编码SEQ ID NO：1的1-468位氨基酸的一种多核苷酸。
本发明的抗体可以结合包含或由一种氨基酸序列组成的TR4多肽片段，所述氨基酸序列包含于SEQ ID NO：1中，由ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA编码，或者由与ATCC保藏物No.97853中包含的核苷酸序列或其互补链杂交(例如在严格杂交条件下)的核酸编码。蛋白质片段可以是“游离存在的”，或包含于一个较大的多肽中，在该较大的多肽中该片段形成其一部分或一个区域，最优选作为一个单一的连续区域。本发明的抗体可以结合多肽片段，包括例如包含或由大约以下氨基酸残基组成的片段：SEQ ID NO：1的第1-23，24-43，44-63，64-83，84-103，104-123，124-143，144-163，164-183，184-203，204-223，224-238，239-264，265-284，285-304，305-324，325-345，346-366，367-387，388-418，419-439和/或440-468位氨基酸。文中“大约”包括特别指出的数值，比一个端值或两个端值多或少几个(5，4，3，2或1)氨基酸的值。另外，由本发明抗体结合的多肽片段的长度可以是至少大约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，175或200个氨基酸。文中“大约”包括特别指出的数值，比一个端值或两个端值多或少几个(5，4，3，2或1)氨基酸的值。
优选地，本发明的抗体结合选自以下一组的多肽片段：一种包含或由TR4受体胞外结构域(预测组成SEQ ID NO：1的约第24-约第238位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由两个TR4富半胱氨酸结构域(这两个结构域可见于由SEQ ID NO：1的约第131-约第229位氨基酸残基组成的蛋白质片段中)组成的多肽；一种包含或由SEQID NO：1的约第131-约第183位氨基酸残基组成的TR4富半胱氨酸结构域组成的多肽；一种包含或由SEQ ID NO：1的约第184-约第229位氨基酸残基组成的TR4富半胱氨酸结构域组成的多肽；一种包含或由TR4受体跨膜结构域(预测组成SEQ ID NO：1的约第239-约第264位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由预测的成熟TR4多肽的片段组成的多肽，其中所述片段具有TR4功能活性(例如抗原性活性或生物学活性)；一种包含或由TR4受体胞内结构域(预测组成SEQ ID NO：1的约第265-约第468位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由全部或部分缺失跨膜结构域的TR4受体胞外和胞内结构域组成的多肽；一种包含或由TR4受体死亡结构域(预测组成SEQ ID NO：1的约第379-约第422位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由TR4受体蛋白的1，2，3，4或多个携带表位部分组成的多肽。在另外的实施方案中，本发明的多肽片段包含或由上述的1，2，3，4，5，6，7或全部8个成员的任意组合组成。组成TR4受体胞外、跨膜和胞内结构域的氨基酸残基由计算机分析预测。因此，本领域技术人员应意识到组成这些结构域的氨基酸残基基于用于限定每个结构域的标准可以略微变化(例如变化大约1-15个氨基酸残基)。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
据信TR4的一或两个胞外富半胱氨酸基序对TR4与其配体(例如TRAIL)之间的相互作用很重要。因此，在特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由SEQ ID NO：1的第131-183位和/或第184-229位氨基酸残基组成的TR4多肽片段。在另一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由两个胞外富半胱氨酸基序(SEQ ID NO：1的第131-229位氨基酸残基)组成的TR4多肽。在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由TR4的胞外可溶结构域(SEQ ID NO：1的第24-238位氨基酸残基)组成的TR4多肽。在特别优选的实施方案中，结合TR4的全部或部分胞外可溶结构域(例如一或两个富半胱氨酸结构域)的本发明抗体阻止TRAIL配体结合TR4。在其它特别优选的实施方案中，结合TR4的全部或部分胞外可溶结构域(例如一或两个富半胱氨酸结构域)的本发明的抗体诱导表达TR4受体的细胞编程性细胞死亡。
本发明的抗体还可以结合包含或由TR4的结构或功能属性部分组成的片段。这些片段包括包含完整(即全长)TR4的α-螺旋及α-螺旋形成区(“α-区”)，β-折叠及β-折叠形成区(“β-区”)，转角及转角形成区(“转角区”)，卷曲及卷曲形成区(“卷曲区”)，亲水区，疏水区，α两亲区，β两亲区，表面形成区及高抗原指数区(即含有抗原指数高于或等于1.5的4个或更多个连续氨基酸，使用Jameson-Wolf程序的默认参数鉴别)的氨基酸残基。一些优选的区域是表2中所述那些区域，并包括但非限于通过分析SEQ ID NO：1所示氨基酸序列而鉴别的上述类型的区域，这些优选的区域包括：Garnier-Robson预测定的α-区，β-区，转角区及卷曲区；Chou-Fasman预测的α-区，β-区和转角区；Kyte-Doolittle预测的亲水区；Eisenbergα和β两亲区；Emini表面形成区；及Jameson-Wolf高抗原指数区，使用这些计算机程序的默认参数预测。
表2示出的代表如上所述的TR4的结构和功能属性的数据，是使用各种DNA*STAR模块和算法按默认参数产生的。第I列表示对α螺旋区的Garnier-Robson分析结果；第II列表示对α螺旋区的Chou-Fasman分析结果；第III列表示对β折叠区的Garnier-Robson分析结果；第IV列表示对β折叠区的Chou-Fasman分析结果；第V列表示对转角区的Garnier-Robson分析结果；第VI列表示对转角区的Chou-Fasman分析结果；第VII列表示对卷曲区的Garnier-Robson分析结果；第VIII列表示Kyte-Doolittle亲水性图；第IX列表示对α两亲区的Eisenberg分析结果；第X列表示对β两亲区的Eisenberg分析结果；第XI列表示对柔性区的Karplus-Schultz分析结果；第XII列表示Jameson-Wolf抗原指数分值；第XIII列表示Emini表面概率图。
在一个优选的实施方案中，表2中第VIII，XII和XIII列所示数据可以用于确定呈现高度抗原性潜力的TR4区域。通过选择表示在一种抗原识别可能发生在免疫应答的初始过程的环境中很可能暴露于多肽表面的多肽区域的数值，从第VIII，XII和/或XIII列所示数据中确定高抗原性区域。
表2所示上述优选的区域包括但非限于通过分析SEQ ID NO：1所示氨基酸序列而鉴别的上述类型区域。如表2所示，这些优选的区域包括Garnier-Robson α-区，β-区，转角区和卷曲区，Chou-Fasmanα-区，β-区和转角区，Kyte-Doolittle亲水区，Eisenberg α-和β-两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Jameson-Wolf高抗原指数区及Emini表面形成区。由本发明的一或多种抗体结合的优选多肽片段是包含组合若干结构特征(如上述及表2所示的若干(例如1，2，3或4个)相同或不同区域特征)的TR4区域的那些片段。
表2
残基   位置   I    II   III  IV   V    VI   VII  VIII    IX   X    XI   XII     XIII
Met    1      .    .    B    .    .    .    .    0.12    .    .    .    -0.10   0.90
Ala    2      .    .    .    .    .    .    C    -0.08   ＊   ＊   .    0.25    1.08
Pro    3      .    .    .    .    .    .    C    0.42    ＊   ＊   .    0.10    0.86
Pro    4      .    .    .    .    .    T    C    -0.04   ＊   ＊   .    1.05    1.69
Pro    5      A    .    .    .    .    T    .    0.31    .    ＊   F    1.00    1.24
Ala    6      A    .    .    .    .    T    .    0.10    .    ＊   F    1.00    1.10
Arg    7      A    .    .    .    .    T    .    0.34    .    ＊   .    0.10    0.58
Val    8      .    .    B    B    .    .    .    -0.03   .    ＊   .    -0.30   0.37
His    9      .    .    B    B    .    .    .    -0.52   .    ＊   .    -0.30   0.37
Leu    10     .    .    B    B    .    .    .    -1.12   .    ＊   .    -0.60   0.17
Gly    11     .    .    B    B    .    .    .    -1.12   .    ＊   .    -0.60   0.18
Ala    12     .    .    B    B    .    .    .    -2.09   .    ＊   .    -0.60   0.14
Phe    13     .    .    B    B    .    .    .    -1.54   .    ＊   .    -0.60   0.12
Leu    14     .    .    B    B    .    .    .    -1.72   .    .    .    -0.60   0.18
Ala    15     .    .    B    B    .    .    .    -0.91   .    .    .    -0.60   0.27
Val    16     .    .    B    B    .    .    .    -0.78   .    .    .    -0.60   0.51
Thr    17     .    .    B    B    .    .    .    -0.53   .    .    F    -0.45   0.95
Pro    18     .    .    .    B    .    .    C    -0.13   .    .    F    0.05    0.93
Asn    19     .    .    .    .    .    T    C    0.09    .    .    F    0.60    1.69
Pro    20     .    .    .    .    .    T    C    0.09    .    .    F    0.60    1.18
Gly    21     .    .    .    .    T    T    .    0.64    .    .    F    0.65    0.77
Ser    22     .    .    .    .    .    T    C    0.61    .    .    F    0.45    0.64
Ala    23     .    .    .    .    .    .    C    0.51    .    .    F    0.25    0.41
Ala    24     .    .    .    .    .    T    C    0.51    .    .    F    0.45    0.60
Ser    25     .    .    B    .    .    T    .    0.13    .    .    F    0.85    0.78
Gly    26     A    .    .    .    .    T    .    -0.11   .    .    F    0.85    0.78
Thr    27     A    .    .    .    .    T    .    -0.40   .    .    F    0.85    0.78
Glu    28     A    A    .    .    .    .    .    -0.40   .    .    F    0.45    0.58
Ala    29     A    A    .    .    .    .    .    -0.12   .    .    .    0.30    0.60
Ala    30     A    A    .    .    .    .    .    -0.03   .    .    .    0.30    0.60
Ala    31     A    A    .    .    .    .    .    0.01    .    .    .    0.30    0.53
Ala    32     A    A    .    .    .    .    .    0.37    .    .    .    -0.30   0.71
Thr    33     A    .    .    .    .    T    .    -0.49   ＊   .    F    1.00    1.40
Pro    34     A    .    .    .    .    T    .    -0.19   .    .    F    1.00    1.03
Ser    35     .    .    B    .    .    T    .    0.06    .    .    F    0.40    1.07
Lys    36     .    .    B    .    .    T    .    0.34    .    .    F    0.25    0.73
Val    37     .    .    B    B    .    .    .    0.63    .    .    F    -0.15   0.64
Trp    38     .    .    B    B    .    .    .    0.36    .    .    F    -0.15   0.64
Gly    39     .    .    B    B    .    .    .    0.22    ＊   ＊   F    -0.15   0.32
Ser    40     .    .    .    .    .    .    C    0.63    ＊   ＊   F    -0.05   0.43
Ser    41     .    .    .    .    .    T    C    -0.30   ＊   ＊   F    0.45    0.80
Ala    42     .    .    .    .    .    T    C    0.56    ＊   ＊   F    1.05    0.57
Gly    43     .    .    .    .    .    T    C    0.63    ＊   ＊   F    1.35    0.73
Arg    44     .    .    B    .    .    T    .    1.09    ＊   ＊   F    1.49    0.84
Ile    45     .    .    B    .    .    .    .    1.04    ＊   ＊   F    1.78    1.63
Glu    46     .    .    B    .    .    .    .    1.00    ＊   ＊   F    2.12    1.63
Pro    47     .    .    B    .    .    T    .    1.24    ＊   ＊   F    2.51    0.83
Arg    48     .    .    .    .    T    T    .    1.70    ＊   ＊   F    3.40    1.17
Gly    49     .    .    .    .    T    T    .    1.24    ＊   ＊   F    3.06    1.32
Gly    50     .    .    .    .    T    T    .    1.54    ＊   ＊   F    2.57    0.84
表2(续)
残基   位置  I    II   III  IV   V    VI   VII  VIII    IX   X     XI   XII     XIII
Gly    51    .    .    .    .    .    T    C    0.73    ＊   ＊    F    2.03    0.44
Arg    52    .    .    .    .    .    T    C    0.73    ＊   ＊    F    1.39    0.36
Gly    53    .    .    B    .    .    T    .    0.31    ＊   ＊    F    0.85    0.57
Ala    54    .    .    B    .    .    T    .    0.36    .    ＊    F    0.85    0.83
Leu    55    .    .    B    .    .    .    .    0.10    .    ＊    F    0.65    0.57
Pro    56    .    .    B    .    .    .    .    0.10    .    ＊    F    -0.25   0.57
Thr    57    .    .    B    .    .    .    .    -0.01   .    ＊    F    -0.25   0.55
Ser    58    .    .    B    .    .    T    .    0.30    .    .     F    0.10    1.16
Met    59    .    .    B    .    .    T    .    0.54    .    .     F    0.40    1.02
Gly    60    .    .    B    .    .    T    .    1.14    .    .     F    0.25    0.70
Gln    61    .    .    .    .    T    T    .    1.06    .    .     F    0.65    0.81
His    62    .    .    .    .    .    .    C    0.78    .    ＊    F    0.40    1.10
Gly    63    .    .    .    .    .    T    C    1.19    .    ＊    F    0.60    1.12
Pro    64    .    .    .    .    .    T    C    1.20    .    ＊    F    1.20    1.27
Ser    65    .    .    .    .    .    T    C    1.66    .    ＊    F    1.05    0.94
Ala    66    .    .    B    .    .    T    .    1.07    .    ＊    F    1.30    1.86
Arg    67    .    .    B    .    .    .    .    0.76    ＊   ＊    .    1.29    1.22
Ala    68    .    .    B    .    .    .    .    1.21    ＊   ＊    .    1.48    0.90
Arg    69    .    .    B    .    .    T    .    0.83    .    ＊    .    2.17    1.74
Ala    70    .    .    B    .    .    T    .    0.92    .    ＊    F    2.51    0.90
Gly    71    .    .    .    .    T    T    .    1.17    .    ＊    F    3.40    1.37
Arg    72    .    .    .    .    .    T    C    0.84    .    ＊    F    2.71    0.69
Ala    73    .    .    .    .    .    T    C    1.54    ＊   .     F    2.48    1.06
Pro    74    .    .    .    .    .    T    C    1.22    ＊   .     F    2.70    2.10
Gly    75    .    .    .    .    .    T    C    1.22    ＊   .     F    2.62    1.66
Pro    76    .    .    .    .    .    T    C    1.68    ＊   ＊    F    2.24    1.66
Arg    77    .    .    .    .    .    .    C    1.57    ＊   .     F    2.60    2.10
Pro    78    .    A    B    .    .    .    .    1.57    ＊   .     F    1.94    3.68
Ala    79    .    A    B    .    .    .    .    1.48    ＊   .     F    1.68    2.40
Arg    80    .    A    B    .    .    .    .    1.61    ＊   ＊    F    1.42    1.64
Glu    81    .    A    B    .    .    .    .    1.93    ＊   ＊    F    1.16    1.64
Ala    82    A    A    .    .    .    .    .    1.01    ＊   ＊    F    0.90    3.19
Ser    83    A    .    .    .    .    T    .    1.33    ＊   ＊    F    1.30    1.34
Pro    84    A    .    .    .    .    T    .    1.07    ＊   ＊    F    1.30    1.52
Arg    85    A    .    .    .    .    T    .    0.92    ＊   ＊    F    1.00    1.12
Leu    86    A    .    .    .    .    T    .    0.97    .    ＊    .    0.85    1.13
Arg    87    A    .    .    B    .    .    .    1.24    .    ＊    .    0.75    1.46
Val    88    A    .    .    B    .    .    .    0.84    ＊   ＊    .    0.75    1.08
His    89    A    .    .    B    .    .    .    1.10    .    ＊    .    -0.15   1.13
Lys    90    A    .    .    B    .    .    .    0.29    ＊   ＊    F    0.90    1.16
Thr    91    .    .    B    B    .    .    .    0.24    ＊   ＊    F    0.00    1.35
Phe    92    .    .    B    B    .    .    .    -0.72   ＊   ＊    .    -0.30   0.74
Lys    93    .    .    B    B    .    .    .    -0.72   ＊   ＊    .    -0.30   0.27
Phe    94    .    .    B    B    .    .    .    -1.03   ＊   .     .    -0.60   0.14
Val    95    .    .    B    B    .    .    .    -1.93   ＊   .     .    -0.60   0.16
Val    96    .    .    B    B    .    .    .    -2.43   .    ＊    .    -0.60   0.06
Val    97    .    .    B    B    .    .    .    -2.54   .    ＊    .    -0.60   0.06
Gly    98    .    .    B    B    .    .    .    -2.59   .    ＊    .    -0.60   0.06
Val    99    .    .    B    B    .    .    .    -2.74   .    .     .    -0.60   0.15
Leu    100   .    .    B    B    .    .    .    -2.74   ＊   .     .    -0.60   0.15
表2(续)
残基 位置   I    II   III  IV   V    VI   VII  VIII    IX   X    XI   XII     XIII
Leu  101    .    .    B    B    .    .    .    -2.10   ＊   .    .    -0.60   0.11
Gln  102    .    .    B    B    .    .    .    -1.54   ＊   .    .    -0.60   0.23
Val  103    .    .    B    B    .    .    .    -1.50   .    .    .    -0.60   0.37
Val  104    .    .    B    .    .    T    .    -1.23   .    .    .    -0.20   0.61
Pro  105    .    .    B    .    .    T    .    -1.01   ＊   .    F    0.25    0.35
Ser  106    A    .    .    .    .    T    .    -0.51   ＊   .    F    -0.05   0.48
Ser  107    A    .    .    .    .    T    .    -1.40   ＊   ＊   F    0.25    0.94
Ala  108    A    .    .    .    .    .    .    -0.50   .    ＊   F    0.05    0.43
Ala  109    A    .    .    .    .    .    .    -0.46   .    ＊   .    0.50    0.63
Thr  110    A    .    .    .    .    .    .    -0.28   .    ＊   .    -0.10   0.39
Ile  111    A    .    .    .    .    .    .    0.02    .    ＊   .    -0.10   0.53
Lys  112    .    .    B    .    .    .    .    0.32    .    ＊   .    0.50    0.87
Lsu  113    .    .    B    .    .    .    .    0.61    .    ＊   F    1.05    1.04
His  114    .    .    B    .    .    .    .    0.31    .    ＊   F    1.30    1.99
Asp  115    .    .    .    .    .    T    C    0.28    ＊   ＊   F    1.80    0.70
Gln  116    .    .    .    .    T    T    .    0.86    .    ＊   F    1.65    0.84
Ser  117    .    .    .    .    T    T    .    0.81    .    .    F    2.50    0.89
Ile  118    .    .    .    .    T    T    .    1.62    .    .    F    2.25    0.92
Gly  119    .    .    .    .    .    .    C    1.37    .    .    F    1.00    0.92
Thr  120    .    .    .    .    .    .    C    1.37    .    .    F    0.45    0.72
Gln  121    .    .    B    .    .    .    C    1.33    .    .    F    0.65    1.79
Gln  122    .    .    B    .    .    .    .    1.33    .    .    F    0.20    2.46
Trp  123    .    .    B    .    .    .    .    2.01    .    .    .    0.05    2.28
Glu  124    .    .    .    .    .    .    C    1.54    .    .    .    0.25    2.04
His  125    .    .    .    .    .    .    C    1.51    .    .    .    0.10    0.97
Ser  126    .    .    .    .    .    T    C    1.51    .    .    F    0.45    0.91
Pro  127    .    .    .    .    T    T    .    0.70    .    .    F    1.55    0.91
Leu  128    .    .    .    .    T    T    .    0.32    .    .    F    0.65    0.55
Gly  129    .    .    .    .    T    T    .    0.11    .    .    F    0.65    0.22
Glu  130    .    .    .    .    T    .    .    -0.07   .    .    F    0.45    0.22
Leu  131    .    .    B    .    .    .    .    -0.11   ＊   .    .    0.18    0.42
Cys  132    .    .    B    .    .    .    .    -0.20   ＊   .    F    1.21    0.42
Pro  133    .    .    B    .    .    T    .    0.58    ＊   ＊   F    1.69    0.32
Pro  134    .    .    .    .    T    T    .    1.03    .    ＊   F    1.47    0.53
Gly  135    .    .    .    .    T    T    .    0.73    .    ＊   F    2.80    1.94
Ser  136    .    .    .    .    .    T    C    1.54    ＊   .    F    2.32    1.68
His  137    .    .    .    .    .    .    C    2.32    ＊   .    F    2.48    1.88
Arg  138    .    .    B    .    .    .    .    2.32    ＊   .    F    2.34    3.72
Ser  139    .    .    B    .    .    .    .    2.19    ＊   .    F    2.40    4.29
Glu  140    .    .    .    .    T    .    .    1.94    ＊   .    F    2.86    3.12
Arg  141    .    .    .    .    T    T    .    1.58    ＊   .    F    3.40    1.61
Pro  142    .    .    .    .    T    T    .    1.61    .    ＊   F    2.91    0.64
Gly  143    .    .    .    .    T    T    .    1.61    .    ＊   F    2.57    0.60
Ala  144    .    .    .    .    T    T    .    1.24    .    ＊   .    2.08    0.60
Cys  145    .    .    .    .    T    .    .    0.93    .    ＊   .    1.41    0.21
Asn  146    .    .    B    .    .    .    .    0.82    .    ＊   .    0.84    0.30
Arg  147    .    .    B    .    .    .    .    0.69    ＊   .    .    1.01    0.52
Cys  148    .    .    B    .    .    T    .    0.18    ＊   .    F    1.83    0.96
Thr  149    .    .    B    .    .    T    .    0.42    ＊   .    F    1.70    0.44
Glu  150    .    .    B    .    .    T    .    0.84    ＊   .    F    1.53    0.22
表2(续)
残基 位置   I    II   III  IV   V    VI   VII  VIII    IX   X    XI   XII     XIII
Gly  151    .    .    B    .    .    T    .    0.53    ＊   .    F    0.76    0.65
Val  152    .    .    B    B    .    .    .    0.42    .    ＊   F    0.19    0.65
Gly  153    .    .    B    B    .    .    .    0.50    .    .    .    -0.13   0.61
Tyr  154    .    .    B    B    .    .    .    0.51    .    .    .    -0.60   0.62
Thr  155    .    .    B    B    .    .    .    0.51    .    .    F    -0.30   1.12
Asn  156    .    .    .    B    .    .    C    0.86    .    .    F    0.20    1.81
Ala  157    .    .    .    .    T    T    .    0.90    .    .    F    0.80    1.86
Ser  158    .    .    .    .    T    T    .    0.54    .    .    F    0.80    1.06
Asn  159    .    .    .    .    T    T    .    0.20    .    .    F    0.35    0.57
Asn  160    .    .    .    .    T    T    .    -0.16   ＊   .    F    0.35    0.57
Leu  161    .    A    B    .    .    .    .    -0.97   ＊   .    .    -0.60   0.23
Phe  162    .    A    B    .    .    .    .    -0.59   .    .    .    -0.60   0.12
Ala  163    .    A    B    .    .    .    .    -0.96   .    .    .    -0.60   0.11
Cys  164    .    A    B    .    .    .    .    -1.27   ＊   .    .    -0.60   0.07
Leu  165    .    .    B    .    .    T    .    -1.86   .    .    .    -0.20   0.12
Pro  166    .    .    B    .    .    T    .    -1.71   ＊   .    .    -0.20   0.12
Cys  167    .    .    .    .    T    T    .    -0.97   ＊   .    .    0.20    0.12
Thr  168    A    .    .    .    .    T    .    -0.68   .    .    .    0.10    0.30
Ala  169    A    .    .    .    .    .    .    -0.01   .    .    .    0.50    0.26
Cys  170    A    .    .    .    .    T    .    0.80    .    .    .    0.70    0.80
Lys  171    A    .    .    .    .    T    .    1.01    .    .    F    1.15    0.96
Ser  172    A    .    .    .    .    T    .    1.68    .    ＊   F    1.30    1.65
Asp  173    A    .    .    .    .    T    .    2.10    .    ＊   F    1.30    5.33
Glu  174    A    A    .    .    .    .    .    2.39    .    ＊   F    0.90    5.22
Glu  175    A    A    .    .    .    .    .    2.84    .    ＊   F    1.24    5.22
Glu  176    A    A    .    .    .    .    .    2.13    .    ＊   F    1.58    4.83
Arg  177    .    A    .    .    T    .    .    2.12    .    .    F    2.32    1.50
Ser  178    .    .    .    .    .    T    C    1.81    .    .    F    2.86    1.25
Pro  179    .    .    .    .    T    T    .    1.50    ＊   .    F    3.40    1.04
Cys  180    .    .    .    .    T    T    .    1.61    ＊   .    F    2.61    0.77
Thr  181    .    .    .    .    T    T    .    1.61    ＊   .    F    2.67    1.12
Thr  182    .    .    .    .    T    .    .    1.19    ＊   ＊   F    2.38    1.16
Thr  183    .    .    .    .    T    T    .    0.90    .    .    F    2.49    3.13
Arg  184    .    .    .    .    T    T    .    0.44    .    .    F    2.40    2.19
Asn  185    .    .    .    .    T    T    .    1.11    .    .    F    2.50    0.81
Thr  186    .    .    .    .    T    T    .    0.76    ＊   .    F    2.25    0.98
Ala  187    .    .    .    .    T    .    .    1.11    ＊   .    .    1.65    0.27
Cys  188    .    .    .    .    T    .    .    1.21    ＊   .    .    1.40    0.33
Gln  189    .    .    B    .    .    .    .    0.76    ＊   .    .    0.75    0.36
Cys  190    .    .    B    .    .    .    .    0.44    .    .    .    0.50    0.35
Lys  191    .    .    B    .    .    T    .    0.06    .    ＊   F    0.85    0.94
Pro  192    .    .    .    .    T    T    .    0.76    .    .    F    0.65    0.47
Gly  193    .    .    .    .    T    T    .    1.42    .    ＊   F    1.74    1.72
Thr  194    .    .    B    .    .    T    .    1.42    .    ＊   F    1.68    1.38
Phe  195    .    .    B    .    .    .    .    2.09    .    ＊   F    1.82    1.49
Arg  196    .    .    .    .    T    .    .    1.74    .    ＊   F    2.56    2.42
Ash  197    .    .    .    .    T    T    .    1.37    .    ＊   F    3.40    2.25
Asp  198    .    .    .    .    T    T    .    1.71    .    ＊   F    3.06    2.63
Asn  199    .    .    .    .    .    T    C    1.42    .    ＊   F    2.52    2.32
Ser  200    A    .    .    .    .    T    .    1.46    .    ＊   F    1.98    1.43
表2(续)
残基   位置   I    II   III  IV  V    VI    VII  VIII    IX   X    XI   XII     XIII
Ala    201    A    .    .    .    .    .    .    1.46    .    ＊   .    1.14    0.46
Glu    202    A    .    .    .    .    .    .    1.50    ＊   .    .    0.80    0.56
Met    203    A    .    .    .    .    .    .    0.83    ＊   .    .    1.11    0.83
Cys    204    A    .    .    .    .    T    .    0.53    ＊   .    .    1.62    0.44
Arg    205    .    .    .    .    T    T    .    0.52    ＊   .    .    2.33    0.34
Lys    206    .    .    .    .    T    T    .    0.77    ＊   .    F    2.49    0.50
Cys    207    .    .    .    .    T    T    .    0.10    ＊   .    F    3.10    0.92
Ser    208    .    .    .    .    T    .    .    0.49    ＊   ＊   F    2.59    0.25
Thr    209    .    .    .    .    T    .    .    1.27    ＊   ＊   F    1.98    0.19
Gly    210    .    .    .    .    T    .    .    0.81    ＊   .    F    1.67    0.71
Cys    211    .    .    B    .    .    T    .    0.17    ＊   ＊   F    1.16    0.53
Pro    212    .    .    .    .    T    T    .    -0.02   ＊   ＊   F    1.25    0.36
Arg    213    .    .    .    .    T    T    .    0.32    ＊   ＊   F    0.65    0.27
Gly    214    .    .    B    .    .    T    .    -0.22   ＊   ＊   .    0.85    1.01
Met    215    .    .    B    B    .    .    .    0.17    ＊   ＊   .    0.30    0.48
Val    216    .    .    B    B    .    .    .    0.83    ＊   ＊   .    0.79    0.49
Lys    217    .    .    B    B    .    .    .    0.38    ＊   ＊   .    0.98    0.83
Val    218    .    .    B    B    .    .    .    -0.04   ＊   ＊   F    1.32    0.45
Lys    219    .    .    B    B    .    .    .    0.09    .    ＊   F    1.51    0.88
Asp    220    .    .    B    .    .    .    .    0.40    .    ＊   F    1.90    0.68
Cys    221    .    .    B    .    .    .    .    0.96    .    ＊   F    0.81    0.96
Thr    222    .    .    .    .    .    T    C    0.91    .    ＊   F    1.62    0.65
Pro    223    .    .    .    .    T    T    .    0.88    .    ＊   F    1.63    0.65
Trp    224    .    .    .    .    T    T    .    0.83    .    ＊   F    0.54    0.84
Ser    225    A    .    .    .    .    T    .    0.17    .    .    F    1.00    1.01
Asp    226    A    A    .    .    .    .    .    -0.02   .    .    F    0.45    0.35
Ile    227    A    A    .    .    .    .    .    0.26    ＊   .    .    -0.30   0.25
Glu    228    A    A    .    .    .    .    .    0.51    ＊   .    .    0.30    0.25
Cys    229    .    A    B    .    .    .    .    0.80    ＊   .    .    0.60    0.30
Val    230    A    A    .    .    .    .    .    0.80    ＊   ＊   .    0.60    0.74
His    231    A    A    .    .    .    .    .    0.46    ＊   ＊   .    0.60    0.58
Lys    232    A    A    .    .    .    .    .    1.34    ＊   .    F    0.60    1.06
Glu    233    .    A    .    .    T    .    .    1.00    ＊   .    F    1.30    2.30
Ser    234    .    .    .    .    T    T    .    1.63    ＊   .    F    1.70    1.68
Gly    235    .    .    .    .    T    T    .    2.49    ＊   .    F    1.70    1.14
Asn    236    .    .    .    .    T    T    .    1.63    ＊   .    F    1.40    1.06
Gly    237    .    .    .    .    .    T    C    1.30    ＊   .    F    0.45    0.55
His    238    .    .    .    B    .    .    C    0.44    .    .    .    -0.40   0.59
Asn    239    .    .    .    B    .    .    C    -0.14   .    .    .    -0.40   0.27
Ile    240    .    .    B    B    .    .    .    -0.61   .    .    .    -0.60   0.19
Trp    241    .    .    B    B    .    .    .    -1.47   .    .    .    -0.60   0.12
Val    242    .    .    B    B    .    .    .    -1.98   .    .    .    -0.60   0.05
Ile    243    .    .    B    B    .    .    .    -2.26   .    .    .    -0.60   0.06
Leu    244    .    .    B    B    .    .    .    -3.07   .    .    .    -0.60   0.08
Val    245    .    .    B    B    .    .    .    -3.03   .    .    .    -0.60   0.09
Val    246    .    .    B    B    .    .    .    -3.60   .    .    .    -0.60   0.09
Thr    247    .    .    B    B    .    .    .    -2.96   .    .    .    -0.60   0.08
Leu    248    .    .    B    B    .    .    .    -2.88   .    .    .    -0.60   0.17
Val    249    .    .    B    B    .    .    .    -2.88   .    ＊   .    -0.60   0.19
Val    250    .    .    B    B    .    .    .    -2.83   .    .    .    -0.60   0.11
表2(续)
残基 位置   I    II   III  IV   V    VI   VII  VIII    IX   X    XI   XII     XIII
Pro  251    .    .    B    B    .    .    .    -2.83   .    .    .    -0.60   0.11
Leu  252    .    .    B    B    .    .    .    -3.11   .    .    .    -0.60   0.11
Leu  253    A    .    .    B    .    .    .    -3.16   .    .    .    -0.60   0.15
Leu  254    A    .    .    B    .    .    .    -3.11   .    .    .    -0.60   0.07
Val  255    A    .    .    B    .    .    .    -3.14   .    .    .    -0.60   0.07
Ala  256    A    .    .    B    .    .    .    -3.79   .    .    .    -0.60   0.06
Val  257    .    .    B    B    .    .    .    -3.64   .    .    .    -0.60   0.05
Leu  258    .    .    B    B    .    .    .    -3.50   .    .    .    -0.60   0.04
Ile  259    .    .    B    B    .    .    .    -3.36   .    .    .    -0.60   0.02
Val  260    .    .    B    B    .    .    .    -3.39   .    .    .    -0.60   0.02
Cys  261    .    .    B    B    .    .    .    -3.14   .    .    .    -0.60   0.01
Cys  262    .    .    B    B    .    .    .    -2.59   .    .    .    -0.60   0.02
Cys  263    .    .    B    B    .    .    .    -2.12   .    .    .    -0.60   0.03
Ile  264    .    .    B    B    .    .    .    -1.90   .    .    .    -0.60   0.06
Gly  265    .    .    .    .    T    T    .    -1.39   .    .    F    0.35    0.06
Ser  266    .    .    .    .    T    T    .    -1.07   .    .    F    0.35    0.11
Gly  267    .    .    .    .    T    T    .    -0.40   .    .    F    0.65    0.16
Cys  268    .    .    .    .    T    T    .    0.06    .    .    F    1.25    0.27
Gly  269    .    .    .    .    T    .    .    0.99    .    ＊   F    1.39    0.31
Gly  270    .    .    .    .    T    .    .    0.67    .    .    F    2.03    0.62
Asp  271    .    .    .    .    .    T    C    0.37    .    .    F    2.37    0.62
Pro  272    .    .    .    .    T    T    .    0.71    ＊   ＊   F    2.91    0.62
Lys  273    .    .    .    .    T    T    .    1.49    ＊   ＊   F    3.40    1.05
Cys  274    .    .    B    .    .    T    .    0.98    ＊   ＊   .    2.51    1.23
Met  275    .    .    B    B    .    .    .    0.66    ＊   ＊   .    1.62    0.59
Asp  276    .    .    B    B    .    .    .    -0.04   ＊   ＊   .    1.28    0.16
Arg  277    .    .    B    B    .    .    .    -0.12   .    ＊   .    0.04    0.26
Val  278    .    .    B    B    .    .    .    -0.06   .    ＊   .    -0.60   0.27
Cys  279    .    .    B    B    .    .    .    -0.20   .    .    .    0.30    0.32
Phe  280    .    .    B    B    .    .    .    0.06    .    ＊   .    -0.60   0.13
Trp  281    .    .    B    B    .    .    .    -0.76   .    .    .    -0.60   0.18
Arg  282    .    .    B    B    .    .    .    -1.68   .    .    .    -0.60   0.28
Leu  283    .    .    B    B    .    .    .    -0.71   .    .    .    -0.60   0.26
Gly  284    .    .    .    B    T    .    .    -0.39   .    ＊   .    -0.20   0.49
Leu  285    .    .    .    B    .    .    C    0.10    .    ＊   .    0.50    0.25
Leu  286    .    .    .    B    .    .    C    0.C4    .    ＊   .    0.20    0.46
Arg  287    .    .    .    B    .    .    C    -0.66   .    .    F    0.65    0.46
Gly  288    .    .    .    .    .    T    C    0.16    .    .    F    1.35    0.57
Pro  289    .    .    .    .    .    T    C    0.50    .    ＊   F    2.70    1.19
Gly  290    .    .    .    .    .    T    C    1.31    ＊   ＊   F    3.00    1.01
Ala  291    A    .    .    .    .    T    .    1.53    .    ＊   F    2.50    1.65
Glu  292    A    .    .    .    .    .    .    1.39    .    .    F    2.00    1.08
Asp  293    A    .    .    .    .    .    .    1.73    .    .    F    1.70    1.48
Asn  294    A    .    .    .    .    T    .    1.94    .    ＊   .    1.45    2.36
Ala  295    A    .    .    .    .    T    .    1.40    .    .    .    1.15    2.36
His  296    A    .    .    .    .    T    .    1.18    ＊   .    .    1.00    0.99
Asn  297    A    .    .    .    .    T    .    0.88    .    .    .    0.10    0.51
Glu  298    A    .    .    .    .    .    .    0.88    ＊   .    .    -0.10   0.67
Ile  299    A    .    .    .    .    .    .    0.29    ＊   ＊   .    -0.10   0.80
Leu  300    A    .    .    .    .    .    .    0.88    ＊   ＊   .    -0.10   0.50
表2(续)
残基   位置   I    II   III  IV  V    VI    VII  VIII    IX   X     XI   XII     XIII
Ser    301    A    .    .    .    .    .    .    0.61    ＊   .     F    0.65    0.48
Asn    302    A    .    .    .    .    T    .    -0.20   ＊   .     F    0.25    0.92
Ala    303    A    .    .    .    .    T    .    -0.50   ＊   .     F    0.25    0.92
Asp    304    A    .    .    .    .    T    .    0.08    ＊   .     F    0.85    0.92
Ser    305    .    .    .    .    .    T    C    0.19    ＊   .     F    1.05    0.83
Leu    306    .    .    .    B    .    .    C    -0.37   ＊   .     F    0.05    0.71
Ser    307    .    .    B    B    .    .    .    -0.67   ＊   .     F    -0.15   0.31
Thr    308    .    .    B    B    .    .    .    -0.08   ＊   .     .    -0.60   0.31
Phe    309    .    .    B    B    .    .    .    -0.08   ＊   .     .    -0.30   0.66
Val    310    A    .    .    B    .    .    .    0.22    .    .     F    -0.15   0.85
Ser    311    A    A    .    .    .    .    .    0.43    .    .     F    0.00    1.03
Glu    312    A    A    .    .    .    .    .    0.73    .    .     F    0.00    1.17
Gln    313    A    A    .    .    .    .    .    0.74    .    .     F    0.90    2.73
Gln    314    A    A    .    .    .    .    .    1.44    .    .     F    0.90    2.73
Met    315    A    A    .    .    .    .    .    2.30    .    .     F    0.90    2.73
Glu    316    A    A    .    .    .    .    .    2.39    .    .     F    0.90    2.73
Ser    317    A    A    .    .    .    .    .    1.80    .    ＊    F    0.90    2.44
Gln    318    A    A    .    .    .    .    .    1.80    .    ＊    F    0.90    2.49
Glu    319    A    A    .    .    .    .    .    0.99    .    ＊    F    0.90    2.40
Pro    320    A    A    .    .    .    .    .    1.28    .    ＊    F    0.90    1.48
Ala    321    A    A    .    .    .    .    .    0.93    .    .     F    0.60    1.23
Asp    322    A    A    .    B    .    .    .    0.38    .    .     F    0.45    0.70
Leu    323    A    A    .    B    .    .    .    0.07    .    .     F    -0.15   0.34
Thr    324    .    A    B    B    .    .    .    -0.79   .    .     F    -0.15   0.48
Gly    325    .    A    B    B    .    .    .    -0.58   .    .     .    -0.30   0.21
Val    326    .    .    B    B    .    .    .    -0.29   .    .     .    -0.60   0.45
Thr    327    .    .    B    B    .    .    .    -0.50   .    .     .    -0.60   0.42
Val    328    .    .    B    B    .    .    .    -0.03   .    ＊    F    -0.17   0.65
Gln    329    .    .    B    B    .    .    .    0.28    .    ＊    F    0.11    0.87
Ser    330    .    .    .    .    .    T    C    0.03    .    ＊    F    2.04    1.05
Pro    331    .    .    .    .    .    T    C    0.89    .    ＊    F    2.32    1.42
Gly    332    .    .    .    .    T    T    .    0.53    .    ＊    F    2.80    1.42
Glu    333    A    .    .    .    .    T    .    0.58    .    ＊    F    1.97    0.57
Ala    334    .    .    B    .    .    .    .    -0.23   .    ＊    .    0.74    0.30
Gln    335    .    .    B    .    .    .    .    -0.28   .    .     .    0.46    0.25
Cys    336    .    .    B    .    .    .    .    -0.28   .    .     .    0.18    0.14
Leu    337    .    .    B    .    .    .    .    -0.52   .    ＊    .    -0.40   0.22
Leu    338    .    .    B    .    .    .    .    -0.52   .    ＊    .    -0.40   0.13
Gly    339    .    A    .    .    .    .    C    -0.52   .    ＊    F    0.05    0.42
Pro    340    A    A    .    .    .    .    .    -0.52   .    ＊    F    -0.15   0.51
Ala    341    A    A    .    .    .    .    .    -0.20   .    ＊    F    0.60    1.07
Glu    342    A    A    .    .    .    .    .    0.31    .    ＊    F    0.90    1.07
Ala    343    A    A    .    .    .    .    .    1.12    ＊   ＊    F    0.75    0.93
Glu    344    A    A    .    .    .    .    .    1.58    .    ＊    F    0.90    1.60
Gly    345    A    A    .    .    .    .    .    1.90    .    ＊    F    0.90    1.80
Ser    346    A    .    .    .    .    T    .    2.60    .    ＊    F    1.30    3.50
Gln    347    A    .    .    .    .    T    .    1.79    .    ＊    F    1.30    3.96
Arg    348    A    .    .    .    .    T    .    1.57    .    ＊    F    1.30    3.30
Arg    349    .    .    B    .    .    T    .    0.71    .    ＊    F    1.30    2.03
Arg    350    .    .    B    B    .    .    .    0.84    .    ＊    F    0.75    0.87
表2(续)
残基   位置   I    II   III  IV   V    VI  VII   VIII    IX   X    XI   XII     XIII
Leu    351    .    .    B    B    .    .    .    0.56    .    ＊   .    0.60    0.69
Leu    352    .    .    B    B    .    .    .    0.56    .    ＊   .    0.30    0.35
Val    353    .    .    B    B    .    .    .    0.10    ＊   ＊   .    -0.30   0.29
Pro    354    .    .    B    .    .    T    .    -0.60   ＊   .    .    -0.20   0.35
Ala    355    .    .    .    .    T    T    .    -0.71   .    ＊   .    0.50    0.43
Asn    356    .    .    .    .    .    T    C    -0.11   .    .    F    1.65    0.96
Gly    357    .    .    .    .    .    T    C    0.39    .    .    F    1.95    0.96
Ala    358    .    .    .    .    .    .    C    1.24    .    .    F    2.20    1.37
Asp    359    .    .    .    .    .    T    C    1.14    .    .    F    3.00    1.48
Pro    360    A    .    .    .    .    T    .    0.92    ＊   .    F    2.50    2.16
Thr    361    A    .    .    .    .    T    .    0.32    .    .    F    1.90    1.76
Glu    362    A    .    .    .    .    T    .    -0.14   .    .    F    1.60    1.04
Thr    363    A    .    .    B    .    .    .    -0.26   .    .    F    0.15    0.56
Leu    364    A    .    .    B    .    .    .    -0.96   ＊   .    .    -0.60   0.33
Met    365    A    .    .    B    .    .    .    -0.74   ＊   .    .    -0.60   0.17
Leu    366    A    .    .    B    .    .    .    -0.39   ＊   .    .    -0.60   0.19
Phe    367    A    .    .    B    .    .    .    -1.09   ＊   .    .    -0.60   0.47
Phe    368    A    .    .    B    .    .    .    -1.37   ＊   .    .    -0.60   0.41
Asp    369    A    .    .    B    .    .    .    -0.56   ＊   .    .    -0.60   0.50
Lys    370    A    A    .    .    .    .    .    -0.84   ＊   .    .    -0.30   0.93
Phe    371    A    A    .    B    .    .    .    -0.39   ＊   .    .    -0.30   0.75
Ala    372    A    A    .    B    .    .    .    -0.40   ＊   .    .    -0.30   0.34
Asn    373    .    A    B    B    .    .    .    -0.40   ＊   .    .    -0.60   0.26
Ile    374    .    A    B    B    .    .    .    -0.40   ＊   .    .    -0.60   0.26
Val    375    .    A    B    B    .    .    .    -0.74   .    .    .    -0.60   0.43
Pro    376    .    A    .    B    .    .    C    -0.33   .    .    .    -0.10   0.36
Phe    377    .    .    .    .    T    T    .    0.25    .    .    .    0.20    0.54
Asp    378    .    .    .    .    T    T    .    0.26    .    .    F    0.80    1.21
Ser    379    .    .    .    .    T    T    .    0.33    .    .    F    1.40    1.35
Trp    380    A    .    .    .    .    T    .    0.59    ＊   ＊   F    0.40    1.29
Asp    381    A    A    .    .    .    .    .    0.91    ＊   .    F    -0.15   0.76
Gln    382    A    A    .    .    .    .    .    1.61    ＊   .    .    -0.15   1.11
Leu    383    A    A    .    .    .    .    .    0.80    ＊   .    .    -0.15   1.84
Met    384    A    A    .    .    .    .    .    1.10    ＊   .    .    0.30    0.91
Arg    385    A    A    .    .    .    .    .    0.58    ＊   .    .    0.30    0.87
Gln    386    A    A    .    .    .    .    .    0.27    ＊   .    .    -0.30   0.87
Leu    387    A    A    .    .    .    .    .    0.31    ＊   .    .    0.45    1.27
Asp    388    A    A    .    .    .    .    .    1.12    ＊   .    .    0.75    1.30
Leu    389    A    A    .    .    .    .    .    1.72    ＊   .    F    0.60    1.21
Thr    390    A    .    .    .    .    T    .    0.72    ＊   .    F    1.30    2.54
Lys    391    A    .    .    .    .    T    .    0.72    .    ＊   F    1.30    1.07
Asn    392    A    .    .    .    .    T    .    0.68    ＊   ＊   F    1.30    2.16
Glu    393    A    .    .    .    .    T    .    -0.18   ＊   .    F    1.30    1.11
Ile    394    .    .    B    B    .    .    .    0.74    ＊   .    F    0.75    0.41
Asp    395    .    .    B    B    .    .    .    0.47    ＊   ＊   .    0.60    0.50
Val    396    .    .    B    B    .    .    .    0.08    ＊   ＊   .    0.60    0.29
Val    397    .    .    B    B    .    .    .    -0.23   .    .    .    0.51    0.41
Arg    398    .    .    B    .    .    T    .    -0.82   ＊   .    .    1.12    0.36
Ala    399    .    .    B    .    .    T    .    -0.28   ＊   .    .    0.73    0.49
Gly    400    .    .    .    .    T    T    .    -0.49   ＊   .    F    2.09    0.65
表2(续)
残基   位置   I    II   III  IV   V    VI   VII  VIII    IX   X      XI   XII     XIII
Thr    401    .    .    .    .    .    T    C    0.02    ＊   ＊     F    2.L0    0.51
Ala    402    .    .    .    .    .    .    C    0.88    ＊   ＊     F    1.09    0.50
Gly    403    .    .    .    .    .    T    C    0.18    ＊   ＊     F    1.68    0.85
Pro    404    .    .    .    .    .    T    C    -0.04   .     .     F    1.47    0.59
Gly    405    .    .    .    .    .    T    C    0.06    .     .     F    1.26    0.48
Asp    406    A    .    .    .    .    T    .    -0.22   .     .     F    0.25    0.76
Ala    407    A    A    .    .    .    .    .    -0.23   .     .     .    -0.30   0.50
Leu    408    A    A    .    .    .    .    .    -0.70   .     .     .    -0.60   0.50
Tyr    409    A    A    .    .    .    .    .    -1.09   ＊    .     .    -0.60   0.25
Ala    410    A    A    .    .    .    .    .    -0.70   ＊    .     .    -0.60   0.24
Met    411    A    A    .    .    .    .    .    -0.99   ＊    .     .    -0.60   0.59
Leu    412    A    A    .    .    .    .    .    -1.26   ＊    .     .    -0.60   0.39
Met    413    A    A    .    .    .    .    .    -0.44   ＊    .     .    -0.60   0.29
Lys    414    A    A    .    B    .    .    .    -0.16   ＊    .     .    -0.60   0.47
Trp    415    A    A    .    B    .    .    .    0.12    ＊    .     .    0.15    1.14
Val    416    A    A    .    B    .    .    .    0.38    ＊    ＊    .    0.45    1.66
Asn    417    A    .    .    .    .    T    .    1.30    ＊    .     F    1.75    0.82
Lys    418    A    .    .    .    .    T    .    1.90    ＊    .     F    2.20    1.53
Thr    419    .    .    .    .    .    T    C    1.27    ＊    .     F    3.00    3.32
Gly    420    .    .    .    .    .    T    C    1.26    ＊    .     F    2.70    2.08
Arg    421    .    .    .    .    T    .    .    1.22    ＊    .     F    2.40    1.40
Asn    422    .    .    .    .    .    T    C    1.19    ＊    .     F    1.65    0.68
Ala    423    .    .    B    .    .    T    .    0.83    .     .     .    1.00    0.93
Ser    424    .    .    B    .    .    T    .    0.33    .     .     .    0.70    0.69
Ile    425    .    .    B    .    .    T    .    -0.13   .     ＊    .    -0.20   0.35
His    426    .    A    B    .    .    .    .    -0.24   .     ＊    .    -0.60   0.29
Thr    427    .    A    B    .    .    .    .    -0.83   ＊    ＊    .    -0.60   0.36
Leu    428    A    A    .    .    .    .    .    -1.06   ＊    ＊    .    -0.60   0.52
Leu    429    A    A    .    .    .    .    .    -0.76   ＊    ＊    .    -0.60   0.31
Asp    430    A    A    .    .    .    .    .    0.24    ＊    ＊    .    -0.30   0.38
Ala    431    A    A    .    .    .    .    .    -0.32   ＊    ＊    .    0.30    0.89
Leu    432    A    A    .    .    .    .    .    -0.01   ＊    ＊    .    0.75    1.07
Glu    433    A    A    .    .    .    .    .    0.80    ＊    ＊    .    0.75    1.11
Arg    434    A    A    .    .    .    .    .    1.72    ＊    ＊    F    0.90    1.90
Met    435    A    A    .    .    .    .    .    1.69    ＊    ＊    F    0.90    4.52
Glu    436    A    A    .    .    .    .    .    1.69    ＊    ＊    F    0.90    3.55
Glu    437    A    A    .    .    .    .    .    2.54    ＊    .     F    0.90    1.83
Arg    438    A    A    .    .    .    .    .    2.54    ＊    ＊    F    0.90    3.70
His    439    A    A    .    .    .    .    .    2.48    ＊    ＊    F    0.90    3.70
Ala    440    A    A    .    .    .    .    .    2.19    ＊    ＊    F    0.90    4.28
Lys    441    A    A    .    .    .    .    .    2.19    ＊    ＊    F    0.90    1.53
Glu    442    A    A    .    .    .    .    .    2.19    ＊    .     F    0.90    1.95
Lys    443    A    A    .    .    .    .    .    1.27    ＊    ＊    F    0.90    3.22
Ile    444    A    A    .    .    .    .    .    0.49    ＊    ＊    F    0.90    1.33
Gln    445    A    A    .    .    .    .    .    0.22    ＊    ＊    F    0.75    0.63
Asp    446    A    A    .    .    .    .    .    0.18    ＊    ＊    F    -0.15   0.23
Leu    447    A    A    .    .    .    .    .    -0.12   ＊    .     .    -0.30   0.56
Leu    448    A    A    .    .    .    .    .    -0.51   ＊    .     .    0.55    0.43
Val    449    A    A    .    .    .    .    .    0.42    ＊    .     F    0.95    0.26
Asp    450    A    .    .    .    .    T    .    -0.28   ＊    .     F    1.60    0.62
表2(续)
残基   位置  I   II  III  IV  V   VI  VII  VIII    IX   X    XI   XII     XIII
Ser    451   .   .   .    .   T   T   .    -1.17   ＊   .    F    2.25    0.65
Gly    452   .   .   .    .   T   T   .    -0.60   ＊   .    F    2.50    0.62
Lys    453   .   .   B    .   .   T   .    -0.50   .    .    F    1.25    0.58
Phe    454   .   A   B    .   .   .   .    0.26    .    .    .    0.15    0.36
Ile    455   .   A   B    .   .   .   .    0.26    .    .    .    0.20    0.62
Tyr    456   .   A   B    .   .   .   .    0.21    .    .    .    0.55    0.52
Leu    457   .   A   B    .   .   .   .    0.24    .    .    .    -0.03   0.59
Glu    458   .   A   B    .   .   .   .    -0.14   .    .    F    0.54    1.22
Asp    459   .   A   .    .   T   .   .    0.26    .    .    F    1.66    0.77
Gly    460   .   .   .    .   T   T   .    0.56    .    .    F    2.78    1.26
Thr    461   .   .   .    .   .   T   C    -0.06   ＊   .    F    2.70    0.73
Gly    462   .   .   .    .   .   T   C    0.46    ＊   .    F    2.13    0.33
Ser    463   .   .   .    .   .   T   C    -0.36   .    .    F    1.26    0.44
Ala    464   A   .   .    .   .   .   .    -0.36   .    .    .    0.14    0.25
Val    465   .   .   B    .   .   .   .    -0.40   .    .    .    0.17    0.44
Ser    466   .   .   B    .   .   .   .    -0.48   .    .    .    -0.10   0.42
Leu    467   .   .   B    .   .   .   .    -0.52   .    .    .    -0.10   0.53
Glu    468   A   .   .    .   .   .   .    -0.61   .    .    .    0.50    0.92
在另一个方面中，本发明提供了一种抗体，其结合包含本文所述的多肽的携带表位部分的一种肽或多肽。这种多肽部分的表位是本发明多肽的一种免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指当整个蛋白质是免疫原时激发抗体应答的蛋白质部分。另一方面，抗体可以结合的蛋白质分子的区域是“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位数一般少于抗原性表位数。见例如Geysen等，美国科学院院报81：3998-4002(1983)。
为选择携带抗原性表位(即含有抗体可以结合的蛋白质分子的区域)的肽或多肽，本领域熟知的是，模拟蛋白质序列一部分的相对短的合成肽通常能激发与所述被部分模拟的蛋白质反应的抗血清。见例如Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.(1983)，与蛋白质上预定位点反应的抗体，科学219：660-666。能激发蛋白质反应性血清的肽通常在蛋白质的初级序列中呈现，可以通过一系列简便的化学规则定性，而且既不限于完整蛋白质的免疫显性区域(即免疫原性表位)，也不限于氨基或羧基末端。
因此携带抗原性表位的肽和多肽可用于产生结合本发明TR4多肽的抗体，包括单克隆抗体。见例如Wilson等，细胞37：767-778(1984)的第777页所述。携带抗原性表位的肽和多肽优选含有一种序列，所述序列具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中包含的至少7个，更优选至少9个及最优选至少大约15-30个氨基酸。
本发明的抗体可以结合一或多种抗原性TR4多肽或肽，包括但非限于：包含SEQ ID NO：1的大约第35-92位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：1的大约第114-160位氨基酸残基的多肽；包含SEQID NO：1的大约第169-240位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：1的大约第267-298位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：1的大约第330-364位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：1的大约第391-404位氨基酸残基的多肽；和/或包含SEQ ID NO：1的大约第418-465位氨基酸残基的多肽。文中“大约”包括所述范围及在一个端值或在两个端值多或少几个(5，4，3，2或1个)氨基酸的范围。如上所述，本发明人已经确定了上述多肽片段是TR4蛋白的抗原性区域。携带表位的TR4肽和多肽可以通过任何常规方法产生。Houghten，R.A.，“快速固相合成大量肽的一般方法：在各个氨基酸水平抗原-抗体相互作用的特异性”，美国科学院院报82：5131-5135(1985)。这个“同时多个肽合成(SMPS)”方法在Houghten等(1986)的美国专利No.4631211中进一步描述。
