PT1450847E - Formulações de ligando de apo2/trail e suas utilizações - Google Patents

Formulações de ligando de apo2/trail e suas utilizações Download PDF

Info

Publication number
PT1450847E
PT1450847E PT02784443T PT02784443T PT1450847E PT 1450847 E PT1450847 E PT 1450847E PT 02784443 T PT02784443 T PT 02784443T PT 02784443 T PT02784443 T PT 02784443T PT 1450847 E PT1450847 E PT 1450847E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
formulation
apo2l
trail
quot
arginine
Prior art date
Application number
PT02784443T
Other languages
English (en)
Inventor
Heather Flores
Tanya P Lin
Timothy C Matthews
Zahra Shahrokh
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of PT1450847E publication Critical patent/PT1450847E/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/30—Zinc; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1682—Processes
    • A61K9/1688—Processes resulting in pure drug agglomerate optionally containing up to 5% of excipient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification

Description

ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Formulações de ligando de AP02/TRAIL e suas utilizações" O presente invento refere-se genericamente a formulações de Apo2L/TRAIL. Em particular, tais formulações de Apo2L/TRAIL incluem composições liofilizadas e cristalinas.
ANTECEDENTES DO INVENTO Várias moléculas, tais como o factor de necrose tumoral-alfa ("TNF-alfa"), factor de necrose tumoral-beta ("TNF-beta" ou "linfotoxina-alfa"), linfotoxina-beta ("LT-beta"), ligando de CD30, ligando de CD27, ligando de CD40, ligando de OX-40, ligando de 4-1BB, ligando de Apo-1 (também referido como ligando de Fas ou ligando de CD95), ligando de Apo-2 (também referido como Apo2L ou TRAIL), ligando de Apo-3 (também referido como TWEAK), APRIL, ligando de OPG (também referido como ligando de RANK, ODF ou TRANCE), e TALL-1 (também referido como BlyS, BAFF ou THANK) foram identificados como membros da família de citoquinas factores de necrose tumoral ("TNF") (Veja-se, p.ex., Gruss e Dower, Blood 85: 3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 83: 1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol. 17: 689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity 3: 673-682 (1995); Browning et al., Cell 72: 847-856 (1993);
Armitage et al., Nature 357: 80-82 (1992), WO 97/01633 publicado a 16 de Janeiro de 1997; WO 97/25428 publicado a 17 de Julho de 1997; Marsters et al., Curr. Biol. 8: 525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem. 272: 32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med. 188: 1185-1190 (1998); WO 98/28426 publicado a 2 de Julho de 1998; WO 98/46751 publicado a 22 de Outubro de 1998; WO/98/18921 publicado a 7 de Maio de 1998; Moore et al., Science 285: 260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol. 65: 680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med. 189: 1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274: 15978-15981 (1999)). Entre estas moléculas, foi relatado que TNF-alfa, TNF-beta, ligando de CD30, ligando de 4-1BB, ligando de Apo-1, ligando de Apo-2 (Apo2L/TRAIL) e ligando de Apo-3 (TWEAK) estão envolvidos em morte celular apoptótica. 2 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Apo2L/TRAIL foi identificado há vários anos como um membro da família de citoquinas TNF (ver, p.ex., Wiley et al., Immunity 3: 673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem. 271: 12697-12690 (1996)). O polipéptido Apo2L/TRAIL humano inteiro é uma proteína transmembranar de Tipo II com 281 aminoácidos de comprimento. Algumas células podem produzir uma forma solúvel natural do polipéptido, através de clivagem enzimática da região extracelular do polipéptido (Mariani et al., J. Cell. Biol. 137: 221-229 (1997)). Estudos cristalográficos de formas solúveis de Apo2L/TRAIL revelaram uma estrutura homotrimérica semelhante às estruturas de TNF e outras proteínas aparentadas (Hymowitz et al., Molec. Cell 4: 563-571 (1999) ; Hymowitz et al., Biochemistry 39: 633-644 (2000)).
Verificou-se, no entanto que Apo2L/TRAIL, ao contrário de outros membros da família TNF, tem uma característica estrutural única por três resíduos de cisteína (na posição 230 de cada subunidade no homotrímero) juntos coordenarem um átomo de zinco, e por a ligação de zinco ser importante para a estabilidade e actividade biológica do trímero. (Hymowitz et al., supra; Bodmer et al., J. Biol. Chem. 275: 20632-20637 (2000) ).
Foi relatado na literatura que Apo2L/TRAIL pode ter um papel na modulação do sistema imunitário, incluindo doenças auto-imunes tais como artrite reumatóide, e no tratamento de VIH (ver, p.ex., Thomas et al., J. Immunol. 161: 2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine 11: 664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med. 189: 1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med. 191: 1095-1103 (2000); Jeremias et al., Eur. J.
Immunol. 28: 143-152 (1998); Katsikis et al., J. Exp. Med. 186: 1365-1372 (1997); Miura et al., J. Exp. Med. 193: 651-660 (2001)).
Foi também relatado que formas solúveis de Apo2L/TRAIL induzem apoptose numa variedade de células de cancro in vitro, incluindo tumores do cólon, pulmão, mama, próstata, bexiga, rim, ovário e cérebro, bem como melanoma, leucemia, e mieloma múltiplo (ver, p.ex., Wiley et al., supra; Pitti et al., supra; Rieger et al., FEBS Letters 427: 124-128 (1998);
Ashkenazi et al., J. Clin. Invest. 104: 155-162 (1999);
Walczak et al., Nature Med. 5: 157-163 (1999); Keane et al., Câncer Research 59: 734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. 3 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ Câncer Res. 5: 2605-2612 (1999); Gazitt, Leucemia 13: 1817-1824 (1999); Yu et al., Câncer Res. 60: 2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 1754-1759 (2000)). Estudos in vivo em modelos de tumor de murídeo sugerem ainda que Apo2L/TRAIL, sozinho ou em combinação com quimioterapia ou terapia de radiação, pode exercer substanciais efeitos anti-tumorais (ver, p.ex., Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra; Gliniak et al., Câncer Res. 59: 6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., supra; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 265: 1999 (1999)). Em contraste com muitos tipos de células de cancro, a maioria dos tipos celulares humanos normais parece ser resistente à indução de apoptose através de certas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra). Jo et al. relataram que uma forma solúvel de Apo2L/TRAIL marcada com poli-histidina induziu apoptose in vitro em hepatócitos isolados normais humanos mas não em não humanos (Jo et al., Nature Med. 6: 564-567 (2000); ver também, Nagata, Nature Med. 6: 502-503 (2000)). Crê-se que certas preparações de Apo2L/TRAIL recombinante podem variar em termos de propriedades bioquímicas e actividades biológicas em células doentes versus normais, dependendo, por exemplo, da presença ou ausência de uma molécula marcadora, do teor de zinco, e da % do teor de trímero (ver, Lawrence et al., Nature Med., Carta ao Editor, 7: 383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Carta ao Editor, 7: 385-386 (2001)).
Crê-se que a indução de várias respostas celulares mediadas por tais citoquinas da família TNF seja iniciada através da sua ligação a receptores celulares específicos. Previamente, foram identificados dois receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFRl) e 75 kDa (TNFR2) (Hohman et al., J. Biol. Chem. 264: 14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 87: 3127-3131 (1990); EP 417563, publicada a 20 de Março de 1991; Loetscher et al., Cell 61: 351 (1990); Schall et al., Cell 61: 361 (1990); Smith et al., Science 248: 1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol. 11: 3020-3026 (1991)). Verificou-se que esses TNFR partilham uma estrutura típica de receptores da superfície celular incluindo as regiões extracelulares, transmembranares e intracelulares. As porções extracelulares de ambos os 4 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ receptores foram verificadas naturalmente também como proteínas solúveis de ligação a TNF (Nophar, Y. et al., EMBO J. 9: 3269 (1990); e Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87: 8331 (1990); Hale et al., J. Cell. Biochem.
Suplemento 15F, 1991, pág. 113 (P424)).
