BRPI0615997A2 - método para prever a sensibilidade de uma amostra de célula ou tecido, método para induzir apoptose em uma amostra de célula ou tecido, método de tratamento de uma disfunção e uso de apo2l/trail - Google Patents

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MéTODO PARA PREVER A SENSIBILIDADE DE UMA AMOSTRA DE CéLULA OU TECIDO, MéTODO PARA INDUZIR APOPTOSE EM UMA AMOSTRA DE CéLULA OU TECIDO, MéTODO DE TRATAMENTO DE UMA DISFUNçãO E USO DE APO2L/TRAIL A presente invenção refere-se a métodos e testes que examinam expressão de um ou mais biomarcadores em uma amostra de célula ou tecido de mamífero. De acordo com os métodos e testes divulgados, a detecção da expressão de moléculas relacionadas à GalNac-T, tais como GalNac-T14 ou GalNac-T3, é preditiva ou indicativa de que a amostra de célula ou tecido será sensível a agentes de indução de apoptose tais como Apo2LITRAIL e anticorpos agonistas de anti-DR5. Kits e artigos de fabricação são também fornecidos.

Description

"MÉTODO PARA PREVER A SENSIBILIDADE DE UMA AMOSTRA DECÉLULA OU TECIDO, MÉTODO PARA INDUZIR APOPTOSE EM UMAAMOSTRA DE CÉLULA OU TECIDO, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMADISFUNÇÃO E USO DE AP02L/TRAIL"
Este pedido reivindica prioridade do pedido provisório US número60/708,677 depositado em 16 de agosto de 2005 e do pedido provisório USnúmero 60/808,076 depositado em 24 de maio de 2006, os conteúdos destessão incorporados no presente pela referência.
Campo Da Invenção
As invenções descritas no presente pedido relacionam-se aosmétodos e testes para detectar biomarcadores preditivos de sensibilidade decélulas de mamíferos para Apo2L/TRAIL e/ou anticorpos agonistas dereceptores de morte. Mais particularmente, as realizações do presente pedidorelacionam-se aos métodos e testes que detectam moléculas associadas àfamília de proteínas GaINac-T que são preditivas de sensibilidade de célulascancerígenas de mamíferos para Apo2L/TRAIL ou anticorpos agonistas dereceptores de morte, tais como anticorpos agonistas de DR4 ou DR5.
Antecedentes Da Invenção
Vários ligantes e receptores pertencentes à superfamília do fatorde necrose tumoral (TNF) foram identificados no estado da técnica. Incluídosentre tais Iigantes estão fator alfa de necrose tumoral ("TNF-alfa"), fator betade necrose tumoral ("TNF-beta" ou "linfotoxina-alfa"), linfotoxina-beta ("LT-beta"), Iigante CD30, ligante CD27, ligante CD40, ligante OX-40, ligante 4-1 BB,LIGHT, Iigante Apo-1 (também referido como ligante Fas ou ligante CD95),ligante Apo-2 (também referido como Apo2L ou TRAIL), ligante Apo-3 (tambémreferido como TWEAK), APRIL, ligante OPG (também referido como liganteRANK, ODF, ou TRANCE), e TALL-1 (também referido como BIyS, BAFF ouTHANK) (Ver, por exemplo, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002);Ashkenazi e Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi e Dixit, Curr.Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997)Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411;Locksley et ai, Cell, 104:487-501 (2001); Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404(1995); Schmid et ai, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et ai, Eur.J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et ai, J. Bioi Chem., 271:12687-12690 (1996);Wiley et ai, Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et ai, Cell, 72:847-856(1993); Armitage et ai Nature, 357:80-82 (1992), documento WO 97/01633publicado em 16 de janeiro de 1997; documento WO 97/25428 publicado em17 de julho de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998);Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et ai, J.Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); documento WO 98/28426 publicado em 2de julho de 1998; documento WO 98/46751 publicado em 22 de outubro de1998; documento WO 98/18921 publicado em 7 de maio de 1998; Moore et ai,Science, 285:260-263 (1999); Shu et ai, J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999);Schneider et ai, J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et ai, J.Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).
A indução de várias respostas celulares mediadas por taisIigantes da família TNF é tipicamente iniciada por suas ligações aos receptorescelulares específicos. Alguns, mas não todos os Iigantes da família TNF ligam-se a, e induzem várias atividades biológicas através dos "receptores de morte"da superfície celular para ativar caspases ou enzimas que realizam a mortecelular ou via da apoptose. (Salvesen et ai, Cell, 91: 443-446 (1997)). Incluídoentre os membros da superfamília de receptores TNF identificados até hojeestão TNFR1, TNFR2, TACI1 GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas(também referido como Apo-1 ou CD95), DR4 (também referido como TRAIL-R1), DR5 (também referido como Apo-2 ou TRAIL-R2), DcR1, DcR2,osteoprotegerina (OPG)1 RANK e Apo-3 (também referido como DR3 ouTRAMΡ) (ver, por exemplo, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002);Ashkenazi e Dixit1 Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi e Dixit, Curr.Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein1 Curr. Biol., 7:750-753 (1997)Wallach1 Cytokine Reference, Academic Press1 2000, pages 377-411; Loeksleyet al, Cell, 104:487-501 (2001); Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995);Hohman et ai, J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Broekhaus et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); patente EP 417.563, publicada em 20de março de 1991; Loetseher et ai, Cell, 61:351 (1990); Sehall et al., Cell,61:361 (1990); Smith et ai, Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et ai, Proc.Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovie et al., EMBO J1 8:1403-1410 (1989); Mallett et ai,EMBO Jil 9:1063-1068 (1990); Anderson et ai, Nature, 390:175-179 (1997);Chieheportiehe et ai, J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et ai,Science, 276:111-113 (1997); Pan et ai, Science, 277:815-818 (1997);Sheridan et ai, Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et ai, J. Exp. Med.,186:1165-1170 (1997); Marsters et ai, Curr.Bioi, 7:1003-1006 (1997); Tsudaet al., BBRC, 234:137-142 (1997); Noeentini et ai, Proc. Natl. Acad. Sci.,94:6216-6221 (1997); vonBulow et ai, Science, 278:138-141 (1997)).
A maioria destes membros da superfamília de receptores TNFcompartilha a mesma estrutura típica de receptores de superfície celularincluindo regiões extracelular, de transmembrana e intracelular, enquantooutros são encontrados naturalmente como proteínas solúveis desprovidas deum domínio de transmembrana e intracelular. A porção extracelular de TNFRstípicos contém um padrão de seqüência de aminoácido repetitivo de múltiplosdomínios ricos em cisteína (CDRs), começando do NH2 terminal.
O ligante referido como Apo-2L ou TRAIL foi identificado muitosanos atrás como um membro da família TNF de citocinas. (ver, por exemplo,Wiley et ai, Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et ai, J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); documento WO 97/01633; documento WO 97/25428; patenteUS 5.763.223 emitida em 9 de junho de 1998; patente US 6.284.236 emitidaem 4 de setembro de 2001). O polipeptídeo Apo2L/TRAIL humano deseqüência nativa de comprimento total é um aminoácido longo 281, deproteína de transmembrana Tipo II. Algumas células podem produzir umaforma solúvel natural do polipeptídeo, através de clivagem enzimática daregião extracelular do polipeptídeo (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229(1997)). Estudos cristalográficos de formas solúveis do Apo2L/TRAIL revelamuma estrutura homotrimérica similar às estruturas do TNF e outras proteínasrelacionadas (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al.,Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology,6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)).
Apo2L/TRAIL, diferente de outros meios da família TNF, entretanto, foidescoberto ter um aspecto único de estrutura em que três resíduos de cisteína(na posição 230 de cada subunidade no homotrímero) juntos coordenam umátomo de zinco, e que a ligação de zinco é importante para a estabilidade dotrímero e atividade biológica. (Hymowitz et al., acima; Bodmer et al., J. Biol.Chem., 275:20632-20637 (2000)).
Foi relatado na literatura que Apo2L/TRAIL pode desempenharum papel na modulação do sistema imune, incluindo doenças auto-imunes taiscomo artrite reumatóide (ver, por exemplo, Thomas et al., J. Immunol.,161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith etal., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)).
Formas solúveis do Apo2L/TRAIL foram também relatadas parainduzir apoptose em uma variedade de células cancerígenas, incluindo cólon,pulmão, mama, próstata, bexiga, rim, ovário e tumores do cérebro, assim comomelanoma, leucemia, e mieloma múltiplo (ver, por exemplo, Wiley et al., acima;Pitti et ai, acima; patente US 6.030.945 emitida em 29 de fevereiro de 2000;patente US 6.746.668 emitida em 8 de junho de 2004; Rieger et ai, FEBSLetters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et ai, J. Clin. Invest., 104:155-162(1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et ai, CâncerResearch, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. CancerRes., 5:2605-2612(1999); Gazitt1 Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et ai, Câncer Res.,60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et ai, Proc. Nati Acad. Sci., 97:1754-1759(2000)). Estudos in vivo em modelos de tumor murino, além disso, sugeremque Apo2L/TRAIL, em combinação com quimioterapia ou radioterapia, podemexercer efeitos substanciais anti-tumorais (ver, por exemplo, Ashkenazi et ai,supra; Walzcak et ai, acima; Gliniak et al., CancerRes., 59:6153-6158 (1999);Chinnaiyan et ai, acima; Roth et ai, Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999(1999); Pedido PCT US 00/15512; Pedido PCT US 01/23691). Em contrastecom muitos tipos de células cancerígenas, muitos tipos de células humanasnormais parecem ser resistentes à indução de apoptose por certas formasrecombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et ai, acima; Walzcak et ai,acima). Jo et al. relatou que uma forma solúvel de polihistidina marcada deApo2L/TRAIL induziu apoptose in vitro em hepatócitos humanos isoladosnormais, mas não em hepatócitos não humanos (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); ver também, Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Acredita-seque certas preparações de Apo2L/TRAIL recombinantes podem variar emtermos de propriedades bioquímicas e atividades biológicas entre as célulasnormais e doentes, dependendo, por exemplo, da presença ou ausência deuma molécula de marcação, conteúdo de zinco, e % de conteúdo de trímero(Ver, Lawrence et ai, Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qinet al., Nature Med., Letterto the Editor, 7:385-386 (2001)).
Foi descoberto que Apo2L/TRAIL liga-se a pelo menos cincoreceptores diferentes. Pelo menos dois dos receptores que se ligam aoApo2L/TRAIL contêm um domínio de morte citoplasmático funcional. Talreceptor foi referido como "DR4" (e alternativamente como TR4 ou TRAIL-R1)(Pan et ai, Science, 276:111-113 (1997); ver também documento WO98/32856 publicado em 30 de julho de 1998; documento WO 99/37684publicado em 29 de julho de 1999; documento WO 00/73349 publicado em 7de dezembro de 2000; pedido de patente US 2003/0036168 publicada em 20de fevereiro de 2003; patente US 6.433.147 emitida em 13 de agosto de 2002;patente US 6.461.823 emitida em 8 de outubro de 2002, e patente US6.342.383 emitida em 29 de janeiro de 2002).
Outro tal receptor para Apo2L/TRAIL foi referido como DR5 (etambém foi alternativamente referido como Apo-2; TRAIL-R ou TRAIL-R2, TR6,Tango-63, hAP08, TRICK2 ou KILLER) (ver, por exemplo, Sheridan et ai,Science, 277:818-821 (1997), Pan et ai., Science, 277:815-818 (1997),documento WO 98/51793 publicado em 19 de novembro de 1998; documentoWO 98/41629 publicado em 24 de setembro de 1998; Screaton et al., Curr.Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu etai, Nature Genetics, 17:141-143 (1997); documento WO 98/35986 publicadoem 20 de agosto de 1998; patente EP 870.827 publicada em 14 de outubro de1998; documento WO 98/46643 publicado em 22 de outubro de 1998;documento WO 99/02653 publicado em 21 de janeiro de 1999; documento WO99/09165 publicado em 25 de fevereiro de 1999; documento WO 99/11791publicado em 11 de março de 1999; documento WO 03/042367 publicado em22 de maio de 2003; documento WO 02/097033 publicado em 5 de dezembrode 2002; documento WO 03/038043 publicado em 8 de maio de 2003; pedidode patente US 2002/0072091 publicada em 13 de agosto de 2002; pedido depatente US 2002/0098550 publicada em 7 de dezembro de 2001; patente US6.313.269 emitida em 6 de dezembro de 2001; pedido de patente US2001/0010924 publicada em 2 de agosto de 2001; pedido de patente US2003/01255540 publicada em 3 de julho de 2003; pedido de patente US2002/0160446 publicada em 31 de outubro de 2002, pedido de patente US2002/0048785 publicada em 25 de abril de 2002; pedido de patente US2004/0141952 publicada em 22 de julho de 2004; pedido de patente US2005/0129699 publicada em 16 de junho de 2005; pedido de patente US2005/0129616 publicada em 16 de junho de 2005; patente US 6.342.369emitida em fevereiro de 2002; patente US 6.569.642 emitida em 27 de maio de2003, patente US 6.072.047 emitida em 6 de junho de 2000, patente US6.642.358 emitida em 4 de novembro de 2003; patente US 6.743.625 emitidaem 1 de junho de 2004). Como DR4, DR5 é relatado conter um domínio demorte citoplasmático e ser capaz de sinalizar apoptose sob ligação do Iigante(ou sob ligação de uma molécula, tal como um anticorpo agonista que imita aatividade do ligante). A estrutura cristalina do complexo formado entre Apo-2L/TRAIL e DR5 é descrita em Hymowitz et ai, Molecular Cell, 4:563-571(1999).
Sob ligação do ligante, ambos DR4 e DR5 podem acionarapoptose independentemente pelo recrutamento e ativação do iniciador deapoptose, caspase-8, por meio da molécula adaptadora que contém o domíniode morte referida como FADD/Mort1 (Kischkel et ai, Immunity, 12:611-620(2000); Sprick et ai, Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et ai, Nature CellBiol., 2:241-243 (2000)).
Apo2L/TRAIL foi também relatado ligar-se àqueles receptoresreferidos como DcR1, DcR2 e OPG, os quais se acredita que funcionem comoinibidores, ao invés de transdutores da sinalização (ver, por exemplo, DCR1(também referido como TRID, LIT ou TRAIL-R3) (Pan et ai, Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et ai, Science, 277:818-821 (1997); McFarIane et ai, J.Bioi Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et ai, FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et ai, J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); eMongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)); DCR2 (também chamadode TRUNDD ou TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr._Biol., 7:1003-1006 (1997);Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity,7:813-820 (1997)), e OPG [Simonet et al., acima], Em contraste com DR4 eDR5, os receptores DcR1 e DcR2 não sinalizam apoptose.
Certos anticorpos que se ligam aos receptores DR4 e/ou DR5foram relatados na literatura. Por exemplo, anticorpos anti-DR4 dirigidos aoreceptor DR4 e tendo atividade agonística ou apoptótica em certas células demamíferos estão descritos em, por exemplo, documento WO 99/37684publicado em 29 de julho de 1999; documento WO 00/73349 publicado em 12de julho de 2000; documento WO 03/066661 publicado em 14 de agosto de2003. Ver, também, por exemplo, Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605(1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); documentoWO 02/097033 publicado em 2 de dezembro de 2002; documento WO03/042367 publicado em 22 de maio de 2003; documento WO 03/038043publicado em 8 de maio de 2003; documento WO 03/037913 publicado em 8de maio de 2003. Certos anticorpos anti-DR5 foram da mesma formadescritos, ver, por exemplo, documento WO 98/51793 publicado em 8 denovembro de 1998; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawaet al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "An Antibody to DR5(TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived GastrointestinalTumors Grown in SCID mice", Resumo, 2o Congresso Internacional emAnticorpos Monoclonais em Câncer, 29 de agosto a 1 de setembro de 2002,Banff, Alberta, Canada; documento WO 03/038043 publicado em 8 de maio de2003; documento WO 03/037913 publicado em 8 de maio de 2003; pedido depatente US 2003/01800296 publicada em 5 de setembro de 2003. Além disso,certos anticorpos que possuem interatividade a ambos os receptores DR4 eDR5 foram descritos (ver, por exemplo, patente US 6.252.050 emitida em 26de junho de 2001).
Descrição Resumida Da Invenção
A presente invenção divulgada no presente pedido fornecemétodos e testes que examinam a expressão de um ou mais biomarcadoresem uma amostra de célula ou tecido de mamífero, em que a expressão de umou mais de tais biomarcadores é preditiva da amostra de célula ou tecido sersensível a agentes tais como Apo2l/TRAIL ou anticorpos agonistas de anti-DR5. Em várias realizações da invenção, os métodos e testes examinam aexpressão de moléculas na família de proteínas GaINac-T1 em particularGaINAc-TI4 ou GalNAc-T3.
Como discutido acima, a maioria dos tipos celulares humanosnormais parecem ser resistentes à indução de apoptose por certas formasrecombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., acima; Walzcak et al.,acima). Foi também observado que algumas populações de tipos celulareshumanos doentes (tais como certas populações de células cancerígenas) sãoresistentes à indução de apoptose por certas formas recombinantes deApo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest, 1999, acima; Walzcak et al.,Nature Med., 1999, acima). Conseqüentemente, pelo exame de uma amostrade tecido ou célula de mamífero para expressão de biomarcadoresselecionados por um ensaio, pode-se convenientemente e de forma eficienteobter informações úteis na avaliação de terapias apropriadas ou eficazes paratratar pacientes. Por exemplo, a informação obtida a partir de um teste paradetectar a expressão de GaINac-TI 4 em uma amostra de tecido ou célula demamífero pode fornecer aos técnicos no assunto dados úteis que podem serusados para determinar um regime terapêutico ótimo (usando Apo2l/TRAIL ouanticorpos agonistas de receptores de morte) para pacientes que sofrem deuma disfunção tal como câncer ou doença imune relacionada, tal como umadisfunção auto-imune.A presente invenção fornece métodos para prever a sensibilidadede uma amostra de célula ou tecido de mamífero (tal como uma célulacancerígena) para Apo2l/TRAIL e/ou anticorpo agonista de receptor de morte.Em certas realizações, os métodos compreendem obter uma amostra de tecidoou célula de mamífero e o exame do tecido ou célula para a expressão deGaINAc-TI4. Estes métodos podem ser conduzidos em uma variedade deformatos de testes, incluindo testes que detectam mRNA e/ou expressão deproteína, testes de atividade enzimática e outros discutidos no presente. Adeterminação da expressão de GaINac-TI4 em ditos tecidos ou células serãopreditivos de forma que tecidos ou células serão sensíveis à atividade queinduz apoptose do Apo2l/TRAIL e/ou anticorpo receptor de morte. Emrealizações opcionais, os tecidos ou células podem também ser examinadospara expressão de receptores DR4, DR5, DcR1 ou DcR2.
Métodos adicionais da invenção incluem métodos de indução deapoptose em uma amostra de célula ou tecido de mamífero, que compreendeetapas de obtenção de uma amostra de célula ou tecido de mamífero,examinando a célula ou tecido para a expressão de GaINac-TI4, e sobdeterminação de se dita amostra de célula ou tecido expressar GaINac-TI4,expondo dita amostra de célula ou tecido a uma quantidade eficaz de Apo2L/TRAIL ou anticorpo agonista de receptor de morte. Estas etapas nosmétodos para examinar a expressão de GaINac-TI4 podem ser conduzidas emuma variedade de formatos de testes, incluindo testes que detectam mRNAe/ou expressão de proteína, atividade enzimática e outros discutidos nopresente. Em realizações opcionais, os métodos também compreendemexaminar a amostra de célula ou tecido para expressão de receptores DR4,DR5, DcR1 ou DcR2. Opcionalmente, a amostra de célula ou tecidocompreende tecido ou células cancerígeno. Opcionalmente, a amostra detecido ou célula cancerígeno compreende células de câncer de pulmão decélula não pequena, células de câncer de mama ou células de Iinfoma não-Hodgkin.
Ainda métodos adicionais da invenção incluem métodos detratamento de uma disfunção em um mamífero, tal como uma disfunção imunerelacionada ou câncer, que compreende etapas de obtenção de uma amostrade tecido ou de célula de mamífero, exame do tecido ou célula para aexpressão de GaINac-TI4, e sob determinação de dita amostra de tecido oucélula que expressa GaINac-TI4, administração de uma quantidade eficaz deApo2l/TRAIL ou anticorpo agonista de receptor de morte para dito mamífero.Estas etapas nos métodos para exame da expressão de um ou maisbiomarcadores podem ser conduzidas em uma variedade de formatos detestes, incluindo testes que detectam mRNA e/ou expressão de proteína,atividade enzimática e outros discutidos no presente pedido. Em realizaçõesopcionais, os métodos também compreendem o exame da amostra de célulaou tecido para a expressão de receptores DR4, DR5, DcR1 ou DcR2.Opcionalmente, os métodos compreendem tratar câncer em um mamífero.Opcionalmente, os métodos compreendem, além da administração de umaquantidade eficaz de Apo2L/TRAIL e/ou anticorpo agonista de receptor demorte, administrar agente(s) quimioterápico(s) ou radioterapia para ditomamífero.
Em realizações adicionais da invenção, os métodos acimamencionados podem compreender o exame de células ou tecidos demamíferos para expressão de outras moléculas GaINacT, tal como GalNac-T3.
Ainda realizações adicionais são ilustradas a título de exemplonas seguintes reivindicações:
1. Método para prever a sensibilidade de uma amostra de célulaou tecido de mamífero para Apo2L/TRAIL, que compreende etapas de:obtenção de uma amostra de célula ou tecido de mamífero;exame da amostra de célula ou tecido para detectar expressão deGaINac-TI4, em que a expressão de dito GaINac-TI4 é preditiva de que ditaamostra de célula ou tecido é sensível à atividade de indução de apoptose deApo2L/TRAIL.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que ditaexpressão de GaINac-TI4 é examinada pela detecção da expressão de mRNAde GalNac-T14.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que ditaexpressão de GalNac-T14 é examinada por imunohistoquímica.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende aetapa de exame da expressão dos receptores DR4, DR5, DcR1 ou DcR2 emdita amostra de célula ou tecido.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra decélula ou tecido compreende células ou tecidos cancerígenos.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que ditas célulascancerígenas são pancreáticas, linfoma, ou células ou tecidos de câncer depulmão de célula não pequena.
7. Método para induzir apoptose em uma amostra de célula outecido de mamífero, que compreende as etapas de:
obtenção de uma amostra de célula ou tecido de mamífero;exame da amostra de célula ou tecido para detectar expressão deGaINac-TI4, e subseqüente à detecção da expressão de dito GaINac-TI4,exposição da dita amostra de célula ou tecido a uma quantidade eficaz doApo2L/TRAIL.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que ditaexpressão de GaINac-TI4 é examinada para expressão de mRNA de GaINac-T14.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que ditaexpressão de GaINac-TI4 é examinada por imunohistoquímica.
10. Método, de acordo com a reivindicação 7, que compreendeadicionalmente a etapa de exame da expressão dos receptores DR4, DR5,DcR1 ou DcR2 em dita amostra de célula ou tecido.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a amostrade célula ou tecido compreende células ou tecidos cancerígenos.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que ditascélulas cancerígenas são pancreáticas, de linfoma, ou células ou tecidos decâncer de pulmão de célula não pequena.
13. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que ditascélulas são expostas a uma quantidade eficaz de polipeptídeo Apo2L/TRAILque compreende os aminoácidos 114-281 da Figura 1.
14. Método de tratamento de uma disfunção em um mamífero, talcomo uma disfunção imune relacionada ou câncer, que compreende as etapasde:
obtenção de uma amostra de célula ou tecido de dito mamífero;
exame da amostra de célula ou tecido para detectar expressão deGaINac-TI4, e
subseqüente à detecção da expressão de dito GaINac-TI4,administração a dito mamífero uma quantidade eficaz de Apo2L/TRAIL.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que ditaexpressão de GaINac-TI4 é examinada pela detecção da expressão de mRNAde GaINac-TI 4. ,
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que ditaexpressão de GalNac-T14 é examinada por imunohistoquímica.
17. Método, de acordo com a reivindicação 14, que tambémcompreende a etapa de exame da expressão dos receptores DR4, DR5, DcR1ou DcR2 em dito de tecido ou célula.
18. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que a amostrade célula ou tecido compreende células ou tecidos cancerígenos.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que ditascélulas ou tecidos cancerígenos compreendem células ou tecidospancreáticas, linfoma, ou células ou tecidos de câncer de pulmão de célula nãopequena.
20. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que umaquantidade eficaz de polipeptídeo Apo2L/TRAIL que compreende osaminoácidos 114-281 da Figura 1 é administrada a dito mamífero.
21. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que umagente(s) quimioterápico(s) ou radioterapia é também administrado a ditomamífero.
22. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que umacitocina, agente citotóxicos ou agente inibitório do crescimento é tambémadministrada a dito mamífero.
23. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que ditopolipeptídeo Apo2L/TRAIL está ligado a uma molécula de polietilenoglicol.
24. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que ditopolipeptídeo Apo2L/TRAIL está ligado a uma molécula de polietilenoglicol.
25. Método para prever a sensibilidade de uma amostra de célulaou tecido de mamífero para anticorpos de receptores de morte, quecompreende as etapas de:
obtenção de uma amostra de célula ou tecido de mamífero;
exame da amostra de célula ou tecido para detectar expressão deGalNac-TI4 em que a expressão de dito GaINac-TI4 é preditiva de que ditaamostra de célula ou tecido é sensível à atividade de indução de apoptose dosanticorpos de receptores de morte.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, em que ditaexpressão de GaINac-TI4 é examinada pela detecção da expressão de mRNAde GalNac-T14.
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, em que ditaexpressão de GaINac-TI4 é examinada por imunohistoquímica.
28. Método, de acordo com a reivindicação 25, que compreende aetapa de exame da expressão dos receptores DR4, DR5, DcR1 ou DcR2 emdita amostra de célula ou tecido.
29. Método, de acordo com a reivindicação 25, em que a amostrade célula ou tecido compreende células ou tecidos cancerígenos.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, em que ditascélulas cancerígenas são pancreáticas, de linfoma, ou células ou tecidos decâncer de pulmão de célula não pequena.
31. Método, de acordo com a reivindicação 25, em que ditosanticorpos receptores de morte são anticorpos agonistas de anti-DR4 ou anti-DR5.
32. Método para induzir apoptose em uma amostra de célula outecido de mamífero que compreende as etapas de:
obtenção de uma amostra de célula ou tecido de mamífero;
exame de uma amostra de célula ou tecido para detectarexpressão de GaINac-TI4, e
subseqüente à detecção da expressão de dito GaINac-TI4,exposição da dita amostra de célula ou tecido a uma quantidade eficaz doanticorpo de receptor de morte.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que ditaexpressão de GaINac-TI4 é examinada pelo teste para expressão de mRNAde GalNac-T14.
34. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que ditaexpressão de GalNac-T14 é examinada por imunohistoquímica.
35. Método, de acordo com a reivindicação 32, que tambémcompreende a etapa de exame da expressão dos receptores DR4, DR5, DcR1ou DcR2 em dita amostra de célula ou tecido.
36. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que ditaamostra de célula ou tecido compreende células ou tecidos cancerígenos.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, em que ditascélulas cancerígenas são pancreáticas, de linfoma, ou células ou tecidos decâncer de pulmão de célula não pequena.
38. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que ditascélulas são expostas a uma quantidade eficaz de anticorpo agonista de DR4ou DR5.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, em que ditascélulas são expostas a uma quantidade eficaz de anticorpo agonista de DR5que se liga ao receptor DR5 mostrado na Figura 3A.
40. Método de tratamento de uma disfunção em um mamífero, talcomo uma disfunção imune relacionada ou câncer, que compreende as etapas de:
obtenção de uma amostra de célula ou tecido de dito mamífero;exame de uma amostra de célula ou tecido para detectar expressão deGaINac-TI 4, e
subseqüente à detecção da expressão de dita GaINac-TI4,administração a dito mamífero de uma quantidade eficaz de anticorpo dereceptor de morte.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, em que ditaexpressão de GaINac-TI4 é examinada pela detecção da expressão de mRNAde GaINac-TI 4.
42. Método, de acordo com a reivindicação 40, em que ditaexpressão de GaINac-TI4 é examinada por imunohistoquímica.
43. Método, de acordo com a reivindicação 40, que tambémcompreende a etapa de exame da expressão dos receptores DR4, DR5, DcR1ou DcR2 em dito tecido ou célula.
44. Método, de acordo com a reivindicação 40, em que a amostrade célula ou tecido compreende células ou tecidos cancerígenos.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, em que ditascélulas ou tecidos cancerígenos compreendem células ou tecidospancreáticos, linfoma, ou células ou tecidos de câncer de pulmão de célula nãopequena.
46. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, em que umaquantidade eficaz de anticorpo anti-DR4 ou DR5 é administrada a ditomamífero.
47. Método, de acordo com a reivindicação 40, em que umagente(s) quimioterápico(s) ou radioterapia é também administrada a ditomamífero.
48. Método, de acordo com a reivindicação 40, em que umacitocina, agente citotóxico ou agente inibitório do crescimento é tambémadministrado a dito mamífero.
Breve Descrição Das Figuras
Figura 1 mostra a seqüência de nucleotídeo do cDNA ligante deApo-2 humano (SEQ ID NO:2) e sua seqüência derivada de aminoácido (SEQID NO:1). O "N" na posição do nucleotídeo 447 é usado para indicar que abase de nucleotídeo pode ser uma "T" ou "G".
Figura 2A e 2B mostra a seqüência de nucleotídeo do cDNA(SEQ ID NO:4) para DR4 humano de comprimento total e sua seqüência deaminoácido derivada (SEQ ID NO:3). As respectivas seqüências denucleotídeo e aminoácido para DR4 estão também reportadas em Pan et al.,Science, 276:111 (1997).Figura 3A mostra a seqüência de aminoácido 411 (SEQ ID NO:5)de DR5 humano como publicado no documento WO 98/51793 em 19 denovembro de 1998. Uma variante unida por transcrição do DR5 humano éconhecida na técnica. Esta variante de junção DR5 codifica a seqüência de440 aminoácidos (SEQ ID NO:6) de DR5 humano mostrada nas Figuras 3B e3C como publicado no documento WO 98/35986 em 20 de agosto de 1998.
Figura 3D mostra as seqüências de nucleotídeo do cDNA (SEQID NO:7) para DcR1 humano de comprimento total e sua seqüência deaminoácido derivada (SEQ ID NO:8). As respectivas seqüências denucleotídeo e aminoácido para DcR1 humano (e domínios específicos deste)estão também mostradas e descritas no documento WO 98/58062.
Figura 3E mostra as seqüências de nucleotídeo do cDNA (SEQ IDNO:9) para DcR2 humano de comprimento total e sua seqüência deaminoácido derivada (SEQ ID NO: 10). As respectivas seqüências denucleotídeo e aminoácido para DcR2 humano (e domínios específicos deste)estão também mostradas no documento WO 99/10484.
Figura 4A mostra a seqüência de nucleotídeo de GaINac-TI4humana (SEQ ID NO:11) e sua seqüência de aminoácido derivada (SEQ IDNO: 12). Estas seqüências estão também descritas em Wang et ai, BBRC1300:738-744 (2003).
Figura 4B mostra a seqüência de nucleotídeo de GalNac-T3humana (SEQ ID NO: 13) e sua seqüência de aminoácido derivada (SEQ IDNO: 14). Estas seqüências estão também descritas em Bennett et ai, J. BioI.Chem., 271:17006-17012 (1996).
Figura 5 fornece uma tabela sumária IC50 dos dados obtidos naanálise de linhagens celulares de câncer de pulmão de célula não pequena("NSCLC") para sensibilidade ou resistência à atividade apoptótica de Apo2L (+0,5% de soro fetal bovino "FBS" ou 10% de FBS) ou anticorpo monoclonal DR5"DR5 ab", "XL" interligado ou não interligado, (+ 0,5% de soro fetal bovino"FBS" ou 10% de FBS) como medido nos testes de citotoxicidade MTT.
Figura 6 fornece uma tabela sumária IC50 dos dados obtidos naanálise de linhagens celulares de câncer pancreático para sensibilidade ouresistência à atividade apoptótica de Apo2L (+ 0,5% de soro fetal bovino "FBS"ou 10% de FBS) ou anticorpo monoclonal DR5 "DR5 ab", "XL" interligado ounão interligado, (+ 0,5% de soro fetal bovino "FBS" ou 10% de FBS) comomedido nos testes de citotoxicidade MTT.
Figura 7 fornece uma tabela sumária IC50 dos dados obtidos naanálise de linhagens celulares de câncer de Iinfoma não-Hodgkin ("NHL") parasensibilidade ou resistência à atividade apoptótica de Apo2L (+ 10% de sorofetal bovino "FBS") ou anticorpo monoclonal DR5 "DR5 ab", "XL" interligado ounão interligado, (+ 10% de soro fetal bovino "FBS") como medido nos testes decitotoxicidade MTT.
Figura 8 fornece uma comparação de sensibilidade ("sen") ouresistência ("RES") de NSCLC selecionada, pancreático, e linhagens celularesde câncer NHL para anticorpo DR5 e a correlação para expressão de GaINac-T14, como medido pela expressão de mRNA de GalNac-T14.
Figura 9 fornece um gráfico de diagrama de barra de váriasNSCLC, pancreático, e linhagens celulares NHL classificadas (em ordemdecrescente) pelos níveis de padrões de expressão de mRNA de GaINac-TI4.
Figura 10A-D ilustra expressão diferencial das enzimas de O-glicosilação específicas em linhagens celulares cancerígenas resistentes esensíveis ao Apo2L/TRAIL: (A) A viabilidade celular foi medida após incubaçãocom doses variáveis do Apo2L/TRAIL. IC50 para cada linhagem celular foicomputado como a concentração do Apo2L/TRAIL que fornece 50% de perdade viabilidade. Cada experimento de viabilidade celular foi repetido pelo menostrês vezes na presença baixa (0,5%) e alta (10%) de soro fetal bovino. Preto,cinza ou símbolos abertos descrevem as linhagens celulares são altamentesensíveis, moderadamente sensíveis ou resistentes ao Apo2L/TRAIL,respectivamente. (B) os níveis de expressão do mRNA de ppGalNAcT-14mRNA (sonda fixa 219271_at) em linhagens celulares de melanoma maligno epancreático. Linhagens celulares estão dispostas por tipo de tecido esensibilidade ao Apo2L/TRAIL. Preta, cinza ou barras abertas descrevemlinhagens celulares como em A. (C) níveis de expressão do mRNA de Fut-6(painel superior, sonda fixa 211885_x_at) e ppGalNAcT-3 (painel inferior,sonda fixa 203397_s_at) em linhagens celulares de câncer coloretal.Linhagens celulares estão dispostas em B^ As válvulas P nos painéis BeC sãobaseadas em um teste de Fisher da correlação entre a sensibilidade dalinhagem celular (incluindo alta e moderada) e expressão de mRNA isoladoacima. (D) Efeito de Apo2L/TRAIL no crescimento de xenoenxertos de tumorestabelecido. Camundongos atímicos nude que carregam tumores GaINAcT-3/Fut-6-positivo (painel esquerdo) ou GalNAcT-3/Fut-6-negativo (painel direito)receberam veículo ou Apo2L/TRAIL (60 mg/kg/dia i.p. nos dias 0-4) e o volumedo tumor foi monitorado (média±SE, N=10 camundongos/grupo).
Figura 11 ilustra que a modulação de enzimas de O-glicosilaçãoespecíficas altera a sensibilidade ao Apo2L/TRAIL. (A) Células Colo205 foram pré-incubadas com todo inibidor de enzima O-glicosilação benzil-GaINAc(bGaINAc), tratadas com Apo2L/TRAIL por 24 h, e a viabilidade celular foideterminada (DMSO=veículo controle). (B) PSN-1 (carcinoma pancreático) ecélulas Hs294T (melanoma) foram transfectadas com caspase-8 ouppGalNAcT-14 siRNAs por 48 h, incubadas com Apo2L/TRAIL por outras 24 he a viabilidade celular foi determinada. siRNA dúplex em comparação a umaseqüência não alvo (Dharmacon) foram usados como controle (NTC). (C)Células de carcinoma coloretal DLD-1 foram transfectadas com ppGalNAcT-3ou Fut-6 por siRNAs e testadas como em B. (D) Células HEK293 foram co-transfectadas com plasmídeos que codificam os genes em combinação comppGalNAcT-14 ou vetor controle. Apoptose foi medida em 24 horas porcoloração Anexina V (painel esquerdo). Células de melanoma H1569 foramtransduzidas com retrovírus direcionando expressão de ppGalNAcT-14 ouretrovírus controle; os pools de linhagem celular resultantes foram tratadosApo2L/TRAIL por 24 h e a viabilidade celular foi determinada (painel direito).Análise Western blot usando anticorpos anti-FLAG foi usada para verificarexpressão do epítopo unido (tagged) ppGalNAcT-14.
Figura 12 ilustra (A) Análise da cascata de caspase induzida peloApo2L/TRAIL. Células PSN-1 e DLD-1 foram transfectadas com siRNAs contrappGalNAcT-14 ou Fut-6, respectivamente, por 48 h. As células foram tratadascom Apo2L/TRAIL por 4 ou 8 h, e as células Iisadas foram analisadas porimunoblot com anticorpos específicos para caspase caspase-8, Bid1 caspase-9,caspase-3, ou actina como um controle de carga. (B) Células PSN-1 foramtransfectadas com ppGalNAcT-14 siRNA como em A, tratado comApo2L/TRAIL por 4 h, e a atividade enzimática de caspase-3/7 nas célulasIisadas foi determinada. (C) Análises do Apo2L/TRAIL DISC. Células PSN-1foram trasfectadas com ppGalNAcT-14 siRNA com em A. FLAG-Apo2L/TRAIL(1 mg/ml) foi adicionado por 0-60 min, as células foram Iisadas e submetidas àimunoprecipitação com um anticorpo anti-FLAG. FADD associado a DISC,caspase-8, DR4, foram detectados por imunoblot. (D) Células PSN-1 foramtransfectadas, tratadas, e submetidas à imunoprecipitação DISC como em C, eatividade enzimática caspase-8 associada a DISC foi medida comopreviamente descrito (Sharp etal., J. Bioi Chem., 280:19401 (2005).
Figura 13 ilustra (A) Análise de monossacarídeos do DR5humano recombinante (variante de junção longa) produzida em células CHO c,realizada por HPAEC-PAD (cromatografia de troca aniônica de alta eficiênciacom detecção amperométrica pulsada). (B) Comparação de seqüência dereceptores Apo2L/TRAIL humanos ("hDR5L" forma de 440 aa longa DR5humano, "hDR5S" forma de 411 aa curta DR5 humano e hDR4), DR5 murina(mDR5), Fas humano (hFas) e TNFR1 humano (hTNFRI). As caixas indicamsupostos sítios de O-glicosilação. (C) Análise imunoblot do total de célulasIisadas que correspondem a D. DR5L-5T e DR5S-5T são construçõescontendo 5 substituições de treonina a alanina e DR5L-5T3S e DR5S-5T3Ssão construções contendo 5 substituições de treonina a alanina e três deserina a alanina, respectivamente, em resíduos que são sítios potenciais de O-glicosilação. (D) Células HEK293 foram co-transfectadas com construçõesDR5 indicadas junto com vetor ou plasmídeo ppGalNAcT-14 por 48 h e aapoptose foi medida por coloração Anexina V. (E) Níveis de expressão paramRNA para ppGalNAcT-14 (chip Affymetrix, sonda fixa 219271_at) emamostras de tumor humano primário de cânceres de pele (SCC=carcinomacelular escamoso), pulmão, pâncreas (Pane), mama, ovário (Ov), endométrio(Endo), bexiga (Bla, TCC= carcinoma celular transicional) e NHL (FL=Iinfomafolicular, DLBCL=Iinfoma de célula B grande difuso). A expressão média deamostras está indicada por uma barra cinza horizontal para cada classe. Umcorte de 500 e 200 (melanoma) que correspondem aos dados da linhagemcelular da Figura 10B é mostrado.
Figura 14 ilustra (A) Redução na expressão de mRNA deppGalNAcT-14 ou ppGalNAcT-3 em células PSN-1 ou DLD-1 após 48h siRNAknockdown por análise Taqman. (B) Expressão de GalNAcT-14 é reconstituídaem células PSN-1 por transfecção do plasmídeo vazio (Empty), tipo selvagemGalNAcT-14 (GalNAcT-14) ou GalNAcT-14 contendo mutações silenciosassiRNA (GalNAcT-14 si(1)Mut) subseqüente a siGalNAcT-14 (1) mediouknockdown de ppGalNAcT-14. (C) Regulação para baixo de ppGalNAcT-3 ouFut-6 por interferência de RNAs inibe morte celular induzida por Apo2L/TRAILem células C170 (câncer coloretal). Procedimentos experimentais como em11C. (Tabela 1) A) Tabela sumária de fenótipos siRNA knockdown. Linhagenscelulares, nas quais a regulação para baixo de GalNAcT-14 ou ppGalNAcT-3 eFut-6 resultou na proteção de Apo2L/TRAIL, estão marcados indicando menos(+) ou mais que 50% (++) de proteção com pelo menos um oligonucleotídeosiRNA testado. (0) indica a ausência de proteção contra Apo2L/TRAIL. (D)1(E)Subseqüente a 48h knockdown com os siRNAs indicados, as células foramtratadas com doses aumentadas de etoposide ou estaurosporina (STS) por24h e sujeitos a um teste de viabilidade celular. (F) ppGalNAcT-14 retroviralque superexpressa pools de linhagens celulares PA-TU-8902 e PL-45 foramsubmetidas a testes de viabilidade celular após tratamento com Apo2L/TRAIL.Análise Western blot usando anticorpos anti-FLAG indica ppGalNAcT-14retroviral expressado nestas células.
Figura 15 (A) Análise Western blot do Apo2L/TRAIL induziucascata de ativação de caspase em Apo2L/TRAIL sensível a Colo205 elinhagens celulares de câncer coloretal resistentes, RKO e SW1417. As célulasforam tratadas com 1000 ng/ml de Apo2L/TRAIL por 8 e 24h e o total de Iisadocelular foi sujeito a análise western blot usando anticorpos específicos paracaspase-8, Bid, caspase-9, caspase-3 e actina como um controle de carga. (B)Knockdown de Fut-6 reduziu o recrutamento e ativação de caspase-8 noApo2L/TRAIL DISC nas células DLD-1. Procedimentos experimentais conforme12D. (C) A expressão de superfície celular de DR4 e DR5 foi medida poranálise FACS em células que foram submetidas a um siRNA knockdown comos genes indicados.
Descrição Detalhada da Invenção
As técnicas e procedimentos descritos ou com referência nopresente pedido são geralmente bem conhecidos e comumente empregadosusando-se metodologia convencional pelos técnicos no assunto, tais como, porexemplo, as metodologias de clonagem molecular amplamente utilizadasdescritas em Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a.edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.Como apropriado, os procedimentos que envolvem o uso de kits e reagentescomercialmente disponíveis são geralmente realizados de acordo com osprotocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante a menos que apontado deoutra forma.
Antes dos métodos presentes e testes da presente invenção,deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologiaespecífica, e protocolos, linhagens celulares, espécies ou gêneros de animais,construções e reagentes como descritos, podem, é claro, variar. Deve serentendido que a terminologia usada no presente pedido é para os propósitosde descrever somente realizações específicas, e não tem a intenção de limitaro escopo da presente invenção que será limitada somente pelas reivindicaçõesanexas.
Deve ser apontado que como usado no presente e nasreivindicações anexas, as formas singulares "um", "e", e "o/a" incluem osreferentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outra forma.Dessa forma, por exemplo, referindo-se a "uma alteração genética" inclui umapluralidade de tais alterações e referindo-se a "uma sonda" inclui referências auma ou mais sondas e equivalentes destas conhecidas pelos técnicos noassunto e adiante.
Todas as publicações mencionadas no presente estãoincorporadas no presente pedido como referência para a divulgação edescrevem os métodos e/ou materiais em conexão com os quais aspublicações estão citadas. As publicações citadas no presente pedido sãocitadas para suas divulgações anteriores para a data de depósito do presentepedido. Nada aqui é para ser construído como uma admissão de que osinventores não são intitulados para preceder as publicações em virtude de umadata de prioridade anterior ou data anterior da invenção. Além disso, as datasde publicação atuais podem ser diferentes daquelas mostradas e requeremverificação independente.
I. Definições
Os termos "Apo2L/TRAIL", "Apo^L", e "TRAIL" são usados nopresente para referir-se a uma seqüência de polipeptídeo que inclui resíduosde aminoácidos 114-281, incluído, 95-281, incluído, resíduos 92-281, incluído,resíduos 91-281, incluído, resíduos 41-281, incluído, resíduos 15-281, incluído,ou resíduos 1-281, incluído, da seqüência de aminoácido mostrado na Figura1, assim como fragmentos ativos biologicamente, variantes delecionais,insercionais, ou substitucionais das seqüências acima. Em uma realização, aseqüência de polipeptídeo compreende resíduos 114-281 da Figura 1, eopcionalmente, consiste de resíduos 114-281 da Figura 1. Opcionalmente, aseqüência de polipeptídeo compreende resíduos 92-281 ou resíduos 91-281 daFigura 1. Os polipeptídeos Apo-2L, podem ser codificados pela seqüência denucleotídeo nativa mostrada na Figura 1. Opcionalmente, o códon que codificaresíduo Prol 19 (Figura 1) pode ser "CCT" ou "CCG". Em outras realizações,os fragmentos ou variantes são biologicamente ativos e têm pelo menos cercade 80% de identidade de seqüência de aminoácido, mais preferivelmente pelomenos cerca de 90% de identidade de seqüência, e até mais preferivelmente,pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüência comqualquer uma das seqüências Apo2L/TRAIL citadas acima. Opcionalmente, opolipeptídeo Apo2L/TRAIL é codificado por uma seqüência de nucleotídeo quehibridiza sob condições de estringência com a seqüência de polinucleotídeo decodificação fornecida na Figura 1. A definição engloba variantes substitucionaisdo Apo-2L/TRAIL em que pelo menos um destes aminoácidos nativos sãosubstituídos por um resíduo alanina. Variantes substitucionais específicas doApo-2L/TRAIL incluem aquelas na qual pelo menos um destes aminoácidos ésubstituído por um resíduo alanina. Estas variantes substitucionais incluídaaquelas identificadas, por exemplo, como "D203A"; "D218A" e "D269A." Estanomenclatura é usada para identificar variantes Apo2L/TRAIL nas quais osresíduos de ácido aspártico nas posições 203, 218, e/ou 269 (usando anumeração mostrada na Figura 1) são substituídos por resíduos alanina.
Opcionalmente, os Apo2L variantes podem compreender uma ou mais dassubstituições alanina que são citadas na Tabela I do pedido PCT publicado nodocumento WO 01/00832. Variantes substitucionais incluem uma ou maissubstituições do resíduo identificado na Tabela I do documento W0/00832publicado em 04 de janeiro de 2001. A definição também engloba umaseqüência nativa Apo2L/TRAIL isolada de uma fonte Apo2L/TRAIL oupreparado por métodos recombinantes ou sintéticos. O Apo2L/TRAIL dainvenção inclui os polipeptídeos referidos como Apo2L/TRAIL ou TRAILrevelados na Publicação PCT documento W097/01633 e documentoWO97/25428. Os termos "Apo2L/TRAIL" ou "Apo2L" são usados para sereferir geralmente a formas do Apo2L/TRAIL que incluem monômeros, dímerosou trímeros do polipeptídeo. Toda numeração de resíduos de aminoácidosreferida na seqüência Apo2L usa a numeração de acordo com a Figura 1, amenos que especificamente declarado de outra forma. Por exemplo, "D203"ou "Asp203" refere-se ao resíduo de ácido aspártico na posição 203 naseqüência fornecida na Figura 1.
O termo "domínio extracelular Apo2L/TRAIL" ou "Apo2L/TRAILECD" refere-se a uma forma do Apo2L/TRAIL que é essencialmente livre dedomínios transmembrana e citoplasmáticos. Geralmente, o ECD terá menosque 1% de tais domínios de transmembrana e citoplasmático, epreferivelmente, terão menos que 0,5% de tais domínios. Será entendido quequalquer domínio(s) de transmembrana identificado(s) para os polipeptídeos dapresente invenção são identificados de acordo com critérios rotineiramenteempregados na técnica para identificação desse tipo de domínio hidrofóbico.
Os limites exatos de um domínio de transmembrana podem variar, mas maisprovavelmente por não mais que cerca de 5 aminoácidos tanto no final dodomínio como inicialmente identificados. Em realizações preferidas, o ECD iráconsistir de uma seqüência de domínio extracelular solúvel do polipeptídeo queé livre da transmembrana e domínios citoplásmicos ou intracelulares (e não éligado à membrana). Seqüências específicas de domínio extracelular de Apo-2L/TRAIL estão descritas em Publicações PCT documento WO 97/01633 edocumento WO 97/25428.
O termo "monômero Apo2L/TRAIL" ou "monômero Apo2L" refere-se a uma cadeia covalente de uma seqüência de domínio extracelular deApo2L.
O termo "dímero Apo2L/TRAIL" ou "dímero Apo2L" refere-se adois monômeros Apo-2L unidos numa ligação covalente via ligação bissulfeto.
O termo como usado no presente pedido inclui dímeros Apo2L livres e dímerosApo2L que estão contidos em formas triméricas de Apo2L (isto é, associadocom outro, terceiro monômero Apo2L).
O termo "trímero Apo2L/TRAIL" ou "trímero Apo2L" refere-se atrês monômeros Apo2L que estão associados não covalentemente.
O termo "agregado Apo2L/TRAIL" é usado para se referir aformas oligoméricas mais altas auto-associadas de Apo2L/TRAIL, tal comoApo2L/TRAIL trímeros, que formam, por exemplo, formas hexaméricas enanoméricas de Apo2L/TRAIL. A determinação da presença e quantificaçãodo monômero Apo2L/TRAIL, dímero ou trímeros (ou outros agregados) podeser feita usando-se métodos e testes conhecidos na técnica (e usando-semateriais disponíveis comercialmente), tal como exclusão por tamanho nativoHPLC ("SEC"), desnaturação de exclusão por tamanho usando-se dodecilsulfato de sódio ("SDS-SEC"), HPLC de fase reversa e eletroforese capilar."Receptor do Iigante Apo-2" inclui os receptores referidos natécnica como "DR4" e "DR5" cujo polinucleotídeo e seqüências depolipeptídeos estão mostrados nas Figuras 2 e 3 respectivamente. Pan et al.descreveram o membro da família do receptor TNF referido como "DR4" (Panet al., Science, 276:111-113 (1997); ver também documento WO 98/32856publicado em 30 de julho de 1998; documento WO 99/37684 publicado em 29de julho de 1999; documento WO 00/73349 publicado em 7 de dezembro de2000; patente US 6.433.147 depositada em 13 de agosto de 2002; patente US6.461.823 emitida em outubro de 2002, e patente US 6.342.383 emitida em 9de janeiro de 2002). Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) e Pan et al.,Science, 277:815-818 (1997) descreveram outro receptor para Apo2L/TRAIL(ver também, documento WO 98/51793 publicado em 19 de novembro de1998; documento WO 98/41629 publicado em 24 de setembro de 1998). Estereceptor é referido como DR5 (o receptor também foi alternativamente referidocomo Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 ou KILLER; Screatonet al., Curr._Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387(1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); documento WO98/35986 publicado em 20 de agosto de 1998; EP870.827 publicado em 14 deoutubro de 1998; documento WO 98/46643 publicado em 22 de outubro de1998; documento WO 99/02653 publicado em 21 de janeiro de 1999;documento WO 99/09165 publicado em 25 de fevereiro de 1999; documentoWO 99/11791 publicado em 11 de março de 1999; pedido de patente US2002/0072091 publicada em 13 de agosto de 2002; pedido de patente US2002/0098550 publicada em 7 de dezembro de 2001; patente US 6.313.269depositada em 6 de dezembro de 2001; pedido de patente US 2001/0010924publicada em 2 de agosto de 2001; pedido de patente US 2003/01255540publicada em 3 de julho de 2003; pedido de patente US 2002/0160446publicada em 31 de outubro de 2002, pedido de patente US 2002/0048785publicada em 25 de abril de 2002; patente US 6.569.642 emitida em 27 demaio de 2003, patente US 6.072.047 emitida em 6 de junho de 2000, patenteUS 6.642.358 emitida em 4 de novembro de 2003). Como descrito acima,outros receptores para Apo-2L incluem DcR1, DcR2, e OPG (ver, Sheridan etai, acima; Marsters et ai, acima; e Simonet et ai, acima). O termo "receptorApo-2L" quando usado no presente pedido engloba receptor de seqüêncianativa e receptores variantes. Estes termos englobam receptor Apo-2Lexpressado em uma variedade de mamíferos, incluindo humanos. ReceptorApo-2L pode ser expresso de maneira endógena como ocorre naturalmenteem uma variedade de linhagens de tecidos humanos, ou pode ser expressopor métodos recombinantes ou sintéticos. Um "receptor Apo-2L de seqüêncianativa" compreende um polipeptídeo que tem a mesma seqüência deaminoácido de um receptor Apo-2L derivado da natureza. Dessa forma, umreceptor Apo-2L de seqüência nativa pode ter a seqüência de aminoácido doreceptor Apo-2L que ocorre naturalmente de qualquer mamífero. Tal receptorApo-2L de seqüência nativa pode ser isolado da natureza ou pode serproduzido por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "receptor Apo-2Lde seqüência nativa" especificamente engloba formas retiradas ou secretadasdo receptor que ocorrem naturalmente (por exemplo, uma forma solúvel quecontém, por exemplo, uma seqüência de domínio extracelular), formasvariantes que ocorrem naturalmente (por exemplo, alternativamente formasunidas) e variantes alélicas que ocorrem naturalmente. Receptores variantespodem incluir fragmentos ou deleção de mutantes do receptor Apo-2L deseqüência nativa. Figura 3A mostra a seqüência de 411 aminoácidos de DR5humano como publicado no documento WO 98/51793 em 19 de novembro de1998. Uma variante unida por transcrição do DR5 humano é conhecida natécnica. Esta variante de união DR5 codifica a seqüência de 440 aminoácidosde DR5 humano exibida nas Figuras 3B e 3C como publicado no documentoWO 98/35986 em 20 de agosto de 1998.
