KR100990273B1 - 세포/조직에서의 ｇａｌｎａｃ－ｔ14 발현에 대한 시험에의해 예측된 ａｐｏ２ｌ／ｔｒａｉｌ에 대한 세포자멸사민감도 - Google Patents

세포/조직에서의 ｇａｌｎａｃ－ｔ14 발현에 대한 시험에의해 예측된 ａｐｏ２ｌ／ｔｒａｉｌ에 대한 세포자멸사민감도 Download PDF

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Abstract

포유동물 조직 또는 세포 샘플에서의 1가지 이상의 바이오마커의 발현을 조사하는 방법 및 분석법이 제공된다. 개시된 방법 및 분석법에 따르면, GalNac-T 관련 분자, 예컨대 GalNac-T14 또는 GalNac-T3의 발현의 검출은 조직 또는 세포 샘플이 세포자멸사 유도제, 예컨대 Apo2L/TRAIL 및 항-DR5 작동제 항체에 민감성일 것이라는 것을 예측하거나 이를 나타낸다. 키트 및 제작품이 또한 제공된다.
바이오마커, 세포자멸사, GalNac-T14, GalNac-T3, Apo2L/TRAIL, 사멸 수용체 항체, 항-DR4 또는 항-DR5 항체

Description

세포/조직에서의 ＧＡＬＮＡＣ－Ｔ14 발현에 대한 시험에 의해 예측된 ＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ에 대한 세포자멸사 민감도 {APOPTOSIS SENSITIVITY TO APO2L/TRAIL BY TESTING FOR GALNAC-T14 EXPRESSION IN CELLS/TISSUES}
관련 출원
본 출원은 미국 특허 가출원 60/708,677 (2005년 8월 16일 출원) 및 미국 특허 가출원 60/808,076 (2006년 5월 24일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이들의 내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.
본원에 기술된 발명은 Apo2L/TRAIL 및/또는 사멸(death) 수용체 작동제(agonist) 항체에 대한 포유동물 세포의 민감도를 예측하는 바이오마커(biomarker)를 검출하는 방법 및 분석법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 작동제 항체, 예컨대 DR4 또는 DR5 작동제 항체에 대한 포유동물 암 세포의 민감도를 예측하는 GalNac-T 족의 단백질과 관련된 분자를 검출하는 방법 및 분석법에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 (TNF) 수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 다양한 리간드 및 수용체가 당업계에서 확인되었다. 이같은 리간드에는 종양 괴사 인자-알파 ("TNF-알파"), 종양 괴사 인자-베타 ("TNF-베타" 또는 "림프독소-알파"), 림프독소-베타 ("LT-베타"), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, OX-40 리간드, 4-1BB 리간드, LIGHT, Apo-1 리간드 (Fas 리간드 또는 CD95 리간드로 또한 지칭됨), Apo-2 리간드 (Apo2L 또는 TRAIL로 또한 지칭됨), Apo-3 리간드 (TWEAK으로 또한 지칭됨), APRIL, OPG 리간드 (RANK 리간드, ODF, 또는 TRANCE로 또한 지칭됨), 및 TALL-1 (BlyS, BAFF 또는 THANK로 또한 지칭됨)이 포함된다 (예를 들어, [Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002)]; [Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998)]; [Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)]; [Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997)]; [Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411]; [Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001)]; [Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995)]; [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)]; [Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)]; [Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)]; [Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995)]; [Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993)]; [Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992)]; WO 97/01633 (1997년 1월 16일 공개); WO 97/25428 (1997년 7월 17일 공개); [Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998)]; [Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997)]; [Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998)]; WO 98/28426 (1998년 7월 2일 공개); WO 98/46751 (1998년 10월 22일 공개); WO/98/18921 (1998년 5월 7일 공개); [Moore et al., Science, 285:260-263 (1999)]; [Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999)]; [Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999)]; [Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)] 참조).
이같은 TNF 족 리간드에 의해 매개되는 다양한 세포성 응답의 유도는 특정 세포 수용체에 대한 이의 결합에 의해 전형적으로 개시된다. 전부는 아니지만 일부 TNF 족 리간드는 세포 표면 "사멸 수용체"에 결합하고, 이를 통하여 다양한 생물학적 활성을 유도하여, 카스파제(caspase) 또는 세포 사멸 또는 세포자멸사 경로를 수행하는 효소를 활성화시킨다 ([Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)]). 현재까지 확인된 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원에는 TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (Apo-1 또는 CD95로 또한 지칭됨), DR4 (TRAIL-R1으로 또한 지칭됨), DR5 (Apo-2 또는 TRAIL-R2로 또한 지칭됨), DcR1, DcR2, 오스테오프로테게린 (OPG), RANK 및 Apo-3 (DR3 또는 TRAMP로 또한 지칭됨)이 포함된다 (예를 들어, [Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002)]; [Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998)]; [Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)]; [Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997)]; [Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411]; [Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001)]; [Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995)]; [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989)]; [Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990)]; EP 417,563 (1991년 3월 20일 공개); [Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990)]; [Schall et al., Cell, 61:361 (1990)]; [Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990)]; [Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991)]; [Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]; [Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989)]; [Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990)]; [Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997)]; [Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997)]; [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)]; [Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)]; [Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)]; [Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997)]; [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997)]; [Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997)]; [Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997)]; [vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)] 참조).
대부분의 이러한 TNF 수용체 족 구성원은 세포외 영역, 막횡단 영역 및 세포내 영역을 포함하여 세포 표면 수용체의 전형적인 구조를 공유하는 반면, 그 밖의 것들은 막횡단 도메인 및 세포내 도메인이 없는 가용성 단백질로서 천연에서 발견된다. 전형적인 TNFR의 세포외 부분은 NH2-말단에서 시작하여 다중 시스테인-풍부 도메인 (CRD)의 반복 아미노산 서열 패턴을 함유한다.
Apo-2L 또는 TRAIL로 지칭되는 리간드가 사이토카인의 TNF 족의 구성원으로서 수년 전에 확인되었다 (예를 들어, [Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995)]; [Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)]; WO 97/01633; WO 97/25428; 미국 특허 5,763,223 (1998년 6월 9일 허여); 미국 특허 6,284,236 (2001년 9월 4일 허여) 참조). 전장 천연 서열 인간 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드는 아미노산 281개 길이의 제II형 막횡단 단백질이다. 일부 세포는 폴리펩티드의 세포외 영역의 효소에 의한 절단을 통해, 폴리펩티드의 천연 가용성 형태를 생성시킬 수 있다 ([Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)]). Apo2L/TRAIL의 가용성 형태의 결정학적 연구는 TNF 및 다른 관련 단백질의 구조와 유사한 동종삼량체성 구조를 나타냈다 ([Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999)]; [Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999)]; [Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999)]; [Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)]). 그러나, 다른 TNF 족 구성원들과는 달리, Apo2L/TRAIL은 3개의 시스테인 잔기 (동종삼량체 내의 각 서브유닛의 위치 230)가 함께 아연 원자와 배위 결합하고, 아연 결합이 삼량체 안정성 및 생물학적 활성에 중요하다는 점에서 독특한 구조적 특색을 갖는 것으로 발견되었다 ([Hymowitz et al., 상기 문헌]; [Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)]).
Apo2L/TRAIL이 류머티스성 관절염과 같은 자가면역 질환이 포함되는 면역계 조정에서 역할을 할 수 있다는 사실이 문헌에서 보고되었다 (예를 들어, [Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998)]; [Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999)]; [Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999)]; [Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)] 참조).
가용성 형태의 Apo2L/TRAIL은 결장, 폐, 유방, 전립선, 방광, 신장, 난소 및 뇌 종양, 뿐만 아니라 흑색종, 백혈병, 및 다발성 골수종이 포함되는 다양한 암 세 포에서 세포자멸사를 유도하는 것으로 또한 보고되었다 (예를 들어, [Wiley et al., 상기 문헌]; [Pitti et al., 상기 문헌]; 미국 특허 6,030,945 (2000년 2월 29일 허여); 미국 특허 6,746,668 (2004년 6월 8일 허여); [Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998)]; [Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)]; [Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999)]; [Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999)]; [Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999)]; [Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999)]; [Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000)]; [Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)] 참조). 뮤린(murine) 종양 모델에서의 생체내 연구는 Apo2L/TRAIL이 단독으로 또는 화학요법 또는 방사선요법과 조합되어 실질적인 항-종양 효과를 발휘할 수 있다는 것을 추가로 시사하였다 (예를 들어, [Ashkenazi et al., 상기 문헌]; [Walzcak et al., 상기 문헌]; [Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999)]; [Chinnaiyan et al., 상기 문헌]; [Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)]; PCT 출원 US/00/15512; PCT 출원 US/01/23691 참조). 많은 유형의 암세포와 달리, 대부분의 정상적인 인간 세포 유형은 특정한 재조합 형태의 Apo2L/TRAIL에 의한 세포자멸사 유도에 대해 저항성인 것으로 보인다 ([Ashkenazi et al., 상기 문헌]; [Walzcak et al., 상기 문헌]). 조(Jo) 등은 폴리히스티딘-태그(tag)가 부착된 가용성 형태의 Apo2L/TRAIL이 시험관 내의 정상적인 단리된 인간 간세포에서 세포자멸사를 유도하였지만, 비-인간 간세포에서는 유도하지 않았음을 보고하였다 ([Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000)]; [Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)]를 또한 참조). 예를 들어, 태그 분자의 존재 또는 부재, 아연 함량, 및 삼량체 함량％에 따라, 질환 세포 대 정상 세포에 대한 생화학적 성질 및 생물학적 활성의 관점에서 특정 재조합 Apo2L/TRAIL 제제가 다양할 수 있다고 여겨진다 ([Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001)]; [Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)] 참조).
Apo2L/TRAIL은 5가지 이상의 상이한 수용체에 결합하는 것으로 발견되었다. Apo2L/TRAIL에 결합하는 수용체 중 2가지 이상은 기능성 세포질 사멸 도메인을 포함한다. 한 이같은 수용체는 "DR4"로 지칭되었다 (별법적으로 TR4 또는 TRAIL-R1로 지칭됨) ([Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)]; WO 98/32856 (1998년 7월 30일 공개); WO 99/37684 (1999년 7월 29일 공개); WO 00/73349 (2000년 12월 7일 공개); US 2003/0036168 (2003년 2월 20일 공개); US 6,433,147 (2002년 8월 13일 허여); US 6,461,823 (2002년 10월 8일 허여) 및 US 6,342,383 (2002년 1월 29일 허여) 참조).
Apo2L/TRAIL에 대한 또다른 이같은 수용체는 DR5로 지칭되었다 (별법적으로 Apo-2; TRAIL-R 또는 TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 또는 KILLER로 또한 지칭되었다) (예를 들어, [Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)]; [Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)]; WO 98/51793 (1998년 11월 19일 공개); WO 98/41629 (1998년 9월 24일 공개); [Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997)]; [Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997)]; [Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997)]; WO 98/35986 (1998년 8월 20일 공개); EP 870,827 (1998년 10월 14일 공개); WO 98/46643 (1998년 10월 22일 공개); WO 99/02653 (1999년 1월 21일 공개); WO 99/09165 (1999년 2월 25일 공개); WO 99/11791 (1999년 3월 11일 공개); WO 03/042367 (2003년 5월 22일 공개); WO 02/097033 (2002년 12월 5일 공개); WO 03/038043 (2003년 5월 8일 공개); US 2002/0072091 (2002년 8월 13일 공개); US 2002/0098550 (2001년 12월 7일 공개); US 6,313,269 (2001년 12월 6일 허여); US 2001/0010924 (2001년 8월 2일 공개); US 2003/01255540 (2003년 7월 3일 공개); US 2002/0160446 (2002년 10월 31일 공개); US 2002/0048785 (2002년 4월 25일 공개); US 2004/0141952 (2004년 7월 22일 공개); US 2005/0129699 (2005년 6월 16일 공개); US 2005/0129616 (2005년 6월 16일 공개); US 6,342,369 (2002년 2월 허여); US 6,569,642 (2003년 5월 27일 허여); US 6,072,047 (2000년 6월 6일 허여); US 6,642,358 (2003년 11월 4일 허여); US 6,743,625 (2004년 6월 1일 허여) 참조). DR4와 같이, DR5는 세포질 사멸 도메인을 함유하고 리간드가 결합했을 때 (또는 리간드의 활성을 모방하는 작동제 항체와 같은 분자가 결합했을 때) 세포자멸사의 신호를 전달할 수 있는 것으로 보고되었다. Apo-2L/TRAIL과 DR5 사이에 형성된 복합체의 결정 구조가 [Hymowitz et al., Molecular Cell., 4:563-571 (1999)]에 기술되어 있다.
리간드가 결합했을 때, DR4와 DR5는 모두 FADD/Mort1로 지칭되는 사멸 도메인 함유 어댑터 분자를 통해 세포자멸사 개시제인 카스파제-8를 동원 및 활성화시킴으로써 독립적으로 세포자멸사를 촉발시킬 수 있다 ([Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000)]; [Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000)]; [Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)]).
Apo2L/TRAIL은 신호전달의 변환인자(transducer)보다는 억제제로서 기능하는 것으로 여겨지는 DcR1, DcR2 및 OPG로 지칭되는 수용체에 또한 결합하는 것으로 보고되었다 (예를 들어, DCR1 (TRID, LIT 또는 TRAIL-R3로 또한 지칭됨)에 대해서 [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)]; [Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)]; [McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997)]; [Schneider et al., FBBS Letters, 416:329-334 (1997)]; [Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997)]; 및 [Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)]; DCR2 (TRUNDD 또는 TRAIL-R4로 또한 지칭됨)에 대해서 [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997)]; [Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998)]; [Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)], OPG에 대해서 [Simonet et al., 상기 문헌] 참조). DR4 및 DR5와 달리, DcR1 및 DcR2 수용체는 세포자멸사 신호를 전달하지 않는다.
DR4 및/또는 DR5 수용체에 결합하는 특정 항체가 문헌에서 보고되었다. 예를 들어, DR4 수용체에 대해 지시되고 특정 포유동물 세포에서 작동제성 또는 세포자멸사성 활성을 갖는 항-DR4 항체가, 예를 들어 WO 99/37684 (1999년 7월 29일 공개); WO 00/73349 (2000년 7월 12일 공개); WO 03/066661 (2003년 8월 14일 공개)에 기술되어 있다. 또한, [Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999)]; [Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001)]; WO 02/097033 (2002년 12월 2일 공개); WO 03/042367 (2003년 5월 22일 공개); WO 03/038043 (2003년 5월 8일 공개); WO 03/037913 (2003년 5월 8일 공개); US 2003/0073187 (2003년 4월 17일 공개); US 2003/0108516 (2003년 6월 12일 공개)을 참조한다. 특정 항-DR5 항체가 마찬가지로 기술되었고, 예를 들어 WO 98/51793 (1998년 11월 8일 공개); [Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999)]; [Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001)]; [Hylander et al., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada]; WO 03/038043 (2003년 5월 8일 공개); WO 03/037913 (2003년 5월 8일 공개); US 2003/0180296 (2003년 9월 25일 공개)을 참조한다. 또한, DR4와 DR5 수용체 모두에 대한 교차반응성을 갖는 특정 항체가 기술되었다 (예를 들어, 미국 특허 6,252,050 (2001년 6월 26일 허여) 참조).
발명의 개요
본원에 개시된 발명은 포유동물 조직 또는 세포 샘플에서 1가지 이상의 바이오마커의 발현을 조사하는 방법 및 분석법을 제공하고, 이때 1가지 이상의 이같은 바이오마커의 발현은 조직 또는 세포 샘플이 Apo2L/TRAIL 또는 항-DR5 작동제 항체와 같은 작용제에 민감성일지 여부를 예측한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 방법 및 분석법은 GalNac-T 족의 단백질의 분자, 특히 GalNAc-T14 또는 GalNAc-T3의 발현을 조사한다.
상기 논의된 바와 같이, 대부분의 정상적인 인간 세포 유형은 특정한 재조합 형태의 Apo2L/TRAIL에 의한 세포자멸사 유도에 대해 저항성인 것으로 보인다 ([Ashkenazi et al., 상기 문헌]; [Walzcak et al., 상기 문헌]). 인간의 질환 세포 유형의 일부 집단 (예컨대 암 세포의 특정 집단)이 특정한 재조합 형태의 Apo2L/TRAIL에 의한 세포자멸사 유도에 저항성이라는 것이 또한 관찰되었다 ([Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 1999, 상기 문헌]; [Walczak et al., Nature Med., 1999, 상기 문헌]). 결과적으로, 선택된 바이오마커의 발현에 대해 분석법에 의해 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 조사함으로써, 환자를 치료하기 위한 적합한 또는 효과적인 요법을 평가하는데 유용한 정보를 간편하게, 그리고 효율적으로 수득할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 조직 또는 세포 샘플에서의 GalNac-T14 발현을 검출하는 분석법으로부터 수득된 정보는 암 또는 면역-관련 질환과 같은 장애, 예컨대 자가-면역 장애를 앓고 있는 환자에 대한 최적의 치료법 (Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 작동제 항체를 사용하는 것)을 결정하는데 사용될 수 있는 유용한 데이타를 의사에게 제공할 수 있다.
본 발명은 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 작동제 항체에 대한 포유동물 조직 또는 세포 샘플 (예컨대 암 세포)의 민감도를 예측하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 이 방법은 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 수득하는 단계 및 조직 또는 세포를 GalNac-T14의 발현에 대해 조사하는 단계를 포함한다. mRNA 및/또는 단백질 발현을 검출하는 분석법, 효소 활성 분석법 및 본원에 논의된 기타 분석법을 포함하여 다양한 분석법 포맷으로 방법이 수행될 수 있다. 상기 조직 또는 세포에 서의 GalNac-T14의 발현의 결정은 이같은 조직 또는 세포가 Apo2L/TRAIL 및/또는 사멸 수용체 항체의 세포자멸사-유도 활성에 민감할 것임을 예측할 것이다. 최적의 실시양태에서, 조직 또는 세포를 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현에 대해 또한 조사할 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시양태는 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 수득하는 단계, 조직 또는 세포를 GalNac-T14의 발현에 대해 조사하는 단계, 및 상기 조직 또는 세포 샘플이 GalNac-T14를 발현하는 것이 결정되었을 때, 상기 조직 또는 세포 샘플을 유효량의 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 작동제 항체에 노출시키는 단계를 포함하는, 포유동물 조직 또는 세포 샘플에서 세포자멸사를 유도하는 방법을 포함한다. 방법 중 GalNac-T14의 발현을 조사하는 단계는 mRNA 및/또는 단백질 발현을 검출하는 분석법, 효소 활성 분석법 및 본원에 논의된 기타 분석법을 포함하여 다양한 분석법 포맷으로 수행될 수 있다. 최적의 실시양태에서, 조직 또는 세포 샘플을 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현에 대해 조사하는 단계가 방법에 또한 포함된다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 암 조직 또는 세포를 포함한다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 비-소세포 폐암 세포, 췌장암 세포, 유방암 세포, 또는 비-호지킨(non-hodgkin) 림프종 세포를 포함한다.
추가적인 본 발명의 방법은 포유동물로부터 조직 또는 세포 샘플을 수득하는 단계, 조직 또는 세포를 GalNac-T14의 발현에 대해 조사하는 단계, 및 상기 조직 또는 세포 샘플이 GalNac-T14를 발현하는 것이 결정되었을 때, 유효량의 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 작동제 항체를 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 관련 장애 또는 암과 같은 포유동물의 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 방법 중 1가지 이상의 바이오마커의 발현을 조사하는 단계는 mRNA 및/또는 단백질 발현을 검출하는 분석법, 효소 활성 분석법 및 본원에 논의된 기타 분석법을 포함하여 다양한 분석법 포맷으로 수행될 수 있다. 최적의 실시양태에서, 조직 또는 세포 샘플을 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현에 대해 조사하는 단계가 방법에 또한 포함된다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 암 조직 또는 세포을 포함한다. 임의로, 포유동물에서 암을 치료하는 단계가 방법에 포함된다. 임의로, 유효량의 Apo2L/TRAIL 및/또는 사멸 수용체 작동제 항체를 투여하는 단계에 더하여, 상기 포유동물에게 화학요법제(들) 또는 방사선 요법을 투여하는 단계가 방법에 포함된다.
본 발명의 추가적인 실시양태에서, 상기 언급된 방법들은 포유동물 조직 또는 세포를 또다른 GalNac-T 분자, 예컨대 GalNac-T3의 발현에 대해 조사하는 단계를 포함할 수 있다.
추가적인 실시양태들이 예를 들어 하기의 청구항에서 설명된다:
1. 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 수득하는 단계;
조직 또는 세포 샘플을 조사하여 GalNac-T14의 발현을 검출하는 단계
를 포함하고, 이때 상기 GalNac-T14의 발현은 상기 조직 또는 세포 샘플이 Apo2L/TRAIL의 세포자멸사-유도 활성에 대해 민감성임을 예측하는 것인, Apo2L/TRAIL에 대한 포유동물 조직 또는 세포 샘플의 민감도를 예측하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 GalNac-T14 mRNA의 발현을 검출하는 것에 의해 조사되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 면역조직화학에 의해 조사되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서의 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 세포를 포함하는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 암 세포가 췌장암, 림프종, 또는 비-소세포 폐암 세포 또는 조직인 방법.
7. 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 수득하는 단계;
조직 또는 세포 샘플을 조사하여 GalNac-T14의 발현을 검출하는 단계, 및
상기 GalNac-T14의 발현의 검출에 이어서, 상기 조직 또는 세포 샘플을 유효량의 Apo2L/TRAIL에 노출시키는 단계
를 포함하는, 포유동물 조직 또는 세포 샘플에서 세포자멸사를 유도하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 GalNac-T14 mRNA의 발현에 대해 시험하는 것에 의해 조사되는 것인 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 면역조직화학에 의해 조사되는 것인 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서의 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 세포를 포함하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 암 세포가 췌장암, 림프종, 또는 비-소세포 폐암 세포 또는 조직인 방법.
13. 제7항에 있어서, 상기 세포가 도 1의 아미노산 114-281을 포함하는 유효량의 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드에 노출되는 것인 방법.
14. 포유동물로부터 조직 또는 세포 샘플을 수득하는 단계;
조직 또는 세포 샘플을 조사하여 GalNac-T14의 발현을 검출하는 단계, 및
상기 GalNac-T14의 발현의 검출에 이어서, 상기 포유동물에게 유효량의 Apo2L/TRAIL을 투여하는 단계
를 포함하는, 면역 관련 장애 또는 암과 같은 포유동물의 장애를 치료하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 GalNac-T14 mRNA의 발현을 검출하는 것에 의해 조사되는 것인 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 면역조직화학에 의해 조사되는 것인 방법.
17. 제14항에 있어서, 상기 조직 또는 세포에서의 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
18. 제14항에 있어서, 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 세포를 포함하는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 암 세포 또는 조직이 췌장암, 림프종 또는 비-소세포 폐암 세포 또는 조직을 포함하는 것인 방법.
20. 제14항에 있어서, 상기 포유동물에게 도 1의 아미노산 114-281을 포함하는 유효량의 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드를 투여하는 방법.
21. 제14항에 있어서, 상기 포유동물에게 화학요법제(들) 또는 방사선 요법을 또한 투여하는 방법.
22. 제14항에 있어서, 상기 포유동물에게 사이토카인, 세포독성제 또는 성장 억제제를 또한 투여하는 방법.
23. 제7항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
24. 제14항에 있어서, 상기 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 것인 방법.
25. 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 수득하는 단계;
조직 또는 세포 샘플을 조사하여 GalNac-T14의 발현을 검출하는 단계
를 포함하고, 이때 상기 GalNac-T14의 발현은 상기 조직 또는 세포 샘플이 사멸 수용체 항체의 세포자멸사-유도 활성에 대해 민감성임을 예측하는 것인, 사멸 수용체 항체에 대한 포유동물 조직 또는 세포 샘플의 민감도를 예측하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 GalNac-T14 mRNA의 발현을 검출하는 것에 의해 조사되는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 면역조직화학에 의해 조사되는 것인 방법.
28. 제25항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서의 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
29. 제25항에 있어서, 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 세포를 포함하는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 암 세포가 췌장암, 림프종 또는 비-소세포 폐암 세포 또는 조직인 방법.
31. 제25항에 있어서, 상기 사멸 수용체 항체가 작동제성 항-DR4 또는 항-DR5 항체인 방법.
32. 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 수득하는 단계;
조직 또는 세포 샘플을 조사하여 GalNac-T14의 발현을 검출하는 단계, 및
상기 GalNac-T14의 발현의 검출에 이어서, 상기 조직 또는 세포 샘플을 유효량의 사멸 수용체 항체에 노출시키는 단계
를 포함하는, 포유동물 조직 또는 세포 샘플에서 세포자멸사를 유도하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 GalNac-T14 mRNA의 발현에 대해 시험하는 것에 의해 조사되는 것인 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 면역조직화학에 의해 조사되는 것인 방법.
35. 제32항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서의 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
36. 제32항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 세포를 포함하는 것인 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 암 세포가 췌장암, 림프종 또는 비-소세포 폐암 세포 또는 조직인 방법.
38. 제32항에 있어서, 상기 세포가 유효량의 작동제 DR4 또는 DR5 항체에 노출되는 것인 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 세포가 도 3A에 제시된 DR5 수용체에 결합하는 유효량의 작동제 DR5 항체에 노출되는 것인 방법.