A porção extracelular dos TNFR de tipo 1 e tipo 2 (TNFR1 e TNFR2) contém um padrão repetitivo na sequência de aminoácidos de quatro domínios ricos em cisteína (CRD) designados 1 a 4, a começar no terminal NH2. (Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra; Banner et al., Cell 73: 431-435 (1993)). Existe um padrão repetitivo de CRD semelhante em várias outras proteínas da superfície celular, incluindo o receptor do factor de crescimento dos nervos (NGFR) p75 (Johnson et al., Cell 47: 545 (1986); Radeke et al., Nature 325: 593 (1987)), o antigénio de células B CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 14.03 (1989)), o antigénio de células T 0X40 (Mallet et al., EMBO J. 9: 1063 (1990)) e o antigénio Fas (Yonehara et al., supra e Itoh et al., Cell 66: 233-243 (1991)) . São também verificadas CRD nas proteínas T2 semelhantes a TNFR (sTNFR) solúveis dos poxvírus de Shope e mixoma (Upton et al., Virology 160: 20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176: 335 (1991); Upton et al., Virology 184: 370 (1991)). O alinhamento óptimo destas sequências indica que as posições dos resíduos de cisteína são bem conservadas. Estes receptores são por vezes colectivamente referidos como membros da superfamília de receptores de TNF/NGF.
Os ligandos da família TNF identificado até à data, com excepção da linfotoxina-beta, são tipicamente proteínas transmembranares de tipo II, cujo terminal C é extracelular. Em contraste, a maioria dos receptores na família de receptores de TNF (TNFR) identificados até à data são tipicamente proteínas transmembranares de tipo I. Em ambas as famílias de ligandos e de receptores de TNF, no entanto, a homologia identificada entre os membros da família tem sido verificada principalmente no domínio extracelular ("DEC") . Várias das citoquinas da família TNF, incluindo TNF-alfa, ligando de Apo-1 e ligando de CD40, são clivadas proteoliticamente na superfície celular; a proteína resultante 5 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ em cada caso forma tipicamente uma molécula homotrimérica que funciona como citoquina solúvel. As proteínas da família dos receptores de TNF são habitualmente clivadas proteoliticamente para libertar DEC do receptor solúveis que podem funcionar como inibidores das citoquinas cognatas.
Pan et al. divulgaram outro membro da família de receptores de TNF referido como "DR4" (Pan et al., Science 276: 111-113 (1997); ver também W098/32856 publicado a 30 de Julho de 1998) . Foi relatado que o DR4 contém um domínio de morte citoplasmático capaz de se envolver no aparelho de suicídio celular. Pan et al. divulgam que se crê que DR4 seja um receptor para o ligando conhecido como Apo2L/TRAIL.
Em Sheridan et al., Science 277: 818-821 (1997) e Pan et al., Science 277: 815-818 (1997), é descrita outra molécula que se crê ser um receptor para Apo2L/TRAIL (ver também, W098/51793 publicado a 19 de Novembro de 1998; W098/41629 publicado a 24 de Setembro de 1998) . Tal molécula é referida como DR5 (foi também alternativamente referida como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 ou KILLER (Screaton et al., Curr. Biol. 7: 693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J.
16: 5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics 17: 141-143 (1997); WO 98/35986 publicado a 20 de Agosto de 1998; EP 870827 publicado a 14 de Outubro de 1998; WO 98/46643 publicado a 22 de Outubro de 1998; WO 99/02653 publicado a 21 de Janeiro de 1999; WO 99/09165 publicado a 25 de Fevereiro de 1999; WO 99/1179 publicado a 11 de Março de 1999) . Está relatado que tal como DR4, DR5 contém um domínio de morte citoplasmático e é capaz de sinalizar apoptose. A estrutura cristalina do complexo formado entre Apo-2L/TRAIL e DR5 está descrita em Hymowitz et al., Molecular Cell 4: 563-571, (1999).
Outro grupo de receptores recentemente identificados é referido como "receptores chamariz", que se crê funcionarem como inibidores, em vez de transdutores de sinalização. Este grupo inclui DCR1 (também referido como TRID, LIT ou TRAIL-R3) (Pan et al., Science 276: 111-113 (1997); Sheridan et al.,
Science 277: 818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem. 272: 25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters 416: 329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med. 186: 1165- 6 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 1170 (1997); e Mongkolsapaya et al., J. Immunol. 160: 3-6 (1998)) e DCR2 (também designado TRUNDD ou TRAIL-R4) (Marsters et al.r Curr. Biol. 7: 1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters 424: 41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity 7: 813-820 (1997)), ambas moléculas da superfície celular, bem como OPG (Simonet et al., supra; Emery et al., infra) e DCR3 (Pitti et al., Nature 396: 699-703, 1998), ambas as quais são proteínas solúveis segregadas. Foi relatado que Apo2L/TRAIL se liga aos receptores referidos como DcRl, DcR2 e OPG.
Crê-se que Apo2L/TRAIL actue através dos "receptores de morte" da superfície celular DR4 e DR5 para activar caspases, ou enzimas que possuem o programa de morte celular. Após ligação do ligando, tanto DR4 como DR5 podem desencadear apoptose independentemente através do recrutamento e activação do iniciador de apoptose, caspase-8, através da molécula adaptadora contendo o domínio de morte referida como FADD/Mortl (Kischkel et al., Immunity 12: 611-620 (2000); Sprick et al., Immunity 12: 599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol. 2: 241-243 (2000)). Em contraste com DR4 e DR5, os receptores DcRl e DcR2 não sinalizam apoptose.
Para uma revisão da família de citoquinas TNF e dos seus receptores, ver Ashkenazi e Dixit, Science 281: 1305-1308 (1998); Golstein, Curr. Biol. 7: 750-753 (1997); Gruss e Dower, supra e Nagata, Cell 88: 355-365 (1997); Locksley et al., Cell 104: 487-501 (2001).
SUMÁRIO DO INVENTO
Certas proteínas, tais como Apo2L/TRAIL e outros membros da família de citoquinas TNF, exibem actividade biológica quando a proteína está numa forma de trímero ou trimérica. Assim, para fins de utilização terapêutica ou mesmo de diagnóstico, são desejadas formulações de tais proteínas em que a proteína é estável e permanece biologicamente activa, particularmente estável numa forma trimérica. Os requerentes verificaram que certos componentes de formulação ou "excipientes", podem proporcionar estabilidade a tais proteínas como Apo2L/TRAIL e aumentar a solubilidade (i.e., para reduzir a agregação ou precipitação da proteína). Os requerentes também verificaram surpreendentemente que, sob 7 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ certas condições, Apo2L/TRAIL pode facilmente cristalizar. Tais formas cristalinas de Apo2L/TRAIL podem ser úteis na preparação de formulações de suspensão de Apo2L/TRAIL e/ou proporcionam um processo eficaz e eficiente para purificação da proteína.
Concordantemente, o presente invento proporciona formulações estáveis compreendendo Apo2L/TRAIL e um ou mais excipientes que proporcionam suficiente força iónica para aumentar a solubilidade e/ou estabilidade do Apo2L/TRAIL, em que a composição tem um pH de 6 (ou cerca de 6) a 9 (ou cerca de 9) . Nas formulações reivindicadas, o excipiente ou excipientes proporcionando suficiente força iónica é um sal de arginina ou sal sulfato. Numa concretização, as composições podem ainda compreender um tampão. Opcionalmente, a concentração da proteína Apo2L/TRAIL na composição é de cerca de 1 a cerca de 100 mg/ml, cerca de 1 a cerca de 20 mg/ml, cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml, ou cerca de 20 mg/ml. As composições do invento podem compreender formulações líquidas ou formulações liofilizadas. As composições podem também compreender formulações de suspensão nas quais a proteína Apo2L/TRAIL está na forma de cristais. Opcionalmente, pode ser desejável incluir um ou mais tensioactivos na composição. Tais tensioactivos podem, por exemplo, compreender um polissorbato ou poloxâmero. Formulações particularmente desejadas são aquelas nas quais o excipiente ou excipientes proporcionam um teor optimizado do trímero de Apo2L/TRAIL e minimizam a quantidade de dímero de Apo2L/TRAIL ou a formação de agregados. Opcionalmente, as formulações contêm não mais de 10% de dímero de Apo2L/TRAIL ou 5% de agregados de Apo2L/TRAIL (da quantidade total de proteína Apo2L/TRAIL na formulação).
