MX2007001469A - Ensayos y metodos que utilizan biomarcadores. - Google Patents

Ensayos y metodos que utilizan biomarcadores.

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Abstract

Se proporcionan metodos y ensayos que examinan la expresion de uno o mas biomarcadores en una muestra de tejido o celula de mamifero. De acuerdo con los metodos y ensayos descritos, la deteccion de la expresion de uno o mas de tales biomarcadores predice o indica si la muestra de tejido o celula sera sensible a agentes que inducen a apoptosis tales como Apo2/TRAIL y anticuerpos agonistas anti-DR5. Ciertos biomarcadores que pueden examinarse incluyen fucosiltransferasas, en particular fucosiltransferasa 3 (FUT3) y/o fucosiltransferasa 6 (FUT6), asi como antigenos de sialilo Lewis A y/o X. Tambien se proporcionan equipos y articulos de manufactura.

Description

ENSAYOS Y MÉTODOS QUE UTILIZAN BIOMARCADORES SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad bajo la Sección 119 (e) para la solicitud provisional de E.U. número 60/599,425, presentada en Agosto 6 de 2004, cuyo contenido se incorpora en la presente mediante la referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención descrita en la presente se refiere a métodos y ensayos para detectar biomarcadores de predicción de sensibilidad de las células de mamífero a Apo2L/TRAIL y/o a anticuerpos agonistas del receptor de eliminación. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se han identificado en la técnica diversos ligandos y receptores que pertenecen a la superfamilia del factor de necrosis de tumor (TNF) . Incluidos entre tales ligandos se encuentra el factor alfa de necrosis de tumor ("TNF-alfa"), factor beta de necrosis de tumor ("TNF-beta" o "linfotoxina-alfa"), linfotoxina beta ("LT-beta"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, LIGHT, ligando Apo-1 (referido también como ligando Fas o ligando CD95) , ligando Apo-2 (también referido como Apo-2L o TRAIL) , ligando Apo-3 (también referido como TWEAK) , APRIL, ligando OPG (también referido como ligando RANK, ODF o TRANCE) , y TALL-1 (también referido como BlyS, BAFF o THANK) (ver, e.g., Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Goldstein, Curr.
Biol., 7:750-753 (1997), Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol . , 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 publicada en Enero 16 de 1997; WO 97/25428 publicada en Julio 17 de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO 98/28426 publicada en Julio 2 de 1998; WO 98/46751 publicada en Octubre 22 de 1998; WO 98/18921 publicada en Mayo 7 de 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukohopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999) ) . La inducción de diversas respuestas celulares mediadas por tales ligandos de la familia TNF se inicia típicamente por su unión a receptores celulares específicos. Algunos, pero no todos, los ligandos de la familia TNF se unen a, e inducen diversas actividades biológicas a través de, "receptores de eliminación" de superficie celular para activar caspasas, o enzimas que llevan a cabo la muerte celular o la trayectoria de apoptosis (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997). Incluidos entre los miembros de la superfamilia del receptor TNF identificados a la fecha se encuentran TNFR1, TNFR2 , TACI , GITR, CD27, OC-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (también referido como Apo-1 o CD95) , DR4 (también referido como TRAIL-R1) , DRS (también referido como Apo-2 o TRAIL-R2) , DcRl. DcR2 , osteoprotegerin (OPG), RANK y Apo-3 (también referido como DR3 o TRAMP) (ver, e.g., Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr, Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) ; Wallach, Citokine Reference, Academic Press, 2000 páginas 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417.563 publicada en Marzo 20 de 1991; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J. , 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997) ) . La mayoría de estos miembros de la familia del receptor TNF comparten la típica estructura de los receptores de superficie celular incluyendo las regiones extracelulares, transmembrana e intracelular, mientras que otros se encuentran naturalmente como proteínas solubles que carecen de un dominio de transmembrana e intracelular. La porción extracelular de los TNFRs típicos contiene un patrón repetitivo de secuencia de aminoácidos de múltiples dominios ricos en cisteína (CDRs), que inician desde la terminal NH2. El ligando referido como Apo2L o TRAIL se identificó hace varios años como un miembro de la familia de citosinas TNF. (Ver, e.g., Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; Patente de E.U. 5,763,223 expedido en Junio 9, 1998; Patente de E.U. 6,284,236 expedida en Septiembre 4 de 2001) . El polipéptido Apo2L/TRAIL humano de secuencia natural de longitud total es una proteína transmembrana Tipo II de 281 aminoácidos de longitud. Algunas células pueden producir una forma natural soluble del polipéptido, a través de la división enzimática de la región extracelular del polipéptido [Mariani et al., J. Cell Biol., 137:221-229 (1997)). Estudios cristalográficos de formas solubles de Apo2L/TRAIL revelan una estructura homotrimérica similar a las estructuras de TNF y otras proteínas relacionadas [Hymowitz et al., Molec. Cell., 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)].
Sin embargo, se encontró que Apo2L/TRAIL, a diferencia de otros miembros de la familia de TNF, tiene una característica estructural única en que tres residuos cisteína (en la posición 230 de cada subunidad en el homotrímero) , coordinan conjuntamente un átomo de zinc, y en que la unión del zinc es importante para la estabilidad y actividad biológica del trímero. (Hymowitz et al., supra; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)). Se ha reportado en la literatura que Apo2L/TRAIL puede jugar un papel en la modulación del sistema inmune, incluyendo enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide [ver, e.g., Thomas et al., J. Immunol . , 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Citosina, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)]. También se ha reportado que las formas solubles de Apo2L/TRAIL inducen a apoptosis en una diversidad de células cancerosas, incluyendo, tumores de colon, pulmón, mama, próstata, vejiga, riñon, ovario y cerebro, así como melanoma, leucemia, y mieloma múltiple (ver, e.g., Wiley et al., supra; Pitti et al., supra; Patente de E.U. 6,030,945 expedida en Febrero 29 de 2000; Patente de E.U. 6,746,688 expedida en Junio 8, 2004; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cáncer Research., 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cáncer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cáncer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000) ) . Estudios in vivo en modelos de tumor murino sugieren además que Apo2L-TRAIL, solo o en combinación con quimioterapia o terapia de radiación, puede ejercer efectos sustanciales anti-tumor (ver, e.g., Ashkenazi et al., supra; Walczak et al., supra; Gliniak et al., Cáncer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., supra; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999), Solicitud PCT US/00/15512; Solicitud PCT US/01723691)). En contraste con muchos tipos de células cancerosas, la mayoría de los tipos celulares humanos parecen ser resistentes a la inducción apropiada por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL [Ashkenazi et al., supra; Walczak et al., supra). Jo et al., han reportado que una forma soluble marcada con polihistidina de Apo2L/TRAIL indujo a apoptosis in vitro en hepatocitos normales humanos aislados, pero no en hepatocitos no humanos (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); ver también, Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Se cree que ciertas preparaciones recombinantes de Apo2L/TRAIL pueden variar en términos de propiedades bioquímicas y actividades biológicas en células enfermas contra normales, dependiendo, por ejemplo, de la presencia o ausencia de una molécula de marcado, contenido de zinc y contenido % de trímero (Ver, Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001) ) . Se ha encontrado que Apo2L/TRAIL se une a al menos cinco receptores diferentes. Al menos dos de los receptores que se unen a Apo2L/TRAIL contienen un dominio funcional de destrucción citoplásmica. Uno de tales receptores se ha referido como "DR4" (y alternativa como TR4 o TRAIL-R1) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); ver también WO 98/32856 publicada en Julio 30 de 1998; WO 99/37684 publicada en Julio 29 de 1999; WO 00/73349 publicada en Diciembre 7 de 2000; US 6,433,147 expedida en Agosto 13 de 2002; US 6,461,823 expedida en Octubre 8, 2002; y US 6,342,383 expedida en Enero 29, 2002) . Otro de tales receptores para Apo2L/TRAIL se ha referido como DR5 (también se ha referido alternativamente como Apo-2; TRAIL-R, o TRAIL-R2, TR6 , Tango-63, hAP08 , TRICK2 o KILLER) (ver e.g., Sheridan et al., Science 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), WO 98/51793 publicada en Noviembre 19 de 1998; WO 98/41629 publicada en Septiembre 24 de 1998; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J. , 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986 publicada en Agosto 20 de 1998; EP870,827 publicada en Octubre 14 de 1998; WO 98/46643 publicada en Octubre 22 de 1998; WO 99/02653 publicada en Enero 21 de 1999; WO 99/09165 publicada en Febrero 25 de 1999; WO 99/11791 publicada en Marzo 11 de 1999; US 2002/0072091 publicada en Agosto 13 de 2002; US 2002/0098550 publicada en Diciembre 7 de 2001; US 6,313,269 expedida en Diciembre 6 de 2001; US 2001/0010924 publicada en Agosto 2 de 2001; US 2003/01255540 publicada en Julio 3 de 2003; US 2002/0160446 publicada en Octubre 31 de 2002, US 2002/0048785 publicada en Abril 25 de 2002; US 6,342,369 expedida en Febrero de 2002; US 6,569,642 expedida en Mayo 27 de 2003; US 6,072,047 expedida en Junio 6 de 2000, US 6,642,358 expedida en Noviembre 4 de 2003; US 6,743,625 expedida en Junio 1 de 2004. Como el DR4 , se reporta que el DR5 contiene un dominio de muerte citoplásmica y es capaz de señalizar apoptosis a la unión del ligando (o a la unión de una molécula, tal como un anticuerpo agonista, que imita la actividad del ligante) . La estructura cristalina del complejo formado entre Apo-2L/TRAIL y el DR5 se describe en Hymowitz et al., Molecular Cell., 4:563-571 (1999). A la unión del ligante, tanto DR4 como DR5 pueden activar la apoptosis independientemente reclutando y activando el iniciador de apoptosis, caspasa-8, mediante la molécula adaptadora que contiene el dominio de destrucción referido como FADD/Mortl [Kischel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)]. Se ha reportado que Apo2L/TRAIL también se une a aquellos receptores referidos como DcRl, DcR2 y OPG, que se cree que funcionan como inhibidores, más que como transductores de señalización (ver e.g., DCR1 (también referido como TRID, LIT o TRAIL-3) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); y Mongkolsapaya et al., J. Immunol . , 160:3-6 (1998); CDR2 (también llamado TRUNDD o TRAIL-R4) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters., 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity 7:813-820 (1997)], y OPG [Simonet et al., supra] . En contraste con DR4 y DR5, los receptores DcRl y DcR2 no señalan apoptosis. Se han reportado en la literatura ciertos anticuerpos que se unen a los receptores DR4 y/o DR5. Por ejemplo, los anticuerpos anti-DR4 dirigidos al receptor DR4 y que tienen actividad agonística o apoptótica en ciertas células de mamífero se describen en e.g., WO 99/37684 publicada en Julio 29 de 1999; WO 00/73349 publicada en Julio 12 de 2000; WO 03/066661 publicada en Agosto 14 de 2003. Ver también Griffith et al., J. Immunol . , 162_2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol . , 166:4891-4898 (2001); WO 02/097033 publicada en Diciembre 2 de 2002; WO 03/042367 publicada en Mayo 22 de 2003; WO 03/03843 publicada en Mayo 8 de 2003; WO 03/037913 publicada en Mayo 8 de 2003. De manera similar se han descrito ciertos anticuerpos anti-DR5 e.g., WO 98/51793 publicada en Noviembre 8 de 1998; Griffith et al., J. Immunol . , 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", extracto, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Agosto 29-Sept.l de 2002, Banff, Alberta, Canadá; WO 03/03843 publicada en Mayo 8 de 2003; WO 03/037913 publicada en Mayo 8, 2003. Adicionalmente, se han descrito ciertos anticuerpos que tienen reactividad cruzada para los receptores tanto DR4 como DR5 (ver, e.g., Patente de E.U. 6,252,050 expedida en Junio 26 de 2001) . La transformación neoplásica de algunas células de mamífero, en ciertas instancias, se ha asociado con cambios característicos en la expresión de antígenos de sialilo Lewis A y sialilo Lewis X. Cantidades relativamente altas de sialilo Lewis A/X se encuentran presentes, por ejemplo, en algunos adenocarcinomas humanos de colon, páncreas y estómago, y se han empleado análisis utilizando anticuerpos dirigidos a las estructuras de carbohidrato en estos antígenos como un medio para detectar cánceres pancreáticos y gastrointestinales. (ver, e.g., Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 49:2:303-311 (2002). El nivel de expresión de estos marcadores de tumor carbohidrato también se ha correlacionado con el resultado clínico, el tiempo de supervivencia del paciente y un indicador de enfermedad metastásica. Tanto sialilo Lewis A como sialilo Lewis X han mostrado unirse a una familia de proteínas de unión carbohidrato implicadas en la extravasación de las células de la corriente sanguínea, llamadas las selectinas. Algunos reportes sugieren que sialilo Lewis A y sialilo Lewis X son ligandos para E-selectina, y pueden ser responsables de la adhesión de las células cancerosas humanas al endotelio. Las estructuras Lewis sialiladas presentes en la superficie de células cancerosas se encuentran contenidas en las cadenas carbohidrato de glicoproteínas y glicolípidos y se unen a E-selectina presente en las células endoteliales. Las selectinas y sus ligandos carbohidrato pueden por tanto jugar un importante papel en el alojamiento selectivo de las células de tumor durante la metástasis. Se cree que la biosíntesis de sialilo Lewis A y X depende de la adición final de fucosa de guanosina difosfato-fucosa (GDP-Fuc) en unión alfa (1,3) y alfa (1,4) a precursores sialilados mediante enzimas específicas del tipo celular y específicas de la etapa de desarrollo, una etapa catalizada por alfa-1, 3/1 , 4-fucosiltransferasas (alfa 1,3/1,4 Fuc-T, FUT) . Actualmente se han clonado y caracterizado diversos genes de fucosiltransferasa humanos. La expresión de estos genes (FUT 3-7) y sus productos de enzima (Fuc-TIII-VII) parece ser específica del tejido. Las enzimas codificadas por los cinco genes se denominan FUTIII, FUTIV, FUTV, FUTVI y FUTVII. Los tres genes que codifican para FUTIII, FUTV y FUTVI se localizan en cercanas posiciones físicas en el cromosoma 19pl3.3. Estudios de clonación bioquímica y molecular sugieren que la expresión específica del linaje del residuo sialilo Lewis A/X se determina por la expresión específica el linaje de genes alfa-1 , 3 -fucosiltransferasa, cuyos productos de enzima operan en precursores oligosacárido expresados constitutivamente para producir determinantes de sialilo Lewis A/X ubicadas en la superficie. Las fucosiltransferasas humanas responsables de la actividad en tejidos epiteliales son FUT3 y FUT6. Las transcripciones de FUT3 [también llamado el gen Lewis alfa (1, 3/1, 4) fucosiltransferasa] y FUT6 [el gen de plasma alfa (1, 3) fucosiltransferasa] se encuentran presentes en tejidos tanto normales como transformados. Las transcripciones de fucosiltransferasa también prevalecen en numerosas líneas celulares de adenocarcinoma, con una notable alta expresión de FUT3 y 6 en carcinoma de colon. (Ver, e.g., Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 49:2:303-311 (2002); Nakamori et al., Dis. Colon Rectum., 40:420-431 (1997); Takada et al., Cáncer Res., 53:354-361 (1993); Ichikawa et al., J. Sug. Oncol., 75:98-102 (2000); Nakagoe et al., J. Exp. Clin. Cáncer Res., 2002, Mar; 21 (1): 107-13 Matsumoto et al., Br J Cáncer., 2002 Ene. 21; 86(2):161-7 Ito et al., J. Gastroenterol., 2001, Dic . ; 36(12) :823-9 Nakagoe et al., Cáncer Detect Prev. 2001; 25 (3) : 299-308 Kumamoto et al., Cáncer Res. 2001 Jun. 1; 61 (11) :4620-7 Murata et al., Dis Colon Rectum., 2001 Abr.; 44(4):A2-A4 Nakagoe et al., J. Exp. Clin. Cáncer Res. 2001 Mar; 20(1) :85-90; Nakagoe et al., Gastroenterol., 2001 Mar; 36 (3) : 166-72 ; Nakagoe et al., Tumour Biol., 2001 Mar-Abr; 22 (2) : 115-22 ; Nakagoe et al., Can J. Gastroenterol., 2000 Oct.; 14(9) :753 60; Izawa et al., Cáncer Res., 2000 Mar 1; 60(5):1410-6 Tanaka et al., Hepatogastroenterology 1999 Mar-Abr 46 (26) :875-82; Matsushita et al., Cáncer Lett., 1998 Nov. 27 133 (2) :151-60; Sato et al., Anticancer Res. 1997 Sept-Oct 17 (5A) : 3505-11; Yamada et al . , Br J Cáncer, 1997; 76(5): 582-7; Nakamori et al., Dis Colon Rectum., 1997 Abr.; 40(4) :420-31; Srinivas et al., Scand J Immunol . , 1996 Sep.; 44(3): 197-203; Matsushita et al., Lab. 