40. 포유동물로부터 조직 또는 세포 샘플을 수득하는 단계;
조직 또는 세포 샘플을 조사하여 GalNac-T14의 발현을 검출하는 단계, 및
상기 GalNac-T14의 발현의 검출에 이어서, 상기 포유동물에게 유효량의 사멸 수용체 항체를 투여하는 단계
를 포함하는, 면역 관련 장애 또는 암과 같은 포유동물의 장애를 치료하는 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 GalNac-T14 mRNA의 발현을 검출하는 것에 의해 조사되는 것인 방법.
42. 제40항에 있어서, 상기 GalNac-T14 발현이 면역조직화학에 의해 조사되는 것인 방법.
43. 제40항에 있어서, 상기 조직 또는 세포에서의 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
44. 제40항에 있어서, 조직 또는 세포 샘플이 암 조직 또는 세포를 포함하는 것인 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 암 세포 또는 조직이 췌장암, 림프종 또는 비-소세포 폐암 세포 또는 조직을 포함하는 것인 방법.
46. 제40항에 있어서, 상기 포유동물에게 유효량의 항-DR4 또는 DR5 항체를 투여하는 방법.
47. 제40항에 있어서, 상기 포유동물에게 화학요법제(들) 또는 방사선 요법을 또한 투여하는 방법.
48. 제40항에 있어서, 상기 포유동물에게 사이토카인, 세포독성제 또는 성장 억제제를 또한 투여하는 방법.
도 1은 인간 Apo-2 리간드 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 2) 및 이의 유도된 아미노산 서열 (서열 1)을 나타낸다. 뉴클레오티드 위치 447에서의 "N"은 뉴클레오티드 염기가 "T" 또는 "G"일 수 있다는 것을 가리키도록 사용된다.
도 2A 및 2B는 전장 인간 DR4에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 4) 및 이의 유도된 아미노산 서열 (서열 3)을 나타낸다. 인간 DR4에 대한 각각의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 [Pan et al., Science, 276:111 (1997)]에 또한 보고되어 있다.
도 3A는 1998년 11월 19일에 WO 98/51793에서 공개된 바와 같은 인간 DR5의 411개 아미노산 서열 (서열 5)을 나타낸다. 인간 DR5의 전사 스플라이스 변이체가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 DR5 스플라이스 변이체는 1998년 8월 20일에 WO 98/35986에서 공개된 바와 같은, 도 3B 및 도 3C에 제시된 인간 DR5의 440개 아미 노산 서열 (서열 6)을 코딩한다.
도 3D1 내지 3D3은 전장 인간 DcR1에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 7) 및 이의 유도된 아미노산 서열 (서열 8)을 나타낸다. 인간 DcR1 (및 이의 특정 도메인)에 대한 각각의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 WO 98/58062에 또한 제시 및 기술되어 있다.
도 3E1 및 3E2는 전장 인간 DcR2에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 9) 및 이의 유도된 아미노산 서열 (서열 10)을 나타낸다. 인간 DcR2 (및 이의 특정 도메인)에 대한 각각의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 WO 99/10484에 또한 제시되어 있다.
도 4A1 내지 4A4는 인간 GalNac-T14의 뉴클레오티드 서열 (서열 11) 및 이의 유도된 아미노산 서열 (서열 12)을 나타낸다. 이러한 서열은 [Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003)]에 또한 기술되어 있다.
도 4B1 내지 4B4는 인간 GalNac-T3의 뉴클레오티드 서열 (서열 13) 및 이의 유도된 아미노산 서열 (서열 14)을 나타낸다. 이러한 서열은 [Bennett et al., J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996)]에 또한 기술되어 있다.
도 5는 MTT 세포독성 분석법에서 측정된 바와 같은, Apo2L (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS) 또는 가교된 "XL" 또는 가교되지 않은 DR5 모노클로날(monoclonal) 항체 "DR5 ab" (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS)의 세포자멸사성 활성에 대한 민감도 또는 저항성에 대해 비-소세포 폐암 ("NSCLC") 세포주를 분석하는 것에서 수득된 데이타의 IC50 요약 도표를 제공한다.
도 6은 MTT 세포독성 분석법에서 측정된 바와 같은, Apo2L (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS) 또는 가교된 "XL" 또는 가교되지 않은 DR5 모노클로날 항체 "DR5 ab" (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS)의 세포자멸사성 활성에 대한 민감도 또는 저항성에 대해 췌장암 세포주를 분석하는 것에서 수득된 데이타의 IC50 요약 도표를 제공한다.
도 7은 MTT 세포독성 분석법에서 측정된 바와 같은, Apo2L (+ 10％ 소 태아 혈청 "FBS") 또는 가교된 "XL" 또는 가교되지 않은 DR5 모노클로날 항체 "DR5 ab" (+ 10％ 소 태아 혈청 "FBS")의 세포자멸사성 활성에 대한 민감도 또는 저항성에 대해 비-호지킨 림프종 암 ("NHL") 세포주를 분석하는 것에서 수득된 데이타의 IC50 요약 도표를 제공한다.
도 8A 및 8B는 GalNac-T14 mRNA 발현에 의해 측정된 바와 같은, DR5 항체에 대한 선택된 NSCLC, 췌장암, 및 NHL 세포주의 민감도 ("sen") 또는 저항성 ("RES")의 비교, 및 GalNac-T14의 발현에 대한 상관관계를 제공한다.
도 9A 및 9B는 GalNac-T14 mRNA 발현 패턴의 수준에 의해 순위 (내림차순)가 매겨진 다양한 NSCLC, 췌장암, 및 NHL 세포주의 막대 도표 그래프를 제공한다.
도 10A-D는 Apo2L/TRAIL-민감성 및 -저항성 암 세포주에서의 특정 O-글리코실화 효소의 차별적인 발현을 도해한다: (A) 다양한 용량의 Apo2L/TRAIL과의 인큐베이션 후 세포 생존력을 측정하였다. 각각의 세포주에 대한 IC50을 생존력의 50％ 손실을 제공하는 Apo2L/TRAIL의 농도로서 컴퓨터처리하였다. 각각의 세포 생존력 실험을 저농도 (0.5％) 및 고농도 (10％) 소 태아 혈청의 존재 하에 3회 이상 반복하였다. 흑색, 회색 또는 백색 기호는 Apo2L/TRAIL에 대해 고도로 민감성인 세포주, 중등도로 민감성인 세포주 또는 저항성인 세포주를 각각 나타낸다. (B) 췌장 및 악성 흑색종 세포주에서의 ppGalNAcT-14 mRNA 발현 수준 (프로브 셋트 219271_at). 세포주는 조직 유형 및 Apo2L/TRAIL에 대한 민감도에 의해 정렬된다. 흑색, 회색, 또는 백색 막대는 A에서와 같은 세포주를 묘사한다. (C) 결장직장암 세포주에서의 Fut-6 (상부 패널, 프로브 셋트 211885_x_at) 및 ppGalNAcT-3 (하부 패널, 프로브 셋트 203397_s_at)의 mRNA 발현 수준. 세포주는 B에서와 같이 정렬된다. 패널 B 및 C에서의 P값은 절사점을 초과하는 mRNA 발현과 세포주 민감도 (고도 및 중등도 포함) 간의 상관관계의 피셔(Fisher) 검증을 기초로 한다. (D) 확립된 종양 이종이식편의 성장에 대한 Apo2L/TRAIL의 효과. GalNAcT-3/Fut-6-양성 (좌측 패널) 또는 GalNAcT-3/Fut-6-음성 (우측 패널) 종양이 있는 무흉선 누드 마우스에게 비히클(vehicle) 또는 Apo2L/TRAIL (60 ㎎/㎏/일, 제0일-제4일에 복강내)을 제공하고, 종양 부피를 모니터링하였다 (평균 + SE, N= 마우스 10 마리/군).
도 11은 특정 O-글리코실화 효소의 조정이 Apo2L/TRAIL에 대한 민감도를 변화시킨다는 것을 도해한다. (A) Colo205 세포를 pan O-글리코실화 효소 억제제 벤질-GalNAc (bGalNAc)와 함께 예비 인큐베이션시키고, Apo2L/TRAIL로 24시간 동안 처리하고, 세포 생존력을 결정하였다 (DMSO = 비히클 대조군). (B) PSN-1 (췌장암종) 및 Hs294T (흑색종) 세포를 카스파제-8 또는 ppGalNAcT-14 siRNA로 48시간 동안 형질감염시키고, Apo2L/TRAIL과 함께 24시간 동안 인큐베이션하고, 세포 생존력을 결정하였다. 비-표적화 서열에 대한 siRNA 듀플렉스 (Dharmacon)를 대조군 (NTC)으로 사용하였다. (C) DLD-1 결장직장암종 세포를 ppGalNAcT-3 또는 Fut-6으로 siRNA에 의해 형질감염시키고, B에서와 같이 시험하였다. (D) HEK293 세포를 ppGalNAcT-14 또는 벡터 대조군과 함께 지시된 유전자를 코딩하는 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 세포자멸사를 24시간에 아넥신 V 염색에 의해 측정하였다 (좌측 패널). H1569 흑색종 세포에 ppGalNAcT-14 발현을 지시하는 레트로바이러스 또는 대조군 레트로바이러스를 형질도입시켰다; 생성된 세포주 풀(pool)을 Apo2L/TRAIL로 24시간 동안 처리하고, 세포 생존력을 결정하였다 (우측 패널). 항-FLAG 항체를 사용하는 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 사용하여 에피토프-태그가 부착된 ppGalNAcT-14의 발현을 입증하였다.
도 12는 (A) Apo2L/TRAIL에 의해 유도된 카스파제 캐스케이드의 분석을 도해한다. PSN-1 및 DLD-1 세포를 각각 ppGalNAcT-14 또는 Fut-6에 대한 siRNA로 48시간 동안 형질감염시켰다. 세포를 Apo2L/TRAIL로 4시간 또는 8시간 동안 처리하고, 세포 용해물을 카스파제-8, Bid, 카스파제-9, 카스파제-3, 또는 로딩 대조군으로서의 액틴에 대해 특이적인 항체로 면역블롯에 의해 분석하였다. (B) PSN-1 세포를 A에서와 같이 ppGalNAcT-14 siRNA로 형질감염시키고, Apo2L/TRAIL로 4시간 동안 처리하고, 세포 용해물에서의 카스파제-3/7 효소 활성을 결정하였다. (C) Apo2L/TRAIL DISC의 분석. PSN-1 세포를 A에서와 같이 ppGalNAcT-14 siRNA로 형질감염시켰다. FLAG-Apo2L/TRAIL (1 ㎎/㎖)을 0-60분 동안 첨가하고, 세포를 용해시키고, 항-FLAG 항체로 면역침전시켰다. DISC-회합 FADD, 카스파제-8, DR4를 면역블롯에 의해 검출하였다. (D) PSN-1 세포를 C에서와 같이 형질감염, 처리 및 DISC 면역침전시키고, DISC-회합 카스파제-8 효소 활성을 기존에 기술된 바와 같이 측정하였다 ([Sharp et al., J. Biol. Chem., 280:19401 (2005)]).
도 13은 (A) HPAEC-PAD (고성능 음이온-교환 크로마토그래피-펄스형 전류측정 검출)에 의해 수행된, CHO 세포에서 생산된 재조합 인간 DR5 (긴 스플라이스 변이체)의 단당류 분석을 도해한다. (B) 인간 Apo2L/TRAIL 수용체 (인간 DR5의 긴 아미노산 440개 형태 "hDR5L", 인간 DR5의 짧은 아미노산 411개 형태 "hDR5S" 및 hDR4), 뮤린 DR5 (mDR5), 인간 Fas (hFas) 및 인간 TNFR1 (hTNFR1)의 서열 비교. 상자는 추정 O-글리코실화 부위를 가리킨다. (C) D에 상응하는 전체 세포 용해물의 면역블롯 분석. DR5L-5T 및 DR5S-5T는 잠재적인 O-글리코실화 부위인 잔기 내에 5개의 트레오닌→알라닌 치환을 함유하는 구축물이고, DR5L-5T3S 및 DR5S-5T3S는 5개의 트레오닌→알라닌 및 3개의 세린→알라닌 치환을 함유하는 구축물이다. (D) HEK293 세포를 벡터 또는 ppGalNAcT-14 플라스미드와 함께 지시된 DR5 구축물로 48시간 동안 공동-형질감염시키고, 세포자멸사를 아넥신 V 염색에 의해 측정하였다. (E) 피부 (SCC = 편평세포암종), 폐, 췌장 (Panc), 유방, 난소 (Ov), 자궁내막 (Endo), 방광 (Bla, TCC = 이행세포암종) 및 NHL (FL = 여포성 림프종, DLBCL = 미만성 거대 B-세포 림프종)의 암으로부터의 원발성 인간 종양 샘플에서의 ppGalNAcT-14에 대한 mRNA 발현 수준 (어피메트릭스(Affymetrix) 칩, 프로브 셋트 219271_at). 샘플의 중앙값 발현이 각각의 클래스에 대해 회색 수평 막대로 지시된다. 도 10B로부터의 세포주 데이타에 상응하는 500 및 200 (흑색종)의 절사값이 표시된다.
도 14는 (A) Taqman 분석법에 의한 48시간 siRNA 녹다운(knockdown) 후의 PSN-1 또는 DLD-1 세포에서의 ppGalNAcT-14 또는 ppGalNAcT-3의 mRNA 발현 감소를 도해한다. (B) 공(Empty) 플라스미드, 야생형 GalNAcT-14 (GalNAcT-14), 또는 ppGalNAcT-14의 siGalNAcT-14 (1) 매개 녹다운에 이은 siRNA 침묵 돌연변이를 함유하는 GalNAcT-14 (GalNAcT-14 si(1)Mut)의 형질감염에 의해 PSN-1 세포에서 GalNAcT-14 발현이 재구성된다. (C) 간섭 RNA에 의한 ppGalNAcT-3 또는 Fut-6의 하향 조절이 C170 (결장직장암) 세포에서 Apo2L/TRAIL 유도 세포 사멸을 억제한다. 11C에서와 같은 실험 절차. (표 1) A) siRNA 녹다운 표현형의 요약표. GalNAcT-14 또는 ppGalNAcT-3 및 Fut-6의 하향조절로 Apo2L/TRAIL로부터의 보호가 초래된 세포주가 1가지 이상의 시험된 siRNA 올리고뉴클레오티드로의 50％ 미만 (+) 또는 초과 (++)의 보호를 가리키면서 표시된다. (0)은 Apo2L/TRAIL에 대한 보호의 부재를 가리킨다. (D), (E) 지시된 siRNA로의 48시간 녹다운에 이어서, 세포를 증가되는 용량의 에토포시드 또는 스타우로스포린 (STS)으로 24시간 동안 처리하고, 세포 생존력 분석법에 적용하였다. (F) Apo2L/TRAIL 처리 후 레트로바이러스 ppGalNAcT-14 과발현 PA-TU-8902 및 PL-45 세포주 풀을 세포 생존력 분석법에 적용하였다. 항-FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석법은 이러한 세포 내의 레트로바이러스 발현 ppGalNAcT-14를 가리켰다.
도 15 (A) Apo2L/TRAIL 민감성 Colo205 및 저항성 결장직장암 세포주 RKO 및 SW1417에서의 Apo2L/TRAIL 유도 카스파제 활성화 캐스케이드의 웨스턴 블롯 분석. 세포를 1000 ng/㎖ Apo2L/TRAIL로 8시간 및 24시간 동안 처리하고, 전체 세포 용해 물을 카스파제-8, Bid, 카스파제-9, 카스파제-3 및 로딩 대조군으로서의 액틴에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. (B) Fut-6의 녹다운이 DLD-1 세포에서 Apo2L/TRAIL DISC에서의 카스파제-8의 동원 및 활성화를 감소시켰다. 12D에 따른 실험 절차. (C) 지시된 유전자로의 siRNA 녹다운에 적용된 세포에서 FACS 분석에 의해 DR4 및 DR5의 세포 표면 발현을 측정하였다.
본원에서 기술(記述) 또는 참조된 기술 및 절차는 당업자에게 일반적으로 잘 이해되고, 통상적인 방법론, 예를 들어 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기술된 광범위하게 활용되는 분자 클로닝 방법론을 사용하여 통상적으로 이용된다. 적절한 경우, 시판되는 키트 및 시약의 사용을 수반하는 절차는 달리 주지되지 않는 한 제조사에 의해 규정된 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 수행된다.
본 발명의 방법 및 분석법이 기술되기 전에, 본 발명이 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구축물, 및 시약에, 이들이 당연히 변할 수 있기 때문에, 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이고, 첨부된 청구항에 의해서만 한정될 본 발명의 범주를 한정하도록 의도되지 않는다는 것을 이해하여야 한다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수 형태의 부정관사 및 정관사는 문맥적으로 명백하게 가리키지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 주지하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "유전자 변형"에 대한 언급은 다수의 이같은 변형을 포함하고, "프로브"에 대한 언급은 1가지 이상의 프로브 및 당업자에게 공지된 이의 등가물을 가리킨다.
본원에서 언급된 모든 간행물은 간행물이 관련되어 인용된 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하기 위해 거명에 의해 본원에 포함된다. 본원에서 인용된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 간행물의 개시 내용에 대해 인용된다. 본원에서 어떤 것도 본 발명자들이 본 발명의 최우선일 또는 우선일에 의해 간행물을 선행할 권리가 없다는 것을 승인하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 또한, 실제 공개일은 제시된 것과 상이할 수 있고, 별도의 확인을 필요로 할 수 있다.
I. 정의
용어 "Apo2L/TRAIL", "Apo-2L" 및 "TRAIL"은 도 1에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 114-281 (경계 포함), 95-281 (경계 포함), 잔기 92-281 (경계 포함), 잔기 91-281 (경계 포함), 잔기 41-281 (경계 포함), 잔기 15-281 (경계 포함), 또는 잔기 1-281 (경계 포함)을 포함하는 폴리펩티드 서열, 뿐만 아니라 상기 서열의 생물학적으로 활성인 단편, 결실, 삽입 또는 치환 변이체를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 도 1의 잔기 114-281을 포함하고, 임의로 도 1의 잔기 114-281로 구성된다. 임의로, 폴리펩티드 서열은 도 1의 잔기 92-281 또는 잔기 91-281을 포함한다. Apo-2L 폴리펩티드는 도 1에 제시된 천연 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 임의로, 잔기 Pro119 (도 1)를 코딩하는 코돈은 "CCT" 또는 "CCG"일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 단편 또는 변이체는 생물학적으로 활성이고, 상기 열거된 Apo2L/TRAIL 서열 중 임의의 하나와의 아미노산 서열 동일성이 적어도 약 80％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90％, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％이다. 임의로, Apo2L/TRAIL 폴리펩티드는 엄격한 조건 하에 도 1에 제공된 코딩 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 상기 정의는 Apo2L/TRAIL의 천연 아미노산 중 1개 이상이 알라닌 잔기로 치환된 Apo2L/TRAIL의 치환 변이체를 포함한다. Apo2L/TRAIL의 특정 치환 변이체에는 1개 이상의 아미노산이 알라닌 잔기에 의해 치환된 것들이 포함된다. 이러한 치환 변이체에는, 예를 들어, 예를 들어 "D203A", "D218A" 및 "D269A"로 확인된 것들이 포함된다. 이러한 명명법은 위치 203, 218 및/또는 269 (도 1에 제시된 번호매김 사용)의 아스파르트산 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 Apo2L/TRAIL 변이체를 확인하는데 사용된다. 임의로, Apo2L 변이체는 공개된 PCT 출원 WO 01/00832의 표 I에 열거된 알라닌 치환 중 1개 이상을 포함할 수 있다. 치환 변이체는 WO 01/00832 (2001년 1월 4일 공개)의 표 I에 확인된 잔기 치환 중 1개 이상을 포함한다. 상기 정의는 Apo2L/TRAIL 공급원으로부터 단리되었거나 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 천연 서열 Apo2L/TRAIL을 또한 포함한다. 본 발명의 Apo2L/TRAIL은 PCT 공개공보 WO 97/01633 및 WO 97/25428에 개시된 Apo2L/TRAIL 또는 TRAIL로 지칭되는 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "Apo2L/TRAIL" 또는 "Apo2L"은 폴리펩티드의 단량체, 이량체 또는 삼량체 형태를 포함하는 Apo2L/TRAIL의 형태를 일반적으로 지칭하도록 사용된다. Apo2L 서열에서 지칭되는 아미노산 잔기의 모든 번호매김은, 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 도 1에 따른 번호매김을 사용한다. 예를 들어, "D203" 또는 "Asp203"은 도 1에서 제공된 서열 내의 위치 203의 아스파르트산 잔기를 지칭한다.
용어 "Apo2L/TRAIL 세포외 도메인" 또는 "Apo2L/TRAIL ECD"는 본질적으로 막횡단 도메인 및 세포질 도메인이 없는 Apo2L/TRAIL의 형태를 지칭한다. 통상적으로, ECD는 1％ 미만의 이같은 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 가질 것이고, 바람직하게는 0.5％ 미만의 이같은 도메인을 가질 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 확인된 모든 막횡단 도메인(들)은 이러한 유형의 소수성 도메인을 확인하기 위해 당업계에서 일상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된다는 것이 이해될 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 변할 수 있지만, 아마도 초기에 확인된 도메인의 어느 한쪽 말단에서 약 5개 이하의 아미노산만큼 변할 것이다. 바람직한 실시양태에서, ECD는 막횡단 도메인 및 세포질 또는 세포내 도메인이 없는 (그리고 막에 결합되지 않은) 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인 서열로 구성될 것이다. Apo-2L/TRAIL의 특정 세포외 도메인 서열이 PCT 공개공보 WO 97/01633 및 WO 97/25428에 기술되어 있다.
용어 "Apo2L/TRAIL 단량체" 또는 "Apo2L 단량체"는 Apo2L의 세포외 도메인 서열의 공유결합 사슬을 지칭한다.
용어 "Apo2L/TRAIL 이량체" 또는 "Apo2L 이량체"는 디술피드 결합을 통해 공유 결합으로 연결된 2개의 Apo-2L 단량체를 지칭한다. 본원에서 사용된 이 용어는 유리 Apo2L 이량체, 및 Apo2L의 삼량체 형태 내에 존재하는 (즉, 또다른 제3의 Apo2L 단량체와 회합된) Apo2L 이량체를 포함한다.
용어 "Apo2L/TRAIL 삼량체" 또는 "Apo2L 삼량체"는 비-공유결합으로 회합된 3개의 Apo2L 단량체를 지칭한다.
용어 "Apo2L/TRAIL 응집체"는 Apo2L/TRAIL의 자가-회합된 더욱 고급의 올리고머 형태, 예컨대 Apo2L/TRAIL 삼량체를 지칭하도록 사용되고, 이는 Apo2L/TRAIL의 육량체 및 구량체 형태를 예를 들어 형성한다. Apo2L/TRAIL 단량체, 이량체, 또는 삼량체 (또는 기타 응집체)의 존재 및 양의 측정은 당업계에 공지된 방법 및 분석법, 예컨대 천연 크기 배제 HPLC ("SEC"), 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 변성 크기 배제 ("SDS-SEC"), 역상 HPLC 및 모세관 전기영동을 사용하여 (그리고 시판되는 재료를 사용하여) 이루어질 수 있다.
"Apo-2 리간드 수용체"는 "DR4" 및 "DR5"로 당업계에서 지칭되는 수용체를 포함하고, 이의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열이 각각 도 2 및 3에 제시된다. [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)]에 "DR4"로 지칭되는 TNF 수용체 족 구성원이 기술되어 있다 (또한 WO 98/32856 (1998년 7월 30일 공개); WO 99/37684 (1999년 7월 29일 공개); WO 00/73349 (2000년 12월 7일 공개); US 6,433,147 (2002년 8월 13일 허여); US 6,461,823 (2002년 10월 8일 허여) 및 US 6,342,383 (2002년 1월 29일 허여) 참조). [Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)] 및 [Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)]에 Apo2L/TRAIL에 대한 또다른 수용체가 기술되어 있다 (또한 WO 98/51793 (1998년 11월 19일 공개); WO 98/41629 (1998년 9월 24일 공개) 참조). 이러한 수용체는 DR5로 지칭된다 (이 수용체는 별법적으로 Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 또는 KILLER로 또한 지칭되었다; [Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997)]; [Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997)]; [Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997)]; WO 98/35986 (1998년 8월 20일 공개); EP 870,827 (1998년 10월 14일 공개); WO 98/46643 (1998년 10월 22일 공개); WO 99/02653 (1999년 1월 21일 공개); WO 99/09165 (1999년 2월 25일 공개), WO 99/11791 (1999년 3월 11일 공개); US 2002/0072091 (2002년 8월 13일 공개); US 2002/0098550 (2001년 12월 7일 공개); US 6,313,269 (2001년 12월 6일 허여); US 2001/0010924 (2001년 8월 2일 공개); US 2003/01255540 (2003년 7월 3일 공개); US 2002/0160446 (2002년 10월 31일 공개), US 2002/0048785 (2002년 4월 25일 공개), US 6,569,642 (2003년 5월 27일 허여), US 6,072,047 (2000년 6월 6일 허여), US 6,642,358 (2003년 11월 4일 허여)). 상기 기술된 바와 같이, Apo-2L에 대한 기타 수용체에는 DcR1, DcR2 및 OPG가 포함된다 ([Sheridan et al., 상기 문헌], [Marsters et al., 상기 문헌] 및 [Simonet et al., 상기 문헌] 참조). 본원에서 사용될 때의 용어 "Apo-2L 수용체"는 천연 서열 수용체 및 수용체 변이체를 포함한다. 이러한 용어는 인간을 포함하는 다양한 포유동물에서 발현된 Apo-2L 수용체를 포함한다. Apo-2L 수용체는 다양한 인간 조직 계통에서 천연적으로 발생하는 바와 같이 내인성으로 발현될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 발현될 수 있다. "천연 서열 Apo-2L 수용체"는 천연에서 유도된 Apo-2L 수용체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 Apo-2L 수용체는 임의의 포유동물로부터의 천연 발생 Apo-2L 수용체의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이같은 천연 서열 Apo-2L 수용체는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 Apo-2L 수용체"는 수용체의 천연-발생 말단절단 또는 분비 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열을 예를 들어 함유하는 가용성 형태), 천연-발생 변이체 형태 (예를 들어, 교대 스플라이싱(splicing)된 형태) 및 천연-발생 대립유전자 변이체를 특히 포함한다. 수용체 변이체는 천연 서열 Apo-2L 수용체의 단편 또는 결실 돌연변이체를 포함할 수 있다. 도 3A는 WO 98/51793 (1998년 11월 19일 공개)에서 공개된 바와 같은 인간 DR5의 아미노산 411개의 서열을 나타낸다. 인간 DR5의 전사 스플라이스 변이체가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 DR5 스플라이스 변이체는 WO 98/35986 (1998년 8월 20일 공개)에서 공개된 바와 같이 도 3B 및 3C에 제시된 인간 DR5의 아미노산 440개의 서열을 코딩한다.