Em concretizações opcionais, o presente invento proporciona composições compreendendo cerca de 1 a cerca de 20 mg/ml de Apo2L/TRAIL e sal de arginina, em que a composição tem um pH de cerca de 6,5 a cerca de 8,5. Opcionalmente, as composições compreendem ainda um tampão tal como Tris e um tensioactivo tal como polissorbato. Opcionalmente, a proteína Apo2L/TRAIL não inclui (i.e., não está ligada nem fundida a) qualquer molécula ou moléculas de marcador epitópico ou molécula ou moléculas de fecho de leucina. 8 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ Ο presente invento proporciona composições compreendendo cerca de 1 a cerca de 20 mg/ml de Apo2L/TRAIL, sal de arginina cerca de 0,4 a cerca de 0,5 M, e tampão, em que as composições têm um pH de cerca de 7 a cerca de 7,5. A proteína Apo2L/TRAIL pode ser proteína Apo2L/TRAIL humana compreendendo os resíduos de aminoácidos 114 a 281 da Figura 1. Opcionalmente, a proteína Apo2L/TRAIL é expressa de forma recombinante em células hospedeiras tais como E. coli.
Adicionalmente, o invento proporciona métodos para preparação das composições descritas acima. Nos métodos, as composições são preparadas através de mistura ou combinação de Apo2L/TRAIL e um ou mais excipientes que proporcionem suficiente força iónica para aumentar a solubilidade e/ou estabilidade da Apo2L/TRAIL, em que a composição tem um pH de 6 (ou cerca de 6) a 9 (ou cerca de 9) . Nas formulações, o excipiente ou excipientes proporcionando suficiente força iónica é um sal de arginina ou sal sulfato. Pode também ser incluído um tampão para manter o pH da composição, e opcionalmente para manter o pH a cerca de 6,5 a cerca de 7,5. Opcionalmente, a concentração da proteína Apo2L/TRAIL na formulação é de cerca de 1 a cerca de 100 mg/ml, cerca de 1 a cerca de 20 mg/ml, cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml, ou pelo menos 20 mg/ml. Em concretizações particularmente desejáveis, as composições resultantes são formulações farmaceuticamente aceitáveis.
Em concretizações adicionais, o invento proporciona estojos compreendendo: a) um recipiente compreendendo uma composição de Apo2L/TRAIL aqui descrita e b) instruções para utilizar a composição de Apo2L/TRAIL; tal como para utilização da composição para tratar um distúrbio contra o qual a composição é eficaz. Opcionalmente, o distúrbio é cancro e mais particularmente é um cancro da mama, do pulmão ou do cólon (ou colorrectal).
Ainda noutros aspectos, o invento proporciona as formulações reivindicadas para utilização no tratamento de um distúrbio, tal como cancro ou um distúrbio relacionado com o sistema imunitário. 9 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Em concretizações mais particulares do invento é proporcionado o seguinte:
Uma formulação estável de ligando de Apo-2, compreendendo ligando de Apo-2 e cerca de 0,2 Ma cerca de 0,5 M de sal, em que a referida formulação tem um pH de cerca de 6 a cerca de 9. Opcionalmente, o sal é um sal de arginina ou sulfato de sódio. Opcionalmente, a concentração do sal de arginina na formulação é de cerca de 0,4 Ma cerca de 0,5 Μ. O sal de arginina pode incluir succinato de arginina, sulfato de arginina, maleato de arginina, citrato de arginina, tartarato de arginina, ou fosfato de arginina. O ligando de Apo-2 pode compreender opcionalmente proteína cristalizada. A formulação pode compreender uma formulação liofilizada ou em suspensão. Opcionalmente, o pH da formulação é de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, e opcionalmente, de cerca de 7 a cerca de 7,5. Opcionalmente, a formulação compreende ainda um tensioactivo, tal como um polissorbato ou poloxâmero. Opcionalmente, a concentração do tensioactivo na formulação é de cerca de 0,005% a cerca de 0,2%. Opcionalmente, a formulação compreende ainda tampão, tal como tampão Tris ou Hepes. Opcionalmente, a formulação compreende ainda um ou mais iões metálicos bivalentes ou um conservante. Opcionalmente, a formulação é estável em armazenamento durante pelo menos 12 meses.
Uma formulação estável liofilizada de ligando de Apo-2, compreendendo de cerca de 1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de ligando de Apo-2, sal de arginina cerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M, tampão, e tensioactivo, em que a referida formulação tem um pH de cerca de 6 a cerca de 9. Opcionalmente, o sal de arginina é succinato de arginina, e a concentração do succinato de arginina pode ser de cerca de 0,4 Ma cerca de 0,5 M. Opcionalmente, o tampão é tampão Tris, e o tensioactivo é um polissorbato. Opcionalmente, a formulação compreende ainda um ou mais iões metálicos bivalentes.
Uma formulação estável do ligando de Apo-2, compreendendo de cerca de 1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de ligando de Apo-2, sulfato de sódio de cerca de 0,2 Ma cerca de 0,5 M, tampão, e tensioactivo, em que o referido ligando de Apo-2 compreende proteína cristalizada e a referida formulação tem um pH de cerca de 6 a cerca de 9. Opcionalmente, o tampão é tampão 10 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Tris. Opcionalmente, ο tensioactivo é polissorbato, e o pH é de cerca de 7 a cerca de 7,5.
Um método de produção de uma formulação estável de ligando de Apo-2, compreendendo os passos de (a) proporcionar de cerca de 1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de ligando de Apo-2, sal de arginina ou sulfato de sódio de cerca de 0,2 Ma cerca de 0,5 M, tampão, e tensioactivo, (b) combinação ou mistura dos ingredientes do passo (a) para produzir uma formulação, e (c) ajuste do pH da formulação do passo (b) a de cerca de 6 a cerca de 9. Opcionalmente, o sal de arginina é succinato de arginina, e a concentração do succinato de arginina é de cerca de 0,4 Ma cerca de 0,5 M. Opcionalmente, o tampão é tampão Tris, e o tensioactivo é um polissorbato.
Um dispositivo para administração de uma formulação de ligando de Apo-2 a um mamífero, compreendendo um recipiente contendo pelo menos uma unidade de dosagem das formulações de ligando de Apo-2 aqui descritas. Opcionalmente, o dispositivo é um dispositivo injector em caneta, e o recipiente é um cartucho.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona um método in vitro de indução de apoptose em células de mamífero, compreendendo a exposição de células de mamífero a uma quantidade eficaz de uma formulação de ligando de Apo-2. As células de mamífero podem ser células de cancro.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a sequência nucleotídica do ADNc de Apo-2L/TRAIL humana (SEQ ID NO:2) e a sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:l). O "N" na posição nucleotídica 447 (em SEQ ID NO:2) é utilizado para indicar que a base nucleotídica pode ser "T" ou "G". A Figura 2 mostra dados (% de trímero restante e % do pico principal de IEX restante) para várias formulações de Apo2L/TRAIL após 1 semana de armazenamento a 30°C. 11 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ A Figura 3Α mostra dados (% de trímero restante e % do pico principal de IEX restante) para várias formulações de Apo2L/TRAIL após 4 meses de armazenamento a 40°C. A Figura 3B mostra dados (% de trimero restante, % de monómero, e % do pico principal de IEX restante) para várias formulações de Apo2L/TRAIL após 1 mês de armazenamento a 50°C. A Figura 3C mostra um gráfico de Arrhenius preditivo do prazo de validade para a formulação de Apo2L/TRAIL descrita.