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SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención descrita en la presente proporciona métodos y ensayos que examinan la expresión de uno o más biomarcadores en una muestra de tejido o célula de mamífero, en donde la expresión de uno o más de tales biomarcadores predice si la muestra de tejido o célula será sensible a agentes que inducen a apoptosis tales como Apo2L/TRAIL y anticuerpos agonistas anti-DR5. En diversas modalidades de la invención, los métodos y ensayos examinan la expresión de biomarcadores tales como ciertas fucosiltransferasas, en particular fucosiltransferasa 3 (FUT3) y/o fucosiltransferasa 6 (FUT6) , así como antígenos de sialilo Lewis A y/o X. Como se trató anteriormente, la mayoría de los tipos celulares humanos normales parecen ser resistentes a la inducción a apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., supra; Walczak et al., supra). También se ha observado que algunas poblaciones de tipos de células humanas enfermas (tales como ciertas poblaciones de células cancerosas) son resistentes a la inducción a apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 1999, supra; Walczak et al., Nature Med., 1999, supra). Consecuentemente, al examinar una muestra de tejido o célula de mamífero por la expresión de ciertos biomarcadores por medio de un análisis, se puede obtener convenientemente y eficientemente información útil para establecer terapias apropiadas o efectivas para tratar pacientes. Por ejemplo, la información obtenida de un análisis para detectar la expresión de FUT3 o FUT6 en una muestra de tejido o célula de mamífero puede proporcionar a lo médicos datos útiles que pueden utilizarse para determinar un régimen terapéutico óptimo (utilizando Apo2L/TRAIL o anticuerpos agonistas receptores de eliminación) para pacientes que sufren de un trastorno tal como cáncer. La invención proporciona métodos para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o células de mamífero (tal como una célula cancerosa) a Apo2L/TRAIL o a un anticuerpo agonista receptor de eliminación. En ciertas modalidades, los métodos comprender la obtención de una muestra de tejido o célula de mamífero y el examen del tejido o célula por la expresión de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6. Los métodos también pueden comprender el examen del tejido o célula por la expresión de otro biomarcador tal como el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X. Los métodos pueden conducirse en una variedad de formatos de análisis, incluyendo análisis para detectar la expresión de ARNm, análisis enzimáticos para detectar la presencia de actividad enzimática, análisis inmunohistoquímicos, y otros tratados en la presente. La determinación de la expresión de tales biomarcadores en dichos tejidos o células predecirán si tales tejidos o células serán sensibles a la actividad que induce la apoptosis de Apo2L/TRAIL y/o del anticuerpo agonista del receptor de eliminación. En modalidades opcionales, los tejidos o células también pueden examinarse por la expresión de los receptores DR4 , DR5, DcRl o DcR2. Métodos adicionales de la invención incluyen métodos para inducir a apoptosis en una muestra de tejido o célula de mamífero, que comprenden las etapas de obtener una muestra de tejido o célula de mamífero, examinar el tejido o célula por la expresión de uno o más biomarcadores, tales como fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, y al determinar que dicha muestra de tejido o célula expresa dichos uno o más biomarcadores, exponer dicha muestra de tejido o célula a una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista receptor de eliminación. Las etapas en los métodos para examinar la expresión de uno o más biomarcadores pueden conducirse en una variedad de formatos de análisis, incluyendo análisis para detectar la expresión de ARNm, análisis enzimáticos para detectar la presencia de actividad enzimática, y análisis inmunohistoquímicos. En modalidades opcionales, los métodos comprenden también el examen de la muestra de tejido o célula por la expresión de los receptores DR4 , DR5, DcRl o DcR2. Opcionalmente, la muestra de tejido o célula comprende tejido o células de cáncer. Aún métodos adicionales de la invención incluyen métodos para tratar un trastorno en un mamífero, tal como un trastorno relacionado con la inmunidad o un cáncer, que comprenden las etapas de obtener una muestra de tejido o célula de mamífero, examinar el tejido o célula por la expresión de uno o más biomarcadores, tales como fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, y al determinar que dicha muestra de tejido o célula expresa dichos uno o más biomarcadores, administrar una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista receptor de eliminación a dicho mamífero. Las etapas en los métodos para examinar la expresión de uno o más biomarcadores pueden conducirse en una variedad de formatos de análisis, incluyendo análisis para detectar la expresión de ARNm, análisis enzimáticos para detectar la presencia de actividad enzimática, y análisis inmunohistoquímicos. En modalidades opcionales, los métodos comprenden también el examen de la muestra de tejido o célula por la expresión de los receptores DR4 , DR5, DcRl o DcR2. Opcionalmente, los métodos comprenden el tratamiento del cáncer en un mamífero. Opcionalmente, los métodos comprenden, además de la administración de una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL y/o anticuerpo agonista receptor de eliminación, la administración de agente (s) quimioterapéutico (s) o terapia de radiación a dicho mamífero. Las modalidades adicionales se describen más particularmente mediante por las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o células de mamífero al Apo2L/TRAIL, que comprende las etapas de: obtener una muestra de tejido o célula de mamífero; examinar la muestra de tejido o célula para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, en donde la expresión de dichos uno o más biomarcadores predice si dicha muestra de tejido o célula es sensible a la actividad que induce la apoptosis de Apo2L/TRAIL. 2. El método de la reivindicación 1, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina detectando la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6. 3. El método de la reivindicación 1, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina mediante inmunohistoquímica para detectar la expresión de antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X. 4. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de examinar la expresión de los receptores DR4 , DR5 , DcRl o DcR2 en dicha muestra de tejido o célula. 5. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de tejido o célula comprende tejido o células de cáncer. 6. El método de la reivindicación 5, en donde dichas células de cáncer son células o tejidos de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal, o pancreático. 7. Un método para inducir apoptosis en una muestra de tejido o célula de mamífero, que comprende las etapas de : obtener una muestra de tejido o célula de mamífero; examinar la muestra de tejido o célula para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, y después de detectar la expresión de dichos uno o más biomarcadores, exponer dicha muestra de tejido o célula a una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL. 8. El método de la reivindicación 7 en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina al probar la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6. 9. El método de la reivindicación 7, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina mediante inmunohistoquímica para detectar la expresión de antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X. 10. El método de la reivindicación 7, que comprende además la etapa de examinar la expresión de los receptores DR4 , DR5, DcRl o DcR2 en dicha muestra de tejido o célula. 11. El método de la reivindicación 7, en donde dicha muestra de tejido o célula comprende tejido o células de cáncer. 12. El método de la reivindicación 11, en donde dichas células de cáncer son células o tejidos de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal, o pancreático. 13. El método de la reivindicación 7, en donde dichas células se exponen a una cantidad efectiva del polipéptido Apo2L/TRAIL que comprende los aminoácidos 114-281 e la Figura 1. 14. Un método para tratar un trastorno en un mamífero, tal como un trastorno relacionado a la inmunidad o cáncer, que comprende las etapas de: obtener una muestra de tejido o célula de dicho mamífero; examinar la muestra de tejido o célula para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, y después de detectar la expresión de dichos uno o más biomarcadores, administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL. 15. El método de la reivindicación 14, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina detectando la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6. 16. El método de la reivindicación 14, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina mediante inmunohistoquímica para detectar la expresión de antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X. 17. El método de la reivindicación 14, que comprende además la etapa de examinar la expresión de los receptores DR4 , DR5, DcRl o DcR2 en dicho tejido o célula. 18. El método de la reivindicación 14, en donde la muestra de tejido o célula comprende tejido o células de cáncer. 19. El método de la reivindicación 18, en donde dichas células o tejidos de cáncer comprenden células o tejidos de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal, o pancreático . 20. El método de la reivindicación 14, en donde una cantidad efectiva del polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 que se administra a dicho animal . 21. El método de la reivindicación 14, en donde también se administra a dicho mamífero un (os) agente (s) terapéutico (s) o terapia de radiación. 22. El método de la reivindicación 14, en donde también se administra a dicho mamífero una citosina, agente citotóxico o agente de inhibición del crecimiento. 23. El método de la reivindicación 7 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL se enlaza a una molécula de polietilenglicol. 24. El método de la reivindicación 14 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL se enlaza a una molécula de polietilenglicol . 25. El método de la reivindicación 6 en donde dichas células de cáncer son células de cáncer de colon o colorectal . 26. El método de la reivindicación 1 en donde dicho Apo2L/TRAIL es un polipéptido que comprende los aminoácidos 41-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) o un fragmento biológicamente activo del mismo. 27. El método de la reivindicación 26, en donde dicho Apo2L/TRAIL es un polipéptido que comprende los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID NO:l). 28. El método de la reivindicación 12 en donde dichas células de cáncer son células de cáncer de colon o colorectal . 29. El método de la reivindicación 20 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL consiste de los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID NO:l). 30. Un método para predecir la sensibilidad de células de cáncer de colon o colorectal de mamífero para Apo2L/TRAIL que comprende las etapas de: obtener células de cáncer de colon o colorectal de mamífero; examinar las células de cáncer para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, en donde la expresión de dichos uno o más biomarcadores predice que dichas células de cáncer son sensibles a la actividad que induce apoptosis de Apo2L/TRAIL. 31. Un método para inducir apoptosis en células de cáncer de colon o colorectal de mamífero que comprende las etapas de : obtener células de cáncer de colon o colorectal de mamífero; examinar las células de cáncer para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, y después de detectar la expresión de dichos uno o más biomarcadores, exponer dichas células de cáncer a una cantidad efectiva de polipéptido Apo2L/TRAIL. 32. El método de la reivindicación 31 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 41- 281 de la Figura 1 (SEQ ID NO:l) o un fragmento del mismo que tiene actividad apoptótica. 33. El método de la reivindicación 32 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL se enlaza a una molécula de polietilen glicol. 34. El método de la reivindicación 32 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1). 35. Un método para tratar cáncer de colon o colorectal en un mamífero, que comprende las etapas de: obtener una muestra de células de cáncer de colon o colorectal de dicho mamífero; examinar la muestra de células de cáncer para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, y después de detectar la expresión de dichos uno o más biomarcadores, administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL. 36. El método de la reivindicación 35 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 41-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) o un fragmento del mismo que tiene actividad apoptótica. 37. El método de la reivindicación 36 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL se enlaza a una molécula de polietilen glicol. 38. El método de la reivindicación 36 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc de ligando Apo-2 humano (SEQ ID NO: 2) y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 1) . El "N" en la posición de nucleótido 447 se utiliza para indicar que la base de nucleótido puede ser un "T" o "G" . Las Figuras 2A y 2B muestran la secuencia de nucleótidos de un ADNc (SEQ ID NO: 4) para DR4 humano de longitud total y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 3) . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos respectivas para DR4 humano también se reportan en Pan et al., Science, 276:111 (1997). La Figura 3A muestra la secuencia de 411 aminoácidos de DR5 humano (SEQ ID NO: 5) como se publicó en la WO 98/51793 en Noviembre 19 de 1998. Se conoce en la técnica una variante de unión de transcripción de DR5 humano. La variante de unión DR5 codifica para la secuencia de 440 aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de DR5 humano mostrada en las Figuras 3B y 3C como se publicó en la WO 98/35986 en Agosto 20 de 1998. La Figura 3D muestra las secuencias de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO: 7) para el DcRl humano de longitud total y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 8) . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos respectivas para DcRl humano (y sus dominios particulares) también son conocidas y se describen en la WO 98/58062. La Figura 3E muestra las secuencias de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO: 9) para el DcR2 humano de longitud total y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 10) . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos respectivas para DcR2 humano (y sus dominios particulares) se muestran en la WO 99/10484. La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO: 11) para fucosiltransferasa humana (1,3/1,4) (FUT3) de longitud total y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 12) . Estas secuencias corresponden al Número de Acceso del GenBank HSU27328 y se describen, por ejemplo, en Kukowska-Latallo et al., Genes Dev. 1990 Agosto; 4 (8) :1288-303. La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO: 13) para fucosiltransferasa alfa humana (1,3) (FUT6) de longitud total y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 14) . Estas secuencias corresponden al Número de Acceso del GenBank HSU27333 y se describen, por ejemplo, en Koszdin y Bowen, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992 Agosto 31; 187(1): 152-7. La Figura 6 proporciona un diagrama en resumen de los datos obtenidos al analizar 28 líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal por su sensibilidad o resistencia a la actividad apoptótica de Apo2L (suero fetal bovino "FBS" al + 0.5% o FBS al 10%) o del anticuerpo monoclonal DR5 "mab", "XL" reticulado o no reticulado, suero fetal bovino "FBS" al + 0.5% o FBS al 10%) y por la expresión de FUT3 , FUT6, sialilo Lewis A y sialilo Lewis X. La Figura 7 proporciona una comparación de la sensibilidad de diversas líneas celulares de cáncer colorrectal al anticuerpo DR5 y la expresión de FUT3 , calculada mediante PCR cuantitativa. La Figura 8 proporciona una comparación de diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal por su sensibilidad o resistencia al anticuerpo DR5 (más reticulador) y la expresión de sialilo Lewis X o A, determinada mediante FACS. La Figura 9A muestra una prueba Spearman Rank Correlation que analiza la sensibilidad o resistencia de diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal y la correlación para la expresión de FUT3. La Figura 9B muestra los resultados de una prueba Fisher' s Exact que analiza la sensibilidad ("sens") o la resistencia ("res") de las diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal y la importancia estadística entre la expresión y sensibilidad de las líneas FUT3 y sialilo Lewis A/X de las respectivas líneas celulares para la actividad apoptótica del anticuerpo DR5. La Figura 10 proporciona una comparación de diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal por la expresión de los receptores DcRl o DcR2 (determinada mediante PCR cuantitativa) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares para Apo2L o anticuerpo DR5. La Figura 11 proporciona una comparación de diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal por la expresión de los receptores DcRl o DcR2 (determinada mediante FACS) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares para Apo2L o anticuerpo DR5. La Figura 12 muestra la coloración inmunohistoquímica para sialilo Lewis A y X en cuatro líneas celulares de cáncer colorrectal, CaCo2 , SW 1417, DLD-1, y Coló 205, y su correlación con a expresión de sialilo Lewis A y X calculada mediante FACS y su correlación con a sensibilidad a Apo2L. La Figura 13 muestra un resumen de los experimentos IHC demostrando la expresión de sialilo Lewis A y X en muestras de tejido de mucosa de colon normal, tejido hepático normal, cáncer de colon primario, y metástasis de cáncer de colon. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las técnicas y procedimientos descritos o referidos en la presente se comprenden bien en general y se emplean comúnmente utilizando metodología convencional por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de equipos y reactivos comercialmente disponibles, se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se anote de otra manera. Antes de describir los presentes métodos y ensayos, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales, construcciones particulares, y los reactivos descritos, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente tiene el propósito de describir solo modalidades particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que solo se limitará mediante las reivindicaciones anexas. Debe notarse que como se utilizan en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un" (una) , "y", y "el" (la) incluyen los referentes en plural a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una alteración genética" incluye una pluralidad de tales alteraciones y la referencia a "una sonda" incluye la referencia a una o más sondas y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan en la presente mediante la referencia para detallar y describir los métodos y/o materiales en conexión con los cuales se citan las publicaciones. Las publicaciones citadas en la presente se citan por su descripción previa a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente debe tomarse como admisión de que los inventores no se encuentran autorizados para antefechar las publicaciones en virtud de una fecha de prioridad anterior o fecha previa de la invención. Además, las fechas de publicación reales pueden ser diferentes a las mostradas y requieren verificación independiente. I. Definiciones Los términos "Apo-2L-TRAIL" , "Apo-2L" , y "TRAIL" , se utilizan en la presente para referirse a una secuencia de polipéptidos que incluye los residuos de aminoácido 114-281, inclusive 95-281, inclusive, los residuos 92-281, inclusive, los residuos 91-281, inclusive, los residuos 41-281, inclusive, los residuos 15-281, inclusive, o los residuos 1-281, inclusive, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1, así como fragmentos, variantes de supresión, de inserción o de sustitución biológicamente activos de las secuencias anteriores. En una modalidad, la secuencia de polipéptidos comprende los residuos 114-281 de la Figura 1 y opcionalmente, consiste de los residuos 114-281 de la Figura 1. Opcionalmente la secuencia de polipéptidos comprende los residuos 92-281 o los residuos 91-281 de la Figura 1. Los polipéptidos Apo-2L pueden encontrarse codificados por la secuencia de nucleótidos natural mostrada en la Figura 1. Opcionalmente, el codón que codifica el residuo Proll9 (Figura 1) puede ser "CCT" o "CCG" . En otras modalidades, los fragmentos o variantes son biológicamente activos y tienen al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferentemente al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos e incluso más preferentemente, al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las secuencias Apo2L/TRAIL antes citadas. Opcionalmente, el polipéptido Apo2L/TRAIL se encuentra codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rígidas con la secuencia de polinucleótido de codificación proporcionada en la Figura 1. La definición abarca variantes de sustitución de Apo-2L/TRAIL en las cuales al menos uno de sus aminoácidos naturales se sustituye por un residuo alanina. Estas variantes de sustitución incluyen aquellas identificadas, por ejemplo, como "D203A"; D218A" y "D269A" . esta nomenclatura se utiliza para identificar variantes de Apo2L/TRAIL en donde los residuos de ácido aspártico en las posiciones 203, 218 y/o 269 (utilizando la numeración mostrada en la Figura 1) se sustituyen por residuos alanina. Opcionalmente, las variantes Apo2L pueden comprender una o más de las sustituciones alanina citadas en la Tabla I de la solicitud PCT publicada WO 01/00832. Las variantes de sustitución incluyen una o más de las sustituciones de residuo identificadas en la Tabla I de la WO 01/00832 publicada en Enero 4 de 2001. La definición abarca también un Apo2L/TRAIL de secuencia natural aislado de una fuente de Apo2L/TRAIL o preparado mediante métodos recombinantes o sintéticos. El Apo2L/TRAIL de la invención incluye los polipéptidos referidos como Apo2L/TRAIL o TRAIL descritos en las Publicaciones PCT Nos. WO 97/01633 y WO 97/25428. Los términos "Apo2L/TRAIL" o "Apo2L" se utilizan para referirse en general a formas del Apo2L/TRAIL que incluyen formas de monómero, dímero o trímero del polipéptido. Toda la numeración de los residuos de aminoácido referidos en la secuencia Apo2L utiliza la numeración de acuerdo con la Figura 1, a menos que se especifique de otra manera. Por ejemplo, . "D203" o "Asp203" se refiere al residuo de ácido aspártico en la posición 203 en la secuencia proporcionada en la Figura 1. El término "dominio extracelular de Apo2L/TRAIL" o "Apo2L/TRAIL ECD" se refiere a una forma de Apo2L/TRAIL que se encuentra esencialmente libre de dominios transmembrana y citoplásmicos. Comúnmente, el ECD tendrá menos que 1% de tales dominios transmembrana y citoplásmicos, y preferentemente, tendrán menos del 05% de tales dominios. Se entenderá que cualquier dominio de transmembrana identificado para los polipéptidos de la presente invención se identifica conforme al criterio rutinariamente empleado en la técnica para la identificación de ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio de transmembrana pueden variar, pero más probablemente por no mas de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio como se identificó inicialmente. En modalidades preferidas. El ECD consistirá de una secuencia soluble de dominio extracelular del polipéptido que se encuentra libre de los dominios tansmembrana y citopásmico o intracelular (y no se encuentra unido a la membrana) . Las secuencias de dominio extracelular particulares de Apo2L/TRAIL se describen en las Publicaciones PCT Nos. WO 97/01633 y WO 97/25428. El término "monómero Apo2L/TRAIL" o "monómero Apo2L" se refiere a una cadena covalente de una secuencia de dominio extracelular de Apo2L. El término "dímero Apo2L/TRAIL" o "dímero Apo2L" se refiere a dos monómeros Apo2L unidos en una unión covalente a través de una unión disulfuro. El término como se utiliza en la presente incluye dímeros Apo2L autónomos y dímeros Apo2L que se encuentran dentro de formas triméricas de Apo2L (i.e. asociados con otro, tercer monómero Apo2L) . El término "trímero Apo2L/TRAIL" o "trímero Apo2L" se refiere a tres monómeros Apo2L que se encuentran asociados de manera no covalente. El término "agregado "Apo2L/TRAIL" se utiliza para referirse a formas oligoméricas más altas auto-asociadas de Apo2L/TRAIL, tales como trímeros Apo2L/TRAIL, que forman, por ejemplo, formas hexaméricas y nanoméricas de Apo2L/TRAIL. La determinación de la presencia y calidad del monómero, dímero o trímero Apo2L/TRAIL (u otros agregados) puede producirse utilizando métodos y ensayos conocidos en la técnica (y utilizando materiales comercialmente disponibles) , tales como HPLC natural de exclusión por tamaño ("SEC"), exclusión por tamaño de desnaturalización utilizando sodio dodecil sulfato ("SDS-SEC"), HPLC en fase inversa y electroforesis capilar. El "receptor ligando Apo-2" incluye los receptores referidos en la técnica como "DR4" y "DR5" cuyas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente. Pan et al., han descrito al miembro de la familia del receptor TNF referido como "DR4" (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); ver también WO 98/32856 publicada en Julio 30 de 1998; WO 99/37684 publicada en Julio 29 de 1999; WO 00/73349 publicada en Diciembre 7 de 2000; US 6,433,147 expedida en Agosto 13 de 2002; US 6,461,823 expedida en Octubre 8 de 2002, y US 6,342,383 expedida en Enero 29 de 2002). Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) y Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) describen otro receptor para Apo2L/TRAIL (ver también, WO 98/51793 publicada en Noviembre 19 de 1998; WO 98/41629 publicada en Septiembre 24 de 1998) . Este receptor se refiere como DR5 (el receptor también se ha referido alternativamente como Apo-2; TRAIL-R, TR6 , Tango-63, hAP08 , TRICK2 o KILLER; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986 publicada en Agosto 20 de 1998; EP870,827 publicada en Octubre 14 de 1998; WO 98/46643 publicada en Octubre 22 de 1998; WO 99/02653 publicada en Enero 21 de 1999; WO 99/09165 publicada en Febrero 25 de 1999; WO 99/11791 publicada en Marzo 11 de 1999; US 2002/0072091 publicada en Agosto 13 de 2002; US 2002/0098550 publicada en Diciembre 7 de 2001; US 6,313,269 expedida en Diciembre 6 de 2001; US 2001/0010924 publicada en Agosto 2 de 2001; US 2003/01255540 publicada en Julio 3 de 2003; US 2002/0160446 publicada en Octubre 31 de 2002, US 2002/0048785 publicada en Abril 25 de 2002; US 6,569,642 expedida en Mayo 27 de 2003; US 6,072,047 expedida en Junio 6 de 2000, US 6,642,358 expedida en Noviembre 4 de 2003). Como se describió anteriormente, otros receptores para Apo-2L incluyen DcRl, DcR2 y OPG (ver Sheridan et al., supra; Marsters et al., supra; y Simonet et al., supra). El término "receptor Apo-2L" cuando se utiliza en la presente abarca el receptor de secuencia natural y variantes del receptor. Estos términos abarcan el receptor Apo-2L expresado en una variedad de mamíferos, incluyendo humanos. El receptor Apo-2L puede expresarse de manera endógena como ocurre naturalmente en una variedad de linajes de tejido humano, o puede expresarse mediante métodos recombinantes o sintéticos. Un "receptor Apo-2L de secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el receptor Apo-2L derivado de la naturaleza. Por tanto, un receptor Apo-2L de secuencia natural puede tener la secuencia de aminoácidos del receptor Apo-2L de origen natural de cualquier mamífero. Tal receptor Apo-2L de secuencia natural puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "receptor Apo-2L de secuencia natural" abarca específicamente formas truncadas o secretadas de origen natural del receptor (e.g., una forma soluble que contiene, por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes de origen natural (e.g., formas unidas alternativamente) y variantes alélicas de origen natural . Las variantes de receptor pueden incluir fragmentos o mutantes de supresión del receptor Apo-2L de secuencia natural. La Figura 3A muestra la secuencia de 411 aminoácidos del DR5 humano publicada en la WO 98/51793 en Noviembre 19 de 1998. Se conoce en la técnica una variante de unión de transcripción de DR5 humano. Esta variante de unión DR5 codifica para la secuencia de 440 aminoácidos del DR5 humano mostrado en las Figuras 3B y 3C publicada en la WO 98/35986 en Agosto 20 de 1998. "Anticuerpo receptor de eliminación" se utiliza en la presente para referirse en general a un anticuerpo o anticuerpos dirigidos a un receptor en la superfamilia del receptor de factor de necrosis de tumor y que contiene un dominio de destrucción capaz de señalizar apoptosis, y tales anticuerpos incluyen el anticuerpo DR5 y el anticuerpo DR4. "Anticuerpo receptor DR5" , "anticuerpo DR5" o "anticuerpo anti-DR5" se utiliza en un sentido amplio para referirse a anticuerpos que se unen a al menos una forma de un receptor DR5 o su dominio extracelular. Opcionalmente, el anticuerpo DR5 se fusiona o se une a una secuencia o molécula heteróloga. Preferentemente, la secuencia heteróloga permite o auxilia al anticuerpo para formar complejos de mayor orden u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo DR5 se une al receptor DR5 pero no se une o reacciona de manera cruzada con ningún receptor Apo-2L (e.g., DR4 , DcRl o DcR2) . Opcionalmente, el anticuerpo es un agonista de la actividad de señalización de DR5. Opcionalmente, el anticuerpo DR5 de la invención se une a un receptor DR5 a un rango de concentración de aproximadamente 0.1 nM a aproximadamente 20 mM medido en un análisis de unión BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpos DR5 de la invención exhiben un valor le 50 de aproximadamente 0.6 nM a aproximadamente 18 mM medido en un análisis de unión BIAcore . "Anticuerpo receptor DR4", "anticuerpo DR4" o "anticuerpo anti-DR4" se utiliza en un sentido amplio para referirse a anticuerpos que se unen a al menos una forma de un receptor DR4 o su dominio extracelular. Opcionalmente, el anticuerpo DR4 se fusiona o se une a una secuencia o molécula heteróloga. Preferentemente, la secuencia heteróloga permite o auxilia para que el anticuerpo forme complejos de mayor orden u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo DR4 se une al receptor DR4 pero no se une o reacciona de manera cruzada con ningún receptor Apo-2L adicional (e.g., DR5, DcRl o DcR2) . Opcionalmente el anticuerpo es un agonista de la actividad de señalización de DR4. Opcionalmente, el anticuerpo DR4 de la invención se une a un receptor DR4 a un rango de concentración de aproximadamente 0.1 nM a aproximadamente 20 mM medido en un análisis de unión BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpos DR5 de la invención exhiben un valor le 50 de aproximadamente 0.6 nM a aproximadamente 18 mM medido en un análisis de unión BIAcore . El término "agonista" se utiliza en el más amplio sentido e incluye una molécula que mejora parcial o totalmente, estimula o activa una o más de las actividades biológicas de Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, in vitro, in situ, o in vivo. Ejemplos de tales actividades biológicas que unen Apo2L/TRAIL a DR4 o DR5, incluyen apoptosis así como aquellas reportadas adicionalmente en la literatura. Un agonista puede funcionar de una manera directa o indirecta. Por ejemplo, el agonista puede funcionar para mejorar parcial o totalmente, estimular o activar una o más de las actividades biológicas de, DR4 o DR5, in vitro, in situ, o in vivo como resultado de su unión directa a DR4 o DR5 , que ocasiona la activación del receptor o la transducción de señal. El agonista también puede funcionar indirectamente para mejorar parcial o totalmente, estimular o activar una o más de las actividades biológicas de DR4 o DR5, in vitro, in situ o in vivo como resultado, por ejemplo, de la estimulación de otra molécula efector que entonces ocasiona la activación o señal de transducción de DR4 o DR5. Se contempla que un agonista puede actuar como una molécula de mejoramiento que funciona indirectamente para mejorar o incrementar la activación o actividad de DR5. Por ejemplo, el agonista puede mejorar la actividad de Apo-2L endógeno en un mamífero. Esto podría lograrse, por ejemplo, pre-complejando DR4 o DR5 o estabilizando complejos del ligando respectivo con el receptor DR4 o DR5 (tal como estabilizando un complejo natural formado entre Apo-2L y DR4 o DR5) .
El término "biomarcador" como se utiliza en la presente invención, se refiere en general a una molécula, incluyendo un gen, proteína, estructura carbohidrato, o glicolípido, cuya expresión en o sobre un tejido o célula de mamífero puede detectarse mediante métodos estándar (o los métodos descritos en la presente) y puede predecirse por la sensibilidad de una célula o tejido de mamífero a Apo2L/TRAIL o de un anticuerpo agonista del receptor de eliminación. Tales biomarcadores contemplados por la presente invención, incluyen pero no se limitan a, "fucosiltransferasa /l,3/l,4)" o "FUT3", "fucosiltransferasa alfa (1,3)" o "FUT6" , "sialilo Lewis A" y "sialilo Lewis X" . Opcionalmente, se determina que la expresión de tal biomarcador es más alta que la observada para un tejido e control o muestra celular. Opcionalmente, por ejemplo, la expresión de tal biomarcador se determinará en un análisis PCR o FACS para ser de al menos 50 veces, o preferentemente 100 veces mayor en el tejido de prueba o muestra celular que la observada para un tejido de control o muestra celular. Opcionalmente, la expresión de tal biomarcador se determinará en un análisis IHC para una puntuación de al menos 2 o más por intensidad de coloración. "Fucosiltransferasa (1,3/1,4)" o "FUT3" se utiliza en la presente para referirse a una molécula que tiene características estructurales como se describe en la presente, y opcionalmente, que cataliza la transferencia de un residuo fucosa del sustrato donante, GDP-fucosa, a un sustrato receptor en una unión a3- o a4- a GlcNAc (FUTs III-VII y IX) . La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácido para FUT3 humano se proporciona en la Figura . Estas secuencias corresponden al Número de Acceso GenBank HSU27328 y se describen por ejemplo en Kukowska-Latallo et al., Genes Dev. 1990 Agosto; 4 (8) : 1288-303. FUTs son generalmente glicoproteínas transmembrana tipo II que residen en báculos Golgi, y se componen típicamente de un extremo citoplásmico de terminación N, una región de expansión de membrana, y un dominio catalítico orientado lumenalmente en el aparato Golgi. Entre la región de expansión de membrana y el dominio catalítico se encuentra una región llamada la raíz (Paulson y Colley, J. Biol. Chem., 264:17615-17618 (1989). "Fucosiltransferasa alfa (1,3)" o "FUT6" se utiliza en la presente para referirse a una molécula que se relaciona estructuralmente, e.g., con la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos para FUT5 humano proporcionada en la Figura 5. Estas secuencias corresponden al Número de Acceso GenBank HSU27333 y se describen, por ejemplo, en Koszdin y Bowen, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992 Agosto 31; 187 (1) : 152-7. FUT6 se expresa típicamente en células epiteliales y en tejidos de hígado, riñon y gastrointestinales, específicamente en estómago, yeyuno y colon (y típicamente se expresa mínimamente en bazo, pulmón y cervix uteri) . FUT6 típicamente no se detecta en el cerebro, corteza adrenal o leucocitos de sangre periférica. "Sialilo Lewis A" se utiliza en la presente para referirse a una estructura o antígeno tetrasacárido carbohidrato que tiene la siguiente secuencia o estructura, que puede encontrarse unida a la membrana o en forma soluble, circulando, por ejemplo, en suero: NeuAca2-»3Gal/3l- 3 [Fucal^4] GlcNA/3l-»R (NeuAcalfa2- 3Galbetal->3 (Fucalfal->4) GlcNAcbetal->R) Fuca1-4 "Sialilo Lewis X" se utiliza en la presente para referirse a una estructura o antígeno tetrasacárido carbohidrato que tiene la siguiente secuencia o estructura, que puede encontrarse unida a la membrana o en forma soluble, circulando, por ejemplo, en suero: NeuAca2->3Gal/3l- 3 [Fucal->3] (NeuAcalfa2^3Galbetal-»4 (Fucalfal->3) GlcNAcbetal^R) Fuca1-3 Por "sujeto o "paciente", se entiende cualquier sujeto individual para quien se desea la terapia, incluyendo humanos, ganado, perros, conejillos de Indias, conejos, pollos, insectos etc. También pretende incluirse como sujeto, cualquier sujeto implicado en pruebas de investigación clínica que no muestran ningún signo clínico de enfermedad, o los sujetos implicados en estudios epidemiológicos, o los sujetos utilizados como controles.
El término "mamífero" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero, incluyendo humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una modalidad preferida de la invención, el mamífero es un humano. Por "muestra de tejido o célula" se entiende una colección de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de la muestra de tejido o célula puede ser tejido sólido como el de un órgano fresco, congelado y/o preservado o muestra de tejido o biopsia o aspirado; sangre o cualquier constituyente de sangre; fluidos corporales tales como fluido espinal cerebral, fluido amniótico, fluido peritoneal, o fluido interstisial ; células de cualquier momento de la gestación o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido también puede ser células primarias o cultivadas o líneas celulares. Opcionalmente, la muestra de tejido o célula se obtiene de un tumor primario o metastásico. La muestra de tejido puede contener compuestos que no se entremezclan naturalmente con el tejido en la naturaleza, tales como preservativos, anticoagulantes, amortiguadores, fijadores, nutrientes, antibióticos, o lo similar. Para los propósitos en la presente una "sección" de una muestra de tejido es una sola parte o pieza de una muestra de tejido, e.g., una delgada tira de tejido o células cortada de una muestra de tejido. SE entiende que pueden tomarse múltiples secciones de muestras de tejido y someterse a análisis de acuerdo con la presente invención, siempre que se entienda que la presente invención comprende un método mediante el cual se analiza la misma sección de muestra de tejido en niveles tanto morfológico como molecular, o se analiza tanto con proteína como ácido nucleico. Por "correlacionar" o "correlacionado" se entiende la comparación, en cualquier manera, del desempeño y/o los resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o los resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, pueden utilizarse los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo un segundo protocolo y/o pueden utilizarse los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si debe efectuarse un segundo análisis o protocolo. Con respecto, a la modalidad de análisis o protocolo inmunohistoquímico pueden utilizarse los resultados de IHC para determinar si debe efectuarse un régimen terapéutico específico. Por "ácido nucleico" se entiende que incluye cualquier ADN o ARN. Por ejemplo, el ácido nucleico cromosómico, mitocondrial, viral y/o bacterial presente en una muestra de tejido. El término "ácido nucleico" abarca cualquiera o ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico bicatenaria e incluye cualquier fragmento o porción de una molécula de ácido nucleico intacta. Por "gen" se entiende cualquier secuencia de ácido nucleico o porción de la misma con un papel funcional en la codificación o transcripción de una proteína, o en la regulación de otra expresión del gen. El gen puede consistir de todos los ácidos nucleicos responsables de la codificación de una proteína funcional o solo de una porción de los ácidos nucleicos responsables de la codificación o expresión de una proteína. La secuencia de ácido nucleico puede contener una anormalidad genética dentro de exones, intrones, regiones de inicio o terminación, secuencias de promoción, otras secuencias reguladoras o regiones adyacentes únicas para el gen. La palabra "marca" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición que se conjuga o se fusiona directa o indirectamente a un reactivo tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo, y facilita la detección del reactivo al cual se conjuga o se fusiona. La marca por sí misma puede ser detectable (e.g., marcas de radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable . El término "anticuerpo" se utiliza en la presente en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (e.g., anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, siempre que exhiban la actividad biológica deseada . Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente su región de unión de antígeno o variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diabodies, anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. "Anticuerpos naturales" son comúnmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se encuentra unida a una cadena pesada mediante una unión disulfuro covalente, aunque el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios regularmente separados.
Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene en un extremo un dominio variable (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se encuentra alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se encuentra uniformemente distribuida a través de los dominios variables de anticuerpos. Ésta se encuentra concentrada en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad o hipervariables, tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones de estructura (FR) . Los dominios variables de cadenas naturales pesada y ligera comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando una configuración de hoja ß , conectadas por tres regiones hipervariables, que forman circuitos que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß . Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en cercana proximidad mediante regiones FR y, con las regiones hipervariables forman la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de antígeno de los anticuerpos (ver Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) . Los dominios constantes no se encuentran directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones de efector, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC) .