"사멸 수용체 항체"는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리의 수용체에 대해 지시되고 세포자멸사의 신호를 전달할 수 있는 사멸 도메인을 포함하는 항체 또는 항체들을 일반적으로 지칭하도록 본원에서 사용되고, 이같은 항체는 DR5 항체 및 DR4 항체를 포함한다.
"DR5 수용체 항체", "DR5 항체" 또는 "항-DR5 항체"는 DR5 수용체의 1가지 이상의 형태, 예컨대 도 3A에 제시된 1-411 서열 또는 도 3B-3C에 제시된 1-440 서열, 또는 이의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 지칭하도록 넓은 의미로 사용된다. 임의로, DR5 항체는 이종 서열 또는 분자에 융합 또는 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 항체가 더 높은 차원의 또는 올리고머성 복합체를 형성하도록 하거나 이를 돕는다. 임의로, DR5 항체는 DR5 수용체에 결합하지만, 임의의 추가적인 Apo-2L 수용체 (예를 들어, DR4, DcR1 또는 DcR2)에는 결합하거나 교차반응하지 않는다. 임의로, 항체는 DR5 신호전달 활성의 작동제이다.
임의로, 본 발명의 DR5 항체는 BIAcore 결합 분석법으로 측정시 약 0.1 nM 내지 약 20 mM의 농도에서 DR5 수용체에 결합한다. 임의로, 본 발명의 DR5 항체는 BIAcore 결합 분석법으로 측정시 약 0.6 nM 내지 약 18 mM의 IC50 값을 나타낸다.
"DR4 수용체 항체", "DR4 항체" 또는 "항-DR4 항체"는 DR4 수용체의 1가지 이상의 형태 또는 이의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 지칭하도록 넓은 의미로 사용된다. 임의로, DR4 항체는 이종 서열 또는 분자에 융합 또는 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 항체가 더 높은 차원의 또는 올리고머성 복합체를 형성하도록 하거나 이를 돕는다. 임의로, DR4 항체는 DR4 수용체에 결합하지만, 임의의 추가적인 Apo-2L 수용체 (예를 들어, DR5, DcR1 또는 DcR2)에는 결합하거나 교차반응하지 않는다. 임의로, 항체는 DR4 신호전달 활성의 작동제이다.
임의로, 본 발명의 DR4 항체는 BIAcore 결합 분석법으로 측정시 약 0.1 nM 내지 약 20 mM의 농도에서 DR4 수용체에 결합한다. 임의로, 본 발명의 DR4 항체는 BIAcore 결합 분석법으로 측정시 약 0.6 nM 내지 약 18 mM의 IC50 값을 나타낸다.
용어 "작동제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 시험관내에서, 계내에서(in situ) 또는 생체내에서 Apo2L/TRAIL, DR4 또는 DR5의 1가지 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 증강시키거나, 자극하거나 활성화시키는 임의의 분자를 포함한다. 이같은 생물학적 활성의 예는 Apo2L/TRAIL의 DR4 또는 DR5에의 결합이고, 세포자멸사뿐만 아니라 문헌에 추가로 보고된 것들이 포함된다. 작동제는 직접 또는 간접 방식으로 기능할 수 있다. 예를 들어, 작동제는 DR4 또는 DR5에 직접 결합하여 수용체 활성화 또는 신호 전달을 야기하는 것의 결과로서, 시험관내에서, 계내에서 또는 생체내에서 DR4 또는 DR5의 1가지 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 증강시키거나, 자극하거나 활성화시키는 기능을 할 수 있다. 또한 작동제는, 예를 들어, 또다른 이펙터(effector) 분자를 자극하고, 이어서 이러한 이펙터 분자가 DR4 또는 DR5 활성화 또는 신호 전달을 야기하는 것의 결과로서, 간접적으로 시험관내에서, 계내에서 또는 생체내에서 DR4 또는 DR5의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 증강시키거나, 자극하거나 활성화시키는 기능을 할 수 있다. 작동제가 DR4 또는 DR5 활성화 또는 활성을 간접적으로 증강 또는 증가시키는 기능을 하는 인핸서(enhancer) 분자로서 작용할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 작동제는 포유동물에서 내인성 Apo-2L의 활성을 증강시킬 수 있다. 이는, 예를 들어, DR4 또는 DR5를 예비-복합체화시킴으로써 또는 DR4 또는 DR5 수용체와 각각의 리간드의 복합체를 안정화시킴으로써 (예컨대 Apo-2L과 DR4 또는 DR5 사이에 형성된 천연 복합체를 안정화시킴으로써) 달성될 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어 "바이오마커"는 포유동물 조직 또는 세포 내 또는 상에서의 발현을 표준 방법 (또는 본원에 개시된 방법)에 의해 검출할 수 있고, 이러한 검출이 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체에 대한 포유동물 세포 또는 조직의 민감도를 예측하는 것인, 유전자, 단백질, 탄수화물 구조, 또는 당지질을 포함하는 분자를 일반적으로 지칭한다. 본 발명에 의해 구현되는 이같은 바이오마커에는 GalNac-T 족의 단백질에 속하는 분자가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 인간 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스페라제 ("GalNac-T") 족의 유전자 및 단백질의 구성원이 기술되어 있고 (예를 들어, [Hang et al., "The chemistry and biology of mucin-type O-linked glycosylation initiated by the polypetide N-acetyl- -galactosaminyltransferases", Bioorganic & Medicinal Chemistry] (2005년 5월 www.sciencedirect.com에서 입수가능) 및 이에 인용된 참고문헌; [Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003)] 및 이에 인용된 참고문헌 참조), 단백질 내의 O-연결 당 사슬의 개수 및 위치를 결정하는데 기능하는 것으로 생각된다. 임의로, 이같은 바이오마커의 발현은 대조군 조직 또는 세포 샘플에 대해 관찰된 것보다 더 높은 것으로 결정된다. 임의로, 예를 들어, 이같은 바이오마커의 발현은 유전자 발현 마이크로어레이(microarray), 정량적 PCR 또는 면역조직화학 (IHC) 분석법을 사용하여 결정될 것이다. 임의로, GalNac-T 바이오마커, 예컨대 GalNac-T14 또는 GalNac-T3의 발현은 정량적 PCR을 사용하여 바이오마커의 발현을 검출했을 때 대조군 조직 또는 세포 샘플에 대해 관찰된 것보다 시험 조직 또는 세포 샘플에서, 어피메트릭스 U133P 마이크로어레이 분석에 의해 측정시, 적어도 750배 또는 500배, 바람직하게는 적어도 1000배 더 높은 수준으로 검출될 것이다.
"UDP-N-아세틸-D-갈락토스아민 폴리펩티드 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스페라제-T14", "pp-GalNac-T14", "GalNac-T14", "GALNT14"는 N-말단 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 줄기 영역 및 촉매 도메인을 포함하는 GalNac-T 족 분자의 특징적인 특색을 갖는 제II형 막 단백질을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 임의의 실시양태에서, 인간 GalNac-T14 분자는, 도 4A1 내지 4A4에 제시된 바와 같이, 아미노산 552개의 단백질을 코딩하는 1659개의 염기쌍을 함유한다. 전장 인간 cDNA가 젠뱅크(GenBank)에 접속 번호 AB078144로 기탁되었다. [Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003)]에 기술된 바와 같이, 특정 엑손, 예컨대 엑손 2, 3, 및/또는 4를 포함하는 (또는 포함하지 않는) GalNac-T14의 스플라이싱 이소형(isoform)이 확인되었다. 본 발명은 GalNac-T14의 임의의 이같은 다양한 이소형의 발현의 조사, 및 임의의 한 이같은 이소형의 발현이 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체에 대한 포유동물 또는 세포 샘플의 민감도를 예측하는 것을 구현한다.
"UDP-N-아세틸-D-갈락토스아민 폴리펩티드 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스페라제-T3", "pp-GalNac-T3", "GalNac-T3", "GALNT3"은 N-말단 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 줄기 영역 및 촉매 도메인을 포함하는 GalNac-T 족 분자의 특징적인 특색을 갖는 제II형 막 단백질을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 임의의 실시양태에서, 인간 GalNac-T3 폴리펩티드는 도 4B1 내지 4B4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. GalNac-T3은 [Bennett et al., J. Biol. Chemistry, 271:17006-17012 (1996)]에 추가로 기술되어 있다.
"대상" 또는 "환자"는 인간을 포함하여 치료법이 요망되는 임의의 단일 대상을 의미한다. 질환의 어떠한 임상 징후도 나타내지 않는 임상 연구 시험에 포함된 임의의 대상, 또는 역학 연구에 포함된 대상, 또는 대조군으로 사용되는 대상이 또한 대상으로 포함되도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "포유동물"은 인간, 소, 말, 개 및 고양이를 포함하여, 포유동물로 분류된 임의의 포유동물을 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 수득된 유사한 세포의 수집물을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선하고/하거나, 동결되고/되거나, 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분; 체액, 예컨대 뇌척수액, 양수, 복막액, 또는 간질액; 대상의 임신 또는 발달 중 임의 시점으로부터의 세포일 수 있다. 또한 조직 샘플은 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 수득된다. 조직 샘플은 천연에서 조직과 본래 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 방부제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다.
본원에서의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조직, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단된 조직 또는 세포의 박편을 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 수준 및 분자 수준 모두에서 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함하는 것으로 이해되는 한, 조직 샘플의 다중 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석법에 적용할 수 있는 것으로 이해된다.
"상관시키다" 또는 "상관시키는"은, 제1 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 임의의 방식으로 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 제2 프로토콜을 수행하는데 사용할 수 있고/있거나, 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용하여 제2 분석 또는 프로토콜이 수행되어야하는지 여부를 결정할 수 있다. 본원에서의 다양한 실시양태와 관련하여, 분석적 분석법, 예컨대 mRNA 발현 또는 IHC의 결과를 사용하여 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체를 사용하는 특정 치료법이 수행되어야 하는지 여부를 결정할 수 있다.
"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 박테리아 핵산이 조직 샘플 내에 존재한다. 용어 "핵산"은 이중 가닥 핵산 분자의 한쪽 가닥 또는 양쪽 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부분을 포함한다.
"유전자"는 단백질의 코딩 또는 전사 또는 다른 유전자 발현의 조절에서 기능성 역할이 있는 임의의 핵산 서열 또는 이의 일부분을 의미한다. 유전자는 기능성 단백질의 코딩을 담당하는 모든 핵산으로 구성될 수 있거나, 또는 단백질 코딩 또는 발현을 담당하는 핵산의 일부분만으로 구성될 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종결 영역, 프로모터 서열, 기타 조절 서열 또는 유전자에 인접한 독특한 영역 내에 유전자 이상을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 단어 "표지"는 핵산 프로브 또는 항체와 같은 시약에 직접적으로 또는 간접적으로 접합 또는 융합되고, 표지가 접합 또는 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 자체가 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 명확하게는 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날(polyclonal) 항체, 2개 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (단, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 경우에 한함)을 포함한다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부분을 포함하며, 바람직하게는 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
일반적으로 "천연 항체"는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결의 개수는 여러 면역글로불린 이소타입의 중쇄들 간에 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된(spaced) 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 다수의 불변 도메인이 이어지는 가변 도메인 (VH)을 한쪽 말단에 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 다른 쪽 말단에는 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간에서 서열이 크게 상이하고 각각의 특정 항체의 이의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역으로 칭해지는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인에서 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해진다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 형상을 주로 채택한 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른쪽 사슬로부터의 초가변 영역들과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다 ([Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 수반되지는 않지만, 항체 의존성 세포형 세포 독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
항체를 파파인(papain)으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 칭해지는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생성되는데, Fc라는 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원과 가교할 수 있는 F(ab')2 단편이 산출된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비-공유결합으로 회합되어 있는 이량체로 구성된다. 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정하는 것은 이러한 형상 내이다. 총괄적으로, 6개의 초가변 영역이 항원-결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변성 영역만을 포함한 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화력이지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기들이 부가되어 있어서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 하나 이상의 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 시스테인을 사이에 갖는 Fab' 단편들의 쌍으로서 본래 생산되었다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 칭해지는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나로 지정될 수 있다.
"중쇄"의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 여러 클래스로 지정될 수 있다. 무손상 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 주요 5개 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 칭해진다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체형태는 주지되어 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 항체의 VH 및 VL 항체 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 개관을 위해서는, [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조.
용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭한다. 동일한 사슬 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성하도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록 강요되고, 2개의 항원-결합 부위가 생성된다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린으로 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. 또한 "모노클로날 항체"는, 예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기술된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 사슬(들)의 나머지부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린), 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 특히 포함된다 (미국 특허 4,816,567; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)]). 본원에서의 당해 키메라 항체에는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구대륙 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화(primitized)" 항체가 포함된다 (미국 특허 5,693,780).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종의 초가변 영역 (공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 성능을 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한 인간화 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 임의로 포함할 것이다. 추가적인 상세사항은 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 참조.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
당해 항원에 "결합하는" 항체는 항체가 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위한 치료 또는 진단제로서 유용하도록 충분한 친화력 및/또는 결합력으로 이러한 항원에 결합할 수 있는 것이다.
본 발명의 목적을 위해, "면역요법"은 항체로 포유동물 (바람직하게는, 인간 환자)을 치료하는 방법을 지칭할 것이고, 이때 항체는 접합되지 않은 또는 "네이키드(naked)" 항체일 수 있거나, 또는 항체가 이종 분자(들) 또는 작용제(들), 예를 들어 1가지 이상의 세포독성 제제(들)과 접합 또는 융합되어 "면역접합체"가 생성될 수 있다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시 95 중량％의 항체를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 서열분석기 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비-환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"유효량"이라는 표현은 문제의 질환 또는 용태의 예방, 완화 또는 치료에 효과적인 작용제 (예를 들어, Apo2L/TRAIL, 항-DR4 또는 DR5 항체 등)의 양을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "치료하는", "치료" 또는 "요법"은 치유 요법, 예방 요법 및 방지 요법을 지칭한다. 연속 치료 또는 투여는 1일 이상의 치료 중단 없이 적어도 매일을 기초로 하는 치료를 지칭한다. 간헐 치료 또는 투여, 또는 간헐 방식의 치료 또는 투여는 연속적이지 않지만, 본질적으로 주기적인 치료를 지칭한다.
용어 "사이토카인"은 세포간 매개자로서 또다른 세포 상에서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반명이다. 이같은 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인에는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반성 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 종양 괴사 인자-β; 뮬러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-회합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 인슐린-유사 성장 인자-II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)가 포함되는 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 용어 사이토카인은 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 재조합 세포 배양액으로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제, 및 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소와 같은 독소, 또는 이의 단편을 포함하도록 의도된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학 화합물이다 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN™); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민이 포함되는, 에틸렌이민 및 메틸렌이민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 파이I1 (예를 들어, [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A가 포함되는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색단백질 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라바이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (ADRIAMYCIN™) (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 또는 테스토락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology (Princeton, NJ)) 및 독세탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer (Antony, France)); 클로람부실; 젬시타빈 (Gemzar™); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈 (Navelbine™); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 임의의 상기 물질들의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 이러한 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 타목시펜 (Nolvadex™ 포함), 라록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (Fareston™)이 예를 들어 포함되는 항-에스트로겐제 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM); 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소인 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (Megace™), 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, 보로졸 (Rivisor™), 레트로졸 (Femara™), 및 아나스트로졸 (Arimidex™); 및 항-안드로겐제, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 바이칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 임의의 상기 물질들의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에 사용된 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 본원에서 확인된 유전자 중 임의의 것을 과발현하는 암 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S단계의 이같은 유전자를 과발현시키는 세포의 백분율을 유의하게 감소시키는 것이다. 성장 억제제의 예로는 (S 단계 이외의 단계에서) 세포 주기 진행을 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M-단계 정지를 유도하는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-단계 차단제로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포(topo) II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어, DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 ara-C 또한 S-단계 정지로 넘쳐 흐른다. 추가적인 정보는 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)], 특히 제13면에서 발견할 수 있다.
용어 "세포자멸사" 및 "세포자멸사 활성"은 넓은 의미로 사용되고, 세포질의 축합, 형질막 미세융모의 손실, 핵 분열, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 손실이 포함되는 1가지 이상의 특징적 세포 변화가 전형적으로 동반되는, 포유동물에서의 규칙적인 또는 제어된 형태의 세포 사멸을 지칭한다. 이러한 활성은, 예를 들어, 당업계에 공지된, 세포 생존율 분석법 (예컨대 알라마르(Alamar) 청색 분석법 또는 MTT 분석법), FACS 분석, 카스파제 활성화, DNA 단편화 (예를 들어, [Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139:271-279 (1991)] 참조), 및 폴리-ADP 리보스 중합효소 ("PARP") 절단 분석에 의해 결정 및 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "장애"는 유효량의 Apo2L/TRAIL, 항-DR4 항체, 및/또는 항-DR5 항체로 치료될 수 있는 임의의 질환 또는 장애를 포함하여, 본원에 기술된 조성물로의 치료로부터 이익을 얻을 임의의 용태를 일반적으로 지칭한다. 여기에는 만성 및 급성 장애, 뿐만 아니라 포유동물이 문제의 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 용태가 포함된다. 본원에서 치료될 장애의 비제한적인 예로는 양성 및 악성 암; 염증성, 혈관생성성 및 면역학적 장애, 자가면역 장애, 관절염 (류머티스성 관절염 포함), 다발성 경화증, 및 HIV/AIDS가 포함된다.
용어 "암", "암성" 또는 "악성"은 조절되지 않는 세포 성장을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에게서의 생리적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 암의 더욱 특정한 예로는 편평 세포 암종, 골수종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경아교종, 위장암, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 위장암 (위장관암), 신장암, 난소암, 간암, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 흑색종, 연골육종, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 자궁경부암, 뇌암, 위암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암종, 및 두경부암이 포함된다.
용어 "면역 관련 질환"은 포유동물의 면역계의 성분이 포유동물의 이환을 야기하거나, 매개하거나 또는 다른 방식으로 이에 기여하는 질환을 의미한다. 면역 응답의 자극 또는 개입이 질환의 진행에 대한 개선 효과를 갖는 질환이 또한 포함된다. 이러한 용어에는 자가면역 질환, 면역-매개 염증성 질환, 비-면역-매개 염증성 질환, 감염성 질환, 및 면역결핍 질환이 포함된다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 면역 관련 및 염증성 질환 (일부는 면역성 또는 T 세포 매개성임)의 예로는 전신 홍반성 루푸스, 류머티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병증, 전신 경화증 (피부경화증), 특발성 염증성 근육병증 (피부근염, 다발근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간 혈색소뇨증), 자가면역 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소 자반증, 면역-매개 혈소판감소증), 갑상선염 (그레이브병, 하시모또 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축 갑상선염), 진성 당뇨병, 면역-매개 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질성 신장염)), 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 기랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 간담즙성 질환, 예컨대 감염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염 및 기타 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종 간염, 및 경화성 담관염, 염증성 및 섬유성 폐 질환, 예컨대 염증성 장 질환 (궤양성 대장염: 크론병); 글루텐-민감성 장병증, 및 휘플(Whipple) 질환, 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환 (수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염 포함), 건선, 알레르기 질환, 예컨대 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식 과민증 및 두드러기, 폐의 면역학적 질환, 예컨대 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴, 이식 관련 질환 (이식편 거부 및 이식편-대-숙주 질환)이 포함된다. 감염성 질환은 AIDS (HIV 감염), A, B, C, D 및 E형 간염, 박테리아 감염, 진균 감염, 원충 감염 및 기생충 감염을 포함한다.
"자가면역 질환"은 개별적인 포유동물의 이의 조직 성분에 대한 체액성 또는 세포성 면역 응답으로부터 정상적인 또는 건강한 조직의 파괴가 발생하는 포유동물에서의 장애 또는 용태를 지칭하도록 넓은, 일반적인 의미로 본원에서 사용된다. 예로는 홍반성 루푸스, 갑상선염, 류머티스성 관절염, 건선, 다발성 경화증, 자가면역성 당뇨병, 및 염증성 장 질환 (IBD)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 용어 "태그가 부착된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 에피토프에 대해 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에, 또는 일부 다른 기능, 예컨대 올리고머화되는 능력 (예를 들어, 류신 지퍼 도메인을 갖는 펩티드에서 발생)을 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만, 항체 또는 폴리펩티드의 활성을 일반적으로 방해하지 않도록 충분히 짧다. 또한 바람직하게는 태그 폴리펩티드는 태그-특이적 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차 반응하지 않도록 상당히 독특하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기, 보통 약 8개 내지 약 50개 사이의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10개 내지 약 20개 사이의 잔기)를 갖는다.
용어 "2가 금속 이온"은 2개의 양성 전하를 갖는 금속 이온을 지칭한다. 2가 금속 이온의 예로는 아연, 코발트, 니켈, 카드뮴, 마그네슘 및 망간이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 이같은 금속의 특정 형태에는 상기 언급된 2가 금속 이온의 클로라이드, 아세테이트, 카르보네이트, 시트레이트 및 술페이트 형태와 같은 염 형태 (예를 들어, 제약상 허용가능한 염 형태)가 포함된다. 임의로, 본 발명에서 사용하기 위한 2가 금속 이온은 아연이고, 바람직하게는 염 형태의 황산아연 또는 염화아연이다.
"단리된"은, 본원에 개시된 다양한 단백질을 기술하기 위해 사용되는 경우, 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 단백질을 의미한다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 펩티드 또는 단백질이 진단 또는 치료에 사용되는 것을 전형적으로 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 또는 단백질은 (1) 스피닝 컵 서열분석기 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비-환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지, 또는 (3) 질량 분광학적 또는 펩티드 지도화(mapping) 기술에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 물질에는 재조합 세포 내의 계내 펩티드 또는 단백질이 포함되는데, 이는 펩티드 또는 단백질의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 펩티드 또는 단백질은 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 확인된 서열과 관련된 "아미노산 서열 동일성 백분율 (％)"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 기준 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 비교될 전장 서열에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 할당 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적합한 파라메터를 결정할 수 있는 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로 달성할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 아미노산 동일성 백분율 값은 Genentech, Inc.에 의해 제작되고, 소스(source) 코드가 사용자 문서와 함께 미국 저작국(United States Copyright Office) (Washington, DC, 20559)에 제출되어 미국 저작권 TXU510087 하에 등록된 서열 비교 컴퓨터 프로그램 "ALIGN-2"를 사용하여 수득될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, CA)로부터 공개적으로 입수가능하다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 및 염 농도에 따라 경험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적합한 어닐링(annealing)을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧을수록 더 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 상보적인 가닥이 이의 용융 온도 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 다시 어닐링하는 능력에 일반적으로 좌우된다. 프로브와 혼성화가능한 서열 간의 원하는 동일성 정도가 높을수록, 사용될 수 있는 상대적인 온도가 더 높다. 결과적으로, 상대적인 온도가 높을수록 반응 조건을 더욱 엄격하게 만드는 경향이 있는 반면, 온도가 낮을수록 덜 엄격해진다는 것을 따른다. 혼성화 반응의 엄격성의 추가적인 상세사항 및 설명에 대해서는, [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)] 참조.
본원에서 정의된 "고도의 엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도를 사용하는 것; 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트; (2) 혼성화 동안에 변성제를 사용하는 것; 42℃에서 50％ (v/v) 포름아미드 + 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨; 또는 (3) 42℃에서 50％ 포름아미드, 5×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5× 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA (50 ㎍/㎖), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2× SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 55℃에서 50％ 포름아미드로 세척한 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1×SSC로 구성된 고도 엄격성 세척을 사용하는 것에 의해 확인된다.