As Figuras 4A-4B mostram gráficos da % de bioactividade e % de trimero de duas formulações diferentes a pH variável. A Figura 5 ilustra a estrutura de Apo2L/TRAIL e a coordenação da estrutura através de uma molécula de zinco intrínseca. A Figura 6 mostra os efeitos de concentrações variáveis de polissorbato na estabilidade de uma formulação de Apo2L/TRAIL. A Figura 7 mostra os efeitos de concentrações variáveis de zinco na estabilidade de uma formulação de Apo2L/TRAIL. A Figura 8 mostra a solubilidade em equilíbrio e a cristalização de Apo2L/TRAlL numa formulação de sulfato de sódio. A Figura 9 mostra a solubilidade em equilíbrio e a cristalização de Apo2L/TRAIL em várias concentrações de sal. A Figura 10A mostra os efeitos das velocidades de agitação na cristalização de Apo2L/TRAIL. A Figura 10B mostra o perfil de dissolução de cristais de Apo2L/TRAlL sob agitação. A Figura 10C mostra os efeitos da velocidade de agitação na distribuição dos tamanhos dos cristais de Apo2L/TRAIL. 12 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ A Figura 11Α mostra ο perfil de ΙΕΧ da Apo2L/TRAIL após reconstituição de cristais secos em vácuo. A Figura 11B mostra a bioactividade da Apo2L/TRAIL após reconstituição dos cristais secos em vácuo. A Figura 12 mostra um gráfico de Arrhenius preditivo do prazo de validade para a formulação de Apo2L/TRAIL descrita.
A Figura 13 mostra um gel de coloração de prata de SDS-PAGE ilustrando a pureza das preparações de Apo2L/TRAIL descritas. A Figura 14 mostra os efeitos de vários sais na cristalização de Apo2L/TRAIL. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO A. Definições "Membro da família TNF" é utilizado num sentido amplo para referir vários polipéptidos que partilham alguma semelhança com o factor de necrose tumoral (TNF) em relação à estrutura ou função. Certas características estruturais e funcionais associadas à família de polipéptidos TNF são conhecidas na arte e estão descritas, por exemplo, em Antecedentes do Invento acima. Tais polipéptidos incluem mas não se limitam aos polipéptidos referidos na arte como TNF-alfa, TNF-beta, ligando de CD40, ligando de CD30, ligando de CD27, ligando de OX-40, ligando de 4-1BB, ligando de Apo-1 (também referido como ligando de Fas ou ligando de CD95), Apo-2L/TRAIL (também referido como TRAIL), ligando de Apo-3 (também referido como TWEAK), APRIL, ligando de OPG (também referido como ligando de RANK, ODF, ou TRANCE), e TALL-1 (também referido como BlyS, BAFF ou THANK) (ver, p.ex., Gruss e Dower, Blood 85: 3378-3404 (1995); Pitti et al., J. Biol.
Chem. 271: 12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity 3: 673— 682 (1995); Browning et al., Cell 72: 847-856 (1993); Armitage et al., Nature 357: 80-82 (1992), Publicações PCT Nos. WO 97/01633; e WO 97/25428; Marsters et al., Curr. Biol. 8: 525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem. 272: 32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med. 188: 1185-1190 13 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ (1998); Publicações PCT Nos. WO 98/28426; WO 98/46751; e WO 98/18921; Moore et al., Science 285: 260-263 (1999); Shu et ai., J. Leukocyte Biol. 65: 680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med. 189: 1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274: 15978-15981 (1999)).
Os termos "Apo2L/TRAIL", "Apo2L", "ligando de Apo-2" e "TRAIL" são aqui utilizados para referir uma sequência polipeptidica que inclui os resíduos de aminoácidos 114-281, inclusive, 95-281, inclusive, resíduos 92-281, inclusive, resíduos 91-281, inclusive, resíduos 41-281, inclusive, resíduos 15-281, inclusive, ou resíduos 1-281, inclusive, da sequência de aminoácidos mostrada na Figura 1 (SEQ ID NO:l), bem como fragmentos biologicamente activos, variantes de deleção, inserção ou substituição das sequências de cima. Numa concretização, a sequência polipeptidica compreende os resíduos 114-281 da Figura 1 (SEQ ID NO:l), e opcionalmente, consiste nos resíduos 114-281 da Figura 1 (SEQ ID NO:l). Opcionalmente, a sequência polipeptidica compreende os resíduos 92-281 ou os resíduos 91-281 da Figura 1 (SEQ ID NO:l). Os polipéptidos Apo-2L podem ser codificados através da sequência nucleotídica nativa mostrada na Figura 1 (SEQ ID NO:2). Opcionalmente, o codão que codifica o resíduo Proll9 (Figura 1; SEQ ID NO:2) pode ser "CCT" ou "CCG". Noutras concretizações, os fragmentos ou variantes são biologicamente activos e têm pelo menos cerca de 80% de identidade da sequência de aminoácidos, de maior preferência pelo menos cerca de 90% de identidade da sequência, e de preferência ainda, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade da sequência com qualquer uma das sequências de Apo2L/TRAIL acima citadas. Opcionalmente, o polipéptido Apo2L/TRAIL é codificado por uma sequência nucleotídica que híbrida sob condições rigorosas com a sequência polinucleotídica codificadora proporcionada na Figura 1 (SEQ ID NO:2). A definição engloba variantes de substituição de Apo2L/TRAIL nas quais pelo menos um dos seus aminoácidos nativos é substituído por um resíduo de alanina. Variantes de substituição particulares do Apo2L/TRAIL incluem aquelas em que pelo menos um aminoácido é substituído por um resíduo de alanina. Estas variantes de substituição incluem as identificadas, por exemplo, como "D203A"; "D218A" e "D269A." Esta nomenclatura é utilizada para identificar variantes de Apo2L/TRAIL em que os resíduos de 14 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ ácido aspártico nas posições 203, 218, e/ou 269 (utilizando a numeração mostrada na Figura 1 (SEQ ID NO:l)) são substituídos por resíduos de alanina. Opcionalmente, as variantes de Apo2L podem compreender uma ou mais das substituições de alanina que são citadas na Tabela I do pedido PCT publicado WO 01/00832. As variantes de substituição incluem uma ou mais das substituições de resíduos identificadas na Tabela I de WO 01/00832 publicado a 4 de Janeiro de 2001. A definição engloba também um Apo2L/TRAIL de sequência nativa isolado a partir de uma fonte de Apo2L/TRAIL ou preparado através de métodos recombinantes ou sintéticos. O Apo2L/TRAIL do invento inclui os polipéptidos referidos como Apo2L/TRAIL ou TRAIL divulgados nas Publicações PCT Nos. WO97/01633 e W097/25428. Os termos "Apo2L/TRAIL" ou "Apo2L" são utilizados para referir geralmente formas do Apo2L/TRAIL que incluem formas monoméricas, diméricas ou triméricas do polipéptido. Toda a numeração de resíduos de aminoácidos referida na sequência de Apo2L utiliza a numeração de acordo com a Figura 1 (SEQ ID NO:l), a menos que especificamente afirmado de outro modo. Por exemplo, "D203" ou "Asp203" refere-se ao resíduo de ácido aspártico na posição 203 na sequência proporcionada na Figura 1 (SEQ ID NO:l). O termo "domínio extracelular de Apo2L/TRAIL" ou "DEC de Apo2L/TRAIL" refere-se a uma forma de Apo2L/TRAIL que é essencialmente livre dos domínios transmembranares e citoplasmáticos. Vulgarmente, o DEC terá menos de cerca de 1% de tais domínios transmembranares e citoplasmáticos, e de preferência, terá menos de cerca de 0,5% de tais domínios. Será entendido que qualquer domínio ou domínios transmembranares identificados para os polipéptidos do presente invento são identificados segundo critérios rotineiramente empregues na arte para identificação desse tipo de domínio hidrófobo. Os limites exactos de um domínio transmembranar podem variar mas muito provavelmente em não mais de cerca de 5 aminoácidos em cada uma das extremidades do domínio tal como inicialmente identificado. Em concretizações preferidas, o DEC consistirá numa sequência do domínio extracelular solúvel do polipéptido que está livre dos domínios transmembranares e citoplasmáticos ou intracelulares (e não está ligado à membrana). Sequências do domínio 15 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ extracelular particulares de Apo-2L/TRAIL são descritas nas Publicações PCT Nos. WO97/01633 e W097/25428. O termo "monómero de Apo2L/TRAIL" ou "monómero de Apo2L" refere-se a uma cadeia covalente de uma sequência do domínio extracelular de Apo2L. O termo "dímero de Apo2L/TRAIL" ou "dímero de Apo2L" refere-se a dois monómeros de Apo-2L unidos numa ligação covalente através de uma ligação dissulfureto. O termo tal como aqui se utiliza inclui dímeros de Apo2L de permanência livre e dímeros de Apo2L que estão dentro de formas triméricas de Apo2L (i.e., associado a um outro terceiro monómero de Apo2L). O termo "trímero de Apo2L/TRAIL" ou "trímero de Apo2L" refere-se a três monómeros de Apo2L que não estão covalentemente associados. O termo "agregado de Apo2L/TRAIL" é utilizado para referir formas oligoméricas superiores de Apo2L/TRAIL auto-associadas, tais como trímeros de Apo2L/TRAIL, que formam, por exemplo, formas hexaméricas e nanoméricas de Apo2L/TRAIL. A determinação da presença e quantidade de monómero, dímero ou trímero de Apo2L/TRAIL (ou outros agregados) pode ser feita utilizando métodos e ensaios conhecidos na arte (e utilizando materiais comercialmente disponíveis), tais como HPLC de exclusão de tamanho nativa ("SEC"), exclusão de tamanho desnaturante utilizando dodecilsulfato de sódio ("SDS-SEC"), HPLC de fase reversa, electroforese capilar, e incluindo os métodos descritos com mais detalhe nos Exemplos abaixo.