"Anticorpo de receptor de morte" é usado no presente pedido parageralmente referir-se ao anticorpo ou anticorpos direcionados a um receptor nasuperfamília do receptor do fator de necrose tumoral e que contém um domíniode morte capaz de sinalizar apoptose, e tais anticorpos incluem anticorpo deDR5 e anticorpo de DR4.
"Anticorpo receptor de DR5", "anticorpo de DR5", ou "anticorpoanti-DR5" é usado em um amplo senso para referir-se aos anticorpos que seligam a pelo menos uma forma de um receptor DR5, tal como a seqüência 1-411 mostrada nas Figuras 3A ou a seqüência mostrada nas Figuras 3B-3C, oudomínio extracelular deste. Opcionalmente o anticorpo DR5 é fundido ouligado a uma seqüência ou molécula heteróloga. Preferivelmente a seqüênciaheteróloga permite ou ajuda o anticorpo a formar complexos de ordem maisalta ou oligoméricos. Opcionalmente, o anticorpo DR5 liga-se ao receptorDR5, mas não se liga ou interage com qualquer receptor Apo-2L adicional (porexemplo, DR4, DcR1, ou DcR2). Opcionalmente o anticorpo é um agonista daatividade de sinalização do DR5.
Opcionalmente, o anticorpo de DR5 da invenção liga-se a umreceptor DR5 na faixa de concentração de aproximadamente 0,1 nM paracerca de 20 mM como medida em um ensaio de ligação BIAcore.Opcionalmente, os anticorpos de DR5 da invenção exibem um valor IC50 decerca de 0,6 nM para cerca de 18 mM como medido em um ensaio de ligaçãoBIAcore.
"Anticorpo receptor de DR4", "anticorpo de DR4", ou "anticorpoanti-DR4" é usado em um amplo senso para referir-se aos anticorpos que seligam a pelo menos uma forma de um receptor DR4 ou domínio extracelulardeste. Opcionalmente o anticorpo de DR4 é fundido ou ligado a umaseqüência ou molécula heteróloga. Preferivelmente a seqüência heterólogapermite ou ajuda o anticorpo a formar complexos de ordem mais alta ouoligoméricos. Opcionalmente, o anticorpo de DR4 liga-se ao receptor DR4,mas não se liga ou interage com qualquer receptor Apo-2L adicional (porexemplo, DR5, DcR1, ou DcR2). Opcionalmente o anticorpo é um agonista daatividade de sinalização de DR4.
Opcionalmente, o anticorpo de DR4 da invenção liga-se a umreceptor DR4 na faixa de concentração de cerca de 0,1 nM para cerca de 20mM como medida em um ensaio de ligação BIAcore. Opcionalmente, osanticorpos de DR4 da invenção exibem um valor IC50 de cerca de 0,6 nM paracerca de 18 mM, como medido em um ensaio de ligação BIAcore.
O termo "agonista" é usado no mais amplo senso, e incluiqualquer molécula que aumenta parcialmente ou completamente, estimula ouativa uma ou mais atividades biológicas de Apo2L/TRAIL, DR4 ou DR5, in vitro,in situ, ou in vivo. Exemplos de tais atividades biológicas de ligação deApo2L/TRAIL para DR4 ou DR5, incluindo apoptose assim como aquelas maisadiante relatadas na literatura. Um agonista pode funcionar de uma maneiradireta ou indireta. Por exemplo, o agonista pode funcionar para aumentarparcialmente ou completamente, estimular ou ativar uma ou mais atividadesbiológicas de DR4 ou DR5, in vitro, in situ ou in vivo como um resultado de sualigação direta para DR4 ou DR5, que causa ativação do receptor ou sinal detransdução. O agonista pode também funcionar indiretamente para aumentarparcialmente ou completamente, estimular ou ativar uma ou mais atividadesbiológicas de DR4 ou DR5, in vitro, in situ ou in vivo como um resultado de, porexemplo, estimulando outra molécula efetora que então causa ativação deDR4 ou DR5 ou sinal de transdução. É contemplado que um agonista podeagir como uma molécula de aumento que funciona indiretamente paraaumentar ou intensificar a ativação ou atividade de DR4 ou DR5. Por exemplo,o agonista pode aumentar a atividade de Apo-2L endógeno em um mamífero.Isto poderia ser realizado, por exemplo, por pré-complexo DR4 ou DR5 ou pelaestabilização dos complexos do respectivo Iigante com o receptor DR4 ou DR5(tal como complexo nativo de estabilização formado entre Apo-2L e DR4 ouDR5).
O termo "biomarcador" como usado no presente pedido refere-segeralmente a uma molécula, incluindo um gene, proteína, estrutura decarboidrato, ou glicolipídeo, a expressão destes no ou em um tecido ou célulade mamífero pode ser detectada por métodos padrão (ou métodos divulgadosno presente pedido) e é preditivo para uma sensibilidade de célula ou tecido demamífero para Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte. Taisbiomarcadores contemplados pela presente invenção incluem, mas não estãolimitados a moléculas na família de proteínas GaINac-T. Membros da famíliade genes e proteínas ("GaINac-T") N-acetilgalactosaminiltransferase humanasforam descritas (ver, por exemplo, Hang et ai., "The chemistry and biology ofmucin-type O-Iinked glycosylation initiated by the polypeptide N-acetyl-galactosaminyltransferases", Bioorganic & Medicinal Chemistry (disponível emmaio de 2005 em www.sciencedirect.com) e referências citadas neste; Wanget ai., BBRC, 300:738-744 (2003) e referências citadas neste), e acredita-sefuncionar na determinação do número e posição de cadeias de açúcar O-ligadas em proteínas. Opcionalmente, a expressão de tal biomarcador édeterminada para ser mais alta do que observada para uma amostra de célulaou tecido controle. Opcionalmente, por exemplo, a expressão de talbiomarcador será determinada usando-se um microarranjo (microarray) deexpressão gênica, PCR quantitativo ou teste de imunohistoquímica (IHC).
Opcionalmente, expressão de um biomarcador GaINac-T, tal como GaINac-T14 ou GalNac-T3, será detectado em um nível de pelo menos 750, comomedido por análise de microarranjo Affymetrix U133P, ou 500 vezes, oupreferivelmente pelo menos 1000 vezes mais alto, na amostra de célula outecido de teste quando detectar expressão do biomarcador usando-se PCRquantitativo.
"UDP-N-acetil-D-galactosamina:polipeptídeo N-acetilgalactosaminiltransferase-T14", "pp-GalNac-T14", "GalNac-T14", "GALNT14" são usadosno presente pedido para referir-se a uma proteína de membrana tipo Il que temtraços de característica da família GaINac-T de moléculas que compreendemum domínio citoplasmático N-terminal, domínio de transmembrana, regiãotronco e domínio catalítico. Em uma realização opcional, a molécula GaINac-T14 humana contém 1659 pares de base que codificam uma proteína de 552aminoácidos, como mostrado na Figura 4A. O cDNA humano de comprimentototal foi depositado no GenBank conforme No. de Acesso AB078144. Comodivulgado em Wang et ai, BBRC, 300:738-744 (2003), isoformas unidas deGalNac-T14 foram identificadas, as quais incluem (ou não incluem) éxonsespecíficos, tais como éxons 2, 3, e/ou 4. A presente invenção contempla oexame da expressão de qualquer de tais isoformas diversas de GalNac-T14, eessa expressão de qualquer uma de tais isoformas é preditiva da sensibilidadeda amostra de células ou tecido mamífero ao Apo2L/TRAIL ou anticorpo dereceptor de morte.
"UDP-N-acetil-D-galactosamina:polipeptídeo N-acetilgalactosaminiltransferase-T3", "pp-GalNac-T3", "GalNac-T3", "GALNT3" são usados nopresente para referir-se a uma proteína de membrana tipo Il que tem traços decaracterística da família GaINac-T de moléculas que compreendem umdomínio citoplasmático N-terminal, domínio de transmembrana, região tronco edomínio catalítico. Em uma realização opcional, o polipeptídeo GalNac-T3humano compreende a seqüência de aminoácido mostrado na Figura 4B.GalNac-T3 é mais adiante descrita em Bennett et ai, J. Biol. Chem.,271:17006-17012 (1996).
Por "sujeito" ou "paciente" entende-se qualquer sujeito único paraos quais a terapia é desejada, incluindo humanos. Também se pretende incluircomo um sujeito quaisquer sujeitos envolvidos em testes de pesquisa clínicanão mostrando qualquer sinal clínico da doença, ou sujeitos envolvidos emestudos epidemiológicos, ou sujeitos usados como controle.
O termo "mamífero" como usado no presente refere-se aqualquer mamífero classificado como um mamífero, incluindo humanos, vacas,cavalos, cachorros e gatos. Em uma realização preferida da invenção, omamífero é humano.
Por "amostra de célula ou tecido" entende-se uma coleção decélulas similares obtidas de um tecido de um sujeito ou paciente. A fonte daamostra de célula ou tecido pode ser tecido sólido a partir de uma amostra deum órgão ou tecido fresco, congelado e/ou preservado ou biópsia ou aspirado;sangue ou quaisquer componentes do sangue; fluidos corporais tais comofluido cérebro-espinhal, fluido amniótico, fluido peritoneal, ou fluido intersticial,células de qualquer tempo na gestação ou desenvolvimento do sujeito. Aamostra de tecido pode também ser células primárias ou cultivadas oulinhagens celulares. Opcionalmente, a amostra de célula ou tecido é obtida apartir de um tumor primário ou metastático. A amostra de tecido pode contercompostos no qual não são mesclados naturalmente com o tecido na naturezatais como conservantes, anticoagulantes, tampões, fixadores, nutrientes,antibióticos, ou similares.
Para os propósitos no presente pedido um "corte" de umaamostra de tecido significa uma parte única ou pedaço de uma amostra de umtecido, por exemplo, uma porção fina de tecido ou corte de células a partir deuma amostra de tecido. Entende-se que cortes múltiplos de amostras detecido podem ser extraídos e submetidos à análise de acordo com a presenteinvenção, ficando estabelecido que se entenda que a presente invençãocompreende um método pelo qual o mesmo corte de amostra de tecido éanalisado tanto em níveis morfológicos como molecular, ou é analisada tantoem relação à proteína como ácido nucléico.
Por "correlação" ou "correlacionar" entende-se comparar, dequalquer forma, o desempenho e/ou resultados de uma primeira análise ouprotocolo com o desempenho e/ou resultados de uma segunda análise ouprotocolo. Por exemplo, pode-se usar os resultados de uma primeira análise ouprotocolo em resultado a um segundo protocolo e/ou pode-se usar osresultados de uma primeira análise ou protocolo para determinar se umasegunda análise ou protocolo deve ser executada. Com relação a diversasrealizações no presente, pode-se usar resultados de uma análise analítica talcomo expressão de mRNA ou IHC para determinar se um regime terapêuticoespecífico usando Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte deve serrealizado.
Por "ácido nucléico" tem-se a intenção de incluir qualquer DNA ouRNA. Por exemplo, ácido nucléico cromossômico, mitocondrial, viral e/oubacteriano presente na amostra de tecido. O termo "ácido nucléico" englobatanto ou ambas as fitas de uma molécula de ácido nucléico de fita dupla einclui qualquer fragmento ou porção de uma molécula de ácido nucléicointacta.
Por "gene" entende-se qualquer seqüência de ácido nucléico ouporção desta com um papel funcional na codificação ou transcrição de umaproteína ou regulação da expressão de outro gene. O gene pode consistir detodos os ácidos nucléicos responsáveis pela codificação de uma proteínafuncional ou somente uma porção dos ácidos nucléicos responsáveis pelacodificação ou expressão de uma proteína. A seqüência de ácido nucléicopode compreender uma anormalidade genética nos éxons, íntrons, regiõesiniciais ou de terminação, seqüências promotoras, outras seqüênciasreguladoras ou regiões adjacentes únicas para o gene.A palavra "marcador" quando usada no presente refere-se a umcomposto ou composição que é conjugada ou fundida diretamente ouindiretamente a um reagente, tal como uma sonda de ácido nucléico ou umanticorpo e facilita a detecção do reagente ao qual está conjugado ou fundido.
O marcador pode ser detectável por si mesmo (por exemplo, marcadores deradioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcadorenzimático, pode catalisar alteração química de um composto ou composiçãodo substrato que é detectável.
O termo "anticorpo" no presente pedido é usado no senso maisamplo e especificamente abrange anticorpos monoclonais intactos, anticorpospoliclonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos)formados por pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo,contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.
"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de umanticorpo intacto, preferivelmente que compreende a região de ligação deantígeno ou região variável deste. Exemplos de fragmentos de anticorpoincluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos, anticorposlineares; moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficosformados de fragmentos de anticorpo.
"Anticorpos nativos" são usualmente glicoproteínasheterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeiasleves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve éligada a uma cadeia pesada por uma ligação bissulfeto covalente, enquanto onúmero de ligações bissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentesisotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também temregularmente pontes bissulfeto espaçadas entre cadeias. Cada cadeia pesadatem em uma terminação um domínio variável (Vh) seguida por um número dedomínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em umaterminação (Vl) e um domínio constante na sua outra terminação, o domínioconstante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante dacadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com odomínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidosespecíficos formem uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve ecadeia pesada.
O termo "variável" refere-se ao fato que certas porções dodomínio variável diferenciam-se extensivamente na seqüência entre anticorpose são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico paraseu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuídauniformemente por todos os domínios variáveis dos anticorpos. Ela estáconcentrada em três segmentos chamados regiões hipervariáveis ou regiõesdeterminadas por complementaridade ambos nos domínios variáveis de cadeialeve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domíniosvariáveis são chamadas de regiões de estrutura (framework) (FRs). Osdomínios variáveis das cadeias leves e pesadas nativas, cada um compreendequatro FRs adotando amplamente uma configuração folha β, conectada portrês regiões hipervariáveis, na qual formam Ioops que se conectam, e emalguns casos formam parte da estrutura folha β. As regiões hipervariáveis emcada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidade pelas FRs e, com asregiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio deligação do antígeno com anticorpos, (ver Kabat et aí., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estãodiretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibemvárias funções efetoras, tal como participação do anticorpo na citotoxicidademediada por células dependente de anticorpo (ADCC).
Digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos deligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com umúnico sítio de ligação de antígeno, e um fragmento "Fc" residual, cujo nomereflete sua habilidade para cristalizar de imediato. Tratamento por pepsinarende um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de ligação de antígeno e éainda capaz de interligar-se ao antígeno.
"Fv" é um fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítiocompleto de reconhecimento de antígeno e de ligação de antígeno. Estaregião consiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável decadeia leve em associação não covalente estreita. É nesta configuração queas três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definirum sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero Vh-Vl- Coletivamente,as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígenoao anticorpo. No entanto, até um único domínio variável (ou metade de umaFv que compreende somente três regiões hipervariáveis específicas para umantígeno) possui a habilidade de reconhecer e ligar-se a um antígeno, emboracom afinidade mais baixa que o sítio de ligação inteiro.
O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. FragmentosFab' diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na terminaçãocarboxila de um domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou maiscisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab1-SH é a designação nopresente para Fab1 na qual o(s) resíduo(s) cisteína(s) dos domínios constantesproduz pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos do anticorpo F(ab')2originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab1 que possuemdobradiça de cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos defragmentos de anticorpo são também conhecidos.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser designadas para um ou dois tiposclaramente distintos, chamados kappa (κ) e Iambda (λ), baseados naseqüência de aminoácidos de seus domínios constantes.
Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constantede suas cadeias pesadas, os anticorpos podem ser designados para diferentesclasses. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA1 IgD1 IgE1IgG1 e IgM1 e várias destas podem também ser divididas em subclasses(isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2. Os domíniosconstantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes deanticorpos são chamados de α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As subunidadesde estruturas e configurações tridimensionais de diferentes classes deimunoglobulinas são bem conhecidas.
Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv"compreendem os domínios Vh e Vl do anticorpo, em que estes domínios estãopresentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente, opolipeptídeo Fv, além disso, compreende um Iigante polipeptídeo entre osdomínios Vh e Vl que permite o scFv formar a estrutura desejada para aligação de antígeno. Para uma revisão de scFv ver Plückthun em ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994).
O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo pequenocom dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem umdomínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável decadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh - VL). Pelo uso de umligante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios namesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínioscomplementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno.Diacorpos estão descritos mais completamente em, por exemplo, patente EP404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sei.USA, 90:6444-6448 (1993).
O termo "anticorpo monoclonal" como utilizado no presenterefere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpossubstancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais quecompreendem a população são idênticos, exceto por possível ocorrêncianatural de mutações que podem estar presentes em menores quantidades.Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionado a umúnico sítio antigênico. Além disto, em contraste com preparações de anticorpoconvencional (policlonal) que tipicamente incluem diferentes anticorposdirecionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpomonoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Alémdisso, para suas especificidades, os anticorpos monoclonais são vantajosos,pois eles são sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminada poroutras imunoglobulinas. O modificador "monoclonal" indica o caráter doanticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogêneade anticorpos, e não sendo construído como produção requerida do anticorpopor qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais paraserem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelométodo de hibridoma, primeiro descrito por Kohler et aí., Nature, 256:495(1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (ver, porexemplo, patente US 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem tambémser isolados de bibliotecas de anticorpo em fago que utilizam as técnicasdescritas em Clackson et a/., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et ai, J. Mol.Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais no presente pedido especificamenteincluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), nos quais uma porção dacadeia leve e/ou pesada é idêntica a, ou homóloga às seqüênciascorrespondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica oupertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto orestante da(s) cadeia(s) é idêntico a, ou homólogo às seqüênciascorrespondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie oupertencendo a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim comofragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológicadesejada (patente US 4.816.567; Morrison et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA,81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse no presente pedidoincluem anticorpos "primatizados" que compreendem seqüências de ligação deantígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (porexemplo, Macaco do Velho Mundo, tal como babuíno, rhesus ou macacocynomolgus) e seqüências de região constante humana (patente US5.693.780).
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo,murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada deimunoglobulina não humana. Na maior parte, anticorpos humanizados sãoimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma regiãohipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma regiãohipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo especificidade,afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da regiãode estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduoscorrespondentes não humanos. Além disto, anticorpos humanizados podemcompreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou noanticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disto, refinar odesempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreendersubstancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domíniosvariáveis, em que todos ou substancialmente todos os Ioops hipervariáveiscorrespondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ousubstancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência deimunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente irá tambémcompreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) daimunoglobulina, tipicamente de uma imunoglobulina humana. Para detalhesadicionais, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et ai,Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
O termo "região hipervariável" quando usado no presente refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis porligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos deaminoácido de uma "região determinada por complementaridade" ou "CDR"(por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variávelde cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável decadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)) e/ou aqueles resíduos de um llIoop hipervariável" (por exemplo,resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia levee 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada;Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Região de estrutura" ouresíduos "FR" são aqueles resíduos de domínio variável, exceto os resíduos deregião hipervariável como definido no presente.
Um anticorpo "que se liga" a um antígeno de interesse é aquelecapaz de se ligar a esse antígeno com afinidade e/ou avidez suficiente, tal queo anticorpo seja útil como um agente terapêutico ou de diagnóstico para atingiruma célula que expressa o antígeno.
Para os propósitos do presente, "imunoterapia" irá se referir a ummétodo de tratamento de um mamífero (preferivelmente um paciente humano)com um anticorpo, em que o anticorpo pode ser um anticorpo não conjugadoou "nu", ou o anticorpo pode ser conjugado ou fundido com molécula(s) ouagente(s) hetrólogo(s), tal como um ou mais agente(s) citotóxico(s), atravésdisso gerando um "imunoconjugado".
Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separadoe/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural.
Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais quepoderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo, epodem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) paramais que 95% por peso de anticorpo como determinado pelo método Lowry, emais preferivelmente mais que 99% por peso, (2) para um grau suficiente paraobter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou seqüência de aminoácidointerna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) parahomogeneidade por FAGO-SDS sob condições de redução ou não reduçãoutilizando-se Coomassie blue ou, preferivelmente, silver stain. Anticorpoisolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde quepelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estejapresente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado porpelo menos uma etapa de purificação.
A expressão "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade deum agente (por exemplo, anticorpo Apo2L/TRAIL, anti-DR4 ou anticorpo DR5,etc.) que é eficaz para prevenir, melhorar ou tratar a doença ou condição emquestão.
Os termos "tratar", "tratamento" e "terapia" como usados nopresente referem-se à terapia curativa, terapia profilática e terapia preventiva.
Tratamento consecutivo ou administração refere-se ao tratamento em pelomenos uma base diária, sem interrupção no tratamento por um ou mais dias.Tratamento ou administração intermitente, ou tratamento ou administração emum modo intermitente, refere-se ao tratamento que não é consecutivo, mas depreferência cíclico na natureza.
O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadaspor uma população de células que agem em outra célula como mediadorasintercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas, ehormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão oshormônios de crescimento, tais como hormônio de crescimento humano,hormônio de crescimento humano N-metionil, e hormônio de crescimentobovino; hormônio da paratiróide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina;prorelaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio folículoestimulante (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH), hormônioluteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento dofibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator-α e -β de necrose tumoral;substância de inibição mulleriana; peptídeo associado a gonadotropina decamundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular;integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento do nervo, fator decrescimento de plaqueta; fatores transformantes do crescimento (TGFs) taiscomo TGF-a e TGF-β; fator-l e -II de crescimento similar a insulina;eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons tais como interferon-α, -β, e -γ; fatores de estimulação de colônia (CSFs) tal como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF);interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17; e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e kit Iigante(KL). Como usado no presente pedido, o termo citocina inclui proteínas defontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentesbiologicamente ativos de citocinas de seqüência nativa.
O termo "agente citotóxico" como usado no presente pedidorefere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/oucausa destruição de células. O termo tem a intenção de incluir isótoposradioativos (por exemplo, I131, I1251 Y901 e Re186), agentes quimioterápicos, etoxinas tais como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana,fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destas.
Um "agente quimioterápico" é um componente químico útil notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentesalquilantes tais como tiotepa e (CYTOXAN™); alquil sulfonados tais comobusulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa,carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindoaltretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida etrimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona);uma camptotecina (incluindo a sintética análoga topotecan), briostatina;calistatina; CC-1065 (incluindo suas análogas adozelesina, carzelesina ebizelesina sintéticas análogas); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 ecriptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina;espongistatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazina,clolofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto óxido demecloretamina, melfalan, novembiquin, fenesterina, prednimustina,trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureas tais como carmustina,clorozotocina, fotemustina, Iomustina1 nimustina e ranimustina; antibióticos taiscomo os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmentecaliqueamicina gamai I e caliqueamicina phill, ver, por exemplo, Agnew1 ChemIntl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A;bifosfonatos, tal como clodronato, uma esperamicina; assim como cromóforosde neocarzinostatina e cromóforos de antibióticos enedina cromoproteínasrelacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina,bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina,cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (Adriamycin™) (incluindo morfolino-doxorubicina,cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e deoxidoxorubicina),epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal comomitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina,potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina,estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitostais como metotrexato, e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico taiscomo denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purinatais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos depirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina,dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais comocalusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano,testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano;ácido fólico restabelecedor tais como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo dealdofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestrabucila;bisantrena; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina;acetato de eliptinio; um epotileno, etoglucideo; nitrato de gálio; hidroxiurea;lentinan; lonidamina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas;mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet;pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico, 2-etil hidrazida; procarbazina;PSK®; razoxana; rizoxina; sizofirana; espirogermanio; ácido tenuazonico;triaziquona; 2,2'2"-tricloro trietil amina; tricotecenos (especialmente toxina T-2,verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina;manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina; arabinosida("Ara-C"); ciclofosfamida, tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (TAXOTERE®,Rhône-Poulenc Rorer, Antony1 France); cloranbucila; gencitabina (Gemzar™);6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais comocisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida;mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (Navelbine™); novantrona, teniposide;edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidorde topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides tais comoácido retinóico; capecitabina; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ouderivados de qualquer um dos acima. Também incluído nesta definição estãoos agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação doshormônios em tumores tal como anti-estrógenos e moduladores seletivos doreceptor de estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifen (incluindoNolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno,LY117018, onapristona, e toremifeno (Fareston™); inibidores de aromataseque inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógeno nasglândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida,acetato de megestrol (Megace™), exemestano, formestano, fadrozola,vorozola (Rivisor™), Ietrozola (Femara™), e anastrozola (Arimidex™); e anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, egoserelina; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados dequalquer dos acima.
Um "agente inibitório de crescimento" quando usado no presentepedido refere-se a um componente ou composição que inibe o crescimento deuma célula, especialmente célula cancerígena que superexpressa qualquer umdos genes identificados no presente, tanto in vitro como in vivo. Dessa forma,o agente inibitório de crescimento pode ser aquele que reduz significantementea porcentagem de células que superexpressam tais genes na fase S.Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluem agentes quebloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local, exceto na fase S), taiscomo agentes que induzem a interrupção G1 e interrupção da fase M.Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina),taxol, e inibidores topo II1 tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina,etoposido e bleomicina. Aqueles agentes que capturam G1 também seespalham na captura da fase S1 por exemplo, agentes alquilantes de DNA taiscomo tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina,metotrexato, 5-flúor uracila, e ara-C. Informações adicionais podem serencontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds.,Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs"por Murakami et ai (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.
Os termos "apoptose" e "atividade apoptótica" são usados nomais amplo sentido e referem-se à forma sistemática ou controlada de mortecelular em mamíferos, que é tipicamente acompanhada por uma ou maiscaracterísticas de modificações celulares, incluindo condensação decitoplasma, perda de microvilosidades da membrana plasmática, segmentaçãodos núcleos, degradação de DNA cromossômico ou perda de função mitocondrial. A atividade pode ser determinada e medida, por exemplo, portestes de viabilidade celular (tal como testes Alamar blue ou testes MTT),análise FACS , ativação da caspase, fragmentação de DNA (ver, por exemplo,Nicoletti et ai, J. Immunol. Methods, 139:271-279 (1991), e poli(ADP ribosepolimerase), "PARP", testes de clivagem conhecidos na técnica.
Como usado no presente pedido, o termo "disfunção" em geralrefere-se a qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com ascomposições descritas no presente, incluindo qualquer doença ou disfunçãoque pode ser tratada por quantidades eficazes de Apo2L/TRAIL, um anticorpoanti-DR4, e/ou um anticorpo anti-DR5. Isto inclui disfunções crônicas eagudas, como também aquelas condições patológicas que predispõem omamífero à disfunção em questão. Exemplos não Iimitantes de disfunções aserem tratadas no presente incluem cânceres benignos e malignos;inflamatórios, disfunções angiogênicas e imunológicas, doenças auto-imune,artrite (incluindo artrite reumatóide), esclerose múltipla, e HIV/AIDS.