"중등도의 엄격성 조건"은 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기술된 바와 같이 확인될 수 있고, 20％ 포름아미드, 5× SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산3나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5× 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎎/㎖의 변성된 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시킨 후, 필터를 1× SSC에서 약 37-50℃에서 세척하는 것을 포함한다. 당업자는, 프로브 길이 등과 같은 인자에 적응시키기 위해 필요하다면, 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 인지할 것이다.
용어 "프라이머" 또는 "프라이머들"은, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응에서 일어나는 것과 같이, 상보적인 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어, 뉴클레오티딜트랜스페라제의 작용에 의한 모노뉴클레오티드로부터의 폴리뉴클레오티드의 단계적인 합성에 대한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 생물 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵생물에 적절한 제어 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리(pre)-서열 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리-단백질로서 발현될 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보좀 결합 부위가 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우에는 인접하고 판독 상 내인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 절단 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실행에 따라 사용된다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)을 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 것과 같은 시험관내 ADCC 분석법을 수행할 수 있다. 이같은 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법적으로 또는 추가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 1가지 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되고, PBMC와 NK 세포가 바람직하다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하도록 사용된다. 바람직한 FcR은 천연-서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, 여기에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (이러한 수용체들의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태 포함)가 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함되고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 ([Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 개관되어 있다. 추후에 확인될 것이 포함되는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어에는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn이 또한 포함된다 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]). 본원의 FcR는 다형성, 예컨대 IgG1에 결합하는 수용체의 영역에 위치하는 아미노산 위치 158에서 페닐알라닌 (F) 또는 발린 (V)이 초래되는, FcγRIIIa를 코딩하는 유전자에서의 유전적 이형성을 포함한다. 동종접합성 발린 FcγRIIIa (FcγRIIIa-158V)는, 동종접합성 페닐알라닌 FcγRIIIa (FcγRIIIa-158F) 또는 이종접합성 (FcγRIIIa-158F/V) 수용체에 비해, 인간 IgG1에 대한 친화력이 더 높고, 시험관내에서 증가된 ADCC를 매개하는 것으로 나타났다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1성분 (C1q)이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어 항체)에 결합하는 것에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
II . 본 발명의 대표적인 방법 및 재료
본원에 개시된 방법 및 분석법은 포유동물 조직 또는 세포 샘플에서 1가지 이상의 바이오마커의 발현을 조사하는 것에 관한 것이고, 이때 1가지 이상의 이같은 바이오마커의 발현의 결정은 조직 또는 세포 샘플이 Apo2L/TRAIL 및/또는 사멸 수용체 항체, 예컨대 항-DR5 작동제 항체 또는 항-DR4 작동제 항체와 같은 작용제에 민감성일 것임을 예측하거나 이를 나타낸다. 이러한 방법 및 분석법은 GalNac-T14 및 GalNac-T3을 포함하여 GalNac-T 족 분자의 구성원의 발현을 조사하는 방법 및 분석법을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체의 세포 사멸 유도 효과에 저항성인 질환 인간 세포 유형의 일부 집단이 존재한다. 따라서, 개시된 방법 및 분석법이 환자를 치료하기 위한 적합한 또는 효과적인 요법을 평가하는데 유용한 데이타 및 정보를 수득하기 위한 간편하고, 효율적이며, 잠재적으로 비용-효과적인 수단을 제공할 수 있을 것으로 여겨진다. 예를 들어, 암 또는 면역-관련 용태로 진단된 환자에게 생검을 수행하여 조직 또는 세포 샘플을 수득할 수 있고, 샘플을 다양한 시험관내 분석법에 의해 조사하여, 환자의 세포가 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체와 같은 치료제에 대해 민감성일지 여부를 결정할 수 있다.
본 발명은 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 작동제 항체에 대한 포유동물 조직 또는 세포 샘플 (예컨대 암 세포)의 민감도를 예측하는 방법을 제공한다. 임의로, 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 수득하여, GalNac-T14의 발현에 대해 조사한다. 이 방법은 mRNA 발현, 단백질 발현을 검출하는 분석법 (예컨대 면역조직화학 분석법) 및 효소성 UDP-N-아세틸-D-갈락토스아민:폴리펩티드 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스페라제 활성을 검출하는 생화학적 분석법이 포함되는 다양한 분석법 포맷에 의해 수행될 수 있다. 상기 조직 또는 세포에서 (또는 조직 또는 세포 상에서) 이같은 GalNac-T14 바이오마커의 발현이 결정되는 것은 이같은 조직 또는 세포가 Apo2L/TRAIL 및/또는 사멸 수용체 항체의 생물학적 활성에 민감성일 것임을 예측할 것이다. 출원인은 GalNac-T14의 발현이 Apo2L/TRAIL 및 사멸 수용체 작동제 항체에 대한 이같은 조직 또는 세포의 민감도와 상호관련된다는 것을 뜻밖에 발견하였다.
하기 논의된 바와 같이, 샘플에서의 다양한 바이오마커, 예컨대 GalNac-T14의 발현은, 면역조직화학적 및/또는 웨스턴 분석, 혈액을 기초로 하는 정량적 분석법 (예를 들어 혈청 ELISA) (예를 들어, 단백질 발현 수준을 조사하기 위해), 생화학적 효소 활성 분석법, 계내 혼성화, mRNA의 노던 분석 및/또는 PCR 분석, 및 게놈 서던 분석 (예를 들어, 유전자 결실 또는 증폭을 조사하기 위해), 뿐만 아니라 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 광범위한 분석법 중 임의의 것이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 다수가 공지되어 있고 당업자에게 이해되는 다수의 방법론에 의해 분석될 수 있다. 유전자 및 유전자 산물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜을, 예를 들어 [Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)]에서 발견할 수 있다.
샘플 내의 GalNac-T14의 검출에 관한 하기의 프로토콜이 설명의 목적을 위해 하기에 제공된다.
임의의 본 발명의 방법은 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서 GalNac-T14의 존재를 조사 또는 시험하는 프로토콜을 포함한다. GalNac-T14을 검출하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있고, 여기에는, 예를 들어, 면역조직화학적 분석, 면역침전, 웨스턴 블롯 분석, 분자 결합 분석법, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 (PACS), 및 면역침전에 이은 MS, 단당류 분석이 포함된다. 예를 들어, 조직 또는 샘플에서 GalNac-T14의 발현을 검출하는 임의의 방법은 샘플을 항-GalNac-T14 항체와 접촉시킨 후, 샘플 내의 GalNac-T14에 대한 항체의 결합을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 샘플에서의 GalNac-T14의 발현을 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 조사한다. 조직 절편의 면역조직화학적 염색은 샘플 내의 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 수 있는 방법인 것으로 판명되었다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 프로브에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 가시화시킨다.
샘플 제조를 위해, 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예로는 암 세포, 예컨대 결장, 유방, 전립선, 난소, 폐, 위, 췌장, 림프종 및 백혈병 암 세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 임의로, 샘플은 비-소세포 폐암 세포, 췌장암 세포 또는 비-호지킨 림프종 암 세포를 포함한다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 수득될 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 고정되어 파라핀 등에 매립된다.
조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 고정 (즉, 보존)될 수 있다 (예를 들어, ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York]; [The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.] 참조). 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 다른 방식으로 분석되는 목적에 의해 고정제가 선택된다는 것을 이해할 것이다. 또한 당업자는 고정 길이가 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 예로서, 중성 완충 포르말린, 부앙액(Bouin's) 또는 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시킬 수 있다.
일반적으로, 샘플은 먼저 고정된 후, 상향 농도의 일련의 알콜을 통해 탈수되고, 조직 샘플을 절편화시킬 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질에 침윤 및 매립된다. 별법적으로, 조직을 절편화하고, 수득된 절편을 고정시킬 수 있다. 예로서, 조직 샘플이 통상적인 방법에 의해 파라핀에 매립되어 가공될 수 있다 (예를 들어, ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 사용될 수 있는 파라핀의 예로는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일단 조직 샘플이 매립되면, 샘플을 마이크로톰 등에 의해 절편화시킬 수 있다 (예를 들어, ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 이러한 절차의 예로서, 절편의 두께는 약 3 미크론 내지 약 5 미크론 범위일 수 있다. 일단 절편화되면, 절편을 여러 표준 방법에 의해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예로는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예로서, 파라핀에 매립된 절편은 양성 전하를 띠는 슬라이드 및/또는 폴리-L-리신으로 코팅된 슬라이드에 부착될 수 있다.
파라핀이 매립 재료로서 사용된 경우, 조직 절편은 일반적으로 탈파라핀화되고 물에 재수화된다. 조직 절편은 여러 통상적인 표준 방법에 의해 탈파라핀화될 수 있다. 예를 들어, 자일렌 및 점진적 하향농도의 일련의 알콜을 사용할 수 있다 (예를 들어, ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 별법적으로, Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas)과 같은 시판되는 탈파라핀화 비-유기 작용제를 사용할 수 있다.
임의로, 샘플 제조에 이어서, 조직 절편을 IHC를 사용하여 분석할 수 있다. IHC는 형태학적 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 같은 추가적인 기술과 조합되어 수행될 수 있다. 2가지의 일반적인 IHC 방법이 이용가능하다; 직접 및 간접 분석법. 첫번째 분석에 따르면, 표적 항원 (예를 들어, GalNac-T14)에 대한 항체의 결합이 직접적으로 결정된다. 이러한 직접 분석법은 추가적인 항체 상호작용 없이 가시화될 수 있는 표지된 시약, 예컨대 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 이용한다. 전형적인 간접 분석에서는, 접합되지 않은 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지된 2차 항체가 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우, 발색 또는 형광 기질이 첨가되어 항원의 가시화를 제공한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프들과 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기의 카테고리로 분류될 수 있다:
(a) 방사성 동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H 및 131I. 예를 들어 [Current Protocols in Immunology Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기술된 기술을 사용하여 항체를 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사성을 섬광 카운팅을 사용하여 측정할 수 있다.
(b) 콜로이드성 금 입자.
(c) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민(Lissamine), 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌, 또는 시판되는 형광단, 예컨대 SPECTRUM 0RANGE7 및 SPECTRUM GREEN7 및/또는 상기 물질 중 임의의 1가지 이상의 유도체가 포함되지만 이에 한정되지 않는 형광 표지. 형광 표지는 예를 들어 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 사용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광측정계를 사용하여 형광을 정량할 수 있다.
(d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 4,275,149는 이들 중 일부의 개관을 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하고, 이를 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서 색 변화를 촉매할 수 있고, 이를 분광광도계로 측정할 수 있다. 별법적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하기 위한 기술은 상기 기술되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전기적으로 여기된 후, 측정 (예를 들어, 화학발광분석기를 사용하여)할 수 있는 빛을 방출하거나 형광 수용체에 에너지를 공여한다. 효소 표지의 예로는 루시퍼라제 (예를 들어, 개똥벌레 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 요소분해효소, 과산화효소, 예컨대 양고추냉이 과산화효소 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 산화효소 (예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소), 헤테로시클릭 산화효소 (예를 들어 요산분해효소 및 잔틴 산화효소), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 포함된다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, Method in Enzym. (ed. J. Langone ＆ H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981)]에 기술되어 있다.
효소-기질 조합의 예로는, 예를 들어, 하기의 것들이 포함된다:
(i) 양고추냉이 과산화효소 (HRPO)와 기질로서의 수소 과산화효소 (이때 수소 과산화효소는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3', 5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴);
(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및
(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 (예를 들어 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제).
다수의 기타 효소-기질 조합이 당업자에게 입수가능하다. 이들의 일반적인 개관을 위해서, 미국 특허 4,275,149 및 4,318,980 참조. 때때로, 표지는 항체에 간접적으로 접합된다. 당업자는 이를 달성하는 다양한 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 표지의 광범위한 4가지 카테고리 중 임의의 것이 아비딘에 접합될 수 있거나, 또는 이의 반대 형태로 접합될 수 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 표지가 이러한 간접적인 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 별법적으로, 표지와 항체의 간접적인 접합을 달성하기 위해서, 항체가 소형 합텐과 접합되고, 상기 언급된 여러 유형의 항체 중 하나가 항-합텐 항체와 접합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 접합을 달성할 수 있다.
상기 논의된 샘플 제조 절차 이외에, IHC 전, 동안 또는 후에 조직 절편의 추가적인 처리가 요구될 수 있다. 예를 들어, 에피토프 복구 방법, 예를 들어 시트레이트 완충제에서 조직 샘플을 가열하는 것이 수행될 수 있다 (예를 들어, [Leong et al., Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).
임의의 차단 단계 후에, 조직 절편은 1차 항체가 조직 샘플 내의 표적 단백질 항원에 결합하도록 적절한 조건 하에 충분한 시간 동안 1차 항체에 노출된다. 이를 달성하기에 적합한 조건은 일상적인 실험에 의해 결정할 수 있다. 항체가 샘플에 결합하는 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 임의의 하나를 사용하여 결정된다. 바람직하게는, 표지는 발색 기질, 예컨대 3,3'-디아미노벤지딘 발색원의 화학적 변형을 촉매하는 효소 표지 (예를 들어 HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체이다).
임의로, GalNac-T14의 발현을 검출하기 위한 IHC 분석에 사용되는 항체는 항-GalNac-T14 항체이다. 별법적으로, GalNac-T14와 교차-반응성이 있는 다른 GalNac-T 항원에 대한 항체를 사용할 수 있다. 임의로, 항-GalNac-T14 항체는 모노클로날 항체이다.
이렇게 제조된 표본을 마운팅(mounting)하여 커버를 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 결정하고, 당업계에서 일상적으로 사용되는 염색 강도 기준을 사용할 수 있다. 염색 강도 기준은 하기와 같이 평가될 수 있다.
염색 패턴 점수
세포에서 염색이 관찰되지 않음 0
희미한/거의 감지할 수 없는 염색이 10％를 초과하는 세포에서 검출됨 1+
약한 수준 내지 중등도의 염색이 10％를 초과하는 세포에서 관찰됨 2+
중등도 내지 강한 염색이 10％를 초과하는 세포에서 관찰됨 3+
전형적으로, 이같은 IHC 분석법에서 약 2+ 이상의 염색 패턴 점수는 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 작동제 항체에 대한 포유동물 세포 (예컨대 포유동물 암 세포)의 민감성을 예측하거나 이를 나타내는 것으로 여겨진다.
별법적인 방법에서, 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 샘플을 항체-바이오마커 복합체가 형성되기에 충분한 조건 하에서 접촉시킨 후, 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 다수의 방식으로, 예컨대 혈장 및 혈청을 포함하는 매우 다양한 조직 및 샘플을 분석하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차에 의해 검출될 수 있다. 이같은 분석 포맷을 이용하는 광범위한 면역분석법 기술이 입수가능하고, 예를 들어, 미국 특허 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653을 참조한다. 이러한 방법은 전통적인 경쟁 결합 분석뿐만 아니라 비-경쟁적 유형의 단일 부위 및 이중 부위 또는 "샌드위치" 분석을 포함한다. 또한 이러한 분석법은 표지된 항체의 표적 바이오마커에 대한 직접적인 결합을 포함한다.
샌드위치 분석법은 가장 유용하고 통상적으로 사용되는 분석법이다. 샌드위치 분석법 기술의 다수의 변형이 존재하고, 이들 모두가 본 발명에 포함되도록 의도된다. 간략하게, 전형적인 전방(forward) 분석에서, 표지되지 않은 항체가 고체 기판에 고정되고, 시험할 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 적절한 인큐베이션 기간 후에, 항체-항원 복합체가 형성되도록 하기에 충분한 시간 동안, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터(reporter) 분자로 표지된, 항원에 특이적인 2차 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 또다른 복합체가 형성되도록 하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 임의의 미반응 물질을 세척하여 제거하고, 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰함으로써 항원의 존재를 결정한다. 결과는 가시적인 신호의 간단한 관찰에 의해 정성적일 수 있거나, 또는 기지량의 바이오마커를 포함하는 대조군 샘플과 비교함으로써 정량화될 수 있다.
전방 분석의 변형은 결합된 항체에 샘플과 표지된 항체 모두가 동시에 첨가되는 동시 분석을 포함한다. 이러한 기술은 용이하게 명백할 임의의 작은 변형을 포함하여 당업자에게 주지되어 있다. 전형적인 전방 샌드위치 분석에서, 바이오마커에 대한 특이성을 갖는 1차 항체는 고체 표면에 공유 결합되거나 소극적으로 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 통상적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 관, 비드, 마이크로플레이트의 디스크, 또는 면역분석법을 수행하는데 적절한 임의의 기타 표면의 형태일 수 있다. 결합공정은 당업계에 주지되어 있고, 일반적으로 가교 결합, 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 구성되고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척된다. 그 후, 시험할 샘플의 분취량을 고체상 복합체에 첨가하고, 충분한 시간 (예를 들어 2-40분 또는 더욱 편리할 경우 하룻밤) 동안 적합한 조건 (예를 들어 실온 내지 40℃, 예컨대 25℃ 내지 32℃) 하에 인큐베이션하여, 항체에 존재하는 임의의 서브유닛이 결합되도록 한다. 인큐베이션 기간 후, 항체 서브유닛 고체상을 세척하고, 건조시켜, 바이오마커의 일부분에 특이적인 2차 항체와 함께 인큐베이션한다. 2차 항체는 분자 마커에 대한 2차 항체의 결합을 지시하도록 사용되는 리포터 분자에 연결된다.
별법적인 방법은 샘플 내의 표적 바이오마커를 고정시킨 후, 고정된 표적을 리포터 분자로 표지되거나 표지되지 않을 수 있는 특이적 항체에 노출시키는 것을 수반한다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 결합된 표적을 항체로의 직접적인 표지에 의해 검출할 수 있다. 별법적으로, 1차 항체에 특이적인 표지된 2차 항체를 표적-1차 항체 복합체에 노출시켜 표적-1차 항체-2차 항체의 3원 복합체를 형성시킨다. 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 복합체를 검출한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "리포터 분자"는 항원-결합된 항체의 검출을 허용하는 분석적으로 확인가능한 신호를 분자의 화학적 특성에 의해 제공하는 분자를 의미한다. 이러한 유형의 분석에서 가장 통상적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사성핵종 함유 분자 (즉, 방사성 동위원소) 및 화학발광 분자이다.
효소 면역분석의 경우, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 페리오데이트에 의해 2차 항체에 접합된다. 그러나, 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 당업자가 쉽게 입수가능한 광범위한 여러 접합 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소에는 양고추냉이 과산화효소, 글루코스 산화효소, 갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제가 특히 포함된다. 특정 효소와 함께 사용되는 기질은 상응하는 효소에 의한 가수분해 시 검출가능한 색 변화가 생성되도록 일반적으로 선택된다. 적절한 효소의 예로는 알칼리성 포스파타제 및 과산화효소가 포함된다. 상기 언급된 발색 기질보다는 형광 생성물이 산출되는 형광 기질을 또한 사용할 수 있다. 모든 경우에, 효소 표지된 항체가 1차 항체-분자 마커 복합체에 첨가되어 결합된 후, 과량의 시약을 세척하여 제거한다. 그후, 적합한 기질을 함유하는 용액을 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질이 2차 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 신호를 제공할 것이고, 이를 일반적으로 분광광도계로 추가로 정량하여 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양의 지표를 제공할 수 있다. 별법적으로, 형광 화합물, 예컨대 플루오레세인 및 로다민이 항체의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장의 빛의 조사에 의해 활성화될 때, 형광색소(fluorochrome)-표지 항체가 빛 에너지를 흡수하여 분자를 여기가능 상태로 유도한 후, 광학현미경으로 가시적으로 검출가능한 특징적인 색에서 빛을 방출한다. EIA에서처럼, 형광 표지된 항체는 1차 항체-분자 마커 복합체에 결합하게 된다. 미결합 시약을 세척으로 제거한 후, 잔존하는 3원 복합체를 적절한 파장의 빛에 노출시키고, 관찰된 형광은 당해 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술 모두 당업계에 잘 확립되어 있다. 그러나, 기타 리포터 분자, 예컨대 방사성 동위원소, 화학발광 또는 생체발광 분자를 또한 사용할 수 있다.
상기 기술된 기술이 GalNac-T14의 발현을 검출하는데 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명의 방법은 조직 또는 세포 샘플에서 GalNac-T14 mRNA의 존재 및/또는 발현을 조사하는 프로토콜을 추가로 포함한다. 세포 내의 mRNA의 평가 방법은 주지되어 있고, 예를 들어, 상보적 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 분석법 (예컨대 표지된 GalNac-T14 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 분석법 (예컨대 GalNac-T14에 특이적인 상보적 프라이머를 이용한 RT-PCR, 및 기타 증폭 유형의 검출 방법, 예를 들어, 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.
포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 노던, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 사용하여 예를 들어 GalNac-T14 mRNA에 대해 편리하게 분석할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 분석, 예컨대 정량적 PCR 분석은 당업계에 주지되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 GalNac-T14 mRNA를 검출하는 방법은 1개 이상의 프라이머를 사용하여 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생산하는 단계; 이렇게 생성된 cDNA를 센스 및 안티센스 프라이머로서 GalNac-T14 폴리뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜서, 내부의 GalNac-T14 cDNA를 증폭시키는 단계; 및 증폭된 GalNac-T14 cDNA의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 또한, 이같은 방법은 생물학적 샘플 내의 GalNac-T14 mRNA의 수준을 결정할 수 있도록 하는 1가지 이상의 단계를 포함할 수 있다 (예를 들어, 액틴 족 구성원과 같은 "하우스키핑(housekeeping)" 유전자의 비교용 대조군 mRNA 서열의 수준을 동시에 조사함으로써). 임의로, 증폭된 GalNac-T14 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.
본 발명의 이러한 양상의 재료 실시양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 임의의 특정 부분이 특이적으로 증폭되도록 하는 GalNac-T14 프라이머 및 프라이머 쌍, 및 본 발명의 핵산 분자 또는 이의 임의의 부분에 선택적으로 또는 특이적으로 혼성화하는 프로브를 포함한다. 프로브는 검출가능한 마커, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지될 수 있다. 이같은 프로브 및 프라이머는 샘플 내의 GalNac-T14 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는데, 그리고 GalNac-T14 단백질을 발현하는 세포를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 매우 많은 상이한 프라이머 및 프로브를 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 제조하여, GalNac-T14 mRNA의 존재 및/또는 수준의 증폭, 클로닝 및/또는 결정에 효과적으로 사용할 수 있다.
임의의 본 발명의 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA, 예를 들어 GalNac-T14 mRNA를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 사용하여, 시험 및 대조군 조직 샘플로부터의 시험 및 대조군 mRNA 샘플을 역전사시키고 표지하여 cDNA 프로브를 생성시킨다. 그후, 프로브를 고체 지지체 상에 고정된 핵산 어레이에 혼성화시킨다. 어레이는 어레이의 각각의 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있도록 형성된다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 발현될 가능성이 있는 유전자의 선집(選集)이 고체 지지체 상에 배열될 수 있다. 표지된 프로브와 특정 어레이 구성원의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 유전자를 발현한다는 것을 가리킨다. 질환 조직의 차등 유전자 발현 분석은 유용한 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술은 핵산 혼성화 기술 및 컴퓨터 기술을 이용하여 단일 실험 내에서 수천개의 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가한다 (예를 들어, WO 01/75166 (2001년 10월 11일 공개) 참조; 어레이 제작의 논의에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 5,700,637, 미국 특허 5,445,934 및 미국 특허 5,807,522, [Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)]; [Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)] 참조). DNA 마이크로어레이는 유리 또는 기타 기판 상에서 직접 합성되거나 이러한 기판 상에 스포팅된 유전자 단편을 함유하는 축소물 어레이이다. 수천개의 유전자가 일반적으로 단일 어레이에 제시된다. 전형적인 마이크로어레이 실험에는 하기의 단계들이 수반된다: 1. 샘플로부터 단리된 RNA로부터의 형광 표지된 표적의 제조, 2. 표지된 표적의 마이크로어레이에 대한 혼성화, 3. 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝, 4. 스캐닝된 영상의 분석 및 5. 유전자 발현 프로파일의 생성. 현재 2가지 주요 유형의 DNA 마이크로어레이가 사용되고 있다: 올리고뉴클레오티드 (보통 25량체 내지 70량체) 어레이, 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 어레이를 형성하는데 있어서, 올리고뉴클레오티드는 예비제작되어 표면에 스포팅될 수 있거나, 또는 표면 상에서 직접 합성될 수 있다 (계내).