O termo "marcado" quando aqui utilizado refere-se a um polipéptido quimérico compreendendo Apo2L/TRAIL, ou uma porção deste, fundido com um "polipéptido marcador". O polipéptido marcador tem resíduos suficientes para proporcionar um epítopo contra o qual pode ser produzido um anticorpo ou proporciona alguma outra função, tal como quelação de iões metálicos, contudo é suficientemente curto para que geralmente não interfira com a actividade da citoquina da família TNF. O 16 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ polipéptido marcador é de preferência também razoavelmente único para que o anticorpo especifico para o marcador não reaja substancialmente com outros epitopos. Tais polipéptidos marcadores têm geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácidos e habitualmente entre cerca de 8 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos (de preferência, entre cerca de 10 a cerca de 20 resíduos). O termo "ião metálico bivalente" refere-se a um ião metálico possuindo duas cargas positivas. Exemplos de iões metálicos bivalentes incluem mas não se limitam a zinco, cobalto, níquel, cádmio, magnésio e manganésio. Formas particulares de tais metais que podem ser empregues incluem formas de sal (p.ex., formas de sais farmaceuticamente aceitáveis), tais como cloreto, acetato, carbonato, citrato e sulfato dos iões metálicos bivalentes acima mencionados. Opcionalmente, um ião metálico bivalente para utilizar no presente invento é zinco, e de preferência, a forma de sal, sulfato de zinco ou cloreto de zinco. "Isolada", quando utilizado para descrever as várias proteínas aqui divulgadas, significa proteína que foi identificada e separada e/ou recuperada de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam tipicamente com as utilizações de diagnóstico ou terapêuticas da proteína e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, a proteína será tipicamente purificada (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório ou (2) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras utilizando coloração de azul de Coomassie ou, de preferência, de prata, ou (3) até à homogeneidade através de técnicas de espectroscopia de massa ou de mapeamento de péptidos. A proteína isolada inclui a proteína in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural da Apo2L/TRAIL não estará presente. Vulgarmente, no entanto, a proteína isolada será preparada através de pelo menos um passo de purificação. 17 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Uma molécula de ácido nucleico de Apo2L/TRAIL "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está vulgarmente associada na fonte natural do ácido nucleico de Apo2L/TRAIL. Uma molécula de ácido nucleico de Apo2L/TRAIL isolada está numa forma ou disposição diferente da qual se verifica na natureza. As moléculas de ácido nucleico de Apo2L/TRAIL isoladas são portanto distintas da molécula de ácido nucleico de Apo2L/TRAIL tal como existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico de Apo2L/TRAIL isolada inclui moléculas de ácido nucleico de Apo2L/TRAIL contidas em células que vulgarmente expressam Apo2L/TRAIL onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente da das células naturais. A "percentagem (%) de identidade da sequência de aminoácidos" em relação às sequências aqui identificadas é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de Apo-2L/TRAIL, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a percentagem máxima de identidade da sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser alcançado de vários modos que estão dentro da perícia na arte. Os peritos na arte podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo a atribuição dos algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo das sequências inteiras a comparar. Para os fins daqui, os valores da percentagem de identidade de aminoácidos podem ser obtidos através da utilização do programa de computador de comparação de sequências, ALIGN-2, que é da autoria de Genentech, Inc. e cujo código-fonte foi apresentado com documentação do utilizador em U.S. Copyright Office, Washington, DC, 20559, onde está registado sob o N.° de Registo U.S. Copyright TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível ao público através de Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos os parâmetros de comparação de sequências são regulados pelo programa ALIGN-2 e não variam. 18 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ Ο "rigor" das reacções de hibridação é facilmente determinável por um vulgar perito na arte e é geralmente um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, da temperatura de lavagem e da concentração de sais. Em geral, sondas maiores requerem temperaturas mais elevadas para uma ligação correcta, enquanto sondas mais curtas necessitam de temperaturas inferiores. A hibridação depende geralmente da capacidade do ADN desnaturado para se re-ligar quando estão presentes cadeias complementares num ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto mais elevado o grau de identidade desejado entre a sonda e a sequência hibridável, mais elevada a temperatura relativa que pode ser utilizada. Como resultado, temperaturas relativas mais elevadas tenderão a tornar as condições reaccionais mais rigorosas, enquanto que temperaturas inferiores as reduzem. Para detalhes adicionais e explicação do rigor das reacções de hibridação, ver Ausubel et ai., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience Publishers, (1995). "Condições de elevado rigor", tal como aqui definidas, podem ser identificadas por aqueles que: (1) empregam baixa força iónica e elevada temperatura para lavagem; cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecilsulfato de sódio a 0,1% a 50°C; (2) empregam durante a hibridação um agente desnaturante; formamida a 50% (v/v) com albumina de soro bovino a 0,1%/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C; ou (3) empregam formamida a 50%, SSC 5X (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M) , fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, solução de Denhardt 5X, ADN de esperma de salmão sujeito a ultra-sons (50 pg/ml) , SDS a 0,1%, e sulfato de dextrano a 10% a 42°C, com lavagens a 42°C em SSC 0,2χ (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50% a 55°C, seguido de uma lavagem de elevado rigor consistindo em SSC 0,1χ contendo EDTA a 55°C. "Condições moderadamente rigorosas", podem ser identificadas tal como descrito por Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem incubação de um dia para o outro a 37°C numa solução compreendendo: formamida a 20%, 19 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ SSC 5χ (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5χ, sulfato de dextrano a 10% e 20 mg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado desnaturado, seguido de lavagem dos filtros em SSC lx a cerca de 37-50 °C. O perito na arte reconhecerá como ajustar a temperatura, a força iónica, etc. consoante necessário para acomodar factores tais como o comprimento da sonda e semelhantes. O termo "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilaçâo e estimuladores. O ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, ADN para uma pré-sequência ou lider de secreção está operativamente ligado a ADN para um polipéptido se for expresso como uma pré-proteina que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou estimulador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a permitir a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a ligar são contíguas e, no caso de um líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os estimuladores não têm de ser contíguos. A ligação é alcançada através da ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existirem, são utilizados os adaptadores ou ligadores oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional. O termo "estável em armazenamento" é utilizado para descrever uma formulação possuindo um prazo de validade aceitável para um produto na cadeia de distribuição comercial, por exemplo, pelo menos 12 meses a uma dada temperatura e de preferência pelo menos 24 meses a uma dada temperatura. 20 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Opcionalmente, uma tal formulação estável em armazém não contém mais de 5% de agregados, não mais de 10% de dímeros, e/ou alterações mínimas na heterogeneidade de cargas ou actividade biológica.