本领域技术人员能意识到，本发明所述TR4多肽及其携带表位的片段(例如相应于胞外结构域的一部分，例如SEQ ID NO：1的第1-240位氨基酸残基)，可以与免疫球蛋白(IgG)的恒定区的部分组合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白便于纯化并示出在体内的半衰期延长，这已经由例如由人CD4多肽的前两个结构域与哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链恒定区的各个结构域组成的嵌合蛋白示出(EPA394827；Traunecker等，自然331：84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白比单独的单体TR4蛋白或蛋白质片段更有效结合及中和其它分子(Fountoulakis等，生物化学杂志270：3958-3964(1995))。因此，本发明的抗体可以结合包含完整或部分TR4多肽如TR4的融合蛋白。
本领域已知的重组DNA技术可以用于产生新的突变蛋白质或称“突变蛋白(muteins)”，所述突变蛋白包括单个或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出例如增强的活性或提高的稳定性。另外，至少在一定的纯化和贮存条件下，它们可以以较高产量纯化，并示出比相应的天然多肽更好的溶解性。本发明的抗体也可以结合这些修饰的TR4多肽或TR4多肽片段或变体。
例如，就许多蛋白质、包括膜结合蛋白的胞外结构域或者分泌蛋白的成熟形式而言，本领域已知可以从N末端或C末端缺失一或多个氨基酸基本不丧失生物学功能，或者不丧失由特异性抗体结合的能力。例如，Ron等，生物化学杂志268：2984-2988(1993)报道了修饰的KGF蛋白即使缺失3，8或27个氨基末端氨基酸残基，仍具有肝素结合活性。在本发明中，因为TR4是含有死亡结构域受体(DDCR)多肽家族的成员，因此缺失N末端氨基酸直至SEQ ID NO：1中第109位的半胱氨酸残基，仍可保留一些生物学活性如诱导编程性细胞死亡的能力。进一步的包括SEQ ID NO：1中第109位半胱氨酸残基(C-109)的N末端缺失的多肽预期不保留这种生物学活性，因为这个残基在家族成员中是保守的，而且可能是形成二硫键以提供结构稳定性所需的，所述结构稳定性是配体结合所需的。
然而，即使蛋白质N末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质被修饰或丧失一或多种生物学功能，但仍可保留其它功能活性(例如生物学活性，多聚体化能力，结合TR4配体(例如TRAIL)能力)。例如，当从N末端除去完整或成熟多肽的少部分残基时，缩短的TR4多肽诱导和/或结合识别完整或成熟形式TR4多肽的抗体的能力一般仍保留。缺失完整多肽N末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫学活性，可以通过本文所述常规方法及本领域已知的其它方法确定。缺失大量N末端氨基酸残基的TR4多肽仍保留一些生物学活性或免疫原性活性不是不可能的。事实上，由少如6个TR4氨基酸残基组成的肽通常就可能激发免疫应答。
因此，本发明进一步提供了结合如下多肽的抗体及编码这种多肽的多核苷酸，所述多肽中自SEQ ID NO：1的TR4氨基酸序列的氨基末端直至第463位丝氨酸残基缺失一或多个残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：1的第n1-468位残基的氨基酸序列，其中n1是相当于SEQ ID NO：1中氨基酸残基位置2-463之间的一个整数。
更特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：1的TR4序列的A-2至E-468；P-3至E-468；P-4至E-468；P-5至E-468；A-6至E-468；R-7至E-468；V-8至E-468；H-9至E-468；L-10至E-468；G-11至E-468；A-12至E-468；F-13至E-468；L-14至E-468；A-15至E-468；V-16至E-468；T-17至E-468；P-18至E-468；N-19至E-468；P-20至E-468；G-21至E-468；S-22至E-468；A-23至E-468；A-24至E-468；S-25至E-468；G-26至E-468；T-27至E-468；E-28至E-468；A-29至E-468；A-30至E-468；A-31至E-468；A-32至E-468；T-33至E-468；P-34至E-468；S-35至E-468；K-36至E-468；V-37至E-468；W-38至E-468；G-39至E-468；S-40至E-468；S-41至E-468；A-42至E-468；G-43至E-468；R-44至E-468；I-45至E-468；E-46至E-468；P-47至E-468；R-48至E-468；G-49至E-468；G-50至E-468；G-51至E-468；R-52至E-468；G-53至E-468；A-54至E-468；L-55至E-468；P-56至E-468；T-57至E-468；S-58至E-468；M-59至E-468；G-60至E-468；Q-61至E-468；H-62至E-468；G-63至E-468；P-64至E-468；S-65至E-468；A-66至E-468；R-67至E-468；A-68至E-468；R-69至E-468；A-70至E-468；G-71至E-468；R-72至E-468；A-73至E-468；P-74至E-468；G-75至E-468；P-76至E-468；R-77至E-468；P-78至E-468；A-79至E-468；R-80至E-468；E-81至E-468；A-82至E-468；S-83至E-468；P-84至E-468；R-85至E-468；L-86至E-468；R-87至E-468；V-88至E-468；H-89至E-468；K-90至E-468；T-91至E-468；F-92至E-468；K-93至E-468；F-94至E-468；V-95至E-468；V-96至E-468；V-97至E-468；G-98至E-468；V-99至E-468；L-100至E-468；L-101至E-468；Q-102至E-468；V-103至E-468；V-104至E-468；P-105至E-468；S-106至E-468；S-107至E-468；A-108至E-468；A-109至E-468；T-110至E-468；I-111至E-468；K-112至E-468；L-113至E-468；H-114至E-468；D-115至E-468；Q-116至E-468；S-117至E-468；I-118至E-468；G-119至E-468；T-120至E-468；Q-121至E-468；Q-122至E-468；W-123至E-468；E-124至E-468；H-125至E-468；S-126至E-468；P-127至E-468；L-128至E-468；G-129至E-468；E-130至E-468；L-131至E-468；C-132至E-468；P-133至E-468；P-134至E-468；G-135至E-468；S-136至E-468；H-137至E-468；R-138至E-468；S-139至E-468；E-140至E-468；R-141至E-468；P-142至E-468；G-143至E-468；A-144至E-468；C-145至E-468；N-146至E-468；R-147至E-468；C-148至E-468；T-149至E-468；E-150至E-468；G-151至E-468；V-152至E-468；G-153至E-468；Y-154至E-468；T-155至E-468；N-156至E-468；A-157至E-468；S-158至E-468；N-159至E-468；N-160至E-468；L-161至E-468；F-162至E-468；A-163至E-468；C-164至E-468；L-165至E-468；P-166至E-468；C-167至E-468；T-168至E-468；A-169至E-468；C-170至E-468；K-171至E-468；S-172至E-468；D-173至E-468；E-174至E-468；E-175至E-468；E-176至E-468；R-177至E-468；S-178至E-468；P-179至E-468；C-180至E-468；T-181至E-468；T-182至E-468；T-183至E-468；R-184至E-468；N-185至E-468；T-186至E-468；A-187至E-468；C-188至E-468；Q-189至E-468；C-190至E-468；K-191至E-468；P-192至E-468；G-193至E-468；T-194至E-468；F-195至E-468；R-196至E-468；N-197至E-468；D-198至E-468；N-199至E-468；S-200至E-468；A-201至E-468；E-202至E-468；M-203至E-468；C-204至E-468；R-205至E-468；K-206至E-468；C-207至E-468；S-208至E-468；T-209至E-468；G-210至E-468；C-211至E-468；P-212至E-468；R-213至E-468；G-214至E-468；M-215至E-468；V-216至E-468；K-217至E-468；V-218至E-468；K-219至E-468；D-220至E-468；C-221至E-468；T-222至E-468；P-223至E-468；W-224至E-468；S-225至E-468；D-226至E-468；I-227至E-468；E-228至E-468；C-229至E-468；V-230至E-468；H-231至E-468；K-232至E-468；E-233至E-468；S-234至E-468；G-235至E-468；N-236至E-468；G-237至E-468；H-238至E-468；N-239至E-468；I-240至E-468；W-241至E-468；V-242至E-468；I-243至E-468；L-244至E-468；V-245至E-468；V-246至E-468；T-247至E-468；L-248至E-468；V-249至E-468；V-250至E-468；P-251至E-468；L-252至E-468；L-253至E-468；L-254至E-468；V-255至E-468；A-256至E-468；V-257至E-468；L-258至E-468；I-259至E-468；V-260至E-468；C-261至E-468；C-262至E-468；C-263至E-468；I-264至E-468；G-265至E-468；S-266至E-468；G-267至E-468；C-268至E-468；G-269至E-468；G-270至E-468；D-271至E-468；P-272至E-468；K-273至E-468；C-274至E-468；M-275至E-468；D-276至E-468；R-277至E-468；V-278至E-468；C-279至E-468；F-280至E-468；W-281至E-468；R-282至E-468；L-283至E-468；G-284至E-468；L-285至E-468；L-286至E-468；R-287至E-468；G-288至E-468；P-289至E-468；G-290至E-468；A-291至E-468；E-292至E-468；D-293至E-468；N-294至E-468；A-295至E-468；H-296至E-468；N-297至E-468；E-298至E-468；I-299至E-468；L-300至E-468；S-301至E-468；N-302至E-468；A-303至E-468；D-304至E-468；S-305至E-468；L-306至E-468；S-307至E-468；T-308至E-468；F-309至E-468；V-310至E-468；S-311至E-468；E-312至E-468；Q-313至E-468；Q-314至E-468；M-315至E-468；E-316至E-468；S-317至E-468；Q-318至E-468；E-319至E-468；P-320至E-468；A-321至E-468；D-322至E-468；L-323至E-468；T-324至E-468；G-325至E-468；V-326至E-468；T-327至E-468；V-328至E-468；Q-329至E-468；S-330至E-468；P-331至E-468；G-332至E-468；E-333至E-468；A-334至E-468；Q-335至E-468；C-336至E-468；L-337至E-468；L-338至E-468；G-339至E-468；P-340至E-468；A-341至E-468；E-342至E-468；A-343至E-468；E-344至E-468；G-345至E-468；S-346至E-468；Q-347至E-468；R-348至E-468；R-349至E-468；R-350至E-468；L-351至E-468；L-352至E-468；V-353至E-468；P-354至E-468；A-355至E-468；N-356至E-468；G-357至E-468；A-358至E-468；D-359至E-468；P-360至E-468；T-361至E-468；E-362至E-468；T-363至E-468；L-364至E-468；M-365至E-468；L-366至E-468；F-367至E-468；F-368至E-468；D-369至E-468；K-370至E-468；F-371至E-468；A-372至E-468；N-373至E-468；I-374至E-468；V-375至E-468；P-376至E-468；F-377至E-468；D-378至E-468；S-379至E-468；W-380至E-468；D-381至E-468；Q-382至E-468；L-383至E-468；M-384至E-468；R-385至E-468；Q-386至E-468；L-387至E-468；D-388至E-468；L-389至E-468；T-390至E-468；K-391至E-468；N-392至E-468；E-393至E-468；I-394至E-468；D-395至E-468；V-396至E-468；V-397至E-468；R-398至E-468；A-399至E-468；G-400至E-468；T-401至E-468；A-402至E-468；G-403至E-468；P-404至E-468；G-405至E-468；D-406至E-468；A-407至E-468；L-408至E-468；Y-409至E-468；A-410至E-468；M-411至E-468；L-412至E-468；M-413至E-468；K-414至E-468；W-415至E-468；V-416至E-468；N-417至E-468；K-418至E-468；T-419至E-468；G-420至E-468；R-421至E-468；N-422至E-468；A-423至E-468；S-424至E-468；I-425至E-468；H-426至E-468；T-427至E-468；L-428至E-468；L-429至E-468；D-430至E-468；A-431至E-468；L-432至E-468；E-433至E-468；R-434至E-468；M-435至E-468；E-436至E-468；E-437至E-468；R-438至E-468；H-439至E-468；A-440至E-468；K-441至E-468；E-442至E-468；K-443至E-468；I-444至E-468；Q-445至E-468；D-446至E-468；L-447至E-468；L-448至E-468；V-499至E-468；D-450至E-468；S-451至E-468；G-452至E-468；K-453至E-468；F-454至E-468；I-455至E-468；Y-456至E-468；L-457至E-468；E-458至E-468；D-459至E-468；G-460至E-468；T-461至E-468；G-462至E-468和/或S-463至E-468。
在另一个实施方案中，TR4多肽的N末端缺失可以用通式n2-238描述，其中n2是相当于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的2-238之间的一个数。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由以下残基的氨基酸序列组成的TR4的N末端缺失：SEQ ID NO：1的TR4胞外结构域序列的A-2至H-238；P-3至H-238；P-4至H-238；P-5至H-238；A-6至H-238；R-7至H-238；V-8至H-238；H-9至H-238；L-10至H-238；G-11至H-238；A-12至H-238；F-13至H-238；L-14至H-238；A-15至H-238；V-16至H-238；T-17至H-238；P-18至H-238；N-19至H-238；P-20至H-238；G-21至H-238；S-22至H-238；A-23至H-238；A-24至H-238；S-25至H-238；G-26至H-238；T-27至H-238；E-28至H-238；A-29至H-238；A-30至H-238；A-31至H-238；A-32至H-238；T-33至H-238；P-34至H-238；S-35至H-238；K-36至H-238；V-37至H-238；W-38至H-238；G-39至H-238；S-40至H-238；S-41至H-238；A-42至H-238；G-43至H-238；R-44至H-238；I-45至H-238；E-46至H-238；P-47至H-238；R-48至H-238；G-49至H-238；G-50至H-238；G-51至H-238；R-52至H-238；G-53至H-238；A-54至H-238；L-55至H-238；P-56至H-238；T-57至H-238；S-58至H-238；M-59至H-238；G-60至H-238；Q-61至H-238；H-62至H-238；G-63至H-238；P-64至H-238；S-65至H-238；A-66至H-238；R-67至H-238；A-68至H-238；R-69至H-238；A-70至H-238；G-71至H-238；R-72至H-238；A-73至H-238；P-74至H-238；G-75至H-238；P-76至H-238；R-77至H-238；P-78至H-238；A-79至H-238；R-80至H-238；E-81至H-238；A-82至H-238；S-83至H-238；P-84至H-238；R-85至H-238；L-86至H-238；R-87至H-238；V-88至H-238；H-89至H-238；K-90至H-238；T-91至H-238；F-92至H-238；K-93至H-238；F-94至H-238；V-95至H-238；V-96至H-238；V-97至H-238；G-98至H-238；V-99至H-238；L-100至H-238；L-101至H-238；Q-102至H-238；V-103至H-238；V-104至H-238；P-105至H-238；S-106至H-238；S-107至H-238；A-108至H-238；A-109至H-238；T-110至H-238；I-111至H-238；K-112至H-238；L-113至H-238；H-114至H-238；D-115至H-238；Q-116至H-238；S-117至H-238；I-118至H-238；G-119至H-238；T-120至H-238；Q-121至H-238；Q-122至H-238；W-123至H-238；E-124至H-238；H-125至H-238；S-126至H-238；P-127至H-238；L-128至H-238；G-129至H-238；E-130至H-238；L-131至H-238；C-132至H-238；P-133至H-238；P-134至H-238；G-135至H-238；S-136至H-238；H-137至H-238；R-138至H-238；S-139至H-238；E-140至H-238；R-141至H-238；P-142至H-238；G-143至H-238；A-144至H-238；C-145至H-238；N-146至H-238；R-147至H-238；C-148至H-238；T-149至H-238；E-150至H-238；G-151至H-238；V-152至H-238；G-153至H-238；Y-154至H-238；T-155至H-238；N-156至H-238；A-157至H-238；S-158至H-238；N-159至H-238；N-160至H-238；L-161至H-238；F-162至H-238；A-163至H-238；C-164至H-238；L-165至H-238；P-166至H-238；C-167至H-238；T-168至H-238；A-169至H-238；C-170至H-238；K-171至H-238；S-172至H-238；D-173至H-238；E-174至H-238；E-175至H-238；E-176至H-238；R-177至H-238；S-178至H-238；P-179至H-238；C-180至H-238；T-181至H-238；T-182至H-238；T-183至H-238；R-184至H-238；N-185至H-238；T-186至H-238；A-187至H-238；C-188至H-238；Q-189至H-238；C-190至H-238；K-191至H-238；P-192至H-238；G-193至H-238；T-194至H-238；F-195至H-238；R-196至H-238；N-197至H-238；D-198至H-238；N-199至H-238；S-200至H-238；A-201至H-238；E-202至H-238；M-203至H-238；C-204至H-238；R-205至H-238；K-206至H-238；C-207至H-238；S-208至H-238；T-209至H-238；G-210至H-238；C-211至H-238；P-212至H-238；R-213至H-238；G-214至H-238；M-215至H-238；V-216至H-238；K-217至H-238；V-218至H-238；K-219至H-238；D-220至H-238；C-221至H-238；T-222至H-238；P-223至H-238；W-224至H-238；S-225至H-238；D-226至H-238；I-227至H-238；E-228至H-238；C-229至H-238；V-230至H-238；H-231至H-238；K-232至H-238和/或E-233至H-238。
如上所述，即使蛋白质C末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质被修饰而丧失一或多种生物学功能，但其它功能活性(例如生物学活性，多聚体化能力，结合TR4配体(例如TRAIL)的能力)仍可保留。例如当从C末端除去完整或成熟多肽的少部分(less than amajority)残基时，缩短的TR4多肽诱导和/或结合识别完整或成熟形式TR4多肽的抗体的能力仍会保留。缺失完整多肽C末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫学活性可以通过本文所述常规方法及本领域已知的其它方法确定。缺失大量C末端氨基酸残基的TR4多肽仍保留一些生物学活性或免疫原性活性不是不可能的。事实上，由少如6个TR4氨基酸残基组成的肽通常就能激发免疫应答。
因此，本发明进一步提供了结合如下多肽的抗体及编码这种多肽的多核苷酸，所述多肽自SEQ ID NO：1的TR4多肽氨基酸序列的羧基末端直至第30位丙氨酸残基缺失一或多个残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：1的第24-m1位残基的氨基酸序列，其中m1是相当于SEQ ID NO：1中氨基酸残基位置30-467之间的一个整数。
更特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含或由以下残基的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：1的TR4序列的A-24至L-467；A-24至S-466；A-24至V-465；A-24至A-464；A-24至S-463；A-24至G-462；A-24至T-461；A-24至G-460；A-24至D-459；A-24至E-458；A-24至L-457；A-24至Y-456；A-24至I-455；A-24至F-454；A-24至K-453；A-24至G-452；A-24至S-451；A-24至D-450；A-24至V-449；A-24至L-448；A-24至L-447；A-24至D-446；A-24至Q-445；A-24至I-444；A-24至K-443；A-24至E-442；A-24至K-441；A-24至A-440；A-24至H-439；A-24至R-438；A-24至E-437；A-24至E-436；A-24至M-435；A-24至R-434；A-24至E-433；A-24至L-432；A-24至A-431；A-24至D-430；A-24至L-429；A-24至L-428；A-24至T-427；A-24至H-426；A-24至I-425；A-24至S-424；A-24至A-423；A-24至N-422；A-24至R-421；A-24至G-420；A-24至T-419；A-24至K-418；A-24至N-417；A-24至V-416；A-24至W-415；A-24至K-414；A-24至M-413；A-24至L-412；A-24至M-411；A-24至A-410；A-24至Y-409；A-24至L-408；A-24至A-407；A-24至D-406；A-24至G-405；A-24至P-404；A-24至G-403；A-24至A-402；A-24至T-401；A-24至G-400；A-24至A-399；A-24至R-398；A-24至V-397；A-24至V-396；A-24至D-395；A-24至I-394；A-24至E-393；A-24至N-392；A-24至K-391；A-24至T-390；A-24至L-389；A-24至D-388；A-24至L-387；A-24至Q-386；A-24至R-385；A-24至M-384；A-24至L-383；A-24至Q-382；A-24至D-381；A-24至W-380；A-24至S-379；A-24至D-378；A-24至F-377；A-24至P-376；A-24至V-375；A-24至I-374；A-24至N-373；A-24至A-372；A-24至F-371；A-24至K-370；A-24至D-369；A-24至F-368；A-24至F-367；A-24至L-366；A-24至M-365；A-24至L-364；A-24至T-363；A-24至E-362；A-24至T-361；A-24至P-360；A-24至D-359；A-24至A-358；A-24至G-357；A-24至N-356；A-24至A-355；A-24至P-354；A-24至V-353；A-24至L-352；A-24至L-351；A-24至R-350；A-24至R-349；A-24至R-348；A-24至Q-347；A-24至S-346；A-24至G-345；A-24至E-344；A-24至A-343；A-24至E-342；A-24至A-341；A-24至P-340；A-24至G-339；A-24至L-338；A-24至L-337；A-24至C-336；A-24至Q-335；A-24至A-334；A-24至E-333；A-24至G-332；A-24至P-331；A-24至S-330；A-24至Q-329；A-24至V-328；A-24至T-327；A-24至V-326；A-24至G-325；A-24至T-324；A-24至L-323；A-24至D-322；A-24至A-321；A-24至P-320；A-24至E-319；A-24至Q-318；A-24至S-317；A-24至E-316；A-24至M-315；A-24至Q-314；A-24至Q-313；A-24至E-312；A-24至S-311；A-24至V-310；A-24至F-309；A-24至T-308；A-24至S-307；A-24至L-306；A-24至S-305；A-24至D-304；A-24至A-303；A-24至N-302；A-24至S-301；A-24至L-300；A-24至I-299；A-24至E-298；A-24至N-297；A-24至H-296；A-24至A-295；A-24至N-294；A-24至D-293；A-24至E-292；A-24至A-291；A-24至G-290；A-24至P-289；A-24至G-288；A-24至R-287；A-24至L-286；A-24至L-285；A-24至G-284；A-24至L-283；A-24至R-282；A-24至W-281；A-24至F-280；A-24至C-279；A-24至V-278；A-24至R-277；A-24至D-276；A-24至M-275；A-24至C-274；A-24至K-273；A-24至P-272；A-24至D-271；A-24至G-270；A-24至G-269；A-24至C-268；A-24至G-267；A-24至S-266；A-24至G-265；A-24至I-264；A-24至C-263；A-24至C-262；A-24至C-261；A-24至V-260；A-24至I-259；A-24至L-258；A-24至V-257；A-24至A-256；A-24至V-255；A-24至L-254；A-24至L-253；A-24至L-252；A-24至P-251；A-24至V-250；A-24至V-249；A-24至L-248；A-24至T-247；A-24至V-246；A-24至V-245；A-24至L-244；A-24至I-243；A-24至V-242；A-24至W-241；A-24至I-240；A-24至N-239；A-24至H-238；A-24至G-237；A-24至N-236；A-24至G-235；A-24至S-234；A-24至E-233；A-24至K-232；A-24至H-231；A-24至V-230；A-24至C-229；A-24至E-228；A-24至I-227；A-24至D-226；A-24至S-225；A-24至W-224；A-24至P-223；A-24至T-222；A-24至C-221；A-24至D-220；A-24至K-219；A-24至V-218；A-24至K-217；A-24至V-216；A-24至M-215；A-24至G-214；A-24至R-213；A-24至P-212；A-24至C-211；A-24至G-210；A-24至T-209；A-24至S-208；A-24至C-207；A-24至K-206；A-24至R-205；A-24至C-204；A-24至M-203；A-24至E-202；A-24至A-201；A-24至S-200；A-24至N-199；A-24至D-198；A-24至N-197；A-24至R-196；A-24至F-195；A-24至T-194；A-24至G-193；A-24至P-192；A-24至K-191；A-24至C-190；A-24至Q-189；A-24至C-188；A-24至A-187；A-24至T-186；A-24至N-185；A-24至R-184；A-24至T-183；A-24至T-182；A-24至T-181；A-24至C-180；A-24至P-179；A-24至S-178；A-24至R-177；A-24至E-176；A-24至E-175；A-24至E-174；A-24至D-173；A-24至S-172；A-24至K-171；A-24至C-170；A-24至A-169；A-24至T-168；A-24至C-167；A-24至P-166；A-24至L-165；A-24至C-164；A-24至A-163；A-24至F-162；A-24至L-161；A-24至N-160；A-24至N-159；A-24至S-158；A-24至A-157；A-24至N-156；A-24至T-155；A-24至Y-154；A-24至G-153；A-24至V-152；A-24至G-151；A-24至E-150；A-24至T-149；A-24至C-148；A-24至R-147；A-24至N-146；A-24至C-145；A-24至A-144；A-24至G-143；A-24至P-142；A-24至R-141；A-24至E-140；A-24至S-139；A-24至R-138；A-24至H-137；A-24至S-136；A-24至G-135；A-24至P-134；A-24至P-133；A-24至C-132；A-24至L-131；A-24至E-130；A-24至G-129；A-24至L-128；A-24至P-127；A-24至S-126；A-24至H-125；A-24至E-124；A-24至W-123；A-24至Q-122；A-24至Q-121；A-24至T-120；A-24至G-119；A-24至I-118；A-24至S-117；A-24至Q-116；A-24至D-115；A-24至H-114；A-24至L-113；A-24至K-112；A-24至I-111；A-24至T-110；A-24至A-109；A-24至A-108；A-24至S-107；A-24至S-106；A-24至P-105；A-24至V-104；A-24至V-103；A-24至Q-102；A-24至L-101；A-24至L-100；A-24至V-99；A-24至G-98；A-24至V-97；A-24至V-96；A-24至V-95；A-24至F-94；A-24至K-93；A-24至F-92；A-24至T-91；A-24至K-90；A-24至H-89；A-24至V-88；A-24至R-87；A-24至L-86；A-24至R-85；A-24至P-84；A-24至S-83；A-24至A-82；A-24至E-81；A-24至R-80；A-24至A-79；A-24至P-78；A-24至R-77；A-24至P-76；A-24至G-75；A-24至P-74；A-24至A-73；A-24至R-72；A-24至G-71；A-24至A-70；A-24至R-69；A-24至A-68；A-24至R-67；A-24至A-66；A-24至S-65；A-24至P-64；A-24至G-63；A-24至H-62；A-24至Q-61；A-24至G-60；A-24至M-59；A-24至S-58；A-24至T-57；A-24至P-56；A-24至L-55；A-24至A-54；A-24至G-53；A-24至R-52；A-24至G-51；A-24至G-50；A-24至G-49；A-24至R-48；A-24至P-47；A-24至E-46；A-24至I-45；A-24至R-44；A-24至G-43；A-24至A-42；A-24至S-41；A-24至S-40；A-24至G-39；A-24至W-38；A-24至V-37；A-24至K-36；A-24至S-35；A-24至P-34；A-24至T-33；A-24至A-32；A-24至A-31和/或A-24至A-30。
在另一个实施方案中，本发明的抗体结合可以用通式24-m2描述的TR4多肽的C末端缺失，其中m2是相当于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列位置30-238之间的一个数。在特异的实施方案中，本发明提供了结合包含或由以下残基的氨基酸序列组成的TR4多肽：SEQID NO：1的TR4胞外结构域序列的A-24至G-237；A-24至N-236；A-24至G-235；A-24至S-234；A-24至E-233；A-24至K-232；A-24至H-231；A-24至V-230；A-24至C-229；A-24至E-228；A-24至I-227；A-24至D-226；A-24至S-225；A-24至W-224；A-24至P-223；A-24至T-222；A-24至C-221；A-24至D-220；A-24至K-219；A-24至V-218；A-24至K-217；A-24至V-216；A-24至M-215；A-24至G-214；A-24至R-213；A-24至P-212；A-24至C-211；A-24至G-210；A-24至T-209；A-24至S-208；A-24至C-207；A-24至K-206；A-24至R-205；A-24至C-204；A-24至M-203；A-24至E-202；A-24至A-201；A-24至S-200；A-24至N-199；A-24至D-198；A-24至N-197；A-24至R-196；A-24至F-195；A-24至T-194；A-24至G-193；A-24至P-192；A-24至K-191；A-24至C-190；A-24至Q-189；A-24至C-188；A-24至A-187；A-24至T-186；A-24至N-185；A-24至R-184；A-24至T-183；A-24至T-182；A-24至T-181；A-24至C-180；A-24至P-179；A-24至S-178；A-24至R-177；A-24至E-176；A-24至E-175；A-24至E-174；A-24至D-173；A-24至S-172；A-24至K-171；A-24至C-170；A-24至A-169；A-24至T-168；A-24至C-167；A-24至P-166；A-24至L-165；A-24至C-164；A-24至A-163；A-24至F-162；A-24至L-161；A-24至N-160；A-24至N-159；A-24至S-158；A-24至A-157；A-24至N-156；A-24至T-155；A-24至Y-154；A-24至G-153；A-24至V-152；A-24至G-151；A-24至E-150；A-24至T-149；A-24至C-148；A-24至R-147；A-24至N-146；A-24至C-145；A-24至A-144；A-24至G-143；A-24至P-142；A-24至R-141；A-24至E-140；A-24至S-139；A-24至R-138；A-24至H-137；A-24至S-136；A-24至G-135；A-24至P-134；A-24至P-133；A-24至C-132；A-24至L-131；A-24至E-130；A-24至G-129；A-24至L-128；A-24至P-127；A-24至S-126；A-24至H-125；A-24至E-124；A-24至W-123；A-24至Q-122；A-24至Q-121；A-24至T-120；A-24至G-119；A-24至I-118；A-24至S-117；A-24至Q-116；A-24至D-115；A-24至H-114；A-24至L-113；A-24至K-112；A-24至I-111；A-24至T-110；A-24至A-109；A-24至A-108；A-24至S-107；A-24至S-106；A-24至P-105；A-24至V-104；A-24至V-103；A-24至Q-102；A-24至L-101；A-24至L-100；A-24至V-99；A-24至G-98；A-24至V-97；A-24至V-96；A-24至V-95；A-24至F-94；A-24至K-93；A-24至F-92；A-24至T-91；A-24至K-90；A-24至H-89；A-24至V-88；A-24至R-87；A-24至L-86；A-24至R-85；A-24至P-84；A-24至S-83；A-24至A-82；A-24至E-81；A-24至R-80；A-24至A-79；A-24至P-78；A-24至R-77；A-24至P-76；A-24至G-75；A-24至P-74；A-24至A-73；A-24至R-72；A-24至G-71；A-24至A-70；A-24至R-69；A-24至A-68；A-24至R-67；A-24至A-66；A-24至S-65；A-24至P-64；A-24至G-63；A-24至H-62；A-24至Q-61；A-24至G-60；A-24至M-59；A-24至S-58；A-24至T-57；A-24至P-56；A-24至L-55；A-24至A-54；A-24至G-53；A-24至R-52；A-24至G-51；A-24至G-50；A-24至G-49；A-24至R-48；A-24至P-47；A-24至E-46；A-24至I-45；A-24至R-44；A-24至G-43；A-24至A-42；A-24至S-41；A-24至S-40；A-24至G-39；A-24至W-38；A-24至V-37；A-24至K-36；A-24至S-35；A-24至P-34；A-24至T-33；A-24至A-32；A-24至A-31和/或A-24至A-30。
本发明还提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽具有自SEQ IDNO：1的TR4多肽氨基酸序列的羧基末端直至SEQ ID NO：1的C-221的一或多个残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第1-m9位残基组成的氨基酸序列，其中m9是221-468之间的任一整数，残基C-221据信是TR4蛋白的受体结合活性所需的完整TR4多肽(SEQ ID NO：1所示)C末端的第一个残基位置。
本发明还提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽自TR4多肽氨基和羧基末端缺失一或多个氨基酸，其可以概括地描述为具有SEQID NO：1的第n1-m1位残基和/或第n2-m2位残基，其中n1，n2，m1和m2是如上所述的整数。
本发明还包括结合如下多肽的抗体，所述多肽由ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆所编码的完整TR4氨基酸序列的一部分组成，其中该部分不包括ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆所编码的完整TR4氨基酸序列的氨基末端的1-约108个氨基酸，或者不包括ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆所编码的完整TR4氨基酸序列羧基末端的1-约247个氨基酸，或者是ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆所编码的完整TR4氨基酸序列的上述氨基末端和羧基末端缺失的任意组合。
优选地，本发明抗体结合TR4片段，所述片段包含胞外结构域的一部分，即在SEQ ID NO：1的第24-238位残基内，因为在此残基范围内的任何部分均预期是可溶的。
本领域能意识到TR4的一些氨基酸序列可以加以变化而不明显影响该蛋白质的结构和功能。如果这种序列差异是预期的，应记得蛋白质上应存在决定活性的关键区域。这种区域通常包含组成配体结合位点或死亡结构域的残基，或者形成影响这些结构域的三级结构的残基。
因此，本发明进一步包括结合TR4蛋白变体的抗体，所述变体示出基本的TR4蛋白活性或包括诸如下述蛋白质片段的TR4区域。这些突变体包括缺失，插入，翻转，重复和典型取代。关于氨基酸变化可能是表型沉默的指导可见于Bowie，J.U.等，科学247：1306-1310(1990)。
因此，本发明抗体可以结合SEQ ID NO：1所示多肽或者由ATCC保藏物No.97853中的cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物。这类片段，变体或衍生物可以是(i)这样的片段、变体或衍生物，其中至少一或多个氨基酸残基由保守或非保守的氨基酸残基(优选保守氨基酸残基，更优选至少1个但少于10个保守氨基酸残基)取代，而且这种取代的氨基酸残基可以是或不是遗传密码编码的氨基酸残基，或者(ii)这样的片段、变体或衍生物，其中一或多个氨基酸残基包括一个取代基团，或者(iii)这样的片段、变体或衍生物，其中成熟多肽与另一种化合物融合，如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)这样的片段、变体或衍生物，其中额外的氨基酸融合于成熟多肽，如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。根据本发明教导，相信这些片段，衍生物和类似物在本领域技术人员技术范围内。
特别感兴趣的是荷电氨基酸由另一种荷电氨基酸及由中性或负电荷氨基酸的取代。后者产生正电荷减少的蛋白质，以改良TR4蛋白的特性。特别需要防止聚集，蛋白质的聚集不仅导致活性丧失，而且当制备药物配方时也会产生问题，因为它们可以是免疫原性的(Pinckard等，临床实验免疫学2：331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36：838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier System 10：307-377(1993))。
氨基酸置换也可以改变与细胞表面受体结合的选择性。Ostade等，自然361：266-268(1993)描述了导致TNF-α只选择性结合两种已知类型TNF受体之一的一些突变。因此，本发明的抗体可以结合一种TR4受体，其含有来自天然突变或人工操纵的一或多个氨基酸取代、缺失或添加。
正如所表明的，氨基酸变化优选是性质改变小的变化，如不明显影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代(见表3)。
表3：保守氨基酸取代
  芳香族疏水性极性碱性酸性小型   苯丙氨酸色氨酸酪氨酸亮氨酸异亮氨酸缬氨酸谷氨酰胺天冬酰胺精氨酸赖氨酸组氨酸天冬氨酸谷氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸甘氨酸
在特异的实施方案中，SEQ ID NO：1的氨基酸序列和/或本发明所述任何多肽片段(例如胞外结构域或胞内结构域)中的取代、添加或缺失数是75，70，60，50，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或30-20，20-15，20-10，15-10，10-1，5-10，1-5，1-3或1-2个。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体(尤其包含或由TR4的胞外可溶结构域组成的片段)，所述多肽或其片段或变体含有任意一个或多个以下TR4中的保守突变：SEQID NO：1的残基的如下置换，即用A，G，I，L，S，T或V置换M1；用G，I，L，S，T，M或V置换A2；用G，I，L，S，T，M或V置换A6；用H或K置换R7；用A，G，I，L，S，T或M置换V8；用K或R置换H9；用A，G，I，S，T，M或V置换L10；用A，I，L，S，T，M或V置换G11；用G，I，L，S，T，M或V置换A12；用W或Y置换F13；用A，G，I，S，T，M或V置换L14；用G，I，L，S，T，M或V置换A15；用A，G，I，L，S，T或M置换V16；用A，G，I，L，S，M或V置换T17；用Q置换N19；用A，I，L，S，T，M或V置换G21；用A，G，I，L，T，M或V置换S22；用G，I，L，S，T，M或V置换A23；用G，I，L，S，T，M或V置换A24；用A，G，I，L，T，M或V置换S25；用A，I，L，S，T，M或V置换G26；用A，G，I，L，S，M或V置换T27；用D置换E28；用G，I，L，S，T，M或V置换A29；用G，I，L，S，T，M或V置换A30；用G，I，L，S，T，M或V置换A31；用G，I，L，S，T，M或V置换A32；用A，G，I，L，S，M或V置换T33；用A，G，I，L，T，M或V置换S35；用H或R置换K36；用A，G，I，L，S，T或M置换V37；用F或Y置换W38；用A，I，L，S，T，M或V置换G39；用A，G，I，L，T，M或V置换S40；用A，G，I，L，T，M或V置换S41；用G，I，L，S，T，M或V置换A42；用A，I，L，S，T，M或V置换S41；用G，I，L，S，T，M或V置换A42；用A，I，L，S，T，M或V置换G43；用H或K置换R44；用A，G，L，S，T，M或V置换145；用D置换E46；用H或K置换R48；用A，I，L，S，T，M或V置换G49；用A，I，L，S，T，M或V置换G50；用A，I，L，S，T，M或V置换G51；用H或K置换R52；用A，I，L，S，T，M或V置换G53；用G，I，L，S，T，M或V置换A54；用A，G，I，S，T，M或V置换L55；用A，G，I，L，S，M或V置换T57；用A，G，I，L，T，M或V置换S58；用A，G，I，L，S，T或V置换M59；用A，I，L，S，T，M或V置换G60；用N置换Q61；用K或R置换H62；用A，I，L，S，T，M或V置换G63；用A，G，I，L，T，M或V置换S65；用G，I，L，S，T，M或V置换A66；用H或K置换R67；用G，I，L，S，T，M或V置换A68；用H或K置换R69；用G，I，L，S，T，M或V置换A70；用A，I，L，S，T，M或V置换G71；用H或K置换R72；用G，I，L，S，T，M或V置换A73；用A，I，L，S，T，M或V置换G75；用H或K置换R77；用G，I，L，S，T，M或V置换A79；用H或K置换R80；用D置换E81；用G，I，L，S，T，M或V置换A82；用A，G，I，L，T，M或V置换S83；用H或K置换R85；用A，G，I，S，T，M或V置换L86；用H或K置换R87；用A，G，I，L，S，T或M置换V88；用K或R置换H89；用H或R置换K90；用A，G，I，L，S，M或V置换T91；用W或Y置换F92；用H或R置换K93；用W或Y置换F94；用A，G，I，L，S，T或M置换V95；用A，G，I，L，S，T或M置换V96；用A，G，I，L，S，T或M置换V97；用A，I，L，S，T，M或V置换G98；用A，G，I，L，S，T或M置换V99；用A，G，I，S，T，M或V置换L100；用A，G，I，S，T，M或V置换L101；用N置换Q102；用A，G，I，L，S，T或M置换V103；用A，G，I，L，S，T或M置换V104；用A，G，I，L，T，M或V置换S106；用A，G，I，L，T，M或V置换S107；用G，I，L，S，T，M或V置换A108；用G，I，L，S，T，M或V置换A109；用A，G，I，L，S，M或V置换T110；用A，G，L，S，T，M或V置换I111；用H或R置换K112；用A，G，I，S，T，M或V置换L113；用K或R置换H114；用E置换D115；用N置换Q116；用A，G，I，L，T，M或V置换S117；用A，G，L，S，T，M或V置换I118；用A，I，L，S，T，M或V置换G119；用A，G，I，L，S，M或V置换T120；用N置换Q121；用N置换Q122；用F或Y置换W123；用D置换E124；用K或R置换H125；用A，G，I，L，T，M或V置换S126；用A，G，I，S，T，M或V置换L128；用A，I，L，S，T，M或V置换G129；用D置换E130；用A，G，I，S，T，M或V置换L131；用A，I，L，S，T，M或V置换G135；用A，G，I，L，T，M，或V置换S136；用K或R置换H137；用H或K置换R138；用A，G，I，L，T，M或V置换S139；用D置换E140；用H或K置换R141；用A，I，L，S，T，M或V置换G143；用G，I，L，S，T，M或V置换A144；用Q置换N146；用H或K置换R147；用A，G，I，L，S，M或V置换T149；用D置换E150；用A，I，L，S，T，M或V置换G151；用A，G，I，L，S，T或M置换V152；用A，I，L，S，T，M或V置换G153；用F或W置换Y154；用A，G，I，L，S，M或V置换T155；用Q置换N156；用G，I，L，S，T，M或V置换A157；用A，G，I，L，T，M或V置换S 158；用Q置换N159；用Q置换N160；用A，G，I，S，T，M或V置换L161；用W或Y置换F162；用G，I，L，S，T，M或V置换A163；用A，G，I，S，T，M或V置换L165；用A，G，I，L，S，M或V置换T168；用G，I，L，S，T，M或V置换A169；用H或R置换K171；用A，G，I，L，T，M或V置换S172；用E置换D173；用D置换E174；用D置换E175；用D置换E176；用H置换R177；用A，G，I，L，T，M或V置换S178；用A，G，I，L，S，M或V置换T181；用A，G，I，L，S，M或V置换T182；用A，G，I，L，S，M或V置换T183；用H或K置换R184；用Q置换N185；用A，G，I，L，S，M或V置换T186；用G，I，L，S，T，M或V置换A187；用N置换Q189；用H或R置换K191；用A，I，L，S，T，M或V置换G193；用A，G，I，L，S，M或V置换T194；用W或Y置换F195；用H或K置换R196；用Q置换N197；用E置换D198；用Q置换N199；用A，G，I，L，T，M或V置换S200；用G，I，L，S，T，M或V置换A201；用D置换E202；用A，G，I，L，S，T或V置换M203；用H或K置换R205；用H或R置换K206；用A，G，I，L，T，M或V置换S208；用A，G，I，L，S，M或V置换T209；用A，I，L，S，T，M或V置换G210；用H或K置换R213；用A，I，L，S，T，M或V置换G214；用A，G，I，L，S，T或V置换M215；用A，G，I，L，S，T或M置换V216；用H或R置换K217；用A，G，I，L，S，T或M置换V218；用H或R置换K219；用E置换D220；用A，G，I，L，S，M或V置换T222；用F或Y置换W224；用A，G，I，L，T，M或V置换S225；用E置换D226；用A，G，L，S，T，M或V置换I227；用D置换E228；用A，G，I，L，S，T或M置换V230；用K或R置换H231；用H或R置换K232；用D置换E233；用A，G，I，L，T，M或V置换S234；用A，I，L，S，T，M或V置换G235；用Q置换N236，用A，I，L，S，T，M或V置换G237；用K或R置换H238；用Q置换N239；用A，G，L，S，T，M或V置换I240；用F或Y置换W241；用A，G，I，L，S，T或M置换V242；用A，G，L，S，T，M或V置换I243；用A，G，I，S，T，M或V置换L244；用A，G，I，L，S，T或M置换V245；用A，G，I，L，S，T或M置换V246；用A，G，I，L，S，M或V置换T247；用A，G，I，S，T，M或V置换L248；用A，G，I，L，S，T或M置换V249；用A，G，I，L，S，T或M置换V250；用A，G，I，S，T，M或V置换L252；用A，G，I，S，T，M或V置换L253；用A，G，I，S，T，M或V置换L254；用A，G，I，L，S，T或M置换V255；用G，I，L，S，T，M或V置换A256；用A，G，I，L，S，T或M置换V257；用A，G，I，S，T，M或V置换L258；用A，G，L，S，T，M或V置换I259；用A，G，I，L，S，T或M置换V260；用A，G，L，S，T，M或V置换I264；用A，I，L，S，T，M或V置换G265；用A，G，I，L，T，M或V置换S266；用A，I，L，S，T，M或V置换G267；用A，I，L，S，T，M或V置换G269；用A，I，L，S，T，M或V置换G270；用E置换D271；用H或R置换R277；用A，G，I，L，S，T或M置换V278；用W或Y置换F280；用F或Y置换W281；用H或K置换R282；用A，G，I，S，T，M或V置换L283；用A，I，L，S，T，M或V置换G284；用A，G，I，S，T，M或V置换L285；用A，G，I，S，T，M或V置换L286；用H或K置换R287；用A，I，L，S，T，M或V置换G288；用A，I，L，S，T，M或V置换G290；用G，I，L，S，T，M或V置换A291；用D置换E292；用E置换D293；用Q置换N294；用G，I，L，S，T，M或V置换A295；用K或R置换H296；用Q置换N297；用D置换E298；用A，G，L，S，T，M或V置换I299；用A，G，I，S，T，M或V置换L300；用A，G，I，L，T，M或V置换S301；用Q置换N302；用G，I，L，S，T，M或V置换A303；用E置换D304；用A，G，I，L，T，M或V置换S305；用A，G，I，S，T，M或V置换L306；用A，G，I，L，T，M或V置换S307；用A，G，I，L，S，M或V置换T308；用W或Y置换F309；用A，G，I，L，S，T或M置换V310；用A，G，I，L，T，M或V置换S311；用D置换E312；用N置换Q313；用N置换Q314；用A，G，I，L，S，T或V置换M315；用D置换E316；用A，G，I，L，T，M或V置换S317；用N置换Q318；用D置换E319；用G，I，L，S，T，M或V置换A321；用E置换D322；用A，G，I，S，T，M或V置换L323；用A，G，I，L，S，M或V置换T324；用A，I，L，S，T，M或V置换G325；用A，G，I，L，S，T或M置换V326；用A，G，I，L，S，M或V置换T327；用A，G，I，L，S，T或M置换V328；用N置换Q329；用A，G，I，L，T，M或V置换S330；用A，I，L，S，T，M或V置换G332；用D置换E333；用G，I，L，S，T，M或V置换A334；用N置换Q335；用A，G，I，S，T，M或V置换L337；用A，G，I，S，T，M或V置换L338；用A，I，L，S，T，M或V置换G339；用G，I，L，S，T，M或V置换A341；用D置换E342；用G，I，L，S，T，M或V置换A343；用D置换E344；用A，I，L，S，T，M或V置换G345；用A，G，I，L，T，M或V置换S346；用N置换Q347；用H或K置换R348；用H或K置换R349；用H或K置换R350；用A，G，I，S，T，M或V置换L351；用A，G，I，S，T，M或V置换L352；用A，G，I，L，S，T或M置换V353；用G，I，L，S，T，M或V置换A355；用Q置换N356；用A，I，L，S，T，M或V置换G357；用G，I，L，S，T，M或V置换A358；用E置换D359；用A，G，I，L，S，M或V置换T361；用D置换E362；用A，G，I，L，S，M或V置换T363；用A，G，I，S，T，M或V置换L364；用A，G，I，L，S，T或V置换M365；用A，G，I，S，T，M或V置换L366；用W或Y置换F367；用W或Y置换F368；用E置换D369；用H或R置换K370；用W或Y置换F371；用G，I，L，S，T，M或V置换A372；用Q置换N373；用A，G，L，S，T，M或V置换I374；用A，G，I，L，S，T或M置换V375；用W或Y置换F377；用E置换D378；用A，G，I，L，T，M或V置换S379；用F或Y置换W380；用E置换D381；用N置换Q382；用A，G，I，S，T，M或V置换L383；用A，G，I，L，S，T或V置换M384；用H或K置换R385；用N置换Q386；用A，G，I，S，T，M或V置换L387；用E置换D388；用A，G，I，S，T，M或V置换L389；用A，G，I，L，S，M或V置换T390；用H或R置换K391；用Q置换N392；用D置换E393；用A，G，L，S，T，M或V置换I394；用E置换D395；用A，G，I，L，S，T或M置换V396；用A，G，I，L，S，T或M置换V397；用H或K置换R398；用G，I，L，S，T，M或V置换A399；用A，I，L，S，T，M或V置换G400；用A，G，I，L，S，M或V置换T401；用G，I，L，S，T，M或V置换A402；用A，I，L，S，T，M或V置换G403；用A，I，L，S，T，M或V置换G405；用E置换D406；用G，I，L，S，T，M或V置换A407；用A，G，I，S，T，M或V置换L408；用F或W置换Y409；用G，I，L，S，T，M或V置换A410；用A，G，I，L，S，T或V置换M411；用A，G，I，S，T，M或V置换L412；用A，G，I，L，S，T或V置换M413；用H或R置换K414；用F或Y置换W415；用A，G，I，L，S，T或M置换V416；用Q置换N417；用H或R置换K418；用A，G，I，L，S，M或V置换T419；用A，I，L，S，T，M或V置换G420；用H或K置换R421；用Q置换N422；用G，I，L，S，T，M或V置换A423；用A，G，I，L，T，M或V置换S424；用A，G，L，S，T，M或V置换I425；用K或R置换H426；用A，G，I，L，S，M或V置换T427；用A，G，I，S，T，M或V置换L428；用A，G，I，S，T，M或V置换L429；用E置换D430；用G，I，L，S，T，M或V置换A431；用A，G，I，S，T，M或V置换L432；用D置换E433；用H或K置换R434；用A，G，I，L，S，T或V置换M435；用D置换E436；用D置换E437；用H或K置换R438；用K或R置换H439；用G，I，L，S，T，M或V置换A440；用H或R置换K441；用D置换E442；用H或R置换K443；用A，G，L，S，T，M，或V置换I444；用N置换Q445；用E置换D446；用A，G，I，S，T，M或V置换L447；用A，G，I，S，T，M或V置换L448；用A，G，I，L，S，T或M置换V449；用E置换D450；用A，G，I，L，T，M或V置换S451；用A，I，L，S，T，M或V置换G452；用H或R置换K453；用W或Y置换F454；用A，G，L，S，T，M或V置换I455；用F或W置换Y456；用A，G，I，S，T，M或V置换L457；用D置换E458；用E置换D459；用A，I，L，S，T，M或V置换G460；用A，G，I，L，S，M或V置换T461；用A，I，L，S，T，M或V置换G462；用A，G，I，L，T，M或V置换S463；用G，I，L，S，T，M或V置换A464；用A，G，I，L，S，T或M置换V465；用A，G，I，L，T，M或V置换S466；用A，G，I，S，T，M或V置换L467和/或用D置换E468。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体(尤其是包含或由TR4的胞外可溶结构域组成的片段)，所述多肽或其片段或变体含有任意一个或多个以下TR4中的非保守突变：SEQ ID NO：1的残基的如下置换，用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M1；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A2；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P3；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P4；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P5；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A6；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R7；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V8；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H9；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L10；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G11；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A12；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F13；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L14；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A15；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V16；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T17；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P18；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N19；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P20；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G21；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S22；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A23；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A24；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S25；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G26；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T27；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E28；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A29；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A30；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A31；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A32；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T33；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P34；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S35；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K36；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V37；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W38；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G39；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S40；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S41；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A42；用A，I，L，S，T，M或V置换S41；用G，I，L，S，T，M或V置换A42；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G43；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R44；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I45；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换E46；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P47；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R48；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G49；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G50；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G51；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R52；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G53；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A54；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L55；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P56；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T57；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S58；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M59；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G60；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q61；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H62；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G63；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P64；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S65；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A66；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R67；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A68；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R69；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A70；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G71；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R72；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A73；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P74；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G75；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P76；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R77；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P78；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A79；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R80；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E81；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A82；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S83；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P84；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R85；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L86；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R87；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V88；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H89；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K90；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T91；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F92；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K93；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F94；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V95；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V96；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V97；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G98；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V99；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L100；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L101；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q102；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V103；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V104；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P105；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S106；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S107；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A108；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A109；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T110；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I111；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K112；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L113；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H114；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D115；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q116；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S 117；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I118；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G119；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T120；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q121；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q122；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W123；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E124；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H125；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S126；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P127；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L128；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G129；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E130；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L131；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C132；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P133；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P134；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G135；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S136；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H137；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R138；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S139；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E140；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R141；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P142；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G143；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A144；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C145；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N146；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R147；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C148；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T149；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E150；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G151；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V152；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G153；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y154；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T155；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N156；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A157；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S158；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N159；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N160；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L161；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F162；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A163；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C164；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L165；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P166；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C167；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T168；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A169；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C170；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K171；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S172；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D173；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E174；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E175；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E176；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R177；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S178；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P179；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C180；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T181；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T182；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T183；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R184；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，W，Y，P或C置换N185；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T186；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A187；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换C188；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q189；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C190；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K191；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P192；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G193；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T194；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F195；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R196；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N197；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D198；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N199；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S200；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A201；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E202；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M203；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C204；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R205；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K206；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C207；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S208；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T209；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G210；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C211；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P212；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R213；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G214；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M215；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V216；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K217；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V218；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K219；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D220；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C221；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T222；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P223；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W224；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S225；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D226；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I227；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E228；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C229；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V230；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H231；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K232；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E233；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S234；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G235；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N236，用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G237；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H238；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N239；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I240；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W241；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V242；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I243；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L244；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V245；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V246；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T247；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L248；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V249；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V250；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P251；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L252；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L253；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L254；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V255；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A256；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V257；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L258；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I259；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V260；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C261；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C262；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C263；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I264；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G265；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S266；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G267；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C268；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G269；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G270；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D271；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P272；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K273；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C274；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M275；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D276；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R277；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V278；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C279；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F280；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W281；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R282；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L283；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G284；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L285；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L286；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R287；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G288；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P289；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G290；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A291；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E292；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D293；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N294；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A295；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H296；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N297；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E298；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I299；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L300；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