Os termos "câncer", "cancerígeno" ou "maligno" referem-se a oudescrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamentecaracterizada pela desregulação do crescimento celular. Exemplos de câncerincluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma esarcoma. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem carcinomacelular escamoso, mieloma, câncer de pulmão de célula pequena, câncer depulmão de célula não-pequena, glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, câncer (trato) gastrointestinal, câncer renal, câncer ovariano, câncerde fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, câncer coloretal, câncerendometrial, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de tireóide, melanoma,condrosarcoma, neuroblastoma, câncer pancreático, glioblastoma multiforme,câncer cervical, câncer do cérebro, câncer de estômago, câncer de bexiga,hepatoma, câncer de mama, carcinoma de cólon, câncer de cabeça e pescoço.
O termo "doença imune relacionada" significa uma doença naqual um componente do sistema imune de um mamífero causa, media ou deoutra forma contribui para uma morbidade no mamífero. Também sãoincluídas doenças em que a estimulação ou intervenção da resposta imunetem um efeito de melhora na progressão da doença. Incluído neste termoestão as doenças auto-imunes, doenças inflamatórias imune mediadas,doenças inflamatórias não imune mediadas, doenças infecciosas, e doençasde imunodeficiéncia. Exemplos de doenças imune relacionadas einflamatórias, algumas destas são imune ou mediadas por célula T, que podemser tratadas de acordo com a invenção incluem lúpus sistêmico, lúpuseritematoso, artrite reumatóide, artrite crônica juvenil, espondiloartropatias,esclerose sistêmica (escleroderma), miopatias inflamatórias idiopáticas(dermatomiosite, polimiosite), síndrome de Sjogren, vasculite sistêmica,sarcoidose, anemia hemolítica auto-imune (pancitopenia imune,hemoglobinúria paroxismal noturna), trombocitopenia auto-imune (púrpuratrombocitopênica idiopática, trombocitopenia imune mediada), tireoidite(doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, tireoidite linfocítica juvenil, tireoiditeatrófica), diabetes mellitus, doença renal imune mediada (glomerulonefrite,nefrite tubulointersticial), doenças de demielinação do sistema nervoso centrale periférico tal como esclerose múltipla, polineuropatia de demielinaçãoidiopática ou síndrome de Guillain-Barré, e polineuropatia de demielinaçãoinflamatória crônica, doenças hepatobiliares tais como hepatite infecciosa(hepatite A, B, C, D, E e outras viroses não hepatotrópicas), hepatite ativacrônica auto-imune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, e colangiteesclerosante, doenças inflamatórias e fibróticas de pulmão tal como doençainflamatória de intestino (colite ulcerativa: doença de Crohn), enteropatiaglúten-sensível, e doença de Whipple, doenças de pele auto-imune ou imunemediada incluindo doenças de pele vesiculares, eritema multiforme e dermatitede contato, psoríase, doenças alérgicas tais como asma, renite alérgica,dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar e urticária, doençasimunológicas do pulmão tal como pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonaridiopática e pneumonite de hipersensibilidade, doenças associadas atransplantes incluindo rejeição de enxerto e doença do enxerto contrahospedeiro. Doenças infecciosas incluem AIDS (infecção HIV), hepatite A, B,C, D, e E, infecções por bactérias, infecções por fungos, infecções porprotozoários e infecções por parasitas.
"Doença auto-imune" é usada no presente em um sentido geral eamplo para se referir a disfunções ou condições em mamíferos em que adestruição dos tecidos sadios ou normais é proveniente de respostas humoraisou celulares do indivíduo mamífero para seus próprios tecidos de constituição.Exemplos incluem, mas não estão limitados a, lúpus eritematoso, tireoidite,artrite reumatóide, psoríase, esclerose múltipla, diabete auto-imune, e doençainflamatória do intestino (IBD).
O termo "marcado" quando usado no presente refere-se a umamolécula quimérica que compreende um anticorpo ou um polipeptídeo unido aum "polipeptídeo de marcação (tag)". O polipeptídeo de marcação possuiresíduos suficientes para fornecer um epítopo contra o qual um anticorpo podeser feito ou para fornecer alguma outra função, tal como a habilidade paraoligomerizar (por exemplo, como ocorre com peptídeos que possuem domíniosde fecho de leucina), ainda é curto o bastante tal que geralmente não interferena atividade do anticorpo ou polipeptídeo. O polipeptídeo de marcaçãotambém é bastante exclusivo, de forma que o anticorpo não interajasubstancialmente com outros epítopos. Polipeptídeos de marcaçãoadequados geralmente possuem pelo menos seis resíduos de aminoácidos eusualmente entre aproximadamente 8 a cerca de 50 resíduos de aminoácido(preferivelmente, entre aproximadamente 10 a cerca de 20 resíduos).
O termo "íon de metal bivalente" refere-se a um íon de metal quetem duas cargas positivas. Exemplos de íons de metal bivalente incluem masnão estão limitados a zinco, cobalto, níquel, cádmio, magnésio, e manganês.
Formas específicas de tais metais que podem ser empregados incluem formassalinas (por exemplo, formas salinas farmaceuticamente aceitáveis), tais comocloreto, acetato, carbonato, citrato e formas de sulfato de íons de metalbivalentes mencionados acima. Opcionalmente, um íon de metal bivalentepara uso na presente invenção é zinco, e preferivelmente, a forma salina,sulfato de zinco ou cloreto de zinco.
"Isolado" quando usado para descrever vários peptídeos ouproteínas divulgadas no presente, significa peptídeo ou proteína que foiidentificada e separada e/ou recuperada de um componente de seu meionatural. Componentes contaminantes de seu meio natural são materiais quepoderiam tipicamente interferir no diagnóstico ou usos terapêuticos para opeptídeo ou proteína, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutosproteináceos ou não-proteináceos. Em realizações preferidas, o peptídeo ouproteína será purificado (1) para um grau suficiente para obter pelo menos 15resíduos de seqüência de aminoácido N-terminal ou interna pelo uso de umseqüenciador de copo giratório, ou (2) para homogeneidade por SDS-PAGEsob condições de redução ou não redução usando-se Coomassie blue ou,preferivelmente, silver stain, ou (3) para homogeneidade por espectroscopia demassa ou técnicas de mapeamento de peptídeo. O material isolado incluipeptídeo ou proteína in situ em células recombinantes, desde que pelo menosum componente de seu meio natural não esteja presente. Geralmente, noentanto, o peptídeo ou proteína isolada será preparado por pelo menos umaetapa de purificação.
"Porcentagem (%) de identidade de seqüência aminoácido" comrelação às seqüências identificadas no presente pedido é definido como aporcentagem de resíduos de aminoácidos em uma seqüência candidata quesão idênticos aos resíduos de aminoácidos na seqüência de referência, apósalinhamento das seqüências e introdução de gaps, se necessário, paraalcançar a porcentagem máxima de identidade de seqüência, e nãoconsiderando qualquer substituição conservativa como parte da identidade deseqüência. Alinhamento para os propósitos de determinação da porcentagemde identidade de seqüência de aminoácido pode ser alcançado de váriasmaneiras que estão dentro da técnica e podem determinar parâmetrosapropriados para medição de alinhamento, incluindo determinação dealgoritmos necessários para alcançar o máximo alinhamento sobre ocomprimento total das seqüências sendo comparadas. Para os propósitos nopresente, os valores de porcentagem de aminoácido idênticos podem serobtidos usando-se o programa de computador de comparação de seqüência,ALIGN-2, que foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código da fonte doqual foi depositado com documentação de usuário no US Copyright Office,Washington, DC1 20559, registrado com base em US Copyright Número deRegistro TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponívelatravés da Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos os parâmetrosde comparação de seqüência são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e nãovariam.
"Estringência" de reações de hibridização é determinada deimediato por um técnico no assunto, e geralmente é um cálculo empíricodependendo do comprimento da sonda, temperatura de lavagem econcentração de sal. Em geral, sondas mais longas exigem temperaturas maisaltas para anelamento apropriado, enquanto que sondas mais curtas precisamde temperaturas mais baixas. A hibridização geralmente depende dahabilidade do DNA denaturado reanelar quando fitas complementares estãopresentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quantomaior o grau de desejada identidade entre a sonda e seqüência hibridizável,maior a temperatura relativa que pode ser usada. Como um resultado, segueque temperaturas relativas mais altas tenderiam a fazer as condições dareação mais estringentes, enquanto temperaturas mais baixas, menos. Paradetalhes adicionais e explicações de estringência de reações de hibridização,ver Ausubel et ai, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley IntersciencePublishers, (1995).
"Condições de alta estringência", como definido no presente, sãoidentificadas por aquelas que: (1) empregam alta. força iônica e altatemperatura para lavagem, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato desódio/0,1% de dodecil sulfato de sódio a 50°C; (2) empregam durante ahibridização um agente denaturante, 50% (v/v) de formamida com 0,1%albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50mM detampão fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mMde citrato de sódio a 42°C; ou (3) empregam 50% de formamida, 5 χ SSC (0,75M de NaCI1 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6.8),0,1% de pirofosfato de sódio, 5 χ solução de Denhardt, DNA de esperma desalmão sonicado (50 pg/ml), 0.1% de SDS, e 10% de sulfato de dextrana a42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 χ SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e50% de formamida a 55°C, seguido por uma lavagem de alta estringênciaconsistindo de 0,1 χ SSC contendo EDTA a 55°C.
"Condições de estringência moderada" podem ser identificadascomo descrito por Sambrook et ai, Molecular Cloning:_A Laboratory Manual,Nova York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem incubação durante anoite a 37°C em uma solução que compreende: 20% de formamida, 5 χ SSC(150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH7.6), 5 χ solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrana, e 20 mg/ml de DNAde esperma de salmão cortado denaturado, seguido por lavagem dos filtros em1 χ SSC a aproximadamente 37-50°C. O técnico no assunto irá reconhecercomo ajustar temperatura, força iônica, etc., conforme necessário paraacomodar fatores tais como comprimento da sonda e similares.
O termo "primei" ou "primers" refere-se à seqüências deoligonucleotídeos que hibridizam a um polinucleotídeo alvo RNA ou DNAcomplementar e serve como o ponto de início para a síntese passo a passo deum polinucleotídeo de mononucleotídeos pela ação de umanucleotidiltransferase, como ocorre, por exemplo, em uma reação em cadeiada polimerase.
O termo "seqüências controle" refere-se à seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificaçãooperacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. Asseqüências controle que são adequadas para procariotos, por exemplo,incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio deligação de ribossomo. Células eucariontes são conhecidas por utilizarpromotores, sinais de poliadenilação, e amplificadores.
Ácido nucléico está "operacionalmente ligado" quando é colocadoem uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Porexemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretório estáoperacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se este é expressocomo uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; umpromotor ou amplificador está operacionalmente ligado a uma seqüência decodificação se afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação deribossomo está operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação seestá posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente,"operacionalmente ligado" significa que as seqüências de DNA sendo ligadassão adjacentes, e, no caso de um líder secretório, adjacentes e na fase deleitura. No entanto, amplificadores não têm que ser adjacentes. A ligação érealizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios nãoexistem, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Iigantes são usadosde acordo com as práticas convencionais.
"Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" e"ADCC" referem-se à reação mediada por célula na qual células citotóxicasnão específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, célulasNatural Killer (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligadona célula atingida e subseqüentemente causam Iise da célula alvo. As célulasprimárias para mediação de ADCC, células NK, expressam somente FcyRIII1enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão FcRem células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 deRavetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar atividadede ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio in vitro de ADCC, tal comodescrito na patente US 5.500.362 ou US 5.821.337 pode ser apresentado.Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares desangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ouadicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode seravaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado emClynes et ai. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as célulasexpressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplosde leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares desangue periférico (PBMC), células Natural Killer (NK), monócitos, células Tcitotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas.
Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados para descrever umreceptor que se liga a região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcRhumano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que seliga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui subclasses dos receptoresFcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formasunidas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor deativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm seqüências similaresde aminoácidos que diferem primeiramente nos domínios citoplasmáticosdestes. Receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação deimuno-receptor baseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático.Receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de inibição de imuno-receptorbaseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (ver Daèron, Annu.Rev. immunoi. 15:203-234 (1997)). FcRs foram revisados em Ravetch e Kinet,Annu. Rev. Immunoi 9:457-92 (1991); Capei et ai, Immunomethods 4:25-34(1994); e de Haas et ai, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs,incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo"FcR" no presente pedido. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn,que é responsável por transferir as IgGs maternas para os fetos (Guyer et ai,J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). FcRs nopresente incluem polimorfismos, tal como dimorfismo genético no gene quecodifica FcyRIIIa resultanto tanto em uma fenilalanina (F) como uma valina (V)na posição de aminoácido 158, localizada na posição do receptor que se ligaao IgGI. O homozigoto valina FcYRIIIa (FcYRIIIa-158V) mostrou ter umaafinidade maior para IgGI humano e mediar aumento de ADCC in vitro, relativoao homozigoto fenilalanina FcYRIIIa (FcYRIIIa-158F) ou receptoresheterozigoto (FcYRIIIa-158F/V).
"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-seà habilidade de uma molécula Iisar um alvo na presença de complemento. Avia de ativação de complemento é iniciada pela ligação do primeirocomponente do sistema complemento (C1q) a uma molécula complexa (porexemplo, um anticorpo) com um antígeno cognato. Para avaliar ativação decomplemento, um teste CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado.
II. Materiais ε Métodos Exemplares da InvençãoOs métodos e testes divulgados no presente pedido sãodirecionados ao exame da expressão de um ou mais biomarcadores em umaamostra de célula ou tecido de mamífero, em que a determinação dessaexpressão de um ou mais de tais biomarcadores é preditiva ou indicativa se aamostra de célula ou tecido será sensível a agentes tais como Apo2L/TRAILe/ou anticorpos receptores de morte tais como anticorpos agonistas de anti-DR5 ou anticorpos agonistas de anti-DR4. Os métodos e testes incluemaqueles que examinam a expressão de membros da família de moléculasGaINac-T, incluindo GalNac-T14 e GalNac-T3.
Como discutido acima, existem algumas populações de tipocelulares humanos doentes (tais como certas populações de célulascancerígenas) que são resistentes à morte celular induzindo efeitos deApo2L/TRAIL ou anticorpos receptores de morte. Acredita-se então que osmétodos e testes divulgados podem fornecer meios convenientes, eficientes ede custo potencialmente efetivo para obter dados e informações úteis naavaliação apropriada ou terapias eficazes para tratar pacientes. Por exemplo,um paciente que foi diagnosticado com câncer ou uma condição imunerelacionada poderia realizar uma biópsia para obter uma amostra de célula outecido, e a amostra poderia ser examinada com o objetivo de realizar váriostestes in vitro para determinar se as células do paciente poderiam ser sensíveisa um agente terapêutico tal como Apo2l/TRAIL ou anticorpo de receptor demorte.
A invenção fornece métodos para prever a sensibilidade de umaamostra de célula ou tecido de mamífero (tal como uma célula cancerígena)para Apo2L/TRAIL e/ou anticorpo agonista de receptor de morte. Opcionalmente, uma amostra de célula ou tecido de mamífero é obtida eexaminada para expressão de GaINac-TI 4. Estes métodos podem serconduzidos em uma variedade de formatos de testes, incluindo testes quedetectam mRNA, expressão de proteína (tal como testes imunohistoquímicos)e testes bioquímicos que detectam UDP-N-acetil-D-galactosamine enzimática:polipeptídeo de atividade N-acetilgalactosaminiltransferase. A determinação daexpressão de tais biomarcadores GaINac-TI4 em ditos tecidos ou célulasserão preditivos de forma que tecidos ou células serão sensíveis aos efeitosbiológicos do Apo2L/TRAIL e/ou anticorpo de receptor de morte. A Depositantedescobriu de maneira surpreendente que a expressão de GaINac-TI4 se correlaciona com a sensibilidade de tais células ou tecidos para Apo2L/TRAILe anticorpos agonistas de receptores de morte.
Como discutido abaixo, a expressão de vários biomarcadores talcomo GalNac-T14 em uma amostra pode ser analisada por uma variedade demetodologias, muitas das quais são conhecidas na técnica e entendidas pelotécnico no assunto, incluindo mas não limitadas a, análise imunohistoquímicae/ou Western, testes quantitativos baseados em sangue (como por exemploSoro ELISA) (para examinar, por exemplo, níveis de expressão de proteína),testes de atividade enzimática bioquímica, hibridização in situ, análise Northerne/ou análise PCR de mRNAs, e análise Southern genômica (para examinar,por exemplo, deleção ou amplificação gênica), assim como qualquer um deuma variedade de testes que podem ser realizados por análise arranjo de genee/ou tecido. Protocolos típicos para avaliação da situação dos genes eprodutos dos genes são encontrados, por exemplo, em Ausubel et al. eds.,1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting), 4(Southern Blotting), 15 (ImmunobIotting) e 18 (Análise PCR).
Os protocolos abaixo que relatam a detecção de GaINac-TI4 emuma amostra são fornecidos para propósitos ilustrativos.
Métodos opcionais da invenção incluem protocolos queexaminam ou testam a presença de GaINac-TI4 em uma amostra de célula outecido de mamífero. Uma variedade de métodos para detectar GaINac-TI4pode ser empregado e inclui, por exemplo, análise imunohistoquímica,imunoprecipitação, análise Western blot, testes de ligação molecular, ELISA,ELIFA, seleção celular ativada por fluorescência (FACS) e imunoprecipitaçãoseguida por MS, análise de monossacarídeo. Por exemplo, um métodoopcional de detecção da expressão de GaINac-TI 4 em um tecido ou amostracompreende contatar a amostra com um anticorpo anti-GalNac-T14 e entãodetectar a ligação do anticorpo a GalNac-T14 na amostra.
Em realizações específicas da invenção, a expressão de GaINac-T14 em uma amostra é examinada usando-se imunohistoquímica e protocolosde coloração. Coloração imunohistoquímica de cortes de tecido mostraram serum método confiável de avaliação ou detecção da presença de proteínas naamostra. Técnicas imunohistoquímicas ("IHC") utilizam um anticorpo parasondar e visualizar antígenos in situ, geralmente por métodos cromatogênicosou fluorescentes.
Para preparação da amostra, uma amostra de célula ou tecido deum mamífero (tipicamente um paciente humano) pode ser usada. Exemplosde amostras incluem, mas não são limitados a, células de câncer tais comocólon, mama, próstata, ovário, pulmão, estômago, pâncreas, Iinfoma e célulasde câncer de leucemia. Opcionalmente, as amostras incluem células decâncer de pulmão de célula não pequena, células de câncer pancreático oucélulas de câncer de Iinfoma não-Hodgkin. A amostra pode ser obtida por umavariedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitadoa excisão cirúrgica, aspiração ou biópsia. O tecido pode ser fresco oucongelado. Em uma realização, a amostra é fixada e embebida em parafina ousimilar.
A amostra de tecido pode ser fixada (isto é, preservada) pormetodologia convencional (Ver, por exemplo, "Manual of HistologicalStaining Method of the Armed Forces Institute of Pathoiogy", 3a edição(1960) Lee G. Luna1 HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-HiIIBook Company, Nova York; The Armed Forces Institute of PathoiogyAdvanced Laboratory Methods in Histology and Pathoiogy (1994) Ulreka V.Mikel1 Editor, Armed Forces Institute of Pathoiogy, American Registry ofPathoiogy, Washington, D.C.). Um técnico no assunto irá apreciar que aescolha de um fixador seja determinada para os propósitos para que aamostra seja histologicamente corada ou analisada de outra forma. Umtécnico no assunto irá também apreciar que a extensão da fixação dependado tamanho da amostra de tecido e do fixador utilizado. A título deexemplo, formalina tamponada neutra, de Bouin ou paraformaldeído,podem ser usados para fixar uma amostra.Geralmente, a amostra é, em primeiro lugar, fixada e é entãodesidratada por meio de uma seqüência ascendente de álcoois, infiltrada eembebida com parafina ou outro meio de corte de forma que a amostra detecido possa ser seccionada. Alternativamente, pode-se cortar o tecido efixar os cortes obtidos. A título de exemplo, a amostra de tecido pode serembebida e processada em parafina por metodologia convencional (ver, porexemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed ForcesInstitute of Pathology", acima). Exemplos de parafina que podem serusadas incluem, mas não estão limitados a, Paraplast, Broloid, eTissuemay. Uma vez que a amostra^está embebida, a amostra pode serseccionada por um micrótomo ou similar (ver, por exemplo, "Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology",acima). A título de exemplo para este procedimento, os cortes podemvariar de aproximadamente três a aproximadamente cinco mícrons emespessura. Uma vez seccionados, os cortes podem ser anexados alâminas por diversos métodos padrões. Exemplos de placas adesivasincluem, mas não estão limitadas a, silano, gelatina, poli-L-lisina esimilares. A título de exemplo, os cortes embebidos em parafina podem seranexados a lâminas carregadas positivamente e/ou lâminas revestidas compoli-L-lisina.
Se a parafina foi usada como material de embebimento, os cortesde tecido são geralmente desparafinados e reidratados em água. Os cortes detecido podem ser desparafinados por diversas metodologias padrãoconvencionais. Por exemplo, xilenos e seqüências decrescentes de alcoóispodem ser usados (ver, por exemplo, "Manual of Histological Staining Methodofthe Armed Forces Institute of Pathology, acima). Alternativamente, agentesnão orgânicos desparafinantes disponíveis comercialmente tal como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas) podem ser usados.Opcionalmente, após a preparação da amostra, um corte podeser analisado usando-se IHC. IHC pode ser realizado em combinação comtécnicas adicionais tais como coloração morfológica e/ou hibridizaçãofluorescente in situ. Dois métodos gerais de IHC estão disponíveis; testesdiretos e indiretos. De acordo com o primeiro teste, a ligação do anticorpoao antígeno alvo (por exemplo, GalNac-T14) é determinada diretamente.Este teste direto usa um reagente marcado, tal como uma marcaçãofluorescente ou um anticorpo primário marcado com uma enzima, que podeser visualizado sem interações de anticorpos adicionais. Em um teste indireto típico, o anticorpo primário não conjugado se liga ao antígeno eentão um anticorpo secundário marcado se liga ao anticorpo primário.Onde o anticorpo secundário é conjugado a um marcador enzimático, umsubstrato cromatogênico ou fluorogênico é adicionado para fornecervisualização do antígeno. A amplificação de sinal ocorre porque diversos anticorpos secundários podem reagir com diferentes epítopos no anticorpo primário.
O anticorpo primário e/ou secundário usado paraimunohistoquímica tipicamente será marcado com um componente detectável.Diversos marcadores estão disponíveis, as quais podem ser agrupadas nas seguintes categorias:
(a) Radioisótopos, tais como 35S1 14C, 125I1 3H1 e 131I. Oanticorpo pode ser marcado com radioisótopo usando-se técnicas descritas emCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et ai, Ed. Wiley-Interscience, Nova York, Pubs. (1991) por exemplo, e a radioatividade pode ser medida usando-se contagem cintilante.
(b) Partículas de ouro coloidais.
(c) Marcadores fluorescentes incluem, mas não estãolimitadas a, quelatos de raros-terra (quelatos európio), Texas Red,rodamina, fluorescina, dansil, Lisamina, umbelífero, ficocriterina, ficocianinaou fluoróforos disponíveis comercialmente tais como SPECTRUM0RANGE7 e SPECTRUM GREEN7 e/ou derivados de qualquer um dosacima. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugadas ao anticorpousando-se técnicas divulgadas em Current Protocols in Immunology, acima,por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada usando-se umfluorímetro.
(d) Vários marcadores enzima-substrato estão disponíveis ea patente US 4.275.149 fornece uma revisão de alguns destes. A enzimageralmente catalisa uma alteração química do substrato cromatogênico quepode ser medida usando-se várias técnicas. Por exemplo, a enzima podecatalisar uma alteração de cor em um substrato que pode ser medidoespectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar afluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas paraquantificar uma alteração na fluorescência estão descritas acima. Osubstrato quimioluminescente torna-se eletronicamente excitado por umareação química e pode então emitir luz, a qual pode ser medida (usando-seum quimioluminômetro, por exemplo) ou doando energia a um receptorfluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem Iuciferases (porexemplo, Iuciferase de vagalume e Iuciferase de bactérias; patente US4.737.456), luciferina, 2,3-desidroftalazinedionas, malato desidrogenase,urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano silvestre (horseradish)(HRPO), fosfatase alcalina. β-galactosidase, glucoamilase, lisozima,sacarídeos oxidases (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, eglicose-6-fosfate desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricasee xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares. Técnicaspara conjugar enzimas a anticorpos estão descritas em O1SuIIivan et ai,Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use inEnzyme lmmunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. VanVunakis), Academic press, Nova York, 73:147-166 (1981).
Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, porexemplo:
(i) Peroxidase de rábano silvestre (HRPO) com peroxidasehidrogenada como um substrato, em que a peroxidase hidrogenada oxida umprecursor de cor (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou 3,3',5,5'-tetrametil benzidina hidrocloreto (TMB));
(ii) fosfatase alcalina (AP) com para-Nitrofenil fosfato comosubstrato cromatogênico; e
(iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substratocromatogênico (por exemplo, p-nitrofenil-p-D-galactosidase) ou substratofluorogênico (por exemplo, 4-metilumbeliferil-p-D-galactosidase).
Diversas outras combinações enzima-substrato estão disponíveispara aqueles técnicos no assunto. Para revisão destas, ver, por exemplo,patentes US 4.275.149 e US 4.318.980. Algumas vezes, o marcador éindiretamente conjugado com o anticorpo. Um técnico no assunto pode terconhecimento de diversas técnicas para alcançar isto. Por exemplo, oanticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das quatro amplascategorias de marcadores mencionados acima podem ser conjugados comavidina ou vice-versa. Biotina liga-se seletivamente à avidina e então, omarcador pode ser conjugado com o anticorpo desta maneira indireta.Alternativamente, para alcançar conjugação indireta do marcador com oanticorpo, o anticorpo é conjugado com um pequeno hapteno, e um dosdiferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado com umanticorpo anti-hapteno. Então, conjugação indireta do marcador com oanticorpo pode ser alcançada.
Com exceção da preparação da amostra dos procedimentosdiscutidos acima, além disso, tratamento do corte do tecido anterior a, duranteou seguindo IHC pode ser desejado, por exemplo, métodos de recuperação deepítopo, tal como aquecimento da amostra de tecido em tampão citrato podeser realizado (ver, por exemplo, Leong et al. Appi Immunohistochem. 4(3):201 (1996)).
Seguindo uma etapa de bloqueio opcional, o corte de tecido éexposto a anticorpo primário por um período de tempo suficiente e sobcondições adequadas tal como o anticorpo primário liga-se ao antígeno deproteína alvo na amostra de tecido. Condições apropriadas para alcançar istopodem ser determinadas por experimento de rotina. A extensão de ligação deanticorpo para a amostra é determinada pelo uso de qualquer um dosmarcadores detectáveis discutidos acima. Preferivelmente, o marcador é ummarcador enzimático (por exemplo, HRPO) que cataliza uma alteração químicado substrato cromatogênico tal como 3,3"-diaminobenzidina cromógeno.