Tal como aqui se utiliza, "solúvel" refere-se a polipéptidos que, quando em soluções aquosas, são completamente dissolvidos, resultando numa solução transparente a ligeiramente opalescente sem partículas visíveis, tal como avaliado através de inspecção visual. Outro ensaio da turbidez da solução (ou solubilidade da proteína) pode ser feito através da medição das absorvâncias de UV a 340 nm a 360 nm com uma célula com um comprimento de via de 1 cm onde a turbidez a 20 mg/ml é inferior a 0,05 unidades de absorvância.
Um "osmólito" refere-se a um modificador da tonicidade ou ajustador osmótico que confere osmolalidade a uma solução. A osmolalidade refere-se à actividade osmótica total para a qual contribuem iões e moléculas não ionizadas a uma solução. Exemplos incluem sais inorgânicos tais como cloreto de sódio, polietilenoglicóis (PEG), polipropilenoglicol, açúcares tais como sacarose ou trealose, glicerol, aminoácidos e álcoois de açúcar tais como manitol conhecidos na arte que são geralmente considerados seguros (GRAS).
Os "conservantes" podem actuar prevenindo a proliferação de bactérias, vírus e fungos na formulação, e os anti-oxidantes, ou outros compostos podem funcionar de vários modos para conservar a estabilidade da formulação. Exemplos incluem cloreto de octadecildimetilbenzilamónio, cloreto de hexametónio, cloreto de benzalcónio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamónio nos quais os grupos alquilo são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetónio. Outros tipos de compostos incluem álcoois aromáticos tais como fenol e álcool benzílico, alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno e m-cresol. Opcionalmente, um tal composto é fenol ou álcool benzílico. O conservante ou outros compostos estarão opcionalmente incluídos numa forma líquida ou aquosa da formulação de Apo2L/TRAIL, mas habitualmente não numa forma liofilizada da formulação. No último caso, o conservante ou outro composto estará tipicamente presente na água para 21 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ injecção (WFI) ou água bacteriostática para injecção (BWFI) utilizada para reconstituição.
Um "tensioactivo" pode actuar diminuindo a turbidez ou desnaturação de uma proteína numa formulação. Exemplos de tensioactivos incluem um tensioactivo não iónico tal como um polissorbato, p.ex., polissorbatos 20, 60, ou 80, um poloxâmero, p.ex., poloxâmero 184 ou 188, polióis Pluronic, polímeros de blocos de etileno/propileno ou quaisquer outros conhecidos na arte que sejam GRAS. Opcionalmente, o tensioactivo é um polissorbato ou poloxâmero.
Um "tampão" tal como aqui se utiliza é qualquer tampão adequado que seja GRAS e confira geralmente um pH de cerca de 6 a cerca de 9, opcionalmente de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, e opcionalmente de cerca de 7 a cerca de 7,5, se o polipéptido for Apo2L/TRAIL. Exemplos incluem Tris, Hepes, trietanolamina, histidina, ou quaisquer outros conhecidos na arte como tendo o efeito desejado. O termo "citoquina" é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população celular que actuam sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citoquinas são as linfoquinas, monoquinas e hormonas polipeptídicas tradicionais. Incluídas entre as citoquinas estão as hormonas do crescimento tais como a hormona do crescimento humana, a hormona do crescimento humana N-metionilo e a hormona do crescimento bovina; a hormona da paratiróide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas tais como a hormona estimuladora do folículo (FSH) , hormona estimuladora da tiróide (TSH), e hormona luteinizante (LH); factor de crescimento hepático; factor de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogénio placentário; factor de necrose tumoral-α e β; substância inibidora da muleriana; péptido associado à gonadotrofina de ratinho; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); factor de crescimento dos nervos; factor de crescimento das plaquetas; factores de crescimento transformantes (TGF) tais como TGF-α e TGF-β; factor de crescimento semelhante à insulina-I e II; eritropoietina (EPO); factores osteoindutores; interferões tais como interferão-α, β e gama; 22 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ factores estimuladores de colónias (CSF) tais como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (IL) tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; e outros factores polipeptidicos incluindo LIF e ligando kit (KL). Tal como aqui se utiliza, o termo citoquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente activos das citoquinas de sequência nativa. O termo "agente citotóxico" tal como aqui se utiliza refere-se a uma substância que inibe ou impede a função de células e/ou causa a destruição de células. O termo pretende incluir isótopos radioactivos (p. ex., I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterapêuticos e toxinas tais como toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destas.
Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e criptoficina 1 (incluindo os eleuterobina; espongistatina; clornafazina, mecloretamina, melfalano, trofosfamida, bizelesina); criptoficinas (particularmente e criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina análogos sintéticos, KW-2189 e CBI-TMI); pancratistatina; uma sarcodictiina; mostardas azotadas tais como clorambucilo, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, cloridrato de óxido de mecloretamina, novembiquina, fenesterina, prednimustina, mostarda de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (p. ex., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina 23 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ γι1 e caliqueamicina θχι, ver, ρ. ex., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186, (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enediina cromoproteina aparentados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adriamycin”) (incluindo morfolinodoxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos do ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purinas tais como fludarabina, β-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-supra-renais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; substitutos do ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2' , 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, p.ex., paclitaxel (TAXOL®, 24 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (TAXOTERE®. Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gencitabina (Gemzar”) ; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina (Navelbine*) ; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides tais como ácido retinóico; capecitabina e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos de cima. Também incluídos nesta definição estão agentes anti-hormonais que actuem regulando ou inibindo a acção hormonal em tumores tais como anti-estrogénios e moduladores de receptores de estrogénio selectivos (SERM), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo Nolvadex”), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno (Fareston”); inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas glândulas supra-renais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace”) , exemestano, formestano, fadrozole, vorozole (Rivisor™) , letrozole (Femara”) , e anastrozole (Arimidex”); e anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos de cima.
Um "agente inibidor do crescimento" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou uma composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula de cancro sobre-expressando qualquer um dos genes aqui identificados, in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento pode ser um que reduza significativamente a percentagem de células que sobre-expressam tais genes em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (num local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a paragem em G1 e a paragem na fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem os vincas (vincristina e vinblastina), taxol, e inibidores da topo II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido e bleomicina. Os agentes que param G1 também 25 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ abrangem a paragem na fase S, por exemplo, agentes alquilantes do ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Mais informação pode ser encontrada em "The Molecular Basis of Câncer", Mendelsohn and Israel, eds., capitulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente na pág. 13. "Biologicamente activo" ou "actividade biológica" para os fins daqui significa (a) possuir a capacidade para induzir ou estimular apoptose em pelo menos um tipo de célula de cancro de mamífero ou célula infectada viralmente in vivo ou ex vivo, sozinho ou como agente único ou em combinação com um agente quimioterapêutico (b) capaz de gerar um anticorpo, i.e., ser imunogénico ou (c) capaz de se ligar a e/ou estimular um receptor para Apo2L/TRAIL (tais receptores podem incluir o receptor DR4, receptor DR5, OPG, receptor DcRl e receptor DcR2); ou (d) manter a actividade de um polipéptido
Apo2L/TRAIL nativo ou de ocorrência natural. Os ensaios para determinação da actividade biológica do Apo2L/TRAIL podem ser conduzidos utilizando métodos conhecidos na arte, tais como fragmentação de ADN (ver, p.ex., Marsters et al., Curr.