어피메트릭스 진칩(GeneChip®) 시스템은 유리 표면 상에서의 올리고뉴클레오티드의 직접 합성에 의해 제작된 어레이를 포함하는 시판되는 마이크로어레이 시스템이다. 프로브/유전자 어레이: 올리고뉴클레오티드 (보통 25량체)는 반도체-기반 사진평판술과 고체상 화학 합성 기술의 조합에 의해 유리 웨이퍼 상에서 직접 합성된다. 각각의 어레이는 400,000개까지의 상이한 올리고머를 함유하고, 각각의 올리고머는 수백만개의 카피로 존재한다. 올리고뉴클레오티드 프로브가 어레이 상의 공지된 위치에서 합성되므로, 혼성화 패턴 및 신호 강도가 어피메트릭스 마이크로어레이 스위트(Microarray Suite) 소프트웨어에 의해 유전자 신원 및 상대적 발현 수준의 관점에서 해석될 수 있다. 각각의 유전자는 일련의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 어레이 상에 제시된다. 각각의 프로브 쌍은 완벽 매치 올리고뉴클레오티드 및 미스매치 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 완벽 매치 프로브는 특정 유전자에 정확하게 상보적인 서열을 갖고, 따라서 유전자의 발현을 측정한다. 미스매치 프로브는 중앙 염기 위치에서의 1개의 염기 치환에 의해 완벽 매치 프로브와 상이하여, 표적 유전자 전사체의 결합을 방해한다. 이것은 완벽 매치 올리고에 대해 측정된 신호에 기여하는 배경 및 비-특이적 혼성화를 결정하는 것을 돕는다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 완벽 매치 프로브의 혼성화 강도로부터 미스매치 프로브의 혼성화 강도를 차감하여, 각각의 프로브 세포에 대한 절대적 또는 특이적 강도값을 결정한다. 프로브는 젠뱅크 및 기타 뉴클레오티드 기탁 기관으로부터의 정보를 기초로 하여 선택된다. 이 서열은 유전자의 3' 말단의 독특한 영역을 인식하는 것으로 여겨진다. 진칩 혼성화 오븐 ("회전식" 오븐)을 사용하여 한번에 64개까지의 어레이의 혼성화를 수행한다. 플루이딕스(fluidics) 스테이션은 프로브 어레이의 세척 및 염색을 수행한다. 이는 완전히 자동화되고 4개의 모듈을 포함하며, 각각의 모듈은 1개의 프로브 어레이를 홀딩한다. 각각의 모듈은 예비프로그래밍된 플루이딕스 프로토콜을 사용하여 마이크로어레이 스위트 소프트웨어를 통해 독립적으로 제어된다. 스캐너는 프로브 어레이에 결합된 표지된 cRNA에 의해 방출된 형광 강도를 측정하는 공초점 레이저 형광 스캐너이다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어가 있는 컴퓨터 워크스테이션이 플루이딕스 스테이션 및 스캐너를 제어한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 프로브 어레이에 대한 예비프로그래밍된 혼성화, 세척, 및 염색 프로토콜을 이용하여 8개까지의 플루이딕스 스테이션을 제어할 수 있다. 또한 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 적절한 알고리즘을 사용하여 혼성화 강도 데이타를 획득하여 이를 각각의 유전자에 대한 존재/부재 콜(call)로 전환시킨다. 마지막으로, 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 비교 분석에 의해 실험들 간의 유전자 발현의 변화를 검출하여, 그 결과를 .txt 파일로 포맷하고, 이는 추가적인 데이타 분석을 위해 다른 소프트웨어 프로그램에서 사용될 수 있다.
형광 계내 혼성화 (FISH) 분석법을 표지된 프로브를 사용하여 바이오마커 mRNA의 발현을 검출하는데 또한 사용할 수 있다. 이같은 분석법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, [Kallioniemi et al., 1992]; 미국 특허 6,358,682 참조).
선택된 바이오마커의 발현을 유전자 결실 또는 유전자 증폭을 조사하여 또한 평가할 수 있다. 유전자 결실 또는 증폭을 당업계에 공지된 광범위한 프로토콜 중 임의의 것에 의해, 예를 들어, 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하는 노던 블롯팅 ([Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 계내 혼성화 (예를 들어, FISH), 세포유전학 방법, 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 비교 게놈 혼성화 (CGH)에 의해 측정할 수 있다. 예로서, 이러한 방법들을 사용하여 GalNac-T14 유전자 증폭의 결실을 검출할 수 있다.
추가적으로, 조직 또는 세포 샘플에서 GalNac-T14 유전자와 같은 바이오마커의 메틸화 상태를 조사할 수 있다. 유전자 5' 조절 영역에서의 CpG 섬의 비정상적인 탈메틸화 및/또는 과다메틸화가 무한증식 및 형질전환 세포에서 종종 발생하고, 결과적으로 다양한 유전자의 발현이 변형될 수 있다. 유전자의 메틸화 상태를 조사하기 위한 다양한 분석법이 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 서던 혼성화 접근법에서, 메틸화된 CpG 부위를 함유하는 서열을 절단할 수 없는 메틸화-민감성 제한효소를 이용하여, CpG 섬의 메틸화 상태를 평가할 수 있다. 또한, MSP (메틸화 특이적 PCR)은 소정의 유전자의 CpG 섬에 존재하는 모든 CpG 부위의 메틸화 상태를 신속하게 프로파일링할 수 있다. 이러한 절차에는 중아황산나트륨에 의한 DNA의 초기 변형 (모든 메틸화되지 않은 사이토신을 우라실로 전환시킴)에 이어서 메틸화된 DNA 대 비메틸화된 DNA에 특이적인 프라이머를 사용한 증폭이 수반된다. 메틸화 간섭이 수반되는 프로토콜은 또한 예를 들어 [Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al., eds., 1995]; [De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)]; [Brooks et al, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536]; 및 [Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)]에서 발견할 수 있다.
조직 또는 세포 샘플에서의 GalNac-T14의 발현을 기능적 또는 활성-기반 분석법에 의해 또한 조사할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 분석법을 사용하여 조직 또는 세포 샘플에서의 소정의 효소성 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스페라제 활성의 존재를 결정 또는 검출할 수 있다 (예를 들어, [Bennett et al., J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996)]; [Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003)]; [Hang et al., 상기 문헌] (www.sciencedirect.com에서 2005년 5월 입수가능) 참조).
본 발명의 방법에서, 조직 또는 세포 샘플을 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체에 결합하는 샘플 내의 Apo2L/TRAIL 또는 수용체의 발현에 대해 또한 조사할 수 있다는 것이 고려된다. 상기 및 당업계에 기술된 바와 같이, Apo2L/TRAIL은 5가지 이상의 상이한 수용체, 즉 DR4, DR5, DcR1, DcR2 및 OPG에 결합하는 것으로 현재 여겨진다. 본원에 기술된 것을 포함하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여, Apo2L/TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2 및/또는 OPG의 발현을 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 검출할 수 있다. 예로서, 상기 기술된 IHC 기술을 사용하여 샘플 내의 다수의 이같은 분자 중 하나의 존재를 검출할 수 있다. 조직 또는 샘플이 GalNac-T14 마커의 존재뿐만 아니라 예를 들어 DR4, DR5 또는 DcR1의 존재에 대해서도 조사되는 방법에서, 별개의 슬라이드를 동일한 조직 또는 샘플로부터 준비하고, 각각의 슬라이드를 각각의 특이적인 바이오마커 또는 수용체에 대해 특이적인 시약으로 시험할 수 있는 것으로 고려된다. 별법적으로, 단일 슬라이드를 조직 또는 세포 샘플로부터 준비하고, 각각의 바이오마커 또는 수용체에 대해 지시된 항체를 다색(多色) 염색 프로토콜과 함께 사용하여, 개별적인 바이오마커 또는 수용체가 가시화 및 검출되도록 할 수 있다.
조직 또는 세포 샘플이 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체에 대해 민감성일 것을 가리키는, 조직 또는 세포 샘플이 GalNac-T14를 발현한다는 것이 결정된 후에, 유효량의 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체를 포유동물에게 투여하여, 포유동물을 괴롭히는 암 또는 면역 관련 장애와 같은 장애를 치료할 수 있는 것으로 고려된다. 본원에 기술된 상이한 병리학적 용태를 포유동물에서 진단하는 것은 숙련된 의사에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어 포유동물에서 암 또는 면역 관련 질환이 진단 또는 검출되도록 하는 진단 기술이 당업계에서 입수가능하다. 예를 들어, 촉진, 혈액 분석, x-선, NMR 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 기술을 통해 암을 확인할 수 있다. 면역 관련 질환 또한 쉽게 확인할 수 있다.
Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체는 공지의 방법에 따라, 예컨대 볼루스로서의 정맥내 투여 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입, 근내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 윤활막내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 임의로, 투여는 다양한 시판 기구를 이용하여 미니 펌프 주입을 통해 수행될 수 있다.
Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체의 투여를 위한 효과적인 투여량 및 스케줄은 경험적으로 결정할 수 있고, 이같은 결정을 내리는 것은 당업계의 기술 내에 속한다. 단일 또는 다중 투여량을 사용할 수 있다. 단독 사용시에 Apo2L/TRAIL의 유효 투여량 또는 유효량은 약 1 ㎍/체중 kg/일 내지 약 100 ㎍/체중 kg/일 이상 범위일 수 있는 것으로 현재 여겨진다. 투여량의 종간 증감은 예를 들어 [Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991)]에 개시된 바와 같이 당업계에 공지된 방식으로 수행될 수 있다.
Apo2L/TRAIL의 생체내 투여가 사용될 경우, 정상 투여량은, 투여 경로에 따라, 약 10 ng/포유동물 체중 kg/일 내지 100 mg/포유동물 체중 kg/일 이상, 바람직하게는 약 1 ㎍/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일로 변할 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌에서 제공된다; 예를 들어, 미국 특허 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212 참조. 상이한 제형이 상이한 치료 화합물 및 상이한 장애에 대해 효과적일 것이고, 예를 들어 한 기관 또는 조직을 표적으로 하는 투여는 또다른 기관 또는 조직과 상이한 방식으로의 전달을 필요로 할 것으로 예상된다.
추가적인 요법을 방법에서 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 1가지 이상의 또다른 요법에는 당업계에 공지되고 상기에서 추가로 상세하게 정의된 방사선요법, 사이토킨(들), 성장억제제(들), 화학요법제(들), 세포독성제(들), 티로신 키나제 억제제, ras 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 혈관생성 억제제, 및 사이클린-의존성 키나제 억제제의 투여가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 또다른 요법이 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체와 별도의 작용제로서 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 종양 항원을 표적으로 하는 치료 항체, 예컨대 리툭산(Rituxan™) 또는 헤르셉틴(Herceptin™), 뿐만 아니라 항-혈관생성 항체, 예컨대 항-VEGF를 기초로 한 요법이 사용될 수 있다.
화학요법제의 제조 및 투여 스케줄은 제조자의 지시에 따라 또는 숙련된 의사에 의해 경험적으로 결정된 바에 같이 사용될 수 있다. 이같은 화학요법제의 제조 및 투여 계획은 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 또한 기술되어 있다. 화학요법제는 Apo2L/TRAIL 또는 사멸 수용체 항체의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있거나, 또는 이와 동시에 투여될 수 있다.
다른 항원에 대한 항체, 예컨대 CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, 혈관 내피 인자 (VEGF), 또는 기타 TNFR 족 구성원 (예컨대 OPG, TNFR1, TNFR2, GITR, Apo-3, TACI, BCMA, BR3)에 결합하는 항체를 또한 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 본원에 개시된 동일하거나 2가지 이상의 상이한 항원에 결합하는 2가지 이상의 항체를 환자에게 공동으로 투여할 수 있다. 때때로, 1가지 이상의 사이토킨을 또한 환자에게 투여하는 것이 이로울 수 있다. 투여 후에, 시험관 내의 처치된 세포를 분석할 수 있다. 생체내 처치인 경우, 처치된 포유동물을 숙련된 의사에게 주지된 다양한 방식으로 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포를 괴사를 분석하기 위해 병리학적으로 조사할 수 있거나, 또는 혈청을 면역계 응답에 대해 분석할 수 있다.
상기에서 기술 또는 제안된 용도로 사용하기 위해, 키트 또는 제조품이 본 발명에 의해 또한 제공된다. 이같은 키트는 1개 이상의 용기 수단, 예컨대 바이알, 튜브 등을 근접하여 수용하도록 구획화되는 운반 수단을 포함할 수 있고, 각각의 컨테이너 수단은 방법에 사용되는 별개의 요소들 중의 하나를 포함한다. 예를 들어, 용기 수단 중 하나는 검출가능하게 표지된 또는 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 이같은 프로브는 각각 GalNac-T14 단백질 또는 GalNac-T14 유전자 또는 메시지에 대해 특이적인 항체 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 키트가 표적 핵산을 검출하기 위해 핵산 혼성화를 이용하는 경우, 키트는 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 뉴클레오티드(들)를 함유하는 용기 및/또는 리포터 분자, 예컨대 효소, 형광 또는 방사성 동위원소 표지에 결합된 리포터-수단, 예컨대 비오틴-결합 단백질, 예컨대 아비딘 또는 스트렙타비딘을 함유하는 용기를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 기술된 용기, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서가 있는 포장 삽입물을 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 요망되는 재료를 포함하는 1개 이상의 다른 용기를 전형적으로 포함할 것이다. 조성물이 특정 요법 또는 비-치료 용도에 사용되는 것을 가리키도록 표지가 용기 상에 존재할 수 있고, 또한 상기 기술된 것들과 같은 생체내 또는 시험관내 용도에 대한 지시를 가리킬 수 있다.
본 발명의 키트에는 다수의 실시양태가 있다. 전형적인 실시양태는 용기, 상기 용기 상의 표지, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물, 및 1가지 이상의 유형의 포유동물 세포 내의 GalNac-T14 단백질의 존재를 평가하기 위해 GalNac-T14 항체를 사용하는 것에 대한 설명서를 포함하는 키트이고; 이때 조성물은 GalNac-T14 폴리펩티드 서열에 결합하는 1차 항체를 포함하고, 상기 용기 상의 표지는 조성물이 1가지 이상의 유형의 포유동물 세포 내의 GalNac-T14 단백질의 존재를 평가하도록 사용될 수 있다는 것을 가리킨다. 키트는 조직 샘플을 제조하고 항체 및 프로브를 조직 샘플의 동일한 절편에 적용하기 위한 설명서 및 재료의 셋트를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 1차 및 2차 항체 모두를 포함할 수 있고, 이때 2차 항체는 표지, 예를 들어 효소 표지에 접합된다.
또다른 실시양태는 용기, 상기 용기 상의 표지, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물, 및 1가지 이상의 유형의 포유동물 세포 내의 GalNac-T14 RNA 또는 DNA의 존재를 평가하기 위해 GalNac-T14 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것에 대한 설명서를 포함하는 키트이고; 이때 조성물은 엄격한 조건 하에 GalNac-T14 폴리뉴클레오티드의 상보물에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 용기 상의 표지는 조성물이 1가지 이상의 유형의 포유동물 세포 내의 GalNac-T14의 존재를 평가하기 위해 사용될 수 있다는 것을 가리킨다.
키트 내의 기타 임의의 성분에는 1가지 이상의 완충제 (예를 들어, 차단 완충제, 세척 완충제, 기질 완충제 등), 효소 표지에 의해 화학적으로 변형되는 기질 (예를 들어, 발색원)과 같은 기타 시약, 에피토프 복구 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등이 포함된다.
본 발명의 다양한 양상이 하기의 실시예에 의해 추가로 기술 및 설명되고, 실시예는 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
방법 및 재료:
세포 배양물 및 세포주.
하기의 인간 세포주: 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포주: H2122, A427, H647, SK-MES-1, H838, H358, H2126, H460, H1703, H2405, H650, H1568, H1666, H322T, SW1573, H292, H1650, H522, EKVX, H661, H23, LXFL 529, H226, A549, H1781, H1299, HOP 62, H2009, HOP 92, H1793, H1975, H1651, calu-1, H1435, HOP 18, H520, H441, H2030, H1155, H1838, H596, HLFa; 췌장암 세포주: Panc 05.04, BxPC3, HPAC, SU.86.86, HuP-T3, PSN1, Panc 08.13, MiaPaCa-2, PA-TU-8988T, Panc 03.27, Capan-1, SW 1990, CFPAC-1, PA-TU-8902, Panc 02.03, Panc 04.03, PL45, Aspc-1, Hs766T, Panc 10.05, Panc1, Capan-2, HPAF-II, 및 NHL: JEKO-1, SU-DHL-4, OCI-LY-19, SR, Farage, DOHH-2, Toledo, WSU-NHL, KARPAS-422, GRANTA-519, Pfeiffer, HT, SC-1, DB. 세포주를 ATCC 기탁기관 (Manassa, Virginia), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures), JCRB (Japanese Cell Resources Bank) 또는 ECACC (European Collection of Cell Cultures)으로부터 수득하여, 10％ 열 불활성화 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 10 mM HEPES가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
세포독성 분석.
가용성 황색 테트라졸륨 염 (MTT)을 청색 포르마잔 결정으로 환원시키는 생존 세포의 능력을 기초로 하는 비색 분석법인 MTT 분석법 (CellTiter 96® 비-방사성 세포 증식 분석 (Promega)))을 사용하여 Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체로의 처리 후 생존 세포의 양을 결정하였다. 예비혼합된 최적화 염료 용액을 다양한 농도 (0 내지 1000 ng/㎖)의 Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체를 함유하는 96-웰 플레이트의 배양 웰에 첨가하여 MTT 분석법을 수행하였다. 4시간 인큐베이션 동안, 살아있는 세포는 염료 용액의 테트라졸륨 성분을 포르마잔 생성물로 전환시킨다. 이어서, 가용화/정지 용액을 배양 웰에 첨가하여 포르마잔 생성물을 가용화시키고, 96-웰 플레이트 판독기 (SpectraMax)를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 기록하였다. 570 nm 흡광도 판독치는 증식 분석법에서 일반적으로 사용되는 세포 수에 정비례한다. 포르마잔 생성물에 대한 최대 흡광도는 570 nm이고 순수 용액은 청색으로 나타나지만, 분석법 말기의 색은 청색이 아닐 수 있고 배양 배지 내의 기타 성분 (혈청, 산성화 페놀 레드 및 비환원 MTT 포함)에 비해 존재하는 포르마잔의 양에 따른다.
분석법의 선형 범위의 고 단부 부근의 분석 신호를 생성시키기 위해 세포 적정을 수행함으로써 세포수를 최적화하였다. 상이한 세포 유형은 대사 활성의 수준 이 상이하기 때문에, 이는 각각의 세포주에 대해 별도로 이루어졌다. 조사된 대부분의 종양 세포에 대해, 5,000개의 세포/웰 내지 20,000개의 세포/웰을 사용하였다.
하기는 사용된 분석의 단계별 설명이다:
1. 생물학적 분석법에 사용된 세포를 모액 배양물로부터 취하였다.
2. 세포 수 및 트리판 블루 생존성을 결정하고, 5,000 내지 20,000개의 세포/웰의 최종 개수로 세포를 현탁시켰다.
3. 50 ㎕의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트로 분배하였다.
4. 플레이트를 37℃에서 가습 5％ CO2 대기에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.
5. 0 내지 1000 ng/㎖ 범위의 다양한 농도의 Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체를 함유하는 50 ㎕ 배양 배지를 96-웰 플레이트의 샘플에 첨가하였다. 대조군은 50 ㎕의 배양 배지 (Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체 없음) 및 100 ㎕ 배양 배지 (세포 없음)이었다. 매 실험을 3중 셋트의 웰에서 3일의 독립적인 날에 수행하였다. 웰의 전체 부피는 100 ㎕/웰이었다.
6. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 가습 5％ CO2 대기에서 인큐베이션하였다.
7. 15 ㎕의 염료 용액을 각 웰에 첨가하였다.
8. 플레이트를 37℃에서 4시간 이내 동안 가습 5％ CO2 대기에서 인큐베이션하였다.
9. 100 ㎕의 가용화/정지 용액을 각각의 웰에 첨가하였다.
10. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.
11. 96-웰 플레이트 판독기를 사용하여 570 nm 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 750 nm의 참조 파장을 사용하여, 세포 잔해물, 지문 및 기타 비특이적 흡광도에 의한 배경을 감소시켰다.
12. 음성 대조군에 대한 흡광도 값의 평균을 블랭크(blank) 값으로 사용하여, 모든 다른 판독치로부터 차감하였다. Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체의 각각의 농도에 대한 흡광도 값의 평균을 양성 대조군의 흡광도 값 (100％ 생존 세포 - 미처리)의 평균으로 나누어 생존 세포의 양 (％ 단위)을 계산하였다.
13. 생존 세포 ％ (Y축) 대 Apo2L/TRAIL 또는 DR5 항체의 농도 (X축, 로그 규모)를 플롯팅하였고, IC50값을 50％ 생존 세포에 대응하는 X축 값 (ng/㎖)을 정함으로써 결정하였다.
어피메트릭스 표지화 프로토콜
OD260/280 판독치를 모든 샘플에 대해 취하고, 샘플을 BioAnalyzer 상에 실행시켰다. 5 ㎍의 고품질의 전체 RNA를 사용하였다.
A. 제1 가닥 cDNA 합성:
1. 프라이머 혼성화
DEPC-H2O: x ㎕. 볼텍싱(vortexing)에 의한 혼합. 신속한 스핀.
RNA (5 ㎍): y ㎕. 70℃에서 10분 동안 인큐베이션시킴.
스파이크(Spike) (5 ㎍에 대해 모액의 1:4 희석): 1 ㎕. 신속한 스핀 및 얼음 상에 놓음
T7-(dT)24 프라이머: 1 ㎕
부피: 12 ㎕
2. 온도 조정
5×-제1 가닥 cDNA 완충제: 4 ㎕
믹스 7 ㎕ (좌측으로)를 각 샘플에 첨가함.
0.1 M DTT: 2 ㎕. 볼텍싱에 의한 혼합. 신속한 스핀.
10 mM dNTP 믹스: 1 ㎕. 42℃에서 2분 동안 인큐베이션시킴.
부피: 7 ㎕
3. 제1 가닥 합성
1 ㎕ SSII RT를 각 샘플에 첨가함.
SSII RT: 1 ㎕. 상하로 피펫팅(pipetting)하거나 가볍게 볼텍싱하여 혼합함.
신속한 스핀.
총 부피: 20 ㎕. 42℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킴.
B. 제2 가닥 cDNA 합성
1. 제1 가닥 반응물을 얼음 상에 놓는다. 간단하게 원심분리하여 튜브의 측면 상의 농축물을 떨어뜨린다.
2. 하기의 제2 가닥 마스터(master) 믹스를 제조한다.
DEPC-처리 H2O: 91 ㎕
5×-제2 가닥 반응 완충제: 30 ㎕
10 mM dNTP 혼합물: 3 ㎕
10 U/㎕ DNA 리가제: 1 ㎕
10 U/㎕ DNA 중합효소 I: 4 ㎕
2 U/㎕ RNA분해효소 H: 1 ㎕
전체 부피: 130 ㎕
3. 130 ㎕의 제2 가닥 마스터 믹스를 20 ㎕의 제1 가닥 cDNA에 첨가한다. (최종 부피 = 150 ㎕)
4. 상하로 피펫팅하거나 가볍게 볼텍싱하여 혼합함. 신속한 스핀.
5. 16℃에서 2시간 동안 냉각 수조 내에서 인큐베이션시킴.
6. 2 ㎕ [10 U] T4 DNA 중합효소를 첨가함. 상하로 피펫팅하거나 가볍게 볼텍싱하여 혼합함. 신속한 스핀.
7. 5분 동안 16℃에서 인큐베이션시킴.
8. 10 ㎕의 0.5 M EDTA를 첨가함. 가볍게 볼텍싱함. 신속한 스핀.
9. cDNA에 대한 세정 절차를 진행하거나, 추후에 사용하기 위해 -20℃에서 보관함.
이중 가닥 cDNA의 세정 (진칩 샘플 세정 모듈)
1. 600 ㎕ cDNA 결합 완충제를 162 ㎕ 최종 이중 가닥 cDNA 합성 제제에 첨가한다. 볼텍싱에 의해 3초 동안 혼합한다.
2. 혼합물의 색이 황색인지를 점검한다 (cDNA 합성 반응이 없는 cDNA 결합 완충제와 유사함). 혼합물의 색이 주황색 또는 보라색이면, 10 ㎕의 3 M 아세트산나트륨 (pH 5.0)을 첨가하고 혼합한다. 혼합물의 색이 황색으로 변할 것이다.
3. 500 ㎕의 샘플을 2 ㎖ 수집관 내에 놓인 cDNA 세정 스핀 컬럼에 적용하고, 1분 동안 ≥8,000×g (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다. 통과물(flow-throught)을 *유해 폐기물로서 폐기한다.
4. 스핀 컬럼에 나머지 혼합물 (262 ㎕)을 다시 로딩하고, 상기와 같이 원심분리한다. 통과물을 *유해 폐기물로서 폐기하고, 수집관을 폐기한다.
5. 스핀 컬럼을 새로운 2 ㎖ 수집관 (제공됨)으로 옮긴다. 750 ㎕의 cDNA 세척 완충제를 스핀 컬럼 상으로 피펫팅한다. 1분 동안 ≥8,000×g (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다. 통과물을 폐기한다.
6. 스핀 컬럼의 캡을 열고 5분 동안 최대 속도 (≤ 25,000×g)에서 원심분리한다. 컬럼을 매번 2번째 버킷(bucket)을 사용하여 원심분리기에 넣는다. 캡을 회전에 대해 반대 방향으로 배향되도록 연결 버킷 상에 배치하고, 즉, 회전이 시계방향이면, 캡을 반시계방향으로 배향시킨다. 이는 캡이 손상되는 것을 방지한다. 통과물 및 수집관을 폐기한다.
7. 스핀 컬럼을 1.5 ㎖ 수집관으로 옮긴다. 10 ㎕의 cDNA 용출 완충제를 스핀 컬럼 막 상으로 직접 피펫팅한다. cDNA 용출 완충제가 막 상으로 직접 분배되는 것을 확실하게 한다. 1분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 1분 동안 최대 속도 (≤ 25,000×g)에서 원심분리하여 용출시킨다.
IVT 반응의 설정 및 실행
Enzo: 바이오어레이 하이일드(Bioarray HighYield) RNA 전사체 표지화 키트 (Part No. 900182)
1. 10 ㎕의 세정된 이중 가닥 cDNA를 사용한다
2. 하기의 IVT 마스터 믹스를 제조한다:
증류 또는 탈이온화 H2O: 12 ㎕
10× HY 반응 완충제: 4 ㎕
10× 비오틴 표지된 리보뉴클레오티드: 4 ㎕
10× DTT: 4 ㎕
10× RNA분해효소 억제제 혼합물: 4 ㎕
20× T7 RNA 중합효소: 2 ㎕
전체 부피: 30 ㎕
3. 30 ㎕의 IVT 마스터 믹스를 10 ㎕ 이중 가닥 cDNA에 첨가한다. (전체 부피 = 40 ㎕)
4. 상하 피펫팅하거나 가볍게 볼텍싱하여 혼합한다. 신속한 스핀.
5. 즉각적으로 튜브를 37℃ 수조에 넣는다. 5시간 동안 인큐베이션한다.
6. RNA를 즉각적으로 정제하지 않는 경우 -20℃에서 보관한다.
비오틴-표지된 cRNA의 세정 (진칩 샘플 세정 모듈)
1. 60 ㎕의 H2O를 IVT 반응물에 첨가하고, 3초 동안 볼텍싱하여 혼합한다.
2. 350 ㎕의 IVT cRNA 결합 완충제를 샘플에 첨가하고, 3초 동안 볼텍싱하여 혼합한다.
3. 250 ㎕의 에탄올 (96-100％)을 용해물에 첨가하고, 피펫팅하여 잘 혼합한다. 원심분리하지 않는다.
4. 샘플 (700 ㎕)을 2 ㎖ 수집관 내에 놓인 IVT cRNA 세정 스핀 컬럼에 적용한다. 15초 동안 ≥8,000×g (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다.
5. 용출물을 컬럼을 통해 1회 더 통과시킨다. 15초 동안 ≥8,000×g (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다. 통과물을 **유해 폐기물로서 폐기하고, 수집관을 폐기한다.
6. 스핀 컬럼을 새로운 2-㎖ 수집관 (공급됨)에 옮긴다.
7. 500 ㎕의 IVT cRNA 세척 완충제를 첨가하고 15초 동안 ≥8,000×g (≥10,000 rpm)에서 원심분리하여 세척한다. 통과물을 폐기한다.
8. 500 ㎕ 80％ (v/v) 에탄올을 스핀 컬럼 상으로 피펫팅하고, 15초 동안 ≥8,000×g (≥10,000 rpm)에서 원심분리한다. 통과물을 폐기한다.
9. 스핀 컬럼의 캡을 열고 5분 동안 최대 속도 (≤ 25,000×g)에서 원심분리한다. 통과물 및 수집관을 폐기한다.
10. 스핀 컬럼을 새로운 1.5 ㎖ 수집관으로 옮긴다.
11. 11 ㎕의 RNA분해효소가 없는 물을 스핀 컬럼 막 상으로 직접 피펫팅한다. 1분 동안 정치시킨다. 1분 동안 최대 속도 (≤25,000×g)에서 원심분리하여 용출시킨다.
12. 10 ㎕의 RNA분해효소가 없는 물을 스핀 컬럼 막 상으로 직접 피펫팅한다. 1분 동안 정치시킨다. 1분 동안 최대 속도 (≤25,000×g)에서 원심분리하여 용출시킨다.
cRNA (IVT 생성물)의 정량
분광광도 분석을 사용하여 RNA 수율을 결정한다. 260 nm에서의 1 OD는 40 ㎍/㎖ RNA와 같다는 전환율을 적용한다.
260 nm 및 280 nm에서의 OD를 점검하여 샘플 농도 및 순도를 결정한다.
순수 RNA에 대해 A260/A280 비율 2.0에 가깝게 유지시킨다 (1.9 내지 2.1의 비율이 허용된다).
전체 RNA를 출발 물질로서 사용하는 경우의 cRNA의 정량을 위해, 표지되지 않은 전체 RNA의 이월량(carryover)을 반영하도록 조정된 cRNA 수율이 계산되어야 한다. 100％ 이월량의 추정치를 사용하여, 조정된 cRNA 수율을 하기 식을 이용하여 결정한다:
조정된 cRNA 수율 = RNAm - (전체 RNAi) (y)
RNAm = IVT 후 측정된 cRNA의 양 (㎍)
전체 RNAi = 전체 RNA의 출발량 (㎍)
y = IVT에서 사용된 cDNA 반응물의 분획
표적 제제를 위한 cRNA의 단편화
단편화를 위해, 조정된 cRNA 농도를 사용한다.
1. 8 ㎕의 RNA + H2O마다 2 ㎕의 5× 단편화 완충제를 첨가한다.
20 ㎍ cRNA: 1 내지 32 ㎕
5× 단편화 완충제: 8 ㎕
RNA분해효소가 없는 물: 40 ㎕가 되도록 하는 양
전체 부피: 40 ㎕
2. 94℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 즉각적으로, 인큐베이션 후 얼음 상에 놓 는다.
혼성화 표적 제조:
1. 20× 진핵생물 혼성화 대조군 (Eukaryotic Hybridization Control) 및 올리고 B2를 5분 동안 65℃에서 가열한다. 어피메트릭스 진칩 진핵생물 혼성화 대조군 키트, Part #900362 (150회의 반응에 대해)
2. 가볍게 볼텍싱하고, 스피닝하여 침강시킨다.
3. 마스터 믹스 (단편화된 cRNA 농도를 0.5 ㎍/㎕으로 가정함):
표준 어레이 (㎕) 최종 농도.
단편화 cRNA 15 ㎍ 30 0.05 ㎍/㎕
올리고 B2 (3 nM) 5 50 pM
20× 대조군 스파이크 15 1.5, 5, 25, 100 pM
(Bio B, C, D, Cre)
청어(Herring) 정자 DNA 3 0.1 mg/㎖
아세틸화 BSA 3 0.5 mg/㎖
Hu cot-1 DNA (1 ㎎/㎖) 30 0.1 mg/㎖
2X MES Hyb 완충제 150 1×
H2O 64
최종 부피 300
4. 270 ㎕ 마스터 믹스를 튜브에 분액하고, 30 ㎕의 단편화된 cRNA를 각각의 튜브에 첨가한다. 이것이 혼성화 믹스이다.
5. 프로브 어레이를 사용 직전에 실온으로 평형화시킨다.
6. 프로브 어레이에 1× MES Hyb 완충제를 충전하고, 회전식 오븐에서 10분 동안 45℃, 60 rpm에서 인큐베이션한다.
7. 혼성화 믹스를 99℃ 수조에서 5분 동안 가열한다.
8. 혼성화 믹스를 45℃ 수조로 5분 동안 옮긴다.
9. 혼성화 믹스를 5분 동안 최대 속도에서 원심분리한다.
10. 1× MES Hyb 완충제를 프로브 어레이로부터 제거한다.
11. 프로브 어레이에 상부 200 ㎕의 혼성화 믹스를 충전한다.
12. 격막을 터프-스폿츠(Tough-Spots)로 밀봉한다.
13. 프로브 어레이를 45℃, 60 RPM에서 19시간 동안 혼성화시킨다.
14. 프로브 어레이를 어피메트릭스 프로토콜에 따라 세척, 염색 및 스캐닝한다.
어피메트릭스 재료
품목 판매사 카탈로그 #
T7-(dT)24 프라이머
대조군 스파이크
Superscript II/5× 제1 가닥 완충제/0.1 M DTT
5× 제2 가닥 완충제
10 mM dNTP
10 U/㎕ 대장균 DNA 리가제
10 U/㎕ 대장균 DNA 중합효소 I
2 U/㎕ RNA 분해효소 H
10 U/㎕ T4 DNA 중합효소
0.5 M EDTA
ENZO 고수율 RNA 전사체 표지화 키트
진칩 샘플 세정 모듈
아세틸화 소 혈청 알부민
염소 IgG - 시약 등급
항-스트렙타비딘 항체 (염소) (비오틴화)
R-피코에리트린 스트렙타비딘
20× SSPE
진핵생물 대조군 키트
물 (분자생물학 등급)
인간 Cot-1 DNA
5 M NaCl (RNA분해효소 없음, DNA분해효소 없음)
소포제 0-30
10％ 트윈(Tween)-20
MES 유리산 일수화물
MES 나트륨 염
EDTA 이나트륨 염 (0.5 M 용액)
터프 스폿츠, 라벨 돗츠(Label Dots)
진칩 혼성화 오븐 640
워크스테이션이 있는 진칩 스캐너 3000
유체학 스테이션
외부 바코드 리더가 있는 오토로더(Autoloader) 		Biosearch Technologies
사내제품(in-house)
Invitrogen
Invitrogen
Invitrogen
Invitrogen
Invitrogen
Invitrogen
Invitrogen
Sigma
Affymetrix 또는 ENZO
Affymetrix
Invitrogen
Sigma
Vector Labs
Molecular Probes
BioWhittaker
Affymetrix
Ambion
Roche
Ambion
Sigma
Pierce Chemical
Sigma
Sigma
Sigma
USA Scientific
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix		 주문품
-
18064-014
10812-014
18427-088
18052-019
18010-025
18021-071
18005-025
E-7889
900182 (ENZO)
900371
15561-020
I-5256
BA-0500
S-866
51214
900362
9934
1-581-074
9760
A-8082
28320
M5287
M3885
E7889
9902
800139
00-0074
00-0081
00-0129
정량적 PCR
cDNA 합성:
성분 부피 (㎕)
10× RT 완충제 10
25× dNTP 혼합물 4
10× 무작위 프라이머 10
MultiScribe RT (50 U/㎕) 5
RNA분해효소가 없는 H2O 21
RNA (100 ng) 50
최종 부피 100
인큐베이션 조건:
10분 동안 25°
2시간 동안 37°
ABI Prism 7700 서열결정 검출기를 사용하는 TaqMan 반응:
성분 부피 (㎕)
TaqMan Universal PCR 마스터 믹스 (2×) 25
TaqMan 프로브 (20×)
(Assays-on-Demand™)		 2.5
cDNA (100 ng) 2
H2O 20.5
최종 부피 50
열 사이클링 조건:
10분 동안 95°
40 사이클: 15초 동안 95°
1분 동안 60°
Figure 112008011624253-pct00001
TaqMan 프로브: Assays-on-Demand™ (TaqMan® MGB 프로브, FAM™ 염료-표지됨)
Figure 112008011624253-pct00002
각각의 반응에 첨가된 샘플 RNA (cDNA)의 양을 표준화하기 위해 내인성 대조군 GAPDH (프로브 농도 100 nM, 전방향 및 역방향 프라이머 농도 200 nM)의 증폭을 수행하였다.
상대적 정량을 표준 곡선 방법을 이용하여 수행하였다. 내인성 대조군에 표준화된 정량을 위해, 표적 및 내인성 기준물 모두에 대한 표준 곡선을 제조하였다. 각각의 실험 샘플에 대해, 표적 및 내인성 기준물의 양을 적절한 표준 곡선으로부터 결정하였다. 그후, 표적의 양을 내인성 기준물의 양으로 나누어서, 표준화된 표적 값을 수득하였다. 실험 샘플 중 하나가 교정값(calibrator) 또는 1× 샘플로서 역할을 하였다. 그후, 각각의 표준화된 표적 값을 교정값 표준화된 표적 값으로 나누어서, 상대적 발현 수준이 생성되었다.
실험 결과:
상기 기술된 방법 및 재료를 사용하여 실험을 수행하였다. 이러한 실험의 결과가 하기 논의된 바와 같이 도 5-9에서 설명된다.
도 5는 MTT 세포독성 분석법에서 측정된 바와 같은, Apo2L (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS) 또는 가교된 "XL" 또는 가교되지 않은 DR5 모노클로날 항체 "mab" (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS)의 세포자멸사성 활성에 대한 민감도 또는 저항성에 대해 비-소세포 폐암 ("NSCLC") 세포주를 분석하는 것에서 수득된 데이타의 IC50 요약 도표를 제공한다.
도 6은 MTT 세포독성 분석법에서 측정된 바와 같은, Apo2L (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS) 또는 가교된 "XL" 또는 가교되지 않은 DR5 모노클로날 항체 "mab" (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS)의 세포자멸사성 활성에 대한 민감도 또는 저항성에 대해 췌장암 세포주를 분석하는 것에서 수득된 데이타의 IC50 요약 도표를 제공한다.
도 7은 MTT 세포독성 분석법에서 측정된 바와 같은, Apo2L (+ 10％ 소 태아 혈청 "FBS") 또는 가교된 "XL" 또는 가교되지 않은 DR5 모노클로날 항체 "mab" (+ 0.5％ 소 태아 혈청 "FBS" 또는 10％ FBS)의 세포자멸사성 활성에 대한 민감도 또는 저항성에 대해 비-호지킨 림프종 암 ("NHL") 세포주를 분석하는 것에서 수득된 데이타의 IC50 요약 도표를 제공한다.
도 8A 및 8B는 GalNac-T14 mRNA 발현에 의해 측정된 바와 같은, DR5 항체에 대한 선택된 NSCLC, 췌장암, 및 NHL 세포주의 민감도 ("sen") 또는 저항성 ("RES")의 비교, 및 GalNac-T14의 발현에 대한 상관관계를 제공한다.
도 9A 및 9B는 GalNac-T14 mRNA 발현 패턴의 수준에 의해 순위 (내림차순)가 매겨진 다양한 NSCLC, 췌장암, 및 NHL 세포주의 막대 도표 그래프를 제공한다.
세포자멸사 세포 사멸 프로그램은 다세포 생물의 발달 및 항성성에서 중요한 역할을 한다 ([Danial et al., Cell, 116:205 (2004)]). 세포내 자극이 세포-내재성 경로를 통해 세포자멸사를 촉발할 수 있고, 이러한 경로는 Bcl-2 유전자 수퍼패밀리의 구성원에 의존하여 세포자멸사성 카스파제 장치를 활성화시킨다 ([Cory et al., Nat. Rev. Cancer, 2:647 (2002)]). 종양 괴사 인자 (TNF) 수퍼패밀리에 속하는 특정 사이토카인은, 기능성 세포자멸사-유도 "사멸 도메인" (DD)을 함유하는 일부 수용체와 상호작용함으로써, 세포-외인성 경로를 통해 세포자멸사를 활성화시킬 수 있다 ([Ashkenazi et al., Science, 281:1305 (1998)]). Fas 리간드 (FasL)는 Fas (Apo1/CD95)를 통해 세포자멸사를 자극하는 반면, Apo-2 리간드/TNF-관련 세포자멸사-유도 리간드 (Apo2L/TRAIL)는 DR4 (TRAIL-R1) 및/또는 DR5 (TRAIL-R2)를 통해 세포자멸사를 촉발한다 ([LeBlanc et al., Cell Death Differ., 10:66 (2003)]). 동족 리간드에 결합시, 이러한 수용체들은 어댑터 분자 FADD (Fas 회합 사멸 도메인)에 결합하고, 이는 세포자멸사-개시제 카스파제-8를 동원하여 사멸-유도 신호전달 복합체 (DISC)를 형성한다 (예를 들어, [Kischkel et al., EMBO J., 14:5579 (1995)]; [Kischkel et al., Immunity, 12:611 (2000)] 참조). DISC-회합은 카스파제-8을 자극하고, 이어서 카스파제-8은 이펙터 프로테아제, 예컨대 카스파제-3, 6, 및 7을 절단 및 활성화시켜, 세포자멸사성 사멸 프로그램을 실행시킨다. 다수의 세포 유형에서, 세포-내재성 경로에 대한 크로스-토크(cross-talk)는 세포-외인성 사멸 신호를 추가로 증폭시킬 수 있다 ([Scaffidi et al., J. Biol. Chem., 274:1541 (1999)]). Apo2L/TRAIL은 정상 조직에 대한 효과가 거의 없거나 없으면서 다양한 종양 세포 유형에서 세포자멸사를 유도하고, 이는 Apo2L/TRAIL이 암 요법에 유용할 수 있음을 시사한다 (예를 들어, [Ashkenazi, Nat. Rev. Cancer, 2:420 (2002)]; [Kelley et al., Curr. Opin. Pharmacol., 4:333 (2004)] 참조). 세포자멸사 경로의 다양한 성분에서의 변형이 특정 암 세포주에서의 Apo2L/TRAIL 민감도를 감소시킬 수 있다 ([Igney et al., Nat. Rev. Cancer, 2:277 (2002)]).
하기 기재된 방법 및 프로토콜에 따라 다양한 실험을 수행하였고, 데이타가 도 10-15에서 제공된다.
수용체 활성화에 대한 민감도를 조사하기 위해, 세포 생존을 23개의 췌장 선암종, 18개의 악성 흑색종, 및 36개의 결장직장 선암종이 포함되는 인간 암 세포주의 패널에서 Apo2L/TRAIL 농도의 함수로서 시험하였다 (도 10A 및 제시되지 않은 데이타). 이러한 분석으로 29/77 (38％)의 세포주가 Apo2L/TRAIL에 대해 고도로 또는 중등도로 민감한 것으로 분류되었다. 이러한 29개의 세포주에서 50％ 세포 사멸을 달성하는데 요구되는 Apo2L/TRAIL 농도는 3 내지 800 ng/㎖ 범위였고, 평균 250 ng/㎖였다.
세포주 패널을 54,613개의 유전자-프로브 셋트의 마이크로어레이를 사용하여 유전자-발현 프로파일링에 의해 또한 조사하였다. 일부 예상에도 불구하고, Apo2L/TRAIL에 대해 강한 또는 중간 정도의 민감도를 나타낸 췌장암 및 흑색종 세포주에서 상응하는 저항성 세포주에 비해 현저하게 더 높은 O-글리코실화 효소 ppGalNAcT-14의 mRNA 수준이 발현되었다 (p=0.5×10-4 (피셔의 정확 검증), 췌장암종에 대해 750, 흑색종에 대해 300으로 반복적으로 할당된 절사값) (도 10B). 대부분의 Apo2L/TRAIL-민감성 결장직장암 세포주는 관련된 O-글리코실화 효소 ppGalNAcT-3의 높은 mRNA 발현을 나타냈지만, 여러 저항성 세포주 또한 이러한 유전자를 발현하여, 더 약하지만 유의한 차이가 생성되었다 (p=0.026, 2000으로 할당된 절사값) (도 10C, 하부). 전체 패널에서의 예외는 하기와 같았다: (a) 민감성이지만, 절사값 수준 미만의 ppGalNAcT-14 또는 ppGalNAcT-3이 발현된 5/29 (17％) 세포주; (b) 저항성임에도 불구하고 ppGalNAcT-14 또는 ppGalNAcT-3 수준이 절사값을 초과한 16/48 (33％) 저항성 세포주. 결장직장 세포주에서의 기타 O-글리코실화 효소의 mRNA 발현을 조사함으로써, 6/24 (25％)의 저항성 세포주와 비교하여 10/12 (83％)의 민감성 세포에서 더 높은 수준의 Fut-6이 검출되었다 (p=0.013; 200으로 할당된 절사값) (도 10C, 상부). 췌장암 및 흑색종에서의 ppGalNAcT-14와 결장직장암 세포주에서의 Fut-6의 조합된 발현은 Apo2L/TRAIL 민감도와 매우 강하게 상호관련되었다 (p=1.83×10-7, N=77). 이러한 유전자-셋트는 각각 23/32 (72％)의 마커-양성 세포주 및 39/45 (87％)의 마커-음성 세포주에 대한 민감도 또는 저항성을 정확하게 예측하였다.
Apo2L/TRAIL 민감도를 종양 이종이식을 사용하여 생체내에서 또한 조사하였다. Fut-6-양성 결장직장암 세포주 Colo205 및 DLD-1로부터 유래된 종양이 있는 마우스를 5일 동안 Apo2L/TRAIL로 처리하면 종양 퇴행이 야기되었고, 이어서 종양 진행이 매우 지연되었다 (도 10D). 대조적으로, Fut-6-음성 결장직장암 세포주 Colo320 및 RKO로부터 유래된 종양은 이러한 처리에 응답하지 않았다.
ppGalNAcT-3/Fut-6-양성 Colo205 세포주를 pan O-글리코실 트랜스페라제 억제제 벤질-GalNAc ([Delannoy et al., Glycoconj., 13:717 (1996)])와 함께 예비인큐베이션하면 Apo2L/TRAIL에 대한 민감도가 현저하게 감소하였고 (도 11A), 이는 O-글리코실화와 Apo2L/TRAIL 신호전달 간의 기능성 연관을 시사한다. 이를 추가로 조사하기 위해, ppGalNacT-14, ppGalNacT-3, 또는 Fut-6 mRNA를 표적으로 하는 특이적 소형 간섭 (si)RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 표적에서 벗어나는 효과를 배제하기 위해, 중첩되지 않는 다중 siRNA를 각각의 유전자에 대해 합성하고, 정량적 RT-PCR에 의해 표적 발현을 감소시키는 능력을 확인하였다 (도 14A). siRNA-표적 영역 내에 6개의 '침묵' 뉴클레오티드 변화를 함유하는 돌연변이체 ppGalNacT-14 플라스미드로 siRNA 특이성을 추가로 확인하였다 ([Editorial, Nat. Cell. Biol., 5:489 (2003)]) (도 14B). ppGalNAcT-14 siRNA로의 ppGalNAcT-14-양성 PSN-1 췌장암종 및 Hs294T 흑색종 세포주의 형질감염은 Apo2L/TRAIL에 대한 민감도를 실질적으로 감소시킨 반면, 카스파제-8 siRNA는 예상대로 본질적으로 완전한 보호를 제공하였다 (도 11B). 유사하게, GalNAcT-3 또는 Fut-6 siRNA로의 DLD- 1 또는 C170 결장직장암 세포의 형질감염은 Apo2L/TRAIL에 대한 민감도를 유의하게 감소시켰다 (도 11C 및 도 14C). 요약하면, GalNAcT-14 siRNA는 4/5의 췌장암 및 2/2의 흑색종 세포주에서 Apo2L/TRAIL에 대한 민감도를 감소시킨 반면, 각각의 ppGalNAcT-3 또는 Fut-6 siRNA는 2/3의 결장직장암 세포주에서 민감도를 감소시켰다. 대조적으로, GalNAcT-14 siRNA로의 PSN-1 또는 Hs294T 세포의 형질감염은 토포이소머라제 II 억제제 에토포시드에 대한 민감도를 변형시키지 않았다 (도 14D). 유사하게, GalNAcT-14 또는 GalNAcT-3 siRNA로의 PSN-1 또는 C170 세포의 형질감염은 광범위한 스펙트럼의 단백질 키나제 억제제 스타우로스포린에 대한 민감도에 영향을 미치지 않았다 (도 14E). 에토포시드 및 스타우로스포린 모두 세포-내재성 경로를 통해 세포자멸사를 자극하기 때문에 ([Wei et al., Science, 292:727 (2001)]), 이러한 연구는 O-글리코실화 효소가 세포-외인성 경로를 통해 세포자멸사 신호전달을 조정할 수 있다는 것을 시사하였다.
ppGalNAcT-14로의 HEK293 세포의 형질감염은 DR4 또는 DR5와 공동-형질감염되었을 때 세포 사멸을 나타냈지만, 관련 수용체 Fas 및 TNFR1 또는 세포-내재성 경로 작동제 Bax와 공동-형질감염되었을 때는 나타내지 않았다 (도 11D). 또한, ppGalNAcT-14 형질감염은 저항성 세포주 H1568 흑색종 (도 11E) 및 PA-TU-8902 및 PL-45 췌장암종 (도 14F)의 Apo2L/TRAIL 민감도를 증가시켰지만, 에토포시드에 대한 민감도는 변화시키지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). 종합적으로, GalNAcT-14 과발현은 4/7의 세포주를 Apo2L/TRAIL에 대해 민감화시켰다.
ppGalNacT-14 또는 Fut-6의 siRNA 녹다운의 효과를 Apo2L/TRAIL-유도 카스파 제 프로세싱에 대해 조사하였다. 대조군 siRNA로 형질감염된 PSN-1 및 DLD-1 세포에서, Apo2L/TRAIL은 본질적으로 완전한 카스파제-8 프로세싱을 유도하여, Bid, 카스파제-9 및 카스파제-3의 절단에 이르게 되었다 (도 12A). 카스파제-8 siRNA로의 형질감염은 이러한 이벤트를 방지하였다. PSN-1 세포에서의 ppGalNAcT-14 녹다운 또는 DLD-1 세포에서의 Fut-6 녹다운 또한 카스파제-8, Bid, 카스파제-9, 및 카스파제-3의 Apo2L/TRAIL-유도 프로세싱 (도 12A), 및 카스파제-3/7 활성의 자극 (도 12B)을 현저하게 약화시켰다. 낮은 수준의 ppGalNAcT-3 및 Fut-6를 발현하는 Apo2L/TRAIL-저항성 RKO 및 SW1417 결장직장암 세포주가 카스파제-8 프로세싱 수준에서의 유사한 차단을 나타냈다 (도 15A). 따라서, O-글리코실화 효소는 카스파제-8 활성화에 이르는 이벤트의 상류에서 Apo2L/TRAIL 경로를 조정할 수 있다.