Preferivelmente o marcador enzimática é conjugado ao anticorpo que se ligaespecificamente ao anticorpo primário (por exemplo, o anticorpo primário éanticorpo policlonal de coelho e anticorpo secundário é anticorpo anti-coelhode cabra).
Opcionalmente, os anticorpos empregados na análise de IHCpara detectar expressão de GaINac-TI4 são anticorpos anti-GalNac-T14.Alternativamente, anticorpos para outros antígenos GaINac-T que têminteração com GaINac-TI 4 podem ser empregados. Opcionalmente, oanticorpo anti-GalNac-T14 é um anticorpo monoclonal.
Espécimes deste modo preparadas podem ser montadas ecobertas com vidro. Avaliação da lâmina é então determinada, por exemplo,usando-se um microscópio, e critério de intensidade de coloração,rotineiramente usado na técnica, pode ser empregado. Critério de intensidadede coloração pode ser avaliado como segue:Tabela 1
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Tipicamente, uma pontuação padrão de coloração deaproximadamente 2+ ou superior em tal teste IHC1 acredita-se ser preditiva ouindicativa de sensibilidade de uma célula de mamífero (tal como uma célulacancerígena de mamífero) a Apo2L/TRAIL ou um anticorpo agonista dereceptor de morte.
Em métodos alternativos, a amostra pode ser contatada com umanticorpo específico para dito marcador sob condições suficientes para umcomplexo anticorpo-biomarcador formar e então detectar dito complexo. Apresença do biomarcador pode ser realizada de diversas maneiras, tal comopor Western blotting (com ou sem imunopreciptação) e procedimentos deELISA para testar uma ampla variedade de tecidos e amostras, incluindoplasma ou soro. Uma ampla variedade de técnicas de imunoensaio usando talformato de teste está disponível, ver, por exemplo, patentes US 4.016.043, US4.424.279 e US 4.018.653. Estes incluem tanto testes de sítio único e doissítios como "sanduíche" de tipos não competitivos, assim como nos testes deligação competitivos tradicionais. Estes testes também incluem ligação diretade um anticorpo marcado a um biomarcador alvo.
Testes sanduíche estão entre os testes mais funcionais efreqüentemente usados. Existem inúmeras variações da técnica de testesanduíche, e todas têm a intenção de ser engobladas pela presente invenção.Resumidamente, em um teste avançado típico, um anticorpo não marcado éimobilizado em um substrato sólido, e a amostra a ser testada trazida emcontato com a molécula ligada. Após um período adequado de incubação, porum período de tempo suficiente para permitir formação de um complexoanticorpo-antígeno, um segundo anticorpo específico ao antígeno, marcadocom uma molécula repórter capaz de produzir um sinal detectável é entãoadicionada e incubada, permitindo tempo suficiente para a formação de outrocomplexo de anticorpo anticorpo-antígeno-marcador. Qualquer material nãorelacionado é tirado lavado, e a presença do antígeno é determinada porobservação de um sinal produzido pela molécula repórter. Os resultadospodem ser tanto qualitativos, pela simples observação do sinal visível, comopodem ser quantificados pela comparação com a amostra controle que contémquantidades conhecidas de biomarcador.
Variações nos testes avançados incluem um teste simultâneo, noqual ambos, amostra e anticorpo marcado são adicionados simultaneamenteao anticorpo ligado. Estas técnicas são bem conhecidas pelos técnicos noassunto, incluindo qualquer variação menor à medida que seria visível deimediato. Em um teste sanduíche avançado típico, um primeiro anticorpotendo especificidade para o biomarcador é tanto ligado covalentemente comode forma passiva a uma superfície sólida. A superfície sólida é tipicamentevidro ou um polímero, a mais comumente usada polímeros sendo celulose,poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinil ou polipropileno. Osuporte sólido pode ser na forma de tubos, gotas, discos de microplacas, ouqualquer outra superfície adequada para conduzir um imunoensaio. Osprocessos de ligação são bem conhecidos na técnica e geralmente consiste deinterligação de ligação covalente ou adsorção física, o complexo polímero-anticorpo é lavado em preparação para a amostra teste. Uma alíquota daamostra a ser testada é então adicionada ao complexo de fase sólida eincubada por um período de tempo suficiente (por exemplo, 2-40 minutos oudurante a noite se mais conveniente) e sob condições adequadas (porexemplo, desde temperatura ambiente a 40°C assim como entre 25° C e 32° Cinclusive) para permitir ligação de qualquer subunidade presente no anticorpo.Seguindo o período de incubação, a subunidade de anticorpo de fase sólida élavada e seca e incubada com um segundo anticorpo específico para umaporção do biomarcador. O segundo anticorpo é ligado a uma molécula repórterque é usado para indicar a ligação do segundo anticorpo ao marcadormolecular.
Um método alternativo envolve imobilização de biomarcadoresalvo na amostra e então exposição ao alvo imobilizado para anticorpoespecífico o qual pode ou não pode ser marcado com uma molécula repórter.Dependendo da quantidade de alvo e a força do sinal da molécula repórter, umalvo ligado pode ser detectável por marcação direta com o anticorpo.
Alternativamente, um segundo anticorpo marcado, específico para o primeiroanticorpo é exposto ao complexo anticorpo alvo-primário para formar umcomplexo anticorpo terciário anticorpo-secundário alvo-primário. O complexo édetectado pelo sinal emitido pela molécula repórter. Por "molécula repórter"como usado no presente relatório descritivo, entende-se uma molécula a qual,pela natureza química, fornece um sinal identificável analicamente o qualpermite a detecção de anticorpo antígeno ligado. As moléculas repórteresmais comumente usadas neste tipo de teste são tanto enzimas, fluoróforoscomo moléculas contendo radionuclídeo (isto é, radioisótopos) e moléculasquimioluminescentes.
No caso de um imunoensaio de enzima, uma enzima é conjugadaao segundo anticorpo, geralmente por meio de glutaraldeído ou periodato.Como será reconhecido prontamente, no entanto, uma ampla variedade detécnicas de conjugação diferente, as quais estão prontamente disponíveis parao técnico no assunto. Freqüentemente enzimas usadas incluem peroxidase derábano silvestre, glicose oxidase, galactosidase e fosfatase alcalina, entreoutras. Os substratos a serem usados com as enzimas específicas sãogeralmente escolhidos para a produção, sob hidrólise pela correspondenteenzima, de uma alteração de cor detectável Exemplos de enzimas adequadasincluem fosfatase alcalina e peroxidase. É possível também empregarsubstratos fluorogênicos, que rende um produto fluorescente ao invés desubstratos cromogênicos apontados acima. Em todos os casos, o anticorpoenzima marcada é adicionado ao primeiro complexo anticorpo marcadormolecular, permitida a ligação, e então o excesso de reagente é lavado. Umasolução contendo o substrato apropriado é então adicionada ao complexo deanticorpo-antígeno anticorpo. O substrato irá reagir com a enzima ligada aosegundo anticorpo, dando um sinal visual qualitativo, que pode ser tambémquantificado, usualmente, espectropotometricamente, dar uma indicação daquantidade de biomarcador que estava presente na amostra.
Alternativamente, compostos fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina,podem ser quimicamente acoplados aos anticorpos sem alterar suascapacidades de ligação. Quando ativado por iluminação com luz de umcomprimento de onda específico, o anticorpo marcado com fluorocromoadsorve a energia da luz, incluindo um estado para excitabilidade na molécula,seguido por emissão da luz em uma característica de cor detectávelvisualmente com um microscópio de luz. Como no EIA, o anticorpo marcadofluorescente é permitido ligar-se ao primeiro complexo anticorpo-marcadormolecular. Após lavagem do reagente não ligado, o complexo terciárioremanescente é então exposto à luz do comprimento de onda apropriado, afluorescência observada indica a presença do marcador molecular deinteresse. Imunofluorescência e técnicas EIA são ambas muito bemconhecidas na técnica. No entanto, outra molécula repórter, tal comoradioisótopo, molécula quimioiluminescente ou bioluminescente, podem serempregadas.
É contemplada que as técnicas acima descritas também podemser empregadas para detectar expressão de GaINac-TI4.
Métodos da invenção, além disto, incluem protocolos queexaminam a presença e/ou expressão de mRNA de GaINac-TI4 em umaamostra de célula ou tecido. Métodos para a avaliação de mRNAs em célulassão bem conhecidos e incluem, por exemplo, testes de hibridização usando-sesondas de DNA complementares (tal como hibridização in situ usando-seribosondas GaINac-TI4 marcadas, Northern blot e técnicas relacionadas) ediversos testes de amplificação de ácido nucléico (tal como RT-PCR usando-seprimers complementares para GaINac-TI 4, e outros métodos de detecção tipoamplificação, tais como, por exemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA esimilares).
Amostras de células ou tecidos de mamíferos podem serconvenientemente testadas por, por exemplo, mRNAs de GalNac-TI 4 usando-se análise Northern, dot blot ou PCR. Por exemplo, testes RT-PCR tal comotestes PCR quantitativos são bem conhecidos na técnica. Em uma realizaçãoilustrativa da invenção, um método para detectar um mRNA de GaINac-TI4 emuma amostra biológica compreende produzir cDNA a partir da amostra portranscrição reversa usando-se pelo menos um primer, amplificando o cDNAentão produzido usando-se um polinucleotídeo GaINac-TI4 como primer sensee antisense para amplificar cDNAs de GaINac-TI 4 neste; e detectar apresença do cDNA de GaINac-TI 4 amplificado. Além disso, tais métodospodem incluir uma ou mais etapas que permitem alguém determinar os níveisde mRNA de GalNac-T14 em uma amostra biológica (por exemplo,simultaneamente examinando os níveis de uma seqüência mRNA controlecomparativa de um gene "housekeeping" tal como um membro da famíliaactina). Opcionalmente, a seqüência do cDNA de GalNac-T14 amplificadopode ser determinada.
Realizações materiais deste aspecto da invenção incluem primersGalNac-14 e pares de primer, que permitem a amplificação específica dospolinucleotídeos da invenção ou de qualquer parte específica disso, e sondasque hibridizam seletivamente ou especificamente moléculas de ácido nucléicoda invenção ou qualquer parte disso. Sondas podem ser marcadas com ummarcador detectável, tais como, por exemplo, um radioisótopo, compostofluorescente, composto bioluminescente, um composto quimioluminescente,quelante de metal ou enzima. Tais sondas e primers podem ser usados paradetectar a presença de polinucleotídeos GaINac-TI4 em uma amostra e comoum meio para detectar uma célula que expressa proteínas GaINac-TI4. Comoseria entendido pelo técnico no assunto, um grande número de diferentesprimers e sondas podem ser preparados baseados nas seqüências fornecidasno presente e usados efetivamente para amplificar, clonar e/ou determinar apresença e/ou níveis de mRNAs de GaINac-TI4.
Opcionalmente métodos da invenção incluem protocolos queexaminam ou detectam mRNAs, tal como mRNAs de GaINac-TI4, em umaamostra de célula ou tecido por tecnologias de microarranjo. Usando-semicroarranjos de ácido nucléico, amostras de teste e controle de mRNA deamostras de tecido de teste e controle são transcritas inversamente emarcadas para gerar sondas de cDNA. As sondas são então hibridizadas paraum arranjo de ácidos nucléicos imobilizados em um suporte sólido. O arranjo éconfigurado de forma que a seqüência e posição de cada membro do arranjoseja conhecida. Por exemplo, uma seleção de genes que tem potencial paraser expresso certos estados da doença pode ser arranjada em um suportesólido. Hibridização de uma sonda marcada com um membro do arranjoespecífico indica que a amostra a partir da qual a sonda foi derivada expressaesse gene. A análise de expressão gênica diferente do tecido doente podefornecer informações valiosas. A tecnologia de microarranjo utiliza técnicas dehibridização e tecnologia de computador para avaliar o perfil de expressão demRNA de milhares de genes dentro de um único experimento, (ver, porexemplo, documento WO 01/75166 publicado em 11 de outubro de 2001; (ver,por exemplo, patente US 5.700.637, patente US 5.445.934 e patente US5.807.522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G.et ai, Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999) para uma discussão defabricação de arranjos ). Microarranjos de DNA são arranjos miniatura quecontêm fragmentos de gene que são tanto sintetizados diretamente sobre ouponteados em vidro ou outros substratos. Milhares de genes são usualmenterepresentados em um único arranjo. Um experimento de microarranjo típicoenvolve as seguintes etapas: 1. preparação de alvo marcado de formafluorescente a partir de RNA isolado da amostra, 2. hibridização do alvomarcado do microarranjo, 3. lavagem, coloração e escaneamento do arranjo, 4.análise da imagem escaneada e 5. geração de perfis de expressão gênica.Atualmente dois tipos principais de microarranjos de DNA estão sendoutilizados, arranjos de oligonucleotídeos (usualmente 25 a 70 mers) e arranjosde expressão gênica contendo produtos PCR preparados a partir de cDNAs.Na formação de um arranjo, os oligonucleotídeos podem tanto ser pré-fabricados e ponteados na superfície ou sintetizados diretamente na superfíciesólida (in situ).
O sistema Affymetrix GeneChip® é um sistema de microarranjodisponível comercialmente que compreende arranjos fabricados pela síntesedireta de oligonucleotídeos em uma superfície de vidro. Arranjos Sonda/Gene:Oligonucleotídeos, usualmente 25 mers, são diretamente sintetizados em umalâmina de vidro por uma combinação de fotolitografia baseada emsemicondutor e tecnologias de síntese química de fase sólida. Cada arranjocontém até 400.000 diferentes oligos e cada oligo está presente em milhões decópias. Visto que sondas de oligonucleotídeo são sintetizadas em locaisconhecidos no arranjo, os padrões de hibridização e intensidade de sinalpodem ser interpretados em termos de identidade gênica e níveis deexpressão relativa pelo programa Integrado de Microarranjo Affymetrix. Cadagene é representado no arranjo por uma série de diferentes sondas deoligonucleotídeo. Cada par de sonda consiste de uma combinação perfeita deoligonucleotídeo e uma combinação mal sucedida de oligonucleotídeo. Umasonda de combinação perfeita tem uma seqüência exatamente complementarpara o gene específico e então mede a expressão do gene. A sonda decombinação mal sucedida difere daquela de combinação perfeita por umaúnica substituição de base na posição de base central, atrapalhando a ligaçãodo gene alvo transcrito. Isto ajuda a determinar a hibridização antecedente enão específica que contribui para o sinal medido para o oligo de combinaçãoperfeita. O programa Integrado de Microarranjo diminui a intensidade dehibridização das sondas de combinação mal sucedida daquelas das sondas decombinação perfeita para determinar o valor de intensidade absoluta ouespecífica para cada conjunto de sonda. As sondas são escolhidas baseadasem informação atual a partir do Genbank e outros repertórios de nucleotídeo.
Acredita-se que as seqüências reconheçam regiões exclusivas da terminação3' do gene. Um forno de hibridização GeneChip (forno "grelha") é usado pararealizar a hibridização de até 64 arranjos ao mesmo tempo. A estação defluidos executa lavagem e coloração dos arranjos de sonda. Isto écompletamente automatizado e contém quatro módulos, com cada módulocontendo um arranjo de sonda. Cada módulo é controlado independentementepor meio do programa Integrado de Microarranjo usando protocolos de fluidosprogramados. O scanner é um scanner de fluorescência a laser com o mesmofoco que mede a intensidade de fluorescência emitida pelo cRNA marcadoligado aos arranjos de sonda. A estação de trabalho de computador com oprograma Integrado de Microarranjo controla a estação de fluidos e o scanner.
O programa Integrado de Microarranjo pode controlar até oito estações defluidos usando hibridização pré-programada, lavagem e protocolos decoloração para o arranjo de sonda. O programa também adquire e convertedados de intensidade de hibridização em uma presença/ausência deconvocação para cada gene usando algoritmos apropriados. Finalmente, oprograma detecta alterações na expressão gênica entre experimentos pelaanálise de comparação e formata a produtividade em arquivos .txt, que podemser usados com outros programas de computador para análise de dadosadicionais.
Teste de hibridização in situ fluorescente (FISH) pode também serusado para detectar expressão do biomarcador mRNA usando-se sondasmarcadas. Tais testes são conhecidos na técnica (ver, por exemplo,Kallioniemi1 1992; patente US 6.358.682).
A expressão de um biomarcador selecionado pode também seravaliada por exame de deleção de gene ou amplificação de gene. Deleção ouamplificação de gene pode ser medida por qualquer um de uma amplavariedade de protocolos conhecidos na técnica, por exemplo, por Southernblotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de mRNA(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)), dot blotting(análise de DNA), ou hibridização in situ (por exemplo, FISH), usando-se umasonda marcada apropriadamente, métodos de citogenética ou hibridizaçãogenômica comparativa (CGH) usando-se uma sonda marcadaapropriadamente. A título de exemplo, estes métodos podem ser empregadospara detectar deleção de amplificação de genes GaINac-TI4.
Adicionalmente, pode-se examinar a posição de metilação dobiomarcador, tal como gene GaINac-TI4, em uma amostra de célula ou tecido.Desmetilação anormal e/ou hipermetilação de ilhas GpG nas regiõesregulatórias 5' do gene freqüentemente ocorrem em células imortalizadas etransformadas, e podem resultar em alteração de expressão de vários genes.
Uma variedade de testes para exame de posição de metilação de um gene ébem conhecida na técnica. Por exemplo, pode-se utilizar, na abordagem dehibridização Southern, enzimas de restrição sensíveis a metilação que nãopodem clivar seqüências que contêm sítios CpG metilados para avaliar aposição de metilação de ilhas CpG. Além disso, MSP (PCR específico parametilação) pode rapidamente traçar o perfil da posição de metilação de todosos sítios CpG presentes em uma ilha CpG de um dado gene. Esteprocedimento envolve modificação inicial de DNA por bissulfito de sódio (queirá converter todas citocinas não metiladas em uracil) seguido por amplificaçãousando-se primers específicos para DNA metilado versus não metilado.
Protocolos envolvendo interferência de metilação podem também serencontrados, por exemplo, em Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12,Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995; De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6):1985-1992 (1999); Brooks et al., Câncer Epidemio!. Biomarkers Prev., 1998,7:531-536); e Lethe et ai., Int. J. Câncer 76(6): 903-908 (1998).
Expressão de GalNac-T14 em uma amostra de célula ou tecidopode também ser examinada a título de testes baseados na atividade oufuncionais. Por exemplo, pode-se conduzir testes conhecidos na técnica paradeterminar ou detectar a presença de dada atividade N-aetilgalactosaminiltransferase enzimática na amostra de célula ou tecido, (ver,por exemplo, Bennett et al., J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996); Wang etal., BBRC, 300:738-744 (2003); Hang et al., acima, disponível em maio de2005 em www.sciencedirect.com.
Nos métodos da presente invenção, é contemplada que aamostra de célula ou tecido pode também ser examinada para a expressão deApo2L/TRAIL ou receptores na amostra que se liga ao Apo2L/ TRAIL ouanticorpo de receptor de morte. Conforme descrito acima e na técnica,acredita-se atualmente que Apo2L/TRAIL liga-se a pelo menos cinco diferentesreceptores: DR4, DR5, DcR1, DcR2 e OPG. Usando-se métodos conhecidosna técnica, incluindo aqueles descritos no presente, a expressão deApo2L/TRAIL1 DR4, DR5, DcR1, DcR2 e/ou OPG pode ser detectada nosníveis de mRNA e nos níveis de proteína. A título de exemplo, as técnicas IHCdescritas acima podem ser empregadas para detectar a presença de um dosmembros de tais moléculas na amostra. É contemplado que em métodos emque um tecido ou amostra está sendo examinado não somente para apresença de marcador GaINac-TI4, mas também para a presença, porexemplo, de DR4, DR5 ou DcR1, lâminas separadas podem ser preparadas apartir do mesmo tecido ou amostra, e cada lâmina testada com um reagenteespecífico para cada biomarcador ou receptor específico. Alternativamente,uma única lâmina pode ser preparada a partir da amostra de célula ou tecido, eanticorpos direcionados para cada biomarcador ou receptor podem ser usadosna conexão com um protocolo de coloração multicor para permitir visualizaçãoe detecção dos respectivos biomarcadores ou receptores.
GaINac-TI4 indicando que a amostra de célula ou tecido será sensível aApo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte, é contemplado que umaquantidade eficaz do Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte pode seradministrado a um mamífero para tratar uma disfunção, tal como câncer oudisfunção imune relacionada que aflige o mamífero. O diagnóstico de váriascondições patológicas em mamíferos descritas no presente pode ser feito pormédicos técnicos no assunto. Técnicas de diagnóstico que estão disponíveisna técnica permitem, por exemplo, o diagnóstico ou detecção de câncer oudoença imune relacionada em um mamífero. Por exemplo, cânceres podemser identificados por meio de técnicas, incluindo mas não limitado a, palpação,análise de sangue, raio X, NMR e similares. Doenças imune relacionadaspodem também ser facilmente identificadas.
O Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte pode seradministrado de acordo com métodos conhecidos, tal como administraçãointravenosa como um bolus ou por infusão contínua por um período de tempo,por rotas intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinhal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação. Opcionalmente, aadministração pode ser realizada através de mini-bomba de infusão usando-sevários dispositivos disponíveis comercialmente.
Dosagens eficazes e programação para administração deApo2L/TRAIL ou anticorpo receptor de morte pode ser determinadaempiricamente, e tais determinações estão dentro do estado da técnica.Dosagens únicas ou múltiplas podem ser empregadas. Acredita-se atualmenteque uma dosagem eficaz ou quantidade de Apo2L/TRAIL usado sozinho possavariar de aproximadamente 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg do peso corporal oumais por dia. Escalas de dosagens entre espécies podem ser preparadas deum modo conhecido na técnica, por exemplo, como divulgado em Mordenti eta/., Pharmaceut._Res., 8:1351 (1991).
Quando administração in vivo de Apo2L/TRAIL é empregada,quantidades normais de dosagem podem variar de aproximadamente 10 ng/kgaté 100 mg/kg de peso corporal do mamífero ou mais por dia, preferivelmentecerca de 1 pg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da rota de administração.Orientações para dosagens específicas e métodos de entrega são fornecidosna literatura; ver, por exemplo, patente US 4.657.760; US 5.206.344; ou US5.225.212. É antecipado que diferentes formulações serão eficazes paradiferentes compostos do tratamento e diferentes disfunções, que aadministração que atinge um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitardistribuição de um modo diferente daquela para outro órgão ou tecido.
É contemplado que terapias adicionais ainda podem serempregadas nos métodos. Uma ou mais outras terapias podem incluir, masnão estão limitadas a, administração de terapia de radiação, citocina(s),agente(s) inibitório de crescimento, agente(s) quimioterátipo(s), agente(s)citotóxico(s), inibidores tirosina quinase, inibidores ras farnesil transferase,inibidores de angiogênese, e inibidores quinase dependente de ciclina que sãoconhecidos na técnica e, além disso, definidos com particularidade acima. Écontemplado que tais outras terapias podem ser empregadas como um agenteseparado do Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte. Além disso,terapias baseadas em anticorpo terapêuticos que atingem antígenos de tumortal como Rituxan™ ou Herceptin™ como também anticorpos anti-angiogênicostal como anti-VEGF.
Preparação e programação de dosagens para agentesquimioterátipos podem ser usadas de acordo com instruções do fabricante oucomo determinado empiricamente por um técnico no assunto. A preparação eprogramação de dosagens para tal quimioterapia estão também descritas emChemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1992). O agente quimioterátipo pode preceder, ou seguir administração doApo2L/TRAIL, anticorpo receptor de morte, e/ou pode ser dadosimultaneamente com estes.
Pode ser também desejável administrar anticorpos contra outrosantígenos, tal como anticorpos que se ligam a CD20, CD11a, CD18, ErbB2,EGFR, ErbB3, ErbB4, ou fator endotelial vascular (VEGF) ou outros membrosda família TNFR (tais como OPG, TNFR1, TNFR2, GITR, Apo-3, TACL, BCMA,BR3) Alternativamente, ou além disso, dois ou mais anticorpos que se ligamao mesmo, ou dois ou mais antígenos diferentes divulgados no presentepodem ser co-administrados ao paciente. Algumas vezes, pode também serbenéfico administrar uma ou mais citocinas ao paciente. Seguindo aadministração, as células tratadas in vitro podem ser analisadas. Onde existiutratamento in vivo, um mamífero tratado pode ser monitorado de váriasmaneiras bem conhecidas por técnicos no assunto. Por exemplo, células detumor podem ser examinadas patologicamente para testar necrose ou o soropode ser analisado para respostas do sistema imune.
Para uso nos pedidos descritos ou sugeridos acima, kits ouartigos de fabricação são também fornecidos pela invenção. Tais kits podemcompreender um meio veículo sendo compartimentalizado para receber emconfinamento fechado um ou mais meios recipientes tais como frascos, tubos esimilares, cada meio recipiente compreendendo um dos elementos separadospara ser usado no método. Por exemplo, um dos meios recipientes podeconter uma sonda que é ou pode ser detectável marcada. Tal sonda pode serum anticorpo ou polinucleotídeo específico para proteína GaINac-TI4 ou umgene GaINac-TI4 ou mensagem, respectivamente. Onde o kit utilizahibridização de ácido nucléico para detectar ácido nucléico alvo, o kit podetambém ter recipientes contendo nucleotídeo(s) para amplificação daseqüência de ácido nucléico alvo e/ou um recipiente contendo um meiorepórter, tal como uma proteína de ligação de biotina, tal como avidina ouestreptavidina, ligada a uma molécula repórter, tal como um marcadorenzimático, fluorescente ou radioisótopo.
O kit da invenção tipicamente irá compreender o recipientedescrito acima e um ou mais recipientes contendo materiais comerciaisdesejáveis do ponto de vista do usuário, incluindo outros tampões, diluentes,filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso. Um marcador podeestar presente no recipiente para indicar que a composição é usada para umaterapia específica ou aplicação não terapêutica, e pode também indicardireções tanto para uso in vivo como in vitro, da forma como descrito acima.
Os kits da invenção têm uma variedade de realizações. Umarealização típica é um kit que compreende um recipiente, um rótulo em ditorecipiente, e uma composição contida dentro de dito recipiente; em que acomposição inclui um anticorpo primário que se liga a uma seqüência depolipeptídeo de GalNac-T14, o rótulo em dito recipiente indica que acomposição pode ser usada para avaliar a presença de proteínas GaINac-TI4em pelo menos um tipo de célula de mamífero, e instruções para usar GaINac-T14 para avaliar a presença de proteínas em pelo menos um tipo de célula demamífero. O kit pode também compreender um conjunto de instruções emateriais para preparar uma amostra de tecido e aplicar o anticorpo e sondano mesmo corte de uma amostra de tecido. O kit pode incluir tanto umanticorpo primário como secundário, em que o anticorpo secundário éconjugado a um marcador, por exemplo, um marcador enzimático.
Outra realização é um kit que compreende um recipiente, umrótulo em dito recipiente, e uma composição contida dentro de dito recipiente;em que a composição inclui um polinucleotídeo que hibridiza com umcomplemento do polinucleotídeo de GalNac-T14 sob condições deestringência, o rótulo em dito recipiente indica que a composição pode serusada para avaliar a presença de GaINac-TI 4 em pelo menos um tipo decélula de mamífero, e instruções para usar o polinucleotídeo GaINac-TI4 paraavaliar a presença de proteínas de RNA ou DNA de GaINac-TI 4 em pelomenos um tipo de célula de mamífero.
Outros componentes opcionais no kit incluem um ou maistampões (por exemplo, tampão de bloqueio, tampão de lavagem, tampãosubstrato, etc), outros reagentes tal como substrato (por exemplo,cromogênico) que é quimicamente alterado por um marcador enzimático,solução de restauração de epítopo, amostras controle (controles positivos e/ounegativos), lâmina(s) controle, etc.
Exemplos
Vários aspectos da invenção são também descritos e ilustrados atítulo de exemplos que seguem, sendo que nenhum destes têm a intenção de limitar o escopo da invenção.
Métodos ε MateriaisCultura Celular ε Linhagens Celulares
As seguintes linhagens celulares humanas: Linhagens de câncerde pulmão de célula não-pequena (NSCLC): H2122, A427, H647, SK-MES-1, H838, H358, H2126, H460, H1703, H2405, H650, H1568, H1666, H322T,SW1573, H292, H1650, H522, EKVX, H661, H23, LXFL 529, H226, A549,H1781, H1299, HOP 62, H2009, HOP 92, H1793, H1975, H1651, calu-1,H1435, HOP 18, H520, H441, H2030, H1155, H1838, H596, HLFa; linhagensde câncer pancreático: Panc 05.04, BxPC3, HPAC, SU.86.86, HuP-T3, PSN1,Panc 08.13, MiaPaCa-2, PA-TU-8988T, Panc 03.27, Capan-1, SW 1990,CFPAC-1, PA-TU-8902, Pane 02.03, Panc 04.03, PL45, Aspc-1, Hs766T, Panc10.05, Panei, Capan-2, HPAF-II and NHL: JEKO-1, SU-DHL-4, OCI-LY-19,SR, Farage, DOHH-2, Toledo, WSU-NHL, KARPAS-422, GRANTA-519,Pfeiffer, HT1 SC-1, DB. As linhagens celulares foram obtidas do DepósitoATCC (Manassas, Virgínia), DSMZ (Coleção Alemã de Microorganismos eCulturas Celulares), JCRB (Banco Japonês de Fontes de Células) ou ECACC(Coleção Européia de Culturas Celulares) e cultivadas em meio RPMI-1640suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado, 2 mM de L-glutamina e10mM de HEPES.
Testes de Citotoxicidade
O teste MTT (CeIITiter 96® Teste de Proliferação Celular NãoRadioativo da Promega), que é um teste colorimétrico baseado na habilidadede células viáveis em reduzir um sal tetrazólio amarelo solúvel (MTT) emcristais azuis formazano), foi usado para determinar a quantidade de célulasviáveis após tratamento com Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5. O teste MTT foirealizado pela adição de uma solução corante otimizada pré-misturada paracultivar poços de uma placa de 96 poços contendo várias concentrações (0 a1000 ng/ml) de Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5. Durante 4 horas deincubação, células vivas convertem o componente tetrazólio da soluçãocorante em um produto formazano. A solução de solubilização/parada foi entãoadicionada aos poços de cultura para solubilizar o produto formazano, e aabsorbância a 570 nm foi registrada usando-se um leitor de placa de 96 poços(SpectraMax). A leitura de absorbância a 570 nm lida é diretamenteproporcional ao número de células normalmente usado nos testes deproliferação. Embora a absorbância máxima para o produto formazona seja570 nm e as soluções puras pareçam azuis, a cor no final do teste pode nãoser azul e depende da quantidade de formazona presente relativa a outroscomponentes (incluindo soro, fenol vermelho acidificado e MTT não reduzido)no meio de cultura.
Os números de células foram otimizados pela realização de umatitulação celular para produzir um teste sinal perto do final mais alto davariação linear do teste. Visto que tipos celulares diferentes possuem níveisdiferentes de atividade metabólica, isto foi feito para cada linhagem celularseparadamente. Para a maioria das células tumorais, 5000 células por poço a20.000 células por poço foram usadas.
O que segue é uma descrição passo a passo dos testesempregados:
1. As células usadas para o bioensaio eram de estoque deculturas.
2. Determinação do número de células e viabilidade azul detripan, e suspensão das células para um número final de 5.000 a 20.000células por poço.
3. Distribuídos 50 μl da suspensão celular em placas de 96poços.
4. Incubação das placas a 37°C em atmosfera umidificadacom 5% de C02 durante a noite.
5. Adição de 50 μl de meio de cultura contendo váriasconcentrações variando de 0 a 1000 ng/ml de Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5 paraamostras das placas de 96 poços. Os controles foram 50 μl de meio de cultura (semtApo2L/TRAIL ou anticorpo DR5) e 100 μl de meio de cultura (sem células).
Todo experimento foi realizado em um conjunto triplicado depoços e em três dias independentes. O total de volume dos poços foi 100μl/poço.
6. Incubação das placas a 37°C por 72 horas em umaatmosfera umidificada com 5% de C02.
7. Adição de 15 μΙ de solução corante para cada poço.
8. Incubação das placas a 37°C por até 4 horas em umaatmosfera umidificada com 5% de CO2.
9. Adição de 100 μl da solução de solubilização/parada paracada poço.
10. Incubação das placas durante a noite a 37°C na noiteanterior.
11. Registro da absorbância a um comprimento de onda de570 nm usando-se um leitor de placa de 96 poços. Uma referência decomprimento de onda de 750 nm foi usada para reduzir fundo causado porfragmentos celulares, impressão digital outra absorbância não específica.
12. A média dos valores da absorbância para o controlenegativo foi usada como um valor vazio e subtraídos de todas as outrasleituras. A média dos valores de absorbância para cada concentração deApo2L/TRAIL ou anticorpo DR5 foi dividida pela média dos valores deabsorbância do controle positivo (células 100% viáveis - não tratadas) paracalcular a quantidade de células viáveis (em %).
13. A porcentagem de células viáveis (eixo Y) versus aconcentração de Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5 (eixo X, escala log) foiplotada e o valor IC50 foi determinado pela localização do valor do eixo X(ng/ml) correspondendo a 50 % de células viáveis.
Protocolo de Marcação AffymetrixUma leitura OD260/280 foi feita para todas as amostras e asamostras foram corridas no BioAnaIyser. 5 pg de RNA total de alta qualidadefoi usado.
A. Síntese Da Primeira Fita de cDNA:1. Hibridização primer
DEPC-H20 χ μΙ Misturar por turbilhonamento. Girar rápido.
RNA (5 ug) y μΙ Incubar a 70°C por 10 minutos.
Aumento (1:4 dil de estoque para 5 ug) 1 μΙ Girar rápido ecolocar no gelo
T7-(dT)24 primer 1 μΙvolume 12 μl
2. Ajuste de temperatura5X- tampão de reação da1afita de cDNA 4 μΙAdicionar 7 μΙ (da mistura à esquerda) para cada amostra.O1IMDTT 2 μΙ Misturar por vortexing. Girar rápido.10mMdemisturadNTP 1 μl Incubar a 42°C por 2 minutos.volume 7 μl
3. Síntese Da Primeira Fita
Adicionar 1 μl de SSII RT para cada amostra.SSII RT 1 μl Misturar por pipetagem para cima e parabaixo -OR- turbilhonar levemente.Girar rápido.
Volume total 20 μΙ Incubar a 42°C por 1 hora.
B. Síntese Da Segunda Fita de cDNA
1. Colocar as reações da Primeira Fita no gelo. Centrifugar brevementepara trazer para baixo a condensação nas laterais do tubo.
2. Fazer a seguinte mistura da Segunda fita máster.H2O tratada com DEPC 91 μΙ5X- Tampão de reação da 2a fita 30 μΙ
10mm demisturadNTP 3 μΙ
10 U/μΙ de DNA Ligase 1 μΙ10 U/μΙ de DNA Polimerase 4 μΙ2U/μI de RNA H 1 μΙVolume total 130 μΙ
3. Adicionar 130 μΙ da mistura master da Segunda fita a 20 μΙ da primeirafita de cDNA. (Volume final = 150 μΙ)
4. Misturar por pipetagem para cima e para baixo -OR- por turbilhonamentoleve. Girar rápido.
5. Incubar a 16°C por 2 horas em um banho-maria resfriado.
6. Adicionar 2 μΙ [10 U] T4 de DNA Polimerase. Misturar por pipetagempara cima e para baixo -OR- turbilhonar levemente. Girar rápido.
7. Incubar por 5 minutos a 16°C.
8. Adicionar 10 μΙ de 0,5 M EDTA. Turbilhonar levemente. Girar rápido.
9. Prosseguir para os procedimentos de limpeza para cDNA -OR- estocar a25 - 20°C para uso posterior.
Limpar a Fita Dupla de cDNA (Módulo de Limpeza de Amostra GeneChip)1. Adicionar 600 μΙ de Tampão de Ligação de cDNA para os 162 μΙ finaisde preparação de síntese de cDNA de fita dupla.Misturar por turbilhonamento por 3 segundos.
2. Checar se a cor da mistura é amarela (similar ao Tampão de Ligação decDNA w/o a síntese de cDNA)
Se a cor da mistura for laranja ou violeta, adicionar 10 μΙ de 3 M deacetato de sódio, pH 5,0 e misturar.
A cor da mistura irá tornar-se amarela.
3. Aplicar 500 μΙ da amostra à Coluna Giratória de Limpeza de cDNAincubando em uma Coleção de Tubo de 2ml e centrifugar.
por 1 minuto a>8,000 χ g (>10,000 rpm). Descartar o fluxo como lixoperigoso.
4. Recarregar a coluna giratória com a mistura remanescente (262 μΙ) ecentrifugar como acima.
Descartar o fluxo como lixo perigoso e descartar a Coleção de Tubo.
5. Transferir a coluna giratória em uma nova Coleção de Tubo de 2 ml(abastecida). Pipetar 750 μΙ de Tampão de Lavagem de cDNAna coluna giratória Centrifugar por 1 minuto a >8.000 χ g (>10.000 rpm).Descartar o fluxo.
6. Abrir a tampa da coluna giratória e centrifugar por 5 minutos emvelocidade máxima (< 25,000 χ g). Colocar
as colunas na centrífuga usando toda segunda cesta. Posicionar astampas sobre a junção da cesta de forma que
elas fiquem orientadas na direção contrária à rotação, isto é, se arotação for ao sentido horário, orientar as tampas.
em uma direção no sentido horário do contador. Isto evita danos àstampas.
Descartar o fluxo e Coleção de Tubo.
7. Transferir a coluna giratória em uma Coleção de Tubo de 1,5 ml.Pipetar 10 μΙ de Tampão de Eluição de cDNA diretamente na membranade coluna giratória. Assegurar que o tampão de Eiuição de cDNA sejadistribuído diretamente na membrana.
Incubar por 1 minuto a RT e centrifugar 1 minuto em velocidade máxima(< 25,000xg) para eluir.
Preparar e ativar a reação IVT
Enzo: Kit de Marcação de Transcrição de RNA Bioensaio de Alto Rendimento(Part No. 900182)
1. Usar 10 μΙ da fita dupla de cDNA limpa
2. Fazer a seguinte mistura IVT máster:
H2O Destilada ou Deionizada 12 μΙ
10X tampão de reação HY 4 μΙ
10x Ribonucleotídeos marcados com Biotina 4 μΙ10XDTT 4 μΙ
10X Mistura Inibidora de RNase 4 μΙ
20X T7 RNA Polimerase 2 μΙ
Volume total: 30 μΙ
3. Adicionar 30 μΙ da mistura master IVT a 10 μΙ da fita dupla de cDNA.(Volume Total = 40 μΙ)
4. Misturar por pipetagem para cima e para baixo -OR- por turbilhonamentoleve. Girar rápido.
5. Imediatamente colocar o tubo em um banho-maria a 37°C. Incubar por5 horas.
6. Armazenar a -20°C se não purificar o RNA imediatamente.
Limpar o cDNA Marcado com Biotina (Módulo de Limpeza de AmostraGeneChip)
1. Adicionar 60 μΙ de H2O à reação IVT e misturar por turbilhonamento por3 segundos.
2. Adicionar 350 μΙ de Tampão IVT de Ligação de cRNA à amostra,misturar por turbilhonamento por 3 segundos.
3. Adicionar 250 μΙ de etanol (96-100%) ao lisado, e misturar bem porpipetagem. Não centrifugar.
4. Aplicar a amostra (700 μΙ) à Coluna Giratória de Limpeza de cDNA IVTincubando em uma coleção de tubo de 2ml.
Centrifugar por 15 segundos a >8 χ g (>10.000 rpm).
5. Passar o eluato através da coluna mais uma vez.Centrifugar por 15 segundos a >8 χ g (>10.000 rpm).
Descartar o fluxo como lixo perigoso e descartar a coleção detubo.
6. Transferir a coluna giratória em uma nova Coleção de Tubo de 2 m!(abastecida).
7. Adicionar 500 μΙ de tampão IVT de Lavagem de cRNA por 15 segundosa >8 χ g (>10.000 rpm) para lavagem.
Descartar o fluxo.
8. Pipetar 500 μΙ 80% (v/v) etanol na coluna giratória, e centrifugar por 15segundos a
>8.OOOxg (>10.000 rpm). Descartar o fluxo.
9. Abrir a tampa da coluna giratória e centrifugar por 5 minutos emvelocidade máxima (< 25,000 χ g).
Descartar o fluxo e Coleção de Tubo.
10. Transferir a coluna giratória em uma nova coleção de tubo de 2 ml.
11. Pipetar 11 μΙ de água livre de RNase diretamente na membrana dacoluna giratória. Deixar descansar por 1 minuto
Centrifugar por 1 minuto a velocidade máxima (>25.000 χ g) para eluir.
12. Pipetar 10 μΙ de água livre de RNase diretamente na membrana dacoluna giratória. Deixar descansar por 1 minuto
Centrifugar por 1 minuto a velocidade máxima (>25.000 χ g) paraeluir.
Quantificação do cRNA (Produto IVT)
Usar análise espectrofotométrica para determinar o rendimento de RNA.Aplicar a convenção de que 1 OD a 260 nm eqüivale a40 pg/ml de RNA.
Checar a OD a 260 nm e 280 nm para determinar a concentração epureza da amostra.
Manter a razão A260/A280 próxima a 2,0 para purificar o RNA (razãoentre 1,9 e 2,1 são aceitáveis).
Para quantificação do cRNA quando se usando o total de RNA comomaterial de partida, um rendimento de cRNA ajustado pode ser calculado pararefletir influência indesejada do RNA total não marcado. Usando-se umaestimativa de 100% de influência indesejada, usar a fórmula abaixo paradeterminar o rendimento de cRNA ajustado:
rendimento de cRNA ajustado = RNAm - (total RNAi)(y)RNAm = quantidade de cRNA medida após IVT (pg)total RNAi = quantidade de RNA total de partida (pg)y = fração de cDNA de reação usado em IVTFragmentação do cRNA para Preparação AlvoPara fragmentação, usar a concentração de cRNA ajustada.
1. Adicionar 2 μΙ de 5x Tampão de Fragmentação para cada 8 pi de RNAmais H2O.
20 pg de cRNA 1 para 32 pl
5X Tampão de Fragmentação 8 μΙ
Água livre de RNase para 40 μΙ
Volume total: 40 μΙ
2. Incubar a 94°C por 30 minutos. Imediatamente colocar no gelo seguindoa incubação.Preparação da Hibridização Alvo
1. Aquecer a 20X Controles de Hibridização Eucarióticos e o Oligo B2 por 5minutos a 65°C.
Kit Controle de Hibridização Eucariótico GeneChip Affymetrix, Part#900362 (por 150 rxns)
2. Turbilhonar levemente, girar baixo
3. Mistura Master (Assumindo que a concentração de cRNA fragmentadoseja 0,5 Mg/μΙ):
<table>table see original document page 91</column></row><table>
4. Alíquota de 270 μΙ de mistura master nos tubos e adicionar 30 μΙ decRNA fragmentado para cada um. Esta é a mistura de Hibridização
5. Equilibrar as sondas de arranjo para temperatura ambienteimediatamente antes do uso.
6. Preencher a sonda de arranjo 1x Tampão MES Hyb e incubar na grelhado forno por 10 minutos a 45°C, 60 rpm.
7. Aquecer a Mistura de Hibridização em banho-maria a 99°C por 5minutos.
8. Transferir a Mistura de Hibridização a um banho-maria a 45°C por 5minutos.
9. Centrifugar a Mistura de Hibridização por 5 minutos em velocidademáxima.
10. Remover o 1x Tampão MES Hyb Buffer da sonda de arranjo.
11. Preencher a sonda de arranjo com a cobertura de 200 μΙ da Mistura deHibridização.
12. Selar os septos com Tough-Spots.
13. Hibridizar a sonda de arranjo a 45°C, 60 RPM por 19 horas.
14. Lavar, corar e rastrear a sonda de arranjo de acordo com os protocolosAffymetrix.
Materiais Affymatrix
Item Fornecedor Catálogo #
T7-(dT)24 primer Biosearch Technologies adaptadoSpikes Controle internoSobrescrito II/5X Tampão Primeira Fita/0,1 M DTT Invitrogen 18064-
014
5X Tampão Segunda Fita Invitrogen 10812-014
IOmMdedNTP Invitrogen 18427-08810 U/ul DNA Ligase de E. coli Invitrogen 18052-01920 10 U/ul DNA Polimerase I de E. coli Invitrogen 18010-025
2 U/ul de RNase H Invitrogen 18021-07110 U/ul de T4 DNA Polimerase Invitrogen 18005-0250,5 M de EDTA Sigma E-7889
Kit de marcação de transcrição de RNA de alto rendimento ENZ25 AffymetrixouENZO 900182 (ENZO)
Módulo de Limpeza de Amostra GeneChip Affymetrix 900371Albumina de Soro Bovino Acetilado Invitrogen 15561-020IgG de Cabra - Reagente para Graduação Sigma I-5256<table>table see original document page 93</column></row><table>
PCR Quantitativo
Síntese De cDNA
<table>table see original document page 93</column></row><table>
Condições de Incubacão:
<table>table see original document page 93</column></row><table>37° por 2 horas
Reação TaqMan Usando Detector De Seqüenciamento ABI Prisma 7700
<table>table see original document page 94</column></row><table>
Condições de Ciclo Termal:95° por 10 minutos
40 ciclos: 95° por 15 segundos
60° por 1 minuto
Sondas TaqMan Testes-on-Demand™ (sondas TaqMan® MGB1
FAM ™ marcado com corante)
* Amplificação do controle endógeno, GAPDH (concentração dasonda 100nM, concentrações de primer de frente e 200nM), foi realizada parapadronizar a quantidade de amostra de RNA (cDNA) adicionada a cadareação.
A quantificação relativa foi realizada usando-se o método decurva padrão. Para quantificação normalizada para um controle endógeno,curvas padrão foram preparadas tanto para o alvo como referência endógena.Para cada amostra experimental, a quantidade de alvo e referência endógenafoi determinada a partir de uma curva padrão apropriada. Então, a quantidadealvo foi dividida pela quantidade referência endógena para obter um valor alvonormalizado. Uma das amostras experimentais serviu como calibrador, ouamostra 1x. Cada um dos valores alvos normalizados foi então dividido pelovalor alvo normalizado calibrador para gerar os níveis de expressão relativa.Resultados Experimentais
Os experimentos foram conduzidos usando-se métodos emateriais descritos acima. Os resultados destes experimentos estão ilustradosnas Figuras 5-9, como discutido abaixo.
Figura 5 fornece uma tabela sumária IC50 dos dados obtidos naanálise de linhagens celulares de câncer de célula de pulmão não-pequena("NSCLC") para sensibilidade ou resistência à atividade apoptótica de Apo2L (+0,5% de soro fetal bovino "FBS" ou 10% de FBS) ou anticorpo monoclonal DR5"mab", "XL" interligado ou não interligado, (+ 0,5% de soro fetal bovino "FBS"ou 10% de FBS) como medido nos testes de citotoxicidade MTT.
Figura 6 fornece uma tabela sumária IC50 dos dados obtidos naanálise de linhagens celulares de câncer pancreático para sensibilidade ouresistência à atividade apoptótica de Apo2L (+ 0,5% de soro fetal bovino "FBS"ou 10% de FBS) ou anticorpo monoclonal DR5 "mab", "XL" interligado ou nãointerligado, (+ 0,5% de soro fetal bovino "FBS" ou 10% de FBS) como medidonos testes de citotoxicidade MTT.
Figura 7 fornece uma tabela sumária IC50 dos dados obtidos naanálise de linhagens celulares de câncer de Iinfoma não-Hodgkin ("NHL") parasensibilidade ou resistência à atividade apoptótica de Apo2L (+ 10% de sorofetal bovino "FBS") ou anticorpo monoclonal DR5 "mab", "XL" interligado ounão interligado, (+ 0,5% de soro fetal bovino "FBS" ou 10% de FBS) comomedido nos testes de citotoxicidade MTT.
Figura 8 fornece uma comparação de sensibilidade ("sen") ouresistência ("RES") de NSCLC selecionado, pancreático e linhagens celularesde câncer NHL para anticorpo DR5 e a correlação para expressão de GaINac-T14, como medido pela expressão de mRNA de GalNac-T14.
Figura 9 fornece um gráfico de diagrama de barra de váriosNSCLC, pancreático, e linhagens celulares NHL classificadas (em ordemdecrescente) pelos níveis de padrões de expressão de mRNA de GaINac-TI4.
O programa de morte celular apoptótica desempenha papéisimportantes no desenvolvimento e homeostase de organismos multicelulares(Danial et al., Cell, 116:205 (2004)). Os estímulos intracelulares podem acionarapoptose por meio da via intrínseca celular que depende de membros dasuperfamília do gene Bcl-2 para ativar o mecanismo caspase apoptótico (Coryet al., Nat. Rev. Câncer, 2:647 (2002)). Certas citocinas que pertencem àsuperfamília do fator de necrose tumoral (TNF) podem ativar apoptose pormeio da via extrínsica celular, pela interação com alguns receptores quecontêm um "domínio de morte" de indução de apoptose (DD) (Ashkenazi et al.,Sciennei 281:1305 (1998)). O Iigante Fas (FasL) estimula apoptose por meiode Fas (Apo1/CD95), enquanto o Iigante de indução de apoptose relacionadoao Iigante Apo-2 L/TNF (Apo2L/TRAIL) aciona apoptose por meio do DR4(TRAIL-R1) e/ou DR5 (TRAIL-R2) (LeBIanc et al., Cell Death Differ., 10:66(2003)). Pela ligação de seus Iigantes cognatos, estes receptores se ligam àmolécula adaptadora FADD (domínio de morte associado a Fas), que recruta acaspase 8 iniciadora de apoptose para formar o complexo de sinalização deindução de morte (DISC) (ver, por exemplo, Kischkel et al., EMBO J., 14:5579(1995); Kischkel et al., Immunity, 12:611 (2000)). Associação a DISC estimulacaspase-8, que uma após a outra, cliva e ativa proteases efetoras tal comocaspase-3, 6, e 7 para executar o programa de morte apoptótica. Em muitostipos celulares, a intercomunicação para a via intrínseca celular pode tambémamplificar o sinal de morte extrínseco celular (Scaffidi et al., J. Bioi Chem.,274:1541 (1999)). Apo2L/TRAIL induz apoptose em uma variedade de tiposcelulares de tumor com nenhum ou menor efeito nos tecidos normais,sugerindo que pode ser útil para terapia de câncer (ver, por exemplo,Ashkenazi, Nat. Rev. Câncer, 2:420 (2002); Kelley et al., Curr. Opin.Pharmacol., 4:333 (2004)). Alterações em vários componentes das vias deapoptose podem reduzir a sensibilidade a Apo2L/TRAIL em linhagens celularescancerígenas específicas (Igney et ai, Nat. Rev. Câncer, 2:277 (2002)).
Vários experimentos foram realizados de acordo com os métodose protocolos estabelecidos abaixo, e os dados estão fornecidos nas Figuras10-15.
Para examinar a sensibilidade à ativação do receptor, asobrevivência celular foi testada como uma função da concentração deApo2L/TRAIL em um painel de linhagens celulares humanas, incluindo 23adenocarcinomas pancreáticos, 18 melanomas malignos e 36adenocarcinomas coloretais (Fig. 10A e dados não mostrados). Esta análiseclassificou 29/77 (38%) das linhagens celulares como altamente oumoderadamente sensível ao Apo2L/TRAIL. A concentração de Apo2L/TRAILexigida para alcançar 50% de morte celular nestas 29 linhagens celularesvariou de 3 a 800 ng/ml, com uma média de 250 ng/ml.
O painel de linhagem celular foi também examinado pelo perfil daexpressão gênica, usando-se um microarranjo de conjuntos de sonda de54.613 genes. Apesar de algumas exceções, câncer pancreático e linhagenscelulares de melanoma que mostraram sensibilidade forte ou intermediáriapara Apo2L/TRAIL expressaram níveis de mRNA significantemente mais altos da enzima ppGalNAcT-14 de O-glicosilatição do que linhagens celularesresistentes correspondentes (P=O-SxIO"4 pelo teste exato de Fisher, cortedeterminado repetidamente em 750 para carcinoma pancreático e 300 paramelanoma) (Fig. 10B). A maioria das linhagens celulares de câncer coloretalsensíveis ao Apo2L/TRAIL mostraram alta expressão de mRNA da enzimappGalNAcT-3 relacionada a O-glicosilação, embora diversas linhagenscelulares resistentes também expressaram este gene, resultando em umadiferença fraca, ainda significante (p=0,026, corte determinado em 2000) (Fig.10C, inferior). Exceções no painel completo foram: (a) 5/29 (17%) daslinhagens celulares que eram sensíveis, ainda expressaram ppGalNAcT-14 ouppGalNAcT-3 abaixo dos níveis de corte; (b) 16/48 (33%) das linhagenscelulares resistentes que apesar de tudo não tiveram níveis de ppGalNAcT-14ou ppGalNAcT-3 abaixo do corte. Pelo exame da expressão de mRNA deoutras enzimas de O-glicosilação nas linhagens celulares coloretais, níveismais altos de Fut-6 foram detectados em 10/12 (83%) de linhagens celularessensíveis quando comparado a 6/24 (25%) de resistentes (p=0,013; cortedeterminado a 200) (Fig. 10C, superior). A expressão combinada deppGalNAcT-14 em câncer pancreático e melanoma com Fut-6 em linhagenscelulares coloretais correlacionaram muito fortemente com a sensibilidade aoApo2L/TRAIL (p=1.83x10"7, N=77). Este conjunto de genes corretamentepreviu sensibilidade ou resistência para 23/32 (72%) de linhagens celularesmarcadoras positivas e 39/45 (87%) marcadoras negativas, respectivamente.
A sensibilidade ao Apo2L/TRAIL foi também examinada in vivousando-se xenoenxertos de tumor. Um tratamento de 5 dias com Apo2L/TRAILde camundongos que abrigam tumores derivados de linhagens celulares decâncer coloretal Fut-6-positivas Colo205 e DLD-1 causaram regressão detumor seguida por uma progressão de tumor muito atrasada (Fig. 10D). Emcontraste, tumores derivados de linhagens celulares de câncer coloretal Fut-6-negativas Colo320 e RKO não responderam a este tratamento.