Biology 6: 1669 (1996)), inactivação de caspases, ligação a DR4, ligação a DR5 (ver, p.ex., WO 98/51793, publicado a 19 de Nov. de 1998), ligação a DcRl (ver, p.ex., WO 98/58062, publicado a 23 de Dez. de 1998), ligação a DcR2 (ver, p.ex., WO 99/10484, publicado a 4 de Março de 1999) bem como os ensaios descritos nas Publicações PCT N.os WO97/01633, W097/25428, WO 01/00832 e WO 01/22987.
Os termos "apoptose" e "actividade apoptótica" são utilizados num sentido amplo e referem-se à forma ordenada ou controlada de morte celular em mamíferos que é tipicamente acompanhada por uma ou mais alterações celulares características, incluindo condensação do citoplasma, perda de microvilosidades da membrana plasmática, segmentação do núcleo, degradação do ADN cromossómico ou perda da função mitocondrial. Esta actividade pode ser determinada e medida, por exemplo, através de ensaios de viabilidade celular (tais como ensaios de azul Alamar ou ensaios MTT), análise FACS, activação de caspases, fragmentação de ADN (ver, por exemplo, 26 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Nicoletti et al., J. Immunol. Methods 139: 271-279 (1991), e poli-ADP-ribose-polimerase, ensaios de clivagem "PARP" conhecidos na arte.
Tal como aqui se utiliza, o termo "distúrbio" refere-se em geral a qualquer condição que beneficiaria de tratamento com as composições aqui descritas, incluindo qualquer doença ou distúrbio que possa ser tratado através de quantidades eficazes de polipéptidos tais como Apo2L/TRAlL. Isto inclui distúrbios crónicos e agudos, bem como as condições patológicas que predispõem o mamífero para o distúrbio em questão. Exemplos não limitantes dos distúrbios a tratar aqui incluem cancros benignos e malignos; distúrbios inflamatórios, angiogénicos e imunológicos, distúrbios auto-imunes, artrite (incluindo artrite reumatóide), esclerose múltipla e VIH/SIDA.
Os termos "cancro", "canceroso" ou "maligno" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem mas não se limitam a, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma e sarcoma. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem carcinoma de células escamosas, mieloma, cancro do pulmão de células pequenas, cancro do pulmão de células não pequenas, glioma, cancro gastrointestinal, cancro renal, cancro do ovário, cancro do fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, cancro colorrectal, cancro do endométrio, cancro do rim, cancro da próstata, cancro da tiróide, neuroblastoma, cancro pancreático, glioblastoma multiforme, cancro cervical, cancro do estômago, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, carcinoma do cólon e cancro da cabeça e do pescoço. Opcionalmente, as células de cancro expressam um ou mais receptores DR4 e/ou DR5.
Os termos "tratar", "tratamento" e "terapia" tal como aqui se utilizam referem-se a terapia curativa, terapia profilática e terapia preventiva. O tratamento ou a administração consecutiva refere-se a tratamento pelo menos numa base diária sem interrupção do tratamento num ou mais dias. O tratamento ou a administração intermitente, ou tratamento ou administração de um modo intermitente, refere-se 27 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ a tratamento que não é consecutivo, mas em vez disso de natureza ciclica. O termo "mamífero" tal como aqui se utiliza refere-se a qualquer mamífero classificado como mamífero, incluindo humanos, vacas, cavalos, cães e gatos. Numa concretização preferida do invento, o mamífero é um humano. B. Métodos e Materiais Exemplares para Realizar o Invento O presente invento proporciona várias formulações e métodos para produzir tais formulações de Apo2L/TRAIL. Vários excipientes das formulações podem aumentar a solubilidade de Apo2L/TRAIL nas formulações, por exemplo, os que são aceitáveis para utilizações farmacêuticas e/ou aumentam a estabilidade da proteína Apo2L/TRAIL numa forma (p.ex., forma de trímero) que tenha actividade biológica. Por exemplo, os Requerentes verificaram que a presença de vários excipientes (por exemplo, sais de arginina) em tais formulações podem aumentar marcadamente a solubilidade e estabilidade de Apo2L/TRAIL. A descoberta inesperada da cristalização facilmente reversível de Apo2L/TRAIL proporciona ainda a base para métodos de purificação e formulações estáveis de Apo2L/TRAIL. Em particular, a formação de cristais e subsequentemente a secagem do material através de vários métodos (incluindo liofilização) pode proporcionar estabilidade a longo prazo de preparações em bruto da proteína. Mais, é esperado que as composições cristalinas liofilizadas mantenham estabilidade ao longo de um intervalo de temperaturas. Os cristais secos podem também ser empregues em formulações em suspensão adequadas para, p.ex., administração subcutânea ou intramuscular. Tal como descrito nos Exemplos, sais de sódio, particularmente sulfato de sódio (Na2S04) , proporcionaram uma cristalização fácil e reversível, com retenção da actividade biológica após re-dissolução da proteína. Os cristais da proteína re-dissolveram-se então facilmente em água ou num tampão aquoso, p.ex. um sal de um ácido carboxílico de um aminoácido, ou podem ser suspensos num meio não aquoso sem perda das propriedades físico-químicas que podem ser importantes para a actividade biológica da proteína. 28 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Geralmente, as formulações são preparadas utilizando polipéptidos Apo2L/TRAIL (proteínas), no grau de pureza desejado, e vários excipientes ou componentes, descritos abaixo.
Produção de Apo2L/TRAlL A descrição abaixo refere-se a métodos de produção de Apo2L/TRAlL através da cultura de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com um vector contendo ácido nucleico codificando Apo2L/TRAIL e da recuperação do polipéptido a partir da cultura celular. O ADN codificando Apo2L/TRAIL pode ser obtido a partir de qualquer biblioteca de ADNc preparada a partir do tecido que se crê possuir o ARNm de Apo2L/TRAIL e o expresse a um nível detectável. Concordantemente, o ADN de Apo2L/TRAIL humano pode ser convenientemente obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecidos humanos, tais como a biblioteca bacteriofágica do ADNc placentário humano tal como descrito na Publicação PCT W097/25428. O gene codificando Apo2L/TRAIL pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou através de síntese oligonucleotídica.
As bibliotecas podem ser pesquisadas com sondas (tais como anticorpos para o Apo2L/TRAIL ou oligonucleótidos de pelo menos cerca de 20-80 bases) desenhadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por ele. A pesquisa da biblioteca de ADNc ou genómica com a sonda seleccionada pode ser conduzida utilizando procedimentos padrão (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Um meio alternativo para isolar o gene codificando Apo2L/TRAIL é utilizar metodologia de PCR (Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., "PCR Primer: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995).
Podem ser preparados fragmentos ou variantes da sequência de aminoácidos de Apo2L/TRAIL através da introdução de mudanças de nucleótidos apropriadas no ADN de Apo2L/TRAIL, ou através da síntese do polipéptido Apo2L/TRAIL desejado. Tais fragmentos ou variantes representam inserções, substituições 29 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ e/ou deleções de resíduos dentro ou numa ou ambas as extremidades da região intracelular, da região transmembranar ou da região extracelular, ou da sequência de aminoácidos mostrada para o Apo2L/TRAIL inteiro da Figura 1 (SEQ ID NO:l). Qualquer combinação de inserção, substituição, e/ou deleção pode ser feita para alcançar a construção final, desde que a construção final possua, por exemplo, uma actividade biológica desejada ou actividade apoptótica tal como aqui definido. Numa concretização preferida, os fragmentos ou variantes têm pelo menos cerca de 80% de identidade da sequência de aminoácidos, de preferência, pelo menos cerca de 90% de identidade da sequência, e ainda de preferência, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade da sequência com, por exemplo, as sequências aqui identificadas para os domínios intracelular, transmembranar, ou extracelular de Apo2L/TRAIL, ou a sequência inteira para Apo-2L/TRAIL. As mudanças de aminoácidos podem também alterar processos pós-tradução do Apo-2L/TRAIL, tais como a mudança do número ou da posição dos locais de glicosilação ou a alteração das caracteristicas de ancoragem na membrana.