카스파제-8 활성화는 DISC 어셈블리를 필요로 한다 ([Ashkenazi et al., Science, 281:1305 (1998)]). PSN-1 및 DLD-1 세포 내의 Apo2L/TRAIL DISC ([Kischkel et al., Immunity, 12:611 (2000)])의 분석은 ppGalNAcT-14 또는 Fut-6의 녹다운이 DISC에 대한 FADD 및 카스파제-8의 동원, DISC-결합 카스파제-8의 프로세싱, 및 DISC-회합 카스파제-8 효소 활성의 자극을 감소시켰다는 것을 가리켰다 ([Sharp et al., J. Biol. Chem., 280:19401 (2005)]) (도 12C, 12D, 및 도 15B). ppGalNacT-14 또는 Fut-6 siRNA는 DISC 내의 DR4 및 DR5의 양, 또는 DR4 및 DR5 모두를 발현하는 PSN-1 또는 DLD-1 세포에 대한 Apo2L/TRAIL의 용량-의존적 결합을 실질적으로 변화시키지 않았다 (도 12C, 도 15B, 및 제시되지 않은 데이타). 따라서, ppGalNAcT-14 및 Fut-6은 세포-표면 수용체 수준 또는 Apo2L/TRAIL 결합에 영 향을 미침으로써 세포자멸사를 조정하는 것으로 보이지 않는다. 이와 일치하여, 77개의 세포주 패널에서의 Apo2L/TRAIL 민감도는 동족 신호전달 수용체 DR4 및 DR5 또는 미끼 수용체 DcR1 및 DcR2의 세포-표면 발현과 유의한 상관관계를 나타내지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). 또한, ppGalNAcT-14, ppGalNacT-3, 또는 Fut-6에 대한 대부분의 siRNA는 PSN-1, C170, 또는 DLD-1 세포 상에서의 DR4 및 DR5 수준을 변화시키지 않았다 (도 15C1 및 15C2). 두 siRNA는 특정 세포주에서 DR4 및 DR5의 검출가능한 감소를 야기하지 않았다 (도 15C1 및 15C2). 그러나, 동일한 효소에 대한 다른 siRNA들은 수용체 수준을 변화시키지 않으면서 Apo2L/TRAIL-유도 세포자멸사를 억제하였다.
인간 DR5의 세포외 도메인 (ECD)이 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 발현되었고, 분비된 단백질을 정제하여, 산 가수분해시키고, 회합된 단당류를 분석하였다 (도 13A). DR5 BCD 내의 예측된 N-글리코실화 부위의 부재와 일치하도록, N-연결 글리칸이 검출되지 않았다. 그러나, 2개의 독립적인 실험으로부터의 2개의 샘플이 DR5 ECD 1 몰 당 3 몰의 GalNAc 및 3 몰의 Gal을 나타냈고 (도 13A), 이는 코어(core) 글리칸 GalNAc-Gal으로의 DR5 상의 3개의 부위의 0-연결 변형을 시사하였다.
단백질 O-글리코실화는 세린 또는 트레오닌을 변형시킨다. 잠재적인 O-글리코실화 부위의 예측을 위해 기존에 수립된 바이오인포매틱스 도구를 사용하여 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc) ([Julenius et al., Glycobiology, 15:153 (2005)]), 인간 DR5의 긴 (DR5-L) 및 짧은 (DR5-S) 스플라이스 변이체의 공 통적인 ECD 서열 내의 2개의 이같은 영역, 및 별법적으로 스플라이싱된 영역 내의 제3의 부위를 확인하였다 (도 13B). 첫번째 아미노산 절편 (74-77)은 3개의 세린을 함유하고; 두번째 절편 (130-144)은 5개의 트레오닌을 함유하는 반면, 세번째 절편은 4개의 트레오닌 및 3개의 세린을 갖는다. 뮤린 DR5는 각각 2개의 세린 및 4개의 트레오닌을 갖는, 첫번째 2개의 절편과 유사한 서열이 갖고, 인간 DR4 또한 1개의 세린 및 5개의 트레오닌을 함유하는 2개의 유사한 서열을 갖는다. 이러한 부위들이 DR5의 번역후 변형에 중요한지 여부를 시험하기 위해, DR5L 및 DR5S 돌연변이체의 셋트를 만들고, 절편 130-144의 5개의 트레오닌 (DR5L-5T, DR5S-5T), 또는 이러한 동일한 5개의 트레오닌뿐만 아니라 절편 74-77의 3개의 세린 (DR5L-5T3S, DR5S-5T3S)을 알라닌으로 대체하였다. DR5L 또는 DR5S로 형질감염된 HEK293 세포로부터의 용해물의 DR5 항체 면역블롯은 예상된 DR5L 또는 DR5S 밴드의 존재를 나타냈다 (도 13C). 항체가 더 높은 분자량 (MW)의 DR5 밴드를 또한 검출하였고, 이는 대조군과 비교하여 DR5L 또는 DR5S와 ppGalNAcT-14의 공동-형질감염시 더욱 풍부해졌다 (도 13C, 별표). 이러한 더 높은 분자량의 밴드의 풍부함 및 ppGalNAcT-14에 의한 이의 증대는, 야생형 구축물과 비교하여, DR5L-5T 또는 DR5S-5T로 유의하게 감소되었고, dDR5L-5T3S 또는 DR5S-5T3S로 거의 폐지되었다. 이러한 결과는 더 높은 분자량의 밴드가 O-글리코실화 형태의 DR5를 나타낸다는 것을 시사하였다: ppGalNAcT-14는 이의 형성을 촉진하고, 예측된 O-글리코실화 부위의 알라닌 치환에 의한 점진적인 제거는 이러한 효과를 점차적으로 역행한다. 뮤린 DR5 또는 인간 DR4, DR5L, 또는 DR5S로의 HEK293 세포의 형질감염은 세포 사멸을 나타냈다 (도 13D); 각각의 DR5 돌연변이체는 이의 상응하는 야생형 구축물보다 활성을 덜 나타냈고, DR5S-5T3S (모든 3개의 부위가 결여됨)가 활성이 가장 약했다. ppGalNAcT-14과의 공동-형질감염은, 활성을 유의하게 덜 나타낸 DR5S-5T3S을 제외하고는, 모든 DR4 및 DR5 구축물에 의한 세포 사멸을 현저하게 증강시켰다.
대다수의 정상-조직, 및 피부, 폐, 췌장, 유방, 난소, 자궁내막 및 방광의 암 또는 비-호지킨 림프종으로부터의 종양 샘플은 절사값 (대부분의 암에 대해 500, 피부 암에 대해 200으로 결정됨, 도 13E) 미만의 ppGalNAcT-14 mRNA 발현을 나타냈다. 그러나, 소엽성 유방암의 10％ 내지 폐암 및 확산성 대형 B-세포 림프종의 30％ 범위에 이르는 종양 세포의 상당한 부분집합이 ppGalNAcT-14의 과발현을 나타냈다. 일부 암 샘플은 mRNA 발현 수준이 상응하는 정상 조직의 1000배를 초과하였다. 암에서의 ppGalNAcT-14의 동적인 발현은 이러한 유전자, 및 가능하게는 기타 관련 효소가 Apo2L/TRAIL에 대한 민감도가 더 큰 종양을 확인하기 위한 유용한 바이오마커를 제공할 수 있다는 것을 시사한다.
O-연결 글리칸은 광범위한 구조적 다양성을 나타내고, 입체구조, 응집, 통행, 반감기, 뿐만 아니라 세포 부착 및 신호전달 활성을 포함하는 형질막 단백질 생물학의 다양한 양상을 조정한다 ([Hang et al., Bioorg. Med. Chem., 13:5021 (2005)]; [Hanisch, Biol. Chem., 382:143 (2001)]). 암 세포는 종종 O-글리칸 프로파일에서 극적인 변화를 나타내어, 독특한 종양-관련 탄수화물 항원을 생성시킨다 ([Brockhausen, Biochim. Biophys. Acta, 1473:67 (1999)]; [Dube et al., Nat. Rev. Drug Discovery, 4:477 (2005)]; [Fuster et al., Nat. Rev. Cancer, 5:526 (2005)]). 또한 O-글리코실화는 특정 전이 부위로의 종양 세포의 귀향에서 중요한 역할을 한다 ([Fuster et al., Cancer Res., 63:2775 (2003)]; [Ohyama et al., EMBO J., 18:1516 (1999)]; [Takada et al., Cancer Res., 53:354 (1993)]). 결장 및 결장직장 세포 샘플, 흑색종 세포 샘플 및 연골육종 세포 샘플을 포함하여, 다양한 인간 암으로부터의 원발성 종양 샘플의 상당한 부분집합은 O-글리코실화 효소 ppGalNAcT-14의 상승된 발현을 나타낸다.
방법
재료.
세포 배양 시약은 Gibco (Invitrogen/Gibco, Carlsbad, CA)에서 구입하였고, 태그가 부착되지 않은 가용성 Apo2L/TRAIL은 기존에 기술된 바와 같이 제조하였으며 ([Lawrence et al., Nat. Med., 7:383 (2001)], O-연결 글리코실화 억제제 벤질-a-GalNAc는 Calbiochem로부터 구입하였고, 모든 기타 화학물질 (에토포시드 및 스타우로스포린 포함)은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
세포 배양 및 세포주.
모든 119개의 인간 암종 세포주 (명칭 및 카탈로그 #에 대해서는 보충 데이타 참조)를 ATCC 또는 DSMZ (Braunschweig, Germany)로부터 수득하여, 페니실린/스트렙토마이신과 같은 항생제가 없는, 10％ 열 불활성화 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 10 mM HEPES가 보충된 RPMI1640에서 37℃ 및 5％ CO2에서 배양하였다. 293 인간 배아 신장 세포 (카탈로그 # CRL-1573)를 또한 ATCC로부터 수득하여, 10％ FBS가 보충된 100％ 둘베코 변형 이글 배지에서 배양하였다. O-글리코실화 돌연변이체 CHO 세포주인 ldlD CHO는 MIT (Boston MA)의 몬티 크레이거(Monty Kreiger) 박사로부터 허가받았다.
세포 생존력 분석법 및 세포자멸사 분석법.
Apo2L/TRAIL에 대한 IC50을 결정하기 위해, 세포를 삼중으로 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 24시간 동안 부착시킨 후, 1000 ng/㎖까지의 증가하는 농도의 재조합 인간 Apo2L/TRAIL로 처리하였다. 72시간 인큐베이션 후, 생존력 분석법 - MTT 분석법 (Pierce) 또는 CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 분석법 (Promega) -에 제조사의 프로토콜에 따라 적용하였다. 각각의 세포 생존력 실험을 저농도 (0.5％) 및 고농도 (10％ PBS) 혈청에서 3회 이상 반복하였고, 독립적인 실험들의 IC50 사이의 또는 저농도와 고농도 혈청 사이의 변동성에 의해 중간 정도로 민감한 세포주를 정의하였다. 1 ㎍/㎖의 Apo2L/TRAIL 농도에서 세포의 50％ 이상의 세포자멸사 유도를 기초로 세포주를 민감한 것으로 정의하였고, 독립적인 실험에서 또는 저농도 (0.5％) 대 고농도 (10％) 혈청의 존재 하에 유도된 세포자멸사의 양의 변동성을 기초로 중간 정도로 민감한 것으로 정의하였다. 아넥신 V (BD Pharmingen)로 염색된 수확된 세포 (부착물 + 배지 내 부유물)의 평균 백분율의 유동 세포계측 분석에 의해 세포자멸사를 정량하였다.
마이크로어레이 혼성화 및 데이타 분석.
전체 세포 RNA를 미처리된 세포 (3×106)로부터 RNeasy 키트 (Quiagen)를 사 용하여 제조하였다. 기존에 기술된 바와 같이 ([Hoffman et al., Nat. Rev. Genetics, 5:229 (2004)]; [Yauch et al., Clin. Cancer Res., 11:8686 (2005)]),표지된 cRNA를 제조하여 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 (U133P 진칩; Affymetrix Incorporated, Santa Clara, CA)에 혼성화시켰다. 스캐닝된 영상 파일을 진칩.3.1 (Affymetrix), Spotfire, GenePattern 및 Cluster/TreeView로 분석하였다. 민감성 세포주와 저항성 세포주 간에 가장 차별적으로 발현된 유전자를 확인하기 위해, 샘플들에 걸친 배수-변화 및 절대 변화량을 시험하고, 최대값 및 최소값의 비율 (최대값/최소값) 및 최대값과 최소값 간의 차이 (최대값 - 최소값)를 미리 정해진 값과 비교하고, 양쪽 조건을 따르지 않는 유전자를 배제함으로써 분석될 샘플들에 걸쳐 변화량이 최소인 유전자를 배제하는 변화량 필터에 유전자-발현 값을 적용하였다.
발현 구축물 및 레트로바이러스 형질도입.
ppGalNAcT-14를 코딩하는 DNA 단편을 Apo2L/TRAIL 민감성 세포주로부터 풀링된 cDNA로부터 클로닝하고, N-말단 Flag 태그와 함께 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (Invitrogen) 내로 삽입하였다. 그후, 이러한 구축물을 부위 지정 돌연변이 유발 (Quikchange 돌연변이유발 키트, Stratagene)에 적용하여, 단백질 서열을 변화시키지 않으면서, siRNA에 상동성인 서열 내에 4-6개의 워블(wobble) 염기쌍 변형이 있는 siRNA 침묵 돌연변이체를 생성시켰다. 돌연변이는 19bp siRNA 결합 서열의 중앙의 10bp 영역에 스패닝(spanning)되었다. DR5Long 및 DR5Short, DR4, 뮤린 TRAIL 수용체, DR4, Fas (변이체 1), TNFR1 및 Bax (베타 변이체)에 대한 DNA 서열 을 cDNA 풀로부터 클로닝하여, pRK 발현 벡터 (Genentech) 내로 삽입하였다. 4개의 트레오닌의 알라닌 잔기로의 부위-지정 돌연변이 Mut4×TA (T130, T131, T132, T135) 또는 5개의 트레오닌의 알라닌 잔기로의 부위-지정 돌연변이 Mut5×TA (T130, T131, T132, T135, T143)에 의해 DR5L 및 DR5S의 O-글리코실화 돌연변이체가 생성되었다. 세포자멸사-유발(proapoptotic) 분자의 발현 구축물로의 HEK293 세포 내로의 일시적인 형질감염을 6웰 플레이트에서 0.5 ㎍/웰의 세포자멸사-유발 분자 및 2.0 ㎍의 ppGalNAcT-14 또는 벡터 대조군의 농도로 수행하였다. 세포를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 48시간 인큐베이션 후, 세포를 세포자멸사 분석에 적용하였다.
레트로바이러스 구축물을 생성시키기 위해, ppGalNAcT-14 및 돌연변이체를 pQCXIP 레트로바이러스 벡터 (Clontech) 내로 클로닝하였다. ΦNX-Ampho 헬퍼 세포주를 사용하여 고역가 레트로바이러스 상청액을 생성시켰다. 패키징(packaging) 세포를 인산칼슘 (Invitrogen)을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후 상청액을 단리하고, 10 ㎍/㎖ 폴리브렌과 함께 표적 세포에 첨가한 후, 1시간 동안 2700 rpm에서 원심분리하여, 감염을 증강시켰다. 형질도입 후, 세포를 2 ㎍/㎖ 푸로마이신으로 선별하였다.
siRNA 디자인 및 형질감염 프로토콜.
ppGalNAcT-14, ppGalNAcT-3, 카스파제-8 및 DR5에 대한 siRNA가 이들의 독점적인 선별 기준을 사용하여 다마콘(Dharmacon) (Lafayette, CO)에 의해 디자인되었다. 선별된 서열은 하기와 같았다:
siGalNAcT-14 (1): 5' GACCATCCGCAGTGTATTA-dTdT 31 (=14-4) (서열 15)
siGalNAcT-14 (2): 5' ATACAGATATGTTCGGTGA-dTdT 3' (=14-6) (서열 16)
siGalNAcT-3 (1): 5' CCATAGATCTGAACACGTT-dTdT 3' (=3-2) (서열 17)
siGalNAcT-3 (2): 5' GCAAGGATATTATACAGCA-dTdT 3' (=3-7) (서열 18)
siFut-6 (1) 5' GUACCAGACACGCGGCAUA-dTdT 3' (=6-1) (서열 19)
siFut-6 (2) 5' ACCGAGAGGUCAUGUACAA-dTdT 3' (=6-2) (서열 20)
si카스파제-8: 5' GGACAAAGTTTACCAAATG-dTdT 3' (서열 21)
siRNA를 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로 구입하여, 각각의 siRNA에 대해 25 nM의 최종 농도로 개별적인 세포주 내로 형질감염시켰다. 비-표적화 서열에 대한 RNA 듀플렉스 (Dharmacon)를 대조군으로 사용하였다. 예비-플레이팅된 지질-siRNA 복합체에 현탁액으로 세포가 첨가되는 역 형질감염에 의해 리포펙타민2000 (Invitrogen)를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 리포펙타민2000의 농도는 제조사의 프로토콜에 따랐다. 48시간 인큐베이션 후, 세포를 mRNA 분석을 위해 수확하거나, 또는 생존력 분석을 위해 재조합 인간 Apo2L/TRAIL, 에토포시드 또는 스타우로스포린과 함께 추가로 24-72시간 동안, 또는 웨스턴 블롯 분석을 위해 4시간, 8시간 또는 24시간 동안 인큐베이션하였다.
벤질-a- GalNAc 로의 O- 글리코실화의 억제.
Colo205 세포를 벤질-a-GalNAc (2 mM 또는 4 mM)의 존재 하에 72시간 동안 성장시켰다. 이러한 시점에, 세포를 96웰 플레이트에 다시 플레이팅하고, 여전히 억제제의 존재 하에 24시간 동안 부착시켰다. 그후, 세포를 지시된 바와 같이 증 가 농도의 Apo2L/TRAIL로 자극하고, 생존력 분석법에 적용하였다.
정량적 PCR .
GalNacT-14 및 GalNacT-3 전사체 발현 수준을 정량적 RT-PCR에 의해 표준Taqman 기술을 사용하여 평가하였다. 전사체 수준을 하우스키핑 유전자인 GAPDH에 대해 표준화시켰고, 결과는 표준화된 발현 값 (=2- DCt)으로 표현된다. GalNacT-14 (카탈로그#: Hs00226180_m1_GT14), GalNacT-3 (카탈로그# :Hs00237084_m1_GT3) 및 GAPDH (카탈로그#: 402869)에 대한 프라이머/프로브 셋트는 Applied Biosystems (Foster City, CA)로부터 구입하였다.
면역침전, 웨스턴 블롯 분석 및 항체.
IP: 항-Apo2L (2E11; ATCC 접속 번호 HB-12256), 항-DR4 (3G1 및 4G7, ATCC 접속 번호 PTA-99) 및 항-DR5 (3H3, ATCC 접속 번호 12534, 및 5C7) 모노클로날 항체가 Genentech, Inc.에서 수용체-Fc 융합 단백질을 항원으로 사용하여 생성되었다. Apo2L/TRAIL DISC를 면역침전시키는데 사용된 항-DR4 (4G7) 및 항-DR5 (5C7) 모노클로날 항체를 이뮤노퓨어 프로테인(ImmunoPure Protein) G IgG 플러스(Plus) 배향 키트 (카탈로그# 44990, Pierce)를 사용하여 아가로스에 접합시켰다. DISC 면역침전에서 DR4/5의 면역검출에 사용된 항-DR4 (3G1) 및 항-DR5 (3H3) 모노클로날 항체를 EZ-링크 술포-NHS-LC 비오틴화 키트 (카탈로그# 21217, Pierce)를 사용하여 비오틴화시켰다. FLAG-태그가 부착된 Apo2L/TRAIL을 제조하고, 기술된 바와 같이 항-FLAG 항체 M2 (Sigma)와 가교시켰다 ([Kischkel, Immunity, 12:611 (2000)]). 이러한 실험은 Apo2L/TRAIL-FLAG + 항-FLAG DISC 분석에 대해 기존에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Kischkel, 상기 문헌]). 항-DR4 (4G7) 및 항-DR5 (5C7) 모노클로날 항체를 면역침전용 아가로스에 직접 접합시킨 것을 제외하고는 DR4/5 DISC 면역침전 실험을 또한 기술된 바와 같이 수행하였다 ([Sharp et al., J. Biol. Chem., 280:19401 (2005)]).
WB: 5×105 개의 세포/웰을 6웰 플레이트에 파종하였다. RNAi 녹다운 실험을 위해, 세포를 여러 siRNA로 48시간 동안 처리한 후, Apo2L/TRAIL로 4시간, 8시간 또는 24시간 동안 처리하였다. 지시된 기간의 시간 후에, 세포를 빙냉 PBS에서 세척하고, 저장성 용해 완충제 (20 mM HEPES pH 7.5, 10 mM KCL, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA 및 1 mM DTT)를 함유하는 1％ 트리톤(Triton) X-100에서 용해시켰다. 각각의 샘플에 대해 40 ㎍의 단백질을 10％ 또는 10-20％ 구배 SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에서 환원 조건 하에 분리시켰다. 니트로셀룰로스 막 (Schleicher & Schuell)으로 옮긴 후, 막을 1시간 동안 10％ 무지방 우유 분말에서 인큐베이션 하고, 이어서 1시간 동안 하기의 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다: 염소 항-카스파제-3 항체 (1:1000, R&D), 토끼 항-카스파제-8 항체 (1:1000, Pharmingen), 마우스 항-카스파제-9 항체 5B4 (1:1000, MBL), 토끼 항-Bid 항체 (1:1000, Pharmingen), 토끼 항-DR5 항체 (1:500, Cayman) 또는 염소 항-액틴 항체 (1:200, Santa Cruz Biotechnology). 막을 TBS/0.05％ 트윈으로 5회 세척한 후, 각각의 과산화효소가 접합된 친화력 정제 2차 항체 (1:5000, Biorad)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였 다. 막을 다시 5회 세척하고, 증강된 화학발광 (ECL, Amersham)을 사용하여 발색시키고, Kodak Biomax 필름에 노출시켰다.
유동 세포계측법/ FACS 분석:
TNF 족 수용체 DR4 및 DR5의 표면 발현을 FACS Calibur 유동 세포계측기 (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA)를 사용하여 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 결정하였다. 지시된 siRNA로 48시간 동안 형질감염된 C170 및 PSN-1 세포를 10 ㎍/㎖의 1차 항체 4G7 (항-DR4) 또는 3H3 (항-DR5) 또는 마우스 IgG 대조군 항체로 1시간 동안 4℃에서 염색하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세척한 후, 플루오레세인 (FITC)이 접합된 염소 항-마우스 2차 항체 (Jackson Laboratories)와 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 유동 세포계측법에 의해 FACS Calibur 유동 세포계측기를 사용하여 분석하였다.
카스파제 분석법.
카스파제-3/-7 활성을 37℃에서 100 μM의 형광 펩티드 Ac-DEVD-AFC를 함유하는 카스파제 완충제 (50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 ％ 수크로스, 1 mM EDTA, 0.1％ CHAPS 및 10 mM DTT) 40 ㎕에서 분석하였다. 405-510 필터 쌍이 있는 키네틱 모드의 Molecular Devices 형광계측기를 사용하여 DEVD-AFC로부터의 AFC의 방출에 의해 지시된 시간에 걸쳐 연속적으로 활성을 측정하였다. 카스파제 활성의 평가를 위해, 20 ㎍의 전체 세포 단백질 (트리톤 X-100 추출물)을 40 ㎕의 카스파제 완충제 (100 μM DEVD-AFC 함유)에서 사용하였다.
CHO -유래 DR5 의 탄수화물 분석.
4 N TFA로의 가수분해 후 CHO-세포-유래 DR5의 단당류 조성을 수득하였다. 방출된 단당류를 펄스형 전류측정 검출기에 커플링된 고성능 음이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 Dionex BioLC HPLC 시스템 상에서 분석하였다..
동물 및 피하 이종이식 연구.
암컷 무흉선 누드 마우스 (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)를 Genentech의 동물 거주 설비에 실험 연구 전에 최소 1주일 동안 순응시켰다. 모든 실험 절차는 Genentech의 동물 실험 윤리 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee: IACAUC)에 의해 허가되었다. 마우스에게 5×106 개의 세포/마우스의 Colo205, DLD-1 및 RKO 또는 20×106 개의 세포/마우스의 Colo320HSR 인간 결장 암종 세포를 피하 접종하였다 (American Type Culture Collection). 종양 측정치를 디지털 캘리퍼에 의해 수집하고, 종양 부피를 식 □～□ (A= 길이) (B=폭)2을 사용하여 계산하였다. 일단 종양이 약 150 - 200 ㎣의 부피에 도달하면, 마우스를 무작위로 분류하고, 비히클 또는 Apo2L/TRAIL (60 ㎎/㎏/일)을 제0일-제4일에 복강내 투여하였다.
<110> Genentech, Inc. et al. <120> ASSAYS AND METHODS USING BIOMARKERS <130> P2245R2 <140> PCT/US2006/031894 <141> 2006-08-15 <150> US 60/708,677 <151> 2005-08-16 <150> US 60/808,076 <151> 2006-05-24 <160> 29 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr 1 5 10 15 Cys Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys 20 25 30 Val Ala Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met 35 40 45 Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu 50 55 60 Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser 65 70 75 Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys 80 85 90 Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu 95 100 105 Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln 110 115 120 Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr 125 130 135 Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys 140 145 150 Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser 155 160 165 Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly 170 175 180 Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu 185 190 195 Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile 200 205 210 Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser 215 220 225 Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg 245 250 255 Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 260 265 270 Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 2 <211> 1042 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> Unsure <222> 447 <223> Unknown base <400> 2 tttcctcact gactataaaa gaatagagaa ggaagggctt cagtgaccgg 50 ctgcctggct gacttacagc agtcagactc tgacaggatc atggctatga 100 tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 150 atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta 200 ctttaccaac gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca 250 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Ala Ser Ile His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Arg Met 425 430 435 Glu Glu Arg His Ala Lys Glu Lys Ile Gln Asp Leu Leu Val Asp 440 445 450 Ser Gly Lys Phe Ile Tyr Leu Glu Asp Gly Thr Gly Ser Ala Val 455 460 465 Ser Leu Glu <210> 4 <211> 1407 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggcgccac caccagctag agtacatcta ggtgcgttcc tggcagtgac 50 tccgaatccc gggagcgcag cgagtgggac agaggcagcc gcggccacac 100 ccagcaaagt gtggggctct tccgcgggga ggattgaacc acgaggcggg 150 ggccgaggag cgctccctac ctccatggga cagcacggac ccagtgcccg 200 ggcccgggca gggcgcgccc caggacccag gccggcgcgg gaagccagcc 250 ctcggctccg ggtccacaag accttcaagt ttgtcgtcgt cggggtcctg 300 ctgcaggtcg tacctagctc agctgcaacc atgatcaatc aattggcaca 350 aattggcaca cagcaatggg aacatagccc tttgggagag ttgtgtccac 400 caggatctca tagatcagaa cgtcctggag cctgtaaccg gtgcacagag 450 ggtgtgggtt acaccaatgc ttccaacaat ttgtttgctt gcctcccatg 500 tacagcttgt aaatcagatg aagaagagag aagtccctgc accacgacca 550 ggaacacagc atgtcagtgc aaaccaggaa ctttccggaa tgacaattct 600 gctgagatgt 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sapiens <400> 5 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg 1 5 10 15 Lys Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro 20 25 30 Gly Leu Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val 35 40 45 Leu Leu Leu Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp 50 55 60 Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser 65 70 75 Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp 80 85 90 Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr 95 100 105 His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp 110 115 120 Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr 125 130 135 Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro 140 145 150 Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val 155 160 165 Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His 170 175 180 Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 185 190 195 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys 200 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ccggtcccgg 1350 attcggggcg ctgacatcgc ccagggcacc actctgactt tcctcgacag 1400 cgatcgatat cattaacctg gacaccttca cctacatcga gtctgcctcg 1450 gagctcagag gggggtttga ctcctatcat agctggaggg ctcttcgtga 1500 tcgacaaagc ttggtttgat tacctgggga aatatgatat ggacatggac 1550 atctggggtg gggagaactt tgaaatctcc ttccgagtgt ggatgtgcgg 1600 gggcagccta gagatcgtcc ctatataaag aacaccaagc ggacagctga 1650 agtgtggatg gatgaataca agcaatacta ttacgctgcc cggccattcg 1700 caagtggtac ctggagaata tctaccctga actcagcatc cccaaggagt 1750 cctccatcca gaagggcaat atccgacaga gaaggtcaaa ggcgaagatg 1800 caaagtccca ggtatgggcc ttcacataca cccagcagat cctccaggag 1850 gagctgtgcc tcaatggacc aaaactggtt cccacatcga gcacatagca 1900 tcccacctct gcctcgatac agatatgttc ggtgatggca cagctcttga 1950 ggacccctgc cagaagcagc aagggccatg gggtggtgct tccctggacc 2000 agaacagact ggaaactggg ccaactgtct cagggaggac agaggaaaac 2050 atcacaagcc aatggggctc aaagacaaat cccacatgtt ctcaaggccg 2100 ttgttccttt tcctacaaag gaagcagtct ctggaggcca gaaacaaaag 2150 ccttcttttt cactaggcca ggactacatt gactgcagcc gagtggggca 2200 cgtcttccgg aagaagcacc cctacgtttt ccctgatgga aatgccaaca 2250 cgcctggaga ggcccttcgg gaatgttgag agcagattgg acctgaggaa 2300 gaatctgcgc tgccagagct tcacagaagt gcctggaatc tcaaaggcag 2350 aacaaccaag aaaccccaaa cctaaagttg agcccctgtg ccgtcagtca 2400 tcaccttgtt ccctggcgcc ccagtggttc ttgtcctttg caagaatgga 2450 gatgaccgac agcgagaacg gcaaggaaat cgtcgtcaac ccatgtgagt 2500 cctcactcat gagccagcac tgggacatgg tgagcaagca gcctgcaacc 2550 acctcagaca tcctggactg ggaggtccag gcagagcccc ccaggacagg 2600 agtaagttcc agtcctggcc agtcattccc tgattggtat ctggagacag 2650 aaacctaatg ggaagtgttt atagagatga agaatggagg ttgtttccaa 2700 aagaaataaa gagaaactta gaagttgaaa aaaaaaaaaa aa 2742 <210> 12 <211> 552 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Arg Arg Leu Thr Arg Arg Leu Val Leu Pro Val Phe Gly Val 1 5 10 15 Leu Trp Ile Thr Val Leu Leu Phe Phe Trp Val Thr Asp Leu Trp 20 25 30 Asp Gln Phe Asp Glu Arg Arg Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Trp Arg 35 40 45 Val Gly Asp Asp Pro Tyr Lys Leu Tyr Cys Thr 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Glu Ser Ala Ser 260 265 270 Glu Leu Arg Gly Gly Phe Asp Pro Ile Ile Ala Gly Gly Leu Phe 275 280 285 Val Ile Asp Lys Ala Trp Phe Asp Tyr Leu Gly Lys Tyr Asp Met 290 295 300 Asp Met Asp Ile Trp Gly Gly Glu Asn Phe Glu Ile Ser Phe Arg 305 310 315 Val Trp Met Cys Gly Gly Ser Leu Glu Ile Val Pro Tyr Ile Lys 320 325 330 Asn Thr Lys Arg Thr Ala Glu Val Trp Met Asp Glu Tyr Lys Gln 335 340 345 Tyr Tyr Tyr Ala Ala Arg Pro Phe Ala Lys Trp Tyr Leu Glu Asn 350 355 360 Ile Tyr Pro Glu Leu Ser Ile Pro Lys Glu Ser Ser Ile Gln Lys 365 370 375 Gly Asn Ile Arg Gln Arg Lys Val Lys Gly Glu Asp Ala Lys Ser 380 385 390 Gln Val Trp Ala Phe Thr Tyr Thr Gln Gln Ile Leu Gln Glu Glu 395 400 405 Leu Cys Leu Gln Trp Thr Lys Thr Gly Ser His Ile Glu His Ile 410 415 420 Ala Ser His Leu Cys Leu Asp Thr Asp Met Phe Gly Asp Gly Thr 425 430 435 Ser Ser Cys Ser Arg Val Gly His Val Phe Arg Lys Lys His Pro 440 445 450 Tyr Val Phe Pro Asp Gly Asn Ala Asn Thr Leu Glu Arg Pro Phe 455 460 465 Gly Asn Val Glu Ser Arg Leu Asp Leu 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gtcgtaagtc cagatattgc 500 atccatagat ctgaacacgt ttgaattcaa caaaccttct ccttatggaa 550 gtaaccataa aaagatgaaa cctacccaat taaaacaccc acttttgcag 600 gaggactttt ttccatatca aaagaatatt ttgagtatat tgtggtgggc 650 agttggagat tatgccttgc tctgttgttg gacatgtttt tcgcagcaaa 700 agccctcata gctttccaaa ttttatagga gaaatacaga tgcagcaaaa 750 attgttaaac aaaaagcatt tggtgatctt tcaaaaagat ttgaaataaa 800 gaagaagaaa taactgttat ttgtcaagtg acaagctttt aatgtcagat 850 tttttcttta taatagtttt ggttttaatg caaagagaag taagtgttca 900 atattccaaa gaggaatcag ccaaaaatgc aaataggagc acctgtcagg 950 caaaacattg atgctggtga gagaccttgt ttgcaaggaa ttcaagacaa 1000 ccaatttaag tgttgaagag caaaaggaaa aggaacgtgg ggaagctaaa 1050 cactgcttta tttaagcgct gccctcccct gcccaccacc agtgtcataa 1100 tagtttttca taatgaagcg tggtccacgt gtagatgagt acttacatga 1150 taaactagat gaatatgtaa aacaattttc tatagtaaaa atagtcagat 1200 gctcactgtg agtgtttcta tggttggcta gaacctctgt tggccagaat 1250 agctgagaac tacacggctc cgtggaaatt ttgactggag tctttcattt 1300 ggctgggagt cgcttcctga tcatgagaag caaagaaggt ggaagctatg 1350 atgaagaaat ggaaatctgg ggaggtgaaa atatagaaat gtctttcaga 1400 gtatggcaaa ggcactcagg tgattgctag aaaccaagtt cgccttgcag 1450 aagtctggat ggatgaatac aaggaaataa caccgtcttc ggtgtaaaaa 1500 ttttacatgg tatctgaaca acatttatcc agaggtgtat gtgccagacc 1550 ttaatcctgt tatatctgga tacattaaaa gcgttggtca gcctctatgt 1600 ctggatgttg gagaaaacaa tcaaggaggg aaattcggca caacatccag 1650 aaggaattat gtcttcatgc tgctcaaggt ctcgttcagc tgaaggcatg 1700 tacctacaat tcttaaaaat gtgcctttca gcaaatggag agcatccaag 1750 tttagtgtca tgcaacccat cagatccact ccaaaaatgc tgtgactagg 1800 catacactgt agtttttgaa aattatgcaa aagcagctaa atgtaactta 1850 ttccaagtgc atttttctta taccaaagac tatttcaaaa tgtccagatg 1900 taggggaaga gatgtttaca gtatgatgaa aataattttc caagtaaagt 1950 atttccccta gttttttggg gggataggaa gaaagatttg ttactgtatt 2000 tttttaacta cataaaaata gatcaataag gtgaactttt ttttgcgttt 2050 ggtttacttg tctgtcaaat gtttccttaa acatgaaact gaataaggag 2100 aagagtattt aagtcttcct taaatgactt ttcttaagta atgatactgt 2150 gtgttttccc aaagcacttt taaaaaaatt tttataaatt gaatgtttgt 2200 gatattaaat ttcaaatgca gaatacttga ctcatttaaa gctaaatttt 2250 gttactgatt caattataaa acacaataaa aaatcctcaa cactaaaaaa 2300 aaaaaaacaa accattaatt atgtatacat gtcatggact tgggggaaac 2350 cagtactttg aatactctgc tcaacatagg tcacaagaca gttgtcactg 2400 gagagcagat atgggagatc cagaaggatc aacttctata caatccagat 2450 acttagccaa aatgattaag tgttccttaa aattaagttg aaaaaggaaa 2500 tattctttct cataaaaatt tatatcttta tgtagcacta tctacagaaa 2550 ttctgcaagt ttctgtttca aagcacaata actagtatga agtttgtgtg 2600 ttttgtacac ttagggatat atatatatag ctacattcac acactcacaa 2650 tttaaaaatg tcagcattgg cctctgtgta caaaccaaga gcttttacag 2700 atccagaatt tattagttta aaatgcattt aacacttaaa tttcttggca 2750 aattttaaaa cattttttag tctgtaatac actccacttg aagcacttac 2800 tatctgttga aaaggtgtcc ttttcctttc ttctagtatt ttttttctta 2850 ccaaaattca ctaatctttg taatggattt ttgactttgt aatggattct 2900 tttcatcaaa aagccttatt tttttatcta tgtggaa 2937 <210> 14 <211> 633 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala His Leu Lys Arg Leu Val Lys Leu His Ile Lys Arg His 1 5 10 15 Tyr His Lys Lys Phe Trp Lys Leu Gly Ala Val Ile Arg Met Glu 20 25 30 Arg Asn Met Lys Asn Lys Asn Lys Met Leu Asp Leu Met Leu Glu 35 40 45 Ala Val Asn Asn Ile Lys Asp Ala Met Tyr Tyr Thr Ala Ala Glu 50 55 60 Leu Lys Pro Val Leu Asp Arg Pro Pro Gln Asp Ser Asn Ala Pro 65 70 75 Gly Ala Ser Gly Lys Ala Asn Ala Phe Ala Ser Asp Arg Ile Ser 80 85 90 Leu His Arg Asp Leu Gly Pro Asp Thr Arg Pro Pro Glu Cys Ile 95 100 105 Glu Gln Lys Leu Leu Arg Thr Val His Ser Val Leu Tyr Ser Ser 110 115 120 Pro Ala Ile Leu Leu Lys Glu Ile Ile Leu Val Asp Asp Ala Ser 125 130 135 Gln Arg Glu Arg Lys Gly Leu Ile Thr Ala Arg Leu Leu Gly Ala 140 145 150 Thr Val Ala Thr Ala Glu Thr Leu Thr Phe Leu Asp Val Val Ser 155 160 165 Pro Asp Ile Ala Ser Ile Asp Leu Asn Thr Phe Glu Phe Asn Lys 170 175 180 Pro Ser Pro Tyr Gly Ser Asn His Asn Lys Asp Glu Thr Tyr Pro 185 190 195 Ile Lys Thr Pro Thr Phe Ala Gly Gly Leu Phe Ser Ile Ser Lys 200 205 210 Glu Tyr Phe Glu Tyr Ile Cys Gly Gly Gln Leu Glu Ile Met Pro 215 220 225 Cys Ser Val Val Gly Asn Val Phe Arg Ser Lys Ser Pro Asn Ser 230 235 240 Phe Pro Lys Phe Tyr Arg Arg Asn Thr Asp Ala Ala Lys Ile Val 245 250 255 Lys Gln Lys Ala Phe Gly Asp Leu Ser Lys Arg Phe Glu Ile Lys 260 265 270 Phe Phe Phe Ile Ile Val Leu Val Leu Met Gln Arg Glu Val Ser 275 280 285 Val Gln Tyr Ser Lys Glu Glu Ser Pro Lys Met Gln Ile Gly Ala 290 295 300 Pro Val Arg Gln Asn Ile Asp Ala Gly Glu Arg Pro Cys Leu Gln 305 310 315 Gly Phe Lys Thr Thr Asn Leu Ser Val Glu Glu Gln Lys Glu Lys 320 325 330 Glu Arg Gly Glu Ala Lys His Cys Phe Phe Lys Arg Cys Pro Pro 335 340 345 Leu Pro Thr Thr Ser Val Ile Ile Val Phe His Asn Glu Ala Trp 350 355 360 Ser Thr Val Asp Glu Tyr Leu His Asp Lys Leu Asp Glu Tyr Val 365 370 375 Lys Gln Phe Ser Ile Val Lys Ile Val Arg Ala His Cys Glu Cys 380 385 390 Phe Tyr Gly Trp Leu Glu Pro Leu Leu Ala Arg Ile Ala Glu Asn 395 400 405 Tyr Thr Ala Arg Gly Asn Phe Asp Trp Ser Leu Ser Phe Gly Trp 410 415 420 Glu Ser Leu Pro Asp His Glu Lys Gln Arg Arg Gly Ser Tyr Asp 425 430 435 Glu Glu Met Glu Ile Trp Gly Gly Glu Asn Ile Glu Met Ser Pro 440 445 450 Arg Val Trp Gln Gly Thr Gln Val Ile Ala Arg Asn Gln Val Arg 455 460 465 Leu Ala Glu Val Trp Met Asp Glu Tyr Lys Glu Ile His Arg Leu 470 475 480 Arg Cys Lys Asn Phe Thr Trp Tyr Leu Asn Asn Ile Tyr Pro Glu 485 490 495 Val Tyr Val Pro Asp Leu Asn Pro Val Ile Ser Gly Tyr Ile Lys 500 505 510 Ser Val Gly Gln Pro Leu Cys Leu Asp Val Gly Glu Asn Asn Gln 515 520 525 Gly Gly Glu Ile Arg His Asn Ile Gln Lys Glu Leu Cys Leu His 530 535 540 Ala Ala Gln Gly Leu Val Gln Leu Lys Ala Cys Thr Tyr Lys Phe 545 550 555 Leu Lys Met Cys Leu Ser Ala Asn Gly Glu His Pro Ser Leu Val 560 565 570 Ser Cys Asn Pro Ser Asp Pro Leu Gln Lys Trp Lys Pro Leu Ile 575 580 585 Met Tyr Thr Cys His Gly Leu Gly Gly Asn Gln Tyr Phe Glu Tyr 590 595 600 Ser Ala Gln His Gly His Lys Thr Val Val Thr Gly Glu Gln Ile 605 610 615 Trp Glu Ile Gln Lys Asp Gln Leu Leu Tyr Asn Pro Ile Leu Ser 620 625 630 Gln Asn Asp <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <223> sequence is synthesized <400> 15 gaccatccgc agtgtatta 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <223> Sequence is synthesized <400> 16 atacagatat gttcggtga 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <223> sequence is synthesized <400> 17 ccatagatct gaacacgtt 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <223> sequence is synthesized <400> 18 gcaaggatat tatacagca 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <222> 2 <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <222> 18 <223> sequence is synthesized <400> 19 guaccagaca cgcggcaua 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <222> 10 <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <222> 13 <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <222> 15 <223> sequence is synthesized <400> 20 accgagaggu cauguacaa 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> misc_RNA <223> sequence is synthesized <400> 21 ggacaaagtt taccaaatg 19 <210> 22 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn 1 5 10 15 Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Ser Gly Thr 20 25 30 Lys His Ser Gly Glu Ala Pro Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser 35 40 45 Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro Cys Ser Leu Ser Gly Ile 50 55 <210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn 1 5 10 15 Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Ser Gly Ile 20 25 30 <210> 24 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Trp Glu His Ser Pro Leu Gly Glu Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn 1 5 10 15 Thr Ala Cys Gln Cys Lys Pro Gly Thr Phe Arg Glu Ser 20 25 <210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Pro Glu Glu Ser Pro Ser Arg Gly Arg Cys Asn Ile Thr Thr Asn 1 5 10 15 Thr Val Cys Arg Cys Lys Pro Gly Thr Phe Glu Thr Ala 20 25 <210> 26 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn 1 5 10 15 Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Gly Ser 20 25 <210> 27 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn 1 5 10 15 Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Asp Ser 20 25 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 28 acgctgctca ggaccattcg ctgcgtgtta aaccgcaccc 40 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 29 ctggtagcgg tcacataat 19

Claims (24)

  1. 포유동물 암 조직 또는 암 세포 샘플을 시험관내에서 면역조직화학법으로 조사하여 GalNac-T14의 발현을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 면역조직화학법은 도 4A의 아미노산 1-552 또는 아미노산 39-552를 포함하는 인간 GalNac-T14 폴리펩티드에 결합하는 항-GalNac-T14 항체를 사용하여 행하며, 상기 GalNac-T14의 발현으로 상기 조직 또는 세포 샘플이 DR4 수용체 항체 또는 DR5 수용체 항체의 세포자멸사-유도 활성에 대해 민감성임을 예측하는 것인, 작동제 DR4 수용체 항체 또는 작동제 DR5 수용체 항체에 대한 포유동물 암 조직 또는 암 세포 샘플의 민감도를 예측하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-GalNac-T14 항체가, 도 4A의 아미노산 1-552를 포함하는 인간 GalNac-T14에 결합하는 모노클로날 항체인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서의 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 시험관내 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암 세포가 췌장암, 림프종, 비-소세포 폐암, 결장암, 결장직장암, 흑색종 또는 연골육종 세포 또는 조직인 방법.
  5. 포유동물 암 조직 또는 암 세포 샘플을 시험관내에서 면역조직화학법으로 조사하여 GalNac-T14의 발현을 검출하는 단계, 및
    상기 GalNac-T14의 발현의 검출에 이어서, 상기 조직 또는 세포 샘플을 시험관내에서 유효량의 DR4 수용체 항체 또는 DR5 수용체 항체에 노출시키는 단계
    를 포함하고, 이때 상기 면역조직화학법은 도 4A의 아미노산 1-552 또는 아미노산 39-552를 포함하는 인간 GalNac-T14 폴리펩티드에 결합하는 항-GalNac-T14 항체를 사용하여 행하며, 상기 GalNac-T14의 발현으로 상기 조직 또는 세포 샘플이 작동제 DR4 수용체 항체 또는 작동제 DR5 수용체 항체의 세포자멸사-유도 활성에 대해 민감성임을 예측하는 것인, 포유동물 암 조직 또는 암 세포 샘플에서 세포자멸사를 유도하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조직 또는 세포 샘플에서의 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 시험관내 발현을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 암 세포가 췌장암, 림프종, 비-소세포 폐암, 결장암, 결장직장암, 흑색종 또는 연골육종 세포 또는 조직인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 세포가 유효량의 작동제 DR5 수용체 항체에 노출되는 것인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 세포가 또한 화학요법제 또는 방사선 요법에 노출되는 것인 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 세포가 또한 사이토카인, 세포독성제 또는 성장 억제제에 노출되는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 DR5 수용체 항체가 도 3A에 나타낸 DR5 수용체에 결합하는 것인 방법.
  12. 제5항에 있어서, 상기 세포가 유효량의 DR4 수용체 항체에 노출되는 것인 방법.
  13. 제5항에 있어서, 상기 암 세포가 비-소세포 폐암 세포인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 암 세포가 비-소세포 폐암 세포인 방법.
  15. 포유동물 암 조직 또는 암 세포 샘플에서 GalNac-T14 단백질 또는 mRNA의 발현을 검출하기 위한 항체 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 GalNac-T14의 발현으로 상기 조직 또는 세포 샘플이 작동제 DR4 수용체 항체 또는 작동제 DR5 수용체 항체의 세포자멸사-유도 활성에 대해 민감성임을 예측하는 것인, 포유동물 조직 또는 세포 샘플의 DR4 수용체 항체 또는 DR5 수용체 항체에 대한 민감성을 예측하기 위한 키트 또는 제품.
  16. 제15항에 있어서, 상기 GalNac-T14의 발현이 GalNac-T14 mRNA의 발현을 검출하는 것에 의해 조사되는 것인 키트 또는 제품.
  17. 제15항에 있어서, 상기 GalNac-T14의 발현이 면역조직화학법에 의해 조사되는 것인 키트 또는 제품.
  18. 제15항에 있어서, 상기 검출이 상기 조직 또는 세포 샘플에서의 DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2 수용체의 발현을 조사하는 것을 추가로 포함하는 것인 키트 또는 제품.
  19. 제15항에 있어서, 상기 암 세포가 췌장암, 림프종, 비-소세포 폐암, 결장암, 결장직장암, 흑색종 또는 연골육종 세포 또는 조직인 키트 또는 제품.
  20. 용기, 상기 용기 상의 표지, 상기 용기 내에 함유된 조성물, 및 1가지 이상의 유형의 포유동물 세포 내의 GalNac-T14의 존재를 평가하기 위해 GalNac-T14 항체를 사용하는 것에 대한 설명서를 포함하며, 이때 상기 조성물은 GalNac-T14에 결합하는 1차 항체를 포함하고, 상기 용기 상의 표지는 조성물이 1가지 이상의 유형의 포유동물 세포 내의 GalNac-T14의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 표시한 것인, 포유동물 조직 또는 세포가 작동제 DR4 수용체 항체 또는 작동제 DR5 수용체 항체에 의한 세포자멸사 유도에 민감성일 지를 예측하기 위한 키트 또는 제품.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항체가 GalNac-T14 모노클로날 항체인 키트 또는 제품.
  22. 용기, 상기 용기 상의 표지, 상기 용기 내에 함유된 조성물, 및 1가지 이상의 유형의 포유동물 세포 내의 GalNac-T14 RNA 또는 DNA의 존재를 평가하기 위해 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것에 대한 설명서를 포함하며, 이때 상기 조성물은 적어도 중등도의 엄격성 조건 하에 GalNac-T14 폴리뉴클레오티드의 상보물에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 용기 상의 표지는 조성물이 1가지 이상의 유형의 포유동물 세포 내의 GalNac-T14의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 표시한 것인, 포유동물 조직 또는 세포가 작동제 DR4 수용체 항체 또는 작동제 DR5 수용체 항체에 의한 세포자멸사 유도에 민감성일 지를 예측하기 위한 키트.
  23. 삭제
  24. 삭제
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