S301；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N302；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A303；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D304；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S305；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L306；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S307；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T308；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F309；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V310；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S311；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E312；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q313；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，F，W，Y，P或C置换Q314；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M315；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E316；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S317；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q318；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E319；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P320；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A321；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D322；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L323；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T324；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G325；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V326；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T327；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V328；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q329；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S330；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P331；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G332；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E333；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A334；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q335；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C336；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L337；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L338；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G339；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P340；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A341；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E342；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A343；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E344；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G345；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S346；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q347；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R348；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R349；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R350；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L351；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L352；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V353；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P354；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A355；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N356；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G357；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A358；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D359；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P360；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T361；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E362；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T363；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L364；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M365；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L366；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F367；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F368；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D369；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K370；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F371；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A372；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N373；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I374；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V375；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，N，Q，F，W，Y或C置换P376；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F377；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D378；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S379；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W380；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D381；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q382；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L383；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M384；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R385；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q386；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L387；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D388；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L389；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T390；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K391；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N392；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E393；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I394；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D395；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V396；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V397；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R398；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A399；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G400；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T401；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A402；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G403；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P404；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G405；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，N，Q，F，W，Y，P或C置换D406；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A407；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L408；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y409；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A410；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M411；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L412；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M413；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K414；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W415；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V416；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N417；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K418；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T419；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G420；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R421；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N422；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A423；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S424；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I425；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H426；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T427；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L428；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L429；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D430；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A431；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L432；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E433；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R434；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M435；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E436；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E437；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R438；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H439；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A440；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K441；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E442；用D，E，A，H，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K443；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I444；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q445；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D446；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L447；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L448；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V449；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D450；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S451；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G452；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K453；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F454；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I455；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y456；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L457；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E458；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D459；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G460；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T461；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G462；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S463；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A464；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V465；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S466；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L467和/或用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E468。
本发明TR4蛋白质中为功能所需的氨基酸可以通过本领域已知方法鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989))。后一方法是在分子的每个残基导入单一的丙氨酸突变。然后将所得突变分子测试生物学活性如受体结合或者体外或体内增殖活性。对配体-受体结合非常关键的位点也可以通过结构分析确定，如结晶，核磁共振或光亲和标记(Smith等，分子生物学杂志224：899-904(1992)及Vos等，科学255：306-312(1992))。在优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR4功能所必需的TR4区域。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR4功能所必需的并抑制或消除TR4功能的TR4区域。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR4功能所必需的并增强TR4功能的TR4区域。
另外，可以应用蛋白质工程化以改良或改变TR4多肽的特性。可以使用本领域已知的重组DNA技术产生新的突变蛋白，包括单一或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出例如增强的活性或提高的稳定性。另外，至少在一定的纯化和贮存条件下，它们可以高产量纯化而且比相应的天然多肽示出更好的溶解性。本发明的抗体可以结合这种修饰的TR4多肽。
TR4的非天然发生的变体可以使用本领域已知的诱变技术产生，包括但非限于寡核苷酸介导的诱变，丙氨酸扫描；PCR诱变，定点诱变(见例如Carter等，核酸研究13：4331(1986)；及Zoller等，核酸研究10：6487(1982))，盒式诱变(见例如Wells等，基因34：315(1985))，限制选择诱变(见例如Wells等，Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA 317：415(1986))。
因此，本发明还涵盖了结合TR4衍生物和类似物的抗体，所述衍生物和类似物具有一或多个氨基酸残基缺失、添加或取代以产生更适于在所选择的宿主细胞中表达、放大等的TR4多肽。例如，半胱氨酸残基可以缺失或用另一种氨基酸残基取代以去除二硫键；N连接的糖基化位点可以改变或去除以实现例如更易于从已知超糖基化N连接位点的酵母宿主中回收及纯化的一种同源产物的表达。为此，在TR4多肽中任一或多个糖基化识别序列的第一个或第三个氨基酸位置之一或这两个位置上的各种氨基酸取代，和/或在任一或多个这种识别序列的第二个位置的一个氨基酸缺失，将防止TR4在修饰的三肽序列糖基化(见例如Miyajimo等，EMBO杂志5(6)：1193-1197)。另外，TR4多肽的一或多个氨基酸残基(例如精氨酸和赖氨酸残基)可以缺失或用另一种残基取代，以消除非所需的蛋白酶加工例如弗林蛋白酶或kexin加工。
本发明的抗体还包括结合如下一种多肽的抗体，所述多肽为包含或由包括引导序列的由保藏的cDNA(ATCC保藏号97853的保藏物)编码的多肽组成的多肽；包含或由减去引导序列的由保藏的cDNA编码的成熟多肽组成的多肽(即成熟蛋白)；包含或由包括引导序列的SEQ ID NO：1的多肽组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：1的多肽减去氨基末端甲硫氨酸组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：1的多肽减去引导序列组成多肽；包含或由TR4胞外结构域组成的多肽；包含或由TR4富半胱氨酸结构域组成的多肽；包含或由TR4跨膜结构域组成的多肽；包含或由TR4胞内结构域组成的多肽；包含或由TR4死亡结构域组成的多肽；包含或由可溶多肽组成的多肽，所述可溶多肽包含全部或部分胞外和胞内结构域但缺少跨膜结构域；以及与上述这些多肽(例如由保藏的cDNA克隆(ATCC保藏号97853的保藏物)编码的多肽，SEQ ID NO：1的多肽)及这些多肽的具有至少30个优选至少50个氨基酸的部分有至少80％，优选至少90％或95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相同性的多肽。
具有与一种TR4多肽的一种参比氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽，是指所述多肽序列可以包括每100个TR4多肽的参比氨基酸序列的氨基酸中最多5个氨基酸变化，除此之外该多肽的氨基酸序列与参比氨基酸序列相同。换而言之，为获得具有与参比氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参比序列中最多有5％的氨基酸残基可以缺失或用另一种氨基酸取代，或者最多占参比序列中氨基酸总数5％的氨基酸可以插入参考序列中。参比序列的这些变化可以发生在氨基或羧基末端位置，或者在两个末端位置之间的任何位置，它们单独分散在参比序列的残基中或在参比序列内呈一或多个连续的组。
实际上，任何特定的多肽与例如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，可以使用已知的计算机程序常规测定，如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，Unix版本8，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)。当使用Bestfit或任何其它序列对比程序以确定一个特定序列与本发明的参比序列是否例如至少95％相同时，参数的设定当然是计算在全长参比氨基酸序列基础上的相同性百分率，并允许占参比序列中氨基酸残基总数最多5％的同源性缺口。
在一个特异的实施方案中，确定参比(查询)序列(本发明的序列)和一个目的序列之间的相同性，也称全局序列比对，可以利用基于Brutlag等的算法(计算机应用生物科学，6：237-245(1990))的FASTDB计算机程序。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数为：Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，Mismath Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或者目标氨基酸序列的长度，取两者中较短的。根据这个实施方案，如果目的序列因N或C末端缺失而非由于内部缺失而比查询序列短，那么必须对结果作手工修正。这是因为FASTDB程序在计算全局相同性百分比时不计算目的序列N或C末端的截短。对于目的序列相对于查询序列在N或C末端截短，则相同性百分比的修正是通过计算不匹配的位于目的序列N或C末端的查询序列的碱基数作为查询序列总碱基数的百分比而进行。通过FASTDB序列比对的结果来确定一个残基是否匹配。然后将此百分比从使用规定参数通过上述FASTDB程序计算的相同性百分比中减去，从而获得最终的相同性百分比数值。这一最终相同性百分比数值是用于本实施方案目的的百分比。进行手工调节相同性百分比数值时，只有不与查询序列相匹配的目的序列N或C末端之外的碱基才被考虑，也就是只有在目的序列的最N端和C端残基之外的查询序列残基位置才予以考虑。例如，将一个90个碱基的目的序列与一个100个碱基的查询序列比对以确定相同性百分比。缺失发生于目的序列的N末端，因此，FASTDB比对不能显示出N末端前10个碱基的匹配/比对。这10个不匹配的碱基相当于序列的10％(N或C端不匹配的碱基数/查询序列中的碱基总数)，因而从FASTDB程序计算的相同性百分比中减去这10％。如果剩余的90个碱基都完全匹配，那么最终的相同性百分比就是90％。再例如，将一个90个碱基的目的序列与一个100个碱基的查询序列相比较，这时的缺失是内部缺失，因而目的序列的N或C末端碱基没有与查询序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB程序计算的相同性百分比不需手工修正。再强调一次，只有位于目的序列的N或C末端以外的碱基，如FSATDB对比中所展示的与查询序列不匹配的才需要手工修正。对于这一实施方案不需要进行其他的手工修正。
本申请还涉及结合如下蛋白质的抗体，所述蛋白质含有与本文以n1-m1和/或n2-m2表示的TR4序列至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的多肽。在优选的实施方案中，本申请涉及结合如下蛋白质的抗体，所述蛋白质含有与具有本文所述特异TR4N和C末端缺失的氨基酸序列的多肽有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多肽。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体结合上述TR4融合蛋白，其中融合蛋白的TR4部分是本文所述的n1-m1和/或n2-m2所示的那些。
TR7
在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体。以下段落更详细描述了可由本发明抗体结合的TR7多肽、其片段和变体。可由本发明抗体结合的TR7多肽，其片段和变体也见于例如国际出版物No.WO98/41629，WO00/66156和WO98/35986所描述，这些文献以其全文并入本文作参考。
在某些实施方案中，本发明的抗体特异性结合TR7多肽。在一些实施方案中，免疫特异性结合TR7的抗体可以结合TR7的片段，变体(包括TR7的直向同源物)，多聚体或修饰形式。例如，TR7的免疫特异性抗体可以结合包含全部或部分TR7的融合蛋白的TR7组分。
TR7蛋白可以作为单体或多聚体(即二聚体，三聚体，四聚体和更高的多聚体)形式发现。因此，本发明涉及结合呈单体或多聚体的一部分形式的TR7蛋白的抗体。在特异的实施方案中，TR7多肽是单体，二聚体，三聚体或四聚体。在另外的实施方案中，本发明的多聚体是至少二聚体，至少三聚体或至少四聚体。
本发明的抗体可以结合TR7同聚体或异聚体。本文所用术语同聚体是指只含有本发明TR7蛋白(包括本文所述TR7片段，变体和融合蛋白)的多聚体。这些同聚体可含有具有相同或不同多肽序列的TR7蛋白质。在一个特异的实施方案中，本发明的同聚体是只含有具有相同多肽序列的TR7蛋白的多聚体。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合含有具有不同多肽序列的TR7蛋白的TR7同聚体。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合一种TR7同源二聚体(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR7蛋白)或TR7同源三聚体(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR7蛋白)。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合TR7的至少一个同源二聚体，至少一个同源三聚体或至少一个同源四聚体。
本文所用术语异聚体是指这样的多聚体，其除了含有本发明TR7蛋白之外，还含有异源蛋白(即含有与TR7基因编码的多肽序列不相应的多肽序列的蛋白质)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合一种异源二聚体，异源三聚体或异源四聚体。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合含有一或多个TR7多肽的至少一个同源二聚体，至少一个同源三聚体或至少一个同源四聚体。
由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以是疏水性、亲水性、离子性和/或共价结合的，和/或可以间接通过例如脂质体形成而连接。因此，在一个实施方案中，当TR7蛋白在溶液中互相接触时，会形成由本发明的一或多个抗体结合的多聚体例如同源二聚体或同源三聚体。在另一个实施方案中，当TR7蛋白与TR7多肽的抗体(包括抗融合蛋白中的异源多肽序列的抗体)接触时，形成由本发明的一或多个抗体结合的异源多聚体例如异源三聚体或异源四聚体。在其它实施方案中，由本发明的一或多个抗体结合的多聚体通过与本发明TR7蛋白的共价结合和/或在本发明TR7蛋白之间的共价结合而形成。这种共价结合可以涉及所述蛋白质多肽序列(例如SEQ ID NO：3所示多肽序列，或由ATCC保藏物97920的cDNA克隆编码的多肽)中包含的一或多个氨基酸残基。在一个例子中，所述共价结合是位于蛋白质多肽序列内的在天然(即天然存在的)多肽中相互作用的半胱氨酸残基之间的交联。在另一个例子中，所述共价结合是化学或重组操作的结果。或者，这种共价结合可以涉及TR7融合蛋白中异源多肽序列中包含的一或多个氨基酸残基。在一个实施例中，共价结合发生在融合蛋白包含的异源序列之间(见例如美国专利No.5478925)。在一个特异的实施例中，共价结合发生在TR7-Fc融合蛋白(如本文所述)中包含的异源序列之间。在另一个特异的实施例中，融合蛋白的共价结合发生在异源多肽序列之间，所述异源多肽序列来自能形成共价结合的多聚体的另一个TNF家族配体/受体成员，例如oseteoprotegerin(见例如国际出版物No.WO98/49305，在此以其全文并入参考)。
可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的化学方法产生。例如，希望包含于本发明多聚体中的蛋白质可以使用本领域已知的接头分子和接头分子长度优化技术进行化学交联(见例如美国专利No.5478925，在此以其全文并入参考)。另外，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的方法产生，以在位于希望包含于多聚体中的蛋白质多肽序列内的半胱氨酸残基之间形成一或多个分子间交联(见例如美国专利No.5478925，在此以其全文并入参考)。另外，可以由本发明的一或多个抗体结合的蛋白质可以通过将半胱氨酸或生物素加入所述蛋白质多肽序列的C或N末端而常规修饰，而且可以使用本领域已知方法产生含有一或多个这些修饰的蛋白质的多聚体(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。再者，可以使用本领域已知方法产生含有希望包含于可由本发明的一或多个抗体结合的多聚体中的蛋白质成分的脂质体(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。
或者，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的基因工程技术产生。在一个实施方案中，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体中包含的蛋白质是使用本文所述的融合蛋白技术或本领域已知其它技术重组产生的(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在一个特异的实施方案中，通过将编码TR7多肽的多核苷酸序列与编码接头多肽的序列连接，然后进一步与一种编码从起始C末端至N末端的反方向的该多肽翻译产物(缺失前导序列)的合成多核苷酸连接，产生编码可以由本发明的一或多个抗体结合的一种同源二聚体的多核苷酸(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在另一个实施方案中，使用本文所述重组技术或本领域已知的其它方法产生重组TR7多肽，其含有一个跨膜结构域并可以通过膜重构技术掺入脂质体中(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在另一个实施方案中，两或多个TR7多肽通过合成接头(例如肽，碳水化合物或可溶聚合物接头)连接。例子包括美国专利No.5073627(在此并入参考)中所述那些肽接头。包含由肽接头分离的多个TR7多肽的蛋白质可以使用常规重组DNA技术产生。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合包含由肽接头分离的多个TR7多肽的蛋白质。
制备多聚体TR7多肽的另一种方法涉及使用融合于亮氨酸拉链或异亮氨酸多肽序列的TR7多肽。亮氨酸拉链结构域和异亮氨酸拉链结构域是促进含有这些结构域的蛋白质多聚体化的多肽。亮氨酸拉链最初在一些DNA结合蛋白质中鉴别(Landschulz等，科学240：1759(1988))，至今已经在许多不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链是天然存在的二聚体化或三聚体化的肽及其衍生物。适于生产可溶多聚体TR7蛋白质的亮氨酸拉链结构域例如是PCT出版物WO94/10308中所述的那些，在此并入参考。将包含与在溶液中二聚体化或三聚体化的肽融合的一种可溶的TR7多肽的重组融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，使用本领域已知技术将所得可溶多聚体化TR7从培养上清中回收。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7-亮氨酸拉链融合蛋白单体和/或TR7-亮氨酸拉链融合蛋白多聚体。
据信蛋白质TNF家族的一些成员以三聚体形式存在(Beutler和Huffel，科学264：667，1994；Banner等，细胞73：431，1993)。因此，三聚体TR7可能提供生物活性增强的优势。优选的亮氨酸拉链组分是优先形成三聚体的那些组分。一个例子是衍生自肺表面活性剂蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链，如Hoppe等(FEBS通讯344：191(1994))，及美国专利申请No.08/446922所述，在此以其全文并入参考。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7-亮氨酸拉链融合蛋白三聚体。
衍生自天然存在的三聚体蛋白质的其它肽可以用于制备三聚体TR7。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7融合蛋白单体和/或TR7融合蛋白三聚体。
结合TR7受体多肽的抗体可以结合分离的或天然存在状态的多肽。“分离多肽”是指从其天然环境中分离的一种多肽。因此本发明中，在重组宿主细胞中产生的和/或包含于重组细胞中的多肽是被认为是分离的。另外，“分离的多肽”也指已经从重组宿主细胞中部分或基本纯化的多肽。例如，一种重组产生的TR7多肽通过一步方法基本纯化，所述方法如Smith和Johnson，基因67：31-40(1988)所述。因此，本发明的抗体可以结合重组产生的TR7受体多肽。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合在一种细胞表面上表达的TR7受体，该细胞包含可操纵地与控制基因表达的调节序列结合的编码SEQ ID NO：3的1-411位氨基酸的一种多核苷酸。
本发明的抗体可以结合包含或由一种氨基酸序列组成的TR7多肽或多肽片段，所述氨基酸序列包含于SEQ ID NO：3中，由ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA编码，或者由与ATCC保藏物No.97920中包含的核苷酸序列或其互补链杂交(例如在严格杂交条件下)的核酸编码。蛋白质片段可以是“游离存在的”，或包含于一个较大的多肽中，在该较大的多肽中该片段形成其一部分或一个区域，最优选作为一个单一的连续区域。本发明的抗体可以结合多肽片段，包括例如包含或由大约以下氨基酸残基组成的片段：SEQ ID NO：3的第1-51，52-78，79-91，92-111，112-134，135-151，152-178，179-180，181-208，209-218，219-231，232-251，252-271，272-291，292-311，312-323，324-361，362-391，392-411位氨基酸残基。文中“大约”包括特别指出的数值，比一个端值或两个端值多或少几个(5，4，3，2或1)氨基酸的值。另外，由多肽片段的长度可以是至少大约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150个氨基酸。文中“大约”包括特别指出的数值，比一个端值或两个端值多或少几个(5，4，3，2或1)氨基酸的值。
优选地，本发明的多肽片段包括选自如下一组的一个成员：一种包含或由TR7受体胞外结构域(预测组成SEQ ID NO：3的约第52-约第184位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由两个TR7富半胱氨酸结构域(这两个结构域可见于由SEQ ID NO：3的约第84-约第179位氨基酸残基组成的蛋白质片段中)组成的多肽；一种包含或由SEQ ID NO：3的约第84-约第131位氨基酸残基组成的TR7富半胱氨酸结构域组成的多肽；一种包含或由SEQ ID NO：3的约第132-约第179位氨基酸残基组成的TR7富半胱氨酸结构域组成的多肽；一种包含或由TR7受体跨膜结构域(预测组成SEQ ID NO：3的约第185-约第208位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由预测的成熟TR7多肽的片段组成的多肽，其中所述片段具有TR7功能活性(例如抗原性活性或生物学活性)；一种包含或由TR7受体胞内结构域(预测组成SEQ ID NO：3的约第209-约第411位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由全部或部分缺失跨膜结构域的TR7受体胞外和胞内结构域组成的多肽；一种包含或由TR7受体死亡结构域(预测组成SEQ ID NO：3的约第324-约第391位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由TR7受体蛋白的1，2，3，4或更多个携带表位部分组成的多肽。在另外的实施方案中，本发明的多肽片段包含或由上述的1，2，3，4，5，6，7或全部8个成员的任意组合组成。上述组成TR7受体胞外、跨膜和胞内结构域的氨基酸残基和前导序列均由计算机分析预测。因此，本领域技术人员应意识到组成这些结构域的氨基酸残基基于用于限定每个结构域的标准可以略微变化(例如变化大约1-15个氨基酸残基)。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
如上所述，据信TR7的一或两个胞外富半胱氨酸基序对TR7与其配体(例如TRAIL)之间的相互作用很重要。因此，在特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由SEQ ID NO：3的第84-131位和/或第132-179位氨基酸残基组成的TR7多肽片段。在另一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由两个胞外富半胱氨酸基序(SEQ ID NO：3的第84-179位氨基酸残基)组成的TR7多肽。在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由TR7的胞外可溶结构域(SEQ ID NO：3的第52-184位氨基酸残基)组成的TR7多肽。在其它特别优选的实施方案中，结合TR7的全部或部分胞外可溶结构域(例如一或两个富半胱氨酸结构域)的本发明抗体拮抗TR7受体。
在其它特别优选的实施方案中，结合TR7的全部或部分胞外可溶结构域(例如一或两个富半胱氨酸结构域)的本发明的抗体诱导表达TR7受体的细胞编程性细胞死亡。
本发明的抗体还可以结合包含或由TR7的结构或功能属性部分组成的片段。这些片段包括包含TR7的α-螺旋及α-螺旋形成区(“α-区”)，β-折叠及β-折叠形成区(“β-区”)，转角及转角形成区(“转角区”)，卷曲及卷曲形成区(“卷曲区”)，亲水区，疏水区，α两亲区，β两亲区，表面形成区及高抗原指数区(即由抗原指数高于或等于1.5的多个氨基酸残基组成的多肽区域，使用Jameson-Wolf程序的默认参数鉴别)的氨基酸残基。一些优选的区域是表4中所述那些区域，并包括但非限于通过分析SEQ ID NO：3所示氨基酸序列而鉴别的上述类型的区域，这些优选的区域包括：Garnier-Robson预测的α-区，β-区，转角区及卷曲区；Chou-Fasman预测的α-区，β-区和转角区；Kyte-Doolittle预测的亲水区和Hopp-Woods预测的疏水区；Eisenbergα和β两亲区；Emini表面形成区；及Jameson-Wolf高抗原指数区，使用这些计算机程序的默认参数预测。
表4示出的代表如上所述的TR7的结构和功能属性的数据，是使用各种DNA*STAR模块和算法按默认参数产生的。第I列表示对α螺旋区的Garnier-Robson分析结果；第II列表示对α螺旋区的Chou-Fasman分析结果；第III列表示对β折叠区的Garnier-Robson分析结果；第IV列表示对β折叠区的Chou-Fasman分析结果；第V列表示对转角区的Garnier-Robson分析结果；第VI列表示对转角区的Chou-Fasman分析结果；第VII列表示对卷曲区的Garnier-Robson分析结果；第VIII列表示Kyte-Doolittle亲水性图；第IX列表示Hopp-Woods疏水性图；第X列表示对α两亲区的Eisenberg分析结果；第XI列表示对β两亲区的Eisenberg分析结果；第XII列表示对柔性区的Karplus-Schultz分析结果；第XIII列表示Jameson-Wolf抗原指数分值；第XIV列表示Emini表面概率图。
在一个优选的实施方案中，表4中第VIII，IX，XIII和XIV列所示数据可以用于确定呈现高度抗原性潜力的TR7区域。通过选择表示在一种抗原识别可能发生在免疫应答的初始过程的环境中很可能暴露于多肽表面的多肽区域的数值，从第VIII，IX，XIII和/或XIV列所示数据中确定高抗原性区域。表4中各列示出对TR7蛋白质序列的不同分析结果。
表4所示上述优选的区域包括但非限于通过分析SEQ ID NO：3所示氨基酸序列鉴别的上述类型区域。如表4所示，这种优选的区域包括Garnier-Robsonα-区，β-区，转角区和卷曲区，Chou-Fasmanα-区，β-区和转角区，Kyte-Doolittle亲水区，Eisenbergα-和β-两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Jameson-Wolf高抗原指数区及Emini表面形成区。优选地，本发明的抗体结合TR7多肽或包含组合一些结构特征的TR7区域的TR7多肽片段和变体，如上述及表4所示一些(例如1，2，3或4个)相同或不同区域特征。
表4
残基 位置 I   II  III  IV   V  VI   VII  VIII    IX      X   XI   XII XIII   XIV
Mer  1    A   .   .    .    .   .   .    1.11    -0.70   .   ＊   .   1.29   2.18
Glu  2    A   .   .    .    .   .   .    1.50    -0.70   .   ＊   .   1.63   1.69
Gln  3    A   .   .    .    .   T   .    1.89    -0.73   .   ＊   .   2.17   2.28
Arg  4    .   .   .    .    T   T   .    1.69    -0.76   .   ＊   .   2.91   3.71
Gly  5    .   .   .    .    T   T   .    1.87    -0.87   .   ＊   F   3.40   2.17
Gln  6    .   .   .    .    T   T   .    1.88    -0.44   .   ＊   F   2.76   1.93
Asn  7    .   .   .    .    .   .   C    1.29    -0.34   .   ＊   F   1.87   1.00
Ala  8    .   .   .    .    .   .   C    0.99    0.16    .   .    F   1.08   1.02
Pro  9    .   .   .    .    .   .   C    0.53    0.11    .   ＊   .   0.44   0.79
Ala  10   A   .   .    .    .   .   .    0.29    0.14    .   ＊   .   -0.10  0.48
Ala  11   A   .   .    .    .   T   .    0.40    0.24    .   .    .   0.10   0.48
Ser  12   A   .   .    .    .   T   .    0.44    -0.26   .   ＊   F   0.85   0.61
Gly  13   A   .   .    .    .   T   .    1.14    -0.69   .   ＊   F   1.30   1.22
Ala  14   A   .   .    .    .   T   .    1.32    -1.19   .   ＊   F   1.30   2.36
Arg  15   A   .   .    .    T   .   .    1.57    -1.19   .   ＊   F   1.50   2.39
Lys  16   .   .   .    .    T   .   .    1.94    -1.14   .   .    F   1.50   2.39
Arg  17   .   .   .    .    T   .   .    1.90    -1.14   .   ＊   F   1.80   3.66
His  18   .   .   .    .    .   .   C    2.03    -1.21   ＊  ＊   F   1.90   1.85
Gly  19   .   .   .    .    .   T   C    2.73    -0.79   ＊  ＊   F   2.40   1.43
Pro  20   .   .   .    .    .   T   C    2.62    -0.79   ＊  ＊   F   2.70   1.43
Gly  21   .   .   .    .    .   T   C    1.99    -0.79   ＊  .    F   3.00   1.82
Pro  22   .   .   .    .    .   T   C    1.99    -0.79   .   ＊   F   2.70   1.86
Arg  23   .   A   .    .    .   .   C    1.68    -1.21   ＊  .    F   2.30   2.35
Glu  24   .   A   B    .    .   .   .    1.43    -1.21   ＊  .    F   2.10   2.35
Ala  25   .   A   .    .    T   .   .    1.76    -1.14   ＊  .    F   2.50   1.54
Arg  26   .   A   .    .    T   .   .    1.89    -1.57   ＊  .    F   2.50   1.54
Gly  27   .   .   .    .    T   .   .    1.76    -1.14   ＊  .    F   3.00   1.37
Ala  28   .   .   .    .    T   .   C    1.43    -0.71   ＊  ＊   F   2.70   1.35
Arg  29   .   .   .    .    .   T   C    1.54    -0.79   ＊  ＊   F   2.66   1.06
Pro  30   .   .   .    .    .   T   C    1.28    -0.79   ＊  ＊   F   2.62   2.10
Gly  31   .   .   .    .    .   T   C    0.96    -0.57   ＊  ＊   F   2.58   1.54
Pro  32   .   .   .    .    .   T   C    1.34    -0.64   ＊  ＊   F   2.54   1.22
Arg  33   .   .   .    .    .   .   C    1.62    -0.64   ＊  ＊   F   2.60   1.58
Val  34   .   .   .    .    .   .   C    0.70    -0.59   ＊  ＊   F   2.34   2.30
Pro  35   .   .   B    .    .   .   .    0.06    -0.33   ＊  ＊   F   1.58   1.23
Lys  36   .   .   B    B    .   .   .    -0.41   -0.11   ＊  .    F   0.97   0.46
Thr  37   .   .   B    B    .   .   .    -1.06   0.57    ＊  ＊   F   -0.19  0.52
Leu  38   .   .   B    B    .   .   .    -2.02   0.57    ＊  ＊   .   -0.60  0.25
Val  39   .   .   B    B    .   .   .    -1.76   0.79    .   .    .   -0.60  0.09
Leu  40   A   .   .    B    .   .   .    -2.13   1.29    .   .    .   -0.60  0.06
Val  41   A   .   .    B    .   .   .    -3.03   1.30    .   .    .   -0.60  0.08
Val  42   A   .   .    B    .   .   .    -3.53   1.26    .   .    .   -0.60  0.08
Ala  43   A   .   .    B    .   .   .    -3.53   1.30    .   .    .   -0.60  0.08
Ala  44   A   .   .    B    .   .   .    -3.49   1.30    .   .    .   -0.60  0.09
Val  45   A   .   .    B    .   .   .    -3.53   1.34    .   .    .   -0.60  0.10
Leu  46   A   .   .    B    .   .   .    -2.98   1.34    .   .    .   -0.60  0.07
Leu  47   A   .   .    B    .   .   .    -2.71   1.23    .   .    .   -0.60  0.09
Leu  48   A   .   .    B    .   .   .    -2.12   1.23    .   .    .   -0.60  0.13
Val  49   A   .   .    B    .   .   .    -1.83   0.59    .   .    .   -0.60  0.27
Ser  50   A   .   .    B    .   .   .    -1.57   0.29    .   ＊   .   -0.30  0.44
表4(续)
残基 位置 I  II III IV  V   VI  VII VIII    IX       X    XI   XII  XIII    XIV
Ala  51   A  A  .   .   .   .   .   -1.57   0.10     .    .    .    -0.30   0.54
Glu  52   A  A  .   .   .   .   .   -1.64   0.10     .    .    .    -0.30   0.60
Ser  53   A  A  .   B   .   .   .   -1.14   0.14     .    .    .    -0.30   0.31
Ala  54   A  A  .   B   .   .   .   -0.29   0.24     .    .    .    -0.30   0.45
Leu  55   A  A  .   B   .   .   .   0.01    0.14     .    .    .    -0.30   0.45
Ile  56   A  A  .   B   .   .   .   0.60    0.54     .    .    .    -0.60   0.58
Thr  57   A  A  .   B   .   .   .   -0.21   0.16     .    .    F    -0.15   0.96
Gln  58   A  A  .   B   .   .   .   -0.50   0.34     .    .    F    -0.15   0.96
Gln  59   A  A  .   B   .   .   .   -0.12   0.16     .    .    F    0.00    1.38
Asp  60   .  A  .   B   T   .   .   0.69    -0.10    .    .    F    1.00    1.48
Leu  61   .  A  .   .   .   .   C   1.58    -0.19    .    ＊   F    0.80    1.48
Ala  62   .  A  .   .   .   .   C   2.00    -0.19    .    ＊   F    0.80    1.48
Pro  63   .  A  .   .   .   .   C   1.41    -0.59    .    ＊   F    1.10    1.73
Gln  64   .  A  .   .   T   .   .   0.82    -0.09    .    ＊   F    1.00    2.13
Gln  65   A  A  .   .   .   .   .   0.61    -0.27    .    ＊   F    0.60    2.13
Arg  66   A  A  .   .   .   .   .   1.42    -0.34    .    ＊   F    0.60    2.13
Ala  67   A  A  .   .   .   .   .   2.01    -0.37    .    ＊   F    0.94    2.13
Ala  68   A  A  .   .   .   .   .   2.27    -0.37    ＊   ＊   F    1.28    2.13
Pro  69   A  A  .   .   .   .   .   2.38    -0.77    ＊   ＊   F    1.92    2.17
Gln  70   .  A  .   .   T   .   .   2.08    -0.77    ＊   .    F    2.66    4.21
Gln  71   .  .  .   .   T   T   .   1.67    -0.89    ＊   ＊   F    3.40    5.58
Lys  72   .  .  .   .   T   T   .   2.04    -1.00    .    .    F    3.06    4.84
Arg  73   .  .  .   .   T   T   .   2.33    -1.00    .    .    F    2.97    4.32
Ser  74   .  .  .   .   .   T   C   2.54    -1.01    .    .    F    2.68    3.34
Ser  75   .  .  .   .   .   T   C   2.20    -1.41    .    .    F    2.59    2.89
Pro  76   .  .  .   .   T   T   .   1.39    -0.99    .    .    F    2.70    1.46
Ser  77   .  .  .   .   T   T   .   0.68    -0.30    .    .    F    2.50    0.90
Glu  78   .  .  .   .   T   T   .   0.36    -0.11    .    ＊   F    2.25    0.36
Gly  79   .  .  .   .   T   .   .   0.44    -0.07    .    .    F    1.80    0.36
Leu  80   .  .  .   .   T   .   .   0.40    -0.07    .    .    F    1.55    0.42
Cys  81   .  .  .   .   .   .   C   0.58    -0.03    .    .    .    0.95    0.24
Pro  82   .  .  .   .   .   T   C   0.84    0.47     ＊   .    F    0.15    0.33
Pro  83   .  .  .   .   T   T   .   -0.04   0.54     ＊   .    F    0.35    0.54
Gly  84   .  .  .   .   T   T   .   0.00    0.54     ＊   .    .    0.20    0.70
His  85   .  .  .   .   .   T   C   0.81    0.36     ＊   .    .    0.30    0.61
His  86   .  .  .   .   .   .   C   1.48    -0.07    ＊   .    .    0.70    0.68
Ile  87   .  .  .   .   .   .   C   1.34    -0.50    ＊   ＊   .    1.19    1.15
Ser  88   .  .  .   .   .   .   C   1.67    -0.50    ＊   ＊   F    1.53    0.84
Glu  89   .  .  .   .   T   .   .   2.01    -1.00    ＊   ＊   F    2.52    1.21
Asp  90   .  .  .   .   T   .   .   1.38    -1.50    ＊   ＊   F    2.86    2.88
Gly  91   .  .  .   .   T   T   .   0.52    -1.61    ＊   ＊   F    3.40    1.15
Arg  92   .  .  .   .   T   T   .   1.11    -1.31    ＊   ＊   F    2.91    0.47
Asp  93   .  .  .   .   T   T   .   0.74    -0.93    .    ＊   F    2.57    0.37
Cys  94   .  .  .   .   T   T   .   0.79    -0.36    .    ＊   .    1.78    0.20
Ile  95   .  .  .   .   T   .   .   0.54    -0.79    .    ＊   .    1.54    0.21
Ser  96   .  .  .   .   T   .   .   0.54    -0.03    .    ＊   .    1.18    0.19
Cys  97   .  .  .   .   T   T   .   0.43    0.40     .    ＊   .    0.76    0.36
Lys  98   .  .  .   .   T   T   .   0.43    0.23     .    .    .    1.34    0.88
Tyr  99   .  .  .   .   T   T   .   0.86    -0.46    .    ＊   F    2.52    1.10
Gly  100  .  .  .   .   T   T   .   1.44    -0.09    .    ＊   F    2.80    3.22
表4(续)
残基   位置  I  II   III  IV   V    VI   VII  VIII    IX     X    XI  XII  XIII    XIV
Gln    101   .  .    .    .    T    T    .    1.43    -0.27  ＊   .   F    2.52    2.16
Asp    102   .  .    .    .    T    T    .    2.07    0.21   ＊   ＊  F    1.64    1.99
Tyr    103   .  .    .    .    T    T    .    1.73    -0.04  ＊   ＊  F    1.96    2.73
Ser    104   .  .    .    .    T    T    .    1.98    0.44   ＊   .   F    0.78    1.55
Thr    105   .  .    .    .    T    .    .    2.32    0.44   ＊   .   F    0.30    1.60
His    106   .  .    .    .    T    .    .    1.51    0.44   ＊   .   .    0.15    1.70
Trp    107   .  .    .    .    T    T    .    0.70    0.37   ＊   .   .    0.65    1.05
Asn    108   .  .    .    .    T    T    .    0.24    0.67   .    .   .    0.20    0.60
Asp    109   .  .    .    .    T    T    .    -0.12   0.97   ＊   .   .    0.20    0.38
Leu    110   A  .    .    .    .    T    .    -0.62   1.04   ＊   ＊  .    -0.20   0.19
Leu    111   .  .    .    B    T    .    .    -0.48   0.81   ＊   ＊  .    -0.20   0.10
Phe    112   .  .    .    B    T    .    .    -0.86   0.41   ＊   ＊  .    -0.20   0.12
Cys    113   .  .    .    B    T    .    .    -1.17   0.99   ＊   ＊  .    -0.20   0.08
Leu    124   .  .    .    B    T    .    .    -1.06   0.79   .    ＊  .    -0.20   0.13
Arg    115   .  .    .    B    T    .    .    -0.91   0.10   .    ＊  .    0.10    0.30
Cys    116   .  .    .    B    T    .    .    -0.10   -0.11  .    .   .    0.70    0.30
Thr    117   .  .    .    B    T    .    .    0.30    -0.69  .    ＊  .    1.00    0.61
Arg    118   .  .    .    B    T    .    .    0.62    -0.99  .    .   F    1.49    0.42
Cys    119   .  .    .    .    T    T    .    1.43    -0.56  ＊   .   F    2.23    0.77
Asp    120   .  .    .    .    T    T    .    0.47    -1.13  ＊   .   F    2.57    0.92
Ser    121   .  .    .    .    T    T    .    1.13    -0.97  .    ＊  F    2.91    0.35
Gly    122   .  .    .    .    T    T    .    0.63    -0.97  .    ＊  F    3.40    1.13
Glu    123   .  A    .    .    T    .    .    0.22    -0.86  .    ＊  F    2.51    0.56
Val    124   A  A    .    .    .    .    .    0.68    -0.47  .    ＊  F    1.47    0.56
Glu    125   .  A    .    .    T    .    .    0.01    -0.43  .    ＊  .    1.38    0.87
Leu    126   .  A    .    .    T    .    .    0.00    -0.29  .    ＊  .    1.04    0.27
Ser    127   .  .    .    .    .    T    C    0.03    0.20   .    ＊  F    0.45    0.52
Pro    128   .  .    .    .    T    T    .    -0.28   0.04   .    ＊  F    0.93    0.44
Cys    129   .  .    .    .    T    T    .    0.69    0.53   .    ＊  F    0.91    0.77
Thr    130   .  .    .    .    T    T    .    0.69    -0.16  .    ＊  F    2.24    1.12
Thr    131   .  .    .    .    T    .    .    1.19    -0.14  .    ＊  F    2.32    1.16
Thr    132   .  .    .    .    T    T    .    0.63    -0.09  .    ＊  F    2.80    3.13
Arg    133   .  .    .    .    T    T    .    0.18    -0.01  .    .   F    2.52    1.61
Asn    134   .  .    .    .    T    T    .    0.84    0.07   .    .   F    1.49    0.60
Thr    135   .  .    .    .    T    T    .    0.49    -0.01  .    .   F    1.81    0.72
Val    136   .  .    .    .    T    .    C    0.80    0.07   ＊   .   .    0.58    0.20
Cys    137   .  A    .    .    T    .    .    1.11    0.07   ＊   .   .    0.10    0.21
Gln    138   .  A    B    .    .    .    .    0.66    -0.33  ＊   .   .    0.30    0.25
Cys    139   .  A    .    .    T    .    .    0.34    -0.39  .    .   .    0.70    0.34
Glu    140   A  A    .    .    .    .    .    -0.04   -0.54  ＊   ＊  F    0.75    0.91
Glu    141   A  A    .    .    .    .    .    0.92    -0.33  ＊   ＊  F    0.45    0.46
Gly    142   .  A    .    .    T    .    .    1.59    -0.73  .    ＊  F    1.30    1.67
Thr    143   A  A    .    .    .    .    .    1.59    -1.30  .    ＊  F    0.90    1.67
Phe    144   A  A    .    .    .    .    .    2.26    -1.30  .    ＊  F    0.90    1.67
Arg    145   A  A    .    .    .    .    .    1.96    -1.30  .    ＊  F    0.90    2.81
Glu    146   A  A    .    .    .    .    .    1.74    -1.34  .    ＊  F    0.90    2.61
Glu    147   A  A    .    .    .    .    .    2.09    -1.40  .    ＊  F    0.90    4.66
Asp    148   A  A    .    .    .    .    .    1.80    -2.19  .    ＊  F    0.90    4.12
Ser    149   A  .    .    .    .    T    .    1.83    -1.57  .    ＊  F    1.30    2.35
Pro    150   A  .    .    .    .    T    .    1.83    -1.00  .    .   F    1.15    0.73
表4(续)
残基   位置   I  II  III IV  V   VI   VII  VIII    IX      X   XI  XII  XIII     XIV
Glu    151    A  .   .   .   .   T    .    1.88    -1.00   ＊  .   F    1.15     0.85
Met    152    A  .   .   .   .   T    .    1.21    -1.00   ＊  ＊  .    1.49     1.28
Cys    153    A  .   .   .   .   T    .    1.32    -0.81   ＊  ＊  .    1.68     0.44
Arg    154    A  .   .   .   .   T    .    1.31    -1.24   ＊  .   .    2.02     0.50
Lys    155    .  .   .   .   T   T    .    1.18    -0.76   ＊  ＊  F    2.91     0.73
Cys    156    .  .   .   .   T   T    .    0.51    -0.94   ＊  .   F    3.40     1.35
Arg    157    .  .   .   .   T   .    .    0.90    -0.94   ＊  .   F    2.71     0.37
Thr    158    .  .   .   .   T   .    .    1.68    -0.51   ＊  .   F    2.37     0.28
Gly    159    .  .   .   .   T   .    .    1.22    -0.51   ＊  .   F    2.43     1.04
Cys    160    .  .   .   .   .   T    C    0.58    -0.66   .   ＊  F    2.19     0.53
Pro    161    .  .   .   .   T   T    .    0.39    -0.04   .   ＊  F    2.00     0.36
Arg    162    .  .   .   .   T   T    .    0.32    0.11    .   ＊  F    1.65     0.27
Gly    163    .  .   .   .   T   T    .    -0.22   -0.31   ＊  ＊  .    2.50     1.01
Met    164    .  .   B   B   .   .    .    -0.22   -0.24   ＊  ＊  .    1.30     0.48
Val    165    .  .   B   B   .   .    .    0.44    -0.24   ＊  ＊  .    1.30     0.24
Lys    166    .  .   B   B   .   .    .    -0.01   -0.24   ＊  ＊  .    1.30     0.41
Val    167    .  .   B   .   .   T    .    -0.43   -0.10   ＊  ＊  F    1.85     0.22
Gly    168    .  .   .   .   T   T    .    -0.30   -0.23   .   .   F    2.25     0.44
Asp    169    .  .   .   .   T   T    .    0.01    -0.44   .   .   F    2.50     0.34
Cys    170    .  .   .   .   T   T    .    0.57    0.47    .   ＊  F    1.35     0.48
Thr    171    .  .   .   .   .   T    C    0.52    0.21    .   ＊  F    1.20     0.65
Pro    172    .  .   .   .   T   T    .    0.49    -0.21   .   ＊  F    1.75     0.65
Trp    173    .  .   .   .   T   T    .    0.83    0.47    .   ＊  F    0.60     0.84
Ser    174    A  .   .   .   .   T    .    0.17    -0.10   .   ＊  F    1.00     1.01
Asp    175    A  A   .   .   .   .    .    -0.02   -0.01   .   .   F    0.45     0.35
Ile    176    A  A   .   .   .   .    .    0.26    0.20    ＊  ＊  .    -0.30    0.25
Glu    177    A  A   .   .   .   .    .    0.51    -0.21   ＊  .   .    0.30     0.25
Cys    178    A  A   .   .   .   .    .    0.80    -0.60   ＊  .   .    0.60     0.30
Val    179    A  A   .   .   .   .    .    0.80    -0.60   ＊  ＊  .    0.60     0.74
His    180    A  A   .   .   .   .    .    0.46    -0.90   .   ＊  .    0.60     0.58
Lys    181    A  A   .   .   .   .    .    0.46    -0.47   ＊  .   F    0.60     1.06
Glu    182    A  .   .   .   .   T    .    -0.43   -0.36   ＊  .   F    1.00     1.00
Ser    183    A  .   .   .   .   T    .    -0.66   -0.31   .   .   F    0.85     0.52
Gly    184    A  .   .   .   T   T    .    -0.14   -0.13   .   .   F    1.25     0.18
Ile    185    A  .   .   .   .   T    .    -0.97   0.30    .   .   .    0.10     0.10
Ile    186    .  .   B   B   .   .    .    -1.32   0.94    .   ＊  .    -0.60    0.06
Ile    187    .  .   B   B   .   .    .    -2.18   1.04    .   .   .    -0.60    0.08
Gly    188    .  .   B   B   .   .    .    -2.47   1.26    .   ＊  .    -0.60    0.09
Val    189    .  .   B   B   .   .    .    -2.71   1.07    .   .   .    -0.60    0.13
Thr    190    A  .   .   B   .   .    .    -2.68   0.89    .   ＊  .    -0.60    0.18
Val    191    A  .   .   B   .   .    .    -2.64   0.84    .   .   .    -0.60    0.14
Ala    192    A  .   .   B   .   .    .    -2.57   1.06    .   ＊  .    -0.60    0.14
Ala    193    A  .   .   B   .   .    .    -3.11   1.10    .   .   .    -0.60    0.08
Val    194    A  .   .   B   .   .    .    -3.11   1.30    .   .   .    -0.60    0.07
Val    195    A  .   .   B   .   .    .    -3.39   1.30    .   .   .    -0.60    0.05
Leu    196    A  .   .   B   .   .    .    -3.39   1.30    .   .   .    -0.60    0.05
Ile    197    A  .   .   B   .   .    .    -3.50   1.44    .   .   .    -0.60    0.05
Val    198    A  .   .   B   .   .    .    -3.77   1.59    .   .   .    -0.60    0.06
Ala    199    A  .   .   B   .   .    .    -3.58   1.59    .   .   .    -0.60    0.06
Val    200    A  .   .   B   .   .    .    -2.68   1.47    .   .   .    -0.60    0.04
表4(续)
残基   位置   I  II   III  IV   V    VI   VII  VIII   IX     X   XI  XII  XIII    XIV
Phe    201    A  .    .    B    .    .    .    -2.17  0.79   .   .   .    -0.60   0.12
Val    202    A  .    .    B    .    .    .    -2.09  0.53   .   .   .    -0.60   0.16
Cys    203    A  .    .    .    .    T    .    -2.04  0.71   .   .   .    -0.20   0.17
Lys    204    A  .    .    .    .    T    .    -1.74  0.76   .   .   .    -0.20   0.17
Ser    205    A  .    .    .    .    T    .    -0.84  0.89   .   .   .    -0.20   0.24
Leu    206    A  .    .    .    .    T    .    -0.10  0.24   .   .   .    0.10    0.88
Leu    207    A  A    .    .    .    .    .    -0.10  -0.33  .   .   .    0.30    0.88
Trp    208    A  A    .    .    .    .    .    -0.24  0.31   .   .   .    -0.30   0.49
Lys    209    A  A    .    .    .    .    .    -0.50  0.61   .   .   .    -0.60   0.49
Lys    210    A  A    .    .    .    .    .    -0.44  0.36   ＊  .   .    -0.30   0.91
Val    211    A  A    .    .    .    .    .    -0.44  0.43   ＊  ＊  .    -0.45   1.36
Leu    212    .  A    B    .    .    .    .    0.41   0.20   ＊  ＊  .    -0.30   0.56
Pro    213    .  A    B    .    .    .    .    0.36   0.20   ＊  .   .    -0.30   0.56
Tyr    214    .  .    .    B    T    .    .    -0.58  0.63   ＊  .   .    -0.20   0.75
Leu    215    .  .    .    B    T    .    .    -1.29  0.67   ＊  ＊  .    -0.20   0.64
Lys    216    .  .    .    B    T    .    .    -0.73  0.56   ＊  .   .    -0.20   0.22
Gly    217    .  .    B    B    .    .    .    -0.27  0.51   ＊  .   .    -0.60   0.19
Ile    218    .  .    B    B    .    .    .    -0.40  0.19   ＊  .   .    -0.30   0.23
Cys    219    .  .    B    .    .    T    .    -0.50  -0.07  ＊  .   .    0.70    0.11
Ser    220    .  .    .    .    T    T    .    -0.03  0.36   .   ＊  F    0.65    0.11
Gly    221    .  .    .    .    T    T    .    -0.08  0.36   .   .   F    0.65    0.16
Gly    222    .  .    .    .    T    T    .    0.06   -0.33  .   .   F    1.25    0.49
Gly    223    .  .    .    .    .    .    C    0.94   -0.47  .   .   F    0.85    0.57
Gly    224    .  .    .    .    .    .    C    1.72   -0.86  ＊  .   F    1.15    0.99
Asp    225    .  .    .    .    .    T    C    1.17   -1.29  .   ＊  F    1.50    1.97
Pro    226    .  .    .    .    .    T    C    1.51   -1.07  ＊  .   F    1.84    1.47
Glu    227    .  .    B    .    .    T    .    1.97   -1.50  ＊  .   F    1.98    2.49
Arg    228    .  .    B    .    .    T    .    2.01   -1.93  ＊  .   F    2.32    2.92
Val    229    .  .    .    .    T    .    .    2.06   -1.54  ＊  .   F    2.86    2.53
Asp    230    .  .    .    .    T    T    .    2.06   -1.59  ＊  .   F    3.40    1.96
Arg    231    .  .    .    .    T    T    .    2.38   -1.19  ＊  ＊  F    3.06    1.73
Ser    232    .  .    .    .    T    T    .    2.17   -1.19  ＊  .   F    2.72    4.57
Ser    233    .  .    .    .    T    T    .    1.71   -1.40  ＊  ＊  F    2.72    4.23
Gln    234    .  .    .    .    .    .    C    1.98   -0.97  ＊  ＊  F    2.32    2.14
Arg    235    .  .    .    .    .    T    C    1.98   -0.47  ＊  ＊  F    2.22    1.61
Pro    236    .  .    .    .    .    T    C    1.87   -0.86  ＊  ＊  F    2.86    2.08
Gly    237    .  .    .    .    T    T    .    2.17   -1.24  .   ＊  F    3.40    2.01
Ala    238    .  .    .    .    .    T    C    1.61   -1.24  .   ＊  F    2.86    1.65
Glu    239    A  .    .    .    .    .    .    0.80   -0.60  .   ＊  F    1.97    0.79
Asp    240    A  .    .    .    .    .    .    0.69   -0.34  .   ＊  F    1.33    0.66
Asn    241    A  .    .    .    .    .    .    0.90   -0.37  ＊  .   .    0.99    1.05
Val    242    A  .    .    .    .    .    .    0.36   -0.87  ＊  .   .    0.95    1.05
Leu    243    A  .    .    .    .    .    .    0.09   -0.19  ＊  .   .    0.50    0.44
Asn    244    A  .    .    B    .    .    .    -0.21  0.46   ＊  .   .    -0.60   0.20
Glu    245    A  .    .    B    .    .    .    -1.10  0.44   ＊  .   .    -0.60   0.37
Ile    246    A  .    .    B    .    .    .    -1.91  0.49   ＊  .   .    -0.60   0.31
Val    247    A  .    .    B    .    .    .    -1.06  0.49   ＊  .   .    -0.60   0.16
Ser    248    .  .    B    B    .    .    .    -0.46  0.49   ＊  .   .    -0.60   0.16
Ile    249    .  .    B    B    .    .    .    -0.77  0.91   ＊  .   .    -0.60   0.35
Leu    250    .  .    .    B    .    .    C    -0.77  0.71   .   .   .    -0.40   0.69
表4(续)
残基   位置  I  II   III  IV   V    VI   VII  VIII   IX      X   XI  XII  XIII    XIV
Gln    251   .  .    .    .    .    T    C    -0.73  0.47    .   .   F    0.15    0.89
Pro    252   .  .    .    .    .    T    C    -0.09  0.73    .   .   F    0.15    0.94
Thr    253   .  .    .    .    .    T    C    0.21   0.47    .   .   F    0.30    1.76
Gln    254   .  .    .    .    .    T    C    1.10   -0.21   .   .   F    1.20    1.76
Val    255   .  A    .    .    .    .    C    1.91   -0.21   .   .   F    0.80    1.97
Pro    256   .  A    .    .    .    .    C    1.31   -0.64   .   .   F    1.10    2.37
Glu    257   A  A    .    .    .    .    .    1.52   -0.51   .   ＊  F    0.90    1.35
Gln    258   A  A    .    .    .    .    .    0.98   -0.91   .   ＊  F    0.90    3.16
Glu    259   A  A    .    .    .    .    .    0.98   -0.91   .   ＊  F    0.90    1.51
Met    260   A  A    .    .    .    .    .    1.83   -0.94   .   ＊  F    0.90    1.51
Glu    261   A  A    .    .    .    .    .    1.83   -0.94   .   ＊  .    0.75    1.51
Val    262   A  A    .    .    .    .    .    1.24   -0.91   .   ＊  F    0.90    1.35
Gln    263   A  A    .    .    .    .    .    1.24   -0.41   .   ＊  F    0.60    1.38
Glu    264   A  A    .    .    .    .    .    1.03   -1.03   .   ＊  F    0.90    1.38
Pro    265   A  A    .    .    .    .    .    1.32   -0.60   .   ＊  F    1.18    2.88
Ala    265   A  A    .    .    .    .    .    0.98   -0.76   .   ＊  F    1.46    2.40
Glu    267   A  .    .    .    .    T    .    0.98   -0.73   .   ＊  F    2.14    1.37
Pro    268   A  .    .    .    .    T    .    0.98   -0.09   .   .   F    1.97    0.66
Thr    269   .  .    .    .    T    T    .    0.38   -0.11   .   .   F    2.80    1.05
Gly    270   A  .    .    .    .    T    .    -0.22  0.00    .   .   F    1.37    0.60