Variações na sequência de Apo2L/TRAIL tal como descritas acima podem ser feitas utilizando qualquer uma das técnicas e linhas orientadoras para mutações conservativas e não conservativas expostas na Pat. U.S. N.° 5364934. Estes incluem mutagénese mediada por oligonucleótidos (dirigida ao local), varrimento de alanina e mutagénese por PCR. A análise de varrimento dos aminoácidos pode ser empregue para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. Entre os aminoácidos de varrimento preferidos estão os aminoácidos relativamente pequenos, neutros. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina e cisteína. A alanina é tipicamente um aminoácido de varrimento preferido entre este grupo porque elimina a cadeia lateral para além do carbono beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante (Cunningham et al., Science 244: 1081, (1989)). A alanina é também tipicamente preferida porque é o aminoácido mais vulgar. Mais, é frequentemente verificado tanto nas posições ocultas como expostas (Creighton, "The Proteins", (W.H. Freeman & Co., NY) ; Chothia, J. Mol. Biol. 150: 1 (1976)). 30 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Variantes particulares de Apo2L/TRAIL do presente invento incluem os polipéptidos Apo2L/TRAIL que incluem uma ou mais das substituições de alanina citadas proporcionadas na TABELA I do pedido PCT publicado WO 01/00832. Tais variantes de Apo2L/TRAIL compreendem tipicamente uma sequência de aminoácidos de ocorrência não natural que difere de uma sequência de aminoácidos de Apo2L/TRAIL nativa (tal como proporcionado na Figura 1; SEQ ID NO:l, para uma forma inteira ou madura de Apo2L/TRAIL ou uma sequência do domínio extracelular deste) em pelo menos um ou mais aminoácidos. Opcionalmente, o um ou mais aminoácidos que diferem na variante de Apo2L/TRAIL em comparação com o Apo2L/TRAIL nativo compreenderão uma ou mais substituições de aminoácidos tais como as indicados na Tabela I de WO 01/00832. As variantes de Apo2L/TRAIL do invento incluem variantes de Apo2L/TRAIL solúveis compreendendo os resíduos 91-281, 92-281, 95-281 ou 114-281 da Figura 1 (SEQ ID NO:l) e possuindo uma ou mais substituições de aminoácidos. Variantes de Apo2L/TRAIL preferidas incluirão as variantes compreendendo os resíduos 91-281, 92-281, 95-281 ou 114-281 da Figura 1 (SEQ ID NO:l) e possuindo uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentem a actividade biológica, tal como ligação ao receptor. Uma variante particularmente preferida compreende os resíduos 114-281 da Figura 1 (SEQ ID NO:l). Numa concretização específica, Apo-2L/TRAIL consiste nos resíduos 114-281 da Figura 1 (SEQ ID NO:l).
Tal como descrito em WO 01/00832 publicado a 4 de Janeiro de 2001, a estrutura cristalina de raios X do domínio extracelular do Apo2L/TRAIL foi identificada, e foi efectuada mutagénese por varrimento de alanina para proporcionar o mapeamento das regiões de contacto com o seu receptor. A estrutura obtida para Apo2L/TRAIL revelou uma proteína homotrimérica que contém um novo local de ligação a um ião metálico bivalente (zinco) que coordena a interacção das três subunidades da molécula trimérica de Apo2L/TRAIL. Tal como outros membros da família TNF, Apo2L/TRAIL parece compreender um trímero compacto formado por três monómeros cilíndricos em chave grega (jelly roll) que se ocultam aproximadamente 5100 Angstrom2 (1700 Angstrom2 por monómero) para formar o trímero globular. A posição das cadeias beta centrais foi bem conservada em comparação com os outros membros estruturalmente 31 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ caracterizados da família TNF, TNF-alfa, TNF-beta, e CD40L quando comparadas com as cadeias centrais de TNF-alfa ou TNF-beta .
Variações na sequência de Apo2L/TRAIL também incluídas dentro do âmbito do invento referem-se a derivados amino-terminais ou formas modificadas. Tais sequências de Apo2L/TRAIL podem incluir qualquer um dos polipéptidos Apo2L/TRAlL aqui descritos possuindo uma metionina ou metionina modificada (tal como formilmetionilo ou outra espécie de metionilo bloqueada) no terminal N da sequência polipeptídica. O ácido nucleico (p.ex., ADNc ou ADN genómico) codificando Apo2L/TRAIL nativo ou variante pode ser inserido num vector replicável para mais clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. Vários vectores estão disponíveis ao público. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição, cada um dos quais é descrito abaixo. Sequências sinal, origens de replicação, genes marcadores, elementos estimuladores e sequências terminadoras da transcrição opcionais que podem ser empregues são conhecidos na arte e descritos com mais detalhe na Publicação PCT W097/25428.
Os vectores de expressão e clonagem contêm habitualmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado à sequência de ácido nucleico de Apo2L/TRAIL. Os promotores são sequências não traduzidas situadas a montante (5') do codão de início de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição e a tradução de uma determinada sequência de ácido nucleico, tal como a sequência de ácido nucleico de Apo2L/TRAIL, à qual estão operativamente ligados. Tais promotores caiem tipicamente em duas classes, indutíveis e constitutivos. Promotores indutíveis são promotores que iniciam níveis crescentes de transcrição de ADN sob o seu controlo em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, p.ex., a presença ou ausência de um nutriente ou uma 32 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ mudança de temperatura. Actualmente é bem conhecido um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras. Estes promotores são operativamente ligados a ADN codificando Apo2L/TRAIL através da remoção do promotor do ADN fonte por digestão com enzimas de restrição e inserção da sequência promotora isolada no vector. Tanto a sequência promotora de Apo2L/TRAIL nativa como muitos promotores heterólogos podem ser utilizados para dirigir a amplificação e/ou expressão do ADN de Apo2L/TRAIL.
Promotores adequados para utilizar com hospedeiros procarióticos e eucarióticos são conhecidos na arte e são descritos em mais detalhe na Publicação PCT N.° W097/25428.
Os métodos preferidos para a produção de Apo2L/TRAIL solúvel em E. coli empregam um promotor indutivel para a regulação da expressão do produto. A utilização de um promotor controlável, indutivel permite o crescimento da cultura até uma densidade celular desejável antes da indução da expressão do produto e da acumulação de quantidades significativas de produto que podem não ser bem toleradas pelo hospedeiro.
Foram avaliados três sistemas promotores indutiveis (polimerase T7, trp e fosfatase alcalina (AP)) pelos Requerentes para a expressão de Apo2L/TRAIL (aminoácidos 114-281). A utilização de cada um destes três promotores resultou em quantidades significativas de trímero de Apo2L/TRAIL solúvel, biologicamente activo recuperado a partir da pasta celular colhida. O promotor de AP é o preferido de entre estes três sistemas promotores indutiveis testados devido ao maior controlo do promotor e à maior densidade e títulos celulares alcançados na pasta celular colhida. A construção de vectores adequados contendo um ou mais dos componentes acima listados emprega técnicas de ligação padrão. Os plasmídeos isolados ou fragmentos de ADN são clivados, cortados e novamente ligados na forma desejada para gerar os plasmídeos necessários.
Para análise para confirmar as sequências correctas nos plasmídeo construídos, as misturas de ligação podem ser utilizadas para transformar a estirpe 294 de E. coli K12 (ATCC 33 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 31446) e os transformantes bem sucedidos serem seleccionados através de resistência à ampicilina ou tetraciclina quando apropriado. Os plasmideos dos transformantes são preparados e analisados através de digestão com endonucleases de restrição e/ou sequenciados utilizando técnicas padrão conhecidas na arte. (Ver, p.ex., Messing et ai., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981); Maxam et ai., Methods in Enzymology 65: 499 (1980)).
Podem ser empregues vectores de expressão que proporcionem a expressão transiente em células de mamífero de ADN codificando Apo2L/TRAIL. Em geral, a expressão transiente envolve a utilização de um vector de expressão que é capaz de se replicar eficientemente numa célula hospedeira, de modo que a célula hospedