KR20070048772A - 바이오마커를 사용한 분석 및 방법 - Google Patents

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Abstract

포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 조사하는 방법 및 분석이 제공된다. 본원에 개시된 방법 및 분석에 따르면, 하나 이상의 상기 바이오마커의 발현의 검출은 조직 또는 세포 샘플이 세포자멸 유도제, 예를 들어 Apo2L/TRAIL 및 항-DR5 작용제 항체에 대해 감수성임을 예측하거나 나타내는 것이다. 검사될 수 있는 특정 바이오마커는 푸코실트랜스퍼라제, 특히 푸코실트랜스퍼라제 3 (FUT3) 및/또는 푸코실트랜스퍼라제 6 (FUT6), 및 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원을 포함한다. 키트 및 제조품도 제공된다.
바이오마커, 분석, 세포자멸, Apo2L, TRAIL, 푸코실트랜스퍼라제 3, 시알릴 루이스 A

Description

바이오마커를 사용한 분석 및 방법 {ASSAYS AND METHODS USING BIOMARKERS}
관련 출원
본원은 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 2004년 8월 6일 출원된 미국 가출원 60/599,425의 미국 특허법 35 USC §119(e) 하의 우선권을 주장한다.
본 발명은 포유동물 세포의 Apo2L/TRAIL 및/또는 치사 수용체 작용제 항체에 대한 감수성을 예측하는 바이오마커를 검출하기 위한 방법 및 분석에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 (TNF) 수퍼패밀리에 속하는 다양한 리간드 및 수용체가 당업계에서 확인되었다. 상기 리간드에는 종양 괴사 인자-알파 ("TNF-알파"), 종양 괴사 인자-베타 ("TNF-베타" 또는 "림프독소-알파"), 림프독소-베타 ("LT- 베타"), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, OX-40 리간드, 4-1BB 리간드, LIGHT, Apo-1 리간드 (Fas 리간드 또는 CD95 리간드로도 언급됨), Apo-2 리간드 (Apo2L 또는 TRAIL로도 언급됨), Apo-3 리간드 (TWEAK로도 언급됨), APRIL, OPG 리간드 (RANK 리간드, ODF 또는 TRANCE로도 언급됨), 및 TALL-1 (BlyS, BAFF 또는 THANK로도 언급됨)이 포함된다 (예를 들어, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); 1997년 1월 16일 공개된 WO 97/01633; 1997년 7월 17일 공개된 WO 97/25428; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); 1998년 7월 2일 공개된 WO98/28426; 1998년 10월 22일 공개된 WO98/46751; 1998년 5월 7일 공개된 WO/98/18921; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999) 참조).
상기 TNF 패밀리 리간드에 의해 매개되는 상이한 세포 반응의 유도는 일반적으로 특정 세포 수용체에 대한 그의 결합에 의해 개시된다. 전부는 아니지만, 일부의 TNF 패밀리 리간드는 세포 표면 "치사 수용체"에 결합하고 이를 통해 다양한 생물학적 활성을 유도하여 카스파제 또는 세포 치사 또는 세포자멸 경로에서 작용하는 효소를 활성화시킨다 (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)). 현재까 지 확인된 TNF 수용체 수퍼패밀리의 멤버에는 TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (Apo-1 또는 CD95로도 언급됨), DR4 (TRAIL-R1로도 언급됨), DR5 (Apo-2 또는 TRAIL-R2로도 언급됨), DcR1, DcR2, 오스테오프로테게린 (OPG), RANK 및 Apo-3 (DR3 또는 TRAMP로도 언급됨)이 포함된다 (예를 들어, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J; Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); 1991년 3월 20일 공개된 EP 417,563; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138- 141 (1997) 참조).
대부분의 상기 TNF 수용체 패밀리 멤버는 세포외, 트랜스멤브레인 및 세포내 영역을 포함하여 세포 표면 수용체의 전형적인 구조를 공유하지만, 다른 멤버는 자연에서 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인이 결여된 가용성 단백질로서 발견된다. 전형적인 TNFR의 세포외 부분은 NH2-말단으로부터 출발하여 다중 시스테인 풍부 도메인 (CRD)의 반복 아미노산 서열 패턴을 포함한다.
Apo-2L 또는 TRAIL로 언급되는 리간드가 수년 전에 사이토킨의 TNF 패밀리 멤버로서 확인되었다 (예를 들어, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697- 12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; 1998년 6월 9일 등록된 미국 특허 5,763,223; 2001년 9월 4일 등록된 미국 특허 6,284,236 참조). 전장 천연 서열 인간 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드는 281개 아미노산 길이의 타입 II 트랜스멤브레인 단백질이다. 몇몇 세포는 폴리펩티드의 세포외 영역의 효소 절단을 통해 폴리펩티드의 천연 가용성 형태를 생산할 수 있다 (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Apo2L/TRAIL의 가용성 형태의 결정학적 연구는 TNP 및 다른 관련 단백질의 구조와 유사한 동종삼량체 구조를 보여주었다 (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). 그러나, 다른 TNP 패밀리 멤버와 달리, Apo2L/TRAIL은 3개의 시스테인 잔기 (동종삼량체의 각각의 서브유닛의 위치 230의)가 함께 아연 원자에 배위결합하고, 아연 결합이 삼량체 안정성 및 생물학적 활성에 중요하기 때문에 특유한 구조적 특징을 갖는 것으로 밝혀졌다 (Hymowitz et al., 상기 문헌; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).
Apo2L/TRAIL이 자가면역 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염을 포함하여 면역계 조절에서 기능을 수행할 수 있다고 문헌에 보고된 바 있다 [예를 들어, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].
또한, 가용성 형태의 Apo2L/TRAIL은 결장, 폐, 유방, 전립선, 방광, 신장, 난소 및 뇌 종양 및 흑색종, 백혈병 및 다발 골수종을 포함하여 다양한 암 세포에서 세포자멸을 유도하는 것으로 보고되었다 (예를 들어, Wiley et al., 상기 문헌; Pitti et al., 상기 문헌; 2000년 2월 29일 등록된 미국 특허 6,030,945; 2004년 6월 8일 등록된 미국 특허 6,746,668; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734- 741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000) 참조). 쥐 종양 모델에서의 생체내 연구는 추가로 Apo2L/TRAIL이 단독으로 또는 화학요법 또는 방사선요법과 조합되어 실질적인 항-종양 효과를 보일 수 있음을 제시한다 (예를 들어, Ashkenazi et al., 상기 문헌; Walzcak et al., 상기 문헌; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., 상기 문헌; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); PCT 출원 US/00/15512; PCT 출원 US/01/23691 참조). 많은 종류의 암 세포와 달리, 대부분의 정상 인간 세포 종류는 특정 재조합 형태의 Apo2L/TRAIL에 의한 세포자멸 유도에 저항하는 것으로 보인다 (Ashkenazi et al., 상기 문헌; Walzcak et al., 상기 문헌). Apo2L/TRAIL의 폴리히스티딘-태깅된 (tagged) 가용성 형태는 정상적인 단리된 인간 간세포에서 (비인간 간세포에서가 아니라) 시험관 내에서 세포자멸을 유도하는 것으로 문헌에 보고되었다 (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). 특정 재조합 Apo2L/TRAIL 제제는 예를 들어 태그 (tag) 분자의 존재 또는 부재, 아연 함량 및 삼량체 함량％에 따라 질병 세포 대 정상 세포에 대한 생화학적 특성 및 생물학적 활성의 측면에서 상이할 수 있다고 생각된다 (Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001) 참조).
Apo2L/TRAIL은 적어도 5개의 상이한 수용체에 결합하는 것으로 밝혀졌다. Apo2L/TRAIL에 결합하는 적어도 2개의 수용체는 기능성 세포질 치사 도메인을 포함한다. 한 상기 수용체는 "DR4" (별법으로 TR4 또는 TRAIL-R1)로 언급된다 (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); 1998년 7월 30일 공개된 WO98/32856; 1999년 7월 29일 공개된 WO99/37684; 2000년 12월 7일 공개된 WO00/73349; 2002년 8월 13일 등록된 US 6,433,147; 2002년 10월 8일 등록된 US 6,461,823 및 2002년 1월 29일 등록된 US 6,342,383).
Apo2L/TRAIL에 대한 또다른 상기 수용체는 DR5로 언급되었다 (별법으로 Apo-2; TRAIL-R 또는 TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 또는 KILLER로도 언급됨) (예를 들어, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), 1998년 11월 19일 공개된 WO98/51793; 1998년 9월 24일 공개된 WO98/41629; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); 1998년 8월 20일 공개된 WO98/35986; 1998년 10월 14일 공개된 EP870,827; 1998년 10월 22일 공개된 WO98/46643; 1999년 1월 21일 공개된 WO99/02653; 1999년 2월 25일 공개된 WO99/09165; 1999년 3월 11일 공개된 WO99/11791; 2002년 8월 13일 공개된 US 2002/0072091; 2001년 12월 7일 공개된 US 2002/0098550; 2001년 12월 6일 등록된 US 6,313,269; 2001년 8월 2일 공개된 US 2001/0010924; 2003년 7월 3일 공개된 US 2003/01255540; 2002년 10월 31일 공개된 US 2002/0160446, 2002년 4월 25일 공개된 US 2002/0048785, 2002년 2월 등록된 US 6,342,369, 2003년 5월 27일 등록된 US 6,569,642, 2000년 6월 6일 등록된 US 6,072,047, 2003년 11월 4일 등록된 US 6,642,358; 2004년 6월 1일 등록된 US 6,743,625 참고). DR4처럼, DR5는 세포질 치사 도메인을 포함하고 리간드 결합시 에 (또는 리간드의 활성을 모방하는 작용제 항체와 같은 분자에 결합시에) 세포자멸의 신호를 전달할 수 있다고 보고되었다. Apo-2L/TRAIL과 DR5 사이에 형성된 복합체의 결정 구조는 문헌에 기재되었다 [Hymowitz et al., Molecular Cell,. 4:563-571 (1999)].
리간드 결합시에, DR4와 DR5는 모두 FADD/Mort1로도 언급되는 치사 도메인 함유 어댑터 분자를 통한 세포자멸 개시제 카스파제-8의 동원 및 활성화에 의해 독립적으로 세포자멸을 촉발시킬 수 있다 [Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)].
Apo2L/TRAIL은 또한 DcR1, DcR2 및 OPG로도 언급되는 수용체에 결합하는 것으로 보고되었고, 이는 신호전달의 변환자이기보다는 억제제로서 기능하는 것으로 생각되었다 (예를 들어 DCR1 (TRID, LIT 또는 TRAIL-R3으로도 언급됨) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FBBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); 및 Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998); DCR2 (TRUNDD 또는 TRAIL-R4로도 언급됨) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 2:813-820 (1997)], 및 OPG [Simonet et al., 상기 문헌] 참조). DR4 및 DR5와 달리, DcR1 및 DcR2 수용체는 세포자멸 신호를 전달하지 않는다.
DR4 및/또는 DR5 수용체에 결합하는 특정 항체가 문헌에 보고된 바 있다. 예를 들어, DR4 수용체에 작용하고 특정 포유동물의 세포에서 작용제 또는 세포자멸 활성을 갖는 항-DR4 항체는 문헌에 기재되어 있다 [예를 들어, 1999년 7월 29일 공개된 WO 99/37684; 2000년 7월 12일 공개된 WO 00/73349; 2003년 8월 14일 공개된 WO 03/066661, Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); 20002년 12월 2일 공개된 WO 02/097033; 2003년 5월 22일 공개된 WO 03/042367; 2003년 5월 8일 공개된 WO 03/038043; 2003년 5월 8일 공개된 WO 03/037913 참조). 특정 항-DR5 항체도 마찬가지로 문헌에 기재된 바 있다 [예를 들어, 1998년 11월 8일 공개된 WO 98/51793; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada; 2003년 5월 8일 공개된 WO 03/038043; 2003년 5월 8일 공개된 WO 03/037913 참조). 또한, DR4와 DR5 수용체 모두에 대한 교차반응성을 갖는 특정 항체가 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어 2001년 6월 26일 등록된 US 특허 6,252,050 참조).
몇몇 포유동물 세포의 신생물 전환은 특정 경우에 시알릴 루이스 (Lewis) A 및 시알릴 루이스 X 항원 발현의 특유한 변형과 관련되었다. 비교적 다량의 시알릴 루이스 A/X가 예를 들어 결장, 췌장 및 위장의 몇몇 인간 선암종에 존재하고, 상기 항원 상의 탄수화물 구조에 작용하는 항체를 사용하는 분석이 췌장암 및 위장암을 검출하기 위한 수단으로서 사용되었다 (예를 들어, Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 49:2:303-311 (2002) 참조). 상기 탄수화물 종양 마커의 발현 수준은 또한 임상 결과, 환자 생존 시간 및 전이성 질병의 지표와 밀접한 관련이 있다.
시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X는 모두 혈류로부터 세포의 배출에 관련되는 셀렉틴으로 불리는 탄수화물-결합 단백질의 패밀리에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 몇몇 보고는 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X가 E-셀렉틴에 대한 리간드이고, 인간 암 세포의 내피에 대한 부착을 위해 작용할 수 있음을 제시한다. 암 세포의 표면에 존재하는 시알릴화 루이스 구조는 당단백질 및 당지질의 탄수화물 사슬에 의해 보유되고, 내피세포 상에 존재하는 E-셀렉틴에 결합한다. 따라서, 셀렉틴 및 그의 탄수화물 리간드는 전이 동안 종양 세포의 선택적인 귀환 (homing)에서 중요한 역할을 수행할 수 있다.
시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 생합성은 알파-1,3/1,4-푸코실트랜스퍼라제 (알파 1,3/1,4 Fuc-T, FUT)에 의해 촉매되는 단계인, 세포 종류 특이적 및 발생 단계 특이적 효소에 의한 알파 (1,3) 및 알파 (1,4) 연결의 구아노신 디포스페이트-푸코스 (GDP-Fuc)로부터의 푸코스의 시알릴화 전구체에 대한 최종 부가에 의존적인 것으로 생각된다.
복수개의 인간 푸코실트랜스퍼라제 유전자가 현재까지 클로닝되어 특성화되었다. 상기 유전자 (FUT 3-7)의 발현 및 그의 효소 생성물 (Fuc-TIII-VII)은 조직 특이적인 것으로 보인다. 5개의 유전자에 의해 코딩되는 효소는 FUTIII, FUTIV, FUTV, FUTVI 및 FUTVII로 명명된다. FUTIII, FUTV 및 FUTVI을 코딩하는 3개의 유전자는 염색체 19p13.3 상의 밀접한 물리적 위치에 편재한다. 생화학적 및 분자 클로닝 연구는 시알릴 루이스 A/X 잔기의 계통 특이적 발현은 그의 유전자 산물이 구성적으로 발현되는 올리고사카라이드 전구체에 대해 작용하여 표면에 편재하는 시알릴 루이스 A/X 결정자를 생성시키는 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라제 유전자의 계열 특이적 발현에 의해 결정됨을 제시한다. 상피 조직에서의 활성을 책임지는 인간 푸코실트랜스퍼라제는 FUT3 및 FUT6이다. FUT3 [루이스 알파 (1,3/1,4) 푸코실트랜스퍼라제 유전자로도 불림] 및 FUT6 [혈장 알파 (1,3) 푸코실트랜스퍼라제 유전자] 전사체는 정상 및 형질전환 조직 모두에 존재한다. 푸코실트랜스퍼라제 전사체는 또한 많은 선암종 세포주에서 우세하게 존재하고, FUT3 및 6은 결장암종에서 매우 높게 발현된다 (예를 들어, Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 40:303-311 (2002); Nakamori et al., Pis. Colon Rectum., 40:420-431 (1997); Takada et al., Cancer Res., 53:354-361 (1993); Ichikawa et al., J. Surg. Oncol., 75:98-102 (2000)); Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res., 2002 Mar:21 (1):107-13; Matsumoto et al., Br J Cancer. 2002 Jan 21;86(2):161-7; Ito et al., J Gastroenterol. 2001 Dec;36 (12):823-9; Nakagoe et al., Cancer Detect Prev. 2001;25 (3):299-308; Kumamoto et al., Cancer Res. 2001 Jun 1;61 (11):4620-7; Murata et al., Dis Colon Rectum. 2001 Apr;44 (4):A2-A4; Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res. 2001 Mar;20(1): 85-90; Nakagoe et al., J Gastroenterol. 2001 Mar;36(3):166-72; Nakagoe et al., Tumour Biol. 2001 Mar-Apr;22(2):115-22; Nakagoe et al., Can J Gastroenterol. 2000 Oct;14 (9):753-60; Izawa et al., Cancer Res. 2000 Mar 1;60(5):1410-6; Tanaka et al., Hepatogastroenterology. 1999 Mar-Apr;46(26):875-82; Matsushita et al., Cancer Lett. 1998 Nov 27;133 (2):151- 60; Sato et al., Anticancer Res. 1997 Sep-Oct;17 (5A):3505-11; Yamada et al., Br J Cancer. 1997;76 (5):582-7; Nakamori et al., Dis Colon Rectum. 1997 Apr;40 (4):420-31; Srinivas et al., Scand J Immunol. 1996 Sep;44 (3):197-203 ; Matsushita et al., Lab Invest. 1990 Dec;63 (6):780-91; Ashizawa et al., J Exp Clin Cancer Res. 2003 Mar;22 (1):91-8; Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res. 2002 Sep;21 (3):363-9; Nakagoe et al., Anticancer Res. 2002 Jan-Peb;22 (IA):451-8; Nakagoe et al., J Clin Gastroenterol. 2002 Apr;34 (4):408-15; Nakagoe et al., Cancer Lett. 2002 Jan 25;175 (2):213-21; Tatsumi et al., Clin Exp Metastasis. 1998 Nov;16(8):743-50; Ikeda et al., J Surg Oncol. 1996 JuI;62 (3):171-6; Ikeda et al., Eur J Surg Oncol. 1995 Apr,-21 (2):168-75; Togayachi et al., Int J Cancer. 1999 Sep 24;83 (1):70-9; Satoh et al., Clin Cancer Res. 1997 Apr;3 (4):495-9; Satoh et al., Respiration. 1998,-65 (4):295-8; Satoh et al., Anticancer Res. 1998 Jul-Aug;18 (4B):2865-8; Fukuoka et al., Lung Cancer. 1998 May;20 (2):109-16; Fujiwara et al., Anticancer Res. 1998 Mar- Apr;18 (2A):1043-6; Ogawa et al., Int J Cancer. 1997 Apr 22;74 (2):189-92; Ogawa et al., J Thorac Cardiovasc Surg. 1994 Aug;108 (2):329-36; Asao et al., Cancer. 1989 Dec 15;64 (12):2541-5; Narita et al., Breast Cancer. 1996 Mar 29;3(1):19-23; Yamaguchi et al., Oncology. 1998 JuI-Aug;55 (4):357-62; Sikut et al., Int J Cancer. 1996 May 29;66 (5):617-23; Saito et al., Anticancer Res. 2003 JuI-Aug;23 (4):3441-6; Fujii et al., Urol Int. 2000;64 (3):129-33; Idikio et al., Glycoconj J. 1997 Nov;14 (7):875-7; Inoue et al., Obstet Gynecol. 1992 Mar; 79 (3):434-40; Yamashita et al., Eur J Cancer. 2000 Jan; 36 (1):113-20; Hamanaka et al., Pancreas. 1996 Aug;13 (2):160-5; Ho et al., Cancer Res. 1995 Aug 15;55 (16):3659-63 참조).
<발명의 개요>
본원에 개시된 발명은 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 조사하는 방법 및 분석을 제공하고, 여기서 하나 이상의 상기 바이오마커의 발현은 조직 또는 세포 샘플이 세포자멸 유도제, 예를 들어 Apo2L/TRAIL 및 항-DR5 작용제 항체에 감수성임을 나타낸다. 본 발명의 상이한 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 분석은 바이오마커, 예를 들어 특정 푸코실트랜스퍼라제, 특히 푸코실트랜스퍼라제 3 (FUT3) 및/또는 푸코실트랜스퍼라제 6 (FUT6), 및 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원의 발현을 조사한다.
상기 논의한 바와 같이, 대부분의 정상 인간 세포 종류는 특정 재조합 형태의 Apo2L/TRAIL에 의한 세포자멸 유도에 내성인 것으로 보인다 (Ashkenazi et al., 상기 문헌; Walzcak et al., 상기 문헌). 또한, 질병이 발생한 인간 세포 종류의 일부 집단 (예를 들어 특정 암 세포 집단)은 특정 재조합 형태의 Apo2L/TRAIL에 의한 세포자멸 유도에 내성인 것으로 관찰되었다 (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 1999, 상기 문헌; Walczak et al., Nature Med., 1999, 상기 문헌). 따라서, 분석에 의해 특정 바이오마커의 발현에 대해 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 조사함으로써, 환자 치료에 적절하거나 효과적인 치료법의 평가에 유용한 정보를 편리하고 효율적으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서 FUT3 또는 FUT6 발현을 검출하기 위한 분석으로부터 얻은 정보는 의사에게 질환, 예를 들어 암 환자에 대한 최적의 치료법 (Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 작용제 항체 사용)의 결정시에 사용될 수 있는 유용한 데이타를 제공할 수 있다.