Val    271   A  .    .    .    .    .    .    0.07   0.69    .   .   .    0.44    0.32
Asn    272   .  .    B    .    .    .    .    -0.14  0.64    .   .   .    0.16    0.30
Met    273   .  .    B    .    .    .    .    -0.28  0.59    .   .   .    0.18    0.46
Leu    274   .  .    .    .    .    .    C    0.03   0.59    .   .   .    0.40    0.62
Ser    275   .  .    .    .    .    T    C    0.08   -0.06   .   .   F    1.95    0.66
Pro    276   .  .    .    .    .    T    C    0.93   -0.07   .   .   F    2.25    0.90
Gly    277   .  .    .    .    .    T    C    0.90   -0.69   .   .   F    3.00    1.89
Glu    278   A  .    .    .    .    T    .    0.69   -0.87   .   .   F    2.50    1.92
Ser    279   A  A    .    .    .    .    .    0.69   -0.57   .   .   F    1.80    1.02
Glu    280   A  A    .    .    .    .    .    0.99   -0.31   .   .   F    1.05    0.85
His    281   A  A    .    .    .    .    .    0.99   -0.74   .   .   F    1.05    0.85
Leu    282   A  A    .    .    .    .    .    0.74   -0.31   .   .   .    0.30    0.98
Leu    283   A  A    .    .    .    .    .    0.74   -0.20   .   .   .    0.30    0.57
Glu    284   A  A    .    .    .    .    .    0.46   -0.20   .   .   F    0.45    0.73
Pro    285   A  A    .    .    .    .    .    0.46   -0.20   .   .   F    0.45    0.89
Ala    286   A  A    .    .    .    .    .    0.60   -0.89   .   .   F    0.90    1.88
Glu    287   A  A    .    .    .    .    .    1.11   -1.57   .   .   F    0.90    2.13
Ala    288   A  A    .    .    .    .    .    1.92   -1.19   .   .   F    0.90    1.84
Glu    289   A  A    .    .    .    .    .    2.03   -1.21   ＊  .   F    0.90    3.16
Arg    290   A  A    .    .    .    .    .    2.36   -1.71   ＊  .   F    0.90    3.57
Ser    291   A  .    .    .    .    T    .    3.06   -1.71   ＊  .   F    1.30    6.92
Gln    292   A  .    .    .    .    T    .    2.24   -2.21   ＊  .   F    1.30    7.83
Arg    293   A  .    .    .    .    T    .    2.02   -1.53   .   .   F    1.30    3.30
Arg    294   A  .    .    .    .    T    .    1.17   -0.84   .   .   F    1.30    2.03
Arg    295   .  .    .    B    T    .    .    0.84   -0.59   .   ＊  F    1.15    0.87
Leu    296   .  .    B    B    .    .    .    0.56   -0.56   .   ＊  .    0.60    0.69
Leu    297   .  .    B    B    .    .    .    0.56   -0.06   .   ＊  .    0.30    0.35
Val    298   .  .    .    B    .    .    C    0.44   0.34    ＊  ＊  .    0.20    0.29
Pro    299   .  .    .    .    .    T    C    -0.01  0.34    ＊  .   .    0.90    0.61
Ala    300   .  .    .    .    .    T    C    -0.12  0.09    ＊  ＊  F    1.35    0.73
表4(续)
残基   位置  I  II  III IV  V   VI  VII VIII   IX     X    XI  XII  XIII    XIV
Asn    301   .  .   .   .   .   T   C   0.48   -0.60  .    .   F    2.70    1.65
Glu    302   .  .   .   .   .   T   C   0.98   -0.81  .    .   F    3.00    1.65
Gly    303   .  .   .   .   .   .   C   1.83   -0.76  .    .   F    2.50    2.35
Aso    304   .  .   .   .   .   T   C   1.73   -1.26  .    .   F    2.40    2.54
Pro    305   .  .   .   .   .   T   C   1.51   -1.17  .    ＊  F    2.10    2.11
Thr    306   A  .   .   .   .   T   .   1.62   -0.49  .    ＊  F    1.30    1.76
Glu    307   A  .   .   .   .   T   .   1.62   -0.91  ＊   ＊  F    1.30    2.07
Thr    308   A  .   .   B   .   .   .   1.30   -0.51  ＊   ＊  F    0.90    2.31
Leu    309   A  .   .   B   .   .   .   0.60   -0.37  ＊   ＊  F    0.45    0.86
Arg    310   A  .   .   B   .   .   .   0.81   -0.07  ＊   ＊  .    0.30    0.43
Gln    311   A  .   .   B   .   .   .   1.12   -0.07  ＊   ＊  .    0.30    0.50
Cys    312   A  .   .   .   .   T   .   0.42   -0.56  ＊   ＊  .    1.15    1.01
Phe    313   A  .   .   .   .   T   .   0.14   -0.46  ＊   ＊  .    0.70    0.45
Asp    314   .  .   .   .   T   T   .   0.96   0.04   ＊   ＊  .    0.50    0.26
Asp    315   A  .   .   .   .   T   .   0.03   -0.36  ＊   ＊  .    0.70    0.81
Phe    316   A  A   .   .   .   .   .   -0.82  -0.24  ＊   .   .    0.30    0.77
Ala    317   A  A   .   .   .   .   .   -0.37  -0.39  ＊   .   .    0.30    0.34
Asp    318   A  A   .   .   .   .   .   -0.37  0.04   ＊   ＊  .    -0.30   0.32
Leu    319   A  A   .   .   .   .   .   -0.37  0.83   .    .   .    -0.60   0.32
Val    320   .  A   .   .   .   .   C   -0.67  0.04   .    .   .    -0.10   0.52
Pro    321   .  A   .   .   .   .   C   -0.26  -0.07  .    .   .    0.50    0.42
Phe    322   .  .   .   .   T   T   .   0.33   0.84   .    .   .    0.20    0.54
Asp    323   A  .   .   .   .   T   .   0.12   0.16   .    .   .    0.25    1.25
Ser    324   A  .   .   .   .   T   .   0.12   -0.06  .    .   F    1.00    1.25
Trp    325   A  .   .   .   .   T   .   0.38   0.20   ＊   ＊  F    0.40    1.19
Glu    326   A  A   .   .   .   .   .   0.70   0.03   ＊   .   F    -0.15   0.71
Pro    327   A  A   .   .   .   .   .   1.44   0.03   ＊   .   .    -0.15   1.03
Leu    328   A  A   .   .   .   .   .   0.63   -0.36  ＊   .   .    0.45    1.96
Met    329   A  A   .   .   .   .   .   0.59   -0.59  ＊   .   .    0.60    0.93
Arg    330   A  A   .   .   .   .   .   0.07   -0.16  ＊   .   .    0.30    0.60
Lys    331   A  A   .   .   .   .   .   -0.5   30.10  ＊   .   .    -0.30   0.60
Leu    332   A  A   .   .   .   .   .   -0.3   20.03  ＊   .   .    -0.30   0.60
Gly    333   A  A   .   .   .   .   .   0.49   -0.59  ＊   .   .    0.60    0.51
Leu    334   A  A   .   .   .   .   .   1.09   -0.19  ＊   .   .    0.30    0.41
Met    335   A  A   .   .   .   .   .   0.09   -0.19  ＊   ＊  .    0.30    0.86
Asp    336   A  A   .   .   .   .   .   0.09   -0.19  .    ＊  F    0.45    0.61
Asn    337   A  A   .   .   .   .   .   0.04   -0.61  ＊   ＊  F    0.90    1.48
Glu    338   A  A   .   .   .   .   .   -0.20  -0.66  ＊   ＊  F    0.90    1.11
Ile    339   A  A   .   .   .   .   .   0.66   -0.77  ＊   ＊  F    0.75    0.67
Lys    340   A  A   .   .   .   .   .   0.67   -0.77  .    ＊  F    0.75    0.83
Val    341   A  A   .   .   .   .   .   0.67   -0.67  .    ＊  .    0.60    0.49
Ala    342   A  A   .   .   .   .   .   0.08   -0.67  .    .   .    0.75    1.20
Lys    343   A  A   .   .   .   .   .   -0.51  -0.86  .    ＊  .    0.60    0.61
Ala    344   A  A   .   .   .   .   .   0.03   -0.36  .    ＊  .    0.30    0.83
Glu    345   A  A   .   .   .   .   .   -0.04  -0.57  ＊   .   .    0.60    0.81
Ala    346   A  A   .   .   .   .   .   0.92   -0.57  ＊   .   .    0.60    0.55
Ala    347   A  A   .   .   .   .   .   1.51   -0.57  .    ＊  .    0.75    1.07
Gly    348   A  .   .   .   .   .   .   1.16   -1.07  .    ＊  .    0.95    1.03
His    349   A  .   .   .   .   T   .   0.93   -0.59  .    .   .    1.15    1.47
Arg    350   A  .   .   .   .   T   .   0.69   -0.40  .    .   F    1.00    1.20
表4(续)
残基   位置   I  II   III  IV   V    VI   VII  VIII    IX      X  XI     XII  XIII   XIV
Asp    351    A  .    .    .    .    T    .    0.97    -0.14   .  .      F    1.00   1.90
Thr    352    A  .    .    .    .    T    .    0.96    -0.09   .  .      F    1.00   2.02
Leu    353    A  .    .    B    .    .    .    0.49    0.03    .  .      .    -0.15  1.02
Tyr    354    A  .    .    B    .    .    .    -0.37   0.71    .  ＊     .    -0.60  0.50
Thr    355    A  .    .    B    .    .    .    -0.43   1.40    .  ＊     .    -0.60  0.24
Met    356    A  .    .    B    .    .    .    -0.72   0.91    ＊  .     .    -0.60  0.59
Leu    357    A  .    .    B    .    .    .    -1.27   1.14    ＊  .     .    -0.60  0.40
Ile    358    A  .    .    B    .    .    .    -0.46   1.03    ＊  ＊    .    -0.60  0.20
Lys    359    A  .    .    B    .    .    .    -0.17   0.94    ＊  ＊    .    -0.60  0.33
Trp    360    A  .    .    B    .    .    .    -0.17   0.33    ＊  ＊    .    0.00   0.81
Val    361    A  .    .    B    .    .    .    0.09    0.13    ＊  ＊    .    0.45   1.66
Asn    362    .  .    .    .    .    T    C    1.01    -0.13   ＊  .     F    1.95   0.82
Lys    363    .  .    .    .    .    T    C    1.90    -0.13   ＊  ＊    F    2.40   1.53
Thr    364    .  .    .    .    .    T    C    1.27    -1.04   ＊  .     F    3.00   3.44
Gly    365    .  .    .    .    .    T    C    1.26    -1.19   ＊  .     F    2.70   2.16
Arg    366    .  A    .    .    T    .    .    1.26    -1.20   ＊  .     F    2.20   1.45
Asp    367    .  A    .    .    .    .    C    1.22    -0.56   ＊  .     F    1.55   0.75
Ala    368    A  A    .    .    .    .    .    0.87    -0.54   .   .     F    1.20   1.03
Ser    369    A  A    .    .    .    .    .    0.37    -0.49   .   .     .    0.30   0.76
Val    370    A  A    .    .    .    .    .    -0.10   0.20    .   ＊    .    -0.30  0.37
His    371    A  A    .    .    .    .    .    -0.21   0.89    .   ＊    .    -0.60  0.30
Thr    372    A  A    .    .    .    .    .    -0.80   0.39    ＊  ＊    .    -0.30  0.38
Leu    373    A  A    .    .    .    .    .    -1.02   0.50    ＊  ＊    .    -0.60  0.52
Leu    374    A  A    .    .    .    .    .    -0.72   0.54    ＊  .     .    -0.60  0.31
Asp    375    A  A    .    .    .    .    .    -0.18   0.04    ＊  .     .    -0.30  0.38
Ala    376    A  A    .    .    .    .    .    -0.96   0.04    ＊  .     .    -0.30  0.66
Leu    377    A  A    .    .    .    .    .    -0.99   0.04    ＊  .     .    -0.30  0.66
Glu    378    A  A    .    .    .    .    .    -0.18   -0.21   ＊  .     .    0.30   0.39
Thr    379    A  A    .    .    .    .    .    0.74    -0.21   ＊  ＊    F    0.45   0.67
Leu    380    A  A    .    .    .    .    .    -0.07   -0.71   ＊  .     F    0.90   1.59
Gly    381    A  A    .    .    .    .    .    -0.07   -0.71   ＊  .     F    0.75   0.76
Glu    382    A  A    .    .    .    .    .    0.79    -0.21   ＊  .     F    0.45   0.53
Arg    383    A  A    .    .    .    .    .    0.79    -0.70   ＊  .     F    0.90   1.28
Leu    384    A  A    .    .    .    .    .    1.14    -0.99   ＊  ＊    F    0.90   2.24
Ala    385    A  A    .    .    .    .    .    1.07    -1.41   ＊  ＊    F    0.90   2.59
Lys    386    A  A    .    .    .    .    .    1.41    -0.73   ＊  .     F    0.75   0.93
Gln    387    A  A    .    .    .    .    .    1.41    -0.73   ＊  ＊    F    0.90   1.95
Lys    388    A  A    .    .    .    .    .    1.27    -1.41   ＊  ＊    F    0.90   3.22
Ile    389    A  A    .    .    .    .    .    1.27    -1.41   .   ＊    F    0.90   2.19
Glu    390    A  A    .    .    .    .    .    1.04    -0.73   ＊  ＊    F    0.90   1.04
Asp    391    A  A    .    .    .    .    .    0.70    -0.44   .   ＊    F    0.45   0.43
His    392    A  A    .    .    .    .    .    0.40    -0.06   ＊  ＊    .    0.30   0.82
Leu    393    A  A    .    .    .    .    .    0.01    -0.36   ＊  ＊    .    0.30   0.64
Leu    394    A  A    .    .    .    .    .    0.94    0.07    ＊  ＊    F    -0.15  0.38
Ser    395    A  .    .    .    .    T    .    0.24    0.07    ＊  ＊    F    0.25   0.55
Ser    396    A  .    .    .    .    T    .    -0.36   0.36    ＊  ＊    F    0.25   0.58
Gly    397    .  .    .    .    T    T    .    -0.57   0.29    .   .     F    0.65   0.70
Lys    398    A  .    .    .    .    T    .    -0.57   0.36    .   .     F    0.25   0.82
Phe    399    A  A    .    .    .    .    .    0.24    0.66    .   .     .    -0.60  0.50
Met    400    .  A    B    .    .    .    .    0.20    0.27    .   ＊    .    -0.30  0.88
表4(续)
残基   位置   I  II III  IV   V    VI   VII  VIII    IX      X   XI   XII  XIII    XIV
Tyr    401    .  A  B    .    .    .    .    0.50    0.27    .   ＊   .    -0.30   0.44
Leu    402    A  A  .    .    .    .    .    0.26    0.67    .   ＊   .    -0.60   0.81
Glu    403    A  A  .    .    .    .    .    0.21    0.39    .   ＊   .    -0.30   0.82
Gly    404    A  .  .    .    .    .    .    0.61    -0.23   .   ＊   F    0.65    0.88
Asn    405    A  .  .    .    .    T    .    0.62    -0.60   .   ＊   F    1.30    1.43
Ala    406    A  .  .    .    .    T    .    0.27    -0.79   .   ＊   F    1.15    0.83
Asp    407    A  .  .    .    .    T    .    0.78    -0.17   .   ＊   F    0.85    0.83
Ser    408    A  .  .    .    .    T    .    0.39    -0.21   .   ＊   F    0.85    0.69
Ala    409    A  .  .    .    .    .    .    0.34    -0.19   .   ＊   .    0.50    0.88
Met    410    A  .  .    .    .    .    .    -0.04   -0.26   .   .    .    0.50    0.67
Ser    411    A  .  .    .    .    .    .    0.16    0.17    .   .    .    -0.10   0.64
在另一个方面中，本发明提供了一种抗体，其结合包含或由TR7的1，2，3，4，5或更多个携带表位部分组成的肽或多肽。这种多肽部分的表位是本文所述多肽的一种免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指当整个蛋白质是免疫原时激发抗体应答的蛋白质部分。另一方面，抗体可以结合的蛋白质分子的区域是“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位数一般少于抗原性表位数。见例如Geysen等，美国科学院院报81：3998-4002(1983)。
为选择携带抗原性表位(即含有抗体可以结合的蛋白质分子的区域)的肽或多肽，本领域熟知的是，模拟蛋白质序列一部分的相对短的合成肽通常能激发与所述被部分模拟的蛋白质反应的抗血清。见例如Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.(1983)，与蛋白质上预定位点反应的抗体，科学219：660-666。能激发蛋白质反应性血清的肽通常在蛋白质的初级序列中呈现，可以通过一系列简便的化学规则定性，而且既不限于完整蛋白质的免疫显性区域(即免疫原性表位)，也不限于氨基或羧基末端。
因此携带抗原性表位的肽和多肽可用于产生结合TR7多肽的抗体，包括单克隆抗体。见例如Wilson等，细胞37：767-778(1984)的第777页所述。携带抗原性表位的肽和多肽优选含有一种序列，所述序列具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中包含的至少7个，更优选至少9个及最优选至少大约15-30个氨基酸。
本发明的抗体可以结合一或多种抗原性TR7多肽或肽，包括但非限于：包含或由SEQ ID NO：3的大约第62-110位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第119-164位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第224-271位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第275-370位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第69-80位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第88-95位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第99-103位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第119-123位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第130-135位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第152-163位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第226-238位氨酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第275-279位氨基酸残基组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约第301-305位氨基酸残基组成的多肽；和/或包含或由SEQ ID NO：3的大约第362-367位氨基酸残基组成的多肽。文中“大约”包括所述范围及在一个端值或在两个端值多或少几个(5，4，3，2或1个)氨基酸的范围。如上所述，本发明人已经确定了上述多肽片段是TR7受体蛋白的抗原性区域。
携带表位的TR7肽和多肽可以通过任何常规方法产生。Houghten，R.A.，“快速固相合成大量肽的一般方法：在各个氨基酸水平抗原-抗体相互作用的特异性”，美国科学院院报82：5131-5135(1985)。这个“同时多个肽合成(SMPS)”方法在Houghten等(1986)的美国专利No.4631211中进一步描述。
本领域技术人员能意识到，本文所述TR7受体多肽及其携带表位的片段(例如相应于胞外结构域的一部分，例如SEQ ID NO：3的第52-184位氨基酸残基)，可以与免疫球蛋白(IgG)的恒定区的部分组合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白便于纯化并示出在体内的半衰期延长，这已经由例如由人CD4多肽的前两个结构域与哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链恒定区的各个结构域组成的嵌合蛋白示出(EPA 394827；Traunecker等，自然331：84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白比单独的单体TR7蛋白或蛋白质片段更有效结合及中和其它分子(Fountoulakis等，生物化学杂志270：3958-3964(1995))。TR7融合蛋白可以用作免疫原激发抗TR7抗体。因此，本发明的抗体可以结合包含完整或部分TR7多肽如TR7的融合蛋白。
本领域已知的重组DNA技术可以用于产生新的突变蛋白质或称“突变蛋白(muteins)”，所述突变蛋白包括单个或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出例如增强的活性或提高的稳定性。另外，至少在一定的纯化和贮存条件下，它们可以以较高产量纯化，并示出比相应的天然多肽更好的溶解性。本发明的抗体也可以结合这些修饰的TR7多肽或TR7多肽片段或变体。
例如，就许多蛋白质、包括膜结合蛋白的胞外结构域或者分泌蛋白的成熟形式而言，本领域已知可以从N末端或C末端缺失一或多个氨基酸基本不丧失生物学功能，或者不丧失由特异性抗体结合的能力。然而，即使蛋白质N末端或C末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质被修饰或丧失一或多种生物学功能，但仍可保留其它的TR7功能活性。例如，在许多情况中，不管缺失的大小或部位，缩短的蛋白质诱导和/或结合识别TR7的抗体(优选特异性结合TR7的抗体)的能力一般仍保留。事实上，由少如6个TR7氨基酸残基组成的肽通常就能激发免疫应答。缺失完整多肽N末端和/或C末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫学活性可以通过本发明所述常规方法及本领域已知的其它方法容易地确定。
如上所述，即使蛋白质的N末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质被修饰或丧失一或多种生物学功能，但其它功能活性仍可保留(例如生物学活性，多聚化能力，结合TR7配体的能力)。例如，当完整或成熟形式多肽的少部分残基从N末端除去时，缩短的TR7多肽诱导和/或结合识别完整或成熟形式多肽的抗体的能力一般仍保留。缺失完整多肽N末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫原性活性，可易于通过在此所述常规方法及本领域已知其它方法确定。大量缺失N末端氨基酸残基的TR7多肽仍保留一些生物学或免疫原性活性不是不可能的。
因此，本发明进一步提供了结合如下多肽的抗体及编码这种多肽的多核苷酸，所述多肽中自SEQ ID NO：3的TR7氨基酸序列的氨基末端直至第406位丙氨酸残基缺失一或多个残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：3的第n5-411位残基的氨基酸序列，其中n5是相当于SEQ ID NO：3中氨基酸残基位置2-406之间的一个整数。
更特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含或由以下残基的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：3所示TR7序列的E-2至S-411；Q-3至S-411；R-4至S-411；G-5至S-411；Q-6至S-411；N-7至S-411；A-8至S-411；P-9至S-411；A-10至S-411；A-11至S-411；S-12至S-411；G-13至S-411；A-14至S-411；R-15至S-411；K-16至S-411；R-17至S-411；H-18至S-411；G-19至S-411；P-20至S-411；G-21至S-411；P-22至S-411；R-23至S-411；E-24至S-411；A-25至S-411；R-26至S-411；G-27至S-411；A-28至S-411；R-29至S-411；P-30至S-411；G-31至S-411；P-32至S-411；R-33至S-411；V-34至S-411；P-35至S-411；K-36至S-411；T-37至S-411；L-38至S-411；V-39至S-411；L-40至S-411；V-41至S-411；V-42至S-411；A-43至S-411；A-44至S-411；V-45至S-411；L-46至S-411；L-47至S-411；L-48至S-411；V-49至S-411；S-50至S-411；A-51至S-411；E-52至S-411；S-53至S-411；A-54至S-411；L-55至S-411；I-56至S-411；T-57至S-411；Q-58至S-411；Q-59至S-411；D-60至S-411；L-61至S-411；A-62至S-411；P-63至S-411；Q-64至S-411；Q-65至S-411；R-66至S-411；A-67至S-411；A-68至S-411；P-69至S-411；Q-70至S-411；Q-71至S-411；K-72至S-411；R-73至S-411；S-74至S-411；S-75至S-411；P-76至S-411；S-77至S-411；E-78至S-411；G-79至S-411；L-80至S-411；C-81至S-411；P-82至S-411；P-83至S-411；G-84至S-411；H-85至S-411；H-86至S-411；I-87至S-411；S-88至S-411；E-89至S-411；D-90至S-411；G-91至S-411；R-92至S-411；D-93至S-411；C-94至S-411；I-95至S-411；S-96至S-411；C-97至S-411；K-98至S-411；Y-99至S-411；G-100至S-411；QL-101至S-411；D-102至S-411；Y-103至S-411；S-104至S-411；T-105至S-411；H-106至S-411；W-107至S-411；N-108至S-411；D-109至S-411；L-110至S-411；L-111至S-411；F-112至S-411；C-113至S-411；L-114至S-411；R-115至S-411；C-116至S-411；T-117至S-411；R-118至S-411；C-119至S-411；D-120至S-411；S-121至S-411；G-122至S-411；E-123至S-411；V-124至S-411；E-125至S-411；L-126至S-411；S-127至S-411；P-128至S-411；C-129至S-411；T-130至S-411；T-131至S-411；T-132至S-411；R-133至S-411；N-134至S-411；T-135至S-411；V-136至S-411；C-137至S-411；Q-138至S-411；C-139至S-411；E-140至S-411；E-141至S-411；G-142至S-411；T-143至S-411；F-144至S-411；R-145至S-411；E-146至S-411；E-147至S-411；D-148至S-411；S-149至S-411；P-150至S-411；E-151至S-411；M-152至S-411；C-153至S-411；R-154至S-411；K-155至S-411；C-156至S-411；R-157至S-411；T-158至S-411；G-159至S-411；C-160至S-411；P-161至S-411；R-162至S-411；G-163至S-411；M-164至S-411；V-165至S-411；K-166至S-411；V-167至S-411；G-168至S-411；D-169至S-411；C-170至S-411；T-171至S-411；P-172至S-411；W-173至S-411；S-174至S-411；D-175至S-411；I-176至S-411；E-177至S-411；C-178至S-411；V-179至S-411；H-180至S-411；K-181至S-411；E-182至S-411；S-183至S-411；G-184至S-411；I-185至S-411；I-186至S-411；I-187至S-411；G-188至S-411；V-189至S-411；T-190至S-411；V-191至S-411；A-192至S-411；A-193至S-411；V-194至S-411；V-195至S-411；L-196至S-411；I-197至S-411；V-198至S-411；A-199至S-411；V-200至S-411；F-201至S-411；V-202至S-411；C-203至S-411；K-204至S-411；S-205至S-411；L-206至S-411；L-207至S-411；W-208至S-411；K-209至S-411；K-210至S-411；V-211至S-411；L-212至S-411；P-213至S-411；Y-214至S-411；L-215至S-411；K-216至S-411；G-217至S-411；I-218至S-411；C-219至S-411；S-220至S-411；G-221至S-411；G-222至S-411；G-223至S-411；G-224至S-411；D-225至S-411；P-226至S-411；E-227至S-411；R-228至S-411；V-229至S-411；D-230至S-411；R-231至S-411；S-232至S-411；S-233至S-411；Q-234至S-411；RG-235至S-411；P-236至S-411；G-237至S-411；A-238至S-411；E-239至S-411；D-240至S-411；N-241至S-411；V-242至S-411；L-243至S-411；N-244至S-411；E-245至S-411；I-246至S-411；V-247至S-411；S-248至S-411；I-249至S-411；L-250至S-411；P-251至S-411；P-252至S-411；T-253至S-411；Q-254至S-411；V-255至S-411；P-256至S-411；E-257至S-411；Q-258至S-411；E-259至S-411；M-260至S-411；E-261至S-411；V-262至S-411；Q-263至S-411；E-264至S-411；P-265至S-411；A-266至S-411；E-267至S-411；P-268至S-411；T-269至S-411；G-270至S-411；V-271至S-411；N-272至S-411；M-273至S-411；L-274至S-411；S-275至S-411；P-276至S-411；G-277至S-411；E-278至S-411；S-279至S-411；E-280至S-411；H-281至S-411；L-282至S-411；L-283至S-411；E-284至S-411；P-285至S-411；A-286至S-411；E-287至S-411；A-288至S-411；E-289至S-411；R-290至S-411；S-291至S-411；Q-292至S-411；R-293至S-411；R-294至S-411；R-295至S-411；L-296至S-411；L-297至S-411；V-298至S-411；P-299至S-411；A-300至S-411；N-301至S-411；E-302至S-411；G-303至S-411；D-304至S-411；P-305至S-411；T-306至S-411；E-307至S-411；T-308至S-411；L-309至S-411；R-310至S-411；Q-311至S-411；C-312至S-411；F-313至S-411；D-314至S-411；D-315至S-411；F-316至S-411；A-317至S-411；D-318至S-411；L-319至S-411；V-320至S-411；P-321至S-411；F-322至S-411；D-323至S-411；S-324至S-411；W-325至S-411；E-326至S-411；P-327至S-411；L-328至S-411；M-329至S-411；R-330至S-411；K-331至S-411；L-332至S-411；G-333至S-411；L-334至S-411；M-335至S-411；D-336至S-411；N-337至S-411；E-338至S-411；I-339至S-411；K-340至S-411；V-341至S-411；A-342至S-411；K-343至S-411；A-344至S-411；E-345至S-411；A-346至S-411；A-347至S-411；G-348至S-411；H-349至S-411；R-350至S-411；D-351至S-411；T-352至S-411；L-353至S-411；Y-354至S-411；T-355至S-411；M-356至S-411；L-357至S-411；I-358至S-411；K-359至S-411；W-360至S-411；V-361至S-411；N-362至S-411；K-363至S-411；T-364至S-411；G-365至S-411；R-366至S-411；D-367至S-411；A-368至S-411；S-369至S-411；V-370至S-411；H-371至S-411；T-372至S-411；L-373至S-411；L-374至S-411；D-375至S-411；A-376至S-411；L-377至S-411；E-378至S-411；T-379至S-411；L-380至S-411；G-381至S-411；E-382至S-411；R-383至S-411；L-384至S-411；A-385至S-411；K-386至S-411；Q-387至S-411；K-388至S-411；I-389至S-411；E-390至S-411；D-391至S-411；H-392至S-411；L-393至S-411；L-394至S-411；S-395至S-411；S-396至S-411；G-397至S-411；K-398至S-411；F-399至S-411；M-400至S-411；Y-401至S-411；L-402至S-411；E-403至S-411；G-404至S-411；N-405至S-411和/或A406至S-411。
在另一个实施方案中，TR7多肽的N末端缺失可以用通式n6-184描述，其中n6是相当于SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的1-179位的一个数目。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由以下残基的氨基酸序列组成的TR7的N末端缺失：SEQ ID NO：3所示TR7胞外结构域序列的E-2至S-411；Q-3至S-411；R-4至S-411；G-5至S-411；Q-6至S-411；N-7至S-411；A-8至S-411；P-9至S-411；A-10至S-411；A-11至S-411；S-12至S-411；G-13至G-184；A-14至G-184；R-15至G-184；K-16至G-184；R-17至G-184；H-18至G-184；G-19至G-184；P-20至G-184；G-21至G-184；P-22至G-184；R-23至G-184；E-24至G-184；A-25至G-184；R-26至G-184；G-27至G-184；A-28至G-184；R-29至G-184；P-30至G-184；G-31至G-184；P-32至G-184；R-33至G-184；V-34至G-184；P-35至G-184；K-36至G-184；T-37至G-184；L-38至G-184；V-39至G-184；L-40至G-184；V-41至G-184；V-42至G-184；A-43至G-184；A-44至G-184；V-45至G-184；L-46至G-184；L-47至G-184；L-48至G-184；V-49至G-184；S-50至G-184；A-51至G-184；E-52至G-184；S-53至G-184；A-54至G-184；L-55至G-184；I-56至G-184；T-57至G-184；Q-58至G-184；Q-59至G-184；D-60至G-184；L-61至G-184；A-62至G-184；P-63至G-184；Q-64至G-184；Q-65至G-184；R-66至G-184；A-67至G-184；A-68至G-184；P-69至G-184；Q-70至G-184；Q-71至G-184；K-72至G-184；R-73至G-184；S-74至G-184；S-75至G-184；P-76至G-184；S-77至G-184；E-78至G-184；G-79至G-184；L-80至G-184；C-81至G-184；P-82至G-184；P-83至G-184；G-84至G-184；H-85至G-184；H-86至G-184；I-87至G-184；S-88至G-184；E-89至G-184；D-90至G-184；G-91至G-184；R-92至G-184；D-93至G-184；C-94至G-184；I-95至G-184；S-96至G-184；C-97至G-184；K-98至G-184；Y-99至G-184；G-100至G-184；QL-101至G-184；D-102至G-184；Y-103至G-184；S-104至G-184；T-105至G-184；H-106至G-184；W-107至G-184；N-108至G-184；D-109至G-184；L-110至G-184；L-111至G-184；F-112至G-184；C-113至G-184；L-114至G-184；R-115至G-184；C-116至G-184；T-117至G-184；R-118至G-184；C-119至G-184；D-120至G-184；S-121至G-184；G-122至G-184；E-123至G-184；V-124至G-184；E-125至G-184；L-126至G-184；S-127至G-184；P-128至G-184；C-129至G-184；T-130至G-184；T-131至G-184；T-132至G-184；R-133至G-184；N-134至G-184；T-135至G-184；V-136至G-184；C-137至G-184；Q-138至G-184；C-139至G-184；E-140至G-184；E-141至G-184；G-142至G-184；T-143至G-184；F-144至G-184；R-145至G-184；E-146至G-184；E-147至G-184；D-148至G-184；S-149至G-184；P-150至G-184；E-151至G-184；M-152至G-184；C-153至G-184；R-154至G-184；K-155至G-184；C-156至G-184；R-157至G-184；T-158至G-184；G-159至G-184；C-160至G-184；P-161至G-184；R-162至G-184；G-163至G-184；M-164至G-184；V-165至G-184；K-166至G-184；V-167至G-184；G-168至G-184；D-169至G-184；C-170至G-184；T-171至G-184；P-172至G-184；W-173至G-184；S-174至G-184；D-175至G-184；I-176至G-184；E-177至G-184；C-178至G-184和/或V-179至G-184。
如上所述，即使蛋白质C末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质被修饰而丧失一或多种生物学功能，但其它功能活性(例如生物学活性，多聚体化能力，结合TR7配体(例如TRAIL)的能力)仍可保留。例如当从C末端除去完整或成熟多肽的一少部分残基时，缩短的TR7多肽诱导和/或结合识别完整或成熟形式TR7多肽的抗体的能力仍保留。缺失完整多肽C末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫学活性可以通过本发明所述常规方法及本领域已知的其它方法确定。缺失大量C末端氨基酸残基的TR7多肽仍保留一些生物学活性或免疫原性活性不是不可能的。事实上，由少如6个TR7氨基酸残基组成的肽通常就能激发免疫应答。
因此，本发明进一步提供了结合如下多肽的抗体及编码这种多肽的多核苷酸，所述多肽中自SEQ ID NO：3的TR7氨基酸序列的羧基末端直至第52位谷氨酸残基缺失一或多个残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：3的52-m5残基的氨基酸序列，其中m5是相当于SEQ ID NO：3中氨基酸残基位置57-410之间的一个整数。
更特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：3所示TR7胞外结构域序列的E-52至M-410；E-52至A-409；E-52至S-408；E-52至D-407；E-52至A-406；E-52至N-405；E-52至G-404；E-52至E-403；E-52至L-402；E-52至Y-401；E-52至M-400；E-52至F-399；E-52至K-398；E-52至G-397；E-52至S-396；E-52至S-395；E-52至L-394；E-52至L-393；E-52至H-392；E-52至D-391；E-52至E-390；E-52至I-389；E-52至K-388；E-52至Q-387；E-52至K-386；E-52至A-385；E-52至L-384；E-52至R-383；E-52至E-382；E-52至G-381；E-52至L-380；E-52至T-379；E-52至E-378；E-52至L-377；E-52至A-376；E-52至D-375；E-52至L-374；E-52至L-373；E-52至T-372；E-52至H-371；E-52至V-370；E-52至S-369；E-52至A-368；E-52至D-367；E-52至R-366；E-52至G-365；E-52至T-364；E-52至K-363；E-52至N-362；E-52至V-361；E-52至W-360；E-52至K-359；E-52至I-358；E-52至L-357；E-52至M-356；E-52至T-355；E-52至Y-354；E-52至L-353；E-52至T-352；E-52至D-351；E-52至R-350；E-52至H-349；E-52至G-348；E-52至A-347；E-52至A-346；E-52至E-345；E-52至A-344；E-52至K-343；E-52至A-342；E-52至V-341；E-52至K-340；E-52至I-339；E-52至E-338；E-52至N-337；E-52至D-336；E-52至M-335；E-52至L-334；E-52至G-333；E-52至L-332；E-52至K-331；E-52至R-330；E-52至M-329；E-52至L-328；E-52至P-327；E-52至E-326；E-52至W-325；E-52至S-324；E-52至D-323；E-52至F-322；E-52至P-321；E-52至V-320；E-52至L-319；E-52至D-318；E-52至A-317；E-52至F-316；E-52至D-315；E-52至D-314；E-52至F-313；E-52至C-312；E-52至Q-311；E-52至R-310；E-52至L-309；E-52至T-308；E-52至E-307；E-52至T-306；E-52至P-305；E-52至D-304；E-52至G-303；E-52至E-302；E-52至N-301；E-52至A-300；E-52至P-299；E-52至V-298；E-52至L-297；E-52至L-296；E-52至R-295；E-52至R-294；E-52至R-293；E-52至Q-292；E-52至S-291；E-52至R-290；E-52至E-289；E-52至A-288；E-52至E-287；E-52至A-286；E-52至P-285；E-52至E-284；E-52至L-283；E-52至L-282；E-52至H-281；E-52至E-280；E-52至S-279；E-52至E-278；E-52至G-277；E-52至P-276；E-52至S-275；E-52至L-274；E-52至M-273；E-52至N-272；E-52至V-271；E-52至G-270；E-52至T-269；E-52至P-268；E-52至E-267；E-52至A-266；E-52至P-265；E-52至E-264；E-52至Q-263；E-52至V-262；E-52至E-261；E-52至M-260；E-52至E-259；E-52至Q-258；E-52至E-257；E-52至P-256；E-52至V-255；E-52至Q-254；E-52至T-253；E-52至P-252；E-52至Q-251；E-52至L-250；E-52至I-249；E-52至S-248；E-52至V-247；E-52至I-246；E-52至E-245；E-52至N-244；E-52至L-243；E-52至V-242；E-52至N-241；E-52至D-240；E-52至E-239；E-52至A-238；E-52至G-237；E-52至P-236；E-52至R-235；E-52至Q-234；E-52至S-233；E-52至S-232；E-52至R-231；E-52至D-230；E-52至V-229；E-52至R-228；E-52至E-227；E-52至P-226；E-52至D-225；E-52至G-224；E-52至G-223；E-52至G-222；E-52至G-221；E-52至S-220；E-52至C-219；E-52至I-218；E-52至G-217；E-52至K-216；E-52至L-215；E-52至Y-214；E-52至P-213；E-52至L-212；E-52至V-211；E-52至K-210；E-52至K-209；E-52至W-208；E-52至L-207；E-52至L-206；E-52至S-205；E-52至K-204；E-52至C-203；E-52至V-202；E-52至F-201；E-52至V-200；E-52至A-199；E-52至V-198；E-52至I-197；E-52至L-196；E-52至V-195；E-52至V-194；E-52至A-193；E-52至A-192；E-52至V-191；E-52至T-190；E-52至V-189；E-52至G-188；E-52至I-187；E-52至I-186；E-52至I-185；E-52至G-184；E-52至S-183；E-52至E-182；E-52至K-181；E-52至H-180；E-52至V-179；E-52至C-178；E-52至E-177；E-52至I-176；E-52至D-175；E-52至S-174；E-52至W-173；E-52至P-172；E-52至T-171；E-52至C-170；E-52至D-169；E-52至G-168；E-52至V-167；E-52至K-166；E-52至V-165；E-52至M-164；E-52至G-163；E-52至R-162；E-52至P-161；E-52至C-160；E-52至G-159；E-52至T-158；E-52至R-157；E-52至C-156；E-52至K-155；E-52至R-154；E-52至C-153；E-52至M-152；E-52至E-151；E-52至P-150；E-52至S-149；E-52至D-148；E-52至E-147；E-52至E-146；E-52至R-145；E-52至F-144；E-52至T-143；E-52至G-142；E-52至E-141；E-52至E-140；E-52至C-139；E-52至Q-138；E-52至C-137；E-52至V-136；E-52至T-135；E-52至N-134；E-52至R-133；E-52至T-132；E-52至T-131；E-52至T-130；E-52至C-129；E-52至P-128；E-52至S-127；E-52至L-126；E-52至E-125；E-52至V-124；E-52至E-123；E-52至G-122；E-52至S-121；E-52至D-120；E-52至C-119；E-52至R-118；E-52至T-117；E-52至C-116；E-52至R-115；E-52至L-114；E-52至C-113；E-52至F-112；E-52至L-111；E-52至L-110；E-52至D-109；E-52至N-108；E-52至W-107；E-52至H-106；E-52至T-105；E-52至S-104；E-52至Y-103；E-52至D-102；E-52至Q-101；E-52至G-100；E-52至Y-99；E-52至K-98；E-52至C-97；E-52至S-96；E-52至I-95；E-52至C-94；E-52至D-93；E-52至R-92；E-52至G-91；E-52至D-90；E-52至E-89；E-52至S-88；E-52至I-87；E-52至H-86；E-52至H-85；E-52至G-84；E-52至P-83；E-52至P-82；E-52至C-81；E-52至L-80；E-52至G-79；E-52至E-78；E-52至S-77；E-52至P-76；E-52至S-75；E-52至S-74；E-52至R-73；E-52至K-72；E-52至Q-71；E-52至Q-70；E-52至P-69；E-52至A-68；E-52至A-67；E-52至R-66；E-52至Q-65；E-52至Q-64；E-52至P-63；E-52至A-62；E-52至L-61；E-52至D-60；E-52至Q-59；E-52至Q-58和/或E-52至T-57。
在另一个实施方案中，本发明的抗体结合可以用通式52-m6描述的TR7多肽的C末端缺失体，其中m6是相当于SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的57-183位的一个数。在特异的实施方案中，本发明提供了结合包含或由以下残基氨基酸序列组成的TR7多肽：SEQ IDNO：3的TR7胞外结构域序列的E-52至S-183；E-52至E-182；E-52至K-181；E-52至H-180；E-52至V-179；E-52至C-178；E-52至E-177；E-52至I-176；E-52至D-175；E-52至S-174；E-52至W-173；E-52至P-172；E-52至T-171；E-52至C-170；E-52至D-169；E-52至G-168；E-52至V-167；E-52至K-166；E-52至V-165；E-52至M-164；E-52至G-163；E-52至R-162；E-52至P-161；E-52至C-160；E-52至G-159；E-52至T-158；E-52至R-157；E-52至C-156；E-52至K-155；E-52至R-154；E-52至C-153；E-52至M-152；E-52至E-151；E-52至P-150；E-52至S-149；E-52至D-148；E-52至E-147；E-52至E-146；E-52至R-145；E-52至F-144；E-52至T-143；E-52至G-142；E-52至E-141；E-52至E-140；E-52至C-139；E-52至Q-138；E-52至C-137；E-52至V-136；E-52至T-135；E-52至N-134；E-52至R-133；E-52至T-132；E-52至T-131；E-52至T-130；E-52至C-129；E-52至P-128；E-52至S-127；E-52至L-126；E-52至E-125；E-52至V-124；E-52至E-123；E-52至G-122；E-52至S-121；E-52至D-120；E-52至C-119；E-52至R-118；E-52至T-117；E-52至C-116；E-52至R-115；E-52至L-114；E-52至C-113；E-52至F-112；E-52至L-111；E-52至L-110；E-52至D-109；E-52至N-108；E-52至W-107；E-52至H-106；E-52至T-105；E-52至S-104；E-52至Y-103；E-52至D-102；E-52至Q-101；E-52至G-100；E-52至Y-99；E-52至K-98；E-52至C-97；E-52至S-96；E-52至I-95；E-52至C-94；E-52至D-93；E-52至R-92；E-52至G-91；E-52至D-90；E-52至E-89；E-52至S-88；E-52至I-87；E-52至H-86；E-52至H-85；E-52至G-84；E-52至P-83；E-52至P-82；E-52至C-81；E-52至L-80；E-52至G-79；E-52至E-78；E-52至S-77；E-52至P-76；E-52至S-75；E-52至P-74；E-52至R-73；E-52至K-72；E-52至Q-71；E-52至Q-70；E-52至P-69；E-52至A-68；E-52至A-67；E-52至R-66；E-52至Q-65；E-52至Q-64；E-52至P-63；E-52至A-62；E-52至L-61；E-52至D-60；E-52至Q-59；E-52至Q-58和/或E-52至T-57。
本发明还提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽中自TR7多肽氨基和羧基末端缺失一或多个氨基酸，其可以一般描述为具有SEQID NO：3的第n5-m5位残基和/或第n6-m6位残基，其中n5，n6，m5和m6是如上所述的整数。
本发明还包括结合如下多肽的抗体，所述多肽由ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA克隆编码的完整TR7氨基酸序列的一部分组成，其中该部分不包括ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA克隆编码的完整TR7氨基酸序列的氨基末端的1-大约78个氨基酸，或者不包括ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA克隆编码的完整TR7氨基酸序列羧基末端的1-大约233个氨基酸，或者上述氨基末端和羧基末端缺失体的任意组合。
优选地，本发明抗体结合只包含胞外结构域(即在SEQ ID NO：3的第52-184位残基内)的一部分的N和C末端缺失突变体，所述片段，因为在此范围之间的任何部分均预期是可溶的。
本领域意识到TR7的一些氨基酸序列可以加以变化而不明显影响该蛋白质的结构和功能。如果这种序列差异包括在内，应记得蛋白质之上应存在决定活性的关键区域。这种区域通常包含组成配体结合位点或死亡结构域的残基，或者形成影响这些结构域的三级结构的残基。
因此，本发明进一步包括结合TR7蛋白变体的抗体，所述变体示出基本的TR7蛋白活性或包括TR7区域如下述蛋白质部分。这种突变体包括缺失，插入，颠换，重复和典型取代。关于氨基酸变化可以是表型沉默的指导可见于Bowie，J.U.等，科学247：1306-1310(1990)。
因此，本发明抗体可以结合SEQ ID NO：3所示多肽的片段，衍生物或类似物或者由ATCC保藏物No.97920中cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物。这种片段，变体或衍生物可以是(i)这样的片段、变体或衍生物，其中至少一或多个氨基酸残基由保守或非保守的氨基酸残基(优选保守氨基酸残基，更优选至少1个但少于10个保守氨基酸残基)取代，而且这种取代的氨基酸残基可以由或不由遗传密码编码，或者(ii)这样的片段、变体或衍生物，其中一或多个氨基酸残基包括一个取代基团，或者(iii)这样的片段、变体或衍生物，其中成熟多肽与另一种化合物，如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或者(iv)这样的片段、变体或衍生物，其中附加的氨基酸融合于成熟多肽，如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或蛋白原序列。根据本发明教导，这些片段，衍生物和类似物在本领域技术人员技术范围内。
特别感兴趣的是一种荷电氨基酸由另一种荷电氨基酸及中性或负电氨基酸取代。后者产生正电荷减少的蛋白质，以改良TR4蛋白的特性。特别需要防止聚集。蛋白质的聚集不仅导致活性丧失，而且当制备药物配方时也存在问题，因为它们可以是免疫原性的(Pinckard等，临床实验免疫学2：331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36：838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystem10：307-377(1993))。
氨基酸置换也可以改变与细胞表面受体结合的选择性。Ostade等，自然361：266-268(1993)描述了导致TNF-α只选择性结合两种已知类型TNF受体之一的一些突变。因此，本发明的抗体可以结合一种TR7受体，该受体含有来自天然突变或人工操纵的一或多个氨基酸取代，缺失或添加。
正如所表明的，变化优选是微小的，如不明显影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代(见上表3)。
在特异的实施方案中，SEQ ID NO：3的氨基酸序列和/或本发明所述任何多肽片段(例如胞外结构域)中的取代、添加或缺失的数目是75，70，60，50，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或30-20，20-15，20-10，15-10，10-1，5-10，1-5，1-3或1-2个。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体(尤其包含或由TR7的胞外可溶结构域组成的片段)，所述多肽或片段或变体含有任一个或多个以下TR7中的保守突变：SEQ IDNO：3的残基如下置换，用A，G，I，L，S，T或V置换M1；用D置换E2；用N置换Q3；用H或K置换R4；用A，I，L，S，T，M或V置换G5；用N置换Q6；用Q置换N7；用G，I，L，S，T，M或V置换A8；用G，I，L，S，T，M或V置换A10；用G，I，L，S，T，M或V置换A11；用A，G，I，L，T，M或V置换S12；用A，I，L，S，T，M或V置换G13；用G，I，L，S，T，M或V置换A14；用H或K置换R15；用H或R置换K16；用H或K置换R17；用K或R置换H18；用A，I，L，S，T，M或V置换G19；用A，I，L，S，T，M或V置换G21；用H或K置换R23；用D置换E24；用G，I，L，S，T，M或V置换A25；用H或K置换R26；用A，I，L，S，T，M或V置换G27；用G，I，L，S，T，M或V置换A28；用H或K置换R29；用A，I，L，S，T，M或V置换G31；用H或K置换R33；用A，G，I，L，S，T或M置换V34；用H或R置换K36；用A，G，I，L，S，M或V置换T37；用A，G，I，S，T，M或V置换L38；用A，G，I，L，S，T或M置换V39；用A，G，I，S，T，M或V置换L40；用A，G，I，L，S，T或M置换V41；用A，G，I，L，S，T或M置换V42；用G，I，L，S，T，M或V置换A43；用G，I，L，S，T，M或V置换A44；用A，G，I，L，S，T或M置换V45；用A，G，I，S，T，M或V置换L46；用A，G，I，S，T，M或V置换L47；用A，G，I，S，T，M或V置换L48；用A，G，I，L，S，T或M置换V49；用A，G，I，L，T，M或V置换S50；用G，I，L，S，T，M或V置换A51；用D置换E52；用A，G，I，L，T，M或V置换S53；用G，I，L，S，T，M或V置换A54；用A，G，I，S，T，M或V置换L55；用A，G，L，S，T，M或V置换I56；用A，G，I，L，S，M或V置换T57；用N置换Q58；用N置换Q59；用E置换D60；用A，G，I，S，T，M或V置换L61；用G，I，L，S，T，M或V置换A62；用N置换Q64；用N置换Q65；用H或K置换R66；用G，I，L.S，T，M或V置换A67；用G，I，L，S，T，M或V置换A68；用N置换Q70；用N置换Q71；用H或R置换K72；用H或K置换R73；用A，G，I，L，T，M或V置换S74；用A，G，I，L，T，M或V置换S75；用A，G，I，L，T，M或V置换S77；用D置换E78；用A，I，L，S，T，M或V置换G79；用A，G，I，S，T，M或V置换L80；用A，I，L，S，T，M或V置换G84；用K或R置换H85；用K或R置换H86；用A，G，L，S，T，M或V置换I87；用A，G，I，L，T，M或V置换S88；用D置换E89；用E置换D90；用A，I，L，S，T，M或V置换G91；用H或K置换R92；用E置换D93；用A，G，L，S，T，M或V置换I95；用A，G，I，L，T，M或V置换S96；用H或R置换K98；用F或W置换Y99；用A，I，L，S，T，M或V置换G100；用N置换Q101；用E置换D102；用F或W置换Y103；用A，G，I，L，T，M或V置换S 104；用A，G，I，L，S，M或V置换T105；用K或R置换H106；用F或Y置换W107；用Q置换N108；用E置换D109；用A，G，I，S，T，M或V置换L110；用A，G，I，S，T，M或V置换L111；用W或Y置换F112；用A，G，I，S，T，M或V置换L114；用H或K置换R115；用A，G，I，L，S，M或V置换T117；用H或K置换R118；用E置换D120；用A，G，I，L，T，M或V置换S 121；用A，I，L，S，T，M或V置换G122；用D置换E123；用A，G，I，L，S，T或M置换V124；用D置换E125；用A，G，I，S，T，M或V置换L126；用A，G，I，L，T，M或V置换S127；用A，G，I，L，S，M或V置换T130；用A，G，I，L，S，M或V置换T131；用A，G，I，L，S，M或V置换T132；用H或K置换R133；用Q置换N134；用A，G，I，L，S，M或V置换T135；用A，G，I，L，S，T或M置换V136；用K或R置换C137；用N置换Q138；用D置换E140；用D置换E141；用A，I，L，S，T，M或V置换G142；用A，G，I，L，S，M或V置换T143；用W或Y置换F144；用H或K置换R145；用D置换E146；用D置换E147；用E置换D148；用A，G，I，L，T，M或V置换S 149；用D置换E151；用A，G，I，L，S，T或V置换M152；用H或K置换R154；用H或R置换K155；用H或K置换R157；用A，G，I，L，S，M或V置换T158；用A，I，L，S，T，M或V置换G159；用H或K置换R162；用A，I，L，S，T，M或V置换G163；用A，G，I，L，S，T或V置换M164；用A，G，I，L，S，T或M置换V165；用H或R置换K166；用A，G，I，L，S，T或M置换V167；用A，I，L，S，T，M或V置换G168；用E置换D169；用A，G，I，L，S，M或V置换T171；用F或Y置换W173；用A，G，I，L，T，M或V置换S 174；用E置换D175；用A，G，L，S，T，M或V置换I176；用D置换E177；用A，G，I，L，S，T或M置换V179；用K或R置换H180；用H或R置换K181；用D置换E182；用A，G，I，L，T，M或V置换S183；用A，I，L，S，T，M或V置换G184；用A，G，L，S，T，M或V置换I185；用A，G，L，S，T，M或V置换I186；用A，G，L，S，T，M或V置换I187；用A，I，L，S，T，M或V置换G188；用A，G，I，L，S，T或M置换V 189；用A，G，I，L，S，M或V置换T190；用A，G，I，L，S，T或M置换V191；用G，I，L，S，T，M或V置换A192；用G，I，L，S，T，M或V置换A193；用A，G，I，L，S，T或M置换V194；用A，G，I，L，S，T或M置换V195；用A，G，I，S，T，M或V置换L196；用A，G，L，S，T，M或V置换I197；用A，G，I，L，S，T或M置换V198；用G，I，L，S，T，M或V置换A199；用A，G，I，L，S，T或M置换V200；用W或Y置换F201；用A，G，I，L，S，T或M置换V202；用H或R置换K204；用A，G，I，L，T，M或V置换S205；用A，G，I，S，T，M或V置换L206；用A，G，I，S，T，M或V置换L207；用F或Y置换W208；用H或R置换K209；用H或R置换K210；用A，G，I，L，S，T或M置换V211；用A，G，I，S，T，M或V置换L212；用F或W置换Y214；用A，G，I，S，T，M或V置换L215；用H或R置换K216；用A，I，L，S，T，M或V置换G217；用A，G，L，S，T，M或V置换I218；用A，G，I，L，T，M或V置换S220；用A，I，L，S，T，M或V置换G221；用A，I，L，S，T，M或V置换G222；用A，I，L，S，T，M或V置换G223；用A，I，L，S，T，M或V置换G224；用E置换D225；用D置换E227；用H或K置换R228；用A，G，I，L，S，T或M置换V229；用E置换D230；用H或K置换R231；用A，G，I，L，T，M或V置换S232；用A，G，I，L，T，M或V置换S233；用N置换Q234；用H或K置换R235；用A，I，L，S，T，M或V置换G237；用G，I，L，S，T，M或V置换A238；用D置换E239；用E置换L240；用Q置换N241；用A，G，I，L，S，T或M置换V242；用A，G，I，S，T，M或V置换L243；用Q置换N244；用D置换E245；用A，G，L，S，T，M或V置换I246；用A，G，I，L，S，T或M置换V247；用A，G，I，L，T，M或V置换S248；用A，G，L，S，T，M或V置换I249；用A，G，I，S，T，M或V置换L250；用N置换Q251；用A，G，I，L，S，M或V置换T253；用N置换Q254；用A，G，I，L，S，T或M置换V255；用D置换E257；用N置换Q258；用D置换E259；用A，G，I，L，S，T或V置换M260；用D置换E261；用A，G，I，L，S，T或M置换V262；用N置换Q263；用D置换E264；用G，I，L，S，T，M或V置换A266；用D置换E267；用A，G，I，L，S，M或V置换T269；用A，I，L，S，T，M或V置换G270；用A，G，I，L，S，T或M置换V271；用Q置换N272；用A，G，I，L，S，T或V置换M273；用A，G，I，S，T，M或V置换L274；用A，G，I，L，T，M或V置换S275；用A，I，L，S，T，M或V置换G277；用D置换E278；用A，G，I，L，T，M或V置换S279；用D置换E280；用K或R置换H281；用A，G，I，S，T，M或V置换L282；用A，G，I，S，T，M或V置换L283；用D置换E284；用G，I，L，S，T，M或V置换A286；用D置换E287；用G，I，L，S，T，M或V置换A288；用D置换E289；用H或K置换R290；用A，G，I，L，T，M或V置换S291；用N置换Q292；用H或K置换R293；用H或K置换R294；用H或K置换R295；用A，G，I，S，T，M或V置换L296；用A，G，I，S，T，M或V置换L297；用A，G，I，L，S，T或M置换V298；用G，I，L，S，T，M或V置换A300；用Q置换N301；用D置换E302；用A，I，L，S，T，M或V置换G303；用E置换D304；用A，G，I，L，S，M或V置换T306；用D置换E307；用A，G，I，L，S，M或V置换T308；用A，G，I，S，T，M或V置换L309；用H或K置换R310；用N置换Q311；用W或Y置换F313；用E置换D314；用E置换D315；用W或Y置换F316；用G，I，L，S，T，M或V置换A317；用E置换D318；用A，G，I，S，T，M或V置换L319；用A，G，I，L，S，T或M置换V320；用W或Y置换F322；用E置换D323；用A，G，I，L，T，M或V置换S324；用F或Y置换W325；用D置换E326；用A，G，I，S，T，M或V置换L328；用A，G，I，L，S，T或V置换M329；用H或K置换R330；用H或R置换K331；用A，G，I，S，T，M或V置换L332；用A，I，L，S，T，M或V置换G333；用A，G，I，S，T，M或V置换L334；用A，G，I，L，S，T或V置换M335；用E置换D336；用Q置换N337；用D置换E338；用A，G，L，S，T，M或V置换I339；用H或R置换K340；用A，G，I，L，S，T或M置换V341；用G，I，L，S，T，M或V置换A342；用H或R置换K343；用G，I，L，S，T，M或V置换A344；用D置换E345；用G，I，L，S，T，M或V置换A346；用G，I，L，S，T，M，或V置换A347；用A，I，L，S，T，M或V置换G348；用K或R置换H349；用H或K置换R350；用E置换D351；用A，G，I，L，S，M或V置换T352；用A，G，I，S，T，M或V置换L353；用F或W置换Y354；用A，G，I，L，S，M或V置换T355；用A，G，I，L，S，T或V置换M356；用A，G，I，S，T，M或V置换L357；用A，G，L，S，T，M或V置换I358；用H或R置换K359；用F或Y置换W360；用A，G，I，L，S，T或M置换V361；用Q置换N362；用H或R置换K363；用A，G，I，L，SM或V置换T364；用A，I，L，S，T，M或V置换G365；用H或K置换R366；用E置换D367；用G，I，L，S，T，M或V置换A368；用A，G，I，L，T，M或V置换S369；用A，G，I，L，S，T或M置换V370；用K或R置换H371；用A，G，I，L，S，M或V置换T372；用A，G，I，S，T，M或V置换L373；用A，G，I，S，T，M，或V置换L374；用E置换D375；用G，I，L，S，T，M或V置换A376；用A，G，I，S，T，M或V置换L377；用D置换E378；用A，G，I，L，S，M或V置换T379；用A，G，I，S，T，M或V置换L380；用A，I，L，S，T，M或V置换G381；用D置换E382；用H或K置换R383；用A，G，I，S，T，M或V置换L384；用G，I，L，S，T，M或V置换A385；用H或R置换K386；用N置换Q387；用H或R置换K388；用A，G，L，S，T，M或V置换I389；用D置换E390；用E置换D391；用K或R置换H392；用A，G，I，S，T，M或V置换L393；用A，G，I，S，T，M或V置换L394；用A，G，I，L，T，M或V置换S395；用A，G，I，L，T，M或V置换S396；用A，I，L，S，T，M或V置换G397；用H或R置换K398；用W或Y置换F399；用A，G，I，L，S，T或V置换M400；用F或W置换Y401；用A，G，I，S，T，M或V置换L402；用D置换E403；用A，I，L，S，T，M或V置换G404；用Q置换N405；用G，I，L，S，T，M或V置换A406；用E置换D407；用A，G，I，L，T，M或V置换S408；用G，I，L，S，T，M，或V置换A409；用A，G，I，L，S，T或V置换M410和/或用A，G，I，L，T，M或V置换S411。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合含有任一或多个以下TR7中的非保守突变的TR7多肽或其片段或变体(特别是包含或由TR7的胞外可溶结构域组成的片段)：SEQ ID NQ：3中用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M1；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E2；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q3；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R4；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G5；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q6；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N7；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A8；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P9；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A10；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A11；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S12；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G13；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A14；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R15；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K16；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R17；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H18；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G19；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P20；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G21；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P22；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R23；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E24；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A25；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换R26；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G27；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A28；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R29；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P30；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G31；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P32；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R33；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V34；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P35；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K36；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T37；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L38；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V39；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L40；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V41；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V42；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A43；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A44；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V45；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L46；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L47；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L48；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V49；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S50；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A51；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E52；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S53；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A54；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L55；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I56；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T57；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q58；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q59；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D60；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L61；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A62；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P63；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q64；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q65；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R66；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A67；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A68；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P69；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q70；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q71；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K72；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R73；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S74；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S75；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P76；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S77；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E78；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G79；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L80；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，或Y置换C81；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P82；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P83；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G84；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H85；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H86；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I87；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S88；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E89；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D90；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G91；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R92；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D93；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C94；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I95；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S96；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，，Q，F，W，Y或P置换C97；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或CR置换K98；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y99；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G100；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q101；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D102；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y103；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S104；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T105；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H106；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W107；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N108；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D109；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L110；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L111；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F112；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C113；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L114；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R115；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C116；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T117；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R118；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C 119；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D120；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S121；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G122；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E123；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V124；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E125；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L126；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S127；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P128；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C129；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T130；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T131；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T132；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R133；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，Q，F，W，Y，P或C置换N134；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T135；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V136；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C137；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q138；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C139；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E140；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E141；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G142；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T143；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F144；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R145；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E146；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E147；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D148；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S149；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P150；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E151；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M152；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C153；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R154；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K155；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C156；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R157；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T158；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G159；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C160；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P161；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R162；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G163；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M164；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V165；用H或R置换K166；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V167；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G168；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D169；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C170；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T171；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P172；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W173；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S174；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D175；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I176；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E177；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C178；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V179；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H180；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K181；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E182；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S183；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G184；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I185；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I186；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I187；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G188；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V189；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T190；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V191；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A192；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A193；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V194；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V195；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L196；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I197；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V198；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A199；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V200；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F201；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V202；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C203；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K204；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S205；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L206；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L207；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W208；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K209；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K210；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V211；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L212；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P213；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y214；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L215；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K216；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G217；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I218；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C219；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S220；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G221；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G222；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G223；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G224；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D225；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P226；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E227；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R228；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V229；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D230；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R231；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S232；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S233；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q234；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R235；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P236；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G237；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A238；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E239；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换L240；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N241；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V242；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L243；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N244；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E245；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I246；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V247；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S248；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I249；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L250；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q251；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y或C置换P252；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T253；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q254；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V255；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P256；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E257；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q258；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E259；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C 换M260；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E261；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V262；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q263；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E264；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P265；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A266；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E267；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P268；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T269；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G270；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V271；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N272；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M273；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L274；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S275；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P276；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G277；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E278；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S279；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E280；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H281；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L282；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L283；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E284；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P285；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A286；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E287；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A288；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E289；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R290；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S291；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q292；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R293；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R294；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R295；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L296；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L297；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V298；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P299；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A300；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N301；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E302；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G303；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D304；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P305；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T306；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E307；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T308；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L309；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R310；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q311；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C312；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F313；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D314；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D315；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F316；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A317；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D318；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L319；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V320；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P321；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F322；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D323；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S324；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W325；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，W，Y，P或C置换E326；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P327；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L328；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M329；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R330；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K331；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L332；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G333；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L334；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M335；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D336；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N337；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E338；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I339；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K340；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V341；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A342；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K343；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A344；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E345；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A346；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A347；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G348；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H349；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R350；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D351；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T352；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L353；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y354；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T355；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M356；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L357；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I358；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K359；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W360；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V361；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N362；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K363；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T364；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G365；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R366；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D367；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A368；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S369；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V370；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H371；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T372；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L373；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L374；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D375；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A376；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L377；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E378；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T379；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L380；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G381；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E382；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R383；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L384；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A385；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K386；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q387；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K388；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换I389；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E390；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D391；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H392；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L393；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L394；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S395；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S396；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G397；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K398；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F399；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M400；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y401；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L402；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E403；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G404；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，Q，F，W，Y，P或C置换N405；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A406；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D407；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S408；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A409；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M410和/或用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S411。
本发明TR7蛋白质中为功能所需的氨基酸可以通过本领域已知方法鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989))。后一方法是在分子的每个残基导入单丙氨酸突变。然后测试所得突变分子生物学活性如受体结合或者体外或体内增殖活性。对配体-受体结合非常关键的位点也可以通过结构分析确定，如结晶，核磁共振或光亲和标记(Smith等，分子生物学杂志224：899-904(1992)及Vos等，科学255：306-312(1992))。在优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR7功能所必需的TR7区域。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR7功能所必需的并抑制或消除TR7功能的TR7区域。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR7功能所必需的并增强TR7功能的TR7区域。
另外，可以应用蛋白质工程以改良或改变TR7多肽的特性。可以使用本领域已知的重组DNA技术产生新的突变蛋白质或多肽，包括单个或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出例如增强的活性或提高的稳定性。另外，它们至少在一定的纯化和贮存条件下可以高产量纯化而且比相应的天然多肽示出更好的溶解性。本发明的抗体可以较好这种修饰的TR4多肽。
TR7的非天然发生的变体可以使用本领域已知的诱变技术产生，包括但非限于寡核苷酸介导的诱变，丙氨酸扫描；PCR诱变，定点诱变(见例如Carter等，核酸研究13：4331(1986)；及Zoller等，核酸研究10：6487(1982))，盒式诱变(见例如Wells等，基因34：315(1985))，限制选择诱变(见例如Wells等，Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA 317：415(1986))。
因此，本发明还涵盖了结合TR7衍生物和类似物的抗体，所述衍生物和类似物具有一或多个氨基酸残基缺失，添加或取代，以产生更适于在选择的宿主细胞中表达、放大等的TR7多肽。例如，半胱氨酸残基可以缺失或用另一种氨基酸残基取代以去除二硫键；N连接的糖基化位点可以改变或去除以实现例如更易于从已知超糖基化N连接的位点的酵母宿主中回收及纯化的一种同源产物的表达。结果，在TR7多肽中任一或多个糖基化识别序列的第一个或第三个氨基酸位置之一或这两个位置上的各种氨基酸取代，和/或在任一或多个这种识别序列的第二个位置的一个氨基酸缺失，将防止TR7在修饰的三肽序列糖基化(见例如Miyajimo等，EMBO杂志5(6)：1193-1197)。另外，TR7多肽的一或多个氨基酸残基(例如精氨酸和赖氨酸残基)可以缺失或用另一种残基取代，以去除非所需的蛋白酶加工例如弗林蛋白酶或kexin加工。
本发明的抗体还包括结合如下一种多肽的抗体，所述多肽包含或由以下多肽组成：包括前导序列的保藏的cDNA(ATCC登记号No.97920)编码的多肽；包含或由保藏的cDNA编码的成熟多肽减去前导序列(即成熟蛋白)组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3中约第1-约411位氨基酸组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3中约第2-约411位氨基酸组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的约第52-约411位氨基酸组成的多肽；包含或由TR7胞外结构域组成的多肽；包含或由TR7富半胱氨酸结构域组成的多肽；包含或由TR7跨膜结构域组成；包含或由TR7胞内结构域组成的多肽；包含或由TR7死亡结构域组成的多肽；包含或由胞外和胞内结构域但缺失全部或部分跨膜结构域组成的多肽；以及与上述多肽有至少80％，优选至少90％或95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相同性的多肽，并还包括这些多肽的具有至少30个优选至少50个氨基酸的部分。
具有与TR7多肽的一种参比氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽，是指所述多肽的氨基酸序列除了可以包括TR7多肽的参比氨基酸序列的每100个氨基酸中最多5个氨基酸变化之外，与参比氨基酸序列相同。换而言之，为获得具有与参比氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参比序列中最多有5％的氨基酸残基可以缺失或用另一种氨基酸取代，或者占参比序列中氨基酸总数最多5％的氨基酸可以插入参比序列中。参比序列的这些变化可以发生在氨基或羧基末端位置、或者在两个末端位置之间的任何位置、单独分散在参比序列残基中或在参比序列内呈连续的一或多组。
实际上，任何特定的多肽与例如图1A-B(SEQ ID NO：3)所示氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列或其片段是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，可以使用已知的计算机程序常规测定，如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，Unix版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575 ScienceDrive，Madison，WI53711)。当使用Bestfit或任何其它序列对比程序以确定一个特定序列与本发明的参比序列是否例如至少95％相同时，参数的设定当然要使得计算针对全长参比氨基酸序列的相同性百分率，并允许占参比序列中氨基酸残基总数最多5％的同源性缺口。
在一个特异的实施方案中，确定参比(查询)序列(本发明的序列)和一个目的序列之间的相同性，也称全局序列比对，可以利用基于Brutlag等的算法(计算机应用生物科学，6：237-245(1990))的FASTDB计算机程序。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数为：Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，Mismath Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或者目标氨基酸序列的长度，取较短的。根据这个实施方案，如果目的序列因N或C末端缺失而非由于内部缺失而比查询序列短，那么必须对结果作手工修正。这是因为FASTDB程序在计算相同性百分比时不计算目的序列N或C末端的截短。对于目的序列相对于查询序列N或C末端的截短，相同性百分比的修正是通过计算与相应目的残基不匹配/比对的位于目的序列N或C末端的查询序列的碱基数，作为查询序列总碱基数的百分比。通过FASTDB序列比对的结果来确定一个残基是否匹配。然后将此百分数从使用特定参数通过FASTDB程序计算的相同性百分比中减去，从而获得最终的相同性百分比结果。这一最终相同性百分比结果是用于这一实施方案目的的结果。只有不与查询序列相匹配/比对的在目的序列N或C末端的碱基才用于手工调节相同性百分比结果。也就是仅位于目的序列最N端和最C端残基之外的查询残基位置。例如，一个90个碱基的目的序列与一个100个碱基的查询序列比对以确定相同性百分比。缺失发生于目的序列的N末端，因此，FASTDB比对不显示N末端前10个碱基的匹配/比对。这10个不匹配的碱基相当于序列的10％(N或C端不匹配的碱基数/查询序列中的碱基总数)，因而从FASTDB程序计算的相同性百分比中减去这10％。如果剩余的90个碱基都完全匹配，那么最终的相同性百分比就是90％。再例如，一个90个碱基的目的序列与一个100个碱基的查询序列相比较，这时的缺失是内部缺失，因而目的序列的N或C末端碱基没有与查询序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB程序计算的相同性百分比不需手工修正。再强调一次，只有位于目的序列的N或C末端外侧的碱基位置，如FSATDB对比中所展示，与查询序列不匹配/比对的才需要手工修正。这一实施方案不需要进行其他的手工修正。
本发明的多肽可以用作SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤柱上的分子量标记，以及用作使用本领域熟知方法产生结合TR7多肽的抗体的来源。
本发明还涉及结合如下蛋白质的抗体，所述蛋白质含有与本文中用n5-m5和/或n6-m6表示的TR7多肽序列有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的多肽。在优选的实施方案中，本申请涉及结合如下蛋白质的抗体，所述蛋白质含有与具有本文所述的特异TR7N末端和C末端缺失体的氨基酸序列的多肽有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的多肽。
在一些实施方案中，本发明的抗体结合包含在如上所述融合蛋白中的本发明的TR7蛋白，其中所述TR7多肽是本文中用n5-m5和n6-m6表示的那些TR7多肽。
本发明的抗体可以结合修饰的TRAIL受体多肽
应特别理解的是本发明的抗体可以结合修饰形式的TR4蛋白(SEQ ID NO：1)。在本发明抗体特异性结合TR4和TR7(SEQ IDNO：3)的那些实施方案中，还应特别理解的是那些抗体可以结合修饰形式的TR4和/或TR7。TR7的修饰形式包括例如相应于下述TR4修饰形式的TR7修饰形式。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽(如上述那些)，包括但非限于天然纯化的TR4多肽，经化学合成方法生产的TR4多肽，及通过重组方法从原核或真核宿主中产生的TR4多肽，所述宿主包括例如细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞，使用例如上述重组组合物和方法进行。根据在重组生产方法中应用的宿主，多肽可以是糖基化或非糖基化的。另外，TR4多肽还可以包括一个最初的修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况中是宿主介导的过程的结果。
另外，由本发明抗体结合的TR4蛋白可以使用本领域已知方法化学合成(例如见Creighton，蛋白质：结构和分子原理，W.H.Freeman&Co.，N.Y.(1983)，及Hunkapiller等，自然310：105-111(1984))。例如，相应于TR4多肽片段的一种肽可以使用肽合成仪合成。另外，如果需要，非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为取代或添加导入TR4多肽序列中。非经典氨基酸包括但非限于常见氨基酸的D-异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，半胱磺酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，b-丙氨酸，氟氨基酸，设计氨基酸如b-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸及氨基酸类似物。另外，所述氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)。
本发明另外涵盖了结合如下TR4多肽的抗体，所述多肽在翻译期间或之后被差异修饰，例如通过糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/阻断基团衍生化，蛋白酶解，连接于抗体分子或其它细胞配体等。任何化学修饰均可以通过已知方法进行，包括但非限于通过以下物质特异性化学裂解：溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4，乙酰化，甲酰化，氧化，还原，在存在衣霉素情况下代谢合成等。
对TR4多肽的额外翻译后修饰例如N-连接的或O-连接的碳水化合物链，N或C末端加工，将化学组分附着于氨基酸主链，化学修饰N连接的或O连接的碳水化合物链，及作为原核宿主细胞表达的结果而加入或缺失一个N末端甲硫氨酸残基。所述多肽也可以用一种可检测标记修饰，如酶标记，荧光标记，同位素标记或亲和标记，以检测及分离蛋白质。
本发明还提供了结合经化学修饰的TR4多肽衍生物的抗体，所述修饰的衍生物可提供另外的优势如多肽的溶解性、稳定性和循环时间增加，或者免疫原性降低(见美国专利No.4179337)。用于衍生的化学组分可以选自水溶性聚合物如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇等。所述多肽可以在分子内的随机位置修饰，或者在分子内预定位置修饰，而且可以包括1，2，3或多个附着的化学组分。
所述聚合物可以是任何分子量的，而且可以是分支或不分支的。针对聚乙二醇，优选的分子量为大约1kDa至大约100kDa(术语“大约”是指在制备聚乙二醇中，一些分子比规定分子量多或少)，以易于处理和生产。根据所需治疗目的(例如所希望的持续释放时间、对生物活性作用(如果有)、处理的简便性、抗原性程度或丧失、及聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物的其它已知作用)，可以使用其它大小的分子。例如，所述聚乙二醇的平均分子量为大约200，500，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10000，10500，11000，11500，12000，12500，13000，13500，14000，14500，15000，15500，16000，16500，17000，17500，18000，18500，19000，19500，20000，25000，30000，35000，40000，50000，55000，60000，65000，70000，75000，80000，85000，90000，95000或100000kDa。
如上所述，所述聚乙二醇可以具有分支结构。分支的聚乙二醇例如美国专利No.5643575；Morpurgo等，应用生物化学生物技术56：59-72(1996)；Vorobjev等，核苷核苷酸18：2745-2750(1999)；及Caliceti等，生物缀合物化学10：638-646(1999)所述，所述内容在此并入参考。
考虑到对蛋白质的功能结构域或抗原结构域的作用，所述聚乙二醇分子(或其它化学组分)应附着于蛋白质。有许多本领域技术人员可利用的附着方法，例如EP0401384所述，在此并入参考(将PEG与G-CSF偶联)，也见于Malik等，Exp Hematol 20：1028-1035(1992)(使用tresyl氯化物对GM-CSF聚乙二醇化)。例如聚乙二醇可以通过一个反应性基团与氨基酸残基共价结合，所述反应性基团例如一种游离的氨基或羧基基团。反应性基团是激活的聚乙二醇分子可以结合的那些基团。具有游离氨基基团的氨基酸残基可以包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；具有游离羧基基团的那些残基可以包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基基团也可以用作反应性基团以附着聚乙二醇分子。针对治疗目的优选在氨基基团附着，如在N末端或赖氨酸基团附着。
如上所提示，聚乙二醇可以通过连接于任何数目的氨基酸残基而附着于蛋白质。例如，聚乙二醇可以通过共价键连接于蛋白质的赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸残基。可以应用一或多种反应化学以将聚乙二醇附着于蛋白质的特异氨基酸残基(例如赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸)，或者附着于蛋白质的一种以上类型的氨基酸残基(例如赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸及其组合)。
特别希望的是在N末端经化学修饰的蛋白质。使用聚乙二醇作为该组合物的例证，可以从多种聚乙二醇分子(通过分子量，分支等)中选择反应混合物中聚乙二醇与蛋白质(或肽)分子的比例，进行的聚乙二醇化反应类型，及获得所选择的N末端聚乙二醇化蛋白的方法。获得N末端聚乙二醇化制品的方法(即如果需要从其它单聚乙二醇化组分中分离这种组分)，可以通过从一群聚乙二醇化蛋白质分子中纯化N末端聚乙二醇化材料。在N末端经化学修饰的选择性蛋白质可以通过还原烷化而实现，其使用不同类型的初级氨基酸基团的不同反应性(赖氨酸对N末端)，以在特殊蛋白质中衍生化。在适当反应条件下，用含有羰基基团的聚合物实现蛋白质N端基本上选择性的衍生化。
如上所示，本发明蛋白质的聚乙二醇化可以通过任何方法实现。例如可以将聚乙二醇直接或通过一个插入接头而附着于蛋白质。将聚乙二醇附着于蛋白质的无接头系统见Delgado等，Crit.Rev.治疗性药物载体系统9：249-304(1992)；Francis等，国际血液杂志68：1-18(1998)；美国专利No.4002531；美国专利No.5349052；WO95/06058及WO98/32466所述，所述文献在此并入参考。
将聚乙二醇不用插入接头而直接附着于蛋白质的氨基酸残基的一个系统是应用tresylated MPEG，其是通过使用tresyl氯(ClSO2CH2CF3)修饰单甲氧基聚乙二醇(MPEG)而产生的。在蛋白质与tresylated MPEG反应时，聚乙二醇直接附着于蛋白质的氨基基团。因此，本发明包括蛋白质一聚乙二醇缀合物，其通过本发明蛋白质与具有2，2，2-三氟乙烷磺酰基团的聚乙二醇分子反应而产生。
聚乙二醇也可以使用一些不同的插入接头附着于蛋白质。例如，在此并入参考的美国专利No.5612460揭示了连接聚乙二醇与蛋白质的氨基甲酸乙酯接头。聚乙二醇通过接头附着于蛋白质的蛋白质-聚乙二醇缀合物也可以通过将蛋白质与化合物反应而产生，所述化合物如MPEG-琥珀酰亚氨基琥珀酸酯、用1，1’-羰基二咪唑活化的MPEG、MPEG-2，4，5-三氯penyl碳酸酯、MPEG-p-硝基酚碳酸酯及各种MPEG-琥珀酸酯衍生物。一些另外的聚乙二醇衍生物及将聚乙二醇附着于蛋白质的反应化学见WO98/32466所述，其全部内容在此并入参考。使用本文所述反应化学产生的聚乙二醇化蛋白质产物包括在本发明范围内。
附着于每一TR4多肽的聚乙二醇组分的数目(即取代的程度)也可以变化。例如，本发明聚乙二醇化蛋白质可以连接于平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20或更多个聚乙二醇分子。相似地，平均取代程度在每个蛋白质分子1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19或18-20个聚乙二醇分子范围内。确定取代程度的方法见例如Delgado等，Crit.Rev.治疗性药物载体系统9：249-304(1992)所述。
如所提及的，本发明的抗体可以结合如下TR4多肽，所述TR4多肽通过天然加工修饰，如翻译后加工，或者通过本领域熟知的化学修饰方法修饰。应意识到，相同类型的修饰可以以相同或不同程度在给定的TR4多肽中的一些位点存在。TR4多肽可以是分支的，例如作为遍在蛋白化的结果，及可以是有或无分支的环形。环形、分支及分支环形的TR4多肽可得自翻译后天然加工。或可以通过合成方法产生。修饰包括乙酰化，脂酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，共价附着黄素，共价附着血红素组分，共价附着一种核苷酸或核苷酸衍生物，共价附着一种液体或液体衍生物，共价附着磷脂酰肌醇，交联，环化，二硫键形成，去甲基化，共价交联形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟化，碘化，甲基化，豆蔻酰化，氧化，聚乙二醇化，蛋白酶解加工，磷酸化，异戊二烯化，外消旋化，硒化，硫化，转移RNA介导的将氨基酸加入蛋白质如精氨酰化，及遍在蛋白化(见例如蛋白质-结构及分子性质，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman及公司，纽约(1993)；蛋白质的翻译后共价修饰，B.C.Johnson编辑，学术出版社，纽约，pgs.1-12(1983)；Seifter等，酶学方法182：626-646(1990)；Rattan等，Ann.NY AcadSci 663：48-62(1992))。
抗TR4抗体
在一个实施方案中，本发明提供了免疫特异性结合TR4(SEQ IDNO：1)或其片段或变体的抗体(例如包含通过二硫键连接在一起的两个重链和两个轻链的抗体)，其中所述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列与由表1所示一或多个scFv或细胞系表达的重链和轻链的氨基酸序列相同。在另一个实施方案中，本发明提供了免疫特异性结合TR4或其片段或变体的抗体(均由通过二硫键连接在一起的两个重链和两个轻链组成以形成抗体)，其中所述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列与由表1所示一或多个scFv或细胞系表达的重链和轻链的氨基酸序列相同。与TR4多肽的免疫特异性结合可以通过本领域已知的免疫分析或者通过在此描述的分析特异性抗体-抗原结合的免疫分析确定。包含或由免疫特异性结合TR4的这些抗体的片段或变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些抗体分子，片段和/或变体的核酸分子(例如SEQ ID NO：54-65)也包括在本发明内。
在本发明的一个实施方案中，免疫特异性结合TR4或其片段或变体的抗体包含一种多肽，所述多肽具有由表1所示至少一种scFv或细胞系表达的任一重链的氨基酸序列和/或表1所示至少一种scFv或细胞系表达的任一轻链的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，免疫特异性结合TR4或其片段或变体的抗体包含一种多肽，所述多肽具有由表1所示至少一种scFv的任一VH结构域的氨基酸序列和/或表1所示至少一种scFv的任一VL结构域的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的抗体包含来自表1所示一个单一scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在另一些实施方案中，本发明的抗体包含来自表1所示不同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。免疫特异性结合TR4的包含或由表1所示至少一种scFv的VH和/或VL结构域的抗体片段或变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些VH和VL结构域，分子，片段和/或变体的核酸分子也包括在本发明内。
本发明还提供了免疫特异性结合一种TR4多肽或多肽片段或变体的抗体，所述抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VH结构域中含有的任意1，2，3或多个VH CDR的氨基酸序列。特别地，本发明提供了免疫特异性结合TRAIL受体的抗体，所述抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VH结构域中含有的VH CDR1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，免疫特异性结合TR4的抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VH结构域中含有的VHCDR2的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，免疫特异性结合TR4的抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VH结构域中含有的VH CDR3的氨基酸序列。包含或由免疫特异性结合TR4或TR4片段或变体的这些抗体或抗体片段或变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些抗体，分子，片段和/或变体的核酸分子(SEQ ID NO：54-65)也包括在本发明内。
本发明还提供了免疫特异性结合一种TR4多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VL结构域中含有的任意1，2，3或多个VL CDR的氨基酸序列。特别地，本发明提供了免疫特异性结合TR4的抗体，所述抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VL结构域中含有的VL CDR1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，免疫特异性结合TR4的抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VL结构域中含有的VL CDR2的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，免疫特异性结合TR4的抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VL结构域中含有的VL CDR3的氨基酸序列。包含或由免疫特异性结合TR4或TR4片段或变体的这些抗体或抗体片段或变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些抗体，分子，片段和/或变体的核酸分子(SEQ ID NO：54-65)也包括在本发明内。
本发明还提供了免疫特异性结合TR4多肽或多肽片段或变体的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，其中所述抗体包含或由表1所示一或多个scFv的VH或VL结构域中含有的1，2，3或多个VH CDR和1，2，3或多个VL CDR组成。特别地，本发明提供了免疫特异性结合一种TR4多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含或由表1所示一或多个scFv的VH或VL结构域中含有的VH CDR1和VL CDR1，VH CDR1和VL CDR2，VH CDR1和VL CDR3，VH CDR2和VL CDR1，VH CDR2和VL CDR2，VH CDR2和VL CDR3，VH CDR3和VL CDR1，VH CDR3和VL CDR2，VHCDR3和VL CDR3，或者VH CDR和VL CDR的任何组合组成。在一个优选的实施方案中，一或多种这些组合来自表1所示相同scFv。包含或由免疫特异性结合TR4的这些抗体的片段或变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些抗体，分子，片段和/或变体的核酸分子(SEQ ID NO：54-65)也包括在本发明内。
编码抗TR4抗体的核酸分子
本发明还提供了编码本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)的核酸分子，其一般是分离的。在特异的实施方案中，编码本发明抗体的核酸分子包含或由SEQ ID NO：54-65或其片段或变体组成。
在一个特异的实施方案中，本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，其包含或由具有表1所示至少一种scFv的任一VH结构域的氨基酸序列的VH结构域及具有表1所示至少一种scFv的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域组成。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，所述抗体包含或由具有表1所示至少一种scFv的任一VH结构域的氨基酸序列的VH结构域或具有表1所示至少一种scFv的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域组成。
本发明还提供了包含或由在此所述抗体分子(例如VH结构域和/或VL结构域)的变体(包括衍生物)组成的抗体，该抗体免疫特异性结合TR4或其片段或变体。可以使用本领域技术人员已知的标准方法，在编码本发明分子的核苷酸序列中导入突变，包括例如导致氨基酸取代的定点诱变及PCR介导的诱变。优选地，所述变体(包括衍生物)编码与参考VH结构域，VHCDR1，VHCDR2，VHCDR3，VL结构域，VLCDR1，VLCDR2或VLCDR3相比少于50，少于40，少于30，少于25，少于20，少于15，少于10，少于5，少于4，少于3或少于2个氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有相似电荷的侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似电荷侧链的氨基酸残基家族在本领域已经确定，这些家族包括具碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸)，具无电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)及具芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。或者，如通过饱和诱变，突变可以随机在全部或部分编码序列中产生，可以筛选所得突变体的生物活性以鉴别保留活性的突变体(例如结合TR4的能力)。
例如，可以只在抗体分子的构架区或CDR区域内进行突变。产生的突变可以是沉默或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力无影响或很小影响。这些类型的突变可以用于最佳化密码子使用，或者改良杂交瘤抗体的产生。或者，非中性错义突变可以改变抗体与抗原的结合能力。大多数沉默及中性错义突变的位置很可能在构架区内，而大多数非中性错义突变的位置很可能在CDR内，尽管这不是绝对要求的。本领域技术人员能设计并测试具有所需性质的突变体分子，如抗原结合活性无改变或者结合活性改变(例如抗原结合活性改进或抗体特异性改变)。在诱变后，编码的蛋白质可以常规表达，而且编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如免疫特异性结合TR4的能力)可以使用在此所述方法或通过本领域已知的常规修饰方法确定。
在一个特异的实施方案中，免疫特异性结合TR4或其片段或变体的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，包含或由一种核苷酸序列编码的一种氨基酸序列组成，所述核苷酸序列与互补于编码表1所示一或多种scFv的一个VH或VL结构域的核苷酸序列杂交，所述杂交在严格条件下，在高严格条件下，或在其它严格条件下进行，所述严格条件例如在大约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤膜结合的DNA杂交，随后在大约50-65℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤一或多次；高严格杂交条件例如在大约45℃在6×SSC中与滤膜结合的核酸杂交，随后在大约68℃在0.1×SSC/0.2％SDS中洗涤一或多次；其它严格杂交条件为本领域已知那些(见例如Ausubel，F.M.等编辑，1989，分子生物学通用方案，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.，及John Wiley & Sons公司，纽约，在第6.3.1-6.3.6和2.10.3页所述)。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本领域熟知具有相似氨基酸序列的多肽或其片段或变体通常具有相似结构及许多相同生物学活性。因此，在一个实施方案中，免疫特异性结合TR4片段或其片段或变体的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，包含或由具有与表1所示至少一种scFv的VH结构域的氨基酸序列有至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％相同性的氨基酸序列的VH结构域组成。
在另一个实施方案中，免疫特异性结合TR4片段或其片段或变体的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，包含或由具有与表1所示至少一种scFv的VL结构域的氨基酸序列有至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％相同性的氨基酸序列的VL结构域组成。
生产抗体的方法
本发明的抗体优选利用噬菌体scFv展示文库制备。用于实现此目的的方法见于在此揭示的专利，申请及参考文献所述。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面展示。特别地，编码VH和VL结构域的DNA序列从动物cDNA文库(例如人或鼠淋巴组织的cDNA文库)或合成的cDNA文库中扩增。编码VH和VL结构域的DNA通过一个scFv接头经PCR连接在一起，并克隆入一个噬菌粒载体中(例如pCANTAB6或pComb3 HSS)。将该载体电穿孔入大肠杆菌中，并将该大肠杆菌用辅助噬菌体感染。这些方法中使用的噬菌体典型是包括fd和M13的丝状噬菌体，VH和VL结构域通常重组融合于噬菌体基因III或基因VIII。表达与相应抗原(即TRAIL受体多肽或其片段)结合的抗原结合结构域的噬菌体，可以用抗原选择或鉴别，例如使用标记的抗原或与一种固体表面或珠结合或捕捉的抗原。可以用于生产本发明抗体的噬菌体展示方法例如包括但非限于Brinkman等，免疫学方法杂志182：41-50(1995)；Ames等，免疫学方法杂志184：177-186(1995)；Kettleborough等，欧洲免疫学杂志24：952-958(1994)；Persic等，基因187：9-18(1997)；Burton等，免疫学进展57：191-280(1994)；PCT申请No.PCT/GB91/01134；PCT出版物WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18719；WO 93/11236；WO95/15982；WO 95/20401；WO 97/13844及美国专利No.5698426；5223409；5403484；5580717；5427908；5750753；5821047；5571698；5427908；5516717；5780225；5658727；5735743及5969108所揭示，所述文献在此以其全文并入参考。
针对一些应用，如本发明抗体的体外亲和性成熟，有利的是表达表1所示一或多种scFv的VH和VL结构域，作为噬菌体展示文库中的单链抗体或Fab片段。例如，编码表1所示scFv的VH和VL结构域的cDNA可以使用噬菌体展示文库以所有可能的组合表达，以选择具有优选的结合特性如改进的亲和性或改善的解离速率的结合TR4多肽的VH/VL组合。另外，VH和VL节段，特别是表1所示scFv的VH和VL结构域的CDR区域，可以在体外突变。在噬菌体展示文库中具有“突变”CDR的VH和VL结构域的表达使得能选择具有优选的结合特性如改进的亲和性或改善的解离速率的结合TR4多肽的VH/VL组合。
生产抗体的其它方法
本发明的抗体(包括抗体片段或变体)可以通过本领域已知的任何方法生产。例如，应意识到本发明的抗体可以在杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列可以例如用于转化一种合适的哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞，或者用于产生噬菌体展示文库。另外，本发明的多肽抗体可以经化学合成或通过使用重组表达系统产生。
生产本发明抗体的一种方式是克隆表1所示scFv的VH和/或VL结构域。为从用含有scFv的载体转染的细菌中分离VH和VL结构域，可以使用互补于VH或VL核苷酸序列的PCR引物(见实施例5)以扩增VH和VL序列。PCR产物然后可以使用载体克隆，所述载体例如具有由5’和3’单T核苷酸突出端组成的PCR产物克隆位点，即互补于通过许多用于PCR反应的DNA聚合酶加入到PCR产物的5’和3’末端上的突出的单腺苷酸。VH和VL结构域然后可以使用本领域已知常规方法测序。或者，VH和VL结构域可以使用设计为扩增全部scFv(即VH结构域，接头和VL结构域)的载体特异性引物扩增。克隆的VH和VL基因可以置于一或多种合适的表达载体中。非限制性举例而言，包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点及保护限制性位点的侧翼序列的PCR引物可以用于扩增VH或VL序列。利用本领域已知的克隆技术，PCR扩增的VH结构域可以克隆入表达适当的免疫球蛋白恒定区的载体中，所述恒定区例如相应于VH结构域的人IgG1或IgG4恒定区，相应于κ和λVL结构域的人κ或λ恒定区。优选地，表达VH或VL结构域的载体包含一个适于指导在选择的表达系统中表达重链和轻链的启动子、分泌信号、用于克隆免疫球蛋白可变区的克隆位点、免疫球蛋白恒定区及选择标记如新霉素。VH和VL结构域还可以克隆入表达必需恒定区的单个载体中。重链转化载体和轻链转化载体然后使用本领域已知的方法共转染入细胞系中，以产生稳定或瞬时表达全长抗体例如IgG的细胞系(见例如Guo等，临床内分泌代谢杂志82：925-31(1997)，及Ames等，免疫学方法杂志184：177-86(1995)所述，在此以其全文并入参考)。
本发明提供了包含或由编码本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)的核苷酸序列组成的多核苷酸。本发明还涵盖了在高度严格杂交条件下或者在中等或较低严格杂交条件下(如前述)，与互补于具有编码本发明抗体或其片段或变体的多核苷酸序列的核酸的多核苷酸杂交的多核苷酸。
通过本领域已知的任何方法，可以获得所述多核苷酸及确定所述多核苷酸的核苷酸序列。如果已知VH结构域，VL结构域及其CDR的氨基酸序列，则可以使用本领域熟知的方法确定编码这些抗体的核苷酸序列，即已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生编码本发明抗体的核酸的方式装配。编码所述抗体的这种多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸中装配(例如Kutmeier等，生物技术17：242(1994)所述)，简而言之，这包括合成含有编码所述抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火并连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码一种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)的多核苷酸可以从合适来源的核酸中产生。如果不能获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但已知所述抗体分子的序列，则编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成或得自一个合适来源(例如抗体cDNA文库，或者从表达所述抗体的任何组织或细胞中产生的cDNA文库，或从中分离的核酸优选聚A+RNA，所述组织或细胞如表达本发明抗体的杂交瘤细胞或Epstein Barr病毒转化的B细胞系)，通过使用与所述序列3’和5’末端杂交的合成引物进行PCR扩增，或者通过使用特异于特定基因序列的寡核苷酸探针进行克隆，以例如从编码所述抗体的cDNA文库中鉴别cDNA克隆。通过PCR产生的扩增的核酸然后可以使用本领域熟知的任何方法克隆入可复制克隆载体中。
一旦确定抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)的核苷酸序列，则该抗体的核苷酸序列可以使用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法进行操作，例如重组DNA技术，定点诱变，PCR等(见例如Sambrook等，1990，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，NY及Ausubel等编辑，1998，分子生物学通用方法，John Wiley&Sons，NY，在此均以其全文并入参考)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代，缺失和/或插入。
在一个特异的实施方案中，使用本领域已知的重组DNA方法将表1所示一或多种scFv的VH和VL结构域或其片段或变体插入构架区中。在一个特异的实施方案中，使用本领域已知的重组DNA方法将表1所示一或多种scFv的VH和/或VL结构域的1，2，3，4，5，6或多个CDR或其片段或变体插入构架区中。该构架区可以是天然发生的或共有的构架区，优选人构架区(见例如Chothia等，分子生物学杂志278：457-479(1998)所列出的人构架区表，其全部内容在此并入参考)。优选地，通过将所述构架区与CDR组合产生的多核苷酸编码一种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，所述抗体特异性结合TRAIL受体。优选地，如前所述，编码具有一或多个氨基酸取代的所述抗体变体或抗体片段的多核苷酸，可以在构架区内产生，优选所述氨基酸取代不明显改变抗体与抗原的结合。另外，这种方法可以用于产生参与链内二硫键的一或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以产生缺失一或多个链内二硫键的抗体分子或抗体片段或抗体变体。多核苷酸内的其它改变也涵盖在本发明范围内并为本领域技术人员所已知。
在YAC中克隆并重建兆碱基(Mb)大小的人基因座并将它们导入小鼠种系中的能力，提供了一种有力方法以阐明非常大的或粗略作图的基因座的功能成分以及产生人体疾病的有效模型。另外，利用这种用其人等价物取代小鼠基因座的方法可以提供关于人体基因产物在发育期间的表达和调节，其与其它系统的通讯及其参与疾病产生和进展的独特认识。
这种策略的一个重要的实际应用是“人源化”小鼠体液免疫系统。将人免疫球蛋白(Ig)基因座导入内源性Ig基因已经失活的小鼠中，可以有机会研究抗体的程序化表达及装配机制，以及其在B细胞产生中的作用。另外，这种策略可以提供一种理想来源以产生完全人单克隆抗体(Mabs)，这是实现用抗体治疗人体疾病的一个重要里程碑。
完全人抗体预期使对小鼠或小鼠衍生的单克隆抗体固有的免疫原性和变态反应应答最小化，并因此提高施用的抗体的效力和安全性。完全人抗体的应用可以预期在治疗需要反复施用抗体的人体慢性及复发疾病如癌症中提供大的优势。
关于这个目的的一个方案是将人Ig基因座的大量片段导入小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系，预期这种小鼠在无小鼠抗体的情况中产生人抗体的大量所有组成成分。大量人Ig片段可以保持大量可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当调节。通过使用小鼠抗体多样化和选择机制及对人体蛋白丧生免疫学耐受性，在这些小鼠品系中再生的人抗体所有组成成分应产生包括人抗原内的相应任何抗原的高亲和性抗体。使用杂交瘤技术，可以易于生产并选择具有所需特异性的抗原特异性人单克隆抗体。
这种一般策略结合在1994年公布的第一个XenoMouseTM品系的产生而表明。见Green等，自然遗传学7：13-21(1994)。XenoMouseTM品系用酵母人工染色体(YAC)工程化，所述YAC分别含有人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和10190kb大小的种系构型片段，其含有核心可变区和恒定区序列。文献同上。已证实含有人Ig的YAC与小鼠系统在抗体重排和表达方面均相容，而且能取代失活的小鼠Ig基因。这通过其诱导B细胞发育，产生完全人抗体的类成人所有组成成分，及产生抗原特异性人单克隆抗体的能力而证实。这些结果还提示导入含有较多V基因的人Ig基因座的较大部分，额外的调节元件及人Ig恒定区，可以基本上重现全部的所有组成成分，这是人体对感染和免疫的体液应答的特征。Green等的研究最近延及通过导入兆碱基大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系构型YAC片段而导入大约80％以上的人体抗体所有组成成分，产生XenoMouseTM小鼠。见Mendz等，自然遗传学15：146-156(1997)，Green和Jakobovits，实验医学杂志188：483-495(1998)，Green，免疫学方法杂志231：11-23(1999)及1996年12月3日提请的美国专利申请系列No.08/759620，所述文献在此全文并入参考。
这种方法在以下文献进一步论述及描绘：1990年1月12日提请的美国专利申请系列No.07/466088，1990年11月8日申请的07/710515，1992年7月24日申请的07/919297，1992年7月30日申请的07/922649，1993年3月15日申请的08/234145，1993年8月27日申请的08/112848，1994年8月28日申请的08/234145，1995年1月20日申请的08/376279，1995年4月27日申请的08/430938，1995年6月5日申请的08/464584，1995年6月5日申请的08/464582，1995年6月5日申请的08/471191，1995年6月5日申请的08/462837，1995年6月5日申请的08/486853，1995年6月5日申请的08/486857，1995年6月5日申请的08/486859，1995年6月5日申请的08/462513，1996年10月2日申请的08/724752，及1996年12月3日申请的08/759620。也见于Mendez等，自然遗传学15：146-156(1997)，及Green和Jakobovits，实验医学杂志188：483-495(1998)。也见于1996年6月12日授权公布的欧洲专利No.EP 0471151B1，1994年2月3日公布的国际专利申请No.WO94/02602，1996年10月31日公布的国际专利申请No.WO 96/34096，及1998年6月11日公布的WO98/24893所述。上述专利，申请及参考文献在此均以其全文并入参考。
人抗小鼠抗体(HAMA)应答导致业界制备嵌合的或其它人源化抗体。尽管嵌合抗体具有人恒定区和鼠可变区，但预期可以观测到一些人抗嵌合抗体(HACA)应答，尤其在长期或多剂量利用这些抗体的情况中。因此，需要提供抗TR4多肽的完全人抗体，以降低HAMA或HACA应答的影响和/或作用。
特异于TR4多肽的单克隆抗体可以使用杂交瘤技术制备(Kohler等，自然256：495(1975)；Kohler等，欧洲免疫学杂志6：511(1976)；Kohler等，欧洲免疫学杂志6：292(1976)；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤，Elsevier，N.Y.，pp571-681(1981))。简而言之，XenoMouseTM小鼠可以用TR4多肽免疫。在免疫后，提取该小鼠的脾细胞并与一种合适的骨髓瘤细胞融合。根据本发明可以使用任何合适的骨髓瘤细胞系；然而，优选应用得自ATCC的亲代骨髓瘤细胞系(SP2O)。在融合后，所得骨髓瘤细胞选择性保持在HAT培养基中，然后通过限制性稀释克隆，如Wands等所述(肠胃病学80：225-232(1981))。然后分析通过这种选择获得的杂交瘤细胞，以鉴别分泌能结合TR4多肽的抗体的克隆。
对于一些应用，包括在人体体内应用抗体及在检测分析中体外应用，优选使用人或嵌合抗体。特别需要完全人抗体用于治疗人类患者。也见于美国专利4444887和4716111；及PCT出版物WO 98/46645，WO 98/50435，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO96/35735及WO 91/10741；所述文献在此均以全文并入参考。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体包含本发明的一或多个VH和VL结构域及来自另一种免疫球蛋白分子的恒定区，优选人免疫球蛋白分子。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体包含一或多个相应于本发明VH和VL结构域的CDR及来自另一种免疫球蛋白分子优选人免疫球蛋白分子的构架区。在其它的实施方案中，本发明的抗体包含相应于表1所示一或多种scFv的一或多个VH或VL结构域的1，2，3，4，5，6或更多个VL CDR或VH CDR或其片段或变体，及来自人免疫球蛋白分子的构架区(及任选不是衍生自由表1所示scFv表达的抗体的一或多个CDR)。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含相应于选自表1所示各scFv的同一scFv或不同scFv的VHCDR3，VL CDR3或两者，或其片段或变体，及来自人免疫球蛋白的构架区。
嵌合抗体是一种分子，其中抗体的不同部分衍生自不同的免疫球蛋白分子，如具有衍生自人抗体的可变区及非人(例如鼠)免疫球蛋白恒定区的抗体或具有衍生自非人(例如鼠)抗体的可变区及人免疫球蛋白恒定区的抗体。本领域已知生产嵌合抗体的方法。见例如Morrison，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术4：214(1986)；Gillies等，免疫学方法杂志125：191-202(1989)；美国专利No.5807715；4816567及4816397，在此以其全文并入参考。包含人物种的一或多个CDR及非人免疫球蛋白分子的构架区(例如来自鼠，犬或猫免疫球蛋白分子的构架区)的嵌合抗体(或相反情况的嵌合抗体)，可以使用本领域已知的各种方法生产，包括例如CDR接枝(EP239400；PCT出版物WO91/09967；美国专利No.5225539；5530101和5585089)，镶嵌或表面再处理(resurfacing)(EP592106；EP519596；Padlan，分子免疫学28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，蛋白质工程7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS91：969-973(1994))，及链改组(美国专利No.5565352)。在一个优选的实施方案中，嵌合抗体包含一个人CDR3和非人构架区或不同于表1所示相应scFv中的构架区的人构架区，所述人CDR3具有表1所示一或多种scFv的VH或VL结构域的任一VH CDR3或VL CDR3的氨基酸序列。通常构架区中的构架残基用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变优选改良抗原结合性。这些框架取代通过本领域熟知方法鉴别，例如通过建立CDR与框架残基的相互作用的模型以鉴别对抗原结合而言重要的构架残基，以及进行序列对比以鉴别在特定位置的不寻常的构架残基(建例如Queen等，美国专利No.5585089；Riechmann等，自然352：323(1988)，在此以其全文并入参考)。
内抗体(Intrabody)是从重组核酸分子中表达并被工程化而保留在胞内(例如保留在胞质，内质网或周质中)的抗体，通常为svFvs。可以使用内抗体例如消除内抗体结合的蛋白质的功能。内抗体的表达还可以通过使用包含所述内抗体的核酸表达载体中的可诱导启动子进行调节。本发明的内抗体可以使用本领域已知方法生产，参见如下文献：Chen等，人体基因治疗5：595：-601(1994)；Marasco，W.A.，基因治疗4：11-15(1997)；Rondon和Marasco，微生物学年度综述51：257-283(1997)；Proba等，分子生物学杂志275：245-253(1998)；Cohen等，癌基因17：2445-2456(1998)；Ohage和Steipe，分子生物学杂志291：1119-1128(1999)；Ohage等，分子生物学杂志291：1129-1134(1999)；Wirtz和Steipe，蛋白质科学8：2245-2250(1999)；Zhu等，免疫学方法杂志231：207-222(1999)，及这些文献所引述的参考文献。
本发明抗体的重组表达(包括抗体片段或变体(例如本发明抗体的重链或轻链))，需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的一种表达载体。一旦获得编码本发明抗体分子(例如完整抗体，抗体的重链或轻链，或其部分(优选但非必需含有重链或轻链可变结构域))的多核苷酸，则生产所述抗体分子的载体可以使用本领域熟知方法通过重组DNA技术产生。因此，在此描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸而制备蛋白质的方法。可以使用本领域熟知的方法构建含有抗体编码序列及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术，合成技术及体内遗传重组。本发明因此提供了可复制载体，所述载体包含编码本发明抗体分子(例如完整抗体，抗体的重链或轻链，抗体的重链或轻链可变结构域，或其部分，或重链或轻链CDR，单链Fv，或其片段或变体)的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操纵地连接于一个启动子。这种载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见例如PCT出版物WO86/05807；PCT出版物WO89/01036；及美国专利5122464，所述文献在此以其全文并入参考)，抗体的可变结构域可克隆入这种载体中，以表达完整重链，完整轻链，或完整的重链和轻链。
将表达载体通过常规方法移至宿主细胞中，然后将转染的细胞通过常规方法培养以产生本发明抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体(例如完整抗体，其重链或轻链，或其部分，或单链抗体，或其片段或变体)的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操纵地连接于一个异源启动子。在优选的实施方案中，为表达完整的抗体分子，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共同表达，以表达完整的免疫球蛋白分子，如以下详细描述。
可以利用各种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分子。这种宿主表达系统代表可以用以产生并随后纯化相应编码序列的载体，但也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达本发明抗体分子的细胞。这些载体包括但非限于工程化的表达抗体片段或其变体(单链抗体)的噬菌体颗粒，微生物如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌，B.subtilis)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如Saccharomyces，Pichia)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的植物细胞系，或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系(例如COS，CHO，BHK，293，3T3，NS0细胞)，所述构建体含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)，或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。优选地，细菌细胞如大肠杆菌，及更优选地尤其表达完整重组抗体分子的真核细胞，用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，与来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件的载体，是一种抗体的有效表达系统(Foecking等，基因45：101(1986)；Cockett等，生物/技术8：2(1990)；Bebbington等，生物/技术10：169(1992)；Keen和Hale，细胞工程18：207(1996))。这些参考文献在此以其全文并入参考。
在细菌系统中，可以有利地根据待表达的抗体分子的应用，选择一些表达载体。例如，当需产生大量这种蛋白质时，为产生抗体分子的药物组合物，需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这种载体包括但非限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO杂志2：1791(1983))，其中所述抗体编码序列可以单独连接于载体中与具有lacZ编码区同框，以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，核酸研究13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，生物化学杂志24：5503-5509(1989))等。pGEX载体也可以用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常地，这种融合蛋白是可溶的，而且，通过吸附并结合于基质谷胱甘肽琼脂糖珠，随后在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱，而易于从裂解的细胞中纯化。pGEX载体设计为包含凝血酶或因子Xa蛋白酶解位点，以便克隆的靶基因产物可以从GST组分中释出。
在一个昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可以用作表达外源基因的载体。所述病毒在草地夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可以单独克隆入病毒的非必需区域(例如多角蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况中，相应的抗体编码序列可以连接于一个腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。这个嵌合的基因然后可以通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。在病毒基因组的一个非必需区域中(例如E1或E3区)的插入，将产生能在感染的宿主中存在并表达所述抗体分子的重组病毒(例如参见Logan & Shenk，美国科学院院报81：355-359(1984))。特异性起始信号也可以是有效翻译插入的抗体编码序列所需的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。另外，所述起始密码子必须与所需编码序列的读框同相，以保证完整插入体的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，可以是天然的和合成的。表达效率可以通过包含适当的增强子元件，转录终止子等而加强(见例如Bittner等，酶学中的方法153：51-544(1987))。
另外，可以选择以所需特异方式调节插入序列表达或者修饰和加工基因产物的宿主细胞菌株。这种对蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对所述蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有特有的和特异的翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以保证正确修饰和加工表达的外源蛋白。为此，可以使用具有合适的加工原始转录物，糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但非限于CHO，VERY，BHK，Hela，COS，NSO，MDCK，293，3T3，W138，尤其乳腺癌细胞系如BT483，Hs578T，HTB2，BT2O和T47D，及正常乳腺细胞系如CRL7O3O和HsS78Bst。
为长期高产量生产重组的蛋白质，优选稳定的表达。例如可以将稳定表达所述抗体的细胞系工程化。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用由适当表达控制元件(例如启动子，增强子，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和一个选择标记转化。在导入外源DNA后，可以使工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移至选择性培养基。重组质粒中可选择标记授予对选择的抗性，并使细胞稳定地将所述质粒整合入其染色体中，并生长形成转化灶，然后将所述转化灶克隆及扩展入细胞系中。这个方法可用于工程化表达抗体分子的细胞系。这种工程化细胞系可特别用于筛选和评价与所述抗体分子直接或间接相互作用的组合物。
可以使用许多筛选系统，包括但非限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，细胞11：223(1977))，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，美国科学院院报48：202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，细胞22：817(1980))基因，它们可以分别用于tk-，hgprt-或aprt-细胞中。同样，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择基础：dhfr，其授予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，美国科学院院报77：357(1980)；O′Hare等，美国科学院院报78：1527(1981))；gpt，其授予对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，美国科学院院报78：2072(1981))；neo，其授予对氨基糖苷G-418抗性(临床药理学12：488-505；Wu和Wu，生物治疗3：87-95(1991)；Tolstoshev，药物毒性分析研究32：573-596(1993)；Mulligan，科学260：926-932(1993)；及Morgan和Anderson，生物化学分析研究62：191-217(1993)；TIBTECH 11(5)：155-215(May，1993))；及hygro，其授予对潮霉素的抗性(Santerre等，基因30：147(1984))。可以常规使用本领域已知的重组DNA技术，选择所需的重组克隆，这种方法见例如Ausubel等(编辑)，分子生物学通用方法，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，基因转移和表达实验指导，Stockton出版社NY(1990)；及Dracopoli等(编辑)，人类遗传学通用方法，第12和13章，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等，分子生物学杂志150：1(1981)，这些文献以其全文并入参考。
抗体分子的表达水平可以通过载体扩增而提高(参见Bebbington和Hentschel，使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因，《DNA克隆》，第3卷(学术出版社，纽约，1987))。当表达抗体的载体系统中的一个标记是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平提高将会提高标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的编码序列相关，因此抗体的产生也将增加(Crouse等，分子细胞生物学3：257(1983))。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为选择标记的载体可以在分别存在药物甲硫氨酸sulphoximine或氨甲蝶呤的情况下扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优势是可利用谷氨酰胺阴性的细胞系(例如鼠骨髓瘤细胞系，NS0)。谷氨酰胺合酶表达系统还可以在谷氨酰胺合酶表达细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中发挥作用，其通过提供另外的抑制剂阻止内源基因的作用而起作用。谷氨酰胺合酶表达系统及其成分详见于PCT出版物WO87/04462，WO86/05807，WO89/01036，WO89/10404，WO91/06657所述，这些文献在此全文并入参考。另外，本发明可以使用的谷氨酰胺合酶表达载体可商购自供应商，例如Lonza生物技术公司(Portsmouth，NH)。使用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达及产生单克隆抗体见Bebbington等，生物/技术10：169(1992)及Biblia和Robinson，生物工程进展11：1(1995)所述，这些文献全文并入参考。
所述宿主细胞可以用本发明的两种表达载体共转染，第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可以含有相同的选择标记，其能等量表达重链和轻链多肽。或者，可以使用编码而且能同时表达重链和轻链多肽的一个载体。在这种情况中，轻链优选置于重链之前，以避免毒性游离重链过量(Proudfoot，自然322：52(1986)；Kohler，美国科学院院报77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的抗体分子已经通过化学合成或重组表达，可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的方法纯化，或更普遍地，使用纯化蛋白质的方法纯化，例如层析(例如离子交换，亲和性，特别是在蛋白质A及大小排阻层析后对特异性抗原的亲和性)，离心，不同的溶解性，或纯化蛋白质的任何其它标准方法。另外，本发明的抗体可以与本发明所述或本领域已知的其它异源多肽序列融合以易于纯化。
抗TR4抗体的定性
本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)还可以根据其与TR4多肽或多肽片段或变体的结合而描述或说明。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体，解离常数KD小于或等于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M或10-5M。更优选地，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体的解离常数或KD小于或等于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，或10-8M。更优选地，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体的解离常数或KD小于或等于5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，或10-15M。本发明涵盖了以解离常数或KD在每个具体列出数值之间任一范围内结合TR4多肽的抗体。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽多肽或其片段或变体的解离速率(koff)小于或等于5×10-2/秒，10-2/秒，5×10-3/秒或10-3/秒。更优选地，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体的解离速率(koff)小于或等于5×10-4/秒，10-4/秒，5×10-5/秒，或10-5/秒，5×10-6/秒，10-6/秒，5×10-7/秒或10-7/秒。本发明涵盖了以解离速率(koff)在每个具体列出的数值之间的任一范围内结合TR4多肽的抗体。
在其它实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体的结合速率(on rate，kon)高于或等于103M-1/秒，5×103M-1/秒，104M-1/秒或5×104M-1/秒。更优选地，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体的结合速率(kon)高于或等于105M-1/秒，5×105M-1/秒，106M-1/秒，或5×106M-1/秒或107M-1/秒。本发明涵盖了以结合速率(kon)在每个具体列出的数值之间的任一范围内结合TR4多肽的抗体。
本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)免疫特异性结合人TR4多肽(SEQ ID NO：1)或多肽片段或变体。在另一个实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合猿TR4多肽或多肽片段或变体。在又一个实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合鼠TR4多肽或多肽片段或变体。在一个实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合人和猿TR4多肽。在另一个实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合人和鼠TR4多肽。更优选地，与鼠TR4多肽相比本发明的抗体优先结合人TR4多肽。
在优选的实施方案中，本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)免疫特异性结合TR4，但与任何其它抗原不交叉反应。在优选的实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合TR4多肽(例如SEQ ID NO：1或其片段或变体)，但与肿瘤坏死因子受体家族多肽的一或多个成员(例如TR1，TR5，TR10 BCMA，TACI，CD30，CD27，OX40，4-1BB，CD40，NGFR，TNFR1，TNFR2，Fas和NGFR)不交叉反应。
在另一个实施方案中，本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)免疫特异性结合TR4多肽并与其它抗原交叉反应。在其它实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合TR4多肽(例如SEQ ID NO：1或其片段或变体)，并与肿瘤坏死因子受体家族的一或多个另外的成员(例如TR1，TR5，TR10，BCMA，TACI，CD30，CD27，OX40，4-1BB，CD40，NGFR，TNFR1，TNFR2，Fas及NGFR)。
在一交叉反应个优选的实施方案中，相对于本发明抗体结合TR1，TR5，TR7或TR10(SEQ ID NO：2-5)或其片段或变体的能力，本发明的抗体优先结合TR4多肽(SEQ ID NO：1)或其片段或变体。在其它优选的实施方案中，相对于结合TR1，TR5或TR10(SEQID NO：5，2和4)或其片段或变体的能力，本发明的抗体优先结合TR4和TR7多肽(SEQ ID NO：1和3)或其片段或变体。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合TR1，TR4，TR5，TR7和TR10(SEQ ID NO：5，1，2，3，和4)。与另一种抗原相比，抗体优先结合一种抗原的能力可以使用本领域已知的任何方法测定。
非限制性例子是，如果一种抗体结合第一种抗原的解离常数(KD)低于该抗体结合第二种抗原的KD，则认为其优先结合第一种抗体。在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的亲和性(即KD)比该抗体与第二种抗原的KD至少低一个数量级，则认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的亲和性(即KD)比该抗体与第二种抗原的KD至少低两个数量级，则认为该抗体优先结合第一种抗原。
在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的解离速率(koff)低于该抗体与第二种抗原的koff，则认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的解离速率(koff)比该抗体与第二种抗原的koff至少低一个数量级，则认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的解离速率(koff)比该抗体与第二种抗原的koff至少低两个数量级，则认为该抗体优先结合第一种抗原。
本发明还涵盖了与本发明所述一或多种抗体具有一或多种相同生物学特征的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)。“生物学特征”是指所述抗体在体外或体内的活性或性质，例如结合TR4多肽(例如膜包埋的TRAIL受体)的能力，刺激TR4介导的生物学活性的能力(例如刺激TR4表达细胞的编程性死亡，见实施例4)，基本阻断TR4配体(例如TRAIL(SEQ ID NO：66)，也称为AIM-I，国际申请No.WO97/35899和美国专利5771223)或其片段、变体或融合蛋白的结合TRAIL受体的能力，见实施例3；或上调TR4在细胞表面表达的能力。TR4多肽的抗体的其它生物学活性可包括但非限于抑制TR4介导的生物学活性的能力(例如抑制TR4表达细胞的编程性死亡)，或者负调节TR4在细胞表面表达的能力。任选地，本发明的抗体与在此特别描述的至少一种抗体结合相同的表位。这种表位结合可以使用本领域已知的方法常规确定。
本发明还提供了刺激TR4介导的生物学活性的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。在一个实施方案中，刺激TR4介导的生物学活性的抗体包含或由表1所示至少一种scFv的VH和/或VL结构域或其片段或变体组成。在一个特异的实施方案中，刺激TR4介导的生物学活性的抗体包含或由表1所示任一种scFv的VH和VL结构域或其片段或变体组成。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还提供了刺激TR4表达细胞编程性死亡的抗体(包含包含或由抗体片段或变体组成的分子)(见实施例4)。在一个实施方案中，刺激TR4表达细胞编程性死亡的抗体包含或由表1所示至少一种scFv的VH和/或VL结构域或其片段或变体组成。在一个特异的实施方案中，刺激TR4表达细胞编程性死亡的抗体包含或由表1所示任一种scFv的VH和VL结构域或其片段或变体组成。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在优选的实施方案中，本发明还提供了在有或无抗体交联剂的情况下均等同良好地刺激TR4表达细胞编程性死亡的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，所述交联剂如抗Ig Fc反应细胞(见例如实施例4)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体在有或无抗Ig Fc抗体交联剂的情况下均等同良好地刺激HeLa细胞编程性死亡。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体在存在2μg/ml环己酰亚胺、有或无抗Ig Fc抗体交联剂的情况下均等同良好地刺激HeLa细胞编程性死亡。在另一个实施方案中，本发明的抗体在有或无抗Ig Fc抗体交联剂的情况下均等同良好地刺激SW480细胞编程性死亡。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体在存在2μg/ml环己酰亚胺、有或无抗Ig Fc抗体交联剂的情况下均等同良好地刺激SW480细胞编程性死亡。
在其它优选的实施方案中，本发明还提供了刺激TR4表达细胞编程性死亡的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，其与等浓度的(例如在ng/ml水平)TRAIL多肽(包括TRAIL片段，变体或融合蛋白)刺激TR4表达细胞编程性死亡的程度至少相同(见例如实施例4)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体刺激TR4表达细胞编程性死亡的程度好于等浓度的(例如在ng/ml水平)TRAIL多肽(包括其片段，变体或融合蛋白)刺激的TR4表达细胞编程性死亡。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体刺激HeLa细胞编程性死亡的程度好于等浓度的(例如在ng/ml水平)TRAIL多肽(包括其片段，变体或融合蛋白)刺激的TR4表达细胞编程性死亡。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体刺激HeLa细胞编程性死亡的程度好于等浓度的(例如在ng/ml水平)TRAIL多肽(包括其片段，变体或融合蛋白)在存在2μg/ml环己酰亚胺下刺激的TR4表达细胞编程性死亡。
在其它优选的实施方案中，本发明还提供了抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，当其与一种化疗药物组合施用时，比单独施用化疗药物或由所述抗体单独刺激受体表达细胞编程性死亡的效果好。在特异的实施方案中，当本发明的抗体与Topotecan组合施用时，与Topotecan或抗体单独刺激受体细胞编程性死亡相比，刺激更多的TR4表达细胞编程性死亡。在特异的实施方案中，当本发明的抗体与环己酰亚胺组合施用时，与环己酰亚胺或所述抗体单独刺激受体表达细胞编程性死亡相比，刺激更多的TR4表达细胞编程性死亡。
本发明还提供了阻断或抑制TRAIL与TR4多肽结合的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)(见实施例3)。在一个实施方案中，阻断或抑制TRAIL与TR4多肽结合的抗体包含或由表1所示至少一种scFv的VH和/或VL结构域或其片段或变体组成。在一个特异的实施方案中，阻断或抑制TRAIL与TR4多肽结合的抗体包含或由表1所示任一种scFv的VH和VL结构域或其片段或变体组成。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还提供了融合蛋白，其包含免疫特异性结合TR4的一种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)，和一个异源多肽。优选地，与抗体融合的所述异源多肽对发挥功能或对将所述抗体定向于TR4表达细胞是有用的。在特异的实施方案中，本发明涵盖了双特异性抗体，其中一个抗体结合位点特异于TR4而另一个抗体结合位点特异于一种异源多肽如TR7或肿瘤特异性抗原。在另一个优选的实施方案中，与抗体融合的异源多肽用于将抗体定向于肿瘤细胞。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由一种多肽和一个异源多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的任一或多个VH结构域的氨基酸序列或者本发明抗体的任一或多个VL结构域的氨基酸序列或它们的片段或变体组成。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由一种多肽和一个异源多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的任一个，两个，三个或多个VH CDR的氨基酸序列或本发明抗体的任一个，两个，三个或多个VL CDR的氨基酸序列，或它们的片段或变体。在一个优选的实施方案中，所述融合蛋白包含一种多肽和一个异源多肽序列，所述多肽具有本发明抗体的一个VH CDR3的氨基酸序列或其片段或变体，这种融合蛋白免疫特异性结合TR4。在另一个实施方案中，融合蛋白包含或由一种多肽和一个异源的多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的至少一个VH结构域的氨基酸序列和本发明抗体的至少一个VL结构域的氨基酸序列，或它们的片段或变体。优选地，融合蛋白的VH和VL结构域相当于本发明的一个单一抗体(或scFv或Fab片段)。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由一种多肽和一个异源多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的任一个，两个，三个或多个VH CDR的氨基酸序列及本发明抗体的任一个，两个，三个或多个VL CDR的氨基酸序列，或它们的片段或变体。优选地，两个，三个，四个，五个，六个或多个VH CDR(s)或VLCDR(s)相应于本发明的一个单一抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明的抗体(包括抗体片段或变体)可以通过各种方式定性。特别地，可以分析本发明的抗体和相关分子免疫特异性结合TR4或其片段或变体的能力，使用在此所述方法或对本领域已知方法常规修改的方法而进行。分析本发明抗体免疫特异性结合TR4或其片段或变体的能力，可以在溶液中(例如Houghten，生物/技术13：412-421(1992))，在珠上(例如Lam，自然354：82-84(1991))，在芯片上(例如Fodor，自然364：555-556(1993))，在细菌上(例如美国专利No.5223409)，在孢子上(例如专利号No.5571698，5403484和5223409)，在质粒上(例如Cull等，美国科学院院报89：1865-1869(1992))或在噬菌体上(例如Scott和Smith，科学249：386-390(1990)；Devlin，科学249：404-406(1990)；Cwirla等，美国科学院院报87：7178-7182(1990)；及Felici，分子生物学杂志222：301-310(1991))进行，在此所有文献并入参考。
可以通过本领域已知的任何方法分析本发明的抗体与TR4多肽的免疫特异性结合及与其它抗原的交叉反应性。可以用于分析免疫特异性结合及交叉反应性的免疫分析方法包括但非限于竞争性及非竞争性分析系统，使用如下技术：BIAcore分析(见例如实施例2)，FACS(荧光激活的细胞淘选仪)分析，免疫荧光，免疫细胞化学，放射免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫分析，免疫沉淀分析，western印迹，沉淀反应，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散分析，凝集分析，补体固定分析，免疫放射分析，荧光免疫分析及蛋白质A免疫分析等。这种分析是本领域常规使用并熟知的(见例如Ausubel等编辑1994，分子生物学通用方法，第1卷，John Wiley&Sons公司，纽约，在此以其全文并入参考)。以下简要阐述了免疫分析(非限制性)。
ELISA包括制备抗原，用所述抗原包被一个96孔微滴定平板的孔，洗去未结合孔的抗原，在所述孔中加入缀合于一种可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的相应抗体，并温育一段时间，冲洗去未结合的抗体或非特异性结合的抗体，并检测特异性结合包被孔的抗原的抗体的存在情况。在ELISAs中，本发明的抗体不用缀合于可检测化合物；取而代之，将缀合于可检测化合物的第二抗体(其识别相应抗体)加入所述孔中。或者，不用所述抗原直接包被孔，而是用抗Ig Fc抗体包被ELISA平板，TRAIL受体-Fc融合蛋白形式的抗原可以结合该抗Ig-Fc抗体包被的平板。这可以维持抗原蛋白(例如TR4多肽)比当其直接包被于平板时呈更天然的构象。另外，与抗原包被孔相反，所述抗体可以包被孔。在这种情况中，可检测分子可以是缀合可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗原。本领域技术人员已知对参数可以加以修改，以提高信号检测，另外，本领域已知其它ELISA变化方式。关于ELISA的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第1卷，John Wiley & Sons公司，纽约，在11.2.1章节。
抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的scFv或其它分子)与抗原的结合亲和性，和抗体-抗原相互作用的解离速率，可以通过竞争性结合分析测定。竞争性结合分析的一个实例是放射免疫分析，包括将感兴趣抗体在未标记抗原数量增加的情况下，与标记的抗原(例如用3H或125I标记的抗原)或其片段或变体温育，并检测与标记的抗原结合的抗体。本发明抗体对TR4多肽的亲和性及结合解离速率，可以从Scatchard作图分析的数据确定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫分析测定。在这种情况中，TR4多肽在未标记的第二种抗TR4多肽抗体量增加的情况下，与缀合于标记的化合物(例如3H或125I标记的化合物)的本发明抗体温育。两种抗体之间的这种竞争性分析也可以用于确定这两种抗体是否结合相同或不同的表位。
在一个优选的实施方案中，使用BIAcore动力学分析确定抗体与TRAIL受体或其片段的结合及解离速率。BIAcore动力学分析包括分析来自芯片的抗体与其表面上固定的TRAIL受体的结合和解离，详见于实施例2所述。
免疫沉淀方法通常包括在裂解缓冲液中裂解一群细胞，所述裂解缓冲液如是补加了蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA，PMSF，抑酶肽，钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠pH 7.2，1％Trasylol)，将感兴趣抗体加入细胞裂解物中，在40℃温育一段时间(例如1-4小时)，在所述细胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，在40℃温育大约1或多个小时，在裂解缓冲液中洗涤珠，并将珠再悬浮于SDS/样品缓冲液中。感兴趣抗体免疫沉淀一种特定抗原的能力可以通过例如Western印迹分析测定。本领域技术人员已知可以对参数加以修改，以提高抗体与抗原的结合并降低背景(例如用琼脂糖珠预先清洁细胞裂解物)。关于免疫沉淀方法的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第1卷，JohnWiley & Sons公司，纽约，在10.16.1章节。
Western印迹分析一般包括制备蛋白质样品，将所述蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳(例如，根据所述抗原的分子量采用8％-20％SDS-PAGE)，将来自聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质样品移至一个膜上，如硝基纤维素膜，PVDF或尼龙膜上，在封闭溶液(例如具有3％BSA或脱脂奶的PBS)中将此膜封闭，在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween 20)洗涤此膜，用在封闭溶液中稀释的初级抗体(感兴趣抗体)封闭此膜，在洗涤缓冲液中洗涤此膜，用在封闭溶液中稀释的第二抗体(其识别初级抗体，例如抗人抗体)封闭此膜，所述第二抗体缀合于酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或125I)，将此膜在洗涤缓冲液中洗涤，并检测抗原的存在情况。本领域技术人员已知可以对参数加以修改，以提高信号检测并降低背景干扰。关于Western印迹的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第1卷，John Wiley & Sons公司，纽约，在10.8.1章。
抗体缀合物
本发明涵盖了重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)于一种异源多肽(或其一部分，优选所述多肽的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，或100个氨基酸)的抗体(包括抗体片段或其变体)，以产生融合蛋白。所述融合非必需是直接的，可以通过接头序列发生。例如，本发明的抗体可以用于将异源多肽在体外或体内定向于特定类型的细胞(例如癌细胞)，这通过将所述异源多肽与本发明抗体融合或缀合进行，本发明抗体特异于特定细胞表面抗原，或与结合特定细胞表面受体的抗原结合。本发明的抗体还可以融合于白蛋白(包括但非限于重组人血清白蛋白(见例如1999年3月2日授权的美国专利No.5876969，EP专利0413622及1998年6月16日授权的美国专利No.5766883所述，在此全文并入参考))，产生嵌合多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽和/或抗体(包括抗体片段或变体)与成熟形式的人血清白蛋白(即EP专利0322094的图1和图2所示人血清白蛋白的1-585位氨基酸，在此全文并入参考)融合。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)与如下多肽片段融合，所述多肽片段包含或由美国专利5766883所述的人血清白蛋白的第1-z位氨基酸残基组成，其中z是369-419之间的一个整数，该专利全文并入参考。本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)可以融合于异源多肽(例如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N或C末端。编码本发明融合蛋白的多核苷酸也涵盖在本发明内。这种融合蛋白可例如易于纯化并提高体内半衰期。融合或缀合于异源多肽的抗体还可以使用本领域已知的方法，用于体外免疫分析和纯化方法中。见例如Harbor等，如前，和PCT出版物WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，免疫学通讯39：91-99(1994)；美国专利No.5,474,981；Gillies等，PNAS89：1428-1432(1992)；Fell等，免疫学杂志146：2446-2452(1991)所述，所述文献以其全文并入参考。
本发明还包括组合物，所述组合物包含或由融合或缀合于抗体片段的异源多肽组成。例如，所述异源多肽可以融合或缀合于Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab)2片段，或其一部分。本领域已知将多肽融合或缀合于抗体部分的方法。见例如美国专利Nos.5,356,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,112,946；EP 307,434；EP367,166；PCT出版物WO 96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi等，美国科学院院报88：10535-10539(1991)；Zheng等，免疫学杂志154：5590-5600(1995)；和Vil等，美国科学院院报89：11337-11341(1992)(所述文献以其全文并入参考)。
本发明的另外的融合蛋白可以通过基因改组(gene shuffling)，基序改组，外显子改组和/或密码子改组方法产生(统称为“DNA“改组)。可以采用DNA改组以调节抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)的活性，可以使用这种方法产生活性改变的抗体(例如具有高亲和性和低解离速率的抗体)。见美国专利Nos.5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458，及Patten等，生物工程通用观点8：724-33(1997)；Harayama，生物工程趋势16(2)：76-82(1998)；Hansson，等，分子生物学杂志287：265-76(1999)；及Lorenzo和Blasco，生物技术24(2)：308-13(1998)(每个专利和出版物在此均以全文并入参考)。在一个实施方案中，在重组前可以通过易错PCR进行随机诱变，随机核苷酸插入或其它方法，改变编码本发明抗体的多核苷酸。在另一个实施方案中，编码部分免疫特异性结合TR4的抗体的多核苷酸的一或多个部分，可以与一或多个异源分子的一或多个成分，基序，节段，部分，结构域，片段等重组。
另外，本发明的抗体(包括抗体片段或其变体)，可以融合于标记序列，如一种促进纯化的多肽。在优选的实施方案中，所述标记氨基酸序列是一个6组氨酸多肽，如pQE载体中提供的标记(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，许多标记是可以商购的。如Gentz等，美国科学院院报86：821-824(1989)所述，提供6组氨酸以方便纯化融合蛋白。用于纯化的其它肽标记包括但非限于血凝素“HA”标记，其相应于衍生自流感血凝素蛋白的一个表位(Wilson等，细胞37：767(1984))，和
Figure C0281490401871
标记(Stratagene，La Jolla，CA)。
本发明还涵盖了缀合于一种诊断或治疗剂的抗体(包括抗体片段或其变体)。所述抗体可以诊断性用于例如监测或预后肿瘤的发生和进展，以作为临床测试程序的一部分，以例如确定给予的治疗方案的效力。可以通过将所述抗体偶联于一种可检测物质而易于检测。可检测物质例如包括但非限于各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性物质，使用各种正电子发射X线断层摄影可检测的发射正电子的金属，和非放射性顺磁性金属离子。可以使用本领域已知方法，将所述可检测物质直接偶联于或缀合于所述抗体，或间接通过中间物(例如本领域已知的接头)偶联或缀合于所述抗体。例如美国专利No.4,741,900阐述了可以缀合于抗体的金属离子，根据本发明可以用作诊断剂。适当的酶包括例如但非限于辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物例如包括但非限于链亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光材料包括但非限于伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料例如包括但非限于鲁米诺；生物发光材料例如包括但非限于萤光素酶，萤光素，和水母发光蛋白；合适的放射性物质包括但非限于，碘(131I，125I，123I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115mIn，113mIn，112In，111In)，和锝(99Tc，99mTc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh和97Ru。
另外，本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子)，可以缀合于一种治疗成分如胞毒素，例如抑制细胞生长的或杀细胞的制剂，一种治疗剂或一种放射性金属离子，例如α发射体，例如213Bi，或其它放射性同位素例如103Pd，135Xe，131I，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，35S，90Y，153Sm，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn，90Y，117Tin，186Re，188Re和166Ho。在特异的实施方案中，本发明的抗体或其片段附着于大环类鳌合剂，用于将射电金属离子包括但非限于177Lu，90Y，166Ho和153Sm缀合于多肽。在特异的实施方案中，大环类鳌合剂是1，4，7，10-四氮环化十二烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸(DOTA)。在其它特异的实施方案中，DOTA通过一个接头分子附于本发明抗体或其片段。用于将DOTA缀合于多肽的接头分子例如是本领域已知的那些，见例如DeNardo等，临床癌症研究4(10)：2483-90，1998；Peterson等，生物缀合化学10(4)：553-7，1999；和Zimmerman等，核酸医学生物学26(8)：943-50，1999，所述文献以其全文并入参考。
细胞毒素或胞毒剂包括对细胞有害的任何制剂。例如包括但非限于paclitaxol，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙啶，吐根碱，丝裂霉素，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，tenoposide，长春新碱，长春花碱，秋水仙素，阿霉素，道诺霉素，二羟基炭疽菌素dione，mitoxantrone(一种DNA嵌入剂)，光神霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，心得安，胸苷激酶，核酸内切酶，，RNAse，和嘌呤霉素及其片段，变体或类似物。治疗剂包括但非限于抗代谢物(例如氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化剂(例如二氯甲基二乙胺，thioepa苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，亚硝基脲氮芥(BSNU)和lomustine(CCNU)，环磷酰胺，二甲磺酸丁酯，二溴甘露醇。链脲霉素，丝裂霉素C，和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂，anthracyclines(例如道诺红菌素(从前的道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如放线菌素D(从前的放线菌素)，博来霉素，光神霉素和氨茴霉素(AMC))，及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
可使用本领域已知的方法标记本发明的抗体。这种方法包括但非限于使用双重功能的缀合剂(见例如美国专利Nos.5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560和5,808,003所述；所述文献均以全文并入参考)及直接偶联反应(例如Bolton-Hunter和氯胺-T反应)。
缀合的本发明的抗体可以用于修饰给定的生物应答，不必受传统化学治疗剂的限制而构建治疗剂或药物组分。例如所述药物组分可以是具有所需生物学活性的一种蛋白质或多肽。这种蛋白质可以包括但非限于毒素，例如相思豆毒素，蓖麻毒素A，α毒素，假单胞菌外毒素，或白喉毒素，皂草素，木鳖子皂苷，gelonin，美洲商陆抗病毒蛋白，α-八叠球菌和霍乱毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经生长因子，血小板衍生的生长因子，组织纤溶酶原激活物，细胞编程性死亡因子例如TNF-α，TNF-β，AIM I(见国际出版物No.WO 97/33899)，AIM II(见国际出版物No.WO 97/34911)，Fas配体(Takahashi等，免疫学研究6：1567-1574(1994))，VEGI(见国际出版物No.WO 99/23105)，血栓形成因子或抗血管发生因子，例如制管张素或endostatin；或者生物应答修饰因子例如淋巴因子，白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-6(IL-6)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，或其它生长因子。
本发明的抗体(包括抗体片段或其变体)还可以附于固体支持物，其特别用于免疫分析或靶抗原纯化中。这种固体支持物包括但非限于玻璃，纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。
将治疗组分缀合于抗体的方法是熟知的，见例如Arnon等，“在癌症治疗中免疫定向药物的单克隆抗体”，单克隆抗体与癌症治疗，Reisfeld等(编辑)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“针对药物输送的抗体”，控制的药物输送(第2版)，Robinson等(编辑)，pp.623-53(Marcel Dekker公司，1987)；Thorpe，“在癌症治疗中胞毒剂的抗体载体回顾”，单克隆抗体‘84：生物和临床应用，Pinchera等(eds.)，pp.475-506(1985)；“在癌症治疗中使用放射标记的抗体的分析，结果和预后”，针对癌症检测和治疗的单克隆抗体，Baldwin等(编辑)，pp.303-16(学术出版社1985)，和Thorpe等，“抗体-毒素缀合物的制备和胞毒性”，免疫学研究62：119-58(1982)。
或者，本发明的抗体可以缀合于第二抗体，形成抗体异源缀合物，如Segal在美国专利No.4,676,980中所述，以其全文并入参考。
有或无治疗组分缀合于其的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的其它分子)，单独施用或与胞毒因子和/或细胞因子组合，可以用作一种治疗剂。
本发明抗体的应用
本发明的抗体可以用于例如但非限于纯化，检测及定向本发明的多肽，包括在体外和体内诊断和治疗方法中。例如，抗体可用于免疫分析中以定性和定量测定生物学样品中TR4多肽水平。见例如Harlow等，抗体：实验室指导(冷泉港实验室出版社，第2版，1988)(在此全文并入参考)。
免疫分型
本发明的抗体可以用于对细胞系和生物学样品进行免疫分型(见例如实施例4)。本发明基因的翻译产物可用作细胞特异性标记，或更特别地用作细胞标记，其在特殊类型细胞尤其肿瘤和癌细胞的分化和/或成熟的不同阶段不同表达。直接抗一个特异性表位或表位组合的单克隆抗体，可以筛选表达该标记的细胞群。可以利用各种技术使用单克隆抗体筛选表达该标记的细胞群，包括使用抗体包被磁珠磁性分离，用附于固体基质(即平板)的抗体“淘选”，及流式细胞计量术(见例如美国专利5985660；及Morrison等，细胞96：737-49(1999))。
这些技术可筛选特殊的细胞群，如可以发现血液恶性肿瘤细胞(即急性白血病患者中的最小存活疾病(MRD))，及移植中的“非自身”细胞以预防移植物抗宿主疾病(GVHD)。或者，这些技术可以筛选能增殖和/或分化的造血干细胞和祖细胞，可在人脐带血中发现。
表位作图
本发明提供了可用于鉴别TR4多肽表位的抗体(包括抗体片段或其变体)。特别地，本发明的抗体可用于鉴别以下多肽的表位：人TR4多肽(SEQ ID NO：1)或在人体细胞上表达的TR4多肽；小鼠TR4多肽或在小鼠细胞上表达的TR4多肽；大鼠TR4多肽受体或在大鼠细胞上表达是TR4多肽；或者猴TR4多肽或在猴细胞上表达的TR4多肽，使用本发明所述和本领域已知的其它方法进行。作为表位的片段可以通过任何常规方式产生(见例如Houghten，美国科学院院报82：5131-5135(1985)，另外见于美国专利No.4,631,211)。鉴别的本发明抗体的表位可例如用作疫苗候选物，即免疫一个个体以激发抗天然发生形式的TR4多肽的抗体。
抗体的诊断性应用
特异性结合TR4多肽的本发明标记的抗体(包括包含抗体片段或其变体组成的分子)，可以用于诊断目的以检测，诊断或监测疾病和/或功能失调。在特异的实施方案中，免疫特异性结合TR4多肽的本发明标记的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，可以用于诊断目的以检测，诊断，预测或监测与TR4异常表达和/或活性相关的疾病和/或功能失调。
本发明提供了检测TR4多肽表达的方法，包括：(a)使用免疫特异性结合TR4多肽的一或多种本发明抗体，分析来自个体的生物样品中TR4多肽的表达；(b)将生物学样品中TR4多肽的表达水平与TR4多肽标准水平(例如正常生物样品中的表达水平)进行对比。
本发明提供了检测TR4多肽异常表达的方法，包括：(a)使用免疫特异性结合TR4多肽的一或多种本发明抗体，分析来自个体的生物样品中TR4多肽的表达；(b)将生物学样品中TR4多肽的表达水平与TR4多肽标准水平(例如正常生物样品中的表达水平)进行对比，从而分析的TR4多肽水平与标准TR4多肽水平相比提高或降低，表明异常表达。
“生物样品”是指得自个体，体液，机体组织，机体细胞，细胞系，组织培养物，或含有TR4多肽蛋白或mRNA的其它源料的任何液体和/或细胞。体液包括但非限于血清，血浆，尿液，滑液，脑脊液，唾液和粘液。组织样品实际上可以取自机体的任何组织。组织样品还可以得自尸检。本领域熟知从哺乳动物中获得活检组织和体液的方法。在所述生物样品包括mRNA的情况中，活检组织是优选的源料。
特异性结合TR4多肽的本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体组成的分子)，可以用于诊断目的以检测，诊断，预测或监测癌症或过度增殖性病变和/或与其相关的疾病或状态。本发明提供了检测TR4多肽异常表达的方法，包括：(a)使用免疫特异性结合TR4多肽的一或多种本发明抗体，分析来自个体的生物样品中TR4多肽的表达；(b)将TR4多肽水平与TR4多肽标准水平(例如正常生物样品中)进行对比，从而分析的TR4多肽水平与标准TR4多肽水平相比提高或降低，表示存在癌症和/或过度增殖性病变。
TRAIL已经示出在一些情况中选择性杀死肿瘤细胞(见例如致癌基因19：3363-71(2000))。这也许是TRAIL受体在正常细胞和癌细胞上的表达不同所致。因此，在特异性实施方案中，分析的TR4多肽水平提高表明存在癌症和/或过度增殖性病变。
其它报道提示肿瘤细胞表达TR4水平降低也许是肿瘤细胞逃避免疫系统机制(见例如致癌基因杂志16：91725(2000))。因此，在其它特异实施方案中，分析的TR4多肽水平降低表明存在癌症和/或过度增殖性病变。
本发明的一方面是检测及诊断与动物优选哺乳动物更优选人体内TR4多肽异常表达相关的疾病或病变。在一个实施方案中诊断包括：a)为对象施用(例如非肠道，皮下或腹膜内施用)有效量的免疫特异性结合TR4多肽的本发明标记的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)；b)施用后等待一段时间，使标记的抗体优先在所述对象的TR4多肽表达部位浓缩(并将未结合的标记的分子从背景水平中清除)；c)确定背景水平；及d)检测所述对象中标记的抗体，这样检测的标记的抗体或其片段的水平高于背景水平及高于或低于在没有疾病或功能失调的人体内观测到的水平，表明所述对象患有与TR4多肽或TR4多肽受体异常表达相关的疾病或功能失调。背景水平可以通过各种方法确定，包括将检测的标记的分子数量与针对特定系统预先测定的标准值对比而确定。
本领域知晓所述对象的大小和所用的成像系统决定产生诊断性成像需要的成像组分的数量。在放射性同位素的情况下，针对人，注射的放射性物质数量通常为大约5-20毫居里的99Tc。然后所述标记的抗体优先在含有特异蛋白质的细胞特定区域积累。在体内肿瘤成像如S.W.Burchiel等所述，“放射标记的抗体及其片段的免疫药物动力学”(肿瘤成像：癌症的化学检测，第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，Masson出版公司(1982)。
根据一些变量，包括所用标记的类型和施用模式，施用后间隔一段时间以便标记的分子优先在对象的特定部位积累，并将未结合的标记分子从背景中清除，所述间隔为6-48小时，或6-24小时或6-12小时。在另一个实施方案中，施用后的时间间隔为5-20天或5-10天。
在一个实施方案中，监测疾病或功能失调是通过重复诊断疾病和功能失调的方法进行的，例如在初次诊断一个月后，六个月后，一年后等进行监测。
标记分子的存在可以通过在患者体内用本领域已知的体内筛选方法检测。这些方法依赖于所用标记的类型。技术人员能确定检测特殊标记的合适方法。可以用于本发明诊断方法中的方法和设备包括但非限于计算机X线断层摄影(CT)，整体扫描如正电子发射X线断层摄影(PET)，磁共振成像(MRI)，及超声。
在特异的实施方案中，所述分子是用放射性同位素标记的，并使用辐射应答外科设备在患者体内检测(Thurston等，美国专利No.5,441,050)。在另一个实施方案中，所述分子是用一种荧光化合物标记的，并用荧光应答扫描设备在患者体内检测。在另一个实施方案中，所述分子是用一种发射正电子的金属标记的，并用正电子发射X线断层摄影在患者体内检测。在另一个实施方案中，所述分子是用一种顺磁性标记标记的，并用磁共振成像(MRI)在患者体内检测。
抗体的治疗应用
免疫特异性结合TR4多肽的本发明的一或多种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，可以作为治疗剂局部或系统用于机体中。本发明进一步涉及基于抗体的治疗方法，包括将本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)施用于动物，优选哺乳动物，最优选人类患者，以预防或治疗一或多种所述疾病，病变或状态。本发明的治疗化合物包括但非限于本发明的抗体及编码本发明抗体(及抗独特型抗体)的核酸。在一个实施方案中，本发明的抗体可以用于治疗，缓解或预防疾病，功能失调或病变，包括但非限于本文所述的任一种或多种疾病，功能失调或病变。所述疾病，功能失调或病变的治疗和/或预防，包括但非限于改善与那些疾病相关的综合征。本发明的抗体可以在如本领域已知的或本发明所述的药物适当组合物中提供。在买鞋实施方案中，在以下实施例中详细描述的本发明抗体的性质，使所述抗体与先前所述的TR4结合抗体相比，成为更好的治疗剂。
抗体在治疗癌症中的应用
在特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗或改善癌症。在特异的实施方案中，本发明的抗体用于移植癌症及其它相关病变的进展或转移。癌症及其它相关疾病包括但非限于结肠癌，宫颈癌，白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞性白血病，早幼粒细胞性白血病，髓单核细胞性白血病，单核细胞性白血病及红白血病))及慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)性白血病和慢性淋巴细胞性白血病))，真性红细胞增多，淋巴瘤(例如Hodgkin’s病或非Hodgkin’s病)，多发性骨髓瘤，Waldenstrom’s巨球蛋白血症，重链病变，及固体肿瘤包括但非限于肉瘤和癌如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨源性肉瘤，脊索癌，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴肉瘤，淋巴内皮肉瘤，滑膜肉瘤，间皮瘤，Ewing′s肿瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状上皮细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳突癌，乳突腺癌，囊腺癌，骨髓癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚癌，Wilms′肿瘤，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮细胞癌，神经胶质瘤，星细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室鼓膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，蜗神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑膜瘤，黑素瘤，成神经细胞瘤，和眼癌。
在特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善肾癌。
在特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善黑素瘤。
在特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善肝癌如肝细胞癌。
在特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善中枢神经系统癌如成神经管细胞瘤，成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤。
根据本发明已经证实TRAIL受体TR4在肺癌组织，膀胱癌组织和卵巢癌组织上的表达。另外，根据本发明已经证实TRAIL受体TR4在原始乳腺癌，结肠癌，肺癌和胃癌组织上表达(见实施例9)。因此，在特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗肺癌。在另外的特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗膀胱癌。在另外的特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗卵巢癌。在另外的特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗乳腺癌。在另外的特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗结肠癌或结肠直肠癌。在另外的特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗胃癌。
在其它特别优选的实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善肾癌，黑素瘤，胰腺癌及肝癌如肝细胞瘤。
在另一个实施方案中，结合TR4并刺激TR4表达细胞编程性死亡的本发明抗体用于治疗与细胞存活力提高或细胞编程性死亡抑制相关的疾病和/或病变，包括癌症(如滤泡淋巴瘤，p53突变癌，激素依赖性肿瘤，包括但非限于结肠癌，心肌瘤，胰腺癌，黑素瘤，成视网膜细胞瘤，成胶质细胞瘤，肺癌，肠癌，睾丸癌，胃癌，成神经细胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，内皮瘤，成骨细胞瘤，破骨细胞瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，Kaposi’s肉瘤和卵巢癌)；自身免疫系统病变(如多发性硬化，Sjogren’s综合征，Hashimoto’s甲状腺炎，胆囊硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多肌炎，系统性红斑狼疮及免疫相关的肾小球肾炎，风湿性关节炎)，及病毒感染(如疱疹病毒，痘病毒和腺病毒)，移植物抗宿主病变，急性移植物排斥及慢性移植物排斥。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物用于抑制癌症的生长，进展和/或转移，特别是上述那些疾病。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物在体外或体内均是非肝毒性的。
抗体的其它治疗性应用
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制TR4表达细胞生长或杀死其的方法和组合物，包括为其中需要抑制TR4表达细胞生长或杀死TR4表达细胞的动物施用有效抑制TR4表达细胞生长或杀死TR4表达细胞的数量的本发明抗体或抗体组合物(例如抗体片段和变体，抗体混合物，抗体多聚物，融合蛋白，及抗体与其它治疗化合物如化疗剂的组合)。
一方面，本发明涉及一种增强通过TNF家族配体(尤其是TRAIL(SEQ ID NO：66))诱导的细胞编程性死亡的方法，包括为表达TR4多肽的细胞施用有效量的本发明抗体，优选能诱导或提高TR4介导的信号化的一种兴奋的抗TR4抗体。优选地，TR4介导的信号化通过本发明抗体诱导或提高，以治疗其中表现为细胞编程性死亡降低或者细胞因子和粘着分子表达降低的疾病。
另一方面，本发明涉及一种抑制通过TNF家族配体(尤其是TRAIL(SEQ ID NO：66))诱导的细胞编程性死亡的方法，包括为表达TR4多肽的细胞施用有效量的本发明抗体，优选能降低TR4介导的信号化的一种拮抗的抗TR4抗体。优选地，降低TR4介导的信号化以治疗其中表现为细胞编程性死亡或NFκB表达增加或者细胞因子和粘着分子表达降低的疾病。
TR4“激动剂”是指能增强或加强TRAIL受体介导的细胞编程性死亡的天然发生的及合成的化合物。“TR4”拮抗剂是指能抑制TRAIL受体介导的细胞编程性死亡的天然发生的及合成的化合物。本发明的任何候选“激动剂”或“拮抗剂”是否能分别增强或抑制细胞编程性死亡可以使用本领域已知的TNF家族配体/受体细胞应答分析而确定，包括在以下详细描述的那些方法。
本发明的抗体可以用于治疗，改善或预防与TR4或TR4配体异常表达和/或活性相关的疾病，病变或状态，包括但非限于在此所述那些嫁接，病变或状态。对与与TR4或TR4配体异常表达和/或活性相关的疾病，病变或状态的治疗和/或预防包括但非限于减轻与那些嫁接，病变或状态相关的症状。本发明的抗体可以以药物合适的组合物形式提供，如本领域已知或如本发明所述。
另外，激活TRAIL受体介导的生物学活性(例如在TRAIL受体表达细胞中诱导细胞编程性死亡)的本发明抗体(包括包含或幼抗体片段或变体组成的分子)，可以使用于动物以治疗，预防或改善在此所述疾病或病变，特别是癌症及其它过度增殖性病变。这些抗体可以加强或激活TRAIL受体的所有生物学活性或一个亚型，例如通过诱导TRAIL受体构象变化而进行。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体施用于动物以治疗，预防或改善疾病或病变，所述抗体使TR4活性在无所述抗体基础上提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。在另一个实施方案中，将本发明的抗体组合，抗体片段组合，抗体变体组合，或抗体，抗体片段和/或抗体变体的组合施用于动物以治疗，预防或改善疾病或病变，所述组合使TR4活性在无所述抗体或抗体片段或抗体变体基础上提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。
另外，激活TRAIL受体介导的生物学活性(例如在TRAIL受体表达细胞中诱导细胞编程性死亡)的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，可以使用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达，或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变。这些抗体可以加强或激活TRAIL受体的所有生物学活性或一个亚型，例如通过诱导TRAIL受体构象变化而进行。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达，或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变，所述抗体使TR4活性在无所述抗体基础上提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体组合，抗体片段组合，抗体变体组合，或抗体，抗体片段和/或抗体变体的组合施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达，或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变，所述组合使TR4活性在无所述抗体或抗体片段和/或抗体变体基础上提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。
作为TRAIL受体优选TR4信号转导的激动剂或拮抗剂的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变。例如，全部或部分模拟TRAIL与TR4结合作用的本发明抗体，TR4激动剂，可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变。再例如，阻断或阻止TR4与其配体之间相互作用或者抑制，降低或阻止通过TR4的信号转导的本发明抗体，可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变。不阻止TR4与其配体结合但抑制或负调节TR4信号转导的本发明抗体，可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变。本发明抗体增强，抑制，正调节或负调节TR4信号转导的能力，可以通过在此所述方法或本领域已知的其它方法确定。例如TRAIL诱导的受体激活和信号分子的激活可以通过免疫沉淀随后进行Western印迹分析，检测衔接蛋白如FADD和TRADD与TR4的关系而确定(例如本发明所述)。
另外，激活TRAIL受体介导的生物学活性(例如在TRAIL受体表达细胞中诱导细胞编程性死亡)的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，可以使用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达，或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变。这些抗体可以加强或激活TRAIL受体的所有生物学活性或一个亚型，例如通过诱导TRAIL受体构象变化而进行。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达，或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变，所述抗体使TR4活性在无所述抗体基础上提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。在另一个实施方案中，本发明的抗体组合，抗体片段组合，抗体变体组合，或抗体，抗体片段和/或抗体变体的组合施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，缺乏TR4功能，TR4配体异常表达，或缺乏TR4配体功能相关的疾病或病变，所述组合使TR4活性在无所述抗体或抗体片段和/或抗体变体基础上提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。
在一个特异的实施方案中，全部或部分抑制或负调节TR4活性(例如刺激细胞编程性死亡)的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，过度TR4功能，TR4配体异常表达，或过度TR4配体功能相关的疾病或病变，所述抗体使TR4活性在无所述抗体基础上抑制或负调节至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％或至少10％。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体组合，抗体片段组合，抗体变体组合，或抗体，抗体片段和/或抗体变体的组合施用于动物以治疗，预防或改善与TR4异常表达，过度TR4功能，TR4配体异常表达，或过度TR4配体功能相关的疾病或病变，所述组合使TR4活性在无所述抗体，抗体片段和/或抗体变体基础上抑制或负调节至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％或至少10％。
在一个实施方案中，本发明的治疗或药物组合物施用于动物，以治疗，预防或改善与细胞编程性死亡增加相关的疾病或病变，包括但非限于AIDS，神经变性疾病(如阿耳茨海默病，Parkinson；s病，肌萎缩性脊髓侧索硬化，色素性视网膜炎，小脑退化)，脊髓发育不良综合征(如障碍性贫血)，缺血性损伤(如由心梗，休克和再灌注导致的损伤)，毒素导致的肝脏病变(如由乙醇导致的)，脓毒性休克，恶液质，厌食。在另一个实施方案中，将本发明的治疗或药物组合物施用于动物以治疗，预防或改善骨髓病变，例如再生障碍性贫血和脊髓发育不良综合征。
还可以施用本发明的治疗或药物组合物治疗，预防或改善器官排斥或移植物抗宿主疾病(GVHD)和/或与之相关的状况。由宿主免疫细胞通过免疫应答破坏移植的组织发生器官排斥。相似地，免疫应答还包含在GVHD中，但在这种情况中，外源移植的免疫细胞破坏宿主组织。由免疫细胞效应功能诱导的细胞死亡是细胞编程性死亡。因此，施用抑制免疫应答的本发明抗体(例如抑制细胞编程性死亡的那些抗体)，在预防器官排斥或GVHD中可以是一种有效疗法。
在另一个实施方案中，将本发明的治疗或药物组合物施用于动物，以治疗，预防或改善感染性疾病。感染性疾病包括与酵母，真菌，病毒和细菌感染相关的疾病。可以根据本发明治疗或预防的，导致病毒感染的病毒包括但非限于逆转录病毒(例如I型和II型人T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV)和人免疫缺陷病毒(HIV))，疱疹病毒(例如I型和II型单纯疱疹病毒(HSV)，Epstein-Barr病毒，HHV6-HHV8，和细胞巨化病毒)，沙粒病毒(例如拉沙热病毒)，副粘病毒(例如麻疹病毒，人呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒，和肺病毒)，腺病毒，布尼奥罗病毒(例如汉坦病毒)，cornaviruses，线状病毒(例如Ebola病毒)，黄病毒(例如丙肝病毒(HCV)，黄热病病毒，和日本脑炎病毒)，嗜肝DNA病毒(例如乙肝病毒(HBV))，正粘病毒(例如流感病毒A，B和C)，乳多空病毒(例如乳头瘤病毒)，小核糖核酸病毒(例如鼻病毒，肠道病毒和甲肝病毒)，痘病毒，呼肠弧病毒(例如轮状病毒)，外衣病毒(例如风疹病毒)，棒状病毒(例如狂犬病毒)。导致细菌感染的微生物病原包括但非限于化脓性链球菌，肺炎链球菌，淋病奈瑟球菌，脑膜炎奈瑟球菌，白喉杆菌，肉毒梭菌，产气荚膜梭菌，破伤风杆菌，流感嗜血杆菌，肺炎克氏杆菌，出臭鼻肺炎克氏杆菌，鼻硬结克氏杆菌，金黄色葡萄球菌，霍乱弧菌，大肠杆菌，铜绿菌素假单胞杆菌，胎儿弯曲菌(弧菌)，空肠弯曲菌，亲水性气单胞菌，Bacillus cereus，Edwardsiella tarda，小肠结肠杆菌，鼠疫杆菌，假结核杆菌，志贺痢疾杆菌，Shigella flexneri，宋内志贺菌，鼠伤寒杆菌，梅毒密螺旋体，Treponema pertenue，Treponema carateneum，Borrelia vincentii，Borreliaburgdorferi，Leptospira icterohemorrhagiae，结核分支杆菌，Toxoplasmagondii，Pneumocystis carinii，Francisella tularensis，Brucella abortus，Brucella suis，Brucella melitensis，Mycoplasma spp.，Rickettsiaprowazeki，Rickettsia tsutsugumushi，Chlamydia spp.，和幽门螺旋菌。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物用于治疗，预防或改善与细胞编程性死亡相关的疾病，包括但非限于AIDS，神经变性(如阿耳茨海默病，帕金森病，肌萎缩性脊髓侧索硬化，色素性视网膜炎，小脑退化，脑肿瘤或朊病毒相关疾病)；自身免疫系统疾病(如多发性硬化，风湿性关节炎，Sjogren’s综合征，Hashimoto’s甲状腺炎，胆囊硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多肌炎，系统性红斑狼疮及免疫相关的肾小球肾炎和风湿性关节炎)，脊髓发育不良综合征(如障碍性贫血)，移植物抗宿主病，缺血性损伤(如由心梗，休克和再灌注导致的损伤)，肝脏损伤(如肝脏损伤相关的肝炎，缺血/再灌注损伤，胆固醇沉着病(胆管损伤)和肝癌)；毒素诱导的肝脏病变(如乙醇所致)，脓毒性休克，恶液质，厌食。在优选的实施方案中，抗TR4拮抗性抗体阻止TRAIL结合抗体结合的TRAIL受体，但不转导产生细胞编程性死亡的生物信号，可用于治疗上述疾病和病变。
许多与HIV相关的病理学是由细胞编程性死亡介导的，包括HIV诱导的肾病及HIV脑炎。因此，在另外的优选实施方案中，本发明的抗体优选拮抗性抗TR4抗体，用于治疗AIDS及与AIDS相关的病变。本发明的另一个实施方案涉及本发明抗体在HIV感染的患者中降低TRAIL介导的T细胞死亡中的应用。
在另外的实施方案中，本发明的抗体尤其拮抗性抗TR4抗体，与T细胞编程性死亡的其它抑制剂组合施用。例如，Fas介导的细胞编程性死亡包含于HIV个体的T细胞丧失中(Katsikis等，实验医学杂志181：2029-2036，1995)。因此，对Fas配体介导的和TRAIL介导的T细胞死亡均敏感的患者，可以既可用阻断TRAIL/TR4相互作用的制剂治疗，也可以用阻断Fas配体/Fas相互作用的制剂治疗。阻断Fas配体与Fas结合的合适制剂包括但非限于可溶的Fas多肽；可溶的Fas多肽的多聚体形式(例如sFas/Fc的二聚体)；结合Fas但不转导引起细胞编程性死亡的生物信号的抗Fas抗体；阻断Fas配体结合Fas的抗Fas配体抗体；及结合Fas但不转导引起细胞编程性死亡的生物信号的Fas配体突变蛋白。优选地，根据这种方法应用的抗体是单克隆抗体。阻断Fas配体/Fas相互作用包括阻断抗Fas单克隆抗体的合适制剂，例如国际申请出版物WO95/10540所描述，在此并入参考。
可以与本发明抗体组合施用的也阻断TRAIL与TR4结合的合适制剂，包括但非限于可溶的TR4多肽(例如可溶形式的OPG，TR5(国际申请出版物WO98/30693)；可溶形式的TR4(国际出版物WO98/32856)；TR7/DR5(国际申请出版物WO98/41629)；及TR10(国际申请出版物WO98/54202))；多聚体形式的可溶TR4多肽；及结合TR4但不转导引起细胞编程性死亡的生物信号的TR4抗体，阻断TRAIL与一或多个TRAIL受体结合的抗TRAIL抗体，结合TRAIL受体但不转导引起细胞编程性死亡的生物信号的TRAIL的突变蛋白。
在异源移植的排斥中，受体动物的免疫系统未预先引发应答，因为免疫系统大部分只由环境抗原引发。来自相同物种其它成员的组织未以例如病毒和细菌呈递的相同方式呈递。在异源移植排斥情况中，设计免疫抑制方案以预防免疫系统达到起效应状态。然而，异种移植排斥的免疫情况比异源移植更类似于疾病复发。在疾病复发的情况中，免疫系统已经激活，由天然islet细胞破坏而证实。因此，在疾病复发情况中，免疫系统已经处于效应状态。本发明的抗体(例如本发明的兴奋性抗体)能抑制对异源移植和异种移植的免疫应答，因为淋巴细胞的激活及分化为效应细胞将表达TR4多肽，从而对增强细胞编程性死亡的化合物敏感。因此，本发明还提供了一种产生具有免疫特权的组织。本发明的拮抗剂进一步可用于治疗炎症性肠道疾病。
本发明的抗体组合物可用于治疗炎症性疾病，如风湿性关节炎，骨关节炎，银屑病，败血病及炎症性肠道疾病。
另外，由于TR4多肽的原淋巴细胞表达，因此本发明的抗体和抗体组合物可用于治疗这种形式的癌症。另外，本发明的抗体和抗体组合物可用于治疗各种慢性和急性形式的炎症，如风湿性关节炎，骨关节炎，银屑病，败血病和炎症性肠道疾病。
在一个实施方案洪灾，本发明的抗体和抗体组合物可用于治疗心血管病变，包括周围动脉疾病如肢体缺血。
心血管疾病包括心血管畸形，如动脉-动脉瘘，动脉-静脉瘘，脑动静脉畸形，先天性心脏病，肺动脉闭锁及Scimitar综合征。先天性心脏病包括主动脉缩窄，心triatriatum，冠状动脉异常，十字形心，右位心，动脉导管未闭，Ebstein’s异常(三尖瓣畸形)，Eisenmenger复合征(室间隔缺损)，左心发育不全综合征，左位心，法乐四联症，大血管错位，右心室双出口，三尖瓣闭锁，持续躯干动脉骨化，及心间隔缺损如主动脉与肺动脉间隔缺损，心内膜垫缺损，Lutembacher’s综合征，法乐三联症，心室间隔缺损。
心血管病变还包括心脏病，如心律不齐，类癌瘤心脏病，高心输出量，低心输出量，心包填塞，心内膜炎(包括细菌性)，心动脉瘤，心搏停止，充血性心衰，充血性心肌病，发作性呼吸困难，心源性水肿，心肌肥大，左心室肥大，右心室肥大，心肌梗塞后破裂，心室间隔破裂，心瓣膜病，心肌病，心肌缺血，心包积液，心包炎(包括缩窄性心包炎和结核性心包炎)，心包积气，心包切开术后综合征，肺心病，风湿性心脏病，心室机能不良，充血，妊娠心血管复合征，Scimitar综合征，梅毒心血管疾病，结核性心血管疾病。
心律不齐包括窦性心律不齐，房性纤颤，房颤，心动过缓，期前收缩，Adams-Stokes综合征，束支传导阻滞，窦房结阻滞，QT延长综合征，心平行收缩，Lown-Ganong-Levine综合征，Mahaim型预激综合征，Wolff-Parkinson-White综合征，病窦综合征，心动过速，及心室纤颤。心动过速包括阵发性心动过速，室上性心动过速，心室自身节律加速，房室结再活动心动过速，异位房性心动过速，异位房室交界处心动过速，窦房结再活动心动过速，窦性心动过速，Torsades dePointes及室性心动过速。
心瓣膜病包括主动脉瓣关闭不全，主动脉瓣狭窄，心脏杂音，主动脉瓣脱垂，二尖瓣脱垂，三尖瓣脱垂，二尖瓣关闭不全，二尖瓣狭窄，肺动脉闭锁，肺动脉瓣关闭不全，肺动脉瓣狭窄，三尖瓣闭锁，三尖瓣关闭不全及三尖瓣狭窄。
心肌病包括乙醇性心肌病变，充血性心肌病变，肥大性心肌病变，主动脉瓣下狭窄，肺动脉瓣下狭窄，限制性心肌病变，Chagas心肌病变，心内膜纤维弹性组织增生，心肌内膜纤维化，Kearns综合征，心肌再灌注损伤，及心肌炎。
心肌缺血包括冠心病如心绞痛，冠状动脉瘤，冠状动脉硬化，冠状动脉血栓形成，冠状动脉痉挛，心肌梗塞及心肌性眩晕。
心血管疾病还包括血管疾病如动脉瘤，血管发育异常，多发性血管瘤，杆状血管瘤，Hippel-Lindau病，Klippel-Trenaunay-Weber综合征，血管神经性水肿，主动脉病变，Takayasu’s主动脉炎，Leriche’s综合征，动脉闭塞疾病，动脉炎，动脉内膜炎，多动脉炎结节，脑血管疾病，糖尿病血管病变，糖尿病视网膜病变，栓塞，血栓形成，红斑性肢痛病，痔，肝静脉闭塞疾病，高血压，低血压，局部缺血，周围血管疾病，静脉炎，肺疾病闭塞疾病，Raynaud’s疾病，CREST综合征，视网膜血管闭塞，Scimitar综合征，上腔静脉综合征，毛细血管扩张症，共济失调性毛细血管扩张症，遗传性出血性毛细血管扩张症，精索静脉曲张，静脉曲张，静脉曲张溃疡，脉管炎及静脉闭锁不全。
动脉瘤包括分割性动脉瘤，疑似动脉瘤，感染性动脉瘤，破裂的动脉瘤，主动脉瘤，脑动脉瘤，冠状动脉瘤，心动脉瘤和髂动脉瘤。
动脉闭塞疾病包括动脉硬化，间歇性跛行，颈动脉狭窄，纤维肌性发育不良，肠系膜血管闭塞，Moyamoya疾病，肾动脉阻塞，及血栓闭塞性脉管炎。
脑血管病变包括颈动脉系疾病，脑血管淀粉样病变，脑动脉瘤，脑缺氧，脑动脉硬化，脑动静脉畸形，脑动脉疾病，脑梗塞及脑血栓形成，颈动脉血栓形成，窦血栓形成，Wallenberg’s综合征，脑出血，硬膜外血肿，硬膜下血肿，蛛网膜下隙血肿，脑梗塞，脑缺血(包括瞬时脑缺血)，锁骨下动脉改道，脑室周围leukomalacia，血管性头痛，多发头痛，偏头痛，及椎基底动脉发育不良。
栓塞包括气体栓塞，羊水栓塞，胆固醇栓塞，蓝趾综合征，脂肪栓塞，肺栓塞及血栓性静脉炎。
局部缺血包括脑缺血，缺血性结肠炎，腔隙综合征，前腔隙综合征，心肌缺血，再灌注损伤及周围肢体缺血。脉管炎包括主动脉炎，动脉炎，Behcet’s综合征，Churg-Strauss综合征，粘膜皮肤淋巴结综合征，血栓闭塞性脉管炎，过敏性脉管炎，Schoenlein-Henoch紫癜，过敏性皮肤脉管炎及Wegener’s肉芽肿病。
在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物用于治疗血栓形成性微血管病变。一个这种病变是血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)(Kwaan，H.C.，Semin.Hematol.24：71(1987)；Thompson等，血液80：1890(1992))。TTP相关的死亡率增加已经由美国疾病控制中心报道(Torok等，Am.J.Hematol.50：84(1995))。来自患有TTP患者(包括HIV+和HIV-患者)的血浆，诱导人皮肤微血管起源而非大血管起源的内皮细胞编程性死亡(Laurence等，血液87：3245(1996))。TTP患者的血浆因此认为含有一或多种直接或间接应答细胞编程性死亡的因子。如国际专利申请书WO97/01715所述(在此全文并入参考)，TRAIL存在于TTP患者血清中，而且很可能在诱导微血管内皮细胞编程性死亡中起作用。另一种血栓形成性微血管病变是溶血性尿毒症综合征(HUS)(Moake，J.L.，Lancet，343：393(1994))；Melnyk等，(Arch.Intern.Med.155：2077(1995)；Thompson等，如前)。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明抗体和抗体组合物在治疗通常称为“成人HUS”的病变(尽管其也可以侵犯儿童)中的应用。称为儿童腹泻相关的HUS与成人HUS在病因学方面不同。在另一个实施方案中，特征在于小血管血栓的状况可以用本发明的抗体和抗体组合物治疗。这种状况包括但非限于在此所述那些病变。例如，在大约5-10％小儿AIDS患者中可见的心脏问题确信包含小血管血栓。在多发性硬化患者中已经报道心脏中微血管破坏。再例如，本发明抗体和抗体组合物预期可以治疗系统性红斑狼疮(SLE)。在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物，优选本发明的拮抗性抗TR4抗体，可以在体内施用于患有血栓形成性微血管病变的患者。因此，本发明提供了治疗血栓形成性微血管病变的一种方法，包括应用有效量的本发明抗体或抗体组合物。
本发明抗体和抗体组合物可以与治疗特殊病变的其它制剂组合应用。例如，在由Laurence等(血液87：3245(1996))报道的体外研究中，通过使用抗Fas阻断抗体，金精三羧酸或减少冷沉物的正常血浆，可以实现TTP血浆介导的微血管内皮细胞编程性死亡降低。因此，患者可以用本发明抗体或抗体组合物组合移植Fas配体介导的内皮细胞编程性死亡的制剂进行治疗，所述制剂如上述那些制剂。在一个实施方案中，将本发明的抗体和抗Fas阻断抗体均施用于患有特征在于血栓形成性微血管病变的患者，如TTP或HUS。抗Fas抗原的阻断单克隆抗体(CD95)例如国际专利申请出版物WO95/10540所述，在此并入参考。
在血管发生的内源性刺激因子和抑制因子之间天然出现的平衡是其中抑制影响占优势的平衡(Rastinejad等，细胞56：345-355(1989))。在其中新血管化在正常生理条件下出现的那些极少情况中，如伤口愈合，器官再生，胚胎发育及雌性生殖过程中，血管发生是严密调节的并受时间和空间限制。在病理性血管发生的情况下，如固体肿瘤生长，这些调节控制失败。未调节的血管发生称为病理性的并持续进展为许多肿瘤转化性或非肿瘤转化性疾病。许多严重的疾病显现为异常新血管化，包括固体肿瘤生长和转移，关节炎，一些类型的眼部病变，及银屑病。见例如Moses等，生物技术9：710-714(1991)；Folkman等，新英格兰医学杂志353：1757-1771(1995)；Auerbach等，微血管研究杂志29：401-411(1985)；Folkman，癌症研究进展，Klein和Weinhouse编辑，学术出版社，纽约，pp175-203(1985)；Patz，Am.J.Opthalmol 94：715-743(1982)；及Folkman等，科学221：719-725(1983)。在许多病理学状况中，血管发生的过程决定了疾病状态。例如，已经积累了许多有意义的数据提示固体肿瘤的生长依赖于血管发生。Folkman和Klagsbrun，科学235：442-447(1987)。
本发明提供了治疗与新血管化相关的疾病或病变的方法，通过施用本发明的抗体或抗体组合物而进行。可以用本发明多核苷酸和多肽治疗的恶性肿瘤和癌转移包括但非限于那些恶性肿瘤，固体肿瘤及本发明所述癌症及本领域已知的其它癌症(这种病变见Fishman等，医学，第2版，J.B.Lippincott公司，Philadelphia(1985))。
另外，可以用本发明抗体或抗体组合物治疗的与新血管化相关的眼部病变包括但非限于：新血管化青光眼，糖尿病视网膜病，成视网膜细胞瘤，晶状体后纤维组织形成，眼色素层炎，早熟黄斑变性视网膜病变，酵母移植新血管化，以及其它眼部炎症疾病，眼部肿瘤及与脉络膜或虹膜新血管化血管的疾病。见例如Waltman等，Am.J.Opthalmol85：704-710(1978)，及Gartner等，Surv.Ophthal 22.291-312(1978)所述。
另外，可以用本发明抗体或抗体组合物治疗的病变包括但非限于血管瘤，关节炎，银屑病，血管纤维瘤，动脉粥样硬化斑，伤口愈合延迟，肉芽发生，血友病性关节，肥大性瘢痕，骨不连骨折，Osler-Weber综合征，化脓性肉芽肿，硬皮病，沙眼，及血管粘连。
本发明的抗体和抗体组合物用于许多疾病和/或病变的诊断和治疗或预防。这种疾病和病变包括但非限于癌症(例如免疫细胞相关的癌症，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，滤泡淋巴瘤，与p53突变或改变相关的癌症，脑肿瘤，膀胱癌，子宫子宫颈癌，结肠癌，结肠直肠癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，胃癌等)，淋巴增殖性病变(例如淋巴结病，微生物(例如病毒，细菌等)感染(例如HIV-1感染，HIV-2感染，疱疹病毒感染(包括但非限于HSV-1，HSV-2，CMV，VZV，HHV-6，HHV-7，EBV)，腺病毒感染，痘病毒感染，人乳头瘤病毒感染，肝炎感染(例如HAV，HBV，HCV等)，Helicobacter pylori感染，侵染性Staphylococcia等感染)，寄生虫感染，肾炎，骨疾病(例如骨质疏松)，动脉粥样硬化，疼痛，心血管病变(例如新血管化，血管化减少或循环血量减少(例如缺血性疾病(例如心肌损伤，休克等)))，AIDS，过敏反应，炎症，神经变性疾病(例如阿耳茨海默病，帕金森病，肌萎缩性脊髓侧索硬化，色素层性视网膜炎，小脑退化)，移植排斥(急性和慢性)，移植物抗宿主病，由于骨髓发育不良所致疾病(例如再生障碍性贫血等)，风湿病中关节组织破坏，肝脏疾病(例如急性和慢性肝炎，肝脏损伤和肝硬化)，自身免疫疾病(例如多发性硬化，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)，免疫复合物肾小球肾炎，自身免疫性糖尿病，自身免疫性血小板减少性紫癜，Grave’s疾病，Hashimoto’s甲状腺炎等)，心肌病(例如扩张性心肌病)，糖尿病，糖尿病并发症(例如糖尿病肾病，糖尿病神经病变，糖尿病视网膜病变)，流感，哮喘，银屑病，肾小球肾炎，败血病休克及溃疡性结肠炎。
本发明的抗体和抗体组合物用于促进血管发生，伤口愈合(例如创伤，烧伤和骨折)中有效。
本发明的抗体和抗体组合物也用作增强对特异抗原免疫应答的佐剂，如抗病毒免疫应答。
更一般地，本发明的抗体和抗体组合物用于调节(即增强或降低)免疫应答。例如，本发明的抗体和抗体组合物可用于预备或从手术，外伤，放疗，化疗和移植中恢复，或者可用于加强免疫应答和/或在老年人和无免疫应答的个体中恢复应答。或者，本发明的抗体或抗体组合物用作免疫抑制剂，例如在治疗或预防自身免疫疾病中。在特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物用于治疗或预防慢性炎症，过敏性或自身免疫性病变，如在此所述那些及本领域已知的其它病变。
治疗/预防组合物及施用
本发明通过为对象施用有效量的本发明抗体(或其片段或变体)或药物组合物，优选本发明抗体，提供了治疗，抑制和预防方法。在优选的一方面，抗体或其片段或变体是基本纯化的(即基本上没有限制其作用或产生非所需副作用的物质)。所述对象优选是动物，包括但非限于如牛，猪，马，鸡，猫，狗，优选是哺乳动物，最优选是人。
当所述化合物包含一种核酸或免疫球蛋白时可以应用的配方和施用方法如上述；其它合适的配方和施用途径可以选自以下所述那些。
本领域已知许多输送系统并可以用于施用本发明抗体或其片段或变体，例如在脂质体中形成胶囊，微颗粒，微囊，能表达抗体或抗体片段的重组细胞，受体介导的胞吞(见例如Wu和Wu等，生物化学杂志262：4429-4432(1987))，构建核酸作为逆转录病毒或其它病毒载体的一部分等。导入方法包括但非限于皮内，肌内，腹膜内，静脉内，皮下，鼻内，硬脑膜外及口服途径。所述组合物可以通过任何常规途径施用，例如通过灌注或丸剂注射，通过上皮或皮肤粘膜分界线吸收(例如口腔粘膜，直肠和小肠粘膜等)，并可以与其它生物活性剂一起施用。可以是系统或局部施用。另外，也许需要将本发明的药物组合物通过任何适当的途径导入中枢神经系统，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可以通过心室内导管而便于进行，例如所述导管附于一个储存库如Ommaya储存库上。也可以应用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，及用雾状制剂配制。
在一个特异的实施方案中，需要将本发明的药物组合物局部施用需要处理的部位；这可以通过例如但非限于以下方式实现：在手术期间局部灌注，局部应用，例如在手术后与伤口敷料一起应用，通过注射，利用导管，利用栓剂，或者利用移植体，所述移植体是有孔，无孔或凝胶物，包括膜，如sialastic膜或纤维。优选地，当施用一种蛋白质包括本发明抗体时，必须注意施用蛋白质不与其吸附的材料。
在另一个实施方案中，所述组合物可以在载体中输送，特别是在脂质体中(见Langer，科学249：1527-1535(1990)；Treat等，在感染性疾病和癌症治疗中的脂质体，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，纽约，pp353-365(1989)；Lopez-Berestein，如前，pp317-327：见如前)。
在又一个实施方案中，所述组合物可以在控制释放系统中输送。在一个实施方案中，可以使用一个泵(见Langer，如前；Seffon，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，外科学88：507(1980)；Saudek等，新英格兰医学杂志321：574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合物(见控制释放的医学应用，Langer和Wise(编辑)，CRC出版社，Boca Raton，Florida(1974)；控制的药物生物可利用度，药物制品设计和性能，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；Levy等，科学228：190(1985)；During等，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71：105(1989))。在另一个实施方案中，可以将一种控制释放的系统置于接近治疗靶位即脑的附近，这样只需要全身用量的一部分(见例如Goodson，控制释放的医学应用，如前，第2卷pp.115-138(1984))。
其它控制释放系统见于Langer所述(科学249：1527-1533(1990))。
在本发明组合物是一种编码蛋白质的核酸的一个特异实施方案中，所述核酸可以体内施用以促进其编码的蛋白质的表达，通过将其构建为一种适当的核酸表达载体的一部分并施用，以便成为胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体(见美国专利No.4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过将其与已知进入核的一种类同源框肽连接而施用(见例如Joliot等，美国科学院院报88：1864-1868(1991))等。或者，可以通过同源重组将核酸导入胞内并掺入宿主细胞内表达。
本发明还提供了药物组合物。这种组合物包含一种治疗有效量的抗体或其片段，及一种药物适当的载体。在一个特异的实施方案中，术语“药物适当的”是指联邦政府管理机构认可的或美国药典或其它认可的药典力列出的，用于动物尤其人体的那些载体。术语“载体”是指通过其施用治疗剂的一种稀释剂，佐剂，赋形剂或运载体。这种药物可以是无菌液体如水和油，包括那些源于石油，动物，植物或合成源的，如花生油，豆油，矿物油，芝麻油等。当所述药物组合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其针对可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，凝胶，麦芽，米，面粉，石灰，硅胶，硬脂酸钠，甘油一酯，滑石，氯化钠，干燥脱脂奶，甘油，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，本发明的组合物还可以包含微量增湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液，悬浮液，乳化液，片剂，药丸，胶囊，粉末，缓释配方等。所述组合物可以配制为栓剂，用传统的结合剂和载体如甘油三酸酯配制。口服配方可以包括标准载体如药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。适当的药物载体例如见于E.W.Martin“Remington′s药物学”所述。这种组合物含有一种治疗有效量的抗体或其片段，优选是纯化形式，及适量的载体，以为患者提供正确的施用方式。所述配方应适于施用模式。
在一个优选的实施方案中，所述组合物是根据配制静脉内施用于人体的药物组合物的常规方式配制的。典型地，静脉内施用的组合物是于无菌等渗水相缓冲液中的溶液。如果需要，所述组合物还可以包括一种增溶剂和一种局部麻醉剂如lignocamne，以减轻注射部位的疼痛。通常地，配料在单位剂量中是单独或混合一起，例如在密封容器的冻干粉末或无水浓缩物，所述容器如是指示活性剂数量的安瓶或小袋。在所述组合物是通过灌注施用之处，其可以灌注瓶分发，所述灌注瓶中含有无菌药物级水或盐水。在所述组合物是通过注射施用之处，提供一安瓶的注射用水或盐水，以便所述配料可以在施用之前混合。
本发明的组合物可以配制为中性或盐形式。药物适当的盐包括与阴离子形成的盐，包括盐酸盐，磷酸盐，乙酸盐，草酸盐，酒石酸盐等，及与阳离子形成的盐如钠盐，钾盐，铵盐，钙盐，氢氧化铁，异丙胺，三乙胺，2-乙氨乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。
控制释放的医学应用，Langer和Wise(编辑)，CRC出版社，BocaRaton，Florida(1974)；控制的药物生物可利用度，药物制品设计和性能，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rey.Macromol.Chem.23：61(1983)；Levy等，科学228：190(1985)；During等，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71：105(1989))。在另一个实施方案中，可以将一种控制释放的系统置于接近治疗靶位即脑的附近，这样只需要全身用量的一部分(见例如Goodson，控制释放的医学应用，如前，第2卷pp.115-138(1984))。
其它控制释放系统见于Langer所述(科学249：1527-1533(1990))。
在本发明组合物是一种编码蛋白质的核酸的一个特异实施方案中，所述核酸可以体内施用以促进其编码的蛋白质的表达，通过将其构建为一种适当的核酸表达载体的一部分并施用，以便成为胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体(见美国专利No.4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过将其与已知进入核的一种类同源框肽连接而施用(见例如Joliot等，美国科学院院报88：1864-1868(1991))等。或者，可以通过同源重组将核酸导入胞内并掺入宿主细胞内表达。
本发明还提供了药物组合物。这种组合物包含一种治疗有效量抗体或其片段，及一种药物适当的载体。在一个特异的实施方案中，术语“药物适当的”是指联邦政府管理机构认可的或美国药典或其它认可的药典力列出的，用于动物尤其人体的那些载体。术语“载体”是指使用其施用治疗剂的一种稀释剂，佐剂，赋形剂或运载体。这种药物可以是无菌液体如水和油，包括那些源于石油，动物，植物或合成源的，如花生油，豆油，矿物油，芝麻油等。当所述药物组合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其针对可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，凝胶，麦芽，米，面粉，石灰，硅胶，硬脂酸钠，甘油一酯，滑石，氯化钠，干燥脱脂奶，甘油，，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，本发明的组合物还可以包含微量增湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液，悬浮液，乳化液，片剂，药丸，胶囊，粉末，缓释配方等。所述组合物可以配制为栓剂，用传统的结合剂和载体如甘油三酸酯配制。口服配方可以包括标准载体如药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。适当的药物载体例如见于E.W.Martin“Remington′s药物学”所述。这种组合物含有一种治疗有效量的抗体或其片段，优选是纯化形式，及适量的载体，以为患者提供正确的施用方式。所述配方应适于施用模式。
在一个优选的实施方案中，所述组合物是根据配制静脉内施用于乳糖的药物组合物的常规方式配制的。典型地，静脉内施用的组合物是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。如果需要，所述组合物还可以包括一种增溶剂和一种局部麻醉剂如lignocamne，以减轻注射部位的疼痛。通常地，配料在单位剂量中是单独或混合一起，例如在密封容器的冻干粉末或无水浓缩物，所述容器如是指示活性剂数量的安瓶或sachette。在所述组合物是通过灌注施用之处，其可以灌注瓶分发，所述灌注瓶中含有无菌药物级水或盐水。在所述组合物是通过注射施用之处，提供一安瓶的注射用水或盐水，以便所述配料可以在施用之前混合。
本发明的组合物可以配制为中性或盐形式。药物适当的盐包括与阴离子形成的盐，包括盐酸盐，磷酸盐，乙酸盐，草酸盐，酒石酸盐等，及与阳离子形成的盐如钠盐，钾盐，铵盐，钙盐，氢氧化铁，异丙胺，三乙胺，2-乙氨乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。
有效治疗，抑制和预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病或功能失调的本发明组合物的数量，可以通过标准临床方法确定。另外，可任选地应用体外分析以助于鉴别最佳剂量范围。配方中应用的准确剂量还依赖于施用途径，及疾病或病变的程度，而且应根据医生的判断和每个患者的情况确定。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统产生的剂量应答曲线中推断出。
就抗体而言，施用于患者的剂量典型地为0.1mg/kg体重至100mg/kg体重。优选地，施用于患者的剂量在0.1mg/kg和20mg/kg体重之间，更优选在1mg/kg至10mg/kg体重之间。通常地，人抗体在人体内比其它物种抗体的半衰期长，这归因于对外源多肽的免疫应答。因此，使用较低剂量的人抗体和较少的施用频率通常是可能的。另外，本发明的治疗或药物组合物的施用剂量和频率，可以通过增强抗体的吸收和组织渗透力(例如进入脑)而降低，这可以通过对抗体加以修饰例如通过脂化而进行。
通常地，施用与患者相同物种起源或物种反应性(在抗体情况下)的产物是优选的。因此，在一个优选的实施方案中，将人抗体，其片段或变体(例如衍生物)或核酸施用于人类患者以进行治疗或预防。
针对免疫分析及治疗与TR4多核苷酸或多肽包括其片段相关的病变，均优选使用免疫特异性结合TR4的本发明高亲和性和/或强力体内抑制和/或中和抗体，或者免疫特异性结合TR4的多核苷酸编码抗体。这种抗体优选与TR4和/或TR4多肽片段具有亲和性。优选的结合亲和性包括解离常数或KD小于或等于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M或10-5M。更优选地，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体，解离常数或KD小于或等于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，或10-8M。更优选地，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体，解离常数或KD小于或等于5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，或10-15M。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体诱导TR4表达细胞编程性死亡。
如以下更详细阐述，本发明的抗体可单独或与其它组合物组合使用。所述抗体还可以进一步在N或C末端重组融合于一种异源多肽，或者化学缀合于(包括共价和非共价缀合)多肽或其它组合物。例如，本发明抗体可以重组融合于或缀合于在检测分析中用作标记的分子及效应分子如异源多肽，药物，放射性核素或毒素。见例如PCT出版物WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利No.5314995及EP396387。
本发明的抗体和抗体组合物可以单独或与其它治疗剂组合施用，包括但非限于化疗剂，抗生素，抗病毒剂，抗逆转录病毒剂，类固醇和非类固醇抗炎剂，常规免疫治疗剂和细胞因子。所述组合可以伴随施用，例如作为混合物，单独但同时施用；或者相继施用。这包括其中组合制剂作为治疗混合物一起施用的说明书，及其中组合制剂单独但同时施用的步骤，例如通过单独的静脉通道输注于同一个体。“组合”施用还包括首先单独施用给定的化合物或制剂之一，然后再施用另一种。
与抗TR4抗体，TRAIL和/或化疗剂的组合治疗
抗TR4抗体可以与其它抗TR4抗体，TRAIL和/或化疗剂组合施用。
在特异的实施方案中，免疫特异性结合TR4的本发明抗体与另一种免疫特异性结合TR7的抗体组合使用或施用。在另一个实施方案中，特异于TR4和TR7的抗体是诱导TR4表达细胞(例如表达TR4和TR7的细胞)编程性死亡的兴奋抗体。在一个特异的实施方案中，与单独施用抗TR4抗体或抗TR7抗体治疗相比，抗TR4治疗与抗TR7治疗的组合诱导更多的TR4和TR7表达细胞编程性死亡。抗TR4和抗TR7抗体可以同时，相继施用或者根据剂量方案组合同时或相继施用。在另一个特异的实施方案中，抗TR4和抗TR7抗体与化疗药物组合施用或使用，所述化疗药物如本发明所述那些(见例如下文和实施例4所述)。在一个特殊的实施方案中，当抗TR4和抗TR7抗体与化疗药物和/或交联剂组合使用或施用时，得自抗TR4和抗TR7抗体治疗的协同诱导的细胞编程性死亡更明显或更显著。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物与一种化疗剂组合物施用。可以与本发明组合物组合施用的化疗剂包括但非限于抗生素衍生物(例如阿霉素(亚德里亚霉素)，博来霉素，道诺霉素，和更生霉素)；抗雌激素(例如三苯氧胺)；抗代谢物(例如氟尿嘧啶，5-FU，氨甲蝶呤，5-氟脱氧尿苷，干扰素α-2b，谷氨酸，plicamycin，巯基嘌呤，和6-硫鸟嘌呤)；胞毒剂(例如亚硝基脲氮芥，BCNU，lomustine，CCNU，胞嘧啶阿拉伯糖苷，环磷酰胺，estramustine，羟基脲，甲基苄肼，丝裂霉素，甲磺酸丁二醇二酯，顺铂和长春新碱硫酸盐)；激素(例如甲孕酮，estramustine磷酸钠，乙炔雌二醇，雌二醇，甲地孕酮乙酸酯，甲基睾酮，二乙基乙烯雌酚二磷酸酯，三对甲氧苯氯乙烯和睾乳酮)；氮芥衍生物(例如mephalen，chorambucil，二氯甲基二乙胺(氮芥)和三胺硫磷)；类固醇及组合物(例如bethamethasone磷酸钠)；及其它物质(例如dicarbazine，天冬酰胺酶，mitotane，长春新碱硫酸盐，长春花碱硫酸盐和表鬼臼毒吡喃葡糖苷，Topotecan，5-氟尿嘧啶，paclitaxel(Taxol)，顺铂，阿糖胞苷及IFN-γ，irinotecan(Camptosar，CPT-11)，irinotecan类似物，及gemcitabine(GEMZARTM))。
在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与CHOP(环磷酰胺，阿霉素，长春新碱，和强的松)或CHOP组分的任意组合物组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与Rituximab组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与Rituxmab和CHOP，或者Rituxmab与CHOP组分的任意组合物组合施用。
在另外优选的实施方案中，本发明的组合物与TRAIL多肽或其片段或变体组合施用，尤其是TRAIL的胞外可溶结构域。
在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与其它TNF家族成员或特异于TNF受体家族成员的抗体组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的TNF，TNF相关的或类TNF分子包括但非限于可溶形式的TNFα，淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)，LT-β(见于异源三聚体复合物LT-α2-β中)，OPGL，FasL，CD27L，CD30L，CD40L，4-1BBL，DcR3，OX40L，TNF-γ(国际出版物No.WO96/14328)，TRAIL，AIM-II(国际出版物No.WO 97/34911)，APRIL(实验方法杂志188(6)：1185-1190(1998))，内因子-α(国际出版物No.WO 98/07880)，Neutrokine-α(国际申请出版物No.WO 98/18921)，OPG，OX40，和神经生长因子(NGF)，及可溶形式的Fas，CD30，CD27，CD40和4-IBB，TR2(国际出版物No.WO 96/34095)，DR3(国际出版物No.WO 97/33904)，DR4(国际出版物No.WO 98/32856)，TR5(国际出版物No.WO 98/30693)，TR6(国际出版物No.WO 98/30694)，TR7(国际出版物No.WO 98/41629)，TRANK，TR9(国际出版物No.WO98/56892)，312C2(国际出版物No.WO 98/06842)，和TR12，及可溶形式的CD154，CD70，和CD153。
其它治疗组合
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与一种抗疟药，氨甲蝶呤，抗TNF抗体，ENBRELTM和/或硫酸水杨嗪组合施用的。在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与氨甲蝶呤组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抗TNF抗体组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与氨甲蝶呤和抗TNF抗体组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与硫酸水杨嗪组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与氨甲蝶呤，抗TNF抗体，和硫酸水杨嗪组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ENBRELTM组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ENBRELTM和氨甲蝶呤组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ENBRELTM，氨甲蝶呤和硫酸水杨嗪组合施用。在其它实施方案中，一或多种抗疟药与上述组合之一组合施用。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种抗疟药(例如羟化氯喹)，ENBRELTM，氨甲蝶呤和硫酸水杨嗪组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种抗疟药(例如羟化氯喹)，硫酸水杨嗪，抗TNF抗体和氨甲蝶呤组合施用。
本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)可以单独施用或与其它治疗或预防方案(例如放疗，化疗，激素治疗，免疫治疗，抗肿瘤剂，抗血管发生剂和抗炎剂)组合施用。这种组合治疗可以相继和/或伴随施用。
可以与本发明抗体或抗体组合物组合施用的常规非特异性免疫抑制剂包括但非限于类固醇，环孢霉素，环孢霉素类似物环磷酰胺，环磷酰胺IV，甲基强的松龙，强的松龙，咪唑硫嘌呤，FK-506，15-脱氧精胍菌素，及通过抑制T细胞应答功能而起作用的其它免疫抑制剂。
在特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种免疫抑制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的免疫抑制剂制品包括但非限于ORTHOCLONETM(OKT3)，SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(环孢菌素)，PROGRAFTM(tacrolimus)，CELLCEPTTM(霉酚酸)，硝基咪唑硫嘌呤，糖皮质激素和RAPAMUNETM(sirolimus)。在一个特异的实施方案中，可以使用免疫抑制剂预防器官或骨髓移植排斥。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与类固醇治疗组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的类固醇包括但非限于口服皮质类固醇，强的松和甲基强的松龙(例如IV甲基强的松龙)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与强的松组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与强的松和一种免疫抑制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的免疫抑制剂是本文所述的那些，并包括但非限于咪唑硫嘌呤，环磷酰胺和环磷酰胺IV。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与甲基强的松龙组合施用。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与甲基强的松龙和一种免疫抑制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的免疫抑制剂是本文所述的那些，并包括但非限于咪唑硫嘌呤，环磷酰胺和环磷酰胺IV。
本发明还涵盖了本发明多核苷酸和/或多肽(和/或其激动剂或拮抗剂)与其它提议或常规的造血疗法的组合。因此，例如本发明多核苷酸和/或多肽(和/或其激动剂或拮抗剂)可以与只具有红细胞生成刺激作用的化合物组合，所述化合物如红细胞生成素，睾酮，祖细胞刺激因子，类胰岛素生长因子，前列腺素，5-羟色胺，环AMP，促乳素和三碘甲腺原氨酸。本发明还涵盖了本发明抗体和抗体组合物与一般用于治疗再生障碍性贫血的化合物组合施用，所述化合物例如是methenolene，stanozolol和苯丙酸诺龙；以治疗缺铁性贫血，例如铁制品；治疗恶性贫血，例如缺乏维生素B12和/或叶酸；治疗溶血性贫血，例如肾上腺皮质激素例如肾上腺皮质素。见例如Resegotti等，Panminerva Medica，23：243-248(1981)；Kurtz，FEBS通讯，14a：105-108(1982)；McGonigle等，肾脏研究25：437-444(1984)；及Pavlovic-Kantera，Expt.Hematol.，8(supp.8)283-291(1980)，所述文献以其全文并入参考。
增强或协同红细胞生成素作用的化合物在此也用作佐剂，包括但非限于肾上腺能激动剂，甲状腺素，雄激素，肝红细胞生成因子，和红细胞生成素，见例如Dunn，″红细胞生成中的通用观点″，John Wiley及Sons(英格兰奇切斯特，1983)；Kalmani，肾脏研究22：383-391(1982)；Shahidi，新英格兰医学杂志，289：72-80(1973)；Urabe等，实验方法杂志149：1314-1325(1979)；Billat等，Expt.Hematol.，10：133-140(1982)；Naughton等，Acta Haemat，69：171-179(1983)；Cognote等，摘要364，Proceedings 7th Intl.Cong.of Endocrinology(Quebec City，Quebec，July 1-7，1984)；及Rothman等，1982，肿瘤外科学杂志20：105-108(1982)。刺激红细胞生成的方法包括为患者施用一种造血有效量(即影响血细胞生成的数量)的药物组合物，所述组合物含有本发明的多核苷酸和/或多肽(和/或其激动剂或拮抗剂)。通过任何适当方法将本发明的多核苷酸和/或多肽(和/或其激动剂或拮抗剂)施用于患者，包括但非限于非肠道，舌下，局部，肺内和鼻内施用，及那些本发明进一步揭示的方法。所述药物组合物任选地含有选自以下的一或多种成分：红细胞生成素，睾丸激素，原细胞刺激因子，类胰岛素生长因子，前列腺素，5-羟色胺，环AMP，促乳素，三碘甲腺原氨酸，methenolene，stanozolol，和苯丙酸诺龙，铁制品，维生素B12，叶酸和/或肾上腺皮质素。
在另一个实施方案中，本发明抗体和抗体组合物与造血生长因子组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的造血生长因子包括但非限于LEUKINETM(SARGRAMOSTIMTM)和NEUPOGENTM(FILGRASTIMTM)。
在另外的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物单独施用或与一种抗血管发生剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的抗血管发生剂，包括但非限于制管张素(Entremed，Rockville，MD)，肌钙蛋白-1(Boston Life Sciences，Boston，MA)，抗侵袭因子，视黄酸及其衍生物，paclitaxel(Taxol)，苏拉明，金属蛋白酶-1的组织抑制剂，金属蛋白酶-2的组织抑制剂，VEGI，血纤溶酶原激活物抑制剂-1，血纤溶酶原激活物抑制剂-2，及各种形式的lighter“d组”过渡金属。
Lighter″d组″过渡金属包括例如钒，钼，钨，钛，铌，和钽。这种过度金属可以形成过度金属复合物。上述过度金属的适当复合物包括含氧过度金属复合物。
钒复合物的代表性实例包括含氧钒复合物如钒酸盐和氧钒复合物。适当的钒酸盐复合物包括偏钒酸盐和原钒酸盐复合物例如偏钒酸铵，偏钒酸钠和原钒酸钠。适当的氧钒复合物包括例如氧钒乙酰丙酮化物，氧钒硫酸盐包括氧钒硫酸盐水合物如氧钒硫酸单和三水合物。
钨和钼复合物的代表性实例包括含氧复合物。适当的含氧钨复合物包括钨酸盐和钨氧化物复合物。适当的钨酸盐复合物包括钨酸铵，钨酸钙，钨酸钠二水合物，和钨酸。适当的钨氧化物包括钨(四价)氧化物和钨(六价)氧化物。适当的含氧钼复合物包括钼酸盐，钼氧化物，和氧钼基复合物。适当的钼酸盐复合物包括钼酸铵及其水合物，钼酸钠及其水合物，及钼酸钾及其水合物适当的钼氧化物包括钼(六价)氧化物，和钼酸。适当的氧钼基复合物例如包括氧钼基乙酰丙酮化物。其它适当的钨和钼复合物包括衍生自例如甘油，酒石酸和糖的hydroxo衍生物。
许多其它抗血管发生因子也可用于本发明中。代表性实例包括但非限于血小板因子4；硫酸鱼精蛋白；硫酸壳多糖衍生物(从雪花蟹壳中制备的)(Murata等，癌症研究51：22-26，1991)；硫酸多糖肽聚糖复合物(SP-PG)(这个化合物的功能可以通过类固醇如雌激素和三苯氧胺柠檬酸盐加强)；星形孢菌素；基质代谢调节剂包括例如脯氨酸类似物，顺羟脯氨酸，d，L-3，4-脱羟脯氨酸，Thiaproline，α-α-二吡啶基，氨基丙腈延胡索酸盐；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-唑酮；氨甲蝶呤；Mitoxantrone；肝素；干扰素；2血清巨球蛋白；ChIMP-3(Pavloff等，生物化学杂志267：17321-17326，1992)；胰凝乳蛋白酶抑制剂(Tomkinson等，生物化学杂志286：475-480，1992)；环式糊精十四硫酸酯；Eponemycin；喜树碱；烟曲霉素(Ingber等，自然348：555-557，1990)；硫代苹果酸金钠(″GST″；Matsubara和Ziff，临床研究杂志79：1440-1446，1987)；血清抗胶原酶；α2-抗纤溶酶(Holmes等，生物化学杂志262(4)：1659-1664，1987)；Bisantrene(国际癌症研究)；Lobenzarit二钠(N-(2)-羧基苯基-4-氯蒽酮酸二钠，或“CCA”；(Takeuchi等，Agents Actions 36：312-316，1992)；和金属蛋白酶抑制剂如BB94。
也可以用于本发明的另外抗血管发生因子包括Thalidomide，(Celgene，Warren，NJ)；制管张性类固醇；AGM-1470(H.Brem和J.Folkman，小儿外科学杂志28：445-51(1993))；一种整联蛋白αvβ3拮抗剂(C.Storgard等，临床研究杂志103：47-54(1999))；carboxynaminolmidazole；羧基酰胺三唑(CAI)(国际癌症研究学会Bethesda，MD)；Conbretastatin A-4(CA4P)(OXiGENE，Boston，MA)；Squalamine(Magainin Pharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA)；TNP-470，(Tap Pharmaceuticals，Deerfield，IL)；ZD-0101 AstraZeneca(London，UK)；APRA(CT2584)；Benefin，Byrostatin-1(SC339555)；CGP-41251(PKC 412)；CM101；Dexrazoxane(ICRF187)；DMXAA；Endostatin；Flavopridiol；Genestein；GTE；ImmTher；Iressa(ZD1839)；Octreotide(Somatostatin)；Panretin；Penacillamine；Photopoint；PI-88；Prinomastat(AG-3340)Purlytin；Suradista(FCE26644)；Tamoxifen(Nolvadex)；Tazarotene；Tetrathiomolybdate；Xeloda(Capecitabine)；和5-氟尿嘧啶。
可以与本发明化合物组合施用的抗血管发生剂可以通过各种机制起作用，包括但非限于抑制胞外基质的蛋白酶解，阻断内皮细胞-胞外基质粘着分子的功能，通过拮抗血管发生诱导剂如生长因子的功能，及抑制在增殖的内皮细胞上表达的整联蛋白受体。干扰胞外基质蛋白酶解，及可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗血管发生抑制剂例如包括但非限于AG-3340(Agouron，La Jolla，CA)，BAY-12-9566(Bayer，West Haven，CT)，BMS-275291(Bristol MyersSquibb，Princeton，NJ)，CGS-27032A(Novartis，East Hanover，NJ)，Marimastat(British Biotech，Oxford，UK)，和Metastat(Aeterna，St-Foy，Quebec)。通过阻断内皮细胞-胞外基质附着分子的功能而起作用，及可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗血管发生抑制剂例如包括但非限于EMD-121974(Merck KcgaA Darmstadt，Germany)和Vitaxin(Ixsys，La Jolla，CA/Medimmune，Gaithersburg，MD)。通过直接拮抗或抑制血管发生诱导剂而起作用，及可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗血管发生剂例如包括但非限于Angiozyme(Ribozyme，Boulder，CO)，抗-VEGF抗体(Genentech，S.San Francisco，CA)，PTK-787/ZK-225846(Novartis，Basel，Switzerland)，SU-101(Sugen，S.San Francisco，CA)，SU-5416(Sugen/Pharmacia Upjohn，Bridgewater，NJ)，和SU-6668(Sugen)。其它抗血管发生剂通过间接抑制血管发生而起作用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的血管发生的间接抑制剂例如包括但非限于IM-862(Cytran，Kirkland，WA)，α-干扰素，IL-12(Roche，Nutley，NJ)，和多硫酸戊聚糖酯(Georgetown大学，华盛顿DC)。
在特殊的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抗血管发生剂的组合施用预期可以治疗，预防和/或改善癌症及其它过渡增殖性病变。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抗病毒剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗病毒剂包括但非限于无环鸟苷，三唑核苷，金刚烷胺和remantidine。
在一些实施方案中，本发明的治疗剂与抗逆转录病毒剂，核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTIs)，非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)，和/或蛋白酶抑制剂(PTs)组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的核苷逆转录酶抑制剂包括但非限于RETROVIRTM(叠氮胸苷/AZT)，VIDEXTM(2’-3’双脱氧肌苷/ddI)，HIVIDTM(2’-3’双脱氧胞苷/ddC)，ZERITTM(双脱氧胸苷/d4T)，EPIVIRTM(lamivudine/3TC)，和COMBIVIRTM(叠氮胸苷/lamivudine)。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的非核苷逆转录酶抑制剂包括但非限于VIRAMUNETM(nevirapine)，RESCRIPTORTM(delavirdine)，和SUSTIVATM(efavirenz)。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的蛋白酶抑制剂包括但非限于CRIXIVANTM(indinavir)，NORVIRTM(ritonavir)，INVIRASETM(saquinavir)，和VIRACEPTTM(nelfinavir)。在特异的实施方案中，抗逆转录病毒剂，核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂，和/或蛋白酶抑制剂，可以与本发明治疗剂任意组合使用，以治疗，预防和/或诊断HIV感染。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抗生素制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗生素组合物包括但非限于amoxicillin，氨基糖苷，β-内酰胺(糖肽)，β-内酰胺酶，氯洁霉素，氯霉素，头孢菌素，ciprofloxacin，ciprofloxacin，红霉素，氟喹啉，大环内酯类药物，甲硝唑，青霉素，喹啉，利福霉素，链霉素，磺胺类药物，四环素，甲氧苄氨嘧啶，甲氧苄氨嘧啶-sulfamthoxazole，和万古霉素。
在其它实施方案中，本发明抗体和抗体组合物可以与抗机会感染制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗机会感染剂包括但非限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，ATOVAQUONETM，ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，ETHAMBUTOLTM，RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，AZITHROMYCINTM，GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM，CIDOFOVIRTM，FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，KETOCONAZOLETM，ACYCLOVIRTM，FAMCICOLVIRTM，PYRIMETHAMINETM，LEUCOVORINTM，NEUPOGENTM(filgrastim/G-CSF)和LEUKINETM(sargramostim/GM-CSF)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物可以与TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，和/或ATOVAQUONETM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断一种Pneumocystis carinii肺部机会感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，和/或ETHAMBUTOLTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断Mycobacterium avium复合物机会感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，和/或AZITHROMYCINTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性肺结核杆菌感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM，和/或CIDOFOVIRTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性巨细胞病毒感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，和/或KETOCONAZOLETM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性真菌感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ACYCLOVIRTM和/或FAMCICOLVIRTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性I型和II型单纯疱疹病毒感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PYRIMETHAMINETM和/或LEUCOVORINTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性Toxoplasma gondii感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与LEUCOVORINTM和/或NEUPOGENTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性细菌感染。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物单独施用或与抗炎剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗炎剂包括但非限于糖皮质激素和非类固醇抗炎剂，氨基芳香基羧酸衍生物，芳香基乙酸衍生物，芳香基丁酸衍生物，芳香基羧酸，芳香基丙酸衍生物，吡唑，吡唑啉酮，水杨酸衍生物，噻嗪氨甲酰，e-乙酰氨基己酸，S-腺苷甲硫氨酸，3-氨基-4-羟丁酸，amixetrine，bendazac，benzydamine，bucolome，吡啶联苯基乙酰胺，ditazol，emorfazone，guaiazulene，nabumetone，nimesulide，orgotein，oxaceprol，paranyline，perisoxal，pifoxime，proquazone，proxazole，和tenidap。
本发明的抗体或抗体组合物可以单独施用或与其它佐剂组合施用。可以与本发明的抗体和抗体组合物一起施用的佐剂包括但非限于明矾，明矾加上脱氧胆酸盐(ImmunoAg)，MTP-PE(Biocine公司)，QS21(Genentech公司)，BCG，和MPL。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与明矾组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与QS-21组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的其它佐剂包括但非限于单磷脂免疫调节剂，Adju Vax 100a，QS-21，QS-18，CRL1005，铝盐，MF-59，和病毒体佐剂。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用疫苗包括但非限于保护性直接抗MMR(麻疹，腮腺炎，风疹)，脊髓灰质炎，水痘，破伤风/白喉，甲肝，乙肝，流感嗜血杆菌B，百日咳，肺炎，流感，Lyme′s病，轮状病毒，霍乱，黄热病，乙型脑炎，脊髓灰质炎，狂犬病，伤寒，和百日咳，和/或PNEUMOVAX-23TM的疫苗。组合物可以例如作为混合物，单独但同时伴随施用；或相继施用。这包括其中所述组合的制剂作为治疗混合物一起施用，也包括其中所述组合的制剂单独但同时施用，例如通过单独的静脉内途径输注于相同个体内。“组合”施用还包括首先单独施用一种给定的化合物或制剂，随后再施用第二种。
在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断相关的任何疾病，功能失调和/或病变。在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断任何革兰氏阳性菌感染和/或任何相关的疾病，病变和/或状况。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断与肠球菌属和/或链球菌属的一或多个成员相关的感染和/或任何相关的疾病，病变和/或状况。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断与B组链球菌属的一或多个成员相关的感染和/或任何相关的疾病，病变和/或状况。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断肺炎链球菌感染和/或任何相关的疾病，病变和/或状况。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与以下物质组合施用：CD40配体(CD40L)，可溶形式的CD40L(例如AVRENDTM)，CD40L的生物活性片段，变体或衍生物，抗CD40L抗体(例如兴奋抗体或拮抗抗体)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种抗凝剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的抗凝血剂包括但非限于肝素，杀鼠灵(warfarin)和阿斯匹林。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与肝素和/或杀鼠灵组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与杀鼠灵组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与杀鼠灵和阿斯匹林组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与肝素组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与肝素和阿斯匹林组合施用。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抑制抗心磷脂抗体产生的一种制剂组合施用的。在特异的实施方案中，本发明的多核苷酸与一种制剂组合施用，所述制剂阻断和/或降低抗心磷脂抗体与磷脂结合血浆蛋白β2-糖蛋白(b2GPI)的结合能力。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种抗疟疾药物组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗疟药包括但非限于羟化氯喹，氯喹和/或奎纳克林。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种NSAID组合施用。
在一个非排外的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与一，二，三，四，五，十或多种以下药物组合施用的：NRD-101(HoechstMarion Roussel)，diclofenac(Dimethaid)，oxaprozinpotassium(Monsanto)，mecasermin(Chiron)，T-614(Toyama)，pemetrexed disodium(Eli Lilly)，atreleuton(Abbott)，valdecoxib(Monsanto)，eltenac(Byk Gulden)，campath，AGM-1470(Takeda)，CDP-571(Celltech Chiroscience)，CM-101(CarboMed)，ML-3000(Merckle)，CB-2431(KS Biomedix)，CBF-BS2(KS Biomedix)，IL-1Ra基因治疗(Valentis)，JTE-522(日本烟草)，paclitaxel(Angiotech)，DW-166HC(Dong Wha)，darbufelone mesylate(Warner-Lambert)，可溶的TNF受体1(synergen；Amgen)，IPR-6001(Institute forPharmaceutical Research)，trocade(Hoffman-La Roche)，EF-5(ScotiaPharmaceuticals)，BIIL-284(Boehringer Ingelheim)，BIIF-1149(Boehringer Ingelheim)，Leuko Vax(Inflammatics)，MK-663(Merck)，ST-1482(Sigma-Tau)，和butixocort propionate(WarnerLambert)。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与一，二，三，四，五或多种以下药物组合施用的：氨甲蝶呤，sulfasalazine，sodium aurothiomalate，auranofin，环孢霉素，青霉胺，咪唑硫嘌呤，一种抗疟药(例如本文所述)，环磷酰胺，苯丁酸氮芥，金，ENBRELTM(Etanercept)，抗-TNF抗体，LJP 394(La Jolla制药公司，San Diego，California)和强的松龙。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物单独施用或与一或多种静脉内免疫球蛋白制品组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的静脉内免疫球蛋白制品包括但非限于GAMMARTM，IVEEGAMTM，SANDOGLOBULINTM，GAMMAGARDS/DTM，和GAMIMUNETM。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物在移植治疗(例如骨髓移植)中与静脉内免疫球蛋白制品组合施用。
CD40配体(CD40L)，一种可溶形式的CD40L(例如AVRENDTM)，CD40L的生物活性片段，变体或衍生物，抗CD40L抗体(例如兴奋抗体或拮抗抗体)，和/或抗CD40抗体(例如兴奋抗体或拮抗抗体)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与细胞因子组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的细胞因子包括但非限于GM-CSF，G-CSF，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL12，IL13，IL15，抗-CD40，CD40L，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，TNF-α，和TNF-β。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与TRAIL受体组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物可以与任何白细胞介素组合施用，所述白细胞介素包括但非限于IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，1L-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21，和IL-22。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与IL4和IL10组合施用。
在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与一或多种趋化因子组合施用的。在特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与选自以下的α(CxC)趋化因子组合施用：γ干扰素可诱导蛋白-10(γIP-10)，白细胞介素-8(IL-8)，血小板因子4(PF4)，中性粒细胞激活蛋白(NAP-2)，GRO-α，GRO-β，GRO-γ，中性粒细胞激活肽，(ENA-78)，粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)，和基质细胞衍生因子-1(SDF-1，或前-B细胞刺激因子(PBSF))；和/或一种β(CC)趋化因子，选自RANTES(调节活化，正常T细胞表达和分泌)，巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)，巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，单核细胞趋化蛋白-2(MCP-2)，单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)，单核细胞趋化蛋白-4(MCP-4)巨噬细胞炎症蛋白-1γ(MIP-1γ)，巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)，巨噬细胞炎症蛋白-3β(MIP-3β)，巨噬细胞炎症蛋白-4(MIP-4/DC-CK-1/PARC)，eotaxin，Exodus和I-309；和/或γ(C)趋化因子，lymphotactin。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与趋化因子β-8，趋化因子β-1，和/或巨噬细胞炎症蛋白-4组合施用。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与趋化因子β-8组合施用。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与IL-4拮抗剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的IL-4拮抗剂包括但非限于：可溶的IL-4受体多肽，聚合形式的可溶IL-4受体多肽；结合IL-4而不转导由IL-4激发的生物信号的抗IL-4受体抗体，阻断IL-4与一或多种IL-4受体结合的抗IL4抗体，和结合IL-4受体但不转导由IL-4激发的生物信号的IL-4突变蛋白。优选地，根据这种方法应用的抗体是单克隆抗体(包括抗体片段，例如本发明所述)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与成纤维细胞生长因子组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的成纤维细胞生长因子包括但非限于FGF-1，FGF-2，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8，FGF-9，FGF-10，FGF-11，FGF-12，FGF-13，FGF-14和FGF-15。
论证组合物的治疗或预防用途
本发明的化合物优选在体外测试，然后在体内测试所需的治疗或预防活性，之后用于人体。例如，可以用于确定是否需要施用本发明特异抗体或组合物的体外分析，包括体外细胞培养分析，其中将患者组织样品在培养物中生长，并暴露于或另外施用本发明的抗体或组合物，观测本发明这种抗体或组合物对所述组织样品的作用。在各种特异的实施方案中，可以用患者病变中包含的代表性细胞进行体外分析，以确定本发明的抗体或组合物对这种细胞是否具有所需的作用。优选地，本发明的抗体或组合物也在体外分析和动物模型系统中进行测试，之后施用于人体。
用于治疗的本发明抗体或组合物，可以在适当的动物模型系统中测试其毒性，包括但非限于大鼠，小鼠，鸡，牛，猴和兔。针对体内测试抗体或组合物毒性，可以使用本领域已知的任何动物模型系统。
可以在体外，源于体内和体内分析中，测试本发明抗体或组合物降低肿瘤形成的能力。还可以在体外和体内分析中，测试本发明抗体或组合物已知病毒复制或降低病毒荷载的能力。还可以在本领域已知的体外和体内分析中，测试本发明抗体或组合物降低细菌数目的能力。还可以测试本发明的抗体或组合物减轻与癌症，免疫功能失调(例如炎症)，神经功能失调或感染性疾病相关的一或多种症状的能力。还可以测试本发明抗体或组合物降低感染性疾病时程的能力。另外，还可以测试本发明的抗体或组合物提高患病动物的存活期的能力，所患疾病包括癌症，免疫功能失调或感染性疾病。可以使用本领域已知的方法分析本发明抗体或组合物在体内的功能。
治疗或预防病毒感染的效力，可以通过检测本发明抗体或组合物抑制病毒复制，抑制传播或阻止病毒在其宿主中安置，或预防，改善或减轻疾病进展的能力而论证。如果在施用本发明抗体或组合物后，病毒荷载减少，改善一或多个症状，或死亡率和/或发病率降低，则认为所述治疗具有治疗效力。
可以测试本发明抗体或组合物调节免疫细胞生物活性的能力，通过将免疫细胞优选人免疫细胞(例如T细胞，B细胞和天然杀伤细胞)与本发明的抗体或组合物或一种对照化合物接触，并确定本发明抗体或组合物调节(即提高或降低)免疫细胞生物活性的能力。本发明抗体或组合物调节免疫细胞生物活性的能力，可以通过检测抗原的表达，检测免疫细胞的增殖(即B细胞增殖)，检测信号分子的活化，检测免疫细胞的效应器功能，或检测免疫细胞的分化而确定。可以使用本领域已知的技术测定这些活性。例如，细胞增殖可以通过3H-胸苷掺入分析和台盼蓝细胞计数确定。抗原表达可以通过例如免疫分析确定，所述分析包括但非限于竞争性和非竞争性分析系统，使用如Werstern印迹，免疫组织化学放射免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫分析，免疫沉淀分析，沉淀反应，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散分析，凝集反应，补体固定分析，免疫放射性分析，荧光免疫分析，蛋白A免疫分析和FACS分析。信号分子的活化可以通过例如激酶分析和电泳迁移分析(EMSAs)确定。在一个优选的实施方案中，测定本发明的抗体或组合物诱导B细胞增殖的能力。在另一个优选的实施方案中，测定本发明的抗体或组合物调节免疫球蛋白表达的能力。
实验对象/混合物
本发明还提供了免疫特异性结合TR4或其片段或变体的抗体的混合物(包括scFvs及包含或由抗体片段或变体组成的其它分子)，其中所述混合物具有至少1，2，3，4，5或多种不同的本发明抗体。在特异的实施方案中，本发明提供了至少2种，优选至少4，6，8，10，12，15，20或25种免疫特异性结合TR4的不同抗体或其片段或变体，其中混合物的至少1，2，4，6，或至少10种抗体是本发明的抗体。在一个特异的实施方案中，混合物的每种抗体军事本发明的抗体。
本发明还提供了免疫特异性结合TR4或其片段或变体的抗体实验对象组(包括scFvs及包含或由抗体片段或变体组成的其它分子)，其中所述实验对象组具有至少1，2，3，4，5或多种不同的本发明抗体。在特异的实施方案中，本发明提供了抗体实验对象组，其具有对TRAIL受体的不同亲和性，对TRAIL受体的不同特异性，或不同的解离速度。本发明提供了至少10种，优选至少25，50，75，100，125，150，175，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，或至少1000种抗体。抗体实验组可以用于例如96孔平板中进行分析，例如ELISA。
本发明还提供了包含一或多种抗体(包括scFvs及包含或由抗体片段或变体组成的分子)的组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs或其变体的任一或多个VH结构域的氨基酸序列的多肽组成。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs或其变体的VH结构域的任一或多个VH CDR1的氨基酸序列的多肽组成。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs或其变体的VH结构域的任一或多个VH CDR2的氨基酸序列的多肽组成。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs或其变体的VH结构域的任一或多个VH CDR3的氨基酸序列的多肽组成。
提供了包含一或多种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)的组合物的本发明其它实施方案如下所述。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs或其变体的任一或多个VL结构域的氨基酸序列的多肽组成。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs或其变体的任一或多个VL CDR1的氨基酸序列的多肽组成。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs或其变体的任一或多个VL CDR2的氨基酸序列的多肽组成。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs或其变体的任一或多个VLCDR3的氨基酸序列的多肽组成。
试剂盒
本发明还提供了一种药物包装或试剂盒，其包含一或多个充填一或多种本发明药物组合物的配料。任选地与这种容器相关的是一个由管理药物或生物制品的生产，使用和销售的政府机构规定的告示，其告知了针对人体施用的生产，使用或销售机构的许可。
本发明提供了可用于上述方法中的试剂盒。在一个实施方案中，一个试剂盒在一或多个容器中含有本发明的抗体，优选纯化的抗体。在另一个实施方案中，试剂盒含有免疫特异性结合TR4多肽或其片段或变体的抗体片段。在一个特异的实施方案中，本发明的试剂盒含有一种基本分离的TR4多肽或其片段或变体作为对照。优选地，本发明的试剂盒还包含与任何，一些或全部TRAIL受体不反应的一种对照抗体。在另一个特异的实施方案中，本发明的试剂盒含有一种检测抗体与TR4多肽结合的手段(例如抗体可以缀合于一种可检测底物乳荧光化合物，酶底物，放射性化合物或发光化合物，或识别第一种抗体的第二种抗体可缀合于一种可检测底物)。在特异的实施方案中，所述试剂盒可以包括一种重组产生的或化学合成的TRAIL受体。试剂盒中的TR4多肽还可以附着于一种固体支持物。在一个更特异的实施方案中，所述试剂盒的检测手段包括TR4多肽附着于其的一种固体支持物。这种试剂盒还可以包括一种未附着的受体标记的抗人抗体。在这个实施方案中，抗体与TR4的结合可以通过所述受体标记的抗体的结合而检测。
在另一个实施方案中，本发明包括一种诊断试剂盒，用于筛选含有本发明多肽的抗原的血清。所述诊断试剂盒包括与TARIL受体特异性免疫反应的一种基本分离的抗体，及检测TR4多肽与抗体结合的方法。在一个实施方案中，所述抗体附着于一种固体支持物。在一个特异的实施方案中，所述抗体可以是一种单克隆抗体。所述试剂盒的检测方法可以包括另一种标记的单克隆抗体。或者，或另外，所述检测方法可以包括一种标记的竞争抗原。
在一个诊断性构型中，将测试血清与一种固相试剂反应，所述固相试剂具有通过本发明方法获得的表面结合的TRAIL受体。在TR4多肽与特异性抗体结合后，通过冲洗除去未结合的血清成分，加入受体标记的抗人抗体，通过冲洗除去未结合的抗人抗体，将一种试剂与受体标记的抗人抗体反应，受体与所述试剂的结合与在固体支持物上结合的抗TR4多肽抗体的数量成比例。典型地，所述受体是一种酶，其是通过在存在适当的荧光，发光或显色底物的情况下，温育所述固相试剂而检测的。
上述分析中的所述固相表面试剂是通过本领域已知的将蛋白质物质吸附于固相物质如聚合物珠，蘸棒，96孔平板或滤膜的方法制备的。这些附着方法通常包括将所述蛋白质非特异性附于支持物，或蛋白质的共价附着，典型地通过一个游离氨基团，附于固相支持物上的一个化学反应基团，如激活的羧基，羟基或醛基团。或者，链亲和素包被的平板可以与生物素酰化的抗原联合使用。
因此，本发明提供了一种分析系统或试剂盒，以进行这种诊断方法。所述试剂盒一般包括具有表面结合的重组TRAIL受体的支持物，和受体标记的抗人抗体，以检测表面结合的抗TR4多肽抗体。
TRAIL受体的胎盘表达
肿瘤坏死因子家族受体和配体在整个胎盘及胎盘巨噬细胞和滋养层细胞系中的表达已经进行仔细检测。示出表达TR7和TR5但不表达TR10滋养层细胞对通过重组TRAIL的杀伤完全抗性，而表达TR4，TR7和TR10但不表达TR5的巨噬细胞是敏感的(Phillips等，免疫学杂志15：6053-9(1999)，在此以其全文并入参考)。因此，使用所述抗TR4抗体的方法也可以用于胎盘和胎盘细胞类型上(例如巨噬细胞和滋养层细胞)，以预防，治疗，诊断，改善或监测胎盘细胞类型的疾病或病变。
基因治疗
在一个特异的实施方案中，通过基因治疗，施用包含编码抗体或其功能衍生物的序列的核酸以治疗，抑制或预防与TRAIL受体和/或其配体(例如TRAIL0)异常表达和/或活性相关的疾病或病变。基因治疗是指通过为对象施用一种表达的或可表达的核酸进行治疗。在本发明的这个实施方案中，所述核酸产生介导治疗作用的其编码的蛋白质。
根据本发明，可以使用本领域可用的基因治疗的任何方法。例如以下阐述了一些方法。
针对基因治疗的一般方法，参见Goldspiel等，临床药理学12：488-505(1993)；Wu和Wu，生物治疗3：87-95(1991)；Tolstoshev，药物毒性学分析研究32：573-596(1993)；Mulligan，科学260：926-932(1993)；及Morgan和Anderson，生物化学分析研究62：191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)：155-215(1993)。可以使用的本领域已知的重组DNA技术的方法见于Ausubel等编辑，分子生物学通用方法，JohnWiley & Sons，NY(1993)；及Kriegler，基因转移和表达实验指导，Stockton出版社，NY(1990)。
在一个优选方面，本发明的组合物包含或者由编码抗体的核酸组成，所述核酸是在适当的宿主中表达抗体或其片段或嵌合蛋白或重链或轻链的表达载体的一部分。特别地，这种核酸具有启动子，优选异源启动子，可操纵地连于抗体编码区，所述启动子是可诱导的或组成型的，并任选地是组织特异性的。在另一个特别的实施方案中，所使用的核酸分子其中所述抗体编码序列和任何其它所需序列，位于促进在基因组中所需位点同源重组的区域两侧，因此提供抗体编码核酸在染色体内表达(Koiler和Smithies，美国科学院院报86：8932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342：435-438(1989)。在一个特异的实施方案中，表达的抗体分子是scFv；或者，所述核酸序列包括编码抗体重链和轻链或其片段或变体序列。
将所述核酸可以直接或间接输送于患者，直接输送是将患者直接暴露于所述核酸或携带核酸的载体，间接输送是将细胞首先用所述核酸在体外转化，然后移植入患者体内。这两种方法分别称为体内或源于体内基因治疗。
在一个特异的实施方案中，所述核酸序列直接在体内施用，其中其表达产生编码的产物。这可以通过本领域已知的任何方法完成，例如通过将它们构建为适当的核酸表达载体的一部分，并施用以使其成为胞内的，例如通过使用缺陷的或弱化的逆转录病毒载体或其它病毒载体感染(见美国专利No.4,980,286)，或通过直接注射裸DNA，或通过微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，包装在脂质体，微粒或微囊中，或通过将其与已知进入核的肽连接施用，通过将其与配体连接进行受体介导的胞吞(见例如Wu和Wu，生物化学杂志262：4429-4432(1987))(其可以用于定向特异性表达所述受体的细胞)等。在另一个实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中所述配体包含一种融合病毒肽以破坏内涵体，使所述核酸免于被溶酶体降解。在另一个实施方案中，所述核酸可以在体内定向以进行细胞特异性吸取和表达，通过定向一个特异性受体进行(见例如PCT出版物WO 92/06180；WO 92/22635；W092/20316；W093/14188，WO 93/20221)。或者，所述核酸可以导入细胞内，并掺入宿主细胞DNA内以表达，通过同源重组进行(Koller和Smithies，美国科学院院报86：8932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342：435-438(1989))。
在一个特异的实施方案中，使用含有编码本发明抗体的核酸序列或其片段或变体的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(见Miller等，酶学方法217：581-599(1993))。这些逆转录病毒含有正确包装病毒基因组及整合入宿主细胞DNA所必需的成分。将编码基因治疗中所用抗体的核酸序列克隆入一或多个载体中，所述载体促进所述基因输送至患者体内。关于逆转录病毒的更详细阐述可见于Boesen等，生物治疗6：291-302(1994)，其阐述了使用一种逆转录病毒将mdr 1基因输送至造血干细胞中，以使所述干细胞对化疗更有抗性。其它例证了在基因治疗中使用逆转录病毒的参考文献见于：Clowes等，临床研究杂志93：644-651(1994)；Klein等，血液83：1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，人体基因治疗4：129-141(1993)；及Grossman和Wilson，遗传和发育中的通用观点3：110-114(1993)。
腺病毒是可用于基因治疗中的其它病毒载体。腺病毒是将基因输送于呼吸道上皮的特别有效的运载体。腺病毒自然感染呼吸道上皮，在此其导致轻微的疾病。基于腺病毒的输送系统的其它靶位是肝，中枢神经系统，内皮细胞和肌。腺病毒具有能感染未分化的细胞的优点。Kozarsky和Wilson，遗传学和发育中的通用观点3：499-503(1993)提出了一种关于基于腺病毒的基因治疗的评价。Bout等，人体基因治疗5：3-10(1994)论证了腺病毒载体将基因转移至恒河猴呼吸道上皮的使用。腺病毒在基因治疗中应用的其它例子可见于Rosenfeld等，科学252：431-434(1991)；Rosenfeld等，细胞68：143-155(1992)；Mastrangeli等，临床研究杂志91：225-234(1993)；PCT出版物W094/12649；及Wang，等，基因治疗2：775-783(1995)。在一个优选的实施方案中。使用腺病毒载体。
腺伴随病毒(AAV)已经被提议用于基因治疗中(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；美国专利No.5,436,146)。
基因治疗的另一种方法包括将基因移至组织培养的细胞中，通过如电穿孔，脂染，磷酸钙介导的转染，或病毒感染等方法。通常地，所述转移方法包括将一个可选择标记移至所述细胞。然后将此细胞在选择下放置，以分离已经被吸收并表达转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞输送于患者。
在这个实施方案中，在体内施用所得重组细胞之前，将所述核酸导入细胞中。这种导入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但非限于转染，电穿孔，微注射，用含有所述核酸序列的病毒或噬菌体载体感染，细胞融合，染色体介导的基因转移，微细胞介导的基因转移，原生质体融合等。本领域已知许多将外源基因导入细胞的方法(见例如Loeffler和Behr，酶学方法217：599-618(1993)；Cohen等，酶学方法217：618-644(1993)；临床药物治疗29：69-92m(1985))，根据本发明可以使用这些方法，使受体细胞的必需发育和生理功能不被破坏。所述技术应稳定将所述核酸移至细胞，以便所述核酸由细胞表达，及优选地可由其子代继承和表达。
所得重组细胞可以通过本领域移至的各种方法输送于患者。重组的血细胞(例如造血干细胞或原细胞)优选通过静脉内注射施用。所用细胞数量依赖于所需作用，患者状态等而定，并可以由本领域技术人员确定。
将核酸导入其中以进行基因治疗的细胞，涵盖了任何所需的可获得的细胞，包括但非限于上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞，肌细胞，肝细胞；血细胞如T淋巴细胞，B淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨核细胞，粒细胞；各种干细胞或原细胞，尤其造血干细胞或原细胞，例如得自骨髓，脐带血，周围血，胎儿肝脏的细胞等。
在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞与患者是自体同源的。
在一个使用重组细胞进行基因治疗的实施方案中，将编码抗体或其片段的核酸序列导入细胞中，这样其可由细胞或其子代表达，然后将所述重组的细胞体内施用以进行治疗。在一个特异的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。根据本发明的这个实施方案，优选使用可以在体外分离并维持的任何干细胞和/或祖细胞(见例如PCT出版物WO94/08598；Stemple和Anderson，细胞71：973-985(1992)；Rheinwald，细胞生物学方法21A：229(1980)；及Pittelkow和Scott，Mayo ClinicProc.61：771(1986))。
在一个特异的实施方案中，导入的以进行基因治疗的核酸包含一个可诱导启动子，其可操纵地连接于编码区，这样所述核酸的表达可通过存在或不存在适当的转录诱导剂而控制
实施例
实施例1：分离和定性表1所示scFv
拯救大scFv文库
使用一个接近1×1011个克隆的scFv文库选择特异于TR4的抗体，所述文库是所述1.38×1010文库的扩展形式(Vaughan等(1996)，自然生物技术学14：309-314)。拯救噬菌体通过从甘油原种培养物中取3×1010个细胞，在2YTAG(补加100μg/ml氨苄青霉素和2％(w/v)葡萄糖的2YT培养基)中在37℃摇动生长2小时而进行。在培养物中以感染复数(moi)为大约10加入M13K07辅助噬菌体(Stratagene)。将培养物在37℃固定温育15分钟，随后在相同温度轻度通气(200rpm)45分钟。将培养物离心并将细胞再悬浮于500ml2YTAK(补加100μg/ml卡那霉素2YT培养基)中，在良好通气下(300rpm)在30℃温育过夜。纯化噬菌体颗粒，在冰上通过三次聚乙二醇(PEG)沉淀(20％PEG 600，2.5M NaCl)浓缩，然后以1012转导单位(tu)/ml再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，滴定为氨苄青霉素抗性颗粒。
在TR4上淘选scFv
通过HGS生产可溶的纯TR4融合蛋白。纯化的噬菌粒首先在无关的融合蛋白上取消选定以除去任何无关的结合剂。为此，将500μl无关的融合蛋白在4℃在75mm×12mm免疫试管(Nunc Maxisorp)上固定(于PBS中10μg/ml)过夜。在用PBS洗涤后，将试管用3％MPBS(于PBS中3％Marvel脱脂奶粉)成天并在37℃封阻2小时。重复洗涤，加入于含有100μg/ml无关融合蛋白的500μl 3％MPBS中的噬菌粒颗粒(1013tu)，在37℃固定温育1小时。然后将噬菌粒颗粒移至一个免疫试管中，所述试管已经用TR4(于PBS中10μg/ul)在4℃包被过夜，并用3％MPBS在37℃封阻2小时。将该试管在37℃固定温育1小时，然后用PBST(含有0.1％(v/v)Tween 20的PBS)洗涤10次，及用PBS洗涤10次。结合的噬菌粒颗粒用1ml 100mM三乙胺在室温洗脱10分钟，然后立即用0.5ml 1M Tris.HCl(pH7.4)中和。洗脱的噬菌体用于感染10ml指数生长的大肠杆菌TG1。感染的细胞在轻度通气下在37℃在2YT肉汤中生长1小时，然后划线接种于2YTAG琼脂平板上(243mm×243mm；Nunc)，在30℃温育过夜。从平板中刮取集落置于10ml的2YT肉汤中，加入和15％(v/v)甘油，在-70℃贮存。
将得自在TR4融合蛋白上第一次淘选的甘油原种培养物然后用辅助噬菌体超感染并拯救，以提供进行第二次淘选的噬菌粒颗粒。将25μl甘油原种接种于25ml 2TYAG肉汤中，在良好通气下在37℃温育直至OD600nm达到0.7。在培养物中加入M13K07辅助噬菌体(moi＝10)，在37℃固定培养15分钟，然后在相同温度摇动培养45分钟。离心培养物，将细胞再悬浮于50ml预温的2YTAK中，如前在30℃拯救过夜。如前纯化噬菌粒颗粒并浓缩，再悬浮于PBS中至1013tu/ml。以相同方式超感染和拯救在随后的选择中收获的所有组成成分。
进行4次淘选选择，并通过噬菌体ELISA分析与TR4的结合而筛选各个集落。
噬菌体ELISA
为确定每种抗体的特异性，对TR4融合蛋臼和无关融合蛋白的每种抗体进行噬菌体ELISA。
将含有噬菌粒的各个大肠杆菌集落，接种于含有100μl 2TYAG培养基/孔的96孔平板中。将平板在37℃摇动温育4小时。将M13KO7辅助噬菌体加入每个孔中至moi为10，并将所述平板在37℃进一步温育1小时。将所述平板在台式离心器中以2000rpm离心10分钟。除去上清，将细胞沉淀再悬浮于100μl 2TYAK中，并在30℃摇动温育过夜。第二天，将平板在2000rpm离心10分钟，并从每个孔中将100μl含有噬菌体的上清小心移至一个新的96孔平板中。在每个孔中加入20μl的6xMPBS，在室温温育1小时以封阻所述噬菌体，之后进行在ELISA。
将柔软的96孔平板(Falcon)在4℃用人TR4(1μg/ml)或无关融合蛋白(1μg/ml)包被过夜。这两种抗原均于PBS中包被。在包被后，将所述溶液从孔中除去，并将所述平板在MPBS中在室温封阻1小时。所述平板用PBS洗涤3次，然后在每个孔中加入50μl预封阻的噬菌体。将所述平板在室温温育1小时，然后用3种变化的PBST洗涤，随后用3种变化的PBS洗涤。
在每个孔中加入在MPBS中1∶5000稀释的50μl抗M13-HRP缀合物(Pharmacia)，并将所述平板在室温温育1小时。每个平板用PBST洗涤3次，随后用PBS洗涤3次。
然后向每个孔中加入50μl的TMB底物，在室温温育30分钟或直至发生变色。通过加入25μl的05M H2SO4结束反应。产生的信号通过用微滴定平板读器(Bio-Rad 3550)读数在450nm的吸光度(A450)而测定。
从通过ELISA筛选的一组1500个克隆中，鉴别了结合TR4融合蛋白但不结合无关的融合蛋白的250种抗体。典型的克隆平板结果示于图1。95％的分离的抗体识别TR4融合蛋白但不识别无关的融合蛋白。
特异性噬菌体ELISA
为确定结合TR4抗体的特异性，对人TR4融合蛋白，及一组相关的和无关的人抗原TR7，TR5，TR10，BLyS(在国际专利出版物WO98/18921和WO00/50597中描述，在此以其全文并入参考)，无关的融合蛋白和BSA进行噬菌体BLISA。
将含有噬菌粒的各个大肠杆菌集落接种子5ml 2YTAG中，在37℃摇动温育4小时。在每个试管中加入M13K07辅助噬菌体(Pharmacia)至moi为10，在37℃温育30分钟，前30分钟静态培养，后30分钟轻轻摇动培养。通过在3500rpm离心10分钟沉淀细胞。将含有噬菌体的上清(5ml)小心移至一个新试管中，加入1ml 6MPBS，然后在室温温育1小时以预封阻噬菌体，之后进行ELISA。
将柔软的96孔平板(Falcon)在4℃用每种抗原(1μg/ml)包被过夜。所有抗原均于PBS中包被。在包被后，将所述溶液从孔中除去，并将所述平板在MPBS中在室温封阻1小时。所述平板用PBS洗涤3次，然后在每个孔中加入50μl预封阻的噬菌体。将所述平板在室温温育1小时，然后用3种变化的PBST洗涤，随后用3种变化的PBS洗涤。
在每个孔中加入在MPBS中1∶5000稀释的50μl抗M13-HRP缀合物(Pharmacia)，并将所述平板在室温温育1小时。每个平板用PBST洗涤3次，随后用PBS洗涤3次。
然后向每个孔中加入50μl的TMB底物，在室温温育30分钟或直至发生变色。通过加入25μl的0.5M H2SO4结束反应。产生的信号通过用微滴定平板读器(Bio-Rad 3550)读数在450nm的吸光度(A450)而测定。
使用这种分析，scFvs，T1014F08，T1014G03，T1014A04，T1014G04，T1014B11，T1017D09示出结合TR4但不结合TR7，TR5，TR10，BLyS或无关融合蛋白，表明所述抗体特异性识别TR4。
实施例2：TR4结合多肽的亲和性的Biacore分析
材料
BIAcore2000设备
BIAcore2000控制软件，版本3.1.1
BIAevaluation，版本3.1
BIAcore CM5传感器芯片，Cat#BR-1000-14Lot#0364(BIAcore)
HBS-EP缓冲液
胺偶联试剂盒Cat#BR-1000-50(BIAcore)
EDC，#1048-950345(BIAcore)
NHS，#1048-950345(BIAcore)
乙醇胺，#1048-950345(BIAcore)
10mM乙酸，pH4.0，Cat#BR1003-50Lot#1821-9503844(BIAcore)
TRAIL-FLAG(Alexis Biochemical Cat#522-003-C010#L04793/a)
所有实验温度均为25℃。
一般方法
将TR4，TR5，TR7和TR10(Fc融合蛋白形式)固定于BIAcore传感器芯片的各个流式细胞上。TR4-Fcc融合蛋白包含TR4(SEQ IDNO：1)的M1-I240残基。整个融合蛋白的翻译后加工产生TR4-Fc融合蛋白，其包含TR4(SEQ ID NO：1)的A109-I240残基。TR5-Fc融合蛋白包含TR5(SEQ ID NO：2)的R70-S282残基。这种蛋白质在杆状病毒表达系统中利用GP信号肽表达。因此，这种融合蛋白的翻译后加工产生TR5-Fc融合蛋白，其包含融合于TR5(SEQ ID NO：3)的R70-S282残基的GP信号肽的后3个残基(Ala-Asp-Pro)，所述残基融合于Fc区域。TR10-Fc融合蛋白包含TR10(SEQ ID NO：4)的M1-G204残基。这种蛋白质的翻译后加工产生TR10-Fc融合蛋白，其包含TR10(SEQ ID NO：4)的A56-G204残基。
胺偶联用于将每个受体(Fc)共价结合于CM5传感器芯片上的葡聚糖基质。这种偶联的最佳pH使用在pH4-7范围进行的预选实验分析，并基于结合斜率确定。
使用手工注射模式进行实际偶联。大约2000RU的靶水平针对所有流式细胞设定为目标(根据受体的分子量可以在2000-3100范围年变化)。进行固定的所有受体浓度为于10mM乙酸(pH4)中10μg/ml。在5μl/分钟进行全部固定实验。EDC/NHS注射的接触时间为7分钟。注射乙醇胺7分钟。
用以下程序进行筛选。完整结合循环的流速为25μl/分钟。相当于scFvs的抗体在HBS-EP中稀释，并流经具有固定的TRAIL受体的所有四种细胞。将每种样品与受体接触4分钟。使用15μl的25mMNaOH进行再生。成功的再生认为不仅除去抗体，而且还不变性固定的受体。
这种筛选实验的阳性对照是同样(流速和时间长度相同)注射可溶的TRAIL配体。浓度为1μg/ml。阴性对照是在HBS-EP中1∶10稀释的抗体稀释剂。使用BIAevaluation软件包分析数据。
抗TR4抗体的Biacore分析
在基于上述一般方法的以下实验中，某些抗体(相当于本发明的scFvs)与TR4的亲和性使用“双参考扣除”方法确定，在实验的流式细胞中使用TR4：Fc受体，TR2：Fc(包含TR2的1-240位氨基酸，如WO96/34095所揭示)作为阴性对照。
固定
这种偶联的最佳pH使用在pH4-7的预选实验分析，确定针对TR4和TR2受体的pH为4.0。使用胺偶联以将每种受体(Fc)共价结合于CM5传感器芯片上的葡聚糖基质。使用手工注射模式进行固定实验。全部固定实验在5μl/分钟进行。对每种流式细胞进行3分钟EDC/NHS(1∶1)注射以激活酯。针对每种流式细胞设定大约200RU的靶水平为目标。5μg/ml的Fc融合蛋白受体，TR4和TR2固定于传感器芯片的各个流式细胞上。应用数量为8-14μl。3分钟乙醇胺注射通过灭活所述酯而完成实验。
动力学
如下进行动力学循环：全部循环的流速为25μl/分钟，在所有时间流道均包括对照(TR2)和实验(TR4)流式细胞。应用1分钟缓冲液注射以稳定基线。将纯化的抗体(包含每种T1014A04，T1014G03，T1014F08和T14G04 scFvs的VH和VL结构域的IgG1抗体)在运转缓冲液中从10μg/ml(65nM)稀释至0.115μg/ml(0.75nM)，并一式两份测试。在4分钟结合及10分钟解离相期间，将每种浓度均与对照(TR2)和实验(TR4)流式细胞接触。根据样品浓度，使用5-12μl的25mM NaOH进行再生。
评价
进行双参考扣除，这是指除了缓冲循环扣除之外，在每次循环中扣除对照流式细胞。针对所有评价设施，使用Langmuir模型。这些实验结果示于下表5。
表5：抗体对TR4亲和性
  克隆   Ka   Kd   K<sub>D</sub>   Chi<sup>2</sup>
  T1014A04   5.67×10<sup>5</sup>   2.65×10<sup>-4</sup>   4.68×10<sup>-10</sup>   2
  T1014G03   3.50×10<sup>5</sup>   1.94×10<sup>-4</sup>   5.54×10<sup>-10</sup>   0.76
  T1014F08   1.23×10<sup>6</sup>   1.02×10<sup>-4</sup>   8.27×10<sup>-10</sup>   1.83
  T1014G04   6.05×10<sup>5</sup>   1.18×10<sup>-4</sup>   1.94×10<sup>-10</sup>   1.14
实施例3：抑制生物素酰化的TRAIL与TR4结合
I.材料：
10×PBS(Quality Biological Cat 130-069-161，Lot 708712)Immulon 4微平板(Dynex Cat 3855，Lot ND540319)
牛血清白蛋白级分V(Sigma，#58H0456)
三羟基甲基氨基甲烷(TRIS BASE)
Tween20(Sigma)
羊抗人Fc(Sigma，I-2136，#89H4871)
TR-4：Fc(如上述)
生物素酰化的TRAIL(AM100200-Peprotech)
HRP-链亲和素(载体，#L0328)
TMB过氧化酶微孔底物系统(KPL，Kirkegaard&Perry实验室公司)
H2SO4(Fisher)
96孔稀释平板(Costar)
II.缓冲液
包被缓冲液(1×PBS)
封阻缓冲液(于PBS中3％BSA)
通用稀释剂(于PBST中1％BSA)
洗涤缓冲液(0.1％Tween20和1×PBS)
III.方法
将羊抗人Fc在包被缓冲液中稀释为0.1μg/ml。将Immulon 4微平板用100μl/孔的羊抗人Fc溶液包被，并在4℃温育过夜。从平板中轻轻倒出包被溶液，并以200μl/孔分液封阻溶液。将平板在室温温育1小时。温育1小时后，从平板中轻轻倒出封阻溶液，并以100μl/孔分液1μg/ml的TR4-Fc，在室温温育2小时。温育后，将平板用Wheatonmanifold人工洗涤5次。
相当于本发明scFvs的抗体在低结合稀释平板中使用稀释剂(预先)制备。一式两份制备该抗体并针对随后的7个孔从原液浓度稀释2.5倍。如果获得纯化形式的抗体，起始浓度为5μg/ml。将阳性对照(TR4-Fc)从5μg/ml稀释。将100μl移至ELISA平板中，并在室温预温育30分钟。向100μl上清中加入20μl的5μg/ml生物素酰化的TRAIL并混合。将组合的120μl溶液在室温温育2小时。
在温育2小时后，重复洗涤循环并将平板轻轻倒出及印迹。将HRP-链亲和素1∶2000稀释并以100μl/孔分液。在室温温育1小时。同时，组合等量的TMB过氧化酶底物和过氧化酶溶液B，将溶液恒温在室温下。
在1小时温育后，轻轻倒出平板并用PBST洗涤5次及印迹。组合TMB过氧化酶底物和过氧化酶溶液B，并在每个孔中分液100μl。在室温生色15分钟。向每个孔中加入50μl的1M H2SO4中止生色。使用得自Molecular Devices的分光计在450nm立即读数平板。
然后测定IC-50，即引起平台结合抑制50％的纯化的抗体浓度。为进行对比，在该分析中使用TR4多肽作为样品。
实施例4：分析抗TRAIL-R1(TR4)抗体诱导细胞编程性死亡的能力
一般方法：
测试抗TR4抗体单独或者组合化疗剂或交联剂诱导TR4表达细胞编程性死亡的能力。简而言之，测试抗体诱导TR4介导的TR4表达细胞系，SW480和HeLa编程性死亡的活性。不表达TR4的HT1080纤维肉瘤细胞系用作阴性对照。
为诱导细胞编程性死亡，将HeLa或SW480细胞用指定浓度的单克隆抗体或人IgG2a对照抗体温育。在分析前一天，将细胞(0.3×106个细胞/ml；100μl/孔)种植于96孔平板的孔中并使其贴壁过夜。第二天，在有或无2.0μg/ml环己酰亚胺(Sigma R75010-7)情况下加入测试抗体。在一些实验中，将抗TR4单克隆抗体的效力与rhuTRAIL-FLAG蛋白(Alexis Biochemicals)对比。在存在2μg/ml抗FLAG增强子抗体的情况下以指定浓度使用rhuTRAIL。二级交联的作用通过测定单克隆抗体单独或者存在二级羊抗人Ig Fc特异性抗体(SIGMA)情况下杀死细胞的能力而确定。二级交联抗体以与测试的单克隆抗体相同浓度加入细胞中。通过用单克隆抗体在存在Topotecan(Hycamtin，SmithKline Beecham NDC0007-4201-01)的情况下处理HeLa或SW480细胞，确定通过单克隆抗体引起的化疗剂敏化细胞被杀死的能力。
将反应在37℃进行16-18小时，之后使用试剂Alamar蓝(Biosource，cat.#DAL1100)证实存活力，使用厂商提供的条件。Alamar蓝荧光使用CytoFluor荧光读器在530nm激发和590nm发射下检测。结果以与未处理细胞对比的存活力百分率表示。
可以在这个分析中测试(及用于结合本发明抗体的治疗方案中)的其它化疗剂包括例如5-氟尿嘧啶，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，紫杉醇，顺铂，Cytabarine(Cytosar)，IFN-γ，喜树碱，irinotecan(camptosar，CPT-11)，阿霉素，氨甲蝶呤，paraplatinin，α-干扰素，paclitaxel，docetaxel，NF-κ-B抑制剂SN50，及gemcitabine(GemzarTM)。可以在这个分析中测试的其它细胞系包括例如人Burkitt淋巴瘤细胞系ST486，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，人子宫癌细胞系RL-95，人肺癌细胞系SK-MES-1，人结肠癌细胞系，LS174T，HT29和HCT116，su.86.86和CFPAC胰腺癌细胞系，人卵巢癌细胞系TOV21G，及人肝细胞癌细胞系SNU449。相当于这些癌细胞衍生自其中的组织的组织癌症，可以用根据本发明的治疗组合物治疗。
抗TR4抗体分析
使用上述分析，对已经转变为整个IgG1分子的本发明的一些scFvs测试其诱导TR41(TR4)表达细胞编程性死亡的能力。T1014A04的IgG1形式在存在交联剂但无环己酰亚胺的情况下诱导SW480细胞编程性死亡。在存在环己酰亚胺但有或无交联剂的情况下，T1014A04的IgG1形式诱导SW480和HeLa细胞编程性死亡。在存在环己酰亚胺的情况下，通过用T1014A04的IgG1形式处理对SW480和HeLa细胞的杀伤能力高于当也使用交联剂的情况。事实上，在存在交联剂和环己酰亚胺情况下，T1014A04的IgG1形式比等浓度的(ng/ml)可溶TRAIL能诱导更多的细胞编程性死亡。在无敏化剂环已酰亚胺的情况下，T1015A02不诱导杀伤。在存在环己酰亚胺，在有或无交联剂的情况下，T1015A02诱导SW480细胞编程性死亡，但不诱导HeLa细胞编程性死亡。通过用T1015A02的IgG1形式处理对SW480细胞的杀伤力高于存在交联剂的情况。
另外，这个实施例中描述的分析还可用于测试一种以上抗TR4抗体对TR4表达细胞的作用。例如，细胞既可以用特异性结合TR4的抗体处理，也可以用特异性结合TR7的抗体处理。如上所述，可以在有或无一或多种化疗剂或交联剂的情况下进行实验。在另一种变化的实验中，可以测试本发明的抗体当在存在TRAIL的情况下使用时诱导细胞编程性死亡的能力。与单独用抗TR4或抗TR7处理相比，用抗TR4和抗TR7双重处理诱导的细胞编程性死亡的数量更多。当在存在化疗剂和/或交联剂的情况下进行实验时，这种作用更明显。
实施例5：鉴别及克隆VH和VL结构域
从表达特殊抗体的细胞系中鉴别和克隆VH和VL结构域的一种方法，是使用VH和VL特异性引物对从抗体表达细胞中产生的cDNA进行PCR。简而言之，从所述细胞系中分离RNA，并用作RT-PCR的模板，所述RT-PCR设计为扩增EBV细胞系表达的抗体的VH和VL结构域。细胞可以在
Figure C0281490402551
试剂(Life Technologies，Rockville，MD)中裂解，并用1/5体积的氯仿提取。在加入氯仿后，将溶液在室温温育10分钟，然后在4℃在桌面离心器中以14000rpm离心15分钟。收集上清，使用等体积的异丙醇沉淀RNA。沉淀的RNA通过在4℃在桌面离心器中以14000rpm离心15分钟而沉淀。在离心后，弃去上清并用75％乙醇洗涤。在洗涤后，将RNA在4℃在800rpm再离心5分钟。弃去上清并将沉淀在空气中干燥。将RNA溶解于DEPC水中，并在60℃加热10分钟。使用光密度测定可以确定RNA的数量。
根据本领域熟知的方法，可以从1.5-2.5μgRNA中合成cDNA，使用逆转录酶和随机六聚体引物。然后将cDNA用作扩增VH和VL结构域的PCR模板。用于扩增VH和VL基因的引物示于表6。典型地，PCR反应使用一个5’引物和一个3’引物。有时当可利用的PCR模板数量有限，或者为达到更高效力时，可以使用5’和/或3’引物组。例如，有时在一个PCR反应中，使用所有5个VH-5’引物和所有JH3’引物。PCR反应在50μl体积中进行，所述体积中含有1×PCR缓冲液，2mM的每种dNTP，0.7单位的高保真Taq聚合酶，5’引物混合物，3’引物混合物和7.5μ流道cDNA。VH和VL的5’和3’引物混合物可以通过集合分别为22pmol和28pmol的各个引物而产生。PCR条件是：96℃5分钟；随后进行25次94℃1分钟，50℃1分钟及72℃1分钟循环；接着进行一次72℃10分钟的扩展循环。在反应完成后，将样品试管贮存于4℃。
表6：用于扩增VH和VL结构域的引物序列
引物名称           SEQ ID NO     引物序列(5’-3’)
VH引物
Hu VH1-5’         6             CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
Hu VH2-5’         7             CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG
Hu VH3-5’         8             GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
Hu VH4-5’         9             CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG
Hu VH5-5’         10            GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC
Hu VH6-5’         11            CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG
Hu JH1，2-5’      12            TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC
Hu JH3-5’         13            TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC
Hu JH4，5-5’      14            TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC
Hu JH6-5’         15            TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC
VL引物
Hu Vkappa1-5’     16            GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
Hu Vkappa2a-5’    17            GATGTTGTGATGACTCACTCTCC
Hu Vkappa2b-5’    18            GATATTGTGATGACTCAGTCTCC
Hu Vkappa3-5’     19            GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC
Hu Vkappa4-5’     20            GACATCGTGATGACCCAGTCTCC
Hu Vkappa5-5’     21            GAAACGACACTCACGCAGTCTCC
Hu Vkapa6-5’      22            GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC
Hu Vlambda1-5’    23            CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC
Hu Vlambda2-5’    24            CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC
Hu Vlambda3-5’    25            TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC
Hu Vlambda3b-5’   26            TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC
Hu Vlambda4-5’    27            CACGTTATACTGACTCAACCGCC
Hu Vlambda5-5’    28            CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC
Hu Vlambda6-5’    29            AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
Hu Jkappa1-3’     30            ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC
Hu Jkappa2-3’     31            ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTGCC
Hu Jkappa3-3’     32            ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC
Hu Jkappa4-3’     33            ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC
Hu Jkappa5-3’     34            ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC
Hu Jlambda1-3’    35            CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC
Hu Jlambda2-3’    36            CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC
Hu Jlambda3-3’    37            TCCTATCTGCTGACTCAGCCACC
Hu Jlambda3b-3’   38            TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC
Hu Jlambda4-3’    39            CACGTTATACTGACTCAACCGCC
Hu Jlambda5-3’    40            CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC
Hu Jlambda6-3’    41            AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
然后将PCR样品在1.3％琼脂糖凝胶上电泳。可以从凝胶中切下预期大小的(针对VH结构域为大约506bp，针对VL结构域为大约344bp)DNA条带，并使用本领域熟知的方法纯化。纯化的PCR产物可以连接于PCR克隆载体(TA载体，来自Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。在大肠杆菌转染及蓝/白色选择后，可以分离各个克隆的PCR产物。克隆的PCR产物然后使用本领域熟知的方法测序。
实施例6：在裸鼠中阻止肿瘤细胞生长的抗TR4抗体
将8W480(结肠直肠腺癌)肿瘤细胞系在体外保持在Leibovitz’sL-15培养基中，所述培养基中补加了胎牛血清，谷氨酰胺和抗生素，接受美国典型培养物保藏中心(ATCC)的指导。3-10传代的细胞用于体内研究。从T-150烧瓶中收获肿瘤细胞，用无菌PBS漂洗，然后以5×104个细胞/μl的密度再悬浮于无菌盐水中。将肿瘤细胞皮下种植于Swiss无胸腺小鼠的上背部或侧部，密度为107个细胞/位点，每只动物2个位点。在预防性(de novo)肿瘤模型中，在接种肿瘤细胞后24小时开始进行化疗剂和抗体处理。
如下进行抗体处理，使用包含来自T1014A04或T1014G03的VH和VL结构域(在该实施例中，后文称为T1014A04或T1014G03)的抗体：荷载剂量20mg/kg，注射肿瘤细胞后24小时开始静脉内注射，维持剂量10mg/kg，腹膜内注射。T1014A04的维持剂量在第4，7，10，14和16天给予。T1014G03的维持剂量在第4，7，10，14，22和25天给予。在该实验中使用Topotecan作为化疗剂。在用T1014A04的实验中，Topotecan的剂量和施用频率如下：在实验的第1，2，3，4，7，10，14，18，22，和25天腹膜内给予0.3或0.6mg/kg。在用T1014G03的实验中，Topotecan的剂量和施用频率如下：在实验的第1，2，3，4，7，10，13和16天腹膜内给予0.3或0.6mg/kg。
当T1014A04或T1014G03与Topotecan一起施用时，观测到肿瘤大小明显降低。单独用抗体处理在较晚的时间点可降低肿瘤生长(见图1-3)。
上述分析也可以用于测试一种以上抗TR4抗体对肿瘤细胞体内生长的处理作用。例如，对已经注射肿瘤细胞的动物可以用特异结合TR4的抗体和特异结合TR7的抗体处理。如上所述，这个实验可以在有或无一或多种化疗剂的情况下进行。在该实验的另一种变化中，本发明的抗体可以与TRAIL组合施用。这种组合治疗抑制肿瘤细胞生长的能力与单独用抗体处理的对比，可以使用上述方法加以分析，并对比组合治疗与单独用抗TR4或抗TR7抗体处理的结果。
实施例7：抗TR4抗体对人肝细胞的作用
人体原代肝细胞中T1014G03的作用通过测定激活或细胞存活力加以确定。将人肝细胞用15.6，62.5，250或1000ng/ml的TRAIL(氨基酸残基114-281，Biomol Research Laboratories公司，PlymouthMeeting，PA)，62.5，125，250或1000ng/ml的同种型对照mAb(hIgG1，CAT002)，或者62.5，125，250或1000ng/ml T1014G03处理。在处理6小时后测定caspase激活，在处理24小时后测定存活力。
Caspase活性利用caspase底物罗丹明缀合的DEVD使用荧光分析测定(例如得自Roche Molecular Biochemical(Indianapolis，IN)的同源荧光caspase分析)。细胞存活力使用ALAMAR BlueTM分析(Biosource International，Camarillo，CA)测定。在所有测试浓度，TRAIL均降低细胞存活力并在最高测试浓度诱导caspase活性。与TRAIL相反，发现在人体肝细胞中T1014G03处理不影响caspase或细胞存活力。
实施例8：RL95-2子宫瘤异种移植模型
这个实验的目的是检测当T1014G03用作单一治疗剂时，T1014G03是否能改变无胸腺小鼠中RL95-2肿瘤的生长模式。
RL95-2是一种子宫腺癌细胞系，当其皮下注射入无胸腺小鼠时形成固体肿瘤。已经证实RL95-2细胞表达TRAIL-R1，而且在体外在无任何敏化剂的情况下对T1014G03诱导的细胞编程性死亡敏感。基于这些发现，选择无胸腺小鼠中RL95-2模型测试T1014G03减小现存肿瘤的体内效力。在这些实验中，T1014F08用作阴性对照(huIgGλ)。T1014F08结合TRAIL-R1，但未观测到具有兴奋作用。
将对数期的RL95-2细胞SC注射入裸鼠中(107个细胞/小鼠)。3天后，测定肿瘤大小并将动物分为各个处理组(6只动物/处理组)，以便所有处理组均有5×5mm大小的肿瘤。将小鼠在第4，8，12和16天IP注射T1014G03或T1014F08抗体，剂量为0.2，2.0和20mg/kg。接受注射盐水的小鼠作为对照。从第3天至第43天，一周监测两次肿瘤大小。通过非参数Mann-Whitney测试分析数据，并表示出与第3天肿瘤大小相比肿瘤大小的增加倍数。与对照的和T1014F08处理的动物相比，用20mg/kg的T1014G03抗体处理明显延迟小鼠中肿瘤生长。0.2和2.0mg/kg的T1014G03抗体的作用与对照组无明显不同。数据表明了T1014G03抑制预先确定的肿瘤细胞的生长。
上述分析还可以用于测试用一种以上的抗TR4抗体处理对预先确定的肿瘤在体内生长的作用。例如，对已经注射肿瘤细胞的动物可以用特异结合TR4的抗体和特异性结合TR7的抗体处理。如上所述，这个实验可以在有或无一或多种化疗剂的情况下进行。在这个实验的另一种变化中，本发明的抗体可以与TRAIL组合施用。与单独用抗体处理相比，这种组合治疗抑制肿瘤生长的能力或者甚至消除肿瘤的能力，可以用上述方法分析，并对比组合治疗与单独的抗TR4抗体或抗TR7抗体处理的结果。
实施例9：原始肿瘤组织表达TRAIL R1(TR4)表达的免疫组织化学
将膀胱，乳腺，结肠，肝，肺，卵巢和胰腺的原始人体肿瘤组织用羊抗人TRAIL-R1多克隆抗体染色(R&D系统)。这种抗体染色用TRAIL-R1表达构建体转染的细胞，但不染色载体对照转染的细胞。染色数据示于下表7。在一些乳腺，结肠，肺和胃癌组织中观测到阳性染色。相反，来自同一器官的正常人体组织样品无特异性染色。另外，在正常人体和猴的肝和脾样品中观测到无特异性染色。
表7：人体肿瘤和正常组织的免疫组织化学染色
  肿瘤组织   评价#   阳性   +/-   阴性
  膀胱   2   0   1   1
  乳腺   2   1   0   1
  结肠   2   1   1   0
  肝   2   0   1   1
  肺   2   2   0   1
  卵巢   1   0   0   1
  胰腺   2   0   0   2
  胃   1   1   0   0
  合计   14   5   3   6
  正常组织
  膀胱   1   0   0   1
  乳腺   0   0   0   0
  结肠   1   0   0   1
  肝   1   0   1   0
  肺   1   0   0   1
  卵巢   1   0   0   1
  胰腺   1   0   0   1
  胃   0   0   0   0
  合计   6   0   1   5
实施例10：抗体的产生和纯化
以下实施例描述了可以用于生产本发明抗体的抗体的大规模生产和纯化方法。本领域技术人员应意识到可以对以下所述方案加以常规修改，例如针对柱的选择，柱，荷载，洗涤和洗脱缓冲液及pH。
细胞培养放大试验和抗体生产
在解冻细胞至放大试验至生产生物反应器中均使用无血清和无动物源生长培养基(HGS-NS0SF)。所述HGS-NS0SF生长培养基通过在无I-谷氨酰胺的1L CD杂交瘤培养基(Invitrogen/Lifetechnologies)中加入20mL/L GS补加物和1mL/L胆固醇(合成的)脂质浓缩物而制备。将培养基贮存在2-8℃直至使用。
从MCB瓶中解冻细胞
将大约16×106个细胞在37℃在水浴中解冻。将细胞移至T-225培养瓶中以产生大约50ml的使用体积，接种密度为大约3.0×105个细胞/ml。然后将培养瓶置于湿润的CO2温育器中在37℃用5％CO2温育4天。
在旋转瓶中首先扩展培养物
将培养物在无菌状态下扩展入500ml旋转瓶中以提供大约300ml的使用体积，接种细胞密度为大约2.2×105个细胞/ml。然后将旋转瓶置于湿润的CO2温育器中的磁性搅拌器上，在37℃用5％CO2温育4天。旋转瓶的搅拌速度为80rpm。
将培养物再次无菌扩入荧光3000ml的旋转瓶中，以提供大约1500ml的使用体积，接种细胞密度为大约2.2×105个细胞/ml。然后将旋转瓶置于湿润的CO2温育器中的磁性搅拌器上，在37℃用5％CO2温育4天。旋转瓶的搅拌速度为80rpm。如果积累了足够数量的细胞培养物以接种子种植生物反应器，进行第4步。否则，将培养物无菌扩展入多个3000ml旋转瓶中，进行共3-4次扩展，直至积累了足够量的细胞培养物以接种种植生物反应器。
种子培养物
将种子生物反应器装备2个叶轮以混合，一个溶解氧探针，一个温度探针，一个pH探针，无菌取样及其它系统。细胞培养过程的第一步是将HGS-NS0SF培养基加入生物反应器中。在HGS-NS0SF培养基温度达到37±0.5℃之后，通过加入N2和CO2稳定溶解氧(DO)和pH水平，以使溶解氧浓度降低为30±5％空气饱和度，并获得pH为7.20±0.10。搅拌速度为80rpm。集合的细胞培养物无菌移至含有无菌HGS-NS0SF生长培养基的15L种植反应器中，以产生具有接种细胞密度为大约2.2×105个细胞/ml的培养物。在培养过程期间，通过热屏蔽和冷却棒保持温度，氧浓度通过喷雾和表面通风而保持，pH通过加入CO2气控制以降低pH。培养时间为5-6天。生物反应器通风孔由疏水性0.2μm通风滤膜封闭。
生产培养物
生产生物反应器装备2个叶轮以混合，2个溶解氧探针，一个温度探针，2个pH探针，无菌取样及其它系统。将80L的HGS-NS0SF生长培养基无菌移至100L生产生物反应器中。在HGS-NS0SF生长培养基温度达到37±±0.5℃之后，通过加入N2和CO2稳定DO和pH水平，以使溶解氧浓度降低为30±5％空气饱和度，并获得pH为7.20±0.10。搅拌速度为45rpm。将15L种子培养物无菌移至生产生物反应器中，以产生具有接种细胞密度为大约2.2×105个细胞/ml的培养物。在培养过程期间，通过热交换器保持温度，氧浓度通过喷雾和表面通风而保持，pH通过加入CO2气控制以降低pH。在接种后第3天，当细胞密度达到大约1.0×106个细胞/ml时，将大约6L的HGS-NS0SF分批培养基加入生产生物反应器中。在加入培养基后第5天，收获含有抗体的生产培养物。
回收及纯化
收获细胞上清
细胞上清(例如表达本发明抗体的NSO细胞的培养上清)，在使用分批细胞培养方法的最终的生产生物反应器中最后加入培养基5或6天后收获。当抗体浓度达到至少400mg/L时，开始收获程序。在收获时，将生产生物反应器中细胞培养物的温度冷却至15℃，并在回收期间保持该温度。使用深度过滤以除去细胞和回收抗体。过滤顺序包括4.5μm，0.45μm和0.2μm滤孔大小。
在用交叉滤膜加压控制的运转期间保持恒定流速1.00L/分钟，直至15psi。将经0.2μm滤膜过滤的培养上清收集在一个程序包中并转移以进行纯化。纯化过程在22-26℃进行。
在MEP超CEL HCIC柱上层析
将培养上清加样于MEP超CELTM柱上，这是一种疏水性电荷相互作用层析(HCIC)，得自Ciphergen Biosystems，或者加样于在50mMTris，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的相等柱中。将MEP柱用25mM柠檬酸钠，0.15M氯化钠，pH6.4洗涤及用25mM柠檬酸钠，0.15M氯化钠，pH4.4洗脱。通过紫外线(UV)在280nm吸光度监测洗脱。收集峰值级分，通过A280和SDS-PAGE分析。集合适当的级分。
病毒失活
得自MEP柱的洗脱物用1M柠檬酸调节至pH3.4±0.2，并使其保持45-60分钟以失活病毒。然后将该溶液用1M Tris碱再调节为pH5.0。
在SP琼脂糖FF柱上层析
将得自MEP柱的失活的洗脱物用水稀释以进行注射(WFI)，至传导性为5mS/cm，加样于SP琼脂糖FF(阳离子交换层析，Amersham-Pharmacia)柱上，或者加样于用65mM乙酸钠，pH5.0平衡的相等柱上。用20mM乙酸钠，0.15M氯化钠，1.9％甘氨酸，pH7.1从SP柱中洗脱抗体。通过UV在280nm吸光度监测洗脱。收集峰值级分，通过A280和SDS-PAGE分析。集合适当的级分。
病毒去除过滤，渗滤和浓缩
将得自SP琼脂糖FF柱的洗脱物相继用0.2μm滤膜和Pall DV50病毒去除滤膜过滤。将DV50滤物置于30kD MW过滤膜设备中(Millipore Pellicon)，以浓缩为目标浓度35-40mg/ml，用10mM柠檬酸钠，1.9％甘氨酸，0.5％蔗糖，pH6.5渗滤。通过A280监测渗滤物。将渗滤的物质经0.2μm滤膜过滤并贮存于2-8℃直至24小时。
在Q琼脂糖FF柱上层析
将渗滤的TRM-1溶液经过Q琼脂糖FF柱(阴离子交换层析，Amersham-Pharmacia)或者用10mM柠檬酸钠，1.9％甘氨酸，0.5％蔗糖，pH6.5平衡的相等柱。在流经中收集抗体并通过A280监测。集合适当的级分，最终目标浓度为25mg/ml。
大批形成，过滤及大批药物填充
将聚山梨酸酯80(2％原液)经过0.2μm滤膜预先过滤，加入得自步骤7的抗体溶液至终浓度为0.02％。纯化的抗体在分层流动状态下经过0.2μm滤膜无菌过滤，并填充入聚丙烯容器中。
大批药物贮存
将大批药物在产物释放之前贮存于2-8℃(短期贮存)或者在低于-65℃贮存(长期贮存)。进行每批收获的未加工的生产生物反应器培养物的加工测试及在纯化过程期间的加工测试。将生物反应器无菌取样，并在培养过程的各个时期测试细胞密度，存活力和营养测定以保证用于纯化的物质的一致性。在每个步骤均监测纯化过程。通过目测显而易见。蛋白质浓度通过在280nm的吸光度测定。检测物质的pH值。例如通过SDS-PAGE和大小排阻层析检测纯度。进行ELISA以检测抗体结合其抗原的能力。还要监测抗体的生物活性。剩余DNA含量，内毒素水平及bioburden(抗体制备中存在的存活的生物体数目)均加以监测，并保持在标准的可接受水平或之下。例外，可以分析寡糖含量；抗体链的肽序列也可以使用N末端测序和肽作图分析。也可以进行对抗体稳定性的短期和长期研究。
应了解本发明可以与前述描述和实施例不同的方式进行。因此根据上述教导对本发明进行的各种修改和变化均在所附权利要求的范围内。
在本发明背景，详细描述和实施例中引用的文献(包括专利，专利申请，杂志文章，摘要，实验指导，书籍或其它揭示)的全部内容在此均并入参考。
另外，本文中以计算机和纸张形式提出的序列表均以其全文并入参考。
以下美国专利申请的全部内容(包括说明书，序列表和图表)在此并入参考：美国临时申请系列No.60/369860，2002年4月5日提请；No.60/341237，2001年12月20日提请；No.60/331310，2001年11月14日提请；No.60/331044，2001年11月7日提请；No.60/327364，2001年10月9日提请；No.60/323807，2001年9月21日提请；No.60/309176，2001年8月2日提请；No.60/294981，2001年6月4日提请；及No.60/293473，2001年5月25日提请。
序列表
<110>人体基因组科学有限公司
<120>免疫特异性结合TRAIL受体的抗体
<130>USLD0992
<140>Unassigned
<141>2002-05-07
<150>60/369,860
<151>2002-04-05
<150>60/341,237
<151>2001-12-20
<150>60/331,310
<151>2001-11-14
<150>60/331,044
<151>2001-11-07
<150>60/327,364
<151>2001-10-09
<150>60/323,807
<151>2001-09-21
<150>60/309,176
<151>2001-08-02
<150>60/294,981
<151>2001-06-04
<150>60/293,473
<151>2001-05-25
<160>66
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>468
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Met Ala Pro Pro Pro Ala Arg Val His Leu Gly Ala Phe Leu Ala Val
  1               5                  10                  15
Thr Pro Asn Pro Gly Ser Ala Ala Ser Gly Thr Glu Ala Ala Ala Ala
             20                  25                  30
Thr Pro Ser Lys Val Trp Gly Ser Ser Ala Gly Arg Ile Glu Pro Arg
         35                  40                  45
Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Pro Thr Ser Met Gly Gln His Gly Pro
     50                  55                  60
Ser Ala Arg Ala Arg Ala Gly Arg Ala Pro Gly Pro Arg Pro Ala Arg
 65                  70                  75                  80
Glu Ala Ser Pro Arg Leu Arg Val His Lys Thr Phe Lys Phe Val Val
                 85                  90                  95
Val Gly Val Leu Leu Gln Val Val Pro Ser Ser Ala Ala Thr Ile Lys
            100                 105                 110
Leu His Asp Gln Ser Ile Gly Thr Gln Gln Trp Glu His Ser Pro Leu
        115                 120                 125
Gly Glu Leu Cys Pro Pro Gly Ser His Arg Ser Glu Arg Pro Gly Ala
    130                 135                 140
Cys Asn Arg Cys Thr Glu Gly Val Gly Tyr Thr Asn Ala Ser Asn Asn
145                 150                 155                 160
Leu Phe Ala Cys Leu Pro Cys Thr Ala Cys Lys Ser Asp Glu Glu Glu
                165                 170                 175
Arg Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Ala Cys Gln Cys Lys Pro
            180                 185                 190
Gly Thr Phe Arg Asn Asp Asn Ser Ala Glu Met Cys Arg Lys Cys Ser
        195                 200                 205
Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp
    210                 215                 220
Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Asn Gly His Asn Ile
225                 230                 235                 240
Trp Val Ile Leu Val Val Thr Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Val Ala
                245                 250                 255
Val Leu Ile Val Cys Cys Cys Ile Gly Ser Gly Cys Gly Gly Asp Pro
            260                 265                 270
Lys Cys Met Asp Arg Val Cys Phe Trp Arg Leu Gly Leu Leu Arg Gly
        275                 280                 285
Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala His Asn Glu Ile Leu Ser Asn Ala Asp