A pré-incubação da linhagem celular ppGalNAcT-3/Fut-6-positivaColo205 com o total benzil-GaINAc inibidor transferase O-glicosil (Delannoy etai, Glycoconj., 13:717 (1996)) reduziu acentuadamente a sensibilidade aoApo2L/TRAIL (Fig. 11 A), sugerindo uma ligação funcional entre O-glicosilaçãoe sinalização Apo2L/TRAIL. Para também examinar isto, oligonucleotídeospequenos (si)RNA específicos de interferência foram usados de forma a atingirppGalNacT-14, ppGalNacT-3, ou mRNA Fut-6. Para excluir efeitos fora doalvo, siRNAs múltiplos, não sobrepostos foram sintetizados para cada gene everificaram sua habilidade para reduzir expressão alvo por RT-PCRquantitativo (fig. 14A). Nós confirmamos especificidade de siRNA também comum plasmídeo ppGalNacT-14 contendo 6 trocas de nucleotídeos 'silenciosos'dentro da região siRNA atingida (Editorial, Nat. Cell. Biol., 5:489 (2003))(fig.
14B). A transfecção de carcinoma pancreático ppGalNAcT-14-positivo PSN-1 elinhagens celulares de melanoma Hs294T com siRNA ppGalNAcT-14 reduziusubstancialmente a sensibilidade ao Apo2L/TRAIL, enquanto siRNA caspase-8, como esperado, forneceu essencialmente proteção completa (Fig. 11B). Demaneira similar, a transfecção de células de câncer coloretal DLD-1 ou C170com GalNAcT-3 ou siRNA Fut-6 diminuiu significantemente a sensibilidade aoApo2L/TRAIL (Fig. 11C e fig. 14C). No total, siRNA GalNAcT-14 reduziusensibilidade ao Apo2L/TRAIL em 4/5 das câncer pancreático e 2/2 daslinhagens celulares de melanoma, enquanto siRNA ppGalNAcT-3 ou Fut-6cada um reduziu a sensibilidade em 2/3 das linhagens celulares de câncercoloretal. Pelo contrário, a transfecção de células PSN-1 ou Hs294T comsiRNA GalNAcT-14 não alterou a sensibilidade ao etoposídeo inibidortopoisomerase Il (fig. 14D). De maneira similar, a transfecção de células PSN-1ou C170 com GalNAcT-14 ou GalNAcT-3 não afetou a sensibilidade àestaurosporina inibidor de proteína quinase de espectro mais amplo (fig. 14E). Devido ao fato de tanto ao etoposídeo como estaurosporina estimularemapoptose por meio da via intrínseca celular (Wei et ai., Science, 292:727(2001)), estes estudos sugeriram que enzimas de O-glicosilação podemmodular sinalização de apoptose por meio da via extrínseca celular.
A transfecção de células HEK293 com ppGalNAcT-14 revelou morte celular quando co-transfectadas com DR4 ou DR5, mas não asrelacionados a Fas e TNFR1 ou a via intrínseca celular agonista de Bax (Fig.11 D). Além disto, a transfecção ppGalNAcT-14 aumentou a sensibilidadeApo2L/TRAIL das linhagens celulares H1568 de melanoma (Fig. 11E) e PA-TU-8902 e PL-45 de carcinoma pancreático (Fig. 14F), mas não alteraram asensibilidade ao etoposídeo (dados não mostrados). No total, asuperexpressão de GalNAcT-14 sensibilizou 4/7 das linhagens celulares aoApo2L/TRAIL.
O efeito de siRNA knockdown de ppGalNacT-14 ou Fut-6 foiexaminado no processo caspase induzida por Apo2L/TRAIL. Em células PSN-1e DLD-1 transfectadas com siRNA controle, Apo2L/TRAIL induziuessencialmente processo completo de caspase-8, levando à clivagem de Bid,caspase-9 e caspase-3 (Fig. 12A). Transfecção com siRNA caspase-8preveniu estes eventos. Knockdown de ppGalNAcT-14 em células PSN-1 ouFut-6 em células DLD-1 também atenuou acentuadamente o processo decaspase-8 induzido por Apo2L/TRAIL, Bid1 caspase-9 e caspase-3 (Fig. 12A), eestimulação da atividade de caspase-3/7 (Fig. 12B). RKO resistente aoApo2L/TRAIL e linhagens celulares de câncer coloretal SW1417, queexpressam baixos níveis de ppGalNAcT-3 e Fut-6, mostraram bloqueio similarao nível do processo de caspase-8 (fig. 15A). Dessa forma, enzimas de O-glicosilação podem modular a via Apo2L/TRAIL a montante de eventos quelevam à ativação de caspase-8.
A ativação de caspase-8 requer montagem DISC (Ashkenazi eta/., Science, 281:1305 (1998)). Análises do Apo2L/TRAIL DISC (Kischkel et al.,Immunity, 12:611 (2000)) em células PSN-1 e DLD-1 indicaram que knockdownde ppGalNAcT-14 ou Fut-6 reduziu o recrutamento de FADD e caspase-8 parao DISC, o processo de atividade enzimática de caspase-8 ligada DISC, e aestimulação de caspase-8 ligada DISC (Sharp etal., J. Biol. Chem., 280:19401(2005)) (Fig. 12C, 12D, e fig. 15B). Nem siRNA ppGalNacT-14 ou Fut-6alteraram substancialmente a quantidade de DR4 e DR5 no DISC, ou a ligaçãodependente de dose de Apo2L/TRAIL para células PSN-1 ou DLD-1, queexpressam tanto DR4 como DR5 (Fig. 12C, fig. 15B, e dados não mostrados).essa forma, ppGalNAcT-14 e Fut-6 não parecem modular apoptose pelainfluência dos níveis de receptores de superfície celular ou ligaçãoApo2L/TRAIL. Consistente com isto, a sensibilidade ao Apo2L/TRAIL no painelde linhagem celular 77 não mostrou correlação significante com a expressãode superfície celular dos cognatos que sinalizam receptores DR4 e DR5 oureceptores isca DcR1 e DcR2 (dados não mostrados). Além disto, muitossiRNAs contra ppGalNAcT-14, ppGalNacT-3 ou Fut-6 não alteraram os níveisde DR4 e DR5 em células PSN-1, C170 ou DLD-1 (fig. 15C). Dois siRNAscausaram um decréscimo detectável em DR4 e DR5 em certas linhagenscelulares (fig. 15C). No entanto, outros siRNAs contra as mesmas enzimasinibiram apoptose induzida por Apo2L/TRAIL sem afetar os níveis dosreceptores.
O domínio extracelular (ECD) de DR5 humano foi expresso emcélulas ovarianas de hamster chinês, a proteína secretada purificada,submetida à hidrólise ácida, e os monossacarídeos associados foramanalisados (Fig. 13A). Consistente com a ausência de sítios de N-glicosilaçãopreditivos no DR5 ECD, nós não detectamos glicanos N-ligados. Embora, duasamostras de 2 experimentos independentes mostraram 3 moles de GaINAc e 3moles de Gal por mol de DR5 ECD (Fig. 13A), sugerindo modificação O-Iigadade três sítios em DR5 com o centro glicano GaINAc-GaI.
A proteína de O-glicosilação modifica serinas ou treoninas.Usando-se uma ferramenta de bioinformática para previsão dos sítiospotenciais de O-glicosilação (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGIyc)(Julenius et ai, Glycobiology, 15:153 (2005)), nós identificamos duas taisregiões na seqüência ECD comum das variantes de junção longa (DR5-L) ecurta (DR5-S) de DR5 humano, e um terceiro sítio dentro da região de junçãoalternativa (Fig. 13B). O primeiro segmento de aminoácido (74-77) tem 3serinas; o segundo (130-144) tem 5 treoninas, enquanto o terceiro tem 4treoninas e 3 serinas. DR5 murino tem seqüência similares aos 2 primeirossegmentos, com 2 serinas e 4 treoninas, respectivamente, enquanto DR4humano também tem 2 seqüência similares que contém 1 serina e 5 treoninas.
Para testar se estes sítios podem ser importantes para modificação pós-tradução de DR5, um conjunto de mutantes DR5L e DR5S foram feitos,substituídos por alanina tanto nas 5 treoninas do segmento 130-144 (DR5L-5T,DR5S-5T) como estas mesmas 5 treoninas, como também as 3 serinas dosegmento 74-77 (DR5L-5T3S, DR5S-5T3S). Usados de imunoblot do anticorpoDR5 a partir de células HEK293 transfectadas com DR5L ou DR5S revelarama presença do DR5L esperado ou bandas DR5S (Fig. 13C). O anticorpotambém detectou bandas de peso molecular mais alto (MW), que se tornammais abundantes sob co-transfecção de DR5L ou DR5S com ppGalNAcT-14quando comparado ao controle (Fig. 13C, asteriscos). A abundância destasbandas mais altas MW e seu aumento por ppGalNAcT-14 foi diminuídasignificantemente com DR5L-5T ou DR5S-5T e quase eliminou DR5L-5T3S ouDR5S-5T3S, quando comparado às construções tipo selvagem. Estesresultados sugerem que bandas MW mais altas representam formas O-glicosiladas de DR5: ppGalNAcT-14 promove sua formação, e a eliminaçãoprogressiva dos sítios de O-glicosilação previstos pela substituição de alaninagradualmente reverte este efeito. A transfecção de células HEK293 com DR5murino ou DR4 humano, DR5L, ou DR5S revelou morte celular (Fig. 13D);cada DR5 mutante mostrou menos atividade do que sua construção tiposelvagem correspondente, com DR5S-5T3S (que é desprovido de todos os 3sítios) que possui a atividade mais fraca. A co-transfecção com ppGalNAcT-14aumentou acentuadamente a morte celular por todas as construções DR4 eDR5 exceto DR5S-5T3S, que mostrou atividade significantemente menor.
A maioria dos tecidos normais e amostras de tumor de câncer depele, pulmão, pâncreas, mama, ovário, endométrio e bexiga, ou de Iinfomanão-Hodgkin mostrou expressão de ppGalNAcT-14 mRNA abaixo dos valoresde corte (determinado em 500 para a maioria dos cânceres e 200 paracânceres de pele, Fig. 13E). No entanto, um subconjunto significante deamostras de tumor, variando de 10% em câncer de mama Iobular a 30% emâncer de pulmão e Iinfoma de célula B grande difuso, mostrousuperexpressão de ppGalNAcT-14. Algumas amostras de câncer tiveram níveisde expressão de mRNA maior que 1000 vezes acima dos tecidos normaiscorrespondentes. A expressão dinâmica de ppGalNAcT-14 em câncer sugereque este gene, e possivelmente outras enzimas relacionadas, podem fornecerbiomarcadores úteis para identificar tumores com grande sensibilidade aoApo2L/TRAIL.
Glicanos O-Iigados mostram diversidade estrutural extensa, eeles modulam vários aspectos da biologia de proteína de membranaplasmática, incluindo conformação, agregação, trânsito, meia-vida, comotambém atividade de adesão e sinalização (Hang et al., Bioorg. Med. Chem.,13:5021 (2005); Hanisch, Biol. Chem., 382:143 (2001)). Células cancerígenasfreqüentemente exibem alterações nos perfis O-glicano, criando exclusivosantígenos de carboidrato associados a tumor (Brockhausen, Biochim.Biophys. Acta, 1473:67 (1999); Dube et al., Nat. Rev. Drug Discovery, 4:477(2005); Fuster et al., Nat. Rev. Câncer, 5:526 (2005)). O-glicosilação tambémdesempenha um papel importante na estabilização de células tumorais parasítios específicos de metástase (Fuster et al., Câncer Res., 63:2775 (2003);Ohyama et al., EMBO J., 18:1516 (1999); Takada et al., CancerRes., 53:354(1993)). Um subconjunto significante de amostras de tumor primário de umavariedade de cânceres humanos mostra expressão elevada da enzimappGalNAcT-14 de O-glicosilação, incluindo amostra de células de cólon ecoloretal, amostras de células de melanoma e amostras de células decondrosarcoma.Métodos
Materiais
Os reagentes da cultura celular foram adquiridos da Gibco(Invitrogen/Gibco, Carlsbad1 CA), Apo2L/TRAIL solúvel não marcado foipreparado como descrito anteriormente (Lawrence et al., Nat. Med., 7:383(2001)), o inibidor de glicosilação O-Iigado Benzil-a-GaINAc foi adquirido daCalbiochem e todos as outras substâncias químicas (incluindo etoposídeo eestaurosporina) eram da Sigma Aldrich (St. Louis, MO).
Cultura Celular ε Linhagens Celulares
Todas as linhagens celulares de carcinoma humano (para nomese números catalogados ver dados adicionais) foram obtidas da ATCC ouDSMZ (Braunschweig, Germany) e cultivadas a 37°C e 5% CO2 em RPM11640suplementado com 10% de soro de bovino fetal inativado pelo calor, 2 mM L-de glutamina e 10 mM de HEPES sem antibióticos similares àpenicilina/estreptomicina. Células de rim embrionárias humanas 293 (númerocatalogado CRL-1573) foram também obtidas da ATCC e cultivadas em 100%de meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de FBS. Alinhagem celular CHO mutante de O-glicosilação, IdID CHO, foi licenciada peloDr. Monty Kreiger1 MIT (Boston MA).
Testes de Viabilidade Celular ε Testes de ApoptosePara determinar IC50 para Apo2L/TRAIL, as células foramplaqueadas em triplicata em placas de 96 poços, permitidas aderir por 24 horase então tratadas com Apo2L/TRAIL recombinante em concentraçõescrescentes, até 1000 ng/ml. Após uma incubação de 72h, elas foram entãosubmetidas a um teste de viabilidade - teste MTT (Pierce) ou Teste deViabilidade Celular Luminescente CeIITiter-GIo (Promega) - de acordo com asinstruções do fabricante. Cada experimento de viabilidade celular foi repetidopelo menos três vezes em soro baixo (0,5%) e alto (10% de FBS) e linhagenscelulares sensíveis intermediárias são definidas pela variabilidade entre osIC50s de experimentos independentes ou entre soro alto e baixo. Nósdefinimos uma linhagem celular como sensível baseado na indução deapoptose de pelo menos 50% das células em uma concentração deApo2L/TRAIL de 1 ug/ml e como intermediariamente sensível baseado navariabilidade da quantidade de apoptoses induzida em experimentosindependentes ou na presença de soro baixo (0,5%) versus alto (10%). Aapoptose foi quantificada pela análise citométrica de fluxo da porcentagemmédia de células colhidas (aderente + flutuante no meio) corada com AnexinaV (BD Pharmingen).
Hibridização de Microarranjo ε Análise de DadosRNA celular total foi preparado a partir de células não tratadas (3χ 106) usando-se o Kit RNeasy (Quiagen). cRNA marcado foi preparado ehibridizado para microarranjos de oligonucleotídeos (U133P GeneChip;Affymetrix Incorporated, Santa Clara, CA) como previamente descrito (Hoffmanet ai, Nat. Rev. Genetics1 5:229 (2004); Yauch et ai, Clin. Câncer Res.,11:8686 (2005)). Arquivos de imagens escaneadas foram analisadas comGENECHIP 3.1 (Affymetrix)1 Spotfire1 GenePattern e Cluster/TreeView. Paraidentificar os genes mais diferentemente expressados entre linhagens decélulas sensíveis e resistentes, valores de expressão gênica foram submetidosa um filtro de variação que excluiu genes com variação mínima através dasamostras sendo analisadas pelo teste para uma troca e variação absolutasobre as amostras, comparando a razão de máx e min (máx/min) e diferençaentre máx e min (máx-min) com valores pré-definidos e excluindo genes quenão obedecem ambas as condições.
Construção de Expressão ε Transdução Retroviral
Um fragmento de DNA que codifica ppGalNAcT-14 foi clonado apartir de cDNA agrupado de linhagens celulares sensíveis Apo2L/TRAIL einseridas no plasmídeo de expressão pcDNA3.1 (Invitrogen) com um N-terminal Flag tag. Esta construção foi então submetida ao sítio dirigido demutagênese (kit Quikchange Mutagenesis, Stratagene) para gerar mutantessilenciosos siRNA que tinham 4-6 alterações de pares de base balenceadas naseqüência homóloga para o siRNA, sem trocar a seqüência de proteína. Asmutações atravessam uma região de 10bp no centro do 19bp da seqüência deligação de siRNA. As seqüência de DNA para DR5Longo e DR5Curto, DR4,receptor TRAIL murino, DR4, Fas (variante 1), TNFR1 e Bax (variante beta)foram clonadas a partir de pools de cDNA e inseridas no vetor de expressãopRK (Genentech). Mutantes O-glicosilação de DR5L e DR5S foram geradospela mutação sítio-específica de quatro treoninas a resíduos alanina, Mut4xTA(T130, T131, T132, T135) ou cinco treoninas a resíduos alanina MutõxTA(T130, T131, T132, T135, T143). A transfecção transitória em células HEK293com construção de expressão de moléculas pró-apoptóticas foram feitas emplacas de 6 poços a uma concentração de 0,5 ug/poço da molécula pró-apoptótica e 2,0 ug de ppGalNAcT-14 ou um vetor controle. As células foramtransfectadas usando-se Lipofectamina 2000 de acordo com o protocolo dofabricante. Seguindo uma incubação de 48h, as células foram submetidas àanálise de apoptose.
Para gerar retrovirais construções ppGalNAcT-14 e mutantesforam clonados no vetor retroviral pQCXIP (Clontech). Sobrenadantesretrovirais de alta titulação foram gerados usando-se linhagem celular auxiliarΦΝΧ-Ampho. Células empacotadas foram transfectadas usando-se Fosfato deCálcio (Invitrogen). Os sobrenadantes foram isolados 48h após transfecção eadicionados às células alvo junto com 10 microg/ml de polibreno, seguido poruma etapa de centrifugação de 1h a 2700 rpm para aumentar infecção.Seguindo transdução, as células foram submetidas à seleção com 2 microg/mlde puromicina.Projeto siRNA ε Protocolos de Transfecção
Os siRNAs contra ppGalNAcT-14, ppGalNAcT-3, Caspase-8 eDR5 foram projetados pela Dharmacon (Lafayette, CO) usando seus critériosde seleção de propriedade. As seqüência selecionadas foram:siGalNAcT-14 (1): 5' GACCATCCGCAGTGTATTA-dTdT 3' (=14-
4) (SEQ ID NO:15)siGalNAcT-14 (2): 5' ATACAGATATGTTCGGTGA-dTdT 3' (=14-
6) (SEQ ID NO:16)
siGalNAcT-3 (1): 5' CCATAGATCTGAACACGTT-dTdT 3' (=3-2) (SEQ ID NO:17)siGalNAcT-3 (2): 5' GCAAGGATATTATACAGCA-dTdT 3' (=3-7)(SEQ ID NO:18)
siFut-6 (1) 5' GUACCAGACACGCGGCAUA-dTdT 3' (=6-1) (SEQID NO:19)
siFut-6 (2) 5' ACCGAGAGGUCAUGUACAA-dTdT 3' (=6-2) (SEQID N0:20)
siCaspase-8: 5' GGACAAAGTTTACCAAATG-dTdT 3' (SEQ IDNO:21)
siRNAs foram adquiridos como oligonucleotídeos RNA de fitadupla e transfectados nas respectivas linhagens celulares a uma concentraçãode 25 nM para cada siRNA. siRNA dúplex contra uma seqüência não alvo(Dharmacon) foi usado como controle. Células foram transfectadas usando-seLipofectamine2000 (Invitrogen) por transfecção reversa onde as células foramadicionadas na suspensão aos complexos siRNA lipídeo pré-plaqueados.
Concentrações para Lipofectamine2000 eram de acordo com as instruções dofabricante. Após 48h de incubação, as células foram colhidas para análise demRNA ou incubadas com Apo2L/TRAIL humano recombinante, etoposídeo ouestaurosporina para um adicional 24-72h para testes de viabilidade para 4, 8ou 24h para análise Western blot.
Inibição de O-Glicosilação com Benzil-A-GalNAc
Células Colo205 foram cultivadas na presença de Benzil-a-GaINAc (2 mM ou 4 mM) por 72 horas. Neste ponto elas foram replaqueadasem placas de 96 poços, permitidas aderirem por 24 horas, enquanto ainda napresença do inibidor. Elas foram então estimuladas com concentraçõescrescentes de Apo2L/TRAIL como indicado e submetidas a um teste deviabilidade.
PCR Quantitativo
Níveis de expressão de transcrição de GalNacT-14 e GalNacT-3foram avaliados por RT-PCR quantitativo usando-se técnicas padrão Taqman.Níveis de transcrição foram normalizados para o gene housekeeping, GAPDHe os resultados estão expressos como valores de expressão normalizados (=2"DCt). Conjuntos pr/mer/sonda para GalNacT-14 (cat#: Hs00226180_m1_GT14),GalNacT-3 (cat#:Hs00237084_m1_GT3) e GAPDH (cat#: 402869) foramadquiridos da Applied Biosystems (Foster City, CA).
imunoprecipitação, análise western blot e anticorpos
IP: Anticorpos monoclonais anti-Apo2L (2E11; ATCC Acesso No.HB-12256), anti-DR4 (3G1 e 4G7, ATCC Acesso No. PTA-99) e anti-DR5 (3H3,ATCC Acesso No. 12534, e 5C7) foram gerados na Genentech, Inc. utilizandoproteínas de fusão receptor Fc como antígenos. Anticorpos monoclonais anti-DR4 (4G7) e anti-DR5 (5C7), usados para imunoprecipitar o Apo2L/TRAILDISC, foram conjugados à agarose usando-se o kit de orientação ImmunoPureProteína G IgG Plus (número catalogado 44990) da Pierce. Os anticorposmonoclonais anti-DR4 (3G1) e anti-DR5 (3H3), usados para imunodetecção deDR4/5 em imunoprecipitações DISC, foram biotinilados usando-se kit debiotinilação EZ-Iink SuIfo-NHS-LC (número catalogado 21217) da Pierce.FLAG-unido Apo2L/TRAIL foi preparado e interligado com anticorpo anti-FLAGΜ2 (Sigma) como descrito (Kischkel, Immunity, 12:611 (2000)). Estesexperimentos foram feitos como previamente descrito para análiseApo2L/TRAIL-FLAG + anti-FLAG DISC (Kischkel, acima). Os experimentos deimunoprecipitação DR4/5 DISC também foram realizados como descrito,exceto que os anticorpos monoclonais anti-DR4 (4G7) e anti-DR5 (5C7) foramdiretamente conjugados à agarose para a imunoprecipitação (Sharp et al., J.Bioi Chem., 280:19401 (2005)).
WB: 5x105 células foram semeadas por poço em placas de 6poços. Para experimentos de RNAi knock-down, as células foram tratadas comsiRNAs diferentes por 48h seguida pelo Apo2L/TRAIL por 4, 8 ou 24h. Após osperíodos de tempo indicados, as células foram lavadas em gelo seco PBS eIisadas em 1% de Triton X-100 contendo tampão de Iise hipotônico (20 mMHEPES pH 7,5, 10 mM de KCL, 1,5 mM de MgCI2, 1 mM de EDTA e 1 mM deDTT). Para cada amostra, 40 pg de proteína foi separada sob condições deredução em gradiente 10% ou 10-20% de géis SDS-poliacrilamida. Apóstransferência para membranas de nitrocelulose (Schleicher e Schuell) asmembranas foram incubadas por 1h em 10% de leite em pó desnatadoseguido por 1h de incubação com os seguintes anticorpos primários: anticorpoanti-caspase-3 de cabra (1:1000, R&D) anticorpo anti-caspase-8 de coelho(1:1000, Pharmingen), anticorpo 5B4 anti-caspase-9 de camundongo 5B4(1:1000, MBL), anticorpo anti-Bid de coelho (1:1000, Pharmingen), anticorpoanti-DR5 de coelho (1:500, Cayman) ou anticorpo anti-actina de cabra (1:200,Santa Cruz Biotechnology). As membranas foram lavadas cinco vezes comTBS/0,05% Tween e então incubadas com o anticorpo secundário purificadode afinidade conjugado com a respectiva peroxidase (1:5000, Biorad) por 30min. As membranas foram lavadas novamente cinco vezes e reveladasusando-se quimioluminescência aumentada (ECL, Amersham) e expostas afilmes Kodak Biomax .Citometria de Fluxo/Análise FACS
A expressão de superfície dos receptores DR4 e DR5 da famíliaTNF foi determinada por seleção celular ativada por fluorescência (FACS)usando-se um citômetro de fluxo FACS Calibur (Becton DickinsonImmunocytometry System, San Jose1 CA). Células C170 e PSN-1,transfectadas com siRNAs indicados por 48h, foram coradas com 10 pg/ml deanticorpo primário, 4G7 (anti-DR4) ou 3H3 (anti-DR5) ou um anticorpo controleIgG de camundongo por 1 h a 4°C. As células foram então lavadas com PBS eentão incubadas com um anticorpo secundário anti-camundongo conjugadocom fluorescina (FITC) (Jackson Laboratories) por 30 min a 4°C. As célulasforam então analisadas por citometria de fluxo usando-se um citômetro defluxo FACS Calibur.
Testes de Caspase
Atividades de caspase-3/-7 foram testadas a 37°C em 40 μΙ detampão caspase (50 mM de HEPES pH 7,4, 100 mM de NaCI, 10 % desacarose, 1 mM de EDTA, 0,1% de CHAPS e10 mM de DTT) contendo 100 μΜdo peptídeo fluorogênico Ac-DEVD-AFC. A atividade foi medida continuamentesobre o tempo indicado pela liberação de AFC a partir de DEVD-AFC usando-se um Dispositivo Molecular fluorômetro no modo cinético e com o par de filtro405-510. Para a avaliação da atividade de caspase 20 pg de proteína celulartotal (Triton X-100 extracts) foi usado em 40 μΙ de tampão caspase (contendo100 μΜ de DEVD-AFC).
Análise de Carboidrato de DR5 Derivado de CHO
A composição de monossacarídeo de DR5 derivado de células deCHO foi obtida após hidrólise com 4 N TFA. A análise dos monossacarídeosliberados foi realizada em um sistema HPLC Dionex BioLC usando-secromatografia de troca aniônica de alta eficiência acoplada a um detectoramperométrico pulsado.Estudos de Animais ε Xenoenxertos S.C.
Fêmeas atímicas de camundongos nus (The Jackson Laboratory,Bar Harbor, ME1 USA) foram aclimatadas ao biotério da Genentech por ummínimo de 1 semana antes de colocado no estudo experimental. Todos osprocedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional deUso e Cuidado Animal da Genentech (IACAUC). Os camundongos foraminoculados s.c com 5 χ 106 células/camundongo de Colo205, DLD-1 e RKO ou20 χ 106 células/camundongo de células de carcinoma de cólon humanoColo320HSR (Coleção Americana de Tipo de Cultura). As medidas do tumorforam coletadas por um calibre digital e os volumes do tumor calculadosusando-se a fórmula p/6 (A= comprimento)(B=largura)2. Uma vez que ostumores atingiram um volume de ~150 - 200 mm3, os camundongos foramagrupados aleatoriamente e administrados de forma intraperitoneal (i.p) comveículo ou Apo2L/TRAIL (60 mg/kg/dia) nos dias 0-4.Listagem de Seqüências
<110> Genentech, Inc.
<120> ENSAIOS E MÉTODOS UTILIZANDO BIOMARCADORES
<130> P2245R1 PCT
<140> PCT/US2006/031785<141> 15-08-2006
<150> US 60/708,677<151> 16-08-2005
<150> US 60/808,076<151> 24-05-2006
<160> 29
<210> 1<211> 281<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 1
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr1 5 10 15
Cys Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys20 25 30
Val Ala Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met35 40 45
Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu50 55 60
Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser65 70 75
Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys80 85 90
Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu95 100 105
Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln110 115 120
Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr125 130 135
Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys140 145 150
Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser155 160 165Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly170 175 180
Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu185 190 195
Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile200 205 210
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser215 220 225
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr230 235 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg245 250 255
Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His260 265 270
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly275 280
<210> 2<211> 1042<212> DNA
<213> Homo sapiens<220>
<221> Incerto<222> 447
<223> Base Desconhecida<400> 2
tttcctcact gactataaaa gaatagagaa ggaagggctt cagtgaccgg 50ctgcctggct gacttacagc agtcagactc tgacaggatc atggctatga 100tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 150atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta 200ctttaccaac gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca 250ttgcttgttt cttaaaagaa gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa 300gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc aagtggcaac tccgtcagct 350cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt tctacagttc 400aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtccncag 450agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc 500ttctccaaac tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct 550gggaatcatc aaggagtggg cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg 600aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg ttttactaca tctattccca 650
aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca aagaacgaca 700
aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata 750
ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata 800
tggactctat tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg 850
acagaatttt tgtttctgta acaaatgagc acttgataga catggaccat 900
gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt ggctaactga cctggaaaga 950
aaaagcaata acctcaaagt gactattcag ttttcaggat gatacactat 1000
gaagatgttt caaaaaatct gaccaaaaca aacaaacaga aa 1042
<210> 3<211> 468<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 3
Met Ala Pro Pro Pro Ala Arg Val His Leu Gly Ala Phe Leu Ala1 5 10 15
Val Thr Pro Asn Pro Gly Ser Ala Ala Ser Gly Thr Glu Ala Ala20 25 30
Ala Ala Thr Pro Ser Lys Val Trp Gly Ser Ser Ala Gly Arg Ile35 40 45
Glu Pro Arg Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Pro Thr Ser Met Gly50 55 60
Gln His Gly Pro Ser Ala Arg Ala Arg Ala Gly Arg Ala Pro Gly65 70 75
Pro Arg Pro Ala Arg Glu Ala Ser Pro Arg Leu Arg Val His Lys80 85 90
Thr Phe Lys Phe Val Val Val Gly Val Leu Leu Gln Val Val Pro95 100 105
Ser Ser Ala Ala Thr Ile Lys Leu His Asp Gln Ser Ile Gly Thr110 115 120
Gln Gln Trp Glu His Ser Pro Leu Gly Glu Leu Cys Pro Pro Gly125 130 135
Ser His Arg Ser Glu Arg Pro Gly Ala Cys Asn Arg Cys Thr Glu140 145 150
Gly Val Gly Tyr Thr Asn Ala Ser Asn Asn Leu Phe Ala Cys Leu155 160 165
Pro Cys Thr Ala Cys Lys Ser Asp Glu Glu Glu Arg Ser Pro Cys170 175 180Thr Thr Thr Arg Asn Thr Ala Cys Gln Cys Lys Pro Gly Thr Phe
185 190 195
Arg Asn Asp Asn Ser Ala Glu Met Cys Arg Lys Cys Ser Thr Gly
200 205 210
Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp Ser
215 220 225
Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Asn Gly His Asn Ile
230 235 240
Trp Val Ile Leu Val Val Thr Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Val
245 250 255
Ala Val Leu Ile Val Cys Cys Cys Ile Gly Ser Gly Cys Gly Gly
260 265 270
Asp Pro Lys Cys Met Asp Arg Val Cys Phe Trp Arg Leu Gly Leu
275 280 285
Leu Arg Gly Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala His Asn Glu Ile Leu
290 295 300
Ser Asn Ala Asp Ser Leu Ser Thr Phe Val Ser Glu Gln Gln Met
305 310 315
Glu Ser Gln Glu Pro Ala Asp Leu Thr Gly Val Thr Val Gln Ser
320 325 330
Pro Gly Glu Ala Gln Cys Leu Leu Gly Pro Ala Glu Ala Glu Gly
335 340 345
Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Gly Ala Asp Pro
350 355 360
Thr Glu Thr Leu Met Leu Phe Phe Asp Lys Phe Ala Asn Ile Val
365 370 375
Pro Phe Asp Ser Trp Asp Gln Leu Met Arg Gln Leu Asp Leu Thr
380 385 390
Lys Asn Glu Ile Asp Val Val Arg Ala Gly Thr Ala Gly Pro Gly
395 400 405
Asp Ala Leu Tyr Ala Met Leu Met Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly
410 415 420
Arg Asn Ala Ser Ile His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Arg Met
425 430 435
Glu Glu Arg His Ala Lys Glu Lys Ile Gln Asp Leu Leu Val Asp
440 445 450
Ser Gly Lys Phe Ile Tyr Leu Glu Asp Gly Thr Gly Ser Ala Val
455 460 465
Ser Leu Glu<210> 4<211> 1407<212> DNA
<213> Homo sapiens<400> 4
atggcgccac caccagctag agtacatcta ggtgcgttcc tggcagtgac 50tccgaatccc gggagcgcag cgagtgggac agaggcagcc gcggccacac 100ccagcaaagt gtggggctct tccgcgggga ggattgaacc acgaggcggg 150ggccgaggag cgctccctac ctccatggga cagcacggac ccagtgcccg 200ggcccgggca gggcgcgccc caggacccag gccggcgcgg gaagccagcc 250ctcggctccg ggtccacaag accttcaagt ttgtcgtcgt cggggtcctg 300ctgcaggtcg tacctagctc agctgcaacc atgatcaatc aattggcaca 350aattggcaca cagcaatggg aacatagccc tttgggagag ttgtgtccac 400caggatctca tagatcagaa cgtcctggag cctgtaaccg gtgcacagag 450ggtgtgggtt acaccaatgc ttccaacaat ttgtttgctt gcctcccatg 500tacagcttgt aaatcagatg aagaagagag aagtccctgc accacgacca 550ggaacacagc atgtcagtgc aaaccaggaa ctttccggaa tgacaattct 600gctgagatgt gccggaagtg cagcacaggg tgccccagag ggatggtcaa 650ggtcaaggat tgtacgccct ggagtgacat cgagtgtgtc cacaaagaat 700caggcaatgg acataatata tgggtgattt tggttgtgac tttggttgtt 750ccgttgctgt tggtggctgt gctgattgtc tgttgttgca tcggctcagg 800ttgtggaggg gaccccaagt gcatggacag ggtgtgtttc tggcgcttgg 850gtctcctacg agggcctggg gctgaggaca atgctcacaa cgagattctg 900agcaacgcag actcgctgtc cactttcgtc tctgagcagc aaatggaaag 950ccaggagccg gcagatttga caggtgtcac tgtacagtcc ccaggggagg 1000cacagtgtct gctgggaccg gcagaagctg aagggtctca gaggaggagg 1050ctgctggttc cagcaaatgg tgctgacccc actgagactc tgatgctgtt 1100ctttgacaag tttgcaaaca tcgtgccctt tgactcctgg gaccagctca 1150tgaggcagct ggacctcacg aaaaatgaga tcgatgtggt cagagctggt 1200acagcaggcc caggggatgc cttgtatgca atgctgatga aatgggtcaa 1250caaaactgga cggaacgcct cgatccacac cctgctggat gccttggaga 1300ggatggaaga gagacatgca aaagagaaga ttcaggacct cttggtggac 1350tctggaaagt tcatctactt agaagatggc acaggctctg ccgtgtcctt 1400ggagtga 1407
<210> 5<211> 411<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 5
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg1 5 10 15
Lys Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro20 25 30
Gly Leu Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val35 40 45
Leu Leu Leu Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp50 55 60
Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser65 70 75
Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp80 85 90
Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr95 100 105
His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp110 115 120
Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr125 130 135
Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro140 145 150
Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val155 160 165
Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His170 175 180
Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val185 190 195
Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys200 205 210
Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp215 220 225Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp230 235 240
Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val245 250 255
Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly260 265 270
Val Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro275 280 285
Ala Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala290 295 300
Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp305 310 315
Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg320 325 330
Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu335 340 345
Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp350 355 360
Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp365 370 375
Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln Lys Ile Glu380 385 390
Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly Asn395 400 405
Ala Asp Ser Ala Leu Ser410
<210> 6<211> 440<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 6
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg15 10 15
Lys Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro20 25 30
Gly Pro Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val35 40 45
Leu Leu Leu Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp50 55 60
Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser65 ' 70 75Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp
80 85 90
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Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro
140 145 150
Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val
155 160 165
Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His
170 175 180
Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro Ala Val Glu
185 190 195
Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro Cys Ser
200 205 210
Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val Leu
215 220 225
Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val
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Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro
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Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala365 370 375Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val
380 385 390
Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala
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<210> 10<211> 386<212> PRT
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<221> Incerto<222> 310
<223> Aminoácido Desconhecido<400> 10
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Ser Pro Glu Met Cys Arg Thr Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly155 160 165
Met Val Lys Val Ser Asn Cys Thr Pro Arg Ser Asp Ile Lys Cys170 175 180
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Glu Glu Thr Val Thr Thr Ile Leu Gly Met Leu Ala Ser Pro Tyr200 205 210
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Val Val Val Gly Phe Ser Cys Arg Lys Lys Phe Ile Ser Tyr Leu230 235 240
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<210> 11
<211> 2742
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
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aaacctaatg ggaagtgttt atagagatga agaatggagg ttgtttccaa 2700
aagaaataaa gagaaactta gaagttgaaa aaaaaaaaaa aa 2742
<210> 12<211> 552<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 12
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Leu His Arg Val Lys Glu Asp Tyr Thr Arg Val Val Cys Pro Val125 130 135
Trp Ser Leu His Phe Gln Trp Glu Gln Leu Ser Pro Glu Gln Lys140 145 150
Ala Arg Arg Leu Asp Pro Thr Glu Pro Ile Arg Thr Lys Arg Lys155 160 165
Leu Glu Val Pro Thr Gly Pro Glu Val Gln Thr Pro Lys Pro Ser170 175 180
Asp Ala Asp Trp Asp Ala Phe Asn Gln Arg Glu Ser Glu Arg Ile185 190 195
Ser Ser Asn Arg Ala Ile Pro Asp Thr Arg His Leu Arg Leu Arg200 205 210
Thr Ile Arg Ser Val Leu Asn Arg Thr Pro Thr His Leu Ile Arg215 220 225Glu Ile Ile Leu Val Asp Gly Leu Val Arg Ser Arg Ile Arg Gly230 235 240
Ala Asp Ile Ala Gln Gly Thr Thr Leu Thr Phe Leu Asp Ser Ile245 250 255
Asp Ile Ile Asn Leu Asp Thr Phe Thr Tyr Ile Glu Ser Ala Ser260 265 270
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<210> 13
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13 atggctcacc taaagcgact agtaaaatta cacattaaaa gacattacca 50taaaaagttc tggaagcttg gtgcagtaat aggatggaaa ggaacatgaa 100aaacaaaaac aagatgttgg atttaatgct agaagctgta aacaatatta 150aggatgccat tattatacag cagcagaatt gaagcctgtc cttgaccgtc 200cacctcagga ttcaaatgca cctggtgctt ctggtaaagc aatgctttcg 250caagtgacag gatttctttg caccgagatc ttggaccaga cactcgacct 300cctgaatgta ttgaacaaaa ttgcttagaa ctgtccacag tgtgctctat 350tcttcacctg caatactgct gaaggaaatc attttggtgg atgatgctag 400caaagagaaa gaaaaggtct gatcactgct cggttgctag gagcaacagt 450cgcaacagct gaaacgctca catttttaga gtcgtaagtc cagatattgc 500atccatagat ctgaacacgt ttgaattcaa caaaccttct ccttatggaa 550gtaaccataa aaagatgaaa cctacccaat taaaacaccc acttttgcag 600gaggactttt ttccatatca aaagaatatt ttgagtatat tgtggtgggc 650agttggagat tatgccttgc tctgttgttg gacatgtttt tcgcagcaaa 700agccctcata gctttccaaa ttttatagga gaaatacaga tgcagcaaaa 750attgttaaac aaaaagcatt tggtgatctt tcaaaaagat ttgaaataaa 800gaagaagaaa taactgttat ttgtcaagtg acaagctttt aatgtcagat 850tttttcttta taatagtttt ggttttaatg caaagagaag taagtgttca 900atattccaaa gaggaatcag ccaaaaatgc aaataggagc acctgtcagg 950caaaacattg atgctggtga gagaccttgt ttgcaaggaa ttcaagacaa 1000ccaatttaag tgttgaagag caaaaggaaa aggaacgtgg ggaagctaaa 1050cactgcttta tttaagcgct gccctcccct gcccaccacc agtgtcataa 1100tagtttttca taatgaagcg tggtccacgt gtagatgagt acttacatga 1150taaactagat gaatatgtaa aacaattttc tatagtaaaa atagtcagat 1200gctcactgtg agtgtttcta tggttggcta gaacctctgt tggccagaat 1250agctgagaac tacacggctc cgtggaaatt ttgactggag tctttcattt 1300ggctgggagt cgcttcctga tcatgagaag caaagaaggt ggaagctatg 1350atgaagaaat ggaaatctgg ggaggtgaaa atatagaaat gtctttcaga 1400gtatggcaaa ggcactcagg tgattgctag aaaccaagtt cgccttgcag 1450aagtctggat ggatgaatac aaggaaataa caccgtcttc ggtgtaaaaa 1500ttttacatgg tatctgaaca acatttatcc agaggtgtat gtgccagacc 1550ttaatcctgt tatatctgga tacattaaaa gcgttggtca gcctctatgt 1600ctggatgttg gagaaaacaa tcaaggaggg aaattcggca caacatccag 1650aaggaattat gtcttcatgc tgctcaaggt ctcgttcagc tgaaggcatg 1700tacctacaat tcttaaaaat gtgcctttca gcaaatggag agcatccaag 1750tttagtgtca tgcaacccat cagatccact ccaaaaatgc tgtgactagg 1800catacactgt agtttttgaa aattatgcaa aagcagctaa atgtaactta 1850ttccaagtgc atttttctta taccaaagac tatttcaaaa tgtccagatg 1900taggggaaga gatgtttaca gtatgatgaa aataattttc caagtaaagt 1950atttccccta gttttttggg gggataggaa gaaagatttg ttactgtatt 2000tttttaacta cataaaaata gatcaataag gtgaactttt ttttgcgttt 2050ggtttacttg tctgtcaaat gtttccttaa acatgaaact gaataaggag 2100aagagtattt aagtcttcct taaatgactt ttcttaagta atgatactgt 2150gtgttttccc aaagcacttt taaaaaaatt tttataaatt gaatgtttgt 2200gatattaaat ttcaaatgca gaatacttga ctcatttaaa gctaaatttt 2250gttactgatt caattataaa acacaataaa aaatcctcaa cactaaaaaa 2300aaaaaaacaa accattaatt atgtatacat gtcatggact tgggggaaac 2350cagtactttg aatactctgc tcaacatagg tcacaagaca gttgtcactg 2400gagagcagat atgggagatc cagaaggatc aacttctata caatccagat 2450acttagccaa aatgattaag tgttccttaa aattaagttg aaaaaggaaa 2500tattctttct cataaaaatt tatatcttta tgtagcacta tctacagaaa 2550ttctgcaagt ttctgtttca aagcacaata actagtatga agtttgtgtg 2600
ttttgtacac ttagggatat atatatatag ctacattcac acactcacaa 2650
tttaaaaatg tcagcattgg cctctgtgta caaaccaaga gcttttacag 2700
atccagaatt tattagttta aaatgcattt aacacttaaa tttcttggca 2750
aattttaaaa cattttttag tctgtaatac actccacttg aagcacttac 2800
tatctgttga aaaggtgtcc ttttcctttc ttctagtatt ttttttctta 2850
ccaaaattca ctaatctttg taatggattt ttgactttgt aatggattct 2900
tttcatcaaa aagccttatt tttttatcta tgtggaa 2937<210> 14<211> 633<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 14
Met Ala His Leu Lys Arg Leu Val Lys Leu His Ile Lys Arg His15 10 15
Tyr His Lys Lys Phe Trp Lys Leu Gly Ala Val Ile Arg Met Glu20 25 30
Arg Asn Met Lys Asn Lys Asn Lys Met Leu Asp Leu Met Leu Glu35 40 45
Ala Val Asn Asn Ile Lys Asp Ala Met Tyr Tyr Thr Ala Ala Glu50 55 60
Leu Lys Pro Val Leu Asp Arg Pro Pro Gln Asp Ser Asn Ala Pro65 70 75
Gly Ala Ser Gly Lys Ala Asn Ala Phe Ala Ser Asp Arg Ile Ser80 85 90
Leu His Arg Asp Leu Gly Pro Asp Thr Arg Pro Pro Glu Cys Ile95 100 105
Glu Gln Lys Leu Leu Arg Thr Val His Ser Val Leu Tyr Ser Ser110 115 120
Pro Ala Ile Leu Leu Lys Glu Ile Ile Leu Val Asp Asp Ala Ser125 130 135
Gln Arg Glu Arg Lys Gly Leu Ile Thr Ala Arg Leu Leu Gly Ala140 145 150
Thr Val Ala Thr Ala Glu Thr Leu Thr Phe Leu Asp Val Val Ser155 160 165
Pro Asp Ile Ala Ser Ile Asp Leu Asn Thr Phe Glu Phe Asn Lys170 175 180
Pro Ser Pro Tyr Gly Ser Asn His Asn Lys Asp Glu Thr Tyr Pro185 190 195Ile Lys Thr Pro Thr Phe Ala Gly Gly Leu Phe Ser Ile Ser Lys200 205 210
Glu Tyr Phe Glu Tyr Ile Cys Gly Gly Gln Leu Glu Ile Met Pro215 220 225
Cys Ser Val Val Gly Asn Val Phe Arg Ser Lys Ser Pro Asn Ser230 235 240
Phe Pro Lys Phe Tyr Arg Arg Asn Thr Asp Ala Ala Lys Ile Val245 250 255
Lys Gln Lys Ala Phe Gly Asp Leu Ser Lys Arg Phe Glu Ile Lys260 265 270
Phe Phe Phe Ile Ile Val Leu Val Leu Met Gln Arg Glu Val Ser275 280 285
Val Gln Tyr Ser Lys Glu Glu Ser Pro Lys Met Gln Ile Gly Ala290 295 300
Pro Val Arg Gln Asn Ile Asp Ala Gly Glu Arg Pro Cys Leu Gln305 310 315
Gly Phe Lys Thr Thr Asn Leu Ser Val Glu Glu Gln Lys Glu Lys320 325 330
Glu Arg Gly Glu Ala Lys His Cys Phe Phe Lys Arg Cys Pro Pro335 340 345
Leu Pro Thr Thr Ser Val Ile Ile Val Phe His Asn Glu Ala Trp350 355 360
Ser Thr Val Asp Glu Tyr Leu His Asp Lys Leu Asp Glu Tyr Val365 370 375
Lys Gln Phe Ser Ile Val Lys Ile Val Arg Ala His Cys Glu Cys380 385 390
Phe Tyr Gly Trp Leu Glu Pro Leu Leu Ala Arg Ile Ala Glu Asn395 400 405
Tyr Thr Ala Arg Gly Asn Phe Asp Trp Ser Leu Ser Phe Gly Trp410 415 420
Glu Ser Leu Pro Asp His Glu Lys Gln Arg Arg Gly Ser Tyr Asp425 430 435
Glu Glu Met Glu Ile Trp Gly Gly Glu Asn Ile Glu Met Ser Pro440 445 450
Arg Val Trp Gln Gly Thr Gln Val Ile Ala Arg Asn Gln Val Arg455 460 465
Leu Ala Glu Val Trp Met Asp Glu Tyr Lys Glu Ile His Arg Leu470 475 480
Arg Cys Lys Asn Phe Thr Trp Tyr Leu Asn Asn Ile Tyr Pro Glu485 490 495Val Tyr Val Pro Asp Leu Asn Pro Val Ile Ser Gly Tyr Ile Lys
500 505 510
Ser Val Gly Gln Pro Leu Cys Leu Asp Val Gly Glu Asn Asn Gln
515 520 525
Gly Gly Glu Ile Arg His Asn Ile Gln Lys Glu Leu Cys Leu His
530 535 540
Ala Ala Gln Gly Leu Val Gln Leu Lys Ala Cys Thr Tyr Lys Phe
545 550 555
Leu Lys Met Cys Leu Ser Ala Asn Gly Glu His Pro Ser Leu Val
560 565 570
Ser Cys Asn Pro Ser Asp Pro Leu Gln Lys Trp Lys Pro Leu Ile
575 580 585
Met Tyr Thr Cys His Gly Leu Gly Gly Asn Gln Tyr Phe Glu Tyr
590 595 600
Ser Ala Gln His Gly His Lys Thr Val Val Thr Gly Glu Gln Ile
605 610 615
Trp Glu Ile Gln Lys Asp Gln Leu Leu Tyr Asn Pro Ile Leu Ser
620 625 630
Gln Asn Asp
<210> 15<211> 19<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<220>
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<210> 22<211> 59<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 22
Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn15 10 15
Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Ser Gly Thr20 25 30
Lys His Ser Gly Glu Ala Pro Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser35 40 45
Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro Cys Ser Leu Ser Gly Ile50 55
<210> 23<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 23
Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn15 10 15
Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Ser Gly Ile20 25 30
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<213> Homo sapiens<400> 24
Trp Glu His Ser Pro Leu Gly Glu Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn15 10 15
Thr Ala Cys Gln Cys Lys Pro Gly Thr Phe Arg Glu Ser20 25
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<213> Mus musculus<400> 25
Pro Glu Glu Ser Pro Ser Arg Gly Arg Cys Asn Ile Thr Thr Asn15 10 15
Thr Val Cys Arg Cys Lys Pro Gly Thr Phe Glu Thr Ala20 25
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Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn15 10 15
Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Gly Ser20 25
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Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn15 10 15
Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Asp Ser20 25
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acgctgctca ggaccattcg ctgcgtgtta aaccgcaccc 40
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<400> 29ctggtagcgg tcacataat 19

Claims (30)

1. MÉTODO PARA PREVER A SENSIBILIDADE DE UMAAMOSTRA DE CÉLULA OU TECIDO, de mamífero, para Apo2L/TRAIL,caracterizado pelo fato de que compreende etapas de:obtenção de uma amostra de célula ou tecido de mamífero;exame da amostra de célula ou tecido para detectar expressão deGalNac-T14, em que a expressão de dito GaINac-TI4 é preditiva de que ditaamostra de célula ou tecido é sensível à atividade de indução de apoptose deApo2L/TRAIL.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita expressão de GaINac-TI4 é examinada pela detecção daexpressão de mRNA de GalNac-T14.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita expressão de GaINac-TI4 é examinada porimunohistoquímica.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de exame da expressãodos receptores DR4, DR5, DcR1 ou DcR2 em dita amostra de célula ou tecido.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a amostra de célula ou tecido compreende células ou tecidoscancerígenos.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que ditas células cancerígenas são pancreáticas, de linfoma,câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de cólon, câncer coloretal,melanoma, ou células ou tecidos de condrosarcoma.
7. MÉTODO PARA INDUZIR APOPTOSE EM UMAAMOSTRA DE CÉLULA OU TECIDO, de mamífero caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:obtenção de uma amostra de célula ou tecido de mamífero;exame da amostra de célula ou tecido para detectar a expressãode GalNac-T14, esubseqüente à detecção da expressão de dito GaINac-TI4,exposição de dita amostra de célula ou tecido a uma quantidade eficaz doApo2L/TRAIL.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que dita expressão de GaINac-TI4 é examinada pelo teste paraexpressão de mRNA de GalNac-T14.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que dita expressão de GalNac-T14 é examinada porimunohistoquímica.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de exame da expressãodos receptores DR4, DR5, DcR1 ou DcR2 em dita amostra de célula ou tecido.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que dita amostra de célula ou tecido compreende células outecidos cancerígenos.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que ditas células cancerígenas são pancreáticas, de linfoma,câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de cólon, câncer coloretal,melanoma, ou células ou tecidos de condrosarcoma.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que ditas células são expostas a uma quantidade eficaz depolipeptídeo Apo2L/TRAIL que compreende os aminoácidos 114-281.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que dito polipeptídeo Apo2L/TRAIL está ligado a uma molécula depolietilenoglicol.
15. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA DISFUNÇÃO, emum mamífero tal como câncer ou uma disfunção imune relacionada,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:obtenção de uma amostra de célula ou tecido de dito mamífero;exame da amostra de célula ou tecido para detectar a expressãode GalNac-T14, esubseqüente à detecção da expressão de dito GaINac-TI4,administração a dito mamífero uma quantidade eficaz de Apo2L/TRAIL.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que dita expressão de GalNac-T14 é examinada pela detecção daexpressão de mRNA de GaINac-TI4.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que dita expressão de GalNac-T14 é examinada porimunohistoquímica.
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de exame da expressãodos receptores DR4, DR5, DcR1 ou DcR2 em dito tecido ou célula.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a amostra de célula ou tecido compreende células ou tecidoscancerígenos.
20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que ditas células ou tecidos cancerígenos são pancreáticos, delinfoma, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de cólon, câncercoloretal, melanoma, ou células ou tecidos de condrosarcoma.
21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que uma quantidade eficaz de polipeptídeo Apo2L/TRAIL quecompreende os aminoácidos 114-281 é administrada a dito mamífero.
22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que agente(s) quimioterático(s) ou radioterapia é tambémadministrada a dito mamífero.
23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que uma citocina, agente citotóxico ou agente inibidor docrescimento é também administrado a dito mamífero.
24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que dito polipeptídeo Apo2L/TRAIL está ligado a uma molécula depolietilenoglicol.
25. USO DE AP02L/TRAIL, caracterizado pelo fato de ser napreparação de um medicamento para tratamento de uma disfunção emmamífero, tal como disfunção imune relacionada ou câncer, em que adisfunção expressa GaINac-TI4.
26. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que dita expressão de GaINac-TI4 é examinada pela detecção daexpressão de mRNA de GaINac-TI4.
27. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que dita expressão de GaINac-TI 4 é examinada porimunohistoquímica.
28. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que compreende adicionalmente a etapa de exame da expressão dosreceptores DR4, DR5, DcR1 ou DcR2 em dito tecido ou célula.
29. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que o câncer é câncer de pâncreas, de linfoma, câncer de pulmão decélula não pequena, câncer de cólon, câncer coloretal, melanoma, ou célulasou tecidos de condrosarcoma.
30. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que dito polipeptídeo Apo2L/TRAIL está ligado a uma molécula depolietilenoglicol.
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