본 발명은 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 작용제 항체에 대한 포유동물의 조직 또는 세포 샘플 (예를 들어 암 세포)의 감수성을 예측하는 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 상기 방법은 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻고, 푸코실트랜스퍼라제 3 또는 푸코실트랜스퍼라제 6의 발현에 대해 조직 또는 세포를 조사하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 다른 바이오마커, 예를 들어 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)의 발현에 대해 조직 또는 세포를 조사하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 mRNA 발현을 검출하는 분석, 효소 활성의 존재를 검출하는 효소 분석, 면역조직화학 분석, 및 본원에서 논의되는 다른 분석을 포함하여 다양한 분석 포맷으로 수행될 수 있다. 상기 조직 또는 세포에서 상기 바이오마커의 발현의 결정은 상기 Apo2/TRAIL 및/또는 치사 수용체 항체의 세포자멸 유도 활성에 감수성인 것으로 예측할 것이다. 선택적인 실시태양에서, 조직 또는 세포는 또한 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현에 대해 조사될 수 있다.
추가로, 본 발명의 방법은 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계, 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)의 발현에 대해 조직 또는 세포를 조사하는 단계, 및 상기 조직 또는 세포 샘플이 상기 하나 이상의 바이오마커를 발현하는지 결정할 때, 상기 조직 또는 세포 샘플을 유효량의 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 작용제 항체에 노출시키는 단계를 포함하는, 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서의 세포자멸 유도 방법을 포함한다. 상기 방법에서, 하나 이상의 바이오마커의 발현을 조사하는 단계는 mRNA 발현을 검출하는 분석, 효소 활성의 존재를 검출하는 효소 분석 및 면역조직화학 분석을 포함하여 다양한 분석 포맷으로 수행될 수 있다. 선택적인 실시태양에서, 상기 방법은 또한 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현에 대한 조직 또는 세포 샘플의 조사를 포함한다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 암 조직 또는 암 세포를 포함한다.
본 발명의 추가의 방법은 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계, 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)의 발현에 대해 조직 또는 세포를 조사하는 단계, 및 상기 조직 또는 세포 샘플이 상기 하나 이상의 바이오마커를 발현하는지 결정할 때, 유효량의 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 작용제 항체를 상기 포유동물 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 질환, 예를 들어 면역 관련 질환 또는 암의 치료 방법을 포함한다. 상기 방법에서 하나 이상의 바이오마커의 발 현을 조사하는 단계는 mRNA 발현을 검출하는 분석, 효소 활성의 존재를 검출하는 효소 분석 및 면역조직화학 분석을 포함하여 다양한 분석 포맷으로 수행될 수 있다. 선택적인 실시태양에서, 상기 방법은 또한 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현에 대한 조직 또는 세포 샘플의 조사를 포함한다. 임의로, 상기 방법은 포유동물에서 암의 치료를 포함한다. 임의로, 상기 방법은 유효량의 Apo2L/TRAIL 및/또는 치사 수용체 작용제 항체의 투여 이외에, 화학요법제(들) 또는 방사선요법을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다.
추가의 실시태양은 다음 청구의 범위에 보다 구체적으로 개시된다.
1. 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계,
푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 조직 또는 세포 샘플을 조사하는 단계
를 포함하고, 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 조직 또는 세포 샘플이 Apo2L/TRAIL의 세포자멸 유도 활성에 대해 감수성이라는 예측 지표인, 포유동물의 조직 또는 세포 샘플의 Apo2L/TRAIL에 대한 감수성 예측 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 푸코실트랜스퍼라제 3 또는 푸코실트랜스퍼라제 6의 mRNA 발현 검출로 조사하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)의 발현 검출을 위한 면역조직화학으로 조사하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 암 세포를 포함하는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암, 결장직장암, 위장암 또는 췌장암의 세포 또는 조직인 방법.
7. 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계,
푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 조직 또는 세포 샘플을 조사하는 단계, 및
상기 하나 이상의 바이오마커 발현 검출 후에, 상기 조직 또는 세포 샘플을 유효량의 Apo2L/TRAIL에 노출시키는 단계
를 포함하는, 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서의 세포자멸 유도 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 푸코실트랜스퍼라제 3 또는 푸코실트랜스퍼라제 6의 mRNA 발현에 대해 시험하여 조사하는 것인 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)의 발현 검출을 위한 면역조직화학으로 조사하는 것인 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 암 세포를 포함하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암, 결장직장암, 위장암 또는 췌장암의 세포 또는 조직인 방법.
13. 제7항에 있어서, 상기 세포를, 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드의 유효량에 노출시키는 것인 방법.
14. 면역 관련 질환 또는 암과 같은 질환을 치료할 포유동물로부터 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계,
푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 조직 또는 세포 샘플을 조사하는 단계, 및
상기 하나 이상의 바이오마커 발현 검출 후에, 상기 포유동물에게 유효량의 Apo2L/TRAIL을 투여하는 단계
를 포함하는, 포유동물에서의 면역 관련 질환 또는 암과 같은 질환의 치료 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 푸코실트랜스퍼라제 3 또는 푸코실트랜스퍼라제 6의 mRNA 발현 검출로 조사하는 것인 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)의 발현 검출을 위한 면역조직화학으로 조사하 는 것인 방법.
17. 제14항에 있어서, 상기 조직 또는 세포에서 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
18. 제14항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 암 세포를 포함하는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 암 세포 또는 암 조직이 결장암, 결장직장암, 위장암 또는 췌장암의 세포 또는 조직을 포함하는 것인 방법.
20. 제14항에 있어서, 상기 포유동물에게 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 것인 방법.
21. 제14항에 있어서, 상기 포유동물에게 화학요법제(들)도 투여하거나, 또는 방사선요법 또한 실시하는 것인 방법.
22. 제14항에 있어서, 상기 포유동물에게 사이토킨, 세포독성제 또는 성장억제제도 투여하는 것인 방법.
23. 제7항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
24. 제14항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
25. 제6항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암 세포 또는 결장직장암 세포인 방법.
26. 제1항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL이 도 1 (서열 1)의 아미노산 41-281 을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 단편인 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL이 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
28. 제12항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암 세포 또는 결장직장암 세포인 방법.
29. 제20항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281로 이루어진 것인 방법.
30. 포유동물의 결장암 또는 결장직장암 세포를 얻는 단계,
푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 암 세포를 조사하는 단계를 포함하고,
상기 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 암 세포가 Apo2L/TRAIL의 세포자멸 유도 활성에 대해 감수성이라는 예측 지표인, 포유동물의 결장암 또는 결장직장암 세포의 Apo2L/TRAIL에 대한 감수성 예측 방법.
31. 포유동물의 결장암 또는 결장직장암 세포를 얻는 단계,
푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 암 세포를 조사하는 단계, 및
상기 하나 이상의 바이오마커 발현 검출 후에, 상기 암 세포를 유효량의 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드에 노출시키는 단계
를 포함하는, 포유동물의 결장암 또는 결장직장암 세포의 세포자멸 유도 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 41-281을 포함하거나, 또는 세포자멸 활성을 갖는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 것인 방법.
35. 결장암 또는 결장직장암을 치료할 포유동물로부터 결장암 또는 결장직장암 세포 샘플을 얻는 단계,
푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 암 세포 샘플을 조사하는 단계, 및
상기 하나 이상의 바이오마커 발현 검출 후에, 상기 포유동물에게 유효량의 Apo2L/TRAIL을 투여하는 단계
를 포함하는, 포유동물에서의 결장암 또는 결장직장암의 치료 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 41-281을 포함하거나, 또는 세포자멸 활성을 갖는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
38. 제36항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 것인 방법.
도 1은 인간 Apo-2 리간드 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 2) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (서열 1)을 보여준다. 뉴클레오티드 위치 447의 "N"은 뉴클레오티드 염기가 "T" 또는 "G"일 수 있음을 나타내기 위해 사용된다.
도 2A 및 2B는 전장 인간 DR4에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 4) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (서열 3)을 보여준다. 인간 DR4에 대한 각각의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 문헌 [Pan et al., Science, 276:111 (1997)]에도 보고된 바 있다.
도 3A는 1998년 11월 19일 공개된 WO 98/51793에 기재된 인간 DR5의 411개의 아미노산 서열 (서열 5)을 보여준다. 인간 DR5의 전사 스플라이스 (splice) 변이체는 당업계에 공지되어 있다. 상기 DR5 스플라이스 변이체는 1998년 8월 20일 공개된 WO 98/35986에 기재된 바와 같이 도 3B 및 3C에 도시된 인간 DR5의 440개의 아미노산 서열 (서열 6)을 코딩한다.
도 3D는 전장 인간 DcR1에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 7) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (서열 8)을 보여준다. 인간 DcR1 (및 그의 특정 도메인)에 대한 각각의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 WO 98/58062에 제시되고 설명된 바 있다.
도 3E는 전장 인간 DcR2에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 9) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (서열 10)을 보여준다. 인간 DcR2 (및 그의 특정 도메인)에 대한 각각의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 WO 99/10484에 제시된 바 있다.
도 4는 전장 인간 (1,3/1,4) 푸코실트랜스퍼라제 (FUT3)에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 11) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (서열 12)을 보여준다. 상기 서열은 GenBank 기탁 번호 HSU27328에 대응하고, 예를 들어 문헌 [Kukowska- Latallo et al., Genes Dev. 1990 Aug;4 (8):1288-303]에 기재되어 있다.
도 5는 전장 인간 알파 (1,3) 푸코실트랜스퍼라제 (FUT6)에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 13) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (서열 14)을 보여준다. 상기 서열은 GenBank 기탁 번호 HSU27333에 대응하고, 예를 들어 문헌 [Koszdin and Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 1992 Aug 31;187 (1):152-7]에 기재되어 있다.
도 6은 28가지 결장암 또는 결장직장암 세포주를 Apo2L (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS) 또는 DR5 모노클로날 항체 "mab", 가교결합된 "XL" 또는 가교결합되지 않은, + 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS)의 세포자멸 활성에 대한 감수성 또는 내성 및 FUT 3, FUT 6, 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 발현의 분석시에 얻은 데이타의 종합 차트를 제공한다.
도 7은 정량적 PCR에 의해 측정된 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 DR5 항체에 대한 감수성 및 FUT 3의 발현의 비교를 제공한다.
도 8은 FACS에 의해 측정된, DR5 항체 (+ 가교결합자 (cross-linker))에 대한 감수성 또는 내성 및 시알릴 루이스 X 또는 A의 발현에 대한 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 비교를 제공한다.
도 9A는 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 감수성 또는 내성 및 FUT3 발현에 대한 상관관계를 분석하는 스피어만 순위 상관 (Spearman Rank Correlation) 시험을 보여준다.
도 9B는 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 감수성 ("sens") 또는 내성 ("res") 및 FUT3 및 시알릴 루이스 A/X 발현과 각각의 세포주의 DR5 항체 세포자멸 활성에 대한 감수성 사이의 통계적 유의성을 분석하는 피셔의 정확 검정 (Fisher's Exact test)의 결과를 보여준다.
도 10은 DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현 (정량적 PCR에 의해 측정) 및 특정 세포주의 Apo2L 또는 DR5 항체에 대한 상태 (감수성 또는 내성)에 대한 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 비교를 제공한다.
도 11은 DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현 (FACS에 의해 측정) 및 특정 세포주의 Apo2L 또는 DR5 항체에 대한 상태 (감수성 또는 내성)에 대한 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 비교를 제공한다.
도 12는 4가지 결장직장암 세포주인 CaCo2, SW 1417, DLD-1, 및 Colo 205에 대한 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 면역조직화학적 염색 및 FACS에 의해 측정된, 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 발현에 대한 그의 상관관계, 및 Apo2L에 대한 감수성에 대한 그의 상관관계를 보여준다.
도 13은 정상 결장 점막, 정상 간 조직, 원발성 결장암 및 결장암 전이의 조직 샘플에서 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 발현을 보여주는 IHC 실험의 개요를 보여준다.
본원에 설명되거나 참조된 기술 및 절차는 당업자에게 일반적으로 잘 이해되고, 통상적인 방법, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재된 바와 같은 널리 이용되는 분자 클로닝 방법을 사용하여 이용된다. 적절한 경우, 시판되는 키트 및 시약의 사용을 수반하는 과정은 달리 언급되지 않으면 제조사에 의해 규정된 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 수행된다.
본 발명의 방법 및 분석을 설명하기 전에, 본 발명이 물론 변할 수 있는, 본원에서 설명되는 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구성체 및 시약으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것으로서 단지 첨부되는 청구의 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본원 명세서 및 첨부되는 청구의 범위에서 단수 형태 (부정관사) 및 정관사는 달리 분명하게 문맥에서 언급되지 않으면 복수 형태를 포함함을 알아야 한다. 따라서, 예를 들어 "유전자 변형"은 복수의 유전자 변형을 포함하고, "프로브"의 언급은 하나 이상의 프로브 및 당업자에게 공지된 그의 동등물 등에 대한 언급을 포함한다.
본원에서 언급되는 모든 간행물은 그 간행물이 그와 관련하여 언급되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 언급되는 간행물은 본원의 출원일 이전의 그의 개시 내용에 대해 인용된다. 여기서, 그 어느 것도 본 발명자들이 본 발명의 최우선일 또는 우선일에 의해 간행물보다 선행한다고 말하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한, 실제 공개일은 제시된 것과 상이할 수 있고, 별도의 확인을 필요로 할 수 있다.
I. 정의
용어 "Apo2L/TRAIL", "Apo-2L" 및 "TRAIL"은 도 1에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 114-281, 95-281, 잔기 92-281, 잔기 91-281, 잔기 41-281, 잔기 15-281 또는 잔기 1-281 (여기서 잔기는 처음 및 마지막 번호의 잔기를 포함함)를 포함하는 폴리펩티드 서열, 및 상기 서열의 생물학적 활성 단편, 결실, 삽입 또는 치환 변이체를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 한 실시태양에서, 폴리펩티드 서열은 도 1의 잔기 114-281을 포함하고, 임의로 도 1의 잔기 114-281로 이루어진다. 임의로, 폴리펩티드 서열은 도 1의 잔기 92-281 또는 잔기 91-281을 포함한다. Apo-2L 폴리펩티드는 도 1에 도시된 천연 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 임의로, 도 1의 잔기 Pro119를 코딩하는 코돈은 "CCT" 또는 "CCG"일 수 있다. 다른 실시태양에서, 단편 또는 변이체는 생물학적으로 활성이고, 상기 언급된 Apo2L/TRAIL 서열의 임의의 하나와 적어도 약 80％ 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 서열 동일성을 갖는다. 임의로, Apo2L/TRAIL 폴리펩티드는 엄격한 조건 하에 도 1에 제시된 코딩 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 상기 정의는 적어도 하나의 그의 천연 아미노산이 알라닌 잔기로 치환된 Apo2L/TRAIL의 치환 변이체를 포함한다. Apo2L/TRAIL의 특정 치환 변이체는 적어도 하나의 아미노산이 알라닌 잔기로 치환된 것을 포함한다. 상기 치환 변이체는 예를 들어 "D203A", "D218A" 및 "D269A"로서 확인된 것을 포함한다. 상기 명명법은 위치 203, 218, 및/또는 269 (도 1에 도시된 넘버링을 사용)의 아스파르트산 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 Apo2L/TRAIL 변이체를 확인하기 위해 사용된다. 임의로, Apo2L 변이체는 PCT 출원 공개 WO 01/00832의 표 I에 제시된 하나 이상의 알라닌 치환을 포함할 수 있다. 치환 변이체는 2001년 1월 4일 공개된 WO 01/00832의 표 I에 제시된 하나 이상의 잔기 치환을 포함한다. 또한, 상기 정의는 Apo2L/TRAIL 공급원으로부터 단리되거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 천연 서열 Apo2L/TRAIL을 포함한다. 본 발명의 Apo2L/TRAIL은 PCT 공개 WO97/01633 및 WO97/25428에 개시된 Apo2L/TRAIL 또는 TRAIL로 언급되는 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "Apo2L/TRAIL" 또는 "Apo2L"은 일반적으로 폴리펩티드의 단량체, 이량체 또는 삼량체 형태를 포함하는 Apo2L/TRAIL의 형태를 의미하기 위해 사용된다. Apo2L 서열에서 언급되는 아미노산 잔기의 모든 넘버링은 달리 구체적으로 언급되지 않으면 도 1에 따른 넘버링을 사용한다. 예를 들어, "D203" 또는 "Asp203"은 도 1에 제시된 서열에서 위치 203의 아스파르트산 잔기를 의미한다.
용어 "Apo2L/TRAIL 세포외 도메인" 또는 "Apo2L/TRAIL ECD"는 본질적으로 트랜스멤브레인 및 세포질 도메인이 존재하지 않는 Apo2L/TRAIL의 형태를 의미한다. 통상적으로, ECD는 1％ 미만의 상기 트랜스멤브레인 및 세포질 도메인을 가질 것이고, 바람직하게는 0.5％ 미만의 상기 도메인을 가질 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 트랜스멤브레인 도메인(들)은 소수성 도메인 종류를 확인하기 위해 당업계에서 통상 사용되는 기준에 따라 확인됨이 이해될 것이다. 트랜스멤브레인 도메인의 정확한 경계는 상이할 수 있지만, 가장 가능하게는 초기에 확인된 도메인의 어느 한 말단에 약 5개 이하의 아미노산만큼 상이할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, ECD는 트랜스멤브레인 및 세포질 또는 세포내 도메인이 존재하지 않는 (및 막 결합되지 않은) 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인 서열로 이루어질 것이다. Apo-2L/TRAIL의 특정 세포외 도메인 서열은 PCT 공개 WO97/01633 및 WO97/25428에 기재되어 있다.
용어 "Apo2L/TRAIL 단량체" 또는 "Apo2L 단량체"는 Apo2L의 세포외 도메인 서열의 공유결합 사슬을 의미한다.
용어 "Apo2L/TRAIL 이량체" 또는 "Apo2L 이량체"는 디술피드 결합을 통해 공유 연결로 결합된 2개의 Apo-2L 단량체를 의미한다. 본원에서 사용되는 상기 용어는 유리 Apo2L 이량체 및 Apo2L의 삼량체 형태 내에 존재하는 (즉, 다른 제3의 Apo2L 단량체와 회합된) Apo2L 이량체를 포함한다.
용어 "Apo2L/TRAIL 삼량체" 또는 "Apo2L 삼량체"는 비공유회합된 3개의 Apo2L 단량체를 의미한다.
용어 "Apo2L/TRAIL 응집체"는 예를 들어 Apo2L/TRAIL의 헥사머 및 나노머 형태를 형성하는 Apo2L/TRAIL의 자가회합된 보다 올리머 형태, 예를 들어 Apo2L/TRAIL 삼량체를 의미하기 위해 사용된다. Apo2L/TRAIL 단량체, 이량체, 또는 삼량체 (또는 다른 응집체)의 존재 및 양의 결정은 당업계에 공지된 방법 및 분석 (및 시판되는 물질을 사용), 예를 들어 천연 크기 배제 HPLC ("SEC"), 소듐 도데실 술페이트를 사용하여 변형 크기 배제 ("SDS-SEC"), 역상 HPLC 및 모세관 전기영동을 사용하여 수행할 수 있다.
"Apo-2 리간드 수용체"는 그의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 각각 도 2 및 3에 나타낸 "DR4" 및 "DR5"로서 당업계에서 언급되는 수용체를 포함한다. 문헌 (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997))에 "DR4"로 언급되는 TNF 수용체 패밀리 멤버가 기재되어 있다 (또한 1998년 7월 30일 공개된 WO98/32856; 1999년 7월 29일 공개된 WO 99/37684; 2000년 12월 7일 공개된 WO 00/73349; 2002년 8월 13일 등록된 US 6,433,147; 2002년 10월 8일 등록된 US 6,461,823 및 2002년 1월 29일 등록된 US 6,342,383 참조). 다른 문헌 [Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) 및 Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)]은 Apo2L/TRAIL에 대한 다른 수용체를 기재한 바 있다 (또한 1998년 11월 19일 공개된 WO98/51793; 1998년 9월 24일 공개된 WO98/41629 참고). 상기 수용체는 DR5로도 언급된다 (수용체는 또한 별법으로 Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 또는 KILLER로도 언급된 바 있다; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., BMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); 1998년 8월 20일 공개된 WO98/35986; 1998년 10월 14일 공개된 EP870,827, 1998년 10월 22일 공개된 WO98/46643; 1999년 1월 21일 공개된 WO99/02653; 1999년 2월 25일 공개된 WO99/09165, 1999년 3월 11일 공개된 WO99/11791; 2002년 8월 13일 공개된 US 2002/0072091; 2001년 12월 7일 공개된 US 2002/0098550; 2001년 12월 6일 등록된 US 6,313,269; 2001년 8월 2일 공개된 US 2001/0010924; 2003년 7월 3일 공개된 US 2003/01255540; 2002년 10월 31일 공개된 US 2002/0160446, 2002년 4월 25일 공개된 US 2002/0048785, 2003년 5월 27일 등록된 US 6,569,642, 2000년 6월 6일 등록된 US 6,072,047, 2003년 11월 4일 등록된 US 6,642,358). 상기한 바와 같이, Apo-2L에 대한 다른 수용체는 DcR1, DcR2 및 OPG를 포함한다 (Sheridan et al., 상기 문헌, Marsters et al., 상기 문헌, 및 Simonet et al., 상기 문헌 참조). 본원에서 사용될 때 용어 "Apo-2L 수용체"는 천연 서열 수용체 및 수용체 변이체를 포함한다. 상기 용어는 인간을 포함하여 다양한 포유동물에서 발현되는 Apo-2L 수용체를 포함한다. Apo-2L 수용체는 다양한 인간 조직 계통에서 자연 발생하는 바와 같이 내인성으로 발현될 수 있거나, 재조합 또는 합성 방법에 의해 발현될 수 있다. "천연 서열 Apo- 2L 수용체"는 자연에서 유도되는 Apo-2L 수용체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 Apo-2L 수용체는 임의의 포유동물의 자연 발생 Apo-2L 수용체의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 천연 서열 Apo-2L 수용체는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 Apo-2L 수용체"는 구체적으로 수용체의 천연 생성 말단 절단 (truncated) 또는 분비 형태 (예를 들어 세포외 도메인 서열을 포함하는 가용성 형태), 천연 생성 변이체 형태 (예를 들어, 교대 스플라이싱된 형태) 및 천연 생성 대립유전자 변이체를 포함한다. 수용체 변이체는 천연 서열 Apo-2L 수용체의 단편 또는 결실 돌연변이체를 포함할 수 있다. 도 3A는 1998년 11월 19일 공개된 WO 98/51793에 제시된 인간 DR5의 411개의 아미노산 서열을 보여준다. 인간 DR5의 전사 스플라이스 변이체는 당업계에 공지되어 있다. 상기 DR5 스플라이스 변이체는 1998년 8월 20일 공개된 WO 98/35986의 도 3B 및 3C에 도시된 인간 DR5의 440개의 아미노산 서열을 코딩한다.
"치사 수용체 항체"는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리의 수용체에 대해 작용하고 세포자멸의 신호를 전달할 수 있는 치사 도메인을 포함하는 항체 또는 항체들을 일반적으로 의미하기 위해 본원에 사용되고, 상기 항체는 DR5 항체 및 DR4 항체를 포함한다.
"DR5 수용체 항체", "DR5 항체" 또는 "항-DR5 항체"는 적어도 하나의 형태의 DR5 수용체 또는 그의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 넓은 의미로 언급하기 위해 사용된다. 임의로, DR5 항체는 이종 서열 또는 분자에 융합되거나 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 항체가 보다 고차원의 또는 올리고머 형태의 복합체를 형성하는 것을 허용하거나 돕는다. 임의로, DR5 항체는 DR5 수용체에 결합하고, 임의의 추가의 Apo-2L 수용체 (예를 들어 DR4, DcR1 또는 DcR2)에는 결합하거나 교차반응하지 않는다. 임의로, 항체는 DR5 신호전달 활성의 작용제이다.
임의로, 본 발명의 DR5 항체는 BIAcore 결합 분석으로 측정시에 약 0.1 nM 내지 약 20 mM의 농도에서 DR5 수용체에 결합한다. 임의로, 본 발명의 DR5 항체는 BIAcore 결합 분석으로 측정시에 약 0.6 nM 내지 약 18 mM의 IC50 값을 보인다.
"DR4 수용체 항체", "DR4 항체" 또는 "항-DR4 항체"는 적어도 하나의 형태의 DR4 수용체 또는 그의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 가장 넓은 의미로 언급하기 위해 사용된다. 임의로, DR4 항체는 이종 서열 또는 분자에 융합되거나 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 항체가 보다 고차원의 또는 올리고머 형태의 복합체를 형성하는 것을 허용하거나 돕는다. 임의로, DR4 항체는 DR4 수용체에 결합하고, 임의의 추가의 Apo-2L 수용체 (예를 들어 DR5, DcR1 또는 DcR2)에는 결합하거나 교차반응하지 않는다. 임의로, 항체는 DR4 신호전달 활성의 작용제이다.
임의로, 본 발명의 DR4 항체는 BIAcore 결합 분석으로 측정시에 약 0.1 nM 내지 약 20 mM의 농도에서 DR4 수용체에 결합한다. 임의로, 본 발명의 DR4 항체는 BIAcore 결합 분석으로 측정시에 약 0.6 nM 내지 약 18 mM의 IC50 값을 보인다.
용어 "작용제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 시험관 내에서, 계 내에서 (in situ) 또는 생체 내에서 Apo2L/TRAIL, DR4 또는 DR5의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 향상, 자극 또는 활성화시키는 임의의 분자를 포함한다. Apo2L/TRAIL의 DR4 또는 DR5에 대한 상기 생물학적 활성 결합의 예는 세포자멸 및 문헌에 추가로 보고된 것을 포함한다. 작용제는 직접 또는 간접 방식으로 기능할 수 있다. 예를 들어, 작용제는 수용체 활성화 또는 신호 전달을 야기하는 DR4 또는 DR5에 대한 그의 직접 결합의 결과로서, 시험관 내에서, 계 내에서 또는 생체 내에서 DR4 또는 DR5의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 향상, 자극 또는 활성화시키는 기능을 수행한다. 작용제는 또한 예를 들어 DR4 또는 DR5 활성화 또는 신호 전달을 추후 야기하는 다른 효과기 분자의 자극의 결과로서, 시험관 내에서, 계 내에서 또는 생체 내에서 DR4 또는 DR5의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 향상, 자극 또는 활성화시키는 기능을 간접적으로 수행한다. 작용제가 DR4 또는 DR5 활성화 또는 활성을 향상 또는 증가시키는 기능을 간접적으로 수행하는 인핸서 분자로서 기능할 수 있음도 고려된다. 예를 들어, 작용제는 포유동물에서 내인성 Apo-2L의 활성을 향상시킬 수 있다. 이것은 예를 들어 DR4 또는 DR5의 예비복합체화 또는 DR4 또는 DR5 수용체와 각각의 리간드의 복합체의 안정화 (예를 들어 Apo-2L과 DR4 또는 DR5 사이에 형성된 천연 복합체의 안정화)에 의해 달성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오마커"는 일반적으로 유전자, 단백질, 탄수화물 구조체, 또는 당지질을 포함하는 분자를 의미하고, 그의 포유동물의 조직 또는 세포 내에서 또는 그 상에서의 발현은 표준 방법 (또는 본원에 개시되는 방법)에 의해 검출될 수 있고, Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체에 대한 포유동물 세포 또는 조직의 감수성을 예측케 하는 것이다. 본원에서 고려되는 상기 바이오마커는 "(1,3/1,4) 푸코실트랜스퍼라제" 또는 "FUT3", "알파 (1,3) 푸코실트랜스퍼라제" 또는 "FUT6", "시알릴 루이스 A" 및 "시알릴 루이스 X"를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 임의로, 상기 바이오마커의 발현은 대조군 조직 또는 세포 샘플에 대해 관찰되는 것보다 더 높게 결정된다. 임의로, 예를 들어, 상기 바이오마커의 발현은 PCR 또는 FACS 분석에서 대조군 조직 또는 세포 샘플에 대해 관찰되는 것보다 시험 조직 또는 세포 샘플에서 적어도 50배 또는 바람직하게는 적어도 100배 더 높은 것으로 결정될 것이다. 임의로, 상기 바이오마커의 발현은 IHC 분석에서 염색 강도에 대해 적어도 2 이상의 스코어로 결정될 것이다.
"(1,3/1,4) 푸코실트랜스퍼라제" 또는 "FUT3"은 본원에서 설명하는 구조적 특징을 갖고 임의로 공여체 GDP-푸코스로부터 푸코스 잔기를 GlcNAc (FUT III-VII 및 IX)에 대한 α3- 또는 β4- 연결로 수용체 기질로 전달하는 것을 촉매하는 분자를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 인간 FUT3에 대한 DNA 서열 및 아미노산 서열은 도 4에 제시된다. 상기 서열은 GenBank 기탁 번호 HSU27328에 대응하고, 예를 들어 문헌 [Kukowska-Latallo et al., Genes Dev. 1990 Aug;4(8):1288-303]에 기재되어 있다. FUT는 일반적으로 골지 (Golgi) 공포에 존재하는 타입 II 트랜스멤브레인 당단백질이고, 일반적으로 N-말단 세포질 테일, 막에 걸치는 영역 및 골지체에 공간 형태로 (lumenally) 배향하는 촉매 도메인으로 이루어진다. 막에 걸치는 영역 및 촉매 도메인은 스템 (stem)으로 불리는 영역이다 (Paulson and Colley, J. Biol. Chem., 264:17615-17618 (1989)).
"알파 (1,3) 푸코실트랜스퍼라제" 또는 "FUT6"은 구조적으로 관련되는 분자, 예를 들어 도 5에 제시된 인간 FUT6에 대한 DNA 서열 및 아미노산 서열에 관련된 분자를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 상기 서열은 GenBank 기탁 번호 HSU27333에 대응하고, 예를 들어 문헌 [Koszdin and Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 1992 Aug 31; 187(1):152-7]에 기재되어 있다. FUT 6은 일반적으로 상피 세포 및 간, 신장 및 위장 조직, 특히 위, 공장 및 결장에서 발현된다 (및 일반적으로 비장, 폐 및 자궁경부에서 최소로 발현된다). FUT 6은 일반적으로 뇌, 부신피질, 또는 말초혈 백혈구에서 검출되지 않는다.
"시알릴 루이스 A"는 막에 결합되거나 예를 들어 혈청에서 순환하는 가용성 형태일 수 있는, 다음 서열 또는 구조를 갖는 사당류 탄수화물 구조체 또는 항원을 의미하기 위해 본원에서 사용된다:
NeuAcα2-->3Galβ1-->3[Fucα1-->4]GlcNAcβ1-->R
(NeuAcα2-->3Galβ1-->3(Fucα1-->4)GlcNAcβ1-->R)
Figure 112007018079398-PCT00001
"시알릴 루이스 X"는 막에 결합되거나 예를 들어 혈청에서 순환하는 가용성 형태일 수 있는, 다음 서열 또는 구조를 갖는 사당류 탄수화물 구조체 또는 항원을 의미하기 위해 본원에서 사용된다:
NeuAcCC2-->3Galβ1-->4 [Fucα1-->3]GlcNAcβ1-->R
(NeuAcα2-->3Galβ1-->4(Fucα1-->3)GlcNAcβ1-->R)
Figure 112007018079398-PCT00002
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "포유동물"은 인간, 소, 말, 개 및 고양이를 포함하는, 포유동물로서 분류된 임의의 포유동물을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 포유동물은 인간이다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 체액, 예를 들어, 뇌척수액, 양수, 복수, 또는 간질액; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻는다. 조직 샘플은 특성상 조직과 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.
"상호관련시키다" 또는 "상호관련시키는"은 제1 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 임의의 방식으로 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜을 수행할 때 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/있거나 제2 분석 또는 프로토콜을 수행하여야 하는지 결정하기 위해 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있다. 면역조직화학적 분석 또는 프로토콜의 실시태양에 대해, 특정 치료법을 수행하여야 하는지 결정하기 위해서 IHC의 결과를 이용할 수 있다.
"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 용어 "핵산"은 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "표지"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅되거나 융합되고 컨쥬게이팅되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.
"항체 단편"은 바람직하게는 항원-결합 또는 가변 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"천연 항체"는 대체로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄에서 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 이어서 많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인에 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 내의 서열에서 크게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용됨을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 보존도가 큰 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 언급된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는, 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 보인다.
항체를 파파인으로 분해하면, 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는, "Fab" 단편으로 언급되는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 잔여 "Fc" 단편이 생성되고, 이 명칭은 그의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 상기 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합할 능력을 갖는다.
Fab 단편도 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 적어도 하나의 유리 티올기를 포함하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이의 힌지 시스테인을 갖는 한쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
임의의 척추동물종의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 분명하게 상이한 종류의 하나로 분류될 수 있다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대해서는, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미하고, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성시키게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 상세하게 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 자연 발생 변이체를 제외하고는 동일하다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그의 특이성에 추가하여, 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되고 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 변경 표현 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 요구되는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 종류 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 목적하는 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예, 구세계 원숭이, 예를 들어 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이)에서 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "프리머타이즈드 (primatized)" 항체를 포함한다 (미국 특허 5,693,780).
비인간 (예, 쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역의 잔기가 요구되는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변경은 항체 성능을 보다 개선하기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 일부의 인간 면역글로불린을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 필요한 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정되는 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
목적하는 항원에 "결합하는" 항체는 항체가 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위한 치료체 또는 진단제로서 유용하도록 충분한 친화도 및/또는 결합력으로 항원에 결합할 수 있는 것이다.
본 발명의 목적을 위해, "면역요법"은 비컨쥬게이팅되거나 또는 "네이키드 (naked)" 항체일 수 있거나, 또는 이종 분자(들) 또는 약제(들), 예를 들어 하나 이상의 세포독성제(들)과 컨쥬게이팅되거나 융합되어 "면역컨쥬게이트"를 생성시킬 수 있는 항체를 사용하여 포유동물 (바람직하게는 인간 환자)을 치료하는 방법을 의미할 것이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 (in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
표현 "유효량"은 대상 질병 또는 병태의 예방, 완화 또는 치료에 효과적인 약제 (예를 들어 Apo2L/TRAIL, 항-DR4 또는 DR5 항체 등)의 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는", "치료" 및 "요법"은 치료 요법, 예방 요법 및 억제 요법을 의미한다. 연속적인 치료 또는 투여는 1일 이상의 치료 중단 없이 적어도 1일을 기준으로 한 치료를 의미한다. 간헐적 치료 또는 투여, 또는 간헐 방식의 치료 또는 투여는 연속적이 아니라 특성상 주기적인 치료를 의미한다.
용어 "사이토킨"은 세포간 매개제로서 다른 세포에 대해 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 관용어이다. 상기 사이토킨의 예는 림포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 전구인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 형성 호르몬 (LH); 간 성장인자; 섬유모세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-회합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장인자; 혈소판-성장인자; 전환 성장인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 마크로파지-CSF (M-CSF); 과립구-마크로파지-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 사이토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 균등물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능의 억제 또는 제한 및/또는 세포의 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 Il31, Il25, Y90 및 Re186), 화학요법제, 및 톡신, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 톡신, 또는 그의 단편을 포함하고자 한 것이다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN(등록상표)); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함), 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 염산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디인 항생제 (예를 들어 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 phiI1 (예를 들어 Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참조); 디네미신, 예를 들어 디네미신 A; 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 Adriamycin(등록상표) (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사체, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리콜테센 (특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL(등록상표), Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스톤 소재) 및 독세탁셀 (TAXOTERE(등록상표), Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로란부실; 겜시타빈 (GEMZAR(등록상표)); 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴; 비노렐빈 (NAVELBINE(등록상표)); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11;C 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 상기 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (NOLVADEX(등록상표) 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (FARESTON(등록상표)); 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (Megace(등록상표)), 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸 (RIVISOR(등록상표)), 레트로졸 (FEMARA(등록상표)) 및 아나스트로졸 (ARIMIDEX(등록상표)); 및 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에서 사용되는 "성장억제제"는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포, 특히 본원에서 확인된 임의의 유전자를 과다발현하는 암 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장억제제는 S기에서 상기 유전자를 과다발현하는 세포의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에) 차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 억제제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p.13]에서 볼 수 있다.
용어 "세포자멸" 및 "세포자멸 활성"은 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 세포질 압축, 형질막 미세융모의 상실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는 하나 이상의 특징적인 세포 변경이 수반되는 포유동물의 규칙에 따르거나 조절된 세포 치사를 의미한다. 상기 활성은 예를 들어 세포 생존성 분석 (예를 들어 알라마르 블루 (Alamar blue) 분석 또는 MTT 분석), FACS 분석, 카스파제 활성화, DNA 단편화 (예를 들어 Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139:271-279 (1991) 참조), 및 당업계에 공지된 폴리-ADP 리보스 폴리머라제 "PARP" 절단 분석에 의해 결정 및 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "질환"은 일반적으로 유효량의 Apo2L/TRAIL, 항-DR4 항체, 및/또는 항-DR5 항체에 의해 치료될 수 있는 임의의 질병 또는 질환을 포함하여 본원에서 설명되는 조성물을 사용한 치료에 의해 개선되는 임의의 병태를 의미한다. 질환은 만성 및 급성 질환, 및 포유동물을 문제되는 질환에 걸리기 쉽게 만드는 병리학적 상태를 포함한다. 본 발명에서 치료되는 질환의 비제한적인 예는 양성 및 악성 암; 염증, 혈관신생 및 면역학적 질환, 자가면역 질환, 관절염 (류마티스성 관절염 포함), 다발 경화증 및 HIV/AIDS를 포함한다.
용어 "암", "암성" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예는 편평세포암종, 골수종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 선암종, 위장(관)암, 신장암, 난소암, 간암, 림프아구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 아교모세포종, 자궁경부암, 뇌암, 위암, 방광암, 간암종, 유방암, 결장암종, 및 두부 및 목암을 포함한다.
용어 "면역 관련 질병"은 포유동물의 면역계의 성분이 포유동물의 이환을 야기, 매개 또는 다른 방식으로 작용하는 질병을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 개입이 질병의 진행에 대한 개선 효과를 갖는 질병이 포함된다. 상기 용어에는, 자가면역 질병, 면역 매기 염증 질환, 비면역 매개 염증 질환, 감염성 질병, 및 면역결핍 질병이 포함된다. 그 일부가 면역 또는 T 세포 매개성인, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 면역 관련 및 염증 질환의 예는 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병증, 전신 경화증 (피부경화증), 특발성 염증성 근육병증 (피부근육염, 다발근육염), 쇼그렌 증후군, 전신 혈관염, 유육종증, 자가면역 용혈 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역 저혈소판증 (특발성 혈소판 감소 자색반, 면역-매개 저혈소판증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모또 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축 갑상선염), 당뇨병, 면역 매개 신장병 (사구체신염, 세뇨관 간질성 신장염)), 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 예를 들어 다발 경화증, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 기랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증; 간담즙성 질환, 예를 들어 감염성 간염 (간염 A, B, C, D, E 및 다른 비간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종 간염, 및 경화성 담관염, 염증성 및 섬유성 폐 질환, 예를 들어 염증성 장 질환 (예를 들어 궤양성 대장염 및 크론병); 글루텐 민감 장병증, 및 휘플 (Whipple) 병, 자가면역 또는 면역 매개 피부병, 예를 들어 수포성 피부 질환, 다형홍반 및 접촉성 피부염, 건선; 알레르기 질환, 예를 들어 천식, 알레르기 비염, 아토피성 피부염, 음식 과민증 및 두드러기, 폐의 면역학적 질병, 예를 들어 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민증 폐렴; 이식 관련 질환, 예를 들어 이식편 거부 및 이식편 대 숙주 질환을 포함한다. 감염성 질병은 AIDS (HIV 감염), 간염 A, B, C, D 및 E, 세균 감염, 진균 감염, 원충 감염 및 기생충 감염을 포함한다.
"자가면역 질병"은 넓은, 일반적인 의미로 정상 또는 건강한 조직의 파괴가 개별 포유동물의 체액성 또는 세포성 면역 반응으로부터 그 자신의 조직 성분까지 발생하는 포유동물의 질환 또는 상태를 의미하기 위해 사용된다. 그 예는 홍반성 루푸스, 갑상선염, 류마티스성 관절염, 건선, 다발 경화증, 자가면역성 당뇨병 및 염증성 장 질환 (IBD)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때, 용어 "태깅된 (tagged)"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 의미한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 작용할 수 있는 에피토프를 제공하거나 일부 다른 기능, 예를 들어 일반적으로 항체 또는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧게 올리고머화하는 능력 (예를 들어 류신 지퍼 도메인을 갖는 펩티드에서 발생)을 제공할 수 있는 잔기를 갖는다. 또한, 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 태그 특이적 항체가 다른 에피토프에는 실질적으로 교차반응하지 않도록 매우 특유하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기, 보통 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10 내지 약 20개의 잔기)를 갖는다.
용어 "2가 금속 이온"은 2개의 양전하를 갖는 금속 이온을 의미한다. 2가 금속 이온의 예는 아연, 코발트, 니켈, 카드뮴, 마그네슘 및 망간을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 상기 금속의 특정 형태는 상기 2가 금속 이온의 염 형태 (예를 들어, 제약학상 허용되는 염 형태), 예를 들어 클로라이드, 아세테이트, 카르보네이트, 시트레이트 및 술페이트 형태를 포함한다. 임의로, 본 발명에 사용하기 위한 2가 금속 이온은 아연, 바람직하게는 염 형태, 즉 아연 술페이트 또는 아연 클로라이드이다.
본원에 개시된 상이한 펩티드 또는 단백질을 설명하기 위해 사용될 때 "단리된"은 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 일반적으로 펩티드 또는 단백질의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질 또는 비단백질 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 펩티드 또는 단백질은 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 또는 (3) 질량 분광법 또는 펩티드 맵핑 기술에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 물질은 그의 자연 환경의 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 펩티드 또는 단백질은 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 확인된 서열에 대해 "아미노산 서열 동일성 비율 (％)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭 (gap)을 도입시킨 후 참조 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 비교되는 전장 서열에 걸친 최대 정렬의 달성에 필요한 할당 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있는, 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 아미노산 동일성 비율값은 그 소스 코드가 미국 저작국 (United States Copyright Office, 미국 워싱턴 디. 씨. 20559)에서 사용자 제출서류로 출원되어 미국 저작권 TXU510087 하에 등록된 제넨테크 (Genentech) 소유의 서열 비교 컴퓨터 프로그램 "ALIGN-2"를 사용하여 얻을 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 (미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)로부터 입수가능하다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 경험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 그의 융점 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화 서열 사이의 요구되는 동일성 정도가 클수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격성의 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해서는 문헌 [Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의되는 "고염격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도의 사용; 50℃의 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트; (2) 혼성화 동안 변성제의 사용; 50％ (v/v) 포름아미드 + 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ Ficoll/O.1％ 폴리비닐피롤리돈/5O mM 인산나트륨 버퍼 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨 (42℃); 또는 (3) 42℃의 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃의 50％ 포름아미드를 사용한 세척, 이어서 55℃의 EDTA 함유 0.1 x SSC로 구성된 고염격성 세척과 함께 50％ 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M/시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트 (42℃)의 사용으로 확인된다.
"중등 엄격성 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 20％ 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단 처리 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서의 철야 인큐베이션, 이어서 약 37-50℃의 1 x SSC를 사용한 필터의 세척을 포함한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 인식할 것이다.
용어 "프라이머" 또는 "프라이머들"은 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
용어 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 예비 서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비 단백질로서 발현될 경우 폴리펩티드용 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치할 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 페이스 (reading phase)로 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 용례에 따라 사용된다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)을 발현하는 비특이적인 세포독성 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합 항체를 인식한 후, 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고 상기 수용체의 대립 유전자 변이체 및 교대 스플라이싱된 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) 참고). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에 개시되어 있다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR가 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 또한, 이 용어는 모체 IgG의 태아로의 전달에 작용하는 신생아의 수용체 FcRn를 포함한다 (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)). 본원에서 FcR은 다형성, 예를 들어 IgG1에 결합하는 수용체의 영역에 위치하는 아미노산 위치 158에 페닐알라닌 (F) 또는 발린 (V)을 생성시키는 FcγRIIIa를 코딩하는 유전자의 유전적 이형성을 포함한다. 동종접합성 발린 FcγRIIIa (FcγRIIIa-158V)는 동종접합성 페닐알라닌 FcγRIIIa (FcγRIIIa-158F) 또는 이종접합성 (FcγRIIIa-158F/V) 수용체에 비해 인간 IgG1에 대해 보다 높은 친화도를 갖고 시험관 내에서 증가된 ADCC를 매개하는 것으로 밝혀졌다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원과 복합체화된 분자 (예를 들어 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.
II. 본 발명의 전형적인 방법 및 물질
본원에 개시된 방법 및 분석은 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 조사하는 것에 관한 것이고, 여기서, 하나 이상의 바이오마커의 발현의 결정은 조직 또는 세포 샘플이 세포자멸 유도제, 예를 들어 Apo2L/TRAIL 및 항-DR5 작용제 항체에 대해 감수성일 것임을 예측하거나 나타내는 것이다. 본원의 방법 및 분석은 바이오마커, 예를 들어 특정 푸코실트랜스퍼라제, 특히 푸코실트랜스퍼라제 3 (FUT3) 및/또는 푸코실트랜스퍼라제 6 (FUT6), 및 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원의 발현을 조사하는 것을 포함한다.
상기 논의한 바와 같이, 세포자멸 유도에 내성인 질병에 걸린 인간 세포 종류의 일부 집단 (예를 들어 특정 암 세포 집단)이 존재한다. 따라서, 본원에 개시된 방법 및 분석은 환자 치료를 위해 적절하거나 효과적인 요법을 평가할 때 유용한 데이타 및 정보를 얻기 위한 편리하고, 효율적이며, 비용 효과적인 수단을 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 예를 들어, 암 또는 면역 관련 병태로 진단된 환자에 대해 조직 또는 세포 샘플을 얻기 위해 생검을 수행할 수 있고, 환자의 세포가 치료제, 예를 들어 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체에 대해 감수성인지를 결정하기 위해 샘플을 각종 시험관내 분석에 의해 조사할 수 있다.
본 발명은 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 작용제 항체에 대한 포유동물의 조직 또는 세포 샘플 (예를 들어 암 세포)의 감수성을 예측하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻고 하나 이상의 바이오마커의 발현에 대해 조사한다. 상기 방법은 mRNA 발현을 검출하는 분석, 효소 활성의 존재를 검출하는 효소 분석, 및 면역조직화학 분석을 포함하여 다양한 분석 포맷으로 수행할 수 있다. 상기 조직 또는 세포에서 상기 바이오마커의 발현의 결정은 상기 조직 또는 세포가 Apo2L/TRAIL 및/또는 치사 수용체 항체의 세포자멸 유도 활성에 감수성인 것으로 예측할 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 상기 특정 바이오마커의 발현이 세포자멸 유도제, 예를 들어 Apo2L/TRAIL 및 치사 수용체 작용제 항체에 대한 상기 조직 및 세포의 감수성과 상호관련됨을 밝혀내었다.
아래에서 논의하는 바와 같이, 샘플에서 다양한 바이오마커의 발현은 면역조직화학적 및/또는 웨스턴 분석, 정량적 혈액 기반 분석 (예를 들어 혈청 ELISA) (예를 들어 단백질 발현 수준을 조사하기 위해), 생화학적 효소 활성 분석, mRNA의 계내 혼성화, 노던 분석 및/또는 PCR 분석, 및 게놈 서던 분석 (예를 들어 유전자 결실 또는 증폭을 조사하기 위해), 및 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 매우 다양한 분석 중의 임의의 하나를 포함하여 이로 제한되지 않는 많은 방법에 의해 분석할 수 있고, 상기 방법 중 많은 방법은 당업계에 공지되고 당업자에게 이해되고 있다. 유전자 및 유전자 산물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)]에서 볼 수 있다.
샘플에서 특정 바이오마커, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제 3 (FUT3), 푸코실트랜스퍼라제 6 (FUT6), 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 검출에 관련된 하기 프로토콜을 예시를 위해 제시한다.
본 발명의 한 방법은 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 단백질의 존재를 조사 또는 시험하는 프로토콜을 포함한다. 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X-관련 단백질을 검출하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 면역조직화학적 분석, 면역침전, 웨스턴 블롯 분석, 분자 결합 분석, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 (PACS) 등을 포함한다. 예를 들어, 조직 또는 샘플에서 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X-관련 단백질의 발현을 검출하는 한 방법은 샘플을 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항체, 그의 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X-반응성 단편, 또는 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 재조합 단백질과 접촉시킨 후, 샘플에서 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X-관련 단백질의 결합을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 샘플에서 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 단백질의 발현은 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 조사한다. 조직 절편의 면역조직화학적 염색은 샘플에서 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 수 있는 방법으로 판명되었다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 프로브에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 가시화시킨다.
샘플 제조를 위해, 포유동물 (일반적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예는 암 세포, 예를 들어 결장, 유방, 전립선, 난소, 폐, 위, 췌장, 림프종 및 백혈병 암 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하여 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 과정에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시태양에서, 샘플은 고정되어 파라핀 등에 매립된다.
조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 고정 (즉 보존)될 수 있다 (예를 들어, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C 참조). 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정액을 선택할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 또한 고정 길이가 조직 샘플의 크기 및 사용되는 고정액에 따라 결정됨을 이해할 것이다. 예로서, 중성 버퍼 처리된 포르말린, 보이인 (Bouin) 또는 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시킬 수 있다.
일반적으로, 샘플은 먼저 고정된 후, 상승하는 일련의 알콜을 통해 탈수되고, 조직 샘플을 절편화시킬 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질로 침윤 및 매립된다. 별법으로, 조직을 절편화하여 얻은 절편을 고정시킬 수 있다. 예로서, 조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 파라핀에 매립되어 처리될 수 있다 (예를 들어, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌 참조). 사용될 수 있는 파라핀의 예는 파라플라스트, 브롤로이드 및 티슈메이를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 조직 샘플을 매립시킨 후, 샘플은 미세절단기 등에 의해 절편화될 수 있다 (예를 들어, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌 참조). 상기 과정의 예로서, 절편의 두께는 약 3 미크론 내지 약 5 미크론일 수 있다. 절편화된 후, 절편은 복수의 표준 방법에 의해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예로서, 파라핀 매립된 절편은 양대전 슬라이드 및/또는 폴리-L-리신으로 코팅된 슬라이드에 부착될 수 있다.
파라핀이 매립 물질로서 사용된 경우, 조직 절편은 일반적으로 탈파라핀화되고 물에 재수화된다. 조직 절편은 통상적인 여러 표준 방법에 의해 탈파라핀화될 수 있다. 예를 들어, 자일렌 및 점진적으로 하강하는 일련의 알콜을 사용할 수 있다 (예를 들어, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌 참조). 별법으로, 시판되는 탈파라핀화 비유기제, 예를 들어 Hemo-De7 (CMS, 미국 텍사스주 휴스톤)를 사용할 수 있다.
임의로, 샘플 제조 후에, 조직 절편을 IHC를 사용하여 분석할 수 있다. IHC는 추가의 기술, 예를 들어 형태학적 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 조합하여 수행할 수 있다. 2가지의 일반적인 IHC 방법, 즉 직접 및 간접 분석을 이용할 수 있다. 첫번째 분석에 따르면, 항체의 표적 항원 (예를 들어, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X)에 대한 결합은 직접 측정된다. 이 직접 분석은 추가의 항체 상호작용 없이도 가시화될 수 있는 표지된 시약, 예를 들어 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 이용한다. 전형적인 간접 분석에서, 비컨쥬게이팅된 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지된 2차 항체가 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 컨쥬게이팅될 경우, 항원의 가시화를 제공하기 위해 발색 또는 형광 기질이 첨가된다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 일반적으로 검출가능한 잔기로 표지될 것이다. 많은 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 다음 범주로 분류된다:
(a) 방사성 동위원소, 예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H 및 131I. 항체는 문헌 [예를 들어 Current Protocols in Immunology Volumes 1 and 2, Coligen et al. Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사성은 신틸레이션 계수를 사용하여 측정할 수 있다.
(b) 콜로이드성 금 입자
(c) 예를 들어 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드, 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민 (Lissamine), 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌 또는 시판되는 형광단, 예를 들어 SPECTRUM 0RANGE7 및 SPECTRUM GREEN7 및/또는 상기 물질의 임의의 하나 이상의 유도체를 포함하고, 이로 제한되지 않는 형광 표지. 형광 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 사용하여 항체에 컨쥬게이팅될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다.
(d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 4,275,149에서는 이들 중 일부를 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이는 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서 색 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광광도계로 측정할 수 있다. 별법으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하기 위한 기술은 상기하였다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전기적으로 여기된 다음, 측정할 수 있는 (예를 들어, 화학발광분석기를 사용하여) 광을 방출하거나 형광 수여체에 에너지를 공여한다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예, 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제; 미국 특허 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예를 들어 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 컨쥬게이팅시키는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Method in Enzym. (ed J. Langone ＆ H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는 예를 들어
(i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3', 5,5'-테트라메틸 벤지딘 염산염 (TMB))를 산화시킴);
(ii) 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼리성 포스파타제 (AP); 및
(iii) 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-베타-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 (예를 들어 4-메틸움벨리페릴-베타-D-갈락토시다제)과 베타-D-갈락토시다제 (베타-D-Gal)
를 포함한다.
많은 다른 효소-기질 조합물이 당업계의 숙련인에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 리뷰를 위해, 미국 특허 4,275,149 및 4,318,980를 참조한다. 때때로, 표지는 항체에 간접적으로 컨쥬게이팅된다. 당업자는 이를 달성하는 다양한 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 컨쥬게이팅될 수 있고, 상기 표지의 4개의 넓은 범위 중의 어떠한 표지도 아비딘과, 또는 그 반대 형태로 컨쥬게이팅될 수 있다. 비오틴은 아미딘에 선택적으로 결합하고, 따라서, 표지는 상기 간접적인 방식으로 항체에 컨쥬게이팅될 수 있다. 별법으로, 표지와 항체의 간접적인 컨쥬게이팅을 달성하기 위해서, 항체는 작은 합텐과 컨쥬게이팅되고, 상기한 상이한 표지 종류 중의 하나가 항-합텐 항체와 컨쥬게이팅된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 컨쥬게이팅을 달성할 수 있다.
상기한 샘플 제조 과정 이외에, IHC 전, 동안 또는 후에 조직 절편의 추가의 처리가 필요할 수 있다. 예를 들어, 에피토프 복구 방법, 예를 들어 시트레이트 버퍼 중의 조직 샘플의 가열을 수행할 수 있다 (예를 들어, Leong et al., Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996) 참조).
임의의 차단 단계 후에, 조직 절편은 1차 항체가 조직 샘플 중의 표적 단백질 항원에 결합하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 1차 항체에 노출된다. 이를 달성하기에 적합한 조건은 통상적인 실험에 의해 결정할 수 있다. 항체가 샘플에 결합하는 정도는 상기 논의한 검출가능한 표지 중의 하나를 사용하여 결정한다. 바람직하게는, 표지는 발색 기질, 예를 들어 3,3'-디아미노벤지딘 발색원의 화학적 변형을 촉매하는 효소 표지 (예를 들어 HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 컨쥬게이팅된다 (예를 들어 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체이다).
임의로, 시알릴 루이스 A 또는 항-시알릴 루이스 X의 발현을 검출하는 IHC 분석에 사용되는 항체는 각각 항-시알릴 루이스 A 및 항-시알릴 루이스 X 항체이다. 임의로, 항-시알릴 루이스 A 및 항-시알릴 루이스 X 항체는 모노클로날 항체이다. 항-시알릴 루이스 A 및 항-시알릴 루이스 X 항체는 상이한 공급처로부터 입수하는 것을 포함하여 당업계에서 용이하게 이용가능하다.
이와 같이 제조한 표본을 배치하여 커버를 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 당업계에서 통상 사용되는 염색 강도 기준을 사용할 수 있고, 여기서 항원이 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 단백질일 경우, 염색 강도 기준은 다음과 같이 평가될 수 있다.
염색 패턴 스코어
어떠한 염색도 세포에서 관찰되지 않음 0
희미한/거의 감지할 수 없는 염색이 10％ 초과의 세포에서 검출됨 1+
약한 수준 내지 중등도의 염색이 10％ 초과의 세포에서 관찰됨 2+
중등도 내지 강한 염색이 10％ 초과의 세포에서 관찰됨 3+
일반적으로, 상기 IHC 분석에서 약 2+ 이상의 염색 패턴 스코어는 포유동물 세포 (예를 들어 포유동물의 암 세포)의 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 작용제 항체에 대한 감수성을 예측하거나 나타내는 것으로 생각된다.
다른 방법에서, 샘플은 항체-바이오마커 복합체 형성에 충분한 조건 하에서 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉한 후, 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 많은 방법, 예를 들어 혈장 및 혈청을 포함하여 매우 다양한 조직 및 샘플을 분석하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 방법으로 검출할 수 있다. 상기 분석 포맷을 이용하는 매우 다양한 면역분석 기술을 이용할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653 참조). 상기 방법은 전통적인 경쟁 결합 분석뿐만 아니라 비경쟁적 형태의 단일 부위 및 이중 부위 또는 "샌드위치" 분석을 포함한다. 또한, 상기 분석은 표지된 항체의 표적 바이오마커에 대한 직접 결합을 포함한다.
샌드위치 분석이 가장 유용하고 통상적으로 사용되는 분석이다. 샌드위치 분석 기술의 많은 변형이 존재하고, 이들 모두가 본 발명에 포함된다. 간단히 설명하면, 전형적인 전방 (forward) 분석에서, 비표지된 항체는 고체 기재에 고정되고, 시험되는 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 적절한 시간 동안 인큐베이션한 후에, 항체-항원 복합체 형성에 충분한 시간 동안 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지된, 항원에 특이적인 제2 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 다른 복합체 형성에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 임의의 미반응 물질을 세척하여 제거하고, 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 검출하여 항원의 존재를 결정한다. 그 결과는 가시적인 신호의 간단한 관찰에 의해 정성적일 수 있거나, 또는 기지량의 바이오마커를 포함하는 대조 샘플과 비교함으로써 정량화될 수 있다.
전방 분석의 변형은 샘플과 표지된 항체가 모두 결합된 항체에 동시에 첨가되는 동시 분석을 포함한다. 이 기술은 쉽게 알 수 있는 임의의 작은 변형을 포함하여 당업자에게 공지되어 있다. 전형적인 전방 샌드위치 분석에서, 바이오마커에 대한 특이성을 갖는 제1 항체는 고체 표면에 공유 결합되거나 수동적으로 결합된다. 고체 표면은 일반적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 통상적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 미세플레이트의 관, 비드, 디스크 형태 또는 면역분석 수행에 적합한 또는 임의의 다른 표면일 수 있다. 결합 방법은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 가교 결합, 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척된다. 시험되는 샘플의 분취액을 이어서 고체상 복합체에 첨가하고, 항체에 존재하는 임의의 서브유닛의 결합에 적합한 조건 (예를 들어 실온 내지 40℃, 예를 들어 25℃ 내지 32℃) 하에 충분한 시간 (예를 들어 2-40분 또는 보다 편리할 경우 철야) 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 시간 후에, 항체 서브유닛 고체상을 세척하고, 건조시켜 바이오마커의 일부에 특이적인 제2 항체와 함께 인큐베이션한다. 제2 항체는 제2 항체의 분자 마커에 대한 결합을 나타내기 위해 사용되는 리포터 분자에 연결된다.
다른 방법은 샘플 내의 표적 바이오마커를 고정시킨 후, 고정된 표적을 리포터 분자로 표지되거나 표지되지 않을 수 있는 특이적 항체에 노출시키는 것을 수반한다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 항체를 사용한 직접 표지에 의해 결합된 표적을 검출할 수 있다. 별법으로, 제1 항체에 특이적인 제2의 표지된 항체를 표적-제1 항체 복합체에 노출시켜 표적-제1 항체-제2 항체의 3원 복합체를 형성시킨다. 복합체는 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 검출된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "리포터 분자"는 항원-결합된 항체의 검출을 허용하는, 그의 화학적 특성에 의해 분석을 통해 확인가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다. 상기 형태의 분석에서 가장 통상적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사성 핵종 함유 분자 (즉 방사성 동위원소) 및 화학발광 분자이다.
효소 면역분석의 경우, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 페리오데이트에 의해 제2 항체에 컨쥬게이팅된다. 그러나, 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 당업자가 쉽게 이용할 수 있는 매우 다양한 상이한 컨쥬게이션 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 갈락토시다제 및 알칼린 포스파타제를 포함한다. 특정 효소와 함께 사용되는 기질은 일반적으로 대응하는 효소의 가수분해 시에 검출가능한 색상 변화의 생성을 위해 선택된다. 적합한 효소의 예는 알칼린 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 또한, 상기한 발색 기질보다는 형광 생성물을 생성시키는 형광 기질을 사용할 수도 잇다. 모든 경우에, 효소 표지된 항체가 제1 항체-분자 마커 복합체에 첨가되어 결합한 후, 과량의 시약을 세척 제거한다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질은 제2 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 신호를 생성시킬 것이고, 이 신호는 샘플에 존재한 바이오마커의 양의 지표를 제시하기 위해 대체로 분광광도법으로 추가로 정량화될 수 있다. 별법으로, 형광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민이 항체의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장의 광을 사용한 조사에 의해 활성화될 때, 형광색소 (fluorochrome)-표지 항체는 광 에너지를 흡수하여 분자를 여기가능 상태로 유도한 후, 광학현미경으로 가시적으로 검출가능한 특징적인 색상에서 광을 방출한다. EIA에서처럼, 형광 표지된 항체는 제1 항체-분자 마커 복합체에 결합하게 된다. 미결합 시약을 세척 제거하고 잔류하는 3원 복합체를 적절한 파장의 광에 노출시킨 후, 관찰된 형광은 목적하는 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술은 모두 당업계에 잘 확립되어 있다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예를 들어 방사성 동위원소, 화학발광 또는 생체발광 분자도 사용할 수 있다.
상기 기술은 또한 FUT3 또는 FUT6 폴리펩티드의 발현 검출에 사용될 수 있음이 고려된다.
본 발명의 방법은 추가로 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA, 예를 들어 FUT3 및/또는 FUT6 mRNA의 존재 및/또는 발현을 조사하는 프로토콜을 포함한다. 세포 내의 mRNA의 평가 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 상보성 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 분석 (예를 들어 표지된 FUT3 및/또는 FUT6 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 분석 (예를 들어 FUT3 및/또는 FUT6에 특이적인 상보성 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 및 다른 증폭 형태의 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.
포유동물의 조직 또는 세포 샘플은 노던, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 사용하여 예를 들어 FUT3 및/또는 FUT6 mRNA에 대해 편리하게 분석할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 분석, 예를 들어 정량적 PCR 분석은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시태양에서, 생물학적 샘플에서 FUT3 및/또는 FUT6 mRNA를 검출하는 방법은 적어도 하나의 프라이머를 사용한 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생성시키고, FUT3 및/또는 FUT6 cDNA를 증폭시키기 위해 센스 및 안티센스 프라이머로서 FUT3 및/또는 FUT6 폴리뉴클레오티드를 사용하여 상기 생성된 cDNA를 증폭시키고, 증폭된 FUT3 및/또는 FUT6 cDNA의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 FUT3 및/또는 FUT6 mRNA의 수준을 결정할 수 있도록 하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다 (예를 들어 mRNA의 수준을 "하우스키핑 (housekeeping)" 유전자, 예를 들어 액틴 패밀리 멤버의 비교가능한 대조군 mRNA 서열과 동시에 조사함으로써). 임의로, 증폭된 FUT3 및/또는 FUT6 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 주요 실시태양은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 임의의 특정 부분의 특이적인 증폭을 허용하는 FUT3 및/또는 FUT6 프라이머 및 프라이머쌍 및 본 발명의 핵산 분자 또는 그의 임의의 부분에 선택적으로 또는 특이적으로 혼성화하는 프로브를 포함한다. 프로브는 검출가능한 마커, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기 프로브 및 프라이머는 샘플 내의 FUT3 및/또는 FUT6 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 및 FUT3 및/또는 FUT6 단백질을 발현하는 세포를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 매우 많은 상이한 프라이머 및 프로브를 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 제조하고, 클론의 증폭 및/또는 FUT3 및/또는 FUT6 mRNA의 존재 및/또는 수준의 결정을 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 한 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA, 예를 들어 FUT3 및 FUT6 또는 다른 푸코실트랜스퍼라제 mRNA를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 사용하여, 시험 및 대조 조직 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 생성시킨다. 이어서, 프로브는 고체 지지체 상에 고정된 핵산 어레이에 혼성화된다. 어레이는 어레이의 각각의 멤버의 서열 및 위치를 알 수 있도록 준비한다. 예를 들어, 특정 질병 상태에서 발현되는 능력을 갖는 유전자가 고체 지지체 상에 배열된다. 표지된 프로브와 특정 어레이 멤버의 혼성화는 프로브가 그로부터 유도되는 샘플이 유전자를 발현함을 나타낸다. 질병 조직의 차등 유전자 발현 분석은 유용한 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술은 단일 실험 내에서 수천개의 유전자의 mRNA 발현 프로필을 평가하기 위해서 핵산 혼성화 기술 및 컴퓨터 기술을 이용한다 (예를 들어, 2001년 10월 11일 공개된 WO 01/75166 참조; 어레이 제조에 대해서는 예를 들어 미국 특허 5,700,637, 미국 특허 5,445,934 및 미국 특허 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999) 참조). DNA 마이크로어레이는 유리 또는 다른 기재 상에서 직접 합성되거나 상기 기재 상에 스포팅된 유전자 단편을 포함하는 미세 어레이이다. 수천개의 유전자가 일반적으로 단일 어레이에 제시된다. 전형적인 마이크로어레이 실험은 1. 샘플로부터 단리된 RNA로부터 형광 표지된 표적의 제조, 2. 표지된 표적의 마이크로어레이에 대한 혼성화, 3. 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝, 4. 스캐닝된 영상의 분석 및 5. 유전자 발현 프로필의 생성을 포함한다. 현재 2가지 주요 유형의 DNA 마이크로어레이가 사용되고 있다: 올리고뉴클레오티드 (보통 25 내지 70 mer) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 어레이를 형성하는데 있어서, 올리고뉴클레오티드는 예비제작되고 표면에 스포팅되거나 표면 상에서 직접 합성될 수 있다 (계내).
애피메트릭스 (Affymetrix) GeneChip(등록상표) 시스템은 유리 표면 상에 올리고뉴클레오티드의 직접 합성에 의해 제작된 어레이를 포함하는 시판되는 마이크로어레이 시스템이다. 프로브/유전자 어레이: 올리고뉴클레오티드 (보통 25 mer)는 반도체-기반 사진평판술과 고체상 화학 합성 기술의 조합에 의해 유리 웨이퍼 상에서 직접 합성된다. 각각의 어레이는 400,000개 이하의 상이한 올리고머를 함유하고, 각각의 올리고머는 수백만개의 카피로 존재한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 어레이 상의 공지된 위치에서 합성되므로, 혼성화 패턴 및 신호 강도는 애피메트릭스 마이크로어레이 스위트 (Microarray Suite) 소프트웨어에 의해 유전자 정체 및 상대적 발현 수준의 면에서 해석될 수 있다. 각각의 유전자는 일련의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 어레이 상에 제시된다. 각각의 프로브쌍은 완전한 매치 올리고뉴클레오티드 및 미스매치 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 완전한 매치 프로브는 특정 유전자에 완전히 상보성인 서열을 갖고 따라서 유전자의 발현을 측정한다. 미스매치 프로브는 중앙 염기 위치에서 하나의 염기 치환에 의해 완전한 매치 프로브와 상이하고, 표적 유전자 전사체의 결합을 방해한다. 이것은 완전한 매치 올리고머에 대해 측정된 신호에 기여하는 배경 및 비특이적 혼성화를 결정하는 것을 돕는다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 각각의 프로브 세포에 대한 절대적 또는 특이적 강도값을 결정하기 위해 완전한 매치 프로브의 혼성화 강도로부터 미스매치 프로브의 혼성화 강도를 공제한다. 프로브는 Genbank 및 다른 뉴클레오티드 기탁 기관으로부터의 정보를 기초로 하여 선택된다. 그 서열은 유전자의 3' 말단의 특유한 영역을 인식하는 것으로 생각된다. GeneChip 혼성화 오븐 ("회전식" 오븐)은 한번에 64개 이하의 어레이의 혼성화를 수행하기 위해 사용된다. 플루이딕스 (fluidics) 스테이션은 프로브 어레이의 세척 및 염색을 수행한다. 이는 완전 자동화되고 4개의 모듈을 포함하고, 각각의 모듈은 하나의 프로브 어레이를 갖는다. 각각의 모듈은 예비프로그래밍된 플루이딕스 프로토콜을 사용하여 마이크로어레이 스위트 소프트웨어를 통해 독립적으로 제어된다. 스캐너는 프로브 어레이에 결합된 표지된 cRNA에 의해 방출된 형광 강도를 측정하는 공촛점 레이저 형광 스캐너이다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어를 갖는 컴퓨터 워크스테이션이 플루이딕스 스테이션 및 스캐너를 제어한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 프로브 어레이에 대한 예비프로그래밍된 혼성화, 세척, 및 염색 프로토콜을 이용하여 8개 이하의 플루이딕스 스테이션을 제어할 수 있다. 상기 소프트웨어는 또한 적절한 알고리즘을 사용하여 혼성화 강도 데이타를 획득하고, 이를 각각의 유전자에 대한 존재/부재 콜 (call)로 전환시킨다. 마지막으로, 상기 소프트웨어는 비교 분석에 의해 실험 사이의 유전자 발현의 변화를 검출하고, 그 결과를 추가의 데이타 분석을 위해 다른 소프트웨어 프로그램에서 사용될 수 있는 .txt 파일로 포맷한다.
선택된 바이오마커의 발현은 또한 유전자 결실 또는 유전자 증폭을 조사하여 평가할 수 있다. 유전자 결실 또는 증폭은 당업계에 공지된 매우 다양한 프로토콜의 임의의 하나, 예를 들어 통상적인 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량화하는 노던 블로팅 (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), 도트 블로팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 계내 혼성화 (예를 들어, PISH), 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 세포유전학 방법 또는 비교 게놈 혼성화 (CGH)에 의해 측정할 수 있다. 예로서, 이들 방법은 FUT3 및/또는 FUT6 유전자 증폭의 결실을 검출하기 위해 사용될 수 있다 .
추가로, 조직 또는 세포 샘플에서 FUT3 및/또는 FUT6 유전자와 같은 바이오마커의 메틸화 상태를 조사할 수 있다. 유전자 5' 조절 영역에서 CpG 섬 (island)의 이상 탈메틸화 및/또는 과다메틸화는 종종 불사의 형질전환된 세포에서 발생하고, 다양한 유전자의 발현 변경을 야기할 수 있다. 유전자의 메틸화 상태를 조사하기 위한 다양한 분석이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 서던 혼성화방법에서 CpG 섬의 메틸화 상태를 평가하기 위해서 메틸화된 CpG 부위를 포함하는 서열을 절단할 수 없는 메틸화 감수성 제한효소를 이용할 수 있다. 또한, MSP (메틸화 특이적 PCR)은 제시된 유전자의 CpG 섬에 존재하는 모든 CpG 부위의 메틸화 상태를 빠르게 프로파일링할 수 있다. 이 과정은 중아황산나트륨에 의한 DNA의 초기 변형 (모든 비메틸화된 시토신을 우라실로 전환시키는), 이어서 메틸화된 대 비메틸화된 DNA에 특이적인 프라이머를 사용한 증폭을 수반한다. 메틸화 간섭을 수반하는 프로토콜도 예를 들어 문헌 [Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al., eds., 1995; De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks et al, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536; 및 Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)]에서 찾아볼 수 있다.
또한, 조직 또는 세포 샘플에서 선택된 바이오마커의 발현은 기능적 또는 활성 기반 분석에 의해 조사할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커가 효소일 경우, 조직 또는 세포 샘플의 제시된 효소 활성의 존재를 결정 또는 검출하기 위해 당업계에 공지된 분석을 수행할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 조직 또는 세포 샘플은 또한 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체에 결합하는 샘플 내의 Apo2L/TRAIL 또는 수용체의 발현에 대해 조사할 수 있음도 고려된다. 상기하고 선행 기술에서 기재된 바와 같이, Apo2L/TRAIL은 적어도 5개의 상이한 수용체, 즉 DR4, DR5, DcR1, DcR2 및 OPG에 결합하는 것으로 현재 생각된다. 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여, Apo2L/TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2 및/또는 OPG의 발현은 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 검출할 수 있다. 도 10 및 11에 나타낸 바와 같이, 데이타는 DcR1 및/또는 DcR2 수용체의 발현에 대한 조직 또는 세포 샘플을 조사하면 조직 또는 세포 샘플이 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체에 대해 감수성인지에 대한 추가의 정보를 얻을 수 있음을 제시한다. 예로서, 상기한 IHC 기술은 샘플 내의 많은 상기 분자 중의 하나의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 조직 또는 샘플이 FUT 또는 루이스 항원 마커의 존재뿐만 아니라 예를 들어 DR4, DR5 또는 DcR1의 존재에 대해서도 조사되는 방법에서, 별개의 슬라이드를 동일한 조직 또는 샘플로부터 준비하고, 각각의 슬라이드를 각각의 특이적인 바이오마커 또는 수용체에 대해 특이적인 시약으로 시험할 수 있음이 고려된다. 별법으로, 하나의 슬라이드를 조직 또는 세포 샘플로부터 준비하고, 각각의 바이오마커 또는 수용체의 가시화 및 검출을 허용하기 위해 각각의 바이오마커 또는 수용체에 대해 작용하는 항체를 다중 색상 염색 프로토콜과 함께 사용할 수 있다.
조직 또는 세포 샘플이 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체의 활성에 감수성인지를 나타내는, 조직 또는 세포 샘플이 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 지를 결정한 후에, 포유동물에서 발생하는 질환, 예를 들어 암 또는 면역 관련 질환의 치료를 위해 유효량의 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체를 포유동물에게 투여할 수 있음이 고려된다. 본원에 기재된 포유동물의 상이한 병리학적 병태는 숙련된 의사에 의해 진단될 수 있다. 예를 들어 포유동물의 암 또는 면역 관련 질병의 진단 또는 검출을 허용하는 진단 기술이 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 암은 촉진, 혈액 분석, x-선, NMR 등을 포함하여 이로 제한되지 않는 기술을 통해 확인될 수 있다. 면역 관련 질병은 또한 쉽게 확인할 수 있다.
Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체는 공지의 방법에 따라, 예를 들어 볼러스로서 정맥내 투여 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입, 근내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 윤활막내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 임의로, 투여는 다양한 시판 장치를 사용한 미니 펌프 주입을 통해 수행될 수 있다.
Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체의 투여에 효과적인 투여량 및 계획은 경험적으로 결정할 수 있고, 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 단일 또는 다중 투여량을 사용할 수 있다. 단독 사용시에 Apo2L/TRAIL의 유효 투여량 또는 유효량은 1일당 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg (체중) 또는 그 초과인 것으로 현재 생각된다. 투여량의 종간 증감은 예를 들어 문헌 [Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991)]에 개시된 바와 같이 당업계에 공지된 방식으로 수행될 수 있다.
Apo2L/TRAIL의 생체내 투여가 사용될 경우, 정상 투여량은 투여 경로에 따라 1일당 약 10 ng/kg 내지 100 mg/kg (포유동물 체중) 또는 그 초과, 바람직하게는 약 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일일 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌에 제시되어 있다 [예를 들어, 미국 특허 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212 참조]. 상이한 제제가 상이한 치료 화합물 및 상이한 질환에 대해 효과적이고, 예를 들어 한 장기 또는 조직을 표적으로 하는 투여는 다른 장기 또는 조직과 상이한 방식으로 전달될 것을 필요로 할 것으로 예상된다.
추가의 요법을 본 발명의 방법에 사용할 수 있음이 고려된다. 하나 이상의 다른 요법제는 당업계에 공지되고 특히 상기에서 추가로 정의된 방사선요법, 사이토킨(들), 성장억제제(들), 화학요법제(들), 세포독성제(들), 티로신 키나제 억제제, ras 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 혈관 형성 억제제, 및 사이클린 의존성 키나제 억제제를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 상기 다른 요법제는 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체로부터 분리된 약제로서 사용될 수 있음이 고려된다. 또한, 종양 항원을 표적으로 하는 치료 항체를 기초로 한 요법제, 예를 들어 Rituxan™ 또는 Herceptin™ 및 항-혈관신생 항체, 예를 들어 항-VEGF가 사용될 수 있다.
화학요법제의 제조 및 투여 계획은 제조자의 지시에 따라 또는 숙련된 의사에 의해 경험적으로 결정된 바에 따라 사용될 수 있다. 상기 화학요법제의 제조 및 투여 계획은 또한 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다. 화학요법제는 Apo2L/TRAIL 또는 치사 수용체 항체의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있거나, 동시에 투여될 수 있다.
또한, 다른 항원에 대해 작용하는 항체, 예를 들어 CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, 혈관 내피 인자 (VEGF), 또는 다른 TNFR 패밀리 멤버 (예를 들어 OPG, TNFR1, TNFR2, GITR, Apo-3, TACI, BCMA, BR3)에 결합하는 항체를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 또는 그에 추가하여, 본원에 개시된 동일하거나 2 이상의 상이한 항원에 결합하는 2 이상의 항체를 환자에게 동시 투여할 수 있다. 때때로, 하나 이상의 사이토킨을 환자에게 투여하는 것도 유익할 수 있다. 투여 후에, 처리된 세포를 시험관 내에서 분석할 수 있다. 생체내 처리가 존재할 경우, 처리된 포유동물은 숙련된 의사에게 공지된 다양한 방식으로 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포는 괴사를 분석하기 위해 병리학적으로 조사할 수 있거나 또는 혈청을 면역계 반응에 대해 분석할 수 있다.
상기 설명하거나 제안된 용도로 사용하기 위해, 키트 또는 제조품도 본 발명에 의해 제공된다. 상기 키트는 방법에 사용되는 별개의 부재들 중의 하나를 각각 포함하는 하나 이상의 용기 수단, 예를 들어 바이알, 튜브 등을 근접하여 수용하도록 구획화되는 운반 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 용기 수단 중의 하나는 검출가능하게 표지된 것이거나 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 상기 프로브는 각각 FUT3 및/또는 FUT6 단백질 또는 FUT3 및/또는 FUT6 유전자 또는 메신저에 대해 특이적인 항체 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 키트가 표적 핵산을 검출하기 위해 핵산 혼성화를 이용할 경우, 키트는 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 뉴클레오티드(들)를 포함하는 용기 및/또는 리포터 분자, 예를 들어 효소, 형광 또는 방사성 동위원소 표지에 결합된 리포터-수단, 예를 들어 비오틴-결합 단백질, 예를 들어 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 용기도 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 일반적으로 상업적 및 사용자 관점에서 요망되는 물질, 예를 들어 버퍼, 희석제, 필터, 주사바늘, 주사기, 및 사용을 위한 지시서를 갖는 포장 삽입물을 포함하는 상기 설명된 용기 및 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다. 조성물이 특수한 요법 또는 비-치료 용도에 사용되는 것을 나타내도록 라벨이 용기 상에 존재할 수 있고, 또한 상기 설명된 바와 같은 생체내 또는 시험관내 용도에 대한 지시를 나타낼 수 있다.
본 발명의 키트는 많은 실시태양을 포함한다. 전형적인 실시태양은 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물, 적어도 하나의 종류의 포유동물 세포 내에 FUT3 및/또는 FUT6 단백질의 존재를 평가하기 위해 FUT3 및/또는 FUT6 항체를 사용하기 위한 지시서를 포함하는 키트이고; 여기서 조성물은 FUT3 및/또는 FUT6 폴리펩티드 서열에 결합하는 1차 항체를 포함하고, 상기 용기 상의 라벨은 적어도 하나의 종류의 포유동물 세포 내에 FUT3 및/또는 FUT6 단백질의 존재를 평가하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 키트는 조직 샘플을 제조하고 항체 및 프로브를 조직 샘플의 동일 절편에 적용하기 위한 지시서와 재료의 세트를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 1차 및 2차 항체를 모두 포함할 수 있고, 여기서 2차 항체는 표지, 예를 들어 효소 표지에 컨쥬게이팅된다.
또다른 실시태양은 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물, 적어도 하나의 종류의 포유동물 세포 내에 FUT3 및/또는 FUT6 RNA 또는 DNA의 존재를 평가하기 위해 FUT3 및/또는 FUT6 폴리뉴클레오티드를 사용하기 위한 지시서를 포함하는 키트이고; 여기서 조성물은 엄격한 조건 하에 FUT3 및/또는 FUT6 폴리뉴클레오티드의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 용기 상의 라벨은 조성물이 적어도 하나의 종류의 포유동물 세포 내에 FUT3 및/또는 FUT6의 존재를 평가하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.
키트 내의 다른 선택적 성분은 하나 이상의 버퍼 (예를 들어, 차단 버퍼, 세척 버퍼, 기질 버퍼 등), 다른 시약, 예를 들어 효소 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예를 들어, 발색원), 에피토프 복구 용액, 대조 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조 슬라이드(들) 등을 포함한다.
실시예
본 발명의 각종 측면은 하기 실시예에 의해 더욱 설명되고 예시되며, 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
방법 및 재료:
세포 배양물 및 세포주.
다음 인간 결장직장 선암종 세포주: HCT-8, COLO 205, HCT 116, SW403, LoVo, SW948, Caco-2, COLO 201, SW1417, DLD-1, CX-1, HCT-15, LS 180, RKO, RKO-AS45-1, SK-CO-1, SW480, SW620, SW837, CL-40, COLO-206F, COLO 320DM, COLO 320HSR, COLO-678, HT-29, KM12, LS1034, SW1116을 ATCC Depository (미국 버지니아주 매나사스), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures), JCRB (Japanese Cell Resources Bank) 또는 ECACC (European Collection of Cell Cultures)으로부터 입수하고, 10％ 열 불활성화 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 10 mM HEPES를 보충한 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
세포독성 분석.
MTT 분석 (프로메가 (Promega)의 CellTiter 96(등록상표) 비-방사성 세포 증식 분석, 가용성 황색 테트라졸륨염 (MTT)을 청색 포르마잔 결정으로 환원시키는 생활 세포의 능력에 기초한 비색 분석)을 사용하여 Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체를 사용한 처리 후 생활 세포의 양을 결정하였다. MTT 분석은 예비혼합된 최적화 염료 용액을 다양한 농도 (0 내지 1000 ng/ml)의 Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체를 함유하는 96-웰 플레이트의 배양 웰에 첨가하여 수행하였다. 4시간 인큐베이션 동안, 살아있는 세포는 염료 용액의 테트라졸륨 성분을 포르마잔 생성물로 전환시킨다. 이어서, 가용화/중지 용액을 배양 웰에 첨가하여 포르마잔 생성물을 가용화시키고, 96-웰 플레이트 판독기 (SpectraMax)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 기록하였다. 570 nm 흡광도 판독치는 증식 분석에서 보통 사용되는 세포 수에 정비례한다. 포르마잔 생성물에 대한 최대 흡광도는 570 nm이고 순수 용액은 청색으로 보이지만, 분석 종료시 색상은 청색이 아닐 수 있고 배양 배지 내의 다른 성분 (혈청, 산성화 페놀 레드 및 비환원 MTT 포함)에 비해 존재하는 포르마잔의 양에 따른다.
세포 수는 분석의 직선 범위의 고 단부 부근의 분석 신호를 생성시키기 위해 세포 적정을 수행함으로써 최적화하였다. 상이한 세포 종류는 상이한 수준의 대사 활성을 가지므로, 이는 각각의 세포주에 대해 따로 이루어졌다. 검사된 대부분의 종양 세포에 대해, 5,000 세포/웰 내지 20,000 세포/웰을 사용하였다.
다음은 사용된 분석의 단계별 설명이다:
1. 생물학적 분석에 사용된 세포는 원액 배양물로부터 취하였다.
2. 세포 수 및 트리판 블루 생활성의 결정, 및 5,000 내지 20,000 세포/웰의 최종 수로 세포의 현탁.
3. 50 ㎕의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트로 분배하였다.
4. 플레이트를 37℃에서 가습 5％ CO2 분위기에서 밤새 인큐베이션하였다.
5. 0 내지 1000 ng/ml의 다양한 농도의 Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체를 함유하는 50 ㎕ 배양 배지를 96-웰 플레이트의 샘플에 첨가하였다. 대조군은 50 ㎕의 배양 배지 (Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체 없음) 및 100 ㎕ 배양 배지 (세포 없음)이었다. 매 실험은 웰의 3중 세트로 3개의 독립적인 날에 수행하였다. 웰의 총 부피는 100 ㎕/웰이었다.
6. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 가습 5％ CO2 분위기에서 인큐베이션하였다.
7. 15 ㎕의 염료 용액을 각 웰에 첨가하였다.
8. 플레이트를 37℃에서 4시간 이내 동안 가습 5％ CO2 분위기에서 인큐베이션하였다.
9. 100 ㎕의 가용화/중지 용액을 각 웰에 첨가하였다.
10. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
11. 96-웰 플레이트 판독기를 사용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 기록하였다. 세포 파편, 지문 및 다른 비특이적 흡광도에 의한 배경을 감소시키기 위해 750 nm의 참조 파장을 사용하였다.
12. 음성 대조군에 대한 흡광도 값의 평균을 블랭크값으로 사용하고 다른 모든 판독치로부터 공제하였다. 각 농도의 Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체에 대한 흡광도 값의 평균을 양성 대조군의 흡광도 값의 평균 (100％ 생활 세포 - 비처리)으로 나누어 생활 세포의 양 (％ 단위)을 계산하였다.
13. 생활 세포 ％ (Y축) 대 Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체의 농도 (X축, 로그 규모)를 플로팅하였고, IC50값은 50％ 생활 세포에 대응하는 X축 값 (ng/ml)을 정함으로써 결정하였다.
애피메트릭스 라벨링 프로토콜
OD260/280 판독치를 모든 샘플에 대해 취하고, 샘플을 BioAnalyzer 상에서 실행하였다. 5 ㎍의 고품질의 총 RNA를 사용하였다.
A. 제1 스트랜드 cDNA 합성:
1. 프라이머 혼성화
DEPC-H2O x ㎕ 볼텍싱에 의한 혼합. 신속한 스핀.
RNA (5 ㎍) y ㎕ 70℃에서 10분 동안 인큐베이션.
스파이크 (Spike) (5 ㎍에 대해 원액의 1:4 희석) 1 ㎕ 신속한 스핀 및 얼음 상에 놓음
T7-(dT)24 프라이머 1 ㎕
부피 12 ㎕
2. 온도 조정
5X-제1 스트랜드 cDNA 버퍼 4 ㎕
혼합물 7 ㎕ (좌측으로)를 각 샘플에 첨가함.
0.1 M DTT 2 ㎕ 볼텍싱에 의한 혼합. 신속한 스핀.
10 mM dNTP 혼합물 1 ㎕ 42℃에서 2분간 인큐베이션함.
부피 7 ㎕
3. 제1 스트랜드 합성
1 ㎕ SSII RT를 각 샘플에 첨가함.
SSII RT 1 ㎕ 상하 피펫팅하거나 가볍게 볼텍싱하여 혼합함.
신속한 스핀.
총 부피 20 ㎕ 42℃에서 1시간 동안 인큐베이션함.
B. 제2 스트랜드 cDNA 합성
1. 제1 스트랜드 반응물을 얼음 상에 놓는다. 잠깐동안 원심분리하여 응축물을 튜브의 측면에 떨어뜨린다.
2. 다음 제2 스트랜드 마스터 (master) 혼합물을 제조한다.
DEPC-처리된 H2O 91 ㎕
5X-제2 스트랜드 반응 버퍼 30 ㎕
10 mM dNTP 혼합물 3 ㎕
10 U/㎕ DNA 리가제 1 ㎕
10 U/㎕ DNA 폴리머라제 I 4 ㎕
2 U/㎕ RNase H 1 ㎕
총 부피 130 ㎕
3. 130 ㎕ 제2 스트랜드 마스터 혼합물을 20 ㎕ 제1 스트랜드 cDNA에 첨가한다. (최종 부피 = 150 ㎕)
4. 상하 피펫팅하거나 가볍게 볼텍싱하여 혼합함. 신속한 스핀.
5. 16℃에서 2시간 동안 냉각 수조 내에서 인큐베이션함.
6. 2 ㎕ [10 U] T4 DNA 폴리머라제를 첨가함. 상하 피펫팅하거나 가볍게 볼텍싱하여 혼합함. 신속한 스핀.
7. 5분 동안 16℃에서 인큐베이션함.
8. 10 ㎕ 0.5 M EDTA를 첨가함. 가볍게 볼텍싱함. 신속한 스핀.
9. cDNA에 대한 세정 절차를 진행하거나 나중에 사용하기 위해 -2O℃에서 보관함.
이중쇄 cDNA의 세정 (GeneChip 샘플 세정 모듈)
1. 600 ㎕ cDNA 결합 버퍼를 162 ㎕ 최종 이중쇄 cDNA 합성 제제에 첨가한다.
볼텍싱에 의해 3초간 혼합한다.
2. 혼합물의 색상이 황색인지 검토한다 (cDNA 합성 반응물이 없는 cDNA 결합 버퍼에 유사함).
혼합물의 색상이 주황색 또는 보라색이면, 10 ㎕의 3 M 아세트산나트륨, pH5.0을 첨가하고 혼합한다.
혼합물의 색상은 황색으로 변할 것이다.
3. 500 ㎕의 샘플을 2 ml 수집관 내에 놓인 cDNA 세정 스핀 칼럼에 적용하고, 1분 동안 ≥8,000 x g (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다. 유동물을 유해 폐기물로서 폐기한다.
4. 스핀 칼럼을 나머지 혼합물 (262 ㎕)로 재부가하고 상기한 바와 같이 원심분리한다.
유동물을 유해 폐기물로서 폐기하고 수집관을 폐기한다.
5. 스핀 칼럼을 새로운 2 ml 수집관 (제공됨)에 옮긴다. 750 ㎕ cDNA 세척 버퍼를 스핀 칼럼 상으로 피펫팅한다. 1분 동안 ≥8,000 x g (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다.
유동물을 폐기한다.
6. 스핀 칼럼의 두껑을 열고 5분 동안 최대 속도 (≤ 25,000 x g)에서 원심분리한다. 칼럼을 매번 2번째 버킷 (bucket)을 사용하여 원심분리기에 넣는다. 두껑을 회전에 대해 반대 방향으로 배향되도록 연결 버킷 상에 배치하고, 즉, 회전이 시계방향으로 회전하면, 두껑을 반시계방향으로 배향시킨다. 이는 두껑이 손상되는 것을 방지한다.
유동물 및 수집관을 폐기한다.
7. 스핀 칼럼을 1.5 ml 수집관로 옮긴다. 10 ㎕의 cDNA 용출 버퍼를 스핀 칼럼 멤브레인 상으로 직접 피펫팅한다. cDNA 용출 버퍼가 멤브레인 상으로 직접 분배되도록 한다.
1분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 1분 동안 최대 속도 (≤ 25,000 x g)에서 원심분리하여 용출시킨다.
IVT 반응의 세팅 및 실행
Enzo: Bioarray HighYield RNA 전사체 라벨링 키트 (Part No. 900182)
1. 10 ㎕의 세정된 이중쇄 cDNA를 사용한다
2. 다음 IVT 마스터 혼합물을 제조한다:
증류 또는 탈이온화 H2O 12 ㎕
1OX HY 반응 버퍼 4 ㎕
10x 비오틴 표지된 리보뉴클레오티드 4 ㎕
1OX DTT 4 ㎕
1OX RNase 억제제 혼합물 4 ㎕
2OX T7 RNA 폴리머라제 2 ㎕
총 부피: 30 ㎕
3. 30 ㎕의 IVT 마스터 혼합물을 10 ㎕ 이중쇄 cDNA에 첨가한다. (총 부피 = 40 ㎕)
4. 상하 피펫팅하거나 가볍게 볼텍싱하여 혼합한다. 신속한 스핀.
5. 즉시 튜브를 37℃ 수조에 넣는다. 5시간 동안 인큐베이션한다.
6. RNA를 즉시 정제하지 않으면 -20℃에서 보관한다.
비오틴-표지된 cRNA의 세정 (GeneChip 샘플 세정 모듈)
1. 60 ㎕ H2O를 IVT 반응물에 첨가하고 3초간 볼텍싱하여 혼합한다.
2. 350 ㎕ IVT cRNA 결합 버퍼를 샘플에 첨가하고, 3초간 볼텍싱하여 혼합한다.
3. 250 ㎕ 에탄올 (96-100％)을 용해물에 첨가하고, 피펫팅하여 잘 혼합한다. 원심분리하지 않는다.
4. 샘플 (700 ㎕)을 2 ml 수집관 내에 놓인 IVT cRNA 세정 스핀 칼럼에 적용한다.
15초간 ≥8,000xg (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다.
5. 용출물을 칼럼을 통해 1회 더 통과시킨다.
15초간 ≥8,000xg (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다.
유동물을 유해 폐기물로서 폐기하고 수집관을 폐기한다.
6. 스핀 칼럼을 새로운 2-ml 수집관 (공급된)에 옮긴다.
7. 500 ㎕ IVT cRNA 세척 버퍼를 첨가하고 15초간 ≥8,000xg (≥10,000 rpm)에서 원심분리하여 세척한다.
유동물을 폐기한다.
8. 500 ㎕ 80％ (v/v) 에탄올을 스핀 칼럼 상으로 피펫팅하고, 15초간 ≥8,000xg (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다. 유동물을 폐기한다.
9. 스핀 칼럼의 두껑을 열고 5분 동안 최대 속도 (≤ 25,000 x g)에서 원심분리한다.
유동물 및 수집관을 폐기한다.
10. 스핀 칼럼을 새로운 1.5 ml 수집관에 옮긴다.
11. 11 ㎕의 RNase가 없는 물을 스핀 칼럼 멤브레인 상으로 직접 피펫팅한다. 1분 동안 정치시킨다.
1분 동안 최대 속도 (≤25,000 x g)에서 원심분리하여 용출시킨다.
12. 10 ㎕의 RNase가 없는 물을 스핀 칼럼 멤브레인 상으로 직접 피펫팅한다. 1분 동안 정치시킨다.
1분 동안 최대 속도 (≤25,000 x g)에서 원심분리하여 용출시킨다.
cRNA (IVT 생성물)의 정량
분광광도 분석을 사용하여 RNA 수율을 결정한다. 260 nm에서 1 OD는 40 ㎍/ml RNA와 동일하다는 전환율을 적용한다.
260 nm 및 280 nm에서 OD를 검토하여 샘플 농도 및 순도를 결정한다.
순수 RNA에 대해 A260/A280비를 2.0에 가깝게 유지한다 (1.9 내지 2.1의 비가 허용된다).
총 RNA를 출발 물질로서 사용할 때 cRNA의 정량을 위해, 비표지된 총 RNA의 이월량 (carryover)을 반영하도록 조정된 cRNA 수율을 계산해야 한다. 100％ 이월량의 추정치를 사용하여, 하기 식을 이용하여 조정된 cRNA 수율을 결정한다:
조정된 cRNA 수율 = RNAm - (총 RNAi) (y)
RNAm = IVT 후 측정된 cRNA의 양 (㎍)
총 RNAi = 총 RNA의 출발량 (㎍)
y = IVT에서 사용된 cDNA 반응물의 분획
표적 제제를 위한 cRNA의 단편화
단편화를 위해, 조정된 cRNA 농도를 사용한다.
1. 매 8 ㎕의 RNA + H2O에 대해 2 ㎕의 5x 단편화 버퍼를 첨가한다.
20 ㎍ cRNA 1 내지 32 ㎕
5X 단편화 버퍼 8 ㎕
40 ㎕가 되도록 하는 RNase가 없는 물
총 부피: 40 ㎕
2. 94℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 즉시, 얼음 상에 놓은 후 인큐베이션한다.
혼성화 표적 제조:
1. 2OX 진핵 혼성화 컨트롤 (Eukaryotic Hybridization Controls) 및 Oligo B2를 5분 동안 65℃에서 가열한다.
애피메트릭스 GeneChip 진핵 혼성화 컨트롤 키트, Part #900362 (150 rxns에 대해)
2. 가볍게 볼텍싱하고, 스피닝함.
3. 마스터 혼합물 (단편화된 cRNA 농도를 0.5 ㎍/㎕으로 가정함):
표준 어레이 (㎕) 최종 농도.
단편화 cRNA 15 ㎍ 30 0.05 ㎍/㎕
올리고 B2 (3 nM) 5 50 pM
2Ox 대조 스파이크 15 1.5, 5, 25, 100 pM
(Bio B, C, D, Cre)
청어 (Herring) 정자 DNA 3 0.1 mg/ml
아세틸화 BSA 3 0.5 mg/ml
Hu cot-1 DNA (1 mg/ml) 30 0.1 mg/ml
2X MES Hyb 버퍼 150 1X
H2O 64
최종 부피 300
4. 270 ㎕ 마스터 혼합물을 튜브에 분액하고 30 ㎕의 단편화된 cRNA를 각각 첨가한다. 이것이 혼성화 혼합물이다.
5. 프로브 어레이를 사용 직전에 실온으로 평형화시킨다.
6. 프로브 어레이를 1x MES Hyb 버퍼로 채우고, 회전식 오븐에서 10분 동안 45℃, 60 rpm에서 인큐베이션한다.
7. 혼성화 혼합물을 99℃ 수조에서 5분 동안 가열한다.
8. 혼성화 혼합물을 45℃ 수조에 5분 동안 옮긴다.
9. 혼성화 혼합물을 5분 동안 최대 속도에서 원심분리한다.
10. 1x MES Hyb 버퍼를 프로브 어레이로부터 제거한다.
11. 프로브 어레이를 상부 200 ㎕의 혼성화 혼합물로 채운다.
12. 격벽을 터프-스폿스 (Tough-Spots)으로 밀봉한다.
13. 프로브 어레이를 45℃, 60 RPM에서 19시간 동안 혼성화한다.
14. 프로브 어레이를 애피메트릭스 프로토콜에 따라 세척하고, 염색하고 스캐닝한다.
애피메트릭스 물질
품목 판매사 카탈로그 #
T7-(dT)24 프라이머 바이오리서치 테크놀로지스 (Biosearch Technologies) 주문품
대조 스파이크 사내제품 (in-house) -
Superscript II/5X 제1 스트랜드 버퍼/0.1 M DTT 인비트로겐 (Invitrogen) 18064-014
5X 제2 스트랜드 버퍼 인비트로겐 10812-014
10 mM dNTP 인비트로겐 18427-088
10 U/㎕ 이. 콜리 (E. coli) DNA 리가제 인비트로겐 18052-019
10 U/㎕ 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I 인비트로겐 18010-025
2 U/㎕ RNase H 인비트로겐 18021-071
10 U/㎕ T4 DNA 폴리머라제 인비트로겐 18005-025
0:5 M EDTA 시그마 (Sigma) E-7889
ENZO 고수율 RNA 전사체 라벨링 키트 애피메트릭스 또는 ENZO 900182 (ENZO)
GeneChip 샘플 세정 모듈 애피메트릭스 900371
아세틸화 소 혈청 알부민 인비트로겐 15561-020
염소 IgG - 시약 등급 시그마 I-5256
항-스트렙타비딘 항체 (염소), 비오티닐화 벡터 랩스 (Vector Labs) BA-0500
R-피코에리트린 스트렙타비딘 몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes) S-866
20X SSPE 바이오휘태커 (BioWhittaker) 51214
진핵 컨트롤 키트 애피메트릭스 900362
물, 분자생물학 등급 앰비온 (Ambion) 9934
인간 Cot-1 DNA 로슈 (Roche) 1-581-074
5 M NaCl RNase 부재, DNase 부재 앰비온 9760
Antifoam 0-30 시그마 A-8082
10％ Tween-20 피어스 케미칼 (Pierce Chemical) 28320
MES 유리산 일수화물 시그마 M5287
MES 나트륨염 시그마 M3885
EDTA 이나트륨염, 0.5 M 용액 시그마 E7889
터프 스폿스, 라벨 도츠 (Label Dots) 유에스에이 사이언티픽 (USA Scientific) 9902
GeneChip 혼성화 오븐 640 애피메트릭스 800139
워크스테이션 애피메트릭스 00-0074가 설치된 GeneChip 스캐너 3000
유체학 스테이션 애피메트릭스 00-0081
외부 바코드 리더 (Barcode Reader) 애피메트릭스 00-0129가 설치된 오토로더 (Autoloader)
정량적 PCR
cDNA 합성:
성분 부피 (㎕)
10X RT 버퍼 10
25X dNTP 혼합물 4
10X 랜덤 프라이머 10
MultiScribe RT (50 U/㎕) 5
RNase 부재 H2O 21
RNA (100 ng) 50
최종 부피 100
인큐베이션 조건:
10분 동안 25°
2시간 동안 37°
ABI Prism 7700 서열결정 검출기를 사용하는 TaqMan 반응:
성분 부피 (㎕)
TaqMan Universal PCR 마스터 혼합물 (2X) 25
TaqMan 프로브 (20X) (Assays-on-Demand™) 2.5
cDNA (100 ng) 2
H2O 20.5
최종 부피 50
열 사이클링 조건:
10분 동안 95°
40 사이클: 15초간 95°
1분 동안 60°
· TaqMan 프로브: Assays-on-Demand™ (TaqMan(등록상표) MGB 프로브, FAM™ 염료-표지된)
· 각각의 반응에 첨가된 샘플 RNA (cDNA)의 양을 표준화하기 위해 내부 대조물, GAPDH (프로브 농도 10O nM, 전방향 ＆ 역방향 프라이머 농도 20O nM)의 증폭을 수행하였다.
상대적 정량은 표준 곡선 방법을 이용하여 수행하였다. 내부 대조물에 표준화시킨 정량을 위해, 표적 및 내부 참조물 모두에 대한 표준 곡선을 작성하였다. 각각의 실험 샘플에 대해, 표적 및 내부 참조물의 양은 적절한 표준 곡선으로부터 결정하였다. 이어서, 표적량을 내부 참조물량으로 나누어 표준화된 표적값을 얻었다. 실험 샘플 중 하나는 교정값 (calibrator) 또는 1x 샘플로서 역할을 하였다. 이어서, 각각의 표준화된 표적값을 교정값 표준화된 표적값으로 나누어 상대적 발현 수준을 얻었다.
FACS /유동 세포분석법 (2°항체 염색 프로토콜):
모든 인큐베이션 및 스핀은 4℃에서 수행하고, 튜브는 냉장고가 아니라 얼음 상에 유지하였다.
1. 사용될 세포주, 관심있는 항체, 및 임의의 특수한 조건 또는 처리를 확인하여 튜브 포맷을 결정한다.
a. 대조군
i. 비염색, 2°항체, 및 형광색소가 겹치는 방출 스펙트럼을 가지면 보충.
b. 예:
튜브 세포주 시간 (분) 1°항체 2°항체
1 예, COLO-205 0 - -
2 예, COLO-205 0 - 항-마우스-FITC
3 예, COLO-205 0 항-시알릴 루이스 A 항-마우스-FITC
4 예, COLO-205 0 항-CD15s (시알릴 루이스 X) 항-마우스-FITC
2. FACS 튜브를 표지한다.
a. BD Falcon 12x75 mm 폴리스티렌 둥근 바닥. 카탈로그 #: 352052
3. 세포를 염색을 위해 준비한다.
a. 부착 세포를 아큐타제 (Accutase) 또는 트립신으로 처리한다.
i. 이노베이티브 셀 테크놀로지스 인크 (Innovative Cell Technologies Inc), 아큐타제.
ii. 깁코 (Gibco), 트립신. 카탈로그 #: 25200-106.
b. 세포가 현탁 상태면 나머지 단계로 진행한다.
4. 세포를 15 mL 또는 50 mL 원추형 튜브에 분액한다.
5. 세포를 5분 동안 1200 rpm, 4℃에서 스피닝한다.
6. 상등액을 흡인여과한다.
7. 세포를 5 mL FACS 버퍼에 재현탁한다.
8. 세포를 5분 동안 1200 rpm, 4℃에서 스피닝한다.
9. 상등액을 흡인여과한다.
10. 세포를 차단 버퍼에 재현탁한다.
a. 필요한 차단 버퍼의 부피를 결정한다:
i. 세포주당 튜브의 수/처리 X 튜브당 100 ㎕.
ii. 100 ㎕ 차단 버퍼 당 1x106 세포를 필요로 한다.
11. 100 ㎕의 세포를 적절한 튜브로 분액한다.
a. 예정된 튜브 포맷에 기초하여.
12. 1°항체를 적절한 튜브에 첨가한다.
a. 루이스 A:
i. 튜브당 10 ㎕의 0.2 ㎍/㎕ 원액을 사용한다.
1. 최종 농도는 2 ㎍이다.
ii. 케미콘 (Chemicon): 항-시알릴 루이스 A. 카탈로그 #: MAB2095.
b. 루이스 X:
i. 튜브당 5 ㎕의 0.5 ㎍/㎕ 원액을 사용한다.
1. 최종 농도는 2.5 ㎍이다.
ii. 비디 파밍엔 (BD Pharmingen): CD15s (시알릴 루이스 X). 카탈로그 #: 551344.
13. 30분 동안 4℃에서 인큐베이션한다.
14. 1 mL의 FACS 버퍼를 각각의 튜브에 첨가한다.
15. 세포를 5분 동안 1200 rpm, 4℃에서 스피닝한다.
16. 상등액을 흡인여과한다.
17. 튜브를 부드럽게 랙킹하여 펠렛을 제거한다.
a. "랙 (Rack)"- 튜브를 12x75 mm 튜브 랙의 표면을 가로질러 진행시킨다.
18. 단계 14-17을 반복한다.
19. 100 ㎕의 차단 버퍼를 각각의 튜브에 첨가한다.
20. 2°항체를 적절한 튜브에 첨가한다.
a. 튜브당 10 ㎕을 사용한다.
b. 잭슨 (Jackson), 염소-항-마우스 FITC. 카탈로그 #: 115-096-068.
21. 30분 동안 4℃에서 인큐베이션한다.
22. 단계 14-17을 2회 반복한다.
23. 세포를 FACS 버퍼/PI에 재현탁한다.
a. 필요한 부피를 결정한다:
i. 튜브당 1 mL의 용액이 필요하다.
ii. PI= 1 ㎕/mL 버퍼.
b. 몰레큘라 프로브스, 프로피듐 요오다이드. 카탈로그 #: P3566.
24. 튜브를 아이스 버킷 또는 얼음이 있는 튜브 랙에 넣는다.
25. 알루미늄 호일로 덮고 샘플을 획득하고 분석하도록 자격있는 조작자를 위해 FACS 실험실로 가져간다.
5％ 차단 버퍼:
1. FBS 총 부피의 5％.
2. FACS 버퍼.
3. 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한다.
FACS 버퍼:
1. 98O mL PBS.
2. 8 mL 0.25M EDTA.
3. 2O mL FBS.
4. 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한다.
면역조직화학 절차: 시알릴 루이스 A
항체: 시알릴 루이스 A AB-1
클론: 121SLE
공급회사: 네오마커스 (NeoMarkers)
카탈로그 번호 MS-279-P
Ig 종: 마우스
IHC 방법: 파라핀
전처리: 없음
IHC 취급: Autostainer
이소형: 마우스 IgM
처리 종: 인간
IgG 농도: 200 ㎍/ml
통상의 절차:
파라핀제거하고 증류수에 수화시킨다.
내인성 비오틴을 벡터 (Vector) 아비딘 비오틴 차단 시스템으로 차단한다.
TBS로 세정한다: 2 교체, 각각 5분.
10％ 정상 말 혈청을 사용하여 30분 동안 RT에서 차단한다.
절편을 60분 동안 RT에서 10％ 정상 말 혈청을 사용하여 5ug/ml로 희석된 마우스 모노클로날 시알릴 루이스 A 항체와 함께 인큐베이션한다.
음성 대조군으로 10％ 정상 말 혈청에 5 ㎍/ml로 희석된 마우스 이소형 IgM을 사용한다.
TBS로 세정한다: 2 교체, 각각 5분.
절편을 30분 동안 RT에서 비오티닐화 말 항-마우스 항체 (10％ 정상 말 혈청에 1:200 희석된)와 함께 인큐베이션한다.
TBS로 세정한다: 2 교체, 각각 5분.
절편을 희석된 벡터 ABC 용출 시스템과 함께 30분 동안 RT에서 인큐베이션한다.
TBS로 세정한다: 2 교체, 각각 5분.
절편을 피어스 (Pierce) 금속 강화 DAB와 함께 5분 동안 인큐베이션한다.
흐르는 수돗물에서 5분 동안 세정한다.
마이어스 (Mayers) 헤마톡실린으로 1분 동안 대조염색한다.
흐르는 수돗물에서 5분 동안 세정한다.
헤마톡실린을 리차드-알란 (Richard-Allan) 블루잉 (Bluing) 시약으로 1분 동안 청색염색한다.
흐르는 수돗물에서 2분 동안 세정한다.
탈수하고, 깨끗이하고 합성 탑재 배지에 탑재한다.
면역조직화학 절차: 시알릴 루이스 X
항체: 마우스 항- 시알릴 루이스 X
클론: KM93
공급회사: 케미콘
카탈로그 번호 MAB2096
Ig 종: 마우스
IHC 방법: 파라핀
전처리: DAKO 표적 복구
IHC 취급: Autostainer
이소형: 마우스 IgM
처리 종: 인간
IgG 농도: 100 ㎍/ml
통상의 절차:
파라핀제거하고 증류수에 수화시킨다.
내인성 퍼옥시다제 활성을 RT에서 4분 동안 KPL 차단 용액 (희석 농도 dH2O 내에 1:10)으로 켄칭한다.
증류수에서 5분 동안 세정한다.
20분 동안 비등 수조 내에서 99도로 예열된 DAKO 표적 복구 (S1700) 내에서 인큐베이션한다. 비등조에서 꺼내어 20분 동안 냉각시킨다.
내인성 비오틴을 벡터 아비딘 비오틴 차단 시스템으로 차단한다.
10％ 정상 말 혈청으로 30분 동안 RT에서 차단한다.
절편을 60분 동안 RT에서 10％ 정상 말 혈청으로 5 ㎍/ml로 희석된 마우스 모노클로날 시알릴 루이스 X 항체와 함께 인큐베이션한다.
음성 대조군으로 10％ 정상 말 혈청에 5 ㎍/ml로 희석된 마우스 이소형 IgM을 사용한다.
TBS로 세정한다: 2 교체, 각각 5분.
절편을 30분 동안 RT에서 벡터 비오티닐화 말 항-마우스 항체 (10％ 정상 말 혈청 중에 1:200 희석된)와 함께 인큐베이션한다.
TBS로 세정한다: 2 교체, 각각 5분.
절편을 30분 동안 RT에서 희석된 벡터 ABC 용출 시스템과 함께 인큐베이션한다.
TBS로 세정한다: 2 교체, 각각 5분.
절편을 피어스 금속 강화 DAB와 함께 5분 동안 인큐베이션한다.
흐르는 수돗물에서 5분 동안 세정한다.
마이어스 헤마톡실린으로 1분 동안 대조염색한다.
흐르는 수돗물에서 5분 동안 세정한다.
헤마톡실린을 리차드-알란 블루잉 시약으로 1분 동안 청색염색한다.
흐르는 수돗물에서 2분 동안 세정한다.
탈수하고, 깨끗이하고 합성 탑재 배지에 탑재한다.
실험 결과:
실험은 상기 설명된 방법 및 물질을 사용하여 수행하였다. 이들 실험의 결과를 아래 논의된 바와 같이 도 6-13에 설명한다.
도 6은 28가지 결장암 또는 결장직장암 세포주를 Apo2L (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS) 또는 DR5 모노클로날 항체 "mab", 가교결합된 "XL" 또는 가교결합되지 않은 (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS)의 세포자멸 활성에 대한 감수성 또는 내성, 및 FUT 3, FUT 6, 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 발현에 대해 분석하여 얻은 데이타의 개요 차트를 제공한다.
도 7은 정량적 PCR에 의해 측정된 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 DR5 항체에 대한 감수성, 및 FUT 3의 발현의 비교를 제공한다.
도 8은 FACS에 의해 측정된 DR5 항체 (+ 가교결합자)에 대한 감수성 또는 내성, 및 시알릴 루이스 X 또는 A의 발현에 대한 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 비교를 제공한다.
도 9A는 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 감수성 또는 내성 및 FUT3 발현에 대한 상관관계를 분석하는 스피어만 순위 상관 시험을 보여준다.
도 9B는 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 감수성 ("sens") 또는 내성 ("res"), 및 FUT3 및 시알릴 루이스 A/X 발현과 각각의 세포주의 DR5 항체 세포자멸 활성에 대한 감수성 사이의 통계적 유의성을 분석하는 피셔의 정확 검정의 결과를 보여준다.
도 10은 DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현 (정량적 PCR에 의해 측정) 및 특정 세포주의 Apo2L 또는 DR5 항체에 대한 상태 (감수성 또는 내성)에 대한 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 비교를 제공한다.
도 11은 DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현 (FACS에 의해 측정) 및 특정 세포주의 Apo2L 또는 DR5 항체에 대한 상태 (감수성 또는 내성)에 대한 각종 결장암 또는 결장직장암 세포주의 비교를 제공한다.
도 12는 4가지 결장직장암 세포주인 CaCo2 (Colo 2), SW 1417, DLD-1 및 Colo 205에 대한 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X에 대한 면역조직화학적 염색, 및 FACS에 의해 측정된, 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 발현에 대한 그의 상관관계 및, Apo2L/TRAIL에 대한 감수성에 대한 그의 상관관계를 보여준다. 결장직장암 세포주 Colo 2 및 SW 1417는 각각 염색되지 않거나 약한 염색을 보이고 (또는 시알릴 루이스 항원), FACS에 의해 각각 음성 및 약한 양성이고, Apo2L/TRAIL에 내성이다. 결장직장암 세포주 DLD-1 및 Colo 205는 시알릴 루이스 항원에 대해 각각 중등도 및 강한 염색을 보이고, FACS에 의해 각각 중등도 및 강한 양성이고, Apo2L/TRAIL에 감수성이다.
도 13은 정상 결장 점막, 정상 간 조직, 원발성 결장암 및 결장암 전이의 조직 샘플에서 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 발현을 보여주는 IHC 실험의 개요를 보여준다. 조직 마이크로어레이에 배열된 정상 결장 및 원발성 결장암의 조직 샘플은 IHC 실험으로 시험한 한편, 정상 간 및 전이성 결장암의 조직 샘플은 개별 유리 슬라이드 상에서 시험하였다. 시알릴 루이스 A 및 시알릴 루이스 X의 발현의 우세도 및 면역조직화학적 염색 강도는 정상 결장 조직에서 원발성 결장암으로 또한 전이성 결장암으로 증가한다. 정상 간 세포는 시알릴 루이스 A 또는 시알릴 루이스 X에 대해 염색되지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> ASSAYS AND METHODS USING BIOMARKERS <130> P2160R1 PCT <140> PCT/US2005/027480 <141> 2005-08-03 <150> US 60/599,425 <151> 2004-08-06 <160> 14 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr 1 5 10 15 Cys Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys 20 25 30 Val Ala Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met 35 40 45 Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu 50 55 60 Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser 65 70 75 Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys 80 85 90 Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu 95 100 105 Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln 110 115 120 Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr 125 130 135 Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys 140 145 150 Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser 155 160 165 Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly 170 175 180 Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu 185 190 195 Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile 200 205 210 Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser 215 220 225 Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg 245 250 255 Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 260 265 270 Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 2 <211> 1042 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> Unsure <222> 447 <223> Unknown base <400> 2 tttcctcact gactataaaa gaatagagaa ggaagggctt cagtgaccgg 50 ctgcctggct gacttacagc agtcagactc tgacaggatc atggctatga 100 tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 150 atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta 200 ctttaccaac gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca 250 ttgcttgttt cttaaaagaa gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa 300 gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc aagtggcaac tccgtcagct 350 cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt tctacagttc 400 aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtccncag 450 agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc 500 ttctccaaac tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct 550 gggaatcatc aaggagtggg cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg 600 aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg ttttactaca tctattccca 650 aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca aagaacgaca 700 aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata 750 ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata 800 tggactctat tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg 850 acagaatttt tgtttctgta acaaatgagc acttgataga catggaccat 900 gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt ggctaactga cctggaaaga 950 aaaagcaata acctcaaagt gactattcag ttttcaggat gatacactat 1000 gaagatgttt caaaaaatct gaccaaaaca aacaaacaga aa 1042 <210> 3 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Pro Pro Pro Ala Arg 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Asp Cys Thr Pro Trp Ser 215 220 225 Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Asn Gly His Asn Ile 230 235 240 Trp Val Ile Leu Val Val Thr Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Val 245 250 255 Ala Val Leu Ile Val Cys Cys Cys Ile Gly Ser Gly Cys Gly Gly 260 265 270 Asp Pro Lys Cys Met Asp Arg Val Cys Phe Trp Arg Leu Gly Leu 275 280 285 Leu Arg Gly Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala His Asn Glu Ile Leu 290 295 300 Ser Asn Ala Asp Ser Leu Ser Thr Phe Val Ser Glu Gln Gln Met 305 310 315 Glu Ser Gln Glu Pro Ala Asp Leu Thr Gly Val Thr Val Gln Ser 320 325 330 Pro Gly Glu Ala Gln Cys Leu Leu Gly Pro Ala Glu Ala Glu Gly 335 340 345 Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Gly Ala Asp Pro 350 355 360 Thr Glu Thr Leu Met Leu Phe Phe Asp Lys Phe Ala Asn Ile Val 365 370 375 Pro Phe Asp Ser Trp Asp Gln Leu Met Arg Gln Leu Asp Leu Thr 380 385 390 Lys Asn Glu Ile Asp Val Val Arg Ala Gly Thr Ala Gly Pro Gly 395 400 405 Asp Ala Leu Tyr Ala Met Leu Met Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly 410 415 420 Arg Asn Ala Ser Ile His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Arg Met 425 430 435 Glu Glu Arg His Ala Lys Glu Lys Ile Gln Asp Leu Leu Val Asp 440 445 450 Ser Gly Lys Phe Ile Tyr Leu Glu Asp Gly Thr Gly Ser Ala Val 455 460 465 Ser Leu Glu <210> 4 <211> 1407 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggcgccac caccagctag agtacatcta ggtgcgttcc tggcagtgac 50 tccgaatccc gggagcgcag cgagtgggac agaggcagcc gcggccacac 100 ccagcaaagt gtggggctct tccgcgggga ggattgaacc acgaggcggg 150 ggccgaggag cgctccctac ctccatggga cagcacggac ccagtgcccg 200 ggcccgggca gggcgcgccc caggacccag gccggcgcgg gaagccagcc 250 ctcggctccg ggtccacaag accttcaagt ttgtcgtcgt cggggtcctg 300 ctgcaggtcg tacctagctc agctgcaacc atgatcaatc aattggcaca 350 aattggcaca cagcaatggg aacatagccc tttgggagag ttgtgtccac 400 caggatctca tagatcagaa cgtcctggag cctgtaaccg gtgcacagag 450 ggtgtgggtt acaccaatgc ttccaacaat ttgtttgctt gcctcccatg 500 tacagcttgt aaatcagatg aagaagagag aagtccctgc accacgacca 550 ggaacacagc atgtcagtgc aaaccaggaa ctttccggaa tgacaattct 600 gctgagatgt gccggaagtg cagcacaggg 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Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg 1 5 10 15 Lys Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro 20 25 30 Gly Leu Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val 35 40 45 Leu Leu Leu Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp 50 55 60 Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser 65 70 75 Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp 80 85 90 Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr 95 100 105 His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp 110 115 120 Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr 125 130 135 Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro 140 145 150 Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val 155 160 165 Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His 170 175 180 Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 185 190 195 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys 200 205 210 Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp 215 220 225 Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp 230 235 240 Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val 245 250 255 Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly 260 265 270 Val Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro 275 280 285 Ala Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala 290 295 300 Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp 305 310 315 Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg 320 325 330 Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu 335 340 345 Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp 350 355 360 Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp 365 370 375 Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln Lys Ile Glu 380 385 390 Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly Asn 395 400 405 Ala Asp Ser Ala Leu Ser 410 <210> 6 <211> 440 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 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Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val Leu 215 220 225 Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro 245 250 255 Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn 260 265 270 Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro 275 280 285 Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val 290 295 300 Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala 305 310 315 Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn 320 325 330 Glu Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe 335 340 345 Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys 350 355 360 Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala 365 370 375 Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val 380 385 390 Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala 395 400 405 Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp 410 415 420 His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly Asn Ala 425 430 435 Asp Ser Ala Met Ser 440 <210> 7 <211> 1180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gctgtgggaa cctctccacg cgcacgaact cagccaacga tttctgatag 50 atttttggga gtttgaccag agatgcaagg ggtgaaggag cgcttcctac 100 cgttagggaa ctctggggac agagcgcccc ggccgcctga tggccgaggc 150 agggtgcgac ccaggaccca ggacggcgtc gggaaccata ccatggcccg 200 gatccccaag accctaaagt tcgtcgtcgt catcgtcgcg gtcctgctgc 250 cagtcctagc ttactctgcc accactgccc ggcaggagga agttccccag 300 cagacagtgg ccccacagca acagaggcac agcttcaagg gggaggagtg 350 tccagcagga tctcatagat cagaacatac tggagcctgt aacccgtgca 400 cagagggtgt ggattacacc aacgcttcca acaatgaacc ttcttgcttc 450 ccatgtacag tttgtaaatc agatcaaaaa cataaaagtt cctgcaccat 500 gaccagagac acagtgtgtc agtgtaaaga aggcaccttc cggaatgaaa 550 actccccaga gatgtgccgg aagtgtagca ggtgccctag tggggaagtc 600 caagtcagta attgtacgtc ctgggatgat atccagtgtg ttgaagaatt 650 tggtgccaat gccactgtgg aaaccccagc tgctgaagag acaatgaaca 700 ccagcccggg gactcctgcc ccagctgctg aagagacaat gaacaccagc 750 ccagggactc ctgccccagc tgctgaagag acaatgacca ccagcccggg 800 gactcctgcc ccagctgctg aagagacaat gaccaccagc ccggggactc 850 ctgccccagc tgctgaagag acaatgacca ccagcccggg gactcctgcc 900 tcttctcatt acctctcatg caccatcgta gggatcatag ttctaattgt 950 gcttctgatt gtgtttgttt gaaagacttc actgtggaag aaattccttc 1000 cttacctgaa aggttcaggt aggcgctggc tgagggcggg gggcgctgga 1050 cactctctgc cctgcctccc tctgctgtgt tcccacagac agaaacgcct 1100 gcccctgccc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1150 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1180 <210> 8 <211> 259 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Arg Ile Pro Lys Thr Leu Lys Phe Val Val Val Ile Val 1 5 10 15 Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Ala Tyr Ser Ala Thr Thr Ala Arg 20 25 30 Gln Glu Glu Val Pro Gln Gln Thr Val Ala Pro Gln Gln Gln Arg 35 40 45 His Ser Phe Lys Gly Glu Glu Cys Pro Ala Gly Ser His Arg Ser 50 55 60 Glu His Thr Gly Ala Cys Asn Pro Cys Thr Glu Gly Val Asp Tyr 65 70 75 Thr Asn Ala Ser Asn Asn Glu Pro Ser Cys Phe Pro Cys Thr Val 80 85 90 Cys Lys Ser Asp Gln Lys His Lys Ser Ser Cys Thr Met Thr Arg 95 100 105 Asp Thr Val Cys Gln Cys Lys Glu Gly Thr Phe Arg Asn Glu Asn 110 115 120 Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Ser Arg Cys Pro Ser Gly Glu 125 130 135 Val Gln Val Ser Asn Cys Thr Ser Trp Asp Asp Ile Gln Cys Val 140 145 150 Glu Glu Phe Gly Ala Asn Ala Thr Val Glu Thr Pro Ala Ala Glu 155 160 165 Glu Thr Met Asn Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu 170 175 180 Glu Thr Met Asn Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu 185 190 195 Glu Thr Met Thr Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu 200 205 210 Glu Thr Met Thr Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu 215 220 225 Glu Thr Met Thr Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Ser His Tyr 230 235 240 Leu Ser Cys Thr Ile Val Gly Ile Ile Val Leu Ile Val Leu Leu 245 250 255 Ile Val Phe Val <210> 9 <211> 2082 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ccaactgcac ctcggttcta tcgattgaat tccccgggga tcctctagag 50 atccctcgac ctcgacccac gcgtccggaa cctttgcacg cgcacaaact 100 acggggacga tttctgattg atttttggcg ctttcgatcc accctcctcc 150 cttctcatgg gactttgggg acaaagcgtc ccgaccgcct cgagcgctcg 200 agcagggcgc tatccaggag ccaggacagc gtcgggaacc agaccatggc 250 tcctggaccc caagatcctt aagttcgtcg tcttcatcgt cgcggttctg 300 ctgccggtcc gggttgactc tgccaccatc ccccggcagg acgaagttcc 350 ccagcagaca gtggccccac agcaacagag gcgcagcctc aaggaggagg 400 agtgtccagc aggatctcat agatcagaat atactggagc ctgtaacccg 450 tgcacagagg gtgtggatta caccattgct tccaacaatt tgccttcttg 500 cctgctatgt acagtttgta aatcaggtca aacaaataaa agttcctgta 550 ccacgaccag agacaccgtg tgtcagtgtg aaaaaggaag cttccaggat 600 aaaaactccc ctgagatgtg ccggacgtgt agaacagggt gtcccagagg 650 gatggtcaag gtcagtaatt gtacgccccg gagtgacatc aagtgcaaaa 700 atgaatcagc tgccagttcc actgggaaaa ccccagcagc ggaggagaca 750 gtgaccacca tcctggggat gcttgcctct ccctatcact accttatcat 800 catagtggtt ttagtcatca ttttagctgt ggttgtggtt ggcttttcat 850 gtcggaagaa attcatttct tacctcaaag gcatctgctc aggtggtgga 900 ggaggtcccg aacgtgtgca cagagtcctt ttccggcggc gttcatgtcc 950 ttcacgagtt cctggggcgg aggacaatgc ccgcaacgag accctgagta 1000 acagatactt gcagcccacc caggtctctg agcaggaaat ccaaggtcag 1050 gagctggcag agctaacagg tgtgactgta gagtygccag aggagccaca 1100 gcgtctgctg gaacaggcag aagctgaagg gtgtcagagg aggaggctgc 1150 tggttccagt gaatgacgct gactccgctg acatcagcac cttgctggat 1200 gcctcggcaa cactggaaga aggacatgca aaggaaacaa ttcaggacca 1250 actggtgggc tccgaaaagc tcttttatga agaagatgag gcaggctctg 1300 ctacgtcctg cctgtgaaag aatctcttca ggaaaccaga gcttccctca 1350 tttacctttt ctcctacaaa gggaagcagc ctggaagaaa cagtccagta 1400 cttgacccat gccccaacaa actctactat ccaatatggg gcagcttacc 1450 aatggtccta gaactttgtt aacgcacttg gagtaatttt tatgaaatac 1500 tgcgtgtgat aagcaaacgg gagaaattta tatcagattc ttggctgcat 1550 agttatacga ttgtgtatta agggtcgttt taggccacat gcggtggctc 1600 atgcctgtaa tcccagcact ttgataggct gaggcaggtg gattgcttga 1650 gctcgggagt ttgagaccag cctcatcaac acagtgaaac tccatctcaa 1700 tttaaaaaga aaaaaagtgg ttttaggatg tcattctttg cagttcttca 1750 tcatgagaca agtctttttt tctgcttctt atattgcaag ctccatctct 1800 actggtgtgt gcatttaatg acatctaact acagatgccg cacagccaca 1850 atgctttgcc ttatagtttt ttaactttag aacgggatta tcttgttatt 1900 acctgtattt tcagtttcgg atatttttga cttaatgatg agattatcaa 1950 gacgtacccc tatgctaagt catgagcata tggacttacg agggttcgac 2000 ttagagtttt gagctttaag ataggattat tgggggctta cccccacctt 2050 aattagaaga aacattttat attgctttac ta 2082 <210> 10 <211> 386 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Unsure <222> 310 <223> Unknown amino acid <400> 10 Met Gly Leu Trp Gly Gln Ser Val Pro Thr Ala Ser Ser Ala Arg 1 5 10 15 Ala Gly Arg Tyr Pro Gly Ala Arg Thr Ala Ser Gly Thr Arg Pro 20 25 30 Trp Leu Leu Asp Pro Lys Ile Leu Lys Phe Val Val Phe Ile Val 35 40 45 Ala Val Leu Leu Pro Val Arg Val Asp Ser Ala Thr Ile Pro Arg 50 55 60 Gln Asp Glu Val Pro Gln Gln Thr Val Ala Pro Gln Gln Gln Arg 65 70 75 Arg Ser Leu Lys Glu Glu Glu Cys Pro Ala Gly Ser His Arg Ser 80 85 90 Glu Tyr Thr Gly Ala Cys Asn Pro Cys Thr Glu Gly Val Asp Tyr 95 100 105 Thr Ile Ala Ser Asn Asn Leu Pro Ser Cys Leu Leu Cys Thr Val 110 115 120 Cys Lys Ser Gly Gln Thr Asn Lys Ser Ser Cys Thr Thr Thr Arg 125 130 135 Asp Thr Val Cys Gln Cys Glu Lys Gly Ser Phe Gln Asp Lys Asn 140 145 150 Ser Pro Glu Met Cys Arg Thr Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly 155 160 165 Met Val Lys Val Ser Asn Cys Thr Pro Arg Ser Asp Ile Lys Cys 170 175 180 Lys Asn Glu Ser Ala Ala Ser Ser Thr Gly Lys Thr Pro Ala Ala 185 190 195 Glu Glu Thr Val Thr Thr Ile Leu Gly Met Leu Ala Ser Pro Tyr 200 205 210 His Tyr Leu Ile Ile Ile Val Val Leu Val Ile Ile Leu Ala Val 215 220 225 Val Val Val Gly Phe Ser Cys Arg Lys Lys Phe Ile Ser Tyr Leu 230 235 240 Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Glu Arg Val His 245 250 255 Arg Val Leu Phe Arg Arg Arg Ser Cys Pro Ser Arg Val Pro Gly 260 265 270 Ala Glu Asp Asn Ala Arg Asn Glu Thr Leu Ser Asn Arg Tyr Leu 275 280 285 Gln Pro Thr Gln Val Ser Glu Gln Glu Ile Gln Gly Gln Glu Leu 290 295 300 Ala Glu Leu Thr Gly Val Thr Val Glu Xaa Pro Glu Glu Pro Gln 305 310 315 Arg Leu Leu Glu Gln Ala Glu Ala Glu Gly Cys Gln Arg Arg Arg 320 325 330 Leu Leu Val Pro Val Asn Asp Ala Asp Ser Ala Asp Ile Ser Thr 335 340 345 Leu Leu Asp Ala Ser Ala Thr Leu Glu Glu Gly His Ala Lys Glu 350 355 360 Thr Ile Gln Asp Gln Leu Val Gly Ser Glu Lys Leu Phe Tyr Glu 365 370 375 Glu Asp Glu Ala Gly Ser Ala Thr Ser Cys Leu 380 385 <210> 11 <211> 1086 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atggatcccc tgggtgcagc caagccacaa tggccatggc gccgctgtct 50 ggccgcactg ctatttcagc tgctggtggc tgtgtgtttc ttctcctacc 100 tgcgtgtgtc ccgagacgat gccactggat cccctagggc tcccagtggg 150 tcctcccgac aggacaccac tcccacccgc cccaccctcc tgatcctgct 200 atggacatgg cctttccaca tccctgtggc tctgtcccgc tgttcagaga 250 tggtgcccgg cacagccgac tgccacatca ctgccgaccg caaggtgtac 300 ccacaggcag acacggtcat cgtgcaccac tgggatatca tgtccaaccc 350 taagtcacgc ctcccacctt ccccgaggcc gcaggggcag cgctggatct 400 ggttcaactt ggagccaccc cctaactgcc agcacctgga agccctggac 450 agatacttca atctcaccat gtcctaccgc agcgactccg acatcttcac 500 gccctacggc tggctggagc cgtggtccgg ccagcctgcc cacccaccgc 550 tcaacctctc ggccaagacc gagctggtgg cctgggcggt gtccaactgg 600 aagccggact cagccagggt gcgctactac cagagcctgc aggctcatct 650 caaggtggac gtgtacggac gctcccacaa gcccctgccc aaggggacca 700 tgatggagac gctgtcccgg tacaagttct acctggcctt cgagaactcc 750 ttgcaccccg actacatcac cgagaagctg tggaggaacg ccctggaggc 800 ctgggccgtg cccgtggtgc tgggccccag cagaagcaac tacgagaggt 850 tcctgccacc cgacgccttc atccacgtgg acgacttcca gagccccaag 900 gacctggccc ggtacctgca ggagctggac aaggaccacg cccgctacct 950 gagctacttt cgctggcggg agacgctgcg gcctcgctcc ttcagctggg 1000 cactggattt ctgcaaggcc tgctggaaac tgcagcagga atccaggtac 1050 cagacggtgc gcagcatagc ggcttggttc acctga 1086 <210> 12 <211> 361 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Asp Pro Leu Gly Ala Ala Lys Pro Gln Trp Pro Trp Arg Arg 1 5 10 15 Cys Leu Ala Ala Leu Leu Phe Gln Leu Leu Val Ala Val Cys Phe 20 25 30 Phe Ser Tyr Leu Arg Val Ser Arg Asp Asp Ala Thr Gly Ser Pro 35 40 45 Arg Ala Pro Ser Gly Ser Ser Arg Gln Asp Thr Thr Pro Thr Arg 50 55 60 Pro Thr Leu Leu Ile Leu Leu Trp Thr Trp Pro Phe His Ile Pro 65 70 75 Val Ala Leu Ser Arg Cys Ser Glu Met Val Pro Gly Thr Ala Asp 80 85 90 Cys His Ile Thr Ala Asp Arg Lys Val Tyr Pro Gln Ala Asp Thr 95 100 105 Val Ile Val His His Trp Asp Ile Met Ser Asn Pro Lys Ser Arg 110 115 120 Leu Pro Pro Ser Pro Arg Pro Gln Gly Gln Arg Trp Ile Trp Phe 125 130 135 Asn Leu Glu Pro Pro Pro Asn Cys Gln His Leu Glu Ala Leu Asp 140 145 150 Arg Tyr Phe Asn Leu Thr Met Ser Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Ile 155 160 165 Phe Thr Pro Tyr Gly Trp Leu Glu Pro Trp Ser Gly Gln Pro Ala 170 175 180 His Pro Pro Leu Asn Leu Ser Ala Lys Thr Glu Leu Val Ala Trp 185 190 195 Ala Val Ser Asn Trp Lys Pro Asp Ser Ala Arg Val Arg Tyr Tyr 200 205 210 Gln Ser Leu Gln Ala His Leu Lys Val Asp Val Tyr Gly Arg Ser 215 220 225 His Lys Pro Leu Pro Lys Gly Thr Met Met Glu Thr Leu Ser Arg 230 235 240 Tyr Lys Phe Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Leu His Pro Asp Tyr 245 250 255 Ile Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu Glu Ala Trp Ala Val 260 265 270 Pro Val Val Leu Gly Pro Ser Arg Ser Asn Tyr Glu Arg Phe Leu 275 280 285 Pro Pro Asp Ala Phe Ile His Val Asp Asp Phe Gln Ser Pro Lys 290 295 300 Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Gln Glu Leu Asp Lys Asp His Ala Arg 305 310 315 Tyr Leu Ser Tyr Phe Arg Trp Arg Glu Thr Leu Arg Pro Arg Ser 320 325 330 Phe Ser Trp Ala Leu Asp Phe Cys Lys Ala Cys Trp Lys Leu Gln 335 340 345 Gln Glu Ser Arg Tyr Gln Thr Val Arg Ser Ile Ala Ala Trp Phe 350 355 360 Thr <210> 13 <211> 1080 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atggatcccc tgggcccggc caagccacag tggtcgtggc gctgctgtct 50 gaccacgctg ctgtttcagc tgctgatggc tgtgtgtttc ttctcctatc 100 tgcgtgtgtc tcaagacgat cccactgtgt accctaatgg gtcccgcttc 150 ccagacagca cagggacccc cgcccactcc atccccctga tcctgctgtg 200 gacgtggcct tttaacaaac ccatagctct gccccgctgc tcagagatgg 250 tgcctggcac ggctgactgc aacatcactg ccgaccgcaa ggtgtatcca 300 caggcagacg cggtcatcgt gcaccaccga gaggtcatgt acaaccccag 350 tgcccagctc ccacgctccc cgaggcggca ggggcagcga tggatctggt 400 tcagcatgga gtccccaagc cactgctggc agctgaaagc catggacgga 450 tacttcaatc tcaccatgtc ctaccgcagc gactccgaca tcttcacgcc 500 ctacggctgg ctggagccgt ggtccggcca gcctgcccac ccaccgctca 550 acctctcggc caagaccgag ctggtggcct gggcagtgtc caactggggg 600 ccaaactccg ccagggtgcg ctactaccag agcctgcagg cccatctcaa 650 ggtggacgtg tacggacgct cccacaagcc cctgccccag ggaaccatga 700 tggagacgct gtcccggtac aagttctatc tggccttcga gaactccttg 750 caccccgact acatcaccga gaagctgtgg aggaacgccc tggaggcctg 800 ggccgtgccc gtggtgctgg gccccagcag aagcaactac gagaggttcc 850 tgccacccga cgccttcatc cacgtggacg acttccagag ccccaaggac 900 ctggcccggt acctgcagga gctggacaag gaccacgccc gctacctgag 950 ctactttcgc tggcgggaga cgctgcggcc tcgctccttc agctgggcac 1000 tcgctttctg caaggcctgc tggaaactgc aggaggaatc caggtaccag 1050 acacgcggca tagcggcttg gttcacctga 1080 <210> 14 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Asp Pro Leu Gly Pro Ala Lys Pro Gln Trp Ser Trp Arg Cys 1 5 10 15 Cys Leu Thr Thr Leu Leu Phe Gln Leu Leu Met Ala Val Cys Phe 20 25 30 Phe Ser Tyr Leu Arg Val Ser Gln Asp Asp Pro Thr Val Tyr Pro 35 40 45 Asn Gly Ser Arg Phe Pro Asp Ser Thr Gly Thr Pro Ala His Ser 50 55 60 Ile Pro Leu Ile Leu Leu Trp Thr Trp Pro Phe Asn Lys Pro Ile 65 70 75 Ala Leu Pro Arg Cys Ser Glu Met Val Pro Gly Thr Ala Asp Cys 80 85 90 Asn Ile Thr Ala Asp Arg Lys Val Tyr Pro Gln Ala Asp Ala Val 95 100 105 Ile Val His His Arg Glu Val Met Tyr Asn Pro Ser Ala Gln Leu 110 115 120 Pro Arg Ser Pro Arg Arg Gln Gly Gln Arg Trp Ile Trp Phe Ser 125 130 135 Met Glu Ser Pro Ser His Cys Trp Gln Leu Lys Ala Met Asp Gly 140 145 150 Tyr Phe Asn Leu Thr Met Ser Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Ile Phe 155 160 165 Thr Pro Tyr Gly Trp Leu Glu Pro Trp Ser Gly Gln Pro Ala His 170 175 180 Pro Pro Leu Asn Leu Ser Ala Lys Thr Glu Leu Val Ala Trp Ala 185 190 195 Val Ser Asn Trp Gly Pro Asn Ser Ala Arg Val Arg Tyr Tyr Gln 200 205 210 Ser Leu Gln Ala His Leu Lys Val Asp Val Tyr Gly Arg Ser His 215 220 225 Lys Pro Leu Pro Gln Gly Thr Met Met Glu Thr Leu Ser Arg Tyr 230 235 240 Lys Phe Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Leu His Pro Asp Tyr Ile 245 250 255 Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu Glu Ala Trp Ala Val Pro 260 265 270 Val Val Leu Gly Pro Ser Arg Ser Asn Tyr Glu Arg Phe Leu Pro 275 280 285 Pro Asp Ala Phe Ile His Val Asp Asp Phe Gln Ser Pro Lys Asp 290 295 300 Leu Ala Arg Tyr Leu Gln Glu Leu Asp Lys Asp His Ala Arg Tyr 305 310 315 Leu Ser Tyr Phe Arg Trp Arg Glu Thr Leu Arg Pro Arg Ser Phe 320 325 330 Ser Trp Ala Leu Ala Phe Cys Lys Ala Cys Trp Lys Leu Gln Glu 335 340 345 Glu Ser Arg Tyr Gln Thr Arg Gly Ile Ala Ala Trp Phe Thr 350 355

Claims (38)

  1. 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계, 및
    푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 조직 또는 세포 샘플을 조사하는 단계
    를 포함하고, 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 조직 또는 세포 샘플이 Apo2L/TRAIL의 세포자멸(apoptosis) 유도 활성에 대해 감수성이라는 예측 지표인, 포유동물의 조직 또는 세포 샘플의 Apo2L/TRAIL에 대한 감수성 예측 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 푸코실트랜스퍼라제 3 또는 푸코실트랜스퍼라제 6의 mRNA 발현 검출로 조사하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)의 발현 검출을 위한 면역조직화학으로 조사하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 암 세포를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암, 결장직장암, 위장암 또는 췌장암의 세포 또는 조직인 방법.
  7. 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계,
    푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 조직 또는 세포 샘플을 조사하는 단계, 및
    상기 하나 이상의 바이오마커 발현 검출 후에, 상기 조직 또는 세포 샘플을 유효량의 Apo2L/TRAIL에 노출시키는 단계
    를 포함하는, 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서의 세포자멸 유도 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 푸코실트랜스퍼라제 3 또는 푸코실트랜스퍼라제 6의 mRNA 발현에 대해 시험하여 조사하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)의 발현 검출을 위한 면역조직화학으로 조사하는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 암 세포를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암, 결장직장암, 위장암 또는 췌장암의 세포 또는 조직인 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 세포를, 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드의 유효량에 노출시키는 것인 방법.
  14. 면역 관련 질환 또는 암과 같은 질환을 치료할 포유동물로부터 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계,
    푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 조직 또는 세포 샘플을 조사하는 단계, 및
    상기 하나 이상의 바이오마커 발현 검출 후에, 상기 포유동물에게 유효량의 Apo2L/TRAIL을 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물에서의 면역 관련 질환 또는 암과 같은 질환의 치료 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 푸코실트랜스퍼라제 3 또는 푸코실트랜스퍼라제 6의 mRNA 발현 검출로 조사하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커 발현을, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)의 발현 검출을 위한 면역조직화학으로 조사하는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 조직 또는 세포에서 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 암 세포를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암 세포 또는 암 조직이 결장암, 결장직장암, 위장암 또는 췌장암의 세포 또는 조직을 포함하는 것인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 포유동물에게 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 것인 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 포유동물에게 화학요법제(들)도 투여하거나, 또는 방사선요법 또한 실시하는 것인 방법.
  22. 제14항에 있어서, 상기 포유동물에게 사이토킨, 세포독성제 또는 성장억제제도 투여하는 것인 방법.
  23. 제7항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
  24. 제14항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
  25. 제6항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암 세포 또는 결장직장암 세포인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL이 도 1 (서열 1)의 아미노산 41-281을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 단편인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL이 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
  28. 제12항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암 세포 또는 결장직장암 세포인 방법.
  29. 제20항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281로 이루어진 것인 방법.
  30. 포유동물의 결장암 또는 결장직장암 세포를 얻는 단계, 및
    푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 암 세포를 조사하는 단계
    를 포함하고, 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 암 세포가 Apo2L/TRAIL의 세포자멸 유도 활성에 대해 감수성이라는 예측 지표인, 포유동물의 결장암 또는 결장직장암 세포의 Apo2L/TRAIL에 대한 감수성 예측 방법.
  31. 포유동물의 결장암 또는 결장직장암 세포를 얻는 단계,
    푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 암 세포를 조사하는 단계, 및
    상기 하나 이상의 바이오마커 발현 검출 후에, 상기 암 세포를 유효량의 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드에 노출시키는 단계
    를 포함하는, 포유동물의 결장암 또는 결장직장암 세포의 세포자멸 유도 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 41-281을 포함하거나, 또는 세포자멸 활성을 갖는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 것인 방법.
  35. 결장암 또는 결장직장암을 치료할 포유동물로부터 결장암 또는 결장직장암 세포 샘플을 얻는 단계,
    푸코실트랜스퍼라제 3, 푸코실트랜스퍼라제 6, 시알릴 루이스 A 및/또는 시알릴 루이스 X 항원(들)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 상기 암 세포 샘플을 조사하는 단계, 및
    상기 하나 이상의 바이오마커 발현 검출 후에, 상기 포유동물에게 유효량의 Apo2L/TRAIL을 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물에서의 결장암 또는 결장직장암의 치료 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 41-281을 포함하거나, 또는 세포자멸 활성을 갖는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 도 1 (서열 1)의 아미노산 114-281을 포함하는 것인 방법.
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