    290                 295                 300
Ser Leu Ser Tnr Phe Val Ser Glu Gln Gln Met Glu Ser Gln Glu Pro
305                 310                 315                 320
Ala Asp Leu Thr Gly Val Thr Val Gln Ser Pro Gly Glu Ala Gln Cys
                325                 330                 335
Leu Leu Gly Pro Ala Glu Ala Glu Gly Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu
            340                 345                 350
Val Pro Ala Asn Gly Ala Asp Pro Thr Glu Thr Leu Met Leu Phe Phe
        355                 360                 365
Asp Lys Phe Ala Asn Ile Val Pro Phe Asp Ser Trp Asp Gln Leu Met
    370                 375                 380
Arg Gln Leu Asp Leu Thr Lys Asn Glu Ile Asp Val Val Arg Ala Gly
385                 390                 395                 400
Thr Ala Gly Pro Gly Asp Ala Leu Tyr Ala Met Leu Met Lys Trp Val
                405                 410                 415
Asn Lys Thr Gly Arg Asn Ala Ser Ile His Thr Leu Leu Asp Ala Leu
            420                 425                 430
Glu Arg Met Glu Glu Arg His Ala Lys Glu Lys Ile Gln Asp Leu Leu
        435                 440                 445
Val Asp Ser Gly Lys Phe Ile Tyr Leu Glu Asp Gly Thr Gly Ser Ala
    450                 455                 460
Val Ser Leu Glu
465
<210>2
<211>299
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Met Gln Gly Val Lys Glu Arg Phe Leu Pro Leu Gly Asn Ser Gly Asp
  1               5                  10                  15
Arg Ala Pro Arg Pro Pro Asp Gly Arg Gly Arg Val Arg Pro Arg Thr
             20                  25                  30
Gln Asp Gly Val Gly Asn His Thr Met Ala Arg Ile Pro Lys Thr Leu
         35                  40                  45
Lys Phe Val Val Val Ile Val Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Ala Tyr
     50                  55                  60
Ser Ala Thr Thr Ala Arg Gln Glu Glu Val Pro Gln Gln Thr Val Ala
 65                  70                  75                  80
Pro Gln Gln Gln Arg His Ser Phe Lys Gly Glu Glu Cys Pro Ala Gly
                 85                  90                  95
Ser His Arg Ser Glu His Thr Gly Ala Cys Asn Pro Cys Thr Glu Gly
            100                 105                 110
Val Asp Tyr Thr Ash Ala Ser Asn Asn Glu Pro Ser Cys Phe Pro Cys
        115                 120                 125
Thr Val Cys Lys Ser Asp Gln Lys His Lys Ser Ser Cys Thr Met Thr
    130                 135                 140
Arg Asp Thr Val Cys Gln Cys Lys Glu Gly Thr Phe Arg Asn Glu Asn
145                 150                 155                 160
Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Ser Arg Cys Pro Ser Gly Glu Val
                165                 170                 175
Gln Val Ser Asn Cys Thr Ser Trp Asp Asp Ile Gln Cys Val Glu Glu
            180                 185                 190
Phe Gly Ala Asn Ala Thr Val Glu Thr Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met
        195                 200                 205
Asn Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Asn
    210                 215                 220
Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr
225                 230                 235                 240
Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr Ser
                245                 250                 255
Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr Ser Pro
            260                 265                 270
Gly Thr Pro Ala Ser Ser His Tyr Leu Ser Cys Thr Ile Val Gly Ile
        275                 280                 285
Ile Val Leu Ile Val Leu Leu Ile Val Phe Val
    290                 295
<210>3
<211>411
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
  1               5                  10                  15
Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro
             20                  25                  30
Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu
         35                  40                  45
Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln
     50                  55                  60
Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu
65                  70                  75                  80
Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser
                 85                  90                  95
Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe
            100                 105                 110
Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro
        115                 120                 125
Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe
    130                 135                 140
Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys
145                 150                 155                 160
Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile
                165                 170                 175
Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala
            180                 185                 190
Ala Val Val Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp
        195                 200                 205
Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly
    210                 215                 220
Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp
225                 230                 235                 240
Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro
                245                 250                 255
Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn
            260                 265                 270
Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala
        275                 280                 285
Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp
    290                 295                 300
Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val
305                 310                 315                 320
Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp
                325                 330                 335
Ash Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr
            340                 345                 350
Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala
        355                 360                 365
Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu
    370                 375                 380
Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met
385                 390                 395                 400
Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser
                405                 410
<210>4
<211>386
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
Met Gly Leu Trp Gly Gln Ser Val Pro Thr Ala Ser Ser Ala Arg Ala
  1               5                  10                  15
Gly Arg Tyr Pro Gly Ala Arg Thr Ala Ser Gly Thr Arg Pro Trp Leu
             20                  25                  30
Leu Asp Pro Lys Ile Leu Lys Phe Val Val Phe Ile Val Ala Val Leu
         35                  40                  45
Leu Pro Val Arg Val Asp Ser Ala Thr Ile Pro Arg Gln Asp Glu Val
     50                  55                  60
Pro Gln Gln Thr Val Ala Pro Gln Gln Gln Arg Arg Ser Leu Lys Glu
 65                  70                  75                  80
Glu Glu Cys Pro Ala Gly Ser His Arg Ser Glu Tyr Thr Gly Ala Cys
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Asn Pro Cys Thr Glu Gly Val Asp Tyr Thr Ile Ala Ser Asn Asn Leu
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Pro Ser Cys Leu Leu Cys Thr Val Cys Lys Ser Gly Gln Thr Asn Lys
        115                 120                 125
Ser Ser Cys Thr Thr Thr Arg Asp Thr Val Cys Gln Cys Glu Lys Gly
    130                 135                 140
Ser Phe Gln Asp Lys Asn Ser Pro Glu Met Cys Arg Thr Cys Arg Thr
145                 150                 155                 160
Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Ser Asn Cys Thr Pro Arg Ser
                165                 170                 175
Asp Ile Lys Cys Lys Asn Glu Ser Ala Ala Ser Ser Thr Gly Lys Thr
            180                 185                 190
Pro Ala Ala Glu Glu Thr Val Thr Thr Ile Leu Gly Met Leu Ala Ser
        195                 200                 205
Pro Tyr His Tyr Leu Ile Ile Ile Val Val Leu Val Ile Ile Leu Ala
    210                 215                 220
Val Val Val Val Gly Phe Ser Cys Arg Lys Lys Phe Ile Ser Tyr Leu
225                 230                 235                 240
Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Glu Arg Val His Arg
                245                 250                 255
Val Leu Phe Arg Arg Arg Ser Cys Pro Ser Arg Val Pro Gly Ala Glu
            260                 265                 270
Asp Asn Ala Arg Asn Glu Thr Leu Ser Asn Arg Tyr Leu Gln Pro Thr
        275                 280                 285
Gln Val Ser Glu Gln Glu Ile Gln Gly Gln Glu Leu Ala Glu Leu Thr
    290                 295                 300
Gly Val Thr Val Glu Ser Pro Glu Glu Pro Gln Arg Leu Leu Glu Gln
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Ala Glu Ala Glu Gly Cys Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Val Asn
                325                 330                 335
Asp Ala Asp Ser Ala Asp Ile Ser Thr Leu Leu Asp Ala Ser Ala Thr
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Leu Glu Glu Gly His Ala Lys Glu Thr Ile Gln Asp Gln Leu Val Gly
        355                 360                 365
Ser Glu Lys Leu Phe Tyr Glu Glu Asp Glu Ala Gly Ser Ala Thr Ser
    370                 375                 380
Cys Leu
385
<210>5
<211>401
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>5
Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile
  1               5                  10                  15
Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp
             20                  25                  30
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Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro
     50                  55                  60
Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu
                 85                  90                  95
Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr
            100                 105                 110
Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe
        115                 120                 125
Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg
    130                 135                 140
Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys
145                 150                 155                 160
Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys
                165                 170                 175
Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr
            180                 185                 190
Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg
        195                 200                 205
Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val
    210                 215                 220
Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
225                 230                 235                 240
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu
                245                 250                 255
Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln
            260                 265                 270
Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala
        275                 280                 285
Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly
    290                 295                 300
Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys
305                 310                 315                 320
Pro Ser Asp Gin Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn
                325                 330                 335
Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser
            340                 345                 350
Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr
        355                 360                 365
Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu
    370                 375                 380
Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys
385                 390                 395                 400
Leu
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>6
caggtgcagc tggtgcagtc tgg                     23
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>7
caggtcaact taagggagtc tgg                     23
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>8
gaggtgcagc tggtggagtc tgg                     23
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>9
caggtgcagc tgcaggagtc ggg                     23
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>10
gaggtgcagc tgttgcagtc tgc                     23
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>11
caggtacagc tgcagcagtc agg                     23
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>12
tgaggagacg gtgaccaggg tgcc                    24
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>13
tgaagagacg gtgaccattg tccc                     24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>14
tgaggagacg gtgaccaggg ttcc                     24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>15
tgaggagacg gtgaccgtgg tccc                     24
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>16
gacatccaga tgacccagtc tcc                      23
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>17
gatgttgtga tgactcagtc tcc                      23
<210>18
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>18
gatattgtga tgactcagtc tcc                     23
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>19
gaaattgtgt tgacgcagtc tcc                     23
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>20
gacatcgtga tgacccagtc tcc                     23
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>21
gaaacgacac tcacgcagtc tcc                     23
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>22
gaaattgtgc tgactcagtc tcc                     23
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>23
cagtctgtgt tgacgcagcc gcc                     23
<210>24
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>24
cagtctgccc tgactcagcc tgc                     23
<210>25
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>25
tcctatgtgc tgactcagcc acc                     23
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>26
tcttctgagc tgactcagga ccc                     23
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>27
cacgttatac tgactcaacc gcc                     23
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>28
caggctgtgc tcactcagcc gtc                     23
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>29
aattttatgc tgactcagcc cca                     23
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>30
acgtttgatt tccaccttgg tccc                    24
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>31
acgtttgatc tccagcttgg tccc                    24
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>32
acgtttgata tccactttgg tccc                    24
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>33
acgtttgatc tccaccttgg tccc                     24
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>34
acgtttaatc tccagtcgtg tccc                     24
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>35
cagtctgtgt tgacgcagcc gcc                      23
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>36
cagtctgccc tgactcagcc tgc                      23
<210>37
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>37
tcctatgtgc tgactcagcc acc                      23
<210>38
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>38
tcttctgagc tgactcagga ccc                     23
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>39
cacgttatac tgactcaacc gcc                     23
<210>40
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>40
caggctgtgc tcactcagcc gtc                     23
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增VH和VL结构域的PCR引物
<400>41
aattttatgc tgactcagcc cca                     23
<210>42
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1014A04 scFv
<400>42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Lys Arg Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly Asp Ser Phe Asn Ala Tyr
             20                  25                  30
Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Trp Phe Asn Pro Asp Ser Gly Thr Ala Asp Ser Ala Gln Lys Phe
     50                  55                  60
His Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe
 65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Val Arg Gln His Arg Gly Asn Thr Phe Ala Pro Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Thr
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Gly Val Asn Gln Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Leu Thr Val Leu Gly
                245
<210>43
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1014G03 scFv
<400>43
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Met Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Val Ser Gly Asp Thr Phe Thr Ala Tyr
     20                  25                  30
Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Trp Phe Asn Pro Ile Ser Gly Thr Ala Gly Ser Ala Glu Lys Phe
     50                  55                  60
Arg Gly Arg Val Ala Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Thr Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gln His Arg Gly Asn Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asp Ile Gly Ala Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Val Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Gln Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Asn Ser Tyr Gln Gly Tyr Asn Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Leu Gly
                245
<210>44
<211>244
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1014A02 scFv
<400>44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asp Tyr
             20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
Gly Ser Ile Asp Tyr Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
     50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Lys Lys Gln Phe Pro Leu
 65                  70                  75                  80
Lys Ile Asp Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
                 85                  90                  95
Arg Gln Leu Gly Arg Ile Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly Ser Ser Ser
145                 150                 155                 160
Asn Ile Gly Gly Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Ala Thr
                165                 170                 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
            180                 185                 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
        195                 200                 205
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr
    210                 215                 220
Trp Asp Asp Ser Arg Gly Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225                 230                 235                 240
Thr Val Leu Gly
<210>45
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1014A12 scFv
<400>45
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Lys Arg Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly Asp Ser Phe Thr Ala Tyr
             20                  25                  30
Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Trp Phe Asn Pro Asp Ser Gly Thr Ala Asp Ser Ala Gln Lys Phe
     50                  55                  60
His Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe
 65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Val Arg Gln His Arg Gly Asn Thr Phe Ala Pro Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val
    130                 135                 140
Ser Gly Pro Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile His Asp Val Ser Arg Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Leu Gly
                245
<210>46
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1014B01 scFv
<400>46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly Asp Thr Phe Ala Ala Tyr
             20                  25                  30
Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Trp Phe Asn Pro Asn Ser Gly Thr Ala Asp Ser Ser Gln Lys Phe
     50                  55                  60
His Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gln His Arg Ser Asn Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asp Ile Gly Ala Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Phe Gln Gln His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile Ser Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Leu Gly
                245
<210>47
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1014B11 scFv
<400>47
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly Asp Ser Phe Thr Ala Tyr
             20                  25                  30
Phe Ile His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Trp Phe Asn Pro Ile Ser Gly Thr Ala Gly Ser Pro Gln Lys Phe
     50                  55                  60
His Gly Arg Val Ala Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Ala Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gln His His Ser Asn Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Ser Tyr Thr Thr Ser Asn Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Leu Thr Val Leu Gly
                245
<210>48
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1014F11 scFv
<400>48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Val Ser Gly Asp Thr Phe Thr Ala Tyr
             20                  25                  30
Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Trp Phe Asn Pro Ile Ser Gly Thr Ala Gly Ser Ala Ala Arg Phe
     50                  55                  60
Arg Gly Arg Val Ala Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Thr Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gln His Arg Gly Asn Thr Phe Asp Pro Trp Gly Lys Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Met Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Leu Thr Val Leu Gly
                245
<210>49
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1014G04 scFv
<400>49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Lys Arg Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly Asp Ser Phe Thr Ala Tyr
             20                  25                  30
Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Trp Phe Asn Pro Asp Ser Gly Thr Ala Asp Ser Ala Gln Lys Phe
     50                  55                  60
His Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe
 65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Val Arg Gln His Arg Gly Asn Thr Phe Ala Pro Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Gly Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Arg Leu Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Leu Gly
                245
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<212>PRT
<213>人工序列
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<220>
<221>SITE
<222>(250)
<223>Xaa等于Gly或Ser
<400>50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Lys Cys Asn Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly Thr Gly
             20                  25                  30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
         35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Lys Pro Ser
     50                  55                  60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Val Ser Met Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe
 65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
                 85                  90                  95
Cys Val Arg Glu Trp Ala Asn Gly Asp His Trp Ser Ala Phe Asp Leu
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Val Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Pro Ser Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Pro
145                 150                 155                 160
Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Thr Val Asn Trp Tyr
                165                 170                 175
Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asp
            180                 185                 190
Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
        195                 200                 205
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
    210                 215                 220
Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ile Gly Tyr Val Phe
225                 230                 235                 240
Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Xaa
                245                 250
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1015A07 scFv
<400>51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly Asp Ser Phe Thr Ala Tyr
             20                  25                  30
Phe Ile His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Trp Phe Asn Pro Ile Ser Gly Thr Ala Asp Ser Pro Gln Lys Phe
     50                  55                  60
His Gly Arg Val Ala Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Ala Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gln His His Ser Asn Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Met
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Ala Val Thr Asn Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Asn Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Leu Gly
                245
<210>52
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1015E01 scFv
<220>
<221>SITE
<222>(4)
<223>Xaa等于Val或Leu
<220>
<221>SITE
<222>(5)
<223>Xaa等于Ala或Val
<220>
<221>SITE
<222>(7)
<223>Xaa等于Ala或ser
<220>
<221>SITE
<222>(10)
<223>Xaa等于Asp或Glu
<220>
<221>SITE
<222>(12)
<223>Xaa等于Asn或Lys
<220>
<221>SITE
<222>(23)
<223>Xaa Met或Lys
<400>52
Glu Val Gln Xaa Xaa Gln Xaa Gly Ala Xaa Val Xaa Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Xaa Ile Ser Gly Asp Ser Phe Thr Ala Tyr
             20                  25                  30
Phe Ile His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Trp Phe Asn Pro Ile Ser Gly Thr Ala Asp Ser Pro Gln Lys Phe
     50                  55                  60
His Gly Arg Val Ala Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Ala Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gln His His Ser Asn Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Met
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Ala Val Thr Asn Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Asn Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Leu Gly
                245
<210>53
<211>249
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T1006F07 scFv
<400>53
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Glu Pro Ser Phe Gln Gln Trp Gly His Tyr Ser Tyr Gly Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Val
    130                 135                 140
Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Ala Ala Arg
145                 150                 155                 160
Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Ser Trp Tyr
                165                 170                 175
Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn
            180                 185                 190
Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly
        195                 200                 205
Asn Thr Ala Thr Leu Lys Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala
    210                 215                 220
Asp Tyr Tyr Cys Leu Ala Trp Asp Ser Ser Ala Asp Trp Val Phe Gly
225                 230                 235                 240
Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
                245
<210>54
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1014A04 scFv的DNA
<400>54
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgac gtgaagaggc ctggggcctc agtgaaggtc  60
tcctgcaaga tttctggaga cagcttcaac gcctacttta ttcactgggt gcgtcaggcc  120
cctggacagg ggcttgagtg gatgggatgg ttcaaccctg acagtggtac cgcagactct  180
gcacagaagt ttcacggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccagcag tactgccttc  240
ttggagctga gcagactgag atctgacgac acagccgtgt attactgtgt gagacaacat  300
cggggtaaca cgttcgcccc ctggggccgg gggacaatgg tcaccgtctc gagtggaggc  360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtg cacagtctgt gctgactcag  420
ccaccctccg cgtccgggtc tcctggacag tcagtcacca tctcctgcac tggaaccacc  480
agtgacgttg gtggttataa ctatgtctcc tggtaccaac agcacccagg caaagccccc  540
aaactcatga tttatggggt caatcagcgg ccctcagggg tccctgatcg cttctctggc  600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc gtctctgggc tccaggctga ggatgaggct  660
gattattact gcagttcata tgcaggcagc aacaattggg tgttcggcgg agggaccaag  720
ctgaccgtcc taggt                                                   735
<210>55
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1014G03 scFv的DNA
<400>55
gaggtccagc tggtacagtc tggagctgaa gtgaagatgc ctggggcctc agtcaagctc  60
tcctgcaggg tttctggaga caccttcacc gcctacttca ttcactgggt gcgacaggcc  120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ttcaacccta tcagtggcac cgcaggctct  180
gctgagaagt ttcgcggcag ggtcgccatg accagggaca cgtccatcag cactgcctac  240
atggaattga acaggctgac atttgacgac acggccgtct attattgtgc gagacaacat  300
cgggggaata cgtttgaccc ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc gagtggaggc  360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtg cacagtctgc cctgactcag  420
cctgcctccg tgtctgggtc tcctggacag tcgatcacca tctcctgcac tggaaccagc  480
agtgacattg gtgcttataa gtatgtctcc tggtatcaac aacacccagg caaagccccc  540
aaacttgtga tttatgaggt cagtaatcgg ccctcagggg tttccagtcg cttctctggc  600
tccaagtctg gccagacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga cgacgaggct  660
gattattact gcaactcata tcaaggttac aacacgtggg tgttcggcgg agggaccaag  720
gtcaccgtcc taggt                                                   735
<210>56
<211>732
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1014A02 scFv的DNA
<400>56
caggtgcagc tgcaggagtc cggcccagga ctggtgaagc cctcggagac cctgtccctc  60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt gattactact ggagttgggt ccggcagtcc  120
cccgggaagg gactggagtg gattgggtct atcgattatg ccggcagcac caattacaac  180
ccgtccctca agagccgagt caccatgaca atagacaagt ccaagaagca attccccctg  240
aagatagatt ctgtgaccgc cgcagatacg gccatgtatt actgtgcgag acaacttggg  300
cggatttctg actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcgagtgg aggcggcggt  360
tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga agtgcacttt cctatgtgct gactcagcca  420
ccctcagcgt ctgggacccc cgggcagagg gtcaccatct cttgtgctgg aagcagctcc  480
aacatcggag gaaatactgt aaactggtac cagcaactcc cagcaacggc ccccaaactc  540
ctcatctata gtaataatca gcggccctca ggggtccctg accgattctc tggctccaag  600
tctggcacgt cagcctccct ggccatcagt gggctccagt ctgaggatga ggctgattat  660
tactgtgcaa catgggatga cagtcggggt ggttgggtgt tcggcggagg gaccaagctg  720
accgtcctag gt                                                      732
<210>57
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1014A12 scFv的DNA
<400>57
gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgac gtgaagaggc ctggggcctc agtgaaggtc  60
tcctgcaaga tttctggaga cagcttcacc gcctacttta ttcactgggt gcgtcaggcc  120
cctggacagg ggcttgagtg gatgggatgg ttcaaccctg acagtggtac cgcagactct  180
gcacagaagt ttcacggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccagcag tactgccttc  240
ttggagctga gcagactgag atctgacgac accgccgtat attactgtgt gagacaacat  300
cggggtaaca cgttcgcccc ctggggccgg gggacaatgg tcaccgtctc gagtggaggc  360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtg cacagtctgc cctgactcag  420
cctgcctccg tgtctggtcc tcctggacag tcgatcacca tctcctgcac tggatccagc  480
agtgacgttg gtggttataa gtatgtctcc tggtaccaac aacacccagg caaagccccc  540
aaactcatta ttcatgatgt cagtaggcgg ccctcagagg tttctagtcg cttctctggc  600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggacgaggct  660
gagtactact gcagctcata ttcaagcacc aactcttggg tgttcggcgg agggaccaag  720
gtcaccgtcc taggt                                                   735
<210>58
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1014B01 scFv的DNA
<400>58
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc  60
tcctgcaaga tttctggaga caccttcgcc gcctacttta ttcactgggt gcgacaggcc  120
cctggacaag ggctggagtg gatgggatgg ttcaacccta acagtggtac cgcagactct  180
tcacagaagt ttcacggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cactgcctac  240
atggagttga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attattgtgc gagacaacat  300
cggtctaata cgttcgaccc ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc gagtggaggc  360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtg cacagtctgt cgtgacgcag  420
ccgccctcag tgtctgggtc tcctggacag tcagtcacca tctcctgcac tggaaccagc  480
agtgacattg gtgcttataa ttatgtctcc tggttccagc agcacccagg taaagccccc  540
aaactcataa tttctgaggt cagtaagcgg ccctcagggg tccctgatcg cctctctggc  600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc gtctccgggc tccaggctga ggatgaggct  660
gattattact gcggctcata tgcaggcagc aatatttggg tgttcggcgg agggaccaag  720
gtcaccgtcc taggt                                                   735
<210>59
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1014B11 scFv的DNA
<400>59
gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtaaaggtc  60
tcctgcaaga tttctggaga cagcttcacc gcctatttta ttcactggct gcgacaggcc  120
cctggagaag ggcttgagtg gatgggatgg ttcaatccta tcagcggtac cgccggctct  180
ccacagaagt ttcacggcag ggtcgccatg acccgtgaca cgtccatcag tactgcctac  240
atggagttga ccaggctggc atctgacgac acggccattt attattgtgc gagacaacat  300
cactctaata cgttcgaccc ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtggaggc  360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtg cacaatctgc cctgactcag  420
cctgcctccg tgtctgggtc tcctggacag tcgatcacca tctcctgcac tggaaccaac  480
agtgacgttg gtggttacaa ctatgtctcc tggtaccaac aacacccagg caaagccccc  540
aaactcatga tttatgaggt caataatcgg ccctcagggg tttctaatcg cttctctggc  600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga cgacgaggct  660
gattattact gcagctcata tacaaccagc aacacttggg tgttcggcgg agggaccaag  720
ctgaccgtcc taggt                                                   735
<210>60
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1014F08 scFv的DNA
<400>60
gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtcaagctc  60
tcctgcaggg tttctggaga caccttcacc gcctacttca ttcactgggt gcgacaggcc  120
cctggacaag ggcctgagtg gatgggatgg ttcaacccta tcagtggcac cgcaggctct  180
gctgcgaggt ttcgcggcag ggtcgccatg accagggaca cgtccatcag cactgcctac  240
atggaattga acaggctgac atttgacgac acggccgtct attattgtgc gagacaacat  300
cgggggaata cctttgaccc ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagtggaggc  360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtg cactgcctgt gctgactcag  420
ccaccctccg cgtccgggtc tcctggacag tcagtcacca tctcctgcac tggaaccagc  480
agtgacgttg gtggttataa gtatgtctcc tggtaccaac agcacccagg caaagccccc  540
aaactcatga tttatgaggt cagtatgcgg ccgtcagggg tcccggatcg cttctctggc  600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc gtctctgggc tccaggctga ggatgaggct  660
gattattact gcgcctcata tgcaggcagc aacaattggg tgttcggcgg agggaccaag  720
ctgaccgtcc taggt                                                   735
<210>61
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1014G04 scFv的DNA
<400>61
gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgac gtgaagaggc ctggggcctc agtgaaggtc  60
tcctgcaaga tttctggaga cagcttcacc gcctacttta ttcactgggt gcgtcaggcc  120
cctggacagg ggcttgagtg gatgggatgg ttcaaccctg acagtggtac cgcagactct  180
gcacagaagt ttcacggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccagcag tactgccttc  240
ttggagctga gcagactgag atctgacgac accgccgtat attactgtgt gagacaacat  300
cggggtaaca cgttcgcccc ctggggcagg ggaaccctgg tcaccgtctc gagtggaggc  360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtg cacagcctgt gctgactcag  420
cccccctccg cgtccgggtc gcctggacag tcagtcacca tctcctgcac tggaaccagc  480
agtgacgttg gtagttatga gtatgtctcc tggtaccaac aacacccagg caaagccccc  540
agactcatga tttctgaggt caataagcgg ccctcagggg tccctaatcg cttctctggc  600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc gtctctgggc tccaggctga cgatgaggct  660
gattactact gcagctcata tgcaggcagc aacaattggg tgttcggcgg agggaccaag  720
gtcaccgtcc taggt                                                   735
<210>62
<211>750
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1015A02 scFv的DNA
<400>62
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc  60
aaatgcaatg tctctggtgg ctccattggt actggtgatt actattggag ttggatccgc  120
cagcccccag ggaagggcct ggagtggatt ggctacatcc atagcagtgg gagcacttat  180
tacaagccgt ccctcaggag tcgacttacc gtatcgatgg atacgtccag gaatcagttc  240
tccctgaagc tgacctctgt gactgccgca gacacggcac tgtattactg tgtcagagag  300
tgggccaatg gtgaccactg gagtgcattt gacctctggg gccaaggaac cctggtcacc  360
gtctcgagtg gaggcggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg aagtgcacag  420
gctgtgctga ctcagccgtc ctcagcgtct gggacccccg ggcagagggt cactatcccc  480
tgttctggaa gcagctccaa catcggaggt aatactgtta attggtacca acaactccca  540
ggaacggccc ccaaactcct catctatggt aatgatcagc ggccgtcagg ggtccctgac  600
cgattctctg gctccaagtc tggcacctca gcctccctgg ccatcactgg gctccagtct  660
gaggatgagg ctgattatta ctgtgcagca tgggatgaca gcctgattgg ttatgtcttc  720
ggaactggga cccagctcac cgttttargt                                   750
<210>63
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1015A07 scFv的DNA
<400>63
gaagtgcagc tggcgcagtc tggcgctgag gtgaataagc ctggggcctc agtaaaggtc  60
tcctgcaaga tttctggaga cagcttcacc gcctatttta ttcactggct gcgacaggcc  120
cctggagaag ggcttgagtg gatgggatgg ttcaatccta tcagcggtac cgccgactct  180
ccacagaagt ttcacggcag ggtcgccatg acccgtgaca cgtccatcag tactgcctac  240
atggagttga ccaggctggc atctgacgac acggccattt attattgtgc gagacaacat  300
cactctaata cgttcgaccc ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtggaggc  360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtg cacagtctgc cctgactcag  420
cctgcctcca tgtctgggtc tcctggacag tcgatcacca tctcctgcac tggaaccagc  480
agtgacgttg gtggttataa ctatgtctcc tggtaccaac agcacccagg caaagccccc  540
aaactcatga tttatgcggt cactaatcgg ccctcagggg tttctaatcg cttctctgcc  600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggacgaggct  660
gattattact gcagctcata tacaagcagc aacacttggg tgttcggcgg agggaccaag  720
gtcaccgtcc taggt                                                   735
<210>64
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1015E01 scFv的DNA
<400>64
gaagtgcags tggygcagkc tggsgctgas gtgaakaagc ctggsgcctc agtaaaggtc  60
tcctgcawga tttctggaga cagcttcacc gcctatttta ttcactggct gcgacaggcc  120
cctggagaag ggcttgagtg gatgggatgg ttcaatccta tcagcggtac cgccgactct  180
ccacagaagt ttcacggcag ggtcgccatg acccgtgaca cgtccatcag tactgcctac  240
atggagttga ccaggctggc atctgacgac acggccattt attattgtgc gagacaacat  300
cactctaata cgttcgaccc ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtggaggc  360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtg cacagtctgc cctgactcag  420
cctgcctcca tgtctgggtc tcctggacag tcgatcacca tctcctgcac tggaaccagc  480
agtgacgttg gtggttataa ctatgtctcc tggtaccaac agcacccagg caaagccccc  540
aaactcatga tttatgcggt cactaatcgg ccctcagggg tttctaatcg cttctctgcc  600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggacgaggct  660
gattattact gcagctcata tacaagcagc aacacttggg tgttcggcgg agggaccaag  720
gtcaccgtcc taggt                                                   735
<210>65
<211>747
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码T1006F07 scFv的DNA
<400>65
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc  60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct  120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac  180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat  240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaacca  300
tcctttcagc agtggggcca ctactcctac ggtatggacg tctggggcca ggggacaatg  360
gtcaccgtct cgagtggagg cggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggaagt  420
gcacagtctg tgctgactca gccaccgtca gtgtccgtgt ccccaggaca ggcagccaga  480
atcacctgct ctggagataa gttgggggat aaatatgctt cgtggtatca acagaggcca  540
ggccagtccc ctgttttggt catctatcaa gataacaaaa ggccctcagg gatccctgag  600
cgattctctg gctccaattc tgggaacaca gccactctga aaatcagcgg gacccaggct  660
atggatgagg ctgactatta ctgtctggcg tgggacagca gcgctgattg ggtcttcggc  720
ggagggacca aggtcaccgt cctaggt                                      747
<210>66
<211>281
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>66
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
  1               5                  10                  15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
             20                  25                  30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
         35                  40                  45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
     50                  55                  60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
 65                  70                  75                  80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
                 85                  90                  95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
            100                 105                 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
        115                 120                 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
    130                 135                 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
145                 150                 155                 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
                165                 170                 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
            180                 185                 190
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
        195                 200                 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
    210                 215                 220
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
225                 230                 235                 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
                245                 250                 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
            260                 265                 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
        275                 280

Claims (38)

1.一种分离的抗体，其包括6个CDR，其中所述VH结构域的CDR1由SEQ ID NO：43的第26-35位氨基酸残基组成，所述VH结构域的CDR2由SEQ ID NO：43的第50-66位氨基酸残基组成，所述VH结构域的CDR3由SEQ ID NO：43的第99-107位氨基酸残基组成，所述VL结构域的CDR1由SEQ ID NO：43的第157-170位氨基酸残基组成，所述VL结构域的CDR2由SEQ ID NO：43的第186-192位氨基酸残基组成，所述VL结构域的CDR3由SEQ ID NO：43的第225-234位氨基酸残基组成，其中所述抗体免疫特异性结合TR4。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体选自以下成员组成的组：
(a)完整免疫球蛋白分子；
(b)scFv；
(c)单克隆抗体；
(d)人抗体；
(e)嵌合抗体；
(f)人源化抗体；
(g)Fab片段；
(h)Fab’片段；
(i)F(ab’)2；
(j)Fv；和
(k)二硫键连的Fv。
3.权利要求1的抗体，其包含选自以下一组的一个重链免疫球蛋白恒定结构域：
(a)人IgM恒定结构域；
(b)人IgG1恒定结构域；
(c)人IgG2恒定结构域；
(d)人IgG3恒定结构域；
(e)人IgG4恒定结构域；和
(f)人IgA恒定结构域。
4.权利要求1的抗体，其包含选自以下一组的一个轻链免疫球蛋白恒定结构域：
(a)人Igκ恒定结构域；和
(b)人Igλ恒定结构域。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体与一种可检测标记缀合。
6.权利要求5的抗体，其中所述可检测标记是一种放射标记。
7.权利要求6的抗体，其中所述放射标记是125I，131I，111In，90Y，99Tc，177Lu，166Ho，或153Sm。
8.权利要求5的抗体，其中所述可检测标记是一种酶，荧光标记，发光标记或生物发光标记。
9.权利要求1的抗体，其中所述抗体是生物素酰化的。
10.权利要求1的抗体，其中所述抗体缀合于一种治疗剂或胞毒剂。
11.权利要求10的抗体，其中所述治疗剂或胞毒剂选自以下成员组成的组：
(a)抗代谢物；
(b)烷化剂；
(c)抗生素；
(d)生长因子；
(e)细胞因子；
(f)抗血管发生剂；
(g)抗有丝分裂剂；
(h)anthracycline；
(i)毒素；和
(j)细胞编程性死亡制剂。
12.权利要求1的抗体，其中所述抗体附着于一种固体支持物。
13.一种分离的细胞，其产生权利要求1的抗体。
14.权利要求1的抗体，其在一种药物学可接受的载体中。
15.权利要求1的抗体在制备一种用于治疗、预防或改善动物癌症的药物组合物中的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述动物是人。
17.权利要求15的用途，其中所述癌症是结肠癌。
18.权利要求15的用途，其中所述癌症是乳腺癌。
19.权利要求15的用途，其中所述癌症是子宫癌。
20.权利要求15的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
21.权利要求15的用途，其中所述癌症是肺癌。
22.权利要求15的用途，其中所述癌症是胃肠道癌。
23.权利要求15的用途，其中所述癌症是Kaposi肉瘤。
24.权利要求15的用途，其中所述癌症是中枢神经系统癌症。
25.权利要求24的用途，其中所述中枢神经系统癌症是成髓质细胞瘤。
26.权利要求24的用途，其中所述中枢神经系统癌症是成神经细胞瘤。
27.权利要求24的用途，其中所述中枢神经系统癌症是成胶质细胞瘤。
28.权利要求15的用途，其中所述抗体与一种化疗剂组合。
29.权利要求28的用途，其中所述化疗剂选自以下一组：
(a)irinotecan；
(b)paclitaxel(TAXOL)
Figure C028149040004C1
和
(c)gemcitabine。
30.权利要求1的抗体在制备一种用于治疗、预防或改善动物的选自以下一组疾病或病变的药物组合物中的用途：
(a)移植物抗宿主疾病(GVHD)；
(b)AIDS；和
(c)神经变性病变。
31.权利要求30的用途，其中所述动物是人。
32.权利要求1的抗体在制备一种用于抑制TR4表达细胞生长或杀死TR4受体表达细胞的药物组合物中的用途。
33.一种检测TR4多肽的方法，包括：
(a)使用权利要求1的抗体分析来自一个个体的生物学样品中TR4多肽的表达；
(b)将TR4多肽的水平与TRAIL受体多肽的标准水平相对比。
34.权利要求1的抗体在制备一种用于通过分析来自一个个体的生物学样品中TR4多肽的表达以将TR4多肽的水平与TRAIL受体多肽的标准水平相对比而检测、诊断、预后或监测癌症或其它过度增殖性病变的诊断剂中的用途。
35.一种试剂盒，其包含权利要求1的抗体。
36.权利要求35的试剂盒，其包含一种对照抗体。
37.权利要求35的试剂盒，其中所述抗体偶联或缀合于一种可检测标记。
38.由ATCC保藏物PTA-3570的细胞系表达的抗体。
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