La digestión papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión de antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" , cada uno con un solo sitio de unión de antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento de pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión de antígeno y aún es capaz de reticular el antígeno. "Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión de antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en la terminación carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Fab' -SH es la designación en la presente para Fab' en el cual el (los) residuo (s) cisteína de los dominios constantes contienen al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulación entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa ( K ) y lambda (?) en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), e.g., IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1 e IgA-2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan alfa, delta, epsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena polipéptido. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además una unión polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de scFv ver Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antobodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . El término "diabodies" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión de antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipéptido (VH - VL) . Utilizando una unión demasiado corta para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a los dominios a formar pares con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión de antígeno. Los diabodies se describen más completamente, por ejemplo, en la EP 404,097; WO 93/11161 y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448 (1993). El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una sola determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan por medio del cultivo hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe entenderse que requiere la producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden producirse mediante el método hibridoma primeramente descrito por Kohier et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante (ver, e.g., Patente de E.U. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas fago de anticuerpos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de E.U. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 81:6851-6855 (1984)]. Los anticuerpo quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión de antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (e.g., Mono del Viejo Mundo, tal como baboon, rhesus o mono cinomolgo) y secuencias de región constante humanas (Pat. de E.U. No. 5,693,780). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (e.g., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en las cuales los residuos de una región hipervariable del recipiente, se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como de ratón, rata o conejo, o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunas instancias, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los circuitos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332_323-329 (1988); y Presta, Curr. Opin. Op. Struct . Biol., 2:593-596 (1992). El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente, se refiere a los residuos aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (e.g., residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) y/o los residuos de un "circuito hipervariable" (e.g., residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) ) . Residuos de "región de estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se define en la presente . Un anticuerpo "que se une a un antígeno de interés es uno capaz de unirse a ese antígeno con afinidad y/o avidez suficiente a fin de que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico o diagnóstico para dirigir una célula que expresa el antígeno. Para los propósitos en la presente, "inmunoterapia" se referirá a un método para tratar a un mamífero (preferentemente un paciente humano) con un anticuerpo, en donde el anticuerpo puede ser un anticuerpo no conjugado o "desnudo", o el anticuerpo puede conjugarse o fusionarse con molécula (s) heteróloga (s) o agente (s), tal (es) como uno o más agentes citotóxicos, generando así un "inmunoconjugado" . Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del antagonista o anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solubles proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más del 95% por peso del anticuerpo determinado por medio del método Lowry, y más preferentemente más del 99% por peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos de terminación N o interna mediante el uso de un secuenciador de cuba giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o de no reducción utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, colorante de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, dado que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se encontrará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. La expresión "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un agente (e.g., Apo2L/TRAIL, anticuerpo anti-DR4 o DR5, etc.) que es efectiva para prevenir, mejorar o tratar la enfermedad o condición en cuestión. Los términos "tratar" , "tratamiento" y "terapia" como se utilizan en la presente se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica, y terapia preventiva. Tratamiento o administración consecutiva se refiere al tratamiento en al menos una base diaria sin la interrupción en el tratamiento durante uno o más días. Tratamiento o administración intermitente, o tratamiento o administración de manera intermitente, se refiere al tratamiento que no es consecutivo, sino de naturaleza cíclica. El término "citosina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa en otra célula como mediadores celulares. Ejemplos de tales citosinas son las linfocinas, monocinas, y hormonas polipéptido tradicionales. Incluidas entre las citosinas se encuentra la hormona de 1 crecimiento tal como la hormona del crecimiento humana, hormona del crecimiento humana N-metionil, y hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteína tales como la hormona de estimulación de folículo (FSH) , hormona de estimulación de tiroides (TSH) , u hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno de placenta; factor-alfa y -beta de necrosis de tumor; sustancia de inhibición mulleriana; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor I y II de crecimiento similar a insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos; interferones tales como interferón-alfa, -beta y gamma; factores de estimulación de colonia (CFSs) tales como CSF-macrófrago (M-CSF) ; CSF-granulocito-macrófago (GM-CSF) ; y CSF-granulocito (G-CSF); interieucinas (lis) tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17; y otros factores polipéptido incluyendo LIF y ligando kit (KL) . Como se utiliza en la presente, el término citosina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citosinas de secuencia natural. El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o ocasiona la destrucción de células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (e.g., I131, I125, Y90, y Re186) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacterial, fungal , vegetal o animal o sus fragmentos . Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™) ; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altertamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ,- una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo los análogos sintéticos adozelesina, carzelesina, y bizelesina) ; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI) ; eleterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, mecloretamina, óxido de mecloretamina hidrocloruro, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos enediina (e.g., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma II y caliqueamicina pHIl, ver, e.g., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de enediina cromoproteína relacionados) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (Adriamycin™) (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluoroacil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona alfornitina; eliptinium acetato; una epotilona; etoglucid nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol ; nitracrina pentostatin; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxin; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2 , 2 ' , 2 ' ' -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente T-2 toxina, verracurin A, roridin A y anguidina) ; uretan; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides; e.g., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc, Anthony, Francia) ; clorambucil; gemicitabina (Gemzar™) ; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etoposida (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinoreblina (Navelbine™) ; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT- 11; inhibidor topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También se encuentran incluidos en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas en tumores tales como anti-estrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs) , incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo Novaldex™) , raloxifeno, droloxifeno, y toremifeno (Fareston™) ; inhibidores aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazolos, aminoglutetimida, megestrol acetato (Megace™) , exemestano, formestano, fadrozolo, vorozolo (Rivisor™) , letrozolo (Femara™) y anastrozolo (Arimidex™) ; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer, que sobreexpresa cualquiera de los genes identificados en la presente, ya sea in vitro y/o in vivo. Por consiguiente, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce significativamente el porcentaje de células que sobreexpresan tales genes en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular (en un lugar diferente a la fase S) , tales como los agentes que inducen el arresto de Gl y el arresto de fase M. Los bloqueadores clásicos de fase M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina) ; taxol , e inhibidores topo II tales como doxorrubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida y bleomicina. Aquellos agentes que arrestan Gl también se extienden en el arresto de fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación de ADN tales como tamoxifen. Prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluoroacilo, y ara-C. Puede encontrarse información adicional en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelshon and Israel, eds., Capítulo 1, titulada "Cell cycle regulation, oncogens and antineoplastic drugs" por Murakami et al., (WB Saunders : Philadeplhia, 1985), especialmente p. 13. Los términos "apoptosis" y ' "actividad apoptótica" se utilizan en un sentido amplio y se refieren a la forma ordenada o controlada de destrucción celular en mamíferos que se acompaña típicamente por uno o más cambios celulares característicos, incluyendo condensación de citoplasma, pérdida de microvilli de membrana en plasma, segmentación del núcleo, degradación de ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial . Esta actividad puede determinarse y calcularse, por ejemplo, mediante análisis de viabilidad celular, (tales como análisis Alamar blue o análisis MTT) , análisis FACS, activación de caspasa, fragmentación de ADN, (ver, por ejemplo, Nicoletti et al., J. Immunol . Methods., 139:271-279 (1981), y análisis de división de poli-ADP ribosa polimerasa "PARP", conocidos en la técnica. Como se utiliza en la presente, el término "trastorno" en general, se refiere a cualquier condición que se beneficie del tratamiento con las composiciones descritas en la presente, incluyendo cualquier enfermedad o trastorno que pueda tratarse mediante cantidades efectivas de Apo2L-/TRAIL, un anticuerpo anti-DR4, y/o un anticuerpo anti-DR5. Estos incluyen trastornos crónicos y agudos, así como aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitantes de los trastornos que se tratan en la presente incluyen cánceres benignos y malignos, trastornos infamatorios, angiogénicos e inmunológicos, enfermedades autoinmunes, artritis (incluyendo artritis reumatoide) , esclerosis múltiple y VIH/SIDA. Los términos "cáncer" , "canceroso" o "maligno" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma y sarcoma. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, mieloma, cáncer pulmonar de célula pequeña, cáncer pulmonar de célula no pequeña, glioma, cáncer gastrointestinal (tracto), cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer hepático, leucemia linfoblástica, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer tioriodeo, neuroblastoma, cáncer pancreático, glioblastoma multiforme, cáncer cervical, cáncer cerebral, cáncer estomacal, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer de cabeza y cuello. El término "enfermedad relacionada con la inmunidad" significa una enfermedad en la cual un componente del sistema inmune de un mamífero ocasiona, media o de otra manera contribuye a la mortalidad en el mamífero. También se incluyen enfermedades en las cuales la estimulación o intervención de la respuesta inmune tiene un efecto de mejoramiento en el progreso de la enfermedad. Incluidas dentro de este término se encuentran las enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias mediadas por la inmunidad, enfermedad inflamatorias no mediadas por la inmunidad, enfermedades infecciosas, y enfermedades de inmunodeficiencia. Ejemplos de enfermedades relacionadas con la inmunidad e inflamatorias, de las cuales algunas son mediadas por la inmunidad o por célula T, que pueden tratarse de acuerdo con la invención, incluyen eritematosis lupus sistémica, artritis reumatoides, artritis juvenil crónica, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías infamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis) , síndrome de Sjorgen, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal) , trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopenia idiopática, trombocitopenia mediada por inmunidad) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), diabetes melitus, enfermedad renal mediada por la inmunidad (glomerulonefritis, nefritis tubulointerstitial) , enfermedad desmielinante de los sistemas nerviosos central y periférico tal como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinante idiopática o síndrome Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos) , hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y colangitis esclerosante, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas tales como enfermedad inflamatoria intestinal (colitis ulcerativa: enfermedad de Crohn), enterpatía sensible al gluten, y enfermedad de Whiple, enfermedades de la piel autoinmunes o mediadas por la inmunidad incluyendo enfermedades bultosas de la piel, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimenticia y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como pneumonías eosinófilas, fibrosis pulmonar idiopática y pneumonitis por hipersensibilidad, enfermedades asociadas a transplante incluyendo rechazo de injerto y enfermedad de injerto contra huésped. Las enfermedades infecciosas incluyen SIDA (infección por VIH) , hepatitis A, B, C, D, y E, infecciones bacteriales, infecciones por hongos, infecciones por protozoarios e infecciones parasitarias. "Enfermedad autoinmune" se utiliza en la presente en un sentido general amplio para referirse a trastornos o condiciones en mamíferos, en las cuales la destrucción de tej ido normal o sano surge de respuestas inmunes humorales o celulares del mamífero individual a los constituyentes de su propio tejido. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso, tiroiditis, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, y enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) . El término "marcado" cuando se utiliza en la presente, se refiere a una molécula quimérica que comprende un anticuerpo o polipéptido fusionado a un "polipéptido marca" . El polipéptido marca tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual puede producirse un anticuerpo o para proporcionar alguna otra función, tal como la capacidad para oligomerizar (e.g., como ocurre con los péptidos que tienen dominios de ziper de leucina) , y aún demasiado cortos a fin de no interferir en general con la actividad del anticuerpo o polipéptido. El polipéptido marca es también preferentemente suficientemente único a fin de que un anticuerpo específico a la marca no reaccione sustancialmente de manera cruzada con otros epítopes. Los polipéptidos marca adecuados tienen generalmente al menos seis residuos aminoácido y comúnmente entre aproximadamente 8 a aproximadamente 50 residuos aminoácido (preferentemente, entre aproximadamente 10 a aproximadamente 20 residuos) . El término "ion de metal divalente" se refiere a un ion de metal que tiene dos cambios positivos. Ejemplos de iones de metal divalentes incluyen, pero no se limitan a zinc, cobalto, níquel, cadmio, magnesio y manganeso. Las formas particulares de tales metales que pueden emplearse incluyen formas de sal (e.g., formas de sal farmacéuticamente aceptables) , tales como formas de cloruro, acetato, carbonato, citrato y sulfato de los iones de metal divalente antes mencionados. Opcionalmente un ion de metal divalente para uso en la presente invención es zinc, y preferentemente, la forma de sal, sulfato de zinc o cloruro de zinc. "Aislado" , cuando se utiliza para describir los diversos péptidos o proteínas descritos en la presente, significa un péptido o proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían típicamente con los usos diagnósticos o terapéuticos para el péptido o proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solubles proteináceos y no proteináceos. En modalidades preferidas, el péptido o proteína se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos de terminación N o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando azul Coomassie o, preferentemente, colorante de plata, o (3) a homogeneidad mediante técnicas espectroscópicas de masa o de mapa de péptido. El material aislado incluye péptido o proteína in situ dentro de células recombinantes dado que al menos un componente de su ambiente natural no se encontrará presente. Sin embargo, ordinariamente, el péptido o proteína aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. "Identidad porcentual (%) de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias identificadas en la presente, se define como el porcentaje de residuos aminoácido en una secuencia candidato que son idénticos a los residuos aminoácido en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr la máxima identidad porcentual de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinación de la identidad porcentual de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que se encuentran en la experiencia en la técnica, que pueden determinar los parámetros apropiados para el cálculo de la alineación, incluyendo la asignación del algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre las secuencias de longitud total que van a compararse. Para los propósitos en la presente, los valores de identidad porcentual de secuencia de aminoácidos pueden obtenerse utilizando el programa de cómputo para comparación de secuencia ALIGN-2, cuyo autor es Genentech, Inc., y el código de la fuente que se ha presentado con documentación de usuario en la U.S. Copyright Office, Washington, D.C., 20559, registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra públicamente disponible de Genentech Inc., South San Francisco, California. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen mediante el programa ALIGN-2 y no varían. La "rigidez" de las reacciones de hibridación se determina fácilmente por el de experiencia ordinaria en la técnica, y es generalmente un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas más altas para el recocido apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para recocerse cuando se encuentran presentes cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Entre más alto sea el grado de identidad deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, será más alta la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, las temperaturas más altas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rígidas, mientras que las temperaturas más bajas las disminuyen. Para detalles adicionales y explicación de la rigidez de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . Las "condiciones de alta rigidez" , como se define en la presente, se identifican por aquellas que: (1) emplean baja resistencia iónica y alta temperatura para lavado; 0.015 M hidrocloruro de sodio/0.0015 M citrato de sodio/0.1% sodio dodecil sulfato a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente de desnaturalización; 50% (v/v) formamida con albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficoll al 0.1%/polivinilpirrolodona al 0.1%/50 mM amortiguador de fosfato de sodio a un pH 6.5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42°C; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (0.75 M NaCl , 0.075 M citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 ug/ml), SDS al 0.1%, y dextran sulfato al 10% a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°C, seguido por un lavado de alta rigidez que consiste de O.l x SSC conteniendo EDTA a 55 °C. Las "condiciones moderadamente rígidas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye incubación durante la noche a 37 °C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato trisodio) , 50 mM fosfato de sodio (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, dextran sulfato al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50 °C. El técnico experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, resistencia iónica, etc., según sea necesario para acomodar los factores tales como longitud de la sonda y lo similar. El término "iniciador" o "iniciadores" se refiere a secuencias de oligonucleótidos que se hibridan a un polinucleótido objetivo de ARN o ADN complementario y sirven como puntos de inicio para la síntesis escalonada de una forma polinucleótido de mononucleótidos mediante la acción de una nucleotidiltransferasa, como ocurre, por ejemplo, en una reacción de cadena polimerasa. El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente unida en un organismo huésped particular. Las secuencias de control adecuadas para procariotos, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operación, y un sitio de unión ribosoma. SE sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y mejoradores. El ácido nucleico se encuentra "operablemente unido" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o guía de secreción se encuentra operablemente unido al ADN por un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se encuentra operablemente unido a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosoma se encuentra operablemente unido a una secuencia de codificación si se encuentra colocado a modo de facilitar la translación. Generalmente, "operablemente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un guía de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que encontrarse contiguos. La unión se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótido sintético o uniones se utilizan de acuerdo con la práctica convencional . "Citotoxicidad mediada por las células, dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por la célula en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcRs) (e.g., células destructoras naturales (NK) , neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y subsecuentemente ocasionan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan solamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI , RcyRII y FcyRIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . , 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede llevarse a cabo un análisis ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de E.U. No. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efector útiles para tales análisis incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células destructoras naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede establecerse in vivo, e.g., en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., PNAS (EUA) 95:652-656 (1998) . Las "células efector humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y efectúan funciones efector. Preferentemente, las células expresan al menos FcyRIII y efectúan una función efector ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células destructoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; siendo preferidas las PBMCs y células NK. Los términos "receptor Fe" y "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye los receptores de las subclases Fc?RI , Fc?RII y Fc?RIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente divididas de estos receptores. Los receptores Fc?RII incluyen Fc?RIIA (un "receptor de activación") y Fc?RIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor de activación Fc?RIIA contiene un motivo de activación en base al inmunorreceptor tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc?RIIB contiene un motivo de inhibición en base al inmunorreceptor tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (ver, Daeron, Annu. Rev. Immunol . , 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetech y Kinet, Annu. Rev. Immunol . , 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330.41 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos que van a identificarse en el futuro, se encuentran abarcados por el término "FcR" en la presente. El término incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol . , 117_587 (1976); y Kim et al., J. Immunol . , 24:249 (1994)). Los FcRs en la presente, incluyen polimorfismos tales como el dimorfismo genético en el gen que codifica FcyRIIIa dando como resultado ya sea una fenilalanina (F) o una valina (V) en la posición de aminoácido 158, ubicada en la región del receptor que se une a IgG. La valina homozigua FcyRIIIa (FcYRIIIa-158V) ha mostrado tener una mayor afinidad para IgGl humana y mediar una ADCC incrementada in vivo, en relación con la fenilalanina homózigua FcyRIIIa (FcyRIIIa-158F) o receptores heteróziguos (FcyRIIIa-158F/V) . "Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar un objetivo en presencia del complemento. La trayectoria de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (Ciq) a una molécula (e.g., un anticuerpo) complejada con un antígeno cognado. Para establecer la activación del complemento, puede llevarse a cabo un análisis CDC, e.g., como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods, 202:163 (1996). II. TÍPICOS MÉTODOS Y MATERIALES DE LA INVENCIÓN Los métodos y ensayos descritos en la presente se dirigen a examinar la expresión de uno o más biomarcadores en una muestra de tejido o célula de mamífero, en donde la determinación de esa expresión de uno o más de tales biomarcadores predice o indica si la muestra de tejido o célula será sensible a los agentes que inducen apoptosis tales como Apo2L/TRAIL y anticuerpos agonistas anti-DR5. Los métodos y ensayos incluyen aquellos que examinan la expresión de biomarcadores tales como ciertas fucosiltransferasas, en particular fucosiltransferasa 3 (FUT3) y/o fucosiltransferasa 6 (FUT6) , así como antígenos silalilo Lewis A y/o X. Como se trató anteriormente, existen algunas poblaciones de tipos celulares humanos enfermos (tales como ciertas poblaciones de células cancerosas) que son resistentes a la inducción a apoptosis. En consecuencia, se cree que los métodos y ensayos descritos pueden proporcionar medios convenientes, eficiente y potencialmente efectivos en costo para obtener datos e información útiles para establecer terapias apropiadas o efectivas para tratar pacientes. Por ejemplo, a un paciente que se ha diagnosticado con cáncer o una condición relacionada con la inmunidad, podría efectuársele una biopsia para obtener una muestra de tejido o célula, y la muestra podría examinarse por medio de diversos análisis in vitro para determinar si las células del paciente serían sensibles a un agente terapéutico tal como Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista del receptor de eliminación. La invención proporciona métodos para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o célula de mamífero (tal como una célula cancerosa) a Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista receptor de eliminación. En los métodos, una muestra de tejido o célula de mamífero se obtiene y se examina por la expresión de uno o más biomarcadores. Los métodos pueden conducirse en una variedad de formatos de análisis, incluyendo análisis para detectar la expresión de ARNm, análisis enzimáticos para detectar la presencia de actividad enzimática, y análisis inmunohistoquímicos. La determinación de la expresión de tales biomarcadores en dichos tejidos o células predecirá si los tejidos o células serán sensibles a la actividad que induce la apoptosis de Apo2L/TRAIL y/o anticuerpo agonista del receptor de eliminación. Los solicitantes encontraron sorprendentemente que la expresión de tales biomarcadores particulares se correlaciona con la sensibilidad de tales tejidos y células a agentes de inducción a apoptosis tales como Apo2L/TRAIL y anticuerpos agonistas receptores de eliminación. Como se trata abajo, la expresión de diversos marcadores en una muestra puede analizarse mediante un número de metodologías, muchas de las cuales son conocidas en la técnica y comprendidas por el técnico experto, incluyendo pero sin limitarse a, análisis inmunohistoquímicos y/o Western, análisis cuantitativos en base a sangre (como por ejemplo Serum ELISA) (para examinar, por ejemplo, los niveles de expresión de proteína) , análisis bioquímicos de actividad enzimática, hibridación in situ, análisis Northern y/o análisis PCR de ARNms y análisis genómicos Southern (para examinar, por ejemplo, la supresión o amplificación del gen) , así como cualquiera de la amplia variedad de análisis que pueden efectuarse mediante análisis de disposición de gen y/o tejido. Los protocolos típicos para evaluar el estado de los genes y productos de gen, se encuentran, por ejemplo, en Ausubel et al., Eds., 1995, Currrent Protocols in Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 (Immunoblotting) y 18 (PCR Analysis) . Los siguientes protocolos referentes a la detección de biomarcadores particulares, tales como fucosiltransferasa 3 (FUT3) , fucosiltransferasa 6 (FUT6) , sialilo Lewis A, y sialilo Lewis X, en una muestra, se proporcionan abajo para propósitos ilustrativos. Los métodos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o prueban por la presencia de proteínas sialilo Lewis A y/o sialilo Lewis X en una muestra de tejido o célula de mamífero. Pueden emplearse una variedad de métodos para detectar proteína relacionada con sialilo Lewis A y/o sialilo Lewis C e incluyen, por ejemplo, análisis inmunohistoquímicos, inmunoprecipitación, inmunoanálisis Western, análisis de unión molecular, ELISA, ELIFA, selección celular activada por fluorescencia (FACS) y lo similar. Por ejemplo, un método opcional para detectar la expresión de proteína sialilo Lewis A y/o sialilo Lewis X en un tejido o muestra comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo sialilo Lewis A y/o sialilo Lewis X, un fragmento de sialilo Lewis A y/o sialilo Lewis X del mismo, o una proteína recombinante que contiene la región de unión de antígeno de un anticuerpo sialilo Lewis A y/o sialilo Lewis X; y después detectar la unión de la proteína relacionada con sialilo Lewis A y/o sialilo Lewis X en la muestra. En modalidades particulares de la invención, la expresión de proteínas sialilo Lewis A y/o sialilo Lewis X en una muestra se examina utilizando protocolos de inmunohistoquímica y coloración. La coloración inmunohistoquímica de secciones de tejido ha mostrado ser un método confiable para establecer o detectar la presencia de proteínas en una muestra. Las técnicas de inmunohistoquímica ("IHC") utilizan un anticuerpo para probar y visualizar antígenos celulares in situ, generalmente mediante métodos cromogénicos o fluorescentes. Para la preparación de muestras, puede utilizarse una muestra de tejido o célula de un mamífero (típicamente un paciente humano) . Los ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, células cancerosas tales como células de cáncer de colon, mama, próstata, ovario, pulmón, estómago, páncreas, linfoma y leucemia. La muestra puede obtenerse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, excisión quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una modalidad, la muestra se fija y se embebe en parafina o lo similar. La muestra de tejido puede fijarse (i.e., preservarse) mediante metodología convencional (Ver e.g., "Manual of Histotogical Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 3a edición, (1960), Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blaston División McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ilreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). el experto en la técnica apreciará que la selección de un fijador se determina por el propósito para el cual va a colorearse histológicamente o analizarse la muestra. El experto en la técnica apreciará también que la longitud de fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y del fijador utilizado. A manera de ejemplo, puede utilizase formalina neutra amortiguada, Bouin's o paraformaldehído para fijar una muestra. Generalmente, la muestra se fija primero y después se deshidrata a través de una serie ascendente de alcoholes, se infiltra y se embebe con parafina u otro medio de seccionado a fin de la muestra pueda seccionarse. Alternativamente, puede seccionarse el tejido y fijar las secciones obtenidas. A manera de ejemplo, la muestra de tejido puede embeberse y procesarse en parafina mediante metodología convencional (Ver, e.g., "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology" , supra) . Ejemplos de parafina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, Paraplast, Broloid y Tissuemay. Una vera embebida la muestra de tejido, la muestra puede seccionarse mediante un microtomo o lo similar (Ver, e.g., "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra) . A modo de ejemplo, para este procedimiento, las secciones pueden variar de aproximadamente tres mieras a aproximadamente cinco mieras de grosor. Una vez seccionadas, las secciones pueden unirse a portaobjetos mediante diversos métodos estándar. Ejemplos de adhesivos para portaobjetos incluyen, pero no se limitan a, silano, gelatina, poli-L-lisina y lo similar. A modo de ejemplo, las secciones embebidas en parafina pueden unirse a portaobjetos de carga positiva y/o portaobjetos cubiertos con poli-L-lisina. Si se ha utilizado parafina como el material de embebido, generalmente se desparafinan las secciones de tejido y se rehidratan en agua. Las secciones de tejido pueden desparafinarse mediante diversas metodologías estándar convencionales. Por ejemplo, pueden utilizarse xilenos y una serie gradualmente descendente de alcoholes (Ver, e.g., "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Alternativamente, pueden utilizarse agentes de desparafinación no orgánicos comercialmente disponibles, tales como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas) . Opcionalmente, subsecuente a la preparación de la muestra, puede analizarse una sección de tejido utilizando IHC. IHC puede efectuarse en combinación con técnicas adicionales tales como coloración morfológicas y/o hibridación de fluorescencia in situ. Se encuentran disponibles dos métodos generales de IHC; análisis directos e indirectos. De acuerdo con el primer análisis, la unión del anticuerpo al antígeno objetivo (e.g., sialilo Lewis A y/o sialilo Lewis X) se determina directamente. Este análisis directo utiliza un reactivo marcado, tal como una marca fluorescente o un anticuerpo primario marcado con enzimas, que pueden visualizarse sin interacción adicional del anticuerpo. En un análisis indirecto típico, el anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno y después un anticuerpo marcado secundario se une al anticuerpo primario. Cuando el anticuerpo secundario se conjuga a una marca enzimática, se agrega un sustrato cromogénico o fluorogénico para proporcionar la visualización del antígeno. La amplificación se señal se presenta debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopes en el anticuerpo primario. El anticuerpo primario y/o secundario utilizado para inmunohistoquímica típicamente se marcará con un residuo detectable. Se encuentran disponibles numerosas marcas que pueden agruparse generalmente en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H, y 131I . el anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991) por ejemplo, y la radiactividad puede calcularse utilizando conteo de escintilación. (b) Partículas de oro coloidal. ® Marcas fluorescentes incluyendo, pero sin limitarse a, quelatos de tierra enrarecida (quelatos de europio), Rojo Texas, rhodamina, fluorescein, dansil, Lissamine, umbelliferona, fococriterina, ficocianina, o fluoróforos comercialmente disponibles tales como SPECTRUM 0RANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de cualquiera o más de los anteriores. Las marcas fluorescentes pueden conjugarse al anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro. (d) Se encuentran disponibles diversas marcas de enzima-sustrato y la Patente de E.U. No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Se describieron anteriormente las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente mediante una reacción química y entonces puede emitir luz que puede medirse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o que proporciona energía a un receptor fluorescente. Ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (e.g., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacterial; Patente de E.U. No. 4,737,456), luciferin, 2 , 3-dihidroftalazinadionas, malato dehidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa horseradish (HRPO) , alcalina fosfatasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (e.g., glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6- fosfato dehidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa y lo similar. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzime-Antibody Conjugates for use en Enzime Immunoassay, en Methods in Enzym. , (ed. J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic press, New York, 73:147-166 (1981). Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) peroxidasa horseradish (HPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en donde la hidrógeno peroxidasa oxida un colorante precursor (e.g., ortofenileno diamina (OPD) o 3, 3' , 5, 5' -tetrametil bencidina hidrocloruro (TMB)); (ii) alcalina fosfatasa (AP) con para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y (iii) beta-D-galactosidasa (3-D-Gal) con un sustrato cromogénico (e.g., p-nitrofenil-beta-D-galactosidasa) o un sustrato fluorogénico (e.g., 4-metilumbeliferil-beta-D-galactosidasa) . Se encuentran disponibles para los expertos en la técnica otras numerosas combinaciones de enzima-sustrato. Para una revisión general de estos, ver Patentes de E.U. Nos. 4,275,149 y 4,318,980. Algunas veces, la marca se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El técnico experto tendrá conocimiento de diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las cuatro amplias categorías de marcas antes mencionadas puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a avidina y por tanto, la marca puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno y uno de los diferentes tipos de marcas mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno. Por consiguiente, puede lograrse la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo. Además de los procedimientos de preparación de muestra anteriormente tratados, puede desearse un tratamiento adicional de la sección de tejido previo a, durante o después de IHC . Por ejemplo, pueden llevarse a cabo métodos de recuperación de epítope tales como calentamiento de la muestra de tejido en amortiguador de citrato (ver, e.g., Leong et al.,' Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996). Después de una etapa de bloqueo opcional, la sección de tejido se expone al anticuerpo primario durante un período de tiempo suficiente y bajo las condiciones adecuadas tales como que el anticuerpo primario se una al antígeno de proteína objetivo en la muestra de tejido. Las condiciones apropiadas para lograr esto pueden determinarse mediante experimentación de rutina. El grado de unión del anticuerpo a la muestra se determina utilizando cualquiera de las marcas detectables antes tratadas. Preferentemente, la marca es una marca enzimática (e.g., HRPO) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico tal como el cromógeno 3,3'-diaminobencidina. Preferentemente, la marca enzimática se conjuga al anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo primario (e.g., el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo de cabra anti-conejo) . Opcionalmente, los anticuerpos empleados en el análisis IHC para detectar la expresión de sialilo Lewis A o sialilo Lewis X, son los anticuerpos anti-sialilo Lewis A y anti-sialilo Lewis X, respectivamente. Opcionalmente, los anticuerpos anti-sialilo Lewis A y anti-sialilo Lewis X son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos anti-sialilo Lewis A y anti-sialilo Lewis X se encuentran fácilmente disponibles en la técnica, incluyendo de diversas fuentes comerciales. Los especímenes así preparados pueden montarse y cubrirse. Entonces se determina la evaluación en portaobjetos, e.g., utilizando un microscopio y pueden utilizarse criterios de intensidad de coloración utilizados rutinariamente en la técnica. cuando el antígeno es la proteína sialilo Lewis A y sialilo Lewis X, el criterio de intensidad de coloración puede evaluarse como sigue: TABLA 1 Típicamente, se cree que una puntuación de patrón de coloración de aproximadamente 2 "o mayor en tal análisis IHC predice o indica sensibilidad de una célula de mamífero (tal como una célula de cáncer de mamífero) a Apo2L/TRAIL o a un anticuerpo agonista receptor de eliminación. En métodos alternativos, la muestra puede ponerse en contacto con un anticuerpo específico para dicho biomarcador bajo condiciones suficientes para formar un complejo de anticuerpo-biomarcador, y después detectar dicho complejo. La presencia del biomarcador puede lograrse en un número de formas, tal como mediante procedimientos de inmunoanálisis Western y ELISA para analizar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Se encuentra disponible un amplio rango de técnicas de inmunoanálisis que utilizan tal formato de análisis, ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estas incluyen análisis de sitio único y de dos sitios o "sandwich" de tipo no competitivo, así como los análisis de unión competitivos típicos. Estos análisis incluyen también la unión indirecta de un anticuerpo marcado a un biomarcador objetivo. Los análisis sandwich se encuentran entre los análisis más útiles y comúnmente utilizados. Existe un número de variaciones de la técnica del análisis sandwich, y todas pretenden abarcarse por la presente invención. Brevemente, en un análisis frontal típico, un anticuerpo no marcado se inmoviliza en un sustrato sólido, y la muestra que va a probarse se pone en contacto con la molécula unida. Después de un período de incubación adecuado, durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, se agrega un segundo anticuerpo específico para el antígeno marcado con una molécula informante capaz de producir una señal detectable, y se incuba permitiendo el tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo de anticuerpo-antígeno-marcado. Todo material sin reactivar se lava, y se determina la presencia del antígeno mediante observación de una señal producida por la molécula informante. Los resultados pueden ser ya sea cualitativos, mediante simple observación de la señal visible, o cuantitativos mediante la comparación con una muestra de control que contiene cantidades conocidas del biomarcador. Las variaciones en el análisis frontal incluyen un análisis simultáneo, en el cual se agrega tanto la muestra como el anticuerpo marcado simultáneamente al anticuerpo unido. Estas técnicas son muy conocidas por los expertos en la técnica incluyendo cualquier variación menor como será fácilmente aparente. En un análisis frontal típico, un primer anticuerpo que tiene especificidad para el biomarcador se une ya sea de manera covalente o pasiva a una superficie sólida. La superficie sólida es típicamente vidrio o un polímero, siendo los polímeros más comúnmente utilizados celulosa, poliacrilamida, nilón, poliestireno, polivinil cloruro o polipropileno. Los soportes sólidos pueden encontrarse en forma de tubos, perlas, discos de microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para conducir un inmunoanálisis. Los procesos de unión son muy conocidos en la técnica y consisten generalmente de la unión de reticulación covalente o absorción física del complejo de polímero-anticuerpo y lavado en la preparación de la muestra de prueba. Se agrega entonces al complejo en fase sólida un alícuota de la muestra que va a probarse y se incuba durante un período de tiempo suficiente (e.g., 2-40 minutos o durante la noche si es más conveniente) y bajo las condiciones adecuadas (e.g., desde temperatura ambiente hasta 40°C tal como 25 °C y 32 °C inclusive) para permitir la unión de toda subunidad presente en el anticuerpo. Después del período de incubación, la fase sólida de la subunidad de anticuerpo se lava y se seca y se incuba con un segundo anticuerpo específico para una porción del biomarcador. El segundo anticuerpo se une a una molécula informante que se utiliza para indicar la unión del segundo anticuerpo al marcador molecular. Un método alternativo implica inmovilizar los marcadores objetivo en la muestra y después exponer el objetivo inmovilizado al anticuerpo específico que puede o no marcarse con una molécula informante. Dependiendo de la cantidad del objetivo y de la resistencia de la señal de la molécula informante, un objetivo unido puede ser detectable mediante el marcado directo con el anticuerpo. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, específico para el primer anticuerpo se expone al complejo de objetivo-primer anticuerpo para formar un complejo terciario de objetivo-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta mediante la señal emitida por la molécula informante. Por "molécula informante" como se utiliza en la presente especificación, se entiende una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección del anticuerpo unido al antígeno. Las moléculas informantes más comúnmente utilizadas en este tipo de análisis son ya sea enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionúclidos (e.g., radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes. En el caso de un inmunoanálisis de enzimas, una enzima se conjuga al segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o periodato. Como se reconocerá fácilmente, existe una amplia variedad de diferentes técnicas de conjugación que se encuentran fácilmente disponibles para el técnico experto. Las enzimas comúnmente utilizadas incluyen peroxidasa horseradish, glucosa oxidasa, galactosidasa y alcalina fosfatasa, entre otras. Los sustrato que se utilizan con las enzimas específicas se seleccionan generalmente para la producción, a la hidrólisis mediante la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen alcalina fosfatasa y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogénicos, que producen un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogénicos anotados anteriormente . en todos los casos, el anticuerpo marcado con enzimas se agrega al primer complejo de anticuerpo-marcador molecular, se deja unir, y después el exceso del reactivo se lava. Una solución conteniendo el sustrato apropiado se agrega entonces al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El sustrato reaccionará con la enzima unida al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede cuantificarse adicionalmente, comúnmente de manera espectrofotométrica, para dar una indicación de la cantidad de biomarcador presente en la muestra. alternativamente, los compuestos fluorescentes, tales como fluorescein y rhodamina, pueden acoplarse químicamente a los anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activa mediante iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo absorbe la energía luminosa, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido por la emisión de la luz en un color característico visualmente detectable con un microscopio luminoso. Como en el EIA, el anticuerpo marcado con fluorescencia se deja unir al primer complejo de anticuerpo-marcador molecular. Después de lavar el reactivo no unido, el complejo terciario restante se expone entonces a la luz de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia del marcador molecular de interés. Las técnicas de inmunofluorescencia y EIA se encuentran ambas muy establecidas en la técnica. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas informantes, tales como radioisótopo, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes.
Se contempla que las técnicas antes descritas pueden emplearse también para detectar la expresión de polipéptidos FUT3 o FUT6. Los métodos de la invención incluyen además protocolos que examinan la presencia y/o expresión de ARNms tales como ARNms FUT3 y/o FUT6 en una muestra de tejido o célula. Los métodos para la evaluación de ARNms en células son muy conocidos e incluyen, por ejemplo, análisis de hibridación utilizando sondas de ADN complementarias (tales como hibridación in situ utilizando ribosondas FUT3 y/o FUT6, inmunoanálisis Northern y técnicas relacionadas) y diversos análisis de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR utilizando iniciadores complementarios para FUT3 y/o FUT6 y otros métodos de detección de tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y lo similar) . Las muestras de tejido o célula de mamíferos puede analizarse convenientemente por, e.g., ARNms FUT3 y/o FUT6 , utilizando análisis Northern, dot blot o PCR. Por ejemplo, los análisis RT-PCR tales como análisis PCR cuantitativos son muy conocidos en la técnica. En una modalidad ilustrativa de la invención, un método para detectar un ARNm FUT3 y/o FUT6 en una muestra biológica comprende la producción de ADNc a partir de la muestra mediante transcripción inversa utilizando al menos un iniciador; la amplificación del ADNc así producido utilizando un polinucleótido FUT3 y/o FUT6 como iniciador de sentido y antisentido para amplificar ADNcs FUT3 y/o FUT6 en el mismo; y la detección de la presencia del ADNc FUT3 y/o FUT6 amplificado. Además, tales métodos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de ARNm FUT3 y/o FUT6 en una muestra biológica (e.g., examinando simultáneamente los niveles de una secuencia de ARNm de control comparativo de un gen "doméstico" tal como un miembro de la familia actina) . Opcionalmente, puede determinarse la secuencia del ADNc FUT3 y/o FUT6 amplificado. Las modalidades de materiales de este aspecto de la invención incluyen iniciadores de FUT3 y/o FUT6 y pares de iniciadores que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualquiera de sus partes específicas, y sondas que se hibridan selectivamente o específicamente a moléculas de ácido nucleico de la invención o cualquiera de sus partes . Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelador de metal o enzima. Tales sondas e iniciadores pueden utilizarse para detectar la presencia de polinucleótidos FUT3 y/o FUT6 en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa proteínas FUT3 y/o FUT6. Como lo entenderá el técnico experto, pueden prepararse muchos diferentes iniciadores y sondas en base a las secuencias proporcionadas en la presente y utilizarse efectivamente para amplificar, clonar y/o determinar la presencia y/o los niveles de ARNms FUT3 y/o FUT6. Los métodos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o detectan ARNms, tales como FUT3 y FUT6 u otros ARNms fucosiltransferasa, en una muestra de tejido o célula mediante tecnologías de microdisposición. Utilizando microdisposiciones de ácido nucleico, las muestras de ARNm de prueba y de control de muestras de tej ido de prueba y de control se transcriben en forma inversa y se marcan para generar sondas de ADNc . Las sondas se hibridan entonces a una disposición de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. La disposición se configura de tal manera que se conoce la secuencia y posición de cada miembro de la disposición. Por ejemplo, . Una selección de genes que tienen potencial para expresarse en ciertos estados de enfermedad pueden disponerse en un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro de la disposición particular indica que la muestra de la cual se derivó la sonda expresa el gen. El análisis de expresión de gen diferencial del tejido enfermo puede proporcionar información valiosa. La tecnología de microdisposición utiliza técnicas de hibridación de ácido nucleico y tecnología de cómputo para evaluar el perfil de expresión de ARNm de miles de genes dentro de un solo experimento. (ver, e.g., WO 01/75166 publicada en Octubre 11 de 2001; (Ver, por ejemplo, U.S. 5,700,637, Patente de E.U. 5,445,934, y Patente de E.U. 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheumg V.G. et al., Nature Genetics 21 (Suppl) : 15-19 (1999) para un tratado de fabricación de disposición) . Las microdisposiciones de ADN son disposiciones miniatura que contienen fragmentos de gen que se sintetizan ya sea directamente sobre o por puntos sobre vidrio u otros sustratos. Miles de genes se representan comúnmente en una sola disposición. Un experimento típico de microdisposición implica las siguientes etapas: 1. Preparación de un objetivo marcado fluorescentemente a partir de ARN aislado de la muestra, 2. Hibridación del objetivo marcado a la disposición, 3. Lavado, coloración y exploración de la disposición, 4. Análisis de la imagen explorada y, 5. Generación de perfiles de expresión del gen. Actualmente, se utilizan dos tipos principales de microdisposiciones de ADN: disposiciones de oligonucleótido (comúnmente de 25 a 70 mers) y disposiciones de expresión de gen conteniendo productos de PCR preparados a partir de ADNcs. Al formar una disposición, los oligonucleótidos pueden ser ya sea prefabricados o colocados por puntos en la superficie o sintetizados directamente en la superficie (in situ) . El sistema Affymetrix GeneChip® es un sistema de microdisposición comercialmente disponible que comprende disposiciones fabricadas mediante la síntesis directa de oligonucleótidos en una superficie de vidrio. Disposiciones de Sonda/Gen: oligonucleótidos, comúnmente 25 mers, se sintetizan directamente sobre una superficie de vidrio mediante una combinación de fotolitografía a base de semiconductor y tecnologías de síntesis química en fase sólida. Cada disposición contiene hasta 400,000 diferentes oligos y cada oligo se encuentra presente en millones de copias. Dado que las sondas de oligonucleótidos se sintetizan en ubicaciones conocidas en la disposición, los patrones de hibridación y las señales de intensidad pueden interpretarse en términos de identidad de gen y niveles de expresión relativos mediante el software Affymetrix Microarray Suite. Cada gen se encuentra representado en la disposición por una serie de diferentes sondas de oligonucleótidos. Cada par de sondas consiste de un oligonucleótido de ajuste perfecto y un oligonucleótido que no ajusta. La sonda de ajuste perfecto tiene una secuencia exactamente complementaria al gen particular y por tanto mide la expresión del gen. La sonda que no ajusta difiere de la sonda de ajuste perfecto por una sola sustitución de base en la posición de base central, interrumpiendo la unión de la transcripción del gen objetivo. Esto ayuda a determinar el fondo y la hibridación no específica que contribuye a la señal medida para el oligo de ajuste perfecto. El software Microarray Suite sustrae las intensidades de hibridación de las sondas de no ajuste de las de las sondas de ajuste perfecto para determinar el valor absoluto o específico de intensidad para cada conjunto de sondas. Las sondas se seleccionan en base a la información actual del GenBank y otros depósitos de nucleótidos. Se cree que las secuencias reconocen regiones únicas del extremo 3' del gen. Se utiliza un horno GeneChip Hybridation Oven (horno de "rosticería" ) para llevar a cabo la hibridación de hasta 64 disposiciones en una sola vez. La estación de fluidos lleva a cabo el lavado y la coloración de las disposiciones de sonda. Éste es completamente automático y contiene cuatro módulos, conteniendo cada módulo una disposición de sonda. Cada módulo se controla independientemente mediante software Microarray Suite utilizando protocolos de fluido preprogramados . El explorador es un explorador confocal de fluorescencia láser que mide la intensidad de fluorescencia emitida por el ARNc marcado unido a las disposiciones de sonda. La estación de trabajo de cómputo con software Microarray Suite controla la estación de fluidos y el explorador. El software Microarray Suite puede controlar hasta ocho estaciones de fluidos utilizando protocolos de hibridación preprogramada, lavado y coloración para la disposición de sonda. El software también adquiere y convierte los datos de intensidad de hibridación en una señal de presencia/ausencia para cada gen utilizando los algoritmos apropiados. Finalmente, el software detecta los cambios en la expresión de gen entre experimentos mediante análisis de comparación y elabora el formato de la salida en archivos .txt, que pueden utilizarse con otros programas de software para análisis de datos posteriores. La expresión de un biomarcador seleccionado también puede establecerse examinando la supresión del gen o la amplificación del gen. La supresión o amplificación del gen puede medirse mediante cualquiera de una amplia variedad de protocolos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante inmunoanálisis Southern convencional, inmunoanálisis Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 77:5201-5205 (1980)), dot blotting (análisis de ADN), o hibridación in situ (e.g., FISH), utilizando una sonda apropiadamente marcada, métodos citogenéticos o hibridación genómica comparativa (CGH) utilizando una sonda apropiadamente marcada. A modo de ejemplo, estos métodos pueden emplearse para detectar la supresión o la amplificación de genes FUT3 y/o FUT6. Adicionalmente, puede examinarse el estado e metilación del biomarcador, tal como el gen FUT3 y/o FUT6, en una muestra de tejido o célula. La desmetilación y/o hipermetilación aberrante de islas CpG en las regiones reguladoras 5' del gen se presenta frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas, y puede dar como resultado la expresión alterada de varios genes. Se conocen en la técnica una variedad de análisis para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, pueden utilizarse, en procedimientos de hibridación Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden dividir secuencias que contienen sitios CpG metilados para establecer el estado de metilación de islas CpG. Además, la MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modificación inicial del ADN mediante bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas no metiladas en uracilo) seguida por amplificación utilizando iniciadores específicos para ADN metilado contra no metilado. Los protocolos que implican interferencia de metilación también pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, Unidad 12, Frederick M. , Ausubel et al., eds. 1995; DeMarzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks et al., Cáncer Epidemiol . Biomarkers Prev. 1998, 7:531-536); y Lethe et al., Int. J. Cáncer 76(6): 903-908 (1998) . La expresión de un biomarcador seleccionado en una muestra de tejido o célula también puede examinarse por medio de análisis funcionales o en base a actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, pueden conducirse análisis conocidos en la técnica para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en la muestra de tejido o célula. En los métodos de la presente invención, se contempla que la muestra de tejido o célula también puede examinarse por la expresión de Apo2L/TRAIL o receptores en la mezcla que se unen a Apo2L/TRAIL o al anticuerpo agonista del receptor de eliminación. Como se describió anteriormente y en la técnica, se cree actualmente que Apo2L/TRAIL se une a al menos cinco receptores diferentes; DR4 , DR5 , DcRl, DcR2 y OPG. Utilizando los métodos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la presente, puede detectarse la expresión de Apo2L/TRAIL, DR4 , DR5 , DcRl. DcR2 y/o OPG al nivel de ARNm y al nivel de la proteína. Como se muestra en las Figuras 10 y 11, los datos sugieren que el examen de la muestra de tejido o célula por la expresión de receptores DcRl y/o DcR2 puede proporcionar información adicional en cuanto a si la muestra de tejido o célula será sensible ya sea a Apo2L/TRAIL o al anticuerpo agonista del receptor de eliminación. A modo de ejemplo, las técnicas IHC antes descritas pueden emplearse para detectar ña presencia de una o más de tales moléculas en la muestra. Se contempla que en los métodos en los cuales se examina un tejido o muestra no solo por la presencia de un FUT o marcador de antígeno Lewis, sino también por la presente, e.g., de DR4 , DR5 o DcRl, pueden prepararse portaobjetos separados a partir del mismo tejido o muestra, y probar cada portaobjetos con un reactivo específico para cada biomarcador o receptor. Alternativamente, puede prepararse un solo portaobjetos a partir de la muestra de tejido o célula, y los anticuerpos dirigidos a cada biomarcador o receptor pueden utilizarse en conexión con un protocolo de coloración multicolor para permitir la visualización y detección de los biomarcadores o receptores respectivos. Subsecuente a la determinación de que la muestra de tejido o célula expresa uno o más de los biomarcadores indicando que la muestra de tejido o célula será sensible a la actividad de Apo2L/TRAIL o al anticuerpo agonista del receptor de eliminación, se contempla que puede administrarse al mamífero una cantidad efectiva del Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista del receptor de eliminación para tratar un trastorno, tal como cáncer o trastorno relacionado con la inmunidad, que afecta al mamífero. El diagnóstico en mamíferos de las diversas condiciones patológicas en la presente puede realizarse por el técnico experto. En la técnica se encuentran disponibles técnicas de diagnóstico que permiten, e.g., el diagnóstico o detección del cáncer o una enfermedad relacionada con la inmunidad en un mamífero. Por ejemplo, los cánceres pueden identificarse a través de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, palpación, análisis de sangre, rayos x, NMR y lo similar. También pueden identificarse fácilmente las enfermedades relacionadas con la inmunidad. El Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista del receptor de eliminación puede administrarse de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa única o mediante infusión continua durante un período de tiempo, mediante vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal , subcutánea, intraarticular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica, o inhalación. Opcionalmente, la administración puede efectuarse a través de infusión por mini bomba utilizando diversos aparatos comercialmente disponibles. Las dosis efectivas y programas para la administración de Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista del receptor de eliminación pueden determinarse empíricamente, y la elaboración de tales determinaciones se encuentra en el experto en la técnica. pueden emplearse dosis únicas o múltiples. Actualmente se cree que una dosis o cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL utilizada sola puede variar de aproximadamente 1 :g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o más al día. La escala de dosis interespecies puede efectuarse de una manera conocida en la técnica, e.g., como se describe en Mordenti et al., Pharmaceut . Res., 8:1351 (1991) . Cuando se emplea administración in vivo de Apo2L/TRAIL, las cantidades de dosis normales pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg hasta más de 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más al día, preferentemente de aproximadamente 1 ug/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. Se proporciona una guía en cuanto a dosis y métodos de suministro particulares en la literatura; ver, por ejemplo, Patentes de E.U. Nos. 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, y que la administración dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar el suministro de una manera diferente al de otro órgano o tejido. Se contempla que pueden emplearse aún terapias adicionales en los métodos. Las una o más terapias pueden incluir, pero no se limitan a, administración de terapia de radiación, citosina (s), agente (s) de inhibición del crecimiento, agente (s) quimioterapéutico (s) , agentes (s) citotóxico (s) , inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores de ras farnesil transferasa, inhibidores de angiogénesis, e inhibidores de cinasa ciclina-dependiente que son conocidos en la técnica y se definieron además anteriormente particularmente. Se contempla que tales otras terapias pueden emplearse como un agente separado de Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista del receptor de eliminación. Adicionalmente, pueden emplearse terapias a base de anticuerpos terapéuticos que se dirigen a antígenos de tumor tales como Rituxan™ o Herceptin™ así como anticuerpos anti-angiogénicos tales como anti-VEGF. Los programas de preparación y dosificación para agentes quimioterapéuticos puede utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o determinarse empíricamente por el médico experto. Los programas de preparación y dosificación para tal quimioterapia se describen también en Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El agente quimioterapéutico puede preceder, o seguir a la administración del Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista del receptor de eliminación, o puede proporcionase simultáneamente con el mismo. También puede ser deseable administrar anticuerpos contra otros antígenos, tales como anticuerpos que se unen a CD20, CD22a, CD18, CD40, ErbB2 , EGFR, ErbB3 , ErbB4 , factor endotelial vascular (VEGF) , u otros miembros de la familia TNFR (tales como OPG, TNFR1, TNFR2 , GITR, Apo-3, TACI , BCMA, BR3) . Alternativamente, o adicionalmente, dos o más anticuerpos que se unen al mismo o a dos o más de los diferentes antígenos descritos en la presente, pueden coadministrarse al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico administrar también una o más citosinas al paciente. Después de la administración, las células tratadas in vitro pueden analizarse. Cuando ha habido un tratamiento in vivo, el mamífero tratado puede monitorearse de diversas formas muy conocidas por el médico experto. Por ejemplo, las células de tumor pueden examinarse patológicamente para analizar por necrosis, o puede analizarse el suero por respuestas del sistema inmune. Para uso en las aplicaciones anteriormente descritas o sugeridas, también se proporcionan por la invención, equipos o artículos de fabricación. Tales equipos pueden comprender un medio de vehículo en compartimentos para recibir en cercano confinamiento uno o más medios de envase tales como viales, tubos y lo similar, comprendiendo cada uno de los medios de envase uno de los elementos separados que van a utilizarse en el método. Por ejemplo, uno de los medios de envase puede comprender una sonda que se encuentra o puede encontrarse marcada de manera detectable. tal sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína FUT3 y/o FUT6 o un gen o mensaje FUT3 y/o FUT6, respectivamente. Cuando el equipo utiliza hibridación de ácido nucleico para detectar el ácido nucleico objetivo, el equipo puede tener también envases que contienen nucleótido (s) para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico objetivo y/o un envase que comprende un medio informante, tal como una proteína de unión biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula informante, tal como una marca enzimática, fluorescente o radioisótopo. El equipo de la invención comprenderá típicamente el envase antes descrito y uno o más envases que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y de usuario, incluyendo amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de empaque con instrucciones de uso. Puede encontrarse presente una etiqueta en el envase para indicar que la composición se utiliza para una terapia específica o una aplicación no terapéutica, y también para indicar las instrucciones ya sea para uso in vivo o in vitro, tales como los descritos anteriormente. Los equipos de la invención tienen un número de modalidades. Una modalidad típica es un equipo que comprende un envase, una etiqueta en dicho envase, y una composición contenida dentro de dicho envase; en donde la composición incluye un anticuerpo primario que se une a la secuencia de polipéptidos FUT3 y/o FUT6, la etiqueta en dicho envase indica que la composición puede utilizarse para evaluar la presencia de proteínas FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero, e instrucciones para uso del anticuerpo FUT3 y/o FUT6 para la evaluación de la presencia de proteínas FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero. El equipo puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra de tejido y aplicar el anticuerpo y la sonda en la misma sección de una muestra de tejido. El equipo puede incluir un anticuerpo tanto primario como secundario, en donde el anticuerpo secundario se conjuga a una marca, e.g., una marca enzimática. Otra modalidad es un equipo que comprende un envase, una etiqueta en dicho envase y una composición contenida dentro de dicho envase; en donde la composición incluye un polinucleótido que se hibrida a un complemento del polinucleótido FUT3 y/o FUT6 bajo condiciones rígidas, la etiqueta en dicho envase indica que la composición puede utilizarse para evaluar la presencia de FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero, e instrucciones para uso del polinucleótido FUT3 y/o FUT6 para la evaluación de la presencia de ARN o ADN de FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero. Otros componentes opcionales en el equipo incluyen uno o más amortiguadores (e.g., amortiguador de bloqueo, amortiguador de lavado, amortiguador de sustrato, etc.), otros reactivos tales como sustrato (e.g., cromógeno) que se altera químicamente mediante una marca enzimática, solución de recuperación de epítope, muestras de control (controles positivos y/o negativos), portaobjetos de control etc. EJEMPLOS Se describen y se ilustran además diversos aspectos de la invención por medio de los siguientes ejemplos, de los cuales ninguno pretende limitar el alcance de la invención.
MÉTODOS Y MATERIALES: Cultivo celular y líneas celulares Las siguientes líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal humano: HCT-8, COLÓ 205, HCT 116, SW403, LoVo, SW948, Caco-2, COLÓ 201, SW1417, DLD-1, CX-1, HCT-15, LS 180, RKO, RKO-AS45-1, SK-CO-1, SW480, SW620, SW837, CL-40, COLO-206F, COLÓ 320M, COLÓ 320 HSR, COLO-678, HT-29, KM12, LS1034, SW1116, se obtuvieron del depósito de ATCC (Manassas, Virginia) , DSMZ (Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures) , JCRB (Japanese Cell Resources Bank) o ECACC (European Collection of Cell Cultures) y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% inactivado térmicamente, 2 mM de L-glutamina y 10 mM de HEPES. Análisis citotóxicos El análisis MTT (CellTiter 96 ® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay de Promega) , que es un análisis colorimétrico en base a la capacidad de células viables para reducir una sal amarilla soluble de tetrazolio (MTT) a cristales azules de formazan) , se utilizó para determinar la cantidad de células viables después del tratamiento con Apo2L/TRAIL o anticuerpo DR5. El análisis MTT se llevó a cabo mediante la adición de una solución de colorante premezclado optimizado a pozos de cultivo de una placa de 96 pozos conteniendo diversas concentraciones (0 a 100 ng/ml) de Apo2L/TRAIL o anticuerpo DR5. Durante una incubación de 4 horas, las células vivas convierten el componente tetrazolio de la solución de colorante en un producto de formazan. Después se agregó la solución de solubilización/detención a los pozos de cultivo para solubilizar el producto de formazan, y se registró la absorbencia a 570 nm utilizando un lector de placa de 96 pozos (SpectraMax) . La lectura de absorbencia a 570 nm es directamente proporcional al número de células normalmente utilizadas en análisis de proliferación. Aunque la máxima absorbencia para el producto de formazan es de 570 nm y las soluciones puras aparecen en azul, el color al final del análisis puede no ser azul y depende de la cantidad de formazan presente en relación con los otros componentes (incluyendo suero, rojo fenol acidificado y MTT no reducido) en el medio de cultivo. Los números de células se optimizaron efectuando una titulación celular para producir una señal de análisis cercana al extremo alto del rango lineal del análisis. Dado que diferentes células tienen niveles diferentes de actividad metabólica, esto se efectuó para cada línea celular por separado. Para la mayoría de las células de tumor examinadas, se utilizaron de 5,000 células por pozo a 20,000 células por pozo. Lo siguiente es una descripción etapa por etapa de los análisis empleados: 1. Las células utilizadas para el bioanálisis fueron de cultivos de reserva. 2. Determinación del número de células y viabilidad del azul triptan, y suspensión de las células hasta un número final de 5,000 a 20,000 células. por pozo. 3. Suministro de 50 ul de la suspensión celular a la placa de 96 pozos. 4. Incubación de las placas a 37°C en una atmósfera humidificada de C02 al 5% durante la noche. 5. Adición de 50 ul de medio de cultivo conteniendo diversas concentraciones variando de 0 a 1000 ng/ml de Apo2L/TRAIL o anticuerpo DR5 a las muestras de la placa de 96 pozos. Los controles fueron de 50 ul del medio de cultivo (sin Apo2L/TRAIL o anticuerpo DR5) y 100 ul del medio de cultivo (sin células) . Cada experimento se efectuó en un juego de pozos por triplicado y en tres días independientes. El volumen total de los pozos fue de 100 ul/pozo. 6. Incubación de las placas a 37°C durante 72 horas en una atmósfera humidificada de C02 al 5%. 7. Adición de 15 ul de solución colorante a cada pozo. 8. Incubación de las placas a 37 °C durante hasta 4 horas en una atmósfera humidificada de C02 al 5%. 9. Adición de 100 ul de la solución de solubilización/detención a cada pozo. 10. Incubación de las placas durante la noche a 37°C. 11. Registro de la absorbencia a una longitud de onda de 570 nm utilizando un lector de placa de 96 pozos. Se utilizó una longitud de onda de referencia de 750 nm para reducir el residuo por polvo celular, huellas digitales, y otra absorbencia no específica. 12. se utilizó el promedio de los valores de absorbencia para el control negativo como un valor vacío y se sustrajo de todas las otras lecturas. El promedio de los valores de absorbencia para cada concentración de Apo2L/TRAIL o anticuerpo DR5 se dividió entre el promedio de los valores de absorbencia del control positivo (células viables 100% -no tratadas) para calcular la cantidad de células viables (en •s . 13. Se trazó el porcentaje de células viables (eje Y) contra la concentración de Apo2L/TRAIL o anticuerpo DR5 (eje x, escala log) y se determinó el valor IC50 localizando el valor del eje X (ng/ml) correspondiente al 50% de células viables . Protocolo de Marcado Affymetrix Se tomó una lectura OD260/280 para todas las muestras, y las muestras se introdujeron en el BioAnalyzer.
Se utilizaron 5 ug de Total RNA de alta calidad. A. Síntesis de ADNc de Primera Cadena 1. Hibridación de iniciador DEPC-H20 x ul Mezclar por vórtice. Giro rápido ARN (5 ug) y ul Incubar a 70 °C durante 10 minutos. Empalmar (1:4 dil de reserva para 5 ug) 1 ul . Giro rápido y colocar en hielo T7-(dt)24 iniciador 1 ul Volumen 12 ul 2. Ajuste de temperatura 5 x amortiguador de ADNc de primera cadena 4 ul Agregar 7 ul (de la mezcla a la izquierda) a cada muestra. 0.1 M DTT 2 ul Mezclar por vórtice. Giro rápido. 10 mM de mezcla dNTP 1 ul Incubar a 42 °C durante 2 minutos. Volumen 7 ul 3. Síntesis de primera cadena Agregar 1 ul de SSII RT a cada muestra. SSII RT 1 ul Mezclar por pipeta hacia arriba y hacia abajo -o- por vórtice ligeramente. Giro rápido. Volumen total 20 ul Incubar a 42 °C durante 1 hora. B. Síntesis de ADNc de segunda cadena 1. Colocar las primera y segunda reacciones en hielo. Centrifugar brevemente para producir condensación en los lados del tubo. 2. Producción de la siguiente mezcla maestra de segunda cadena. DEPC-tratado H20 91 ul 5 x amortiguador de reacción de segunda cadena 30 ul 10 mM de mezcla sNTP 3 ul 10 U/ul de ADN ligasa 1 ul 10 U/ul de ADN Polimerasa I 4 ul 2 U/ul de RNasa H 1 ul Volumen total 130 ul 3. Agregar 130 ul de mezcla maestra de segunda cadena a los 20 ul del ADNc de primera cadena. (Volumen final = 150 ul) 4. Mezclar por pipeta hacia arriba y hacia abajo - o- por vórtice ligeramente. Giro rápido. 5. >Incubar a 16°C durante 2 horas en una baño de agua helada. 6. Agregar 2 ul (10 U) de T4 ADN Polimerasa. Mezclar por pipeta hacia arriba y hacia abajo - o - por vértice ligeramente. Giro rápido. 7. Incubar durante 5 minutos a 16 °C. 8. Agregar 10 ul de 0.5 M EDTA. Vértice ligero. Giro rápido. 9. Proceder al procedimiento de limpieza para almacenamiento de ADNc -OR- a -20 °C para uso posterior.
Limpiar el ADNc bicatenario (GeneChip Sample Cleanup Module) 1. Agregar 600 ul de amortiguador de unión de ADNc a los 162 ul de la preparación final de síntesis de ADNc bicatenario. Mezclar por vértice durante 3 segundos. 2. Revisar que el color de la mezcla sea amarillo (similar al amortiguador de unión de ADNc y/o la reacción de síntesis de ADNc) . Si el color de la mezcla es naranja o violeta, agregar 10 ul de 3 M de acetato de sodio, pH 5.0 y mezclar. El color de la mezcla se volverá amarillo. 3. Aplicar 500 ul de la muestra a la columna de ADNc Cleanup Spin sobre un tubo de recolección de 2 ml , y centrifugar durante 1 minuto a = 8,000 x g (= 10,000 rpm) . Descartar el flujo como desecho peligroso. 4. Recargar la columna giratoria con la mezcla restante (262 ul) y centrifugar como anteriormente. Descartar el flujo como desecho peligroso y descartar el tubo de recolección. 5. Transferir la columna giratoria en un nuevo tubo de recolección de 2 ml (suministrado) . Agitar con pipeta 750 ul de amortiguador de lavado de ADNc sobre la columna giratoria. Centrifugar durante 1 minuto a = 8,000 x g (= 10, 000 rpm) . Descartar el flujo. 6. Abrir la tapa de la columna giratoria y centrifugar durante 5 minutos a máxima velocidad (= 25,000 x g) . Colocar las columnas en la centrífuga utilizando cada segunda cuba. Colocar las tapas sobre la cuba adjunta a fin de que se encuentre orientadas en la dirección opuesta a la rotación, i.e., si la rotación es en la dirección de las manecillas del reloj , orientar las tapas en una dirección contra las manecillas del reloj . Esto evita el daño a las tapas . 7. Transferir la columna giratoria en un tubo de recolección de 1.5 ml . Agitar con pipeta 10 ul de amortiguador de elución de ADNc directamente sobre la membrana de la columna giratoria. Asegurar que el amortiguador de elución de ADNc se suministre directamente sobre la membrana. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar 1 minuto a máxima velocidad (= 25,000 xg) para eluir. Colocación e Introducción de la Reacción IVT Enzo: Bioarray Highfield ARN transcript Labeling Kit (Parte No. 900182) 1. Utilizar 10 ul del ADNc bicatenario limpio 2. Preparar la siguiente mezcla maestra IVT: 10 X amortiguador de reacción HY 4 ul 10 X ribonucleótidos marcados con biotina 4 ul 10 X DTT 4 ul 10 X mezcla de inhibidor de RNasa 4 ul 20 X T7 ARN Polimerasa 2 ul Volumen total: 30 ul 3. Agregar 30 ul de la mezcla maestra IVT a 10 ul de ADNc bicatenario. (volumen total = 40 ul) 4. Mezclar por pipeta hacia arriba y hacia abajo - o- por vórtice ligeramente. Giro rápido. 5. Colocar inmediatamente el tubo en un baño de agua a 37°C. Incubar durante 5 horas. 6. Almacenar a -20°C si no se purifica el ARN inmediatamente . Limpieza del ARNc marcado con biotina (GeneCHip Sample Cleanup Module) 1. Agregar 60 ul de H20 a la reacción de IVT y mezclar mediante vórtice durante 3 segundos. 2. Agregar 350 ul de amortiguador de unión de ARNc IVT a la muestra, mezclar por vórtice durante 3 segundos . 3. Agregar 250 ul de etanol (96-100%) al lisado, y mezclar bien por pipeta. No centrifugar. 4. Aplicar la muestra (700 ul) a la columna giratoria de limpieza de ARNc IVT colocada en un tubo de recolección de 2 ml . Centrifugar durante 15 segundos a = 8,000 x g (= 10,000 rpm) .
. Pasar el eluido a través de la columna una vez más . Centrifugar durante 15 segundos a = 8,000 x g (= 10,000 rpm) . Descartar el flujo como desecho peligroso y descartar el tubo de recolección. 6. Transferir la columna giratoria en un tubo de recolección nuevo de 2 ml (suministrado) . 7. Agregar 500 ul de amortiguador de lavado de ARNc IVT y centrifugar durante 15 segundos a = 8,000 x g (= 10,000 rpm) para lavar. Descartar el flujo. 8. agitar por pipeta 500 ul 80% (v/v) etanol sobre la columna giratoria, y centrifugar durante 15 segundos a = 8,000 x g (= 10,000 rpm). Descartar el flujo. 9. Abrir la tapa de la columna giratoria y centrifugar durante 5 minutos a máxima velocidad (= 25,000 x g)- Descartar el flujo y el tubo de recolección. 10. Transferir la columna giratoria en un nuevo tubo de recolección de 1.5 ml . 11. Agitar por pipeta 11 ul de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna giratoria. Dejar reposar durante 1 minuto. Centrifugar durante 1 minuto a máxima velocidad (= 25,000 x g) para eluir. 12. Agitar por pipeta 10 ul de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna giratoria. Dejar reposar durante 1 minuto. Centrifugar durante 1 minuto a máxima temperatura (= 25,000 x g) para eluir. Cuantificación del ARNc (Producto IVT) Utilizar análisis espectrométrico para determinar el rendimiento de ARN. Aplicar la convención de que 1 OD a 260 nm es igual a 40 ug/ml de ARN. Verificar el OD a 260 nm y 280 nm para determinar la concentración y pureza de la muestra. Mantener la proporción de A260/A280 cercana a 2.0 para ARN puro (proporciones entre 1.9 y 2.1 son aceptables) . Para cuantificación de ARNc al utilizar ARN total como material de inicio, debe calcularse un ARNc ajustado para reflejar el desempeño del ARN total no marcado. Utilizando un estimado de 100% de desempeño, utilizar la fórmula siguiente para determinar el rendimiento del ARNc ajustado : Rendimiento del ARNc ajustado = ARNm - (total ARNi) (y) ARNm = cantidad de ARNc medida después de IVT (ug) ARNi total = cantidad de inicio del ARN total (ug) y = fracción de la reacción de ADNc utilizada en IVT Fragmentación del ARNc para preparación del objetivo Para fragmentación, utilizar la concentración de ARNc ajustado. 1. Agregar 2 ul de 5 x amortiguador de fermentación por cada 8 ul de ARN más H20. 20 ug de ARNc 1 a 32 ul 5 x amortiguador de fragmentación 8 ul agua libre de RNasa a 40 ul Volumen total: 40 ul 2. Incubar a 94 °C durante 30 minutos.
Inmediatamente, colocar en hielo después de la incubación.
Preparación del objetivo de hibridación 1. Calentar 20x controles de hibridación eucarióticos y el oligo B2 durante 5 minutos a 65°C. Affymetrix GeneCHip Eukariotic Hybridization Control Kit, Parte #900362 (durante 150 rxns) 2. Agitar por vórtice ligeramente, baja velocidad. 3. Mezcla maestra (asumiendo que la concentración de ARNc fragmentado es de 0.5 ug/ul) : Disposición estándar (ul) Conc. Final ARNc fragmentado 15 ug 30 0.05 ug/ul Oligo B2 (3 nM) 5 50 pM 20 x Control Spike 15 1.5, 5, 25, lOOpM (Bio B, C, D, Cre) ADN Herring Sperm 3 0.1 mg/ml BSA acetilado 3 0.5 mg/ml Hu cot-1 ADN (1 mg/ml) 30 0.1 mg/ml 2X amortiguador MES Hyb 150 IX H20 64 Volumen final 300 4. Alicuotar 270 ul de la mezcla maestra en tubos y agregar 30 ul de ARNc fragmentado a cada uno. Esta es la mezcla de hibridación. 5. Equilibrar las disposiciones de sonda a temperatura ambiente inmediatamente antes de usarse. 6. Llenar la disposición de sonda con 1 X amortiguador MES Hyb, e incubar en el horno de rosticería durante 10 minutos a 45°C, 60 rpm. 7. Calentar la mezcla de hibridación en un baño de agua a 99 °C durante 5 minutos. 8. Transferir la mezcla de hibridación a un baño de agua a 45 °C durante 5 minutos. 9. Centrifugar la mezcla de hibridación durante 5 minutos a máxima velocidad. 10. Retirar el IX amortiguador MES Hyb de las disposiciones de sonda. 11. Llenar la disposición de sonda con los 200 ul superiores de la mezcla de hibridación. 12. Sellas el septum con Tough-Spots. 13. Hibridar la disposición de sonda a 45°C, 60 rpm durante 19 horas. 14. Lavar, colorear y explorar la disposición de sonda de acuerdo con los protocolos de Affymetrix. Materiales Affymetrix Artículo del vendedor Catálogo # Iniciador T7-(dt)24 Bioresearch Technologies Control Spikes internos Superscript II/5X amortiguador de primera cadena/O.l M DTT Invitrogen 18064-014 5 X amortiguador de segunda cadena Invitrogen 10812-014 10 mM dNTP Invitrogen 18427.088 10 U/ul E. coli ADN ligasa Invitrogen 18052-019 10 U/ul E. coli ADN Polimerasa I Invitrogen 18010-025 2 U/ul RNasa H Invitrogen 18021-071 10 U/ul T4 ADN Polimerasa Invitrogen 18005-025 0.5 M EDTA Sigma E-7889 ENZO equipo de marcado High Yield RNA Transcript Affymetrix o ENZO 900182 (ENZO) GeneChip Sample Cleanup Module Affymetrix 900371 Albúmina de suero bovino acetilado Invitrogen 15561-020 IgG de cabra - grado reactivo Sigma 1-5256 Anticuerpo anti-estreptavidina (cabra) , biotinilado Vector Labs BA-050 Estreptavidina R-ficoeritrina Molecular Probes S-866 20 X SSPE BioWhittaker 51214 Equipo de control eucariótico Affymetrix 900362 Agua, grado de biología molecular Ambion 9934 ADN Cot-1 humano Roche 1-581-074 5 M de NaCl libre de RNasa, libre de Dnasa Ambion 9760 antiespuma 0.30 Sigma A-8082 Tween-20 al 10% Pierce Chemical 28320 Monohidrato de ácido libre de MES Sigma M5287 Sal de sodio MES Sigma M3885 Sal disodio EDTA, 0.5 M solución Sigma E7889 Tough Spots, Label Dots USA Scientific 9902 Horno de hibridación GeneChip 640 Affymetrix 800139 Explorador GeneChip 3000 w/Workstation Affymetrix 00.0074 Estación de fluidos Affymetrix 00.0081 Autoloader w/external Barcode Reader Affymetrix 00-0129 PCR Cuantitativa Síntesis de ADNc: Condiciones de incubación: 25° durante 10 minutos 37° durante 2 horas Reacción TaqMan utilizando el detector de secuencia ABl Prism 7700: Condiciones de ciclado térmico: 95° durante 10 minutos 40 ciclos: 95° durante 15 segundos 60° durante 1 minuto - Sondas TaqMan : Assays-on-Demand™ (sondas TaqMan® MGB, FAM™ marcadas con colorante) - La amplificación del control endógeno, GAPDH (concentración de sonda 100 nM, concentraciones de iniciador de adelanto & reversa 200 nM) , se llevó a cabo para estandarizar la cantidad del ARN muestra (ADNc) agregado a cada reacción. La cuantificación relativa se llevó a cabo utilizando el método de curva estándar. Para la cuantificación normalizada a un control endógeno, se prepararon curvas estándar para la referencia tanto de objetivo como endógena. Para cada muestra experimental, la cantidad de referencia objetivo y endógena se determinó a partir de la curva estándar apropiada. Después, la cantidad objetivo se dividió entre la cantidad de referencia endógena para obtener un valor objetivo normalizado. Una de las muestras experimentales sirvió como calibrador o muestra lx. Cada uno de los valores objetivo normalizados se dividió entonces entre el valor objetivo normalizado calibrador para generar los niveles de expresión relativos. Citometría FACS/flujo (2° Protocolo de Coloración de Anticuerpo) : Todas las incubaciones y giros se efectuaron a 4°C y los tubos se mantuvieron en hielo mientras no estuvieron en el refrigerador. 1. Determinar el formato del tubo identificando las líneas celulares que van a utilizarse, los anticuerpos de interés, y cualquier condición o tratamiento especial. a. controles i. no coloreado, 2° anticuerpo, y compensación si los fluorócromos tienen espectro de emisión sobrepuesto, b. Ejemplo: 2. Marcar los tubos FACS a. BD Falcon 12 x 75 mm Poliestireno de fondo redondo. Catálogo #: 352052 3. Preparar las células para coloración. a. Tratar células adherentes con acutasa o tripsina . i. Innovative Cell Technologies Inc. Accutase. ii. Gibco, Trypsin. Catálogo #: 25200-106. b. Proceder con las etapas restantes si las células se encuentran en suspensión. 4. Alicuotar las células en un tubo cónico de 15 mL o 50 mL. 5. Girar las células durante 5 min., 1200 rpm, 4°C. 6. Aspirar el sobrenadante. 7. Resuspender las células en 5 mL de amortiguador FACS. 8. Girar las células durante 5 min., 1200 rpm, 4°C. 9. Aspirar el sobrenadante . 10. Resuspender las células en amortiguador de bloqueo. a. Determinar el volumen de amortiguador de bloqueo necesario: i. Número de tubos por línea celular/tratamiento X 100 ul amortiguador de bloqueo por tubo. ii. faltante de 1 x 106 células por 100 ul de amortiguador de bloqueo. 11. Alicuotar 100 ul de las células en el tubo apropiado. a. en base al formato pre-determinado del tubo. 12. Agregar el 1° anticuerpo al tubo apropiado. a. Lewis A: i. Utilizar 10 ul de reserva de 0.2 ug/ul por tubo . 1. La concentración final es de 2 ug. ii. Chemicon: anti-sialilo Lewis A. Catálogo #: MAB2095. b. Lewis X: i. Utilizar 5 ul de reserva de 0.5 ug/ul por tubo. 1. La concentración final es de 2.5 ug. ii. BD pharmigen: CD15s (Sialilo Lewis X) . Catálogo #: 551344. 13. Incubar durante 30 min, a 4°C. 14. Agregar 1 mL de amortiguador FACS a cada tubo. 15. Girar las células durante 5 min., 1200 rpm, 4°C. 16. Aspirar el sobrenadante 17. Rasgar suavemente los tubos para desalojar la pildora, a. "rasgar" - correr los tubos a través de la superficie del estante de tubos de 12 x 75 mm. 18. Repetir las etapas 14-17. 19. Agregar 100 ul de amortiguador de bloqueo a cada tubo . 20. Agregar el 2° anticuerpo en el tubo apropiado. a. Utilizar 10 ul por tubo. b. Jackson, FITC Cabra-anti-Ratón, Catálogo #: 115-096-068. 21 Incubar durante 30 min, a 4°C. 22 Repetir etapas 14-17 dos veces. 23 Resuspender las células en amortiguador FACS/PI. a. Determinar el volumen necesario: i. Se necesita 1 mL de solución por tubo. ii. Pl = 1 ul por 1 mL de amortiguador. b. Sondas moleculares, Yoduro de propidio. Catálogo #: P3566. 24. Colocar los tubos en una charola de hielo o repisa de tubos helada. 25. Cubrir con hoja de aluminio y llevar al lab FACS para que un operador calificado adquiera y analice las muestras . Amortiguador de bloqueo al 5%: 1. FBS a 5% del volumen total 2. Amortiguador FACS. 3. Filtrar la solución a través de un filtro de 0.2 um. Amortiguador FACS: 1. 980 mL PBS. 2. 8 mL 0.25 M EDTA. 3. 20 mL FBS. 4. Filtrar la solución a través de un filtro de 0.2 um. Procedimiento de Inmunohistoquímica: Silalilo Lewis A Anticuerpo: Sialilo Lewis A AB-1 Clon: 121SLE Proveedor : NeoMarkers Catálogo No. MS-279-P Especie Ig: Ratón Método IHC: Parafina Pretratamiento: Ninguno Manejo IHC: Autostainer Isotipo: IgM de ratón Especie de procedimiento: Humana Concentración IgG: 200 ug/ml Procedimiento normal : Desparafinizar e hidratar a agua destilada. Bloquear biotina endógena con el Vector Biotin Blocking System. Enjuagar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada uno. Bloquear con suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente . Incubar las secciones con anticuerpo sialilo Lewis A monoclonal de ratón diluido a 5 ug/ml con suero de caballo normal al 10% durante 60 minutos a temperatura ambiente. Utilizar un isotipo de IgM de ratón diluido a 5 ug/ml en suero de caballo normal al 10% para el control negativo. Enjuagar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada uno. Incubar las secciones con anticuerpo de caballo anti-ratón biotinilado; 1:200 diluido en suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuagar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada uno. Incubar las secciones con Vector ABC Élite System diluido durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuagar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada uno. Incubar las secciones con Pierce Metal Enhanced DAB durante 5 minutos . Enjuagar en agua Running Tap durante 5 minutos. Contra colorear con Mayers Hematoxylin durante 1 minuto. Enjuagar en agua Running Tap durante 5 minutos. Blue Hematoxylin con reactivo Richard-Alian Bluing durante 1 minuto . Enjuagar en agua Running Tap durante 2 minutos. Deshidratar, aclarar y montar en medio sintético de montaje.
Procedimiento de Inmunohistoquímica: Silalilo Lewis X Anticuerpo: anti-sialilo Lewis X de ratón Clon: KM93 Proveedor: Chemicon Catálogo No. MAB2096 Especie Ig: Ratón Método IHC: Parafina Pretratamiento: DAKO Target Retrieval Manejo IHC: Autostainer Isotipo: IgM de ratón Especie de procedimiento: Humana Concentración IgG: 100 ug/ml Procedimiento normal : Desparafinizar e hidratar a agua destilada.
Saciar la actividad de peroxidasa endógena con KPL Blocking Solution - diluido concentrado 1:10 en dH20, temperatura ambiente durante 4 minutos . Enjuagar en agua destilada durante 5 minutos. Incubar en DAKO Target Retrieval (S1700) precalentado a 99 grados durante 20 minutos en un baño de agua hirviendo.
Retirar del baño hirviendo y dejar enfriar durante 20 minutos . Bloquear la biotina endógena con Vector Avidin Biotin Blocking System. Bloquear con suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Incubar las secciones con anticuerpo sialilo Lewis X monoclonal de ratón diluido a 5 ug/ml con suero de caballo normal al 10% durante 60 minutos a temperatura ambiente. Utilizar un isotipo de IgM de ratón diluido a 5 ug/ml en suero de caballo normal al 10% para el control negativo. Enjuagar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada uno. Incubar las secciones con anticuerpo de caballo anti-ratón biotinilado Vector; 1:200 diluido en suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuagar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada uno. Incubar las secciones con Vector ABC Élite System diluido durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuagar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada uno.
Incubar las secciones con Pierce Metal Enhanced DAB durante 5 minutos . Enjuagar en agua Running Tap durante 5 minutos. Contra colorear con Mayers Hematoxylin durante 1 minuto. Enjuagar en agua Running Tap durante 5 minutos. Blue Hematoxylin con reactivo Richard-Alian Bluing durante 1 minuto. Enjuagar en agua Running Tap durante 2 minutos. Deshidratar, aclarar y montar en medio sintético de montaje. Resultados Experimentales : Se condujeron experimentos utilizando los métodos y materiales antes descritos. Los resultados de estos experimentos se ilustran en las Figuras 6-13, como se trata abaj o . La Figura 6 proporciona un diagrama en resumen de los datos obtenidos al analizar 28 líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal por su sensibilidad o resistencia a la actividad apoptótica de Apo2L (suero fetal bovino "FBS" al + 0.5% o FBS al 10%) o del anticuerpo monoclonal DR5 "mab", "XL" reticulado o no reticulado, suero fetal bovino "FBS" al + 0.5% o FBS al 10%) y por la expresión de FUT3 , FUT6, sialilo Lewis A y sialilo Lewis X. La Figura 7 proporciona una comparación de la sensibilidad de diversas líneas celulares de cáncer colorrectal al anticuerpo DR5 y la expresión de FUT3 , calculada mediante PCR cuantitativa. La Figura 8 proporciona una comparación de diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal por su sensibilidad o resistencia al anticuerpo DR5 (más reticulador) y la expresión de sialilo Lewis X o A, determinada mediante FACS . La Figura 9A muestra una prueba Spearman Rank Correlation que analiza la sensibilidad o resistencia de diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal y la correlación para la expresión de FUT3. La Figura 9B muestra los resultados de una prueba Fisher' s Exact que analiza la sensibilidad ("sens") o la resistencia ("res") de las diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal y la importancia estadística entre la expresión y sensibilidad de las líneas FUT3 y sialilo Lewis A/X de las respectivas líneas celulares para la actividad apoptótica del anticuerpo DR5. La Figura 10 proporciona una comparación de diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal por la expresión de los receptores DcRl o DcR2 (determinada mediante PCR cuantitativa) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares para Apo2L o anticuerpo DR5. La Figura 11 proporciona una comparación de diversas líneas celulares de cáncer de colon o colorrectal por la expresión de los receptores DcRl o DcR2 (determinada mediante FACS) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares para Apo2L o anticuerpo DR5. La Figura 12 muestra la coloración inmunohistoquímica para sialilo Lewis A y X en cuatro líneas celulares de cáncer colorrectal, CaCo2, SW 1417, DLD-1, y Coló 205, y su correlación con la expresión de sialilo Lewis A y X calculada mediante FACS y su correlación con la sensibilidad a Apo2L/TRAIL. Las líneas celulares de cáncer Coló 2 y SW417 muestran ninguna o una débil coloración, respectivamente, o los antígenos de sialilo Lewis, son negativos y débilmente positivos, respectivamente, mediante FACS y son resistentes a Apo2L/TRAIL. las líneas celulares de cáncer colorrectal DLD-1 y Coló 205 muestran coloración de moderada a fuerte, respectivamente para antígenos de sialilo Lewis, son moderadamente y fuertemente positivas, respectivamente, mediante FACS y son sensibles a Apo2L/TRAIL. La Figura 13 muestra un resumen de los experimentos IHC demostrando la expresión de sialilo Lewis A y X en muestras de tejido de mucosa de colon normal, tejido hepático normal, cáncer de colon primario, y metástasis de cáncer de colon. Las muestras de tejido de colon normal y cáncer de colon primario dispuestas en una micro disposición de tejido de analizaron en el experimento IHC, mientras que las muestras de tejido del hígado normal y de cáncer de colon metastásico se encontraron en portaobjetos de vidrio individuales. La prevalencia de la expresión de sialilo lewis A y X y la intensidad de coloración inmunohistoquímica aumenta del tejido de clon normal al cáncer de colon primario al cáncer de colon metastásico. Las células de hígado normal no se colorearon para sialilo Lewis A o X.

Claims (38)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o células de mamífero para Apo2L/TRAIL, que comprende las etapas de : obtener una muestra de tejido o célula de mamífero; examinar la muestra de tejido o célula para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, en donde la expresión de dichos uno o más biomarcadores predice si dicha muestra de tejido o célula es sensible a la actividad que induce la apoptosis de Apo2L/TRAIL.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina detectando la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6.
  3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina mediante inmunohistoquímica para detectar la expresión de antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X.
  4. 4. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de examinar la expresión de los receptores DR4 , DR5, DcRl o DcR2 en dicha muestra de tejido o célula.
  5. 5. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de tejido o célula comprende tejido o células de cáncer.
  6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde dichas células de cáncer son células o tejidos de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal, o pancreático.
  7. 7. Un método para inducir apoptosis en una muestra de tejido o célula de mamífero, que comprende las etapas de : obtener una muestra de tejido o célula de mamífero; examinar la muestra de tejido o célula para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, y después de detectar la expresión de dichos uno o más biomarcadores, exponer dicha muestra de tejido o célula a una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL.
  8. 8. El método de la reivindicación 7 en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina al probar la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6.
  9. 9. El método de la reivindicación 7, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina mediante inmunohistoquímica para detectar la expresión de antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X.
  10. 10. El método de la reivindicación 7, que comprende además la etapa de examinar la expresión de los receptores DR4, DR5, DcRl o DcR2 en dicha muestra de tejido o célula.
  11. 11. El método de la reivindicación 7, en donde dicha muestra de tejido o célula comprende tejido o células de cáncer.
  12. 12. El método de la reivindicación 11, en donde dichas células de cáncer son células o tejidos de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal, o pancreático.
  13. 13. El método de la reivindicación 7, en donde dichas células se exponen a una cantidad efectiva del polipéptido Apo2L/TRAIL que comprende los aminoácidos 114-281 e la Figura 1 (SEQ ID NO:l) .
  14. 14. Un método para tratar un trastorno en un mamífero, tal como un trastorno relacionado a la inmunidad o cáncer, que comprende las etapas de: obtener una muestra de tejido o célula de dicho mamífero; examinar la muestra de tejido o célula para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno(s) de sialilo Lewis A y/o x, y después de detectar la expresión de dichos uno o más biomarcadores, administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL.
  15. 15. El método de la reivindicación 14, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina detectando la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6.
  16. 16. El método de la reivindicación 14, en donde dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina mediante inmunohistoquímica para detectar la expresión de antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X.
  17. 17. El método de la reivindicación 14, que comprende además la etapa de examinar la expresión de los receptores DR4 , DR5, DcRl o DcR2 en dicho tejido o célula.
  18. 18. El método de la reivindicación 14, en donde dicha muestra de tejido o célula comprende tejido o células de cáncer.
  19. 19. El método de la reivindicación 18, en donde dichas células o tejidos de cáncer comprenden células o tejidos de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal, o pancreático.
  20. 20. El método de la reivindicación 14, en donde una cantidad efectiva del polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) que se administra a dicho animal.
  21. 21. El método de la reivindicación 14, en donde también se administra a dicho mamífero un (os) agente (s) terapéutico (s) o terapia de radiación.
  22. 22. El método de la reivindicación 14, en donde también se administra a dicho mamífero una citosina, agente citotóxico o agente de inhibición del crecimiento.
  23. 23. El método de la reivindicación 7 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL se enlaza a una molécula de polietilenglicol .
  24. 24. El método de la reivindicación 14 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL se enlaza a una molécula de polietilenglicol .
  25. 25. El método de la reivindicación 6 en donde dichas células de cáncer son células de cáncer de colon o colorectal .
  26. 26. El método de la reivindicación 1 en donde dicho Apo2L/TRAIL es un polipéptido que comprende los aminoácidos 41-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) o un fragmento biológicamente activo del mismo.
  27. 27. El método de la reivindicación 26, en donde dicho Apo2L/TRAIL es un polipéptido que comprende los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1).
  28. 28. El método de la reivindicación 12 en donde dichas células de cáncer son células de cáncer de colon o colorectal .
  29. 29. El método de la reivindicación 20 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL consiste de los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1).
  30. 30. Un método para predecir la sensibilidad de células de cáncer de colon o colorectal de mamífero para Apo2L/TRAIL que comprende las etapas de: obtener células de cáncer de colon o colorectal de mamífero; examinar las células de cáncer para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, en donde la expresión de dichos uno o más biomarcadores predice que dichas células de cáncer son sensibles a la actividad que induce apoptosis de Apo2L/TRAIL.
  31. 31. Un método para inducir apoptosis en células de cáncer de colon o colorectal de mamífero que comprende las etapas de: obtener células de cáncer de colon o colorectal de mamífero; examinar las células de cáncer para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, y después de detectar la expresión de dichos uno o más biomarcadores, exponer dichas células de cáncer a una cantidad efectiva de polipéptido Apo2L/TRAIL.
  32. 32. El método de la reivindicación 31 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 41-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) o un fragmento del mismo que tiene actividad apoptótica.
  33. 33. El método de la reivindicación 32 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL se enlaza a una molécula de polietilen glicol.
  34. 34. El método de la reivindicación 32 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) .
  35. 35. Un método para tratar cáncer de colon o colorectal en un mamífero, que comprende las etapas de: obtener una muestra de células de cáncer de colon o colorectal de dicho mamífero; examinar la muestra de células de cáncer para detectar la expresión de uno o más biomarcadores, seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, el (los) antígeno (s) de sialilo Lewis A y/o X, y después de detectar la expresión de dichos uno o más biomarcadores, administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL.
  36. 36. El método de la reivindicación 35 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 41-281 de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) o un fragmento del mismo que tiene actividad apoptótica.
  37. 37. El método de la reivindicación 36 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL se enlaza a una molécula de polietilen glicol.
  38. 38. El método de la reivindicación 36 en donde dicho polipéptido Apo2L/TRAIL comprende los aminoácidos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID NO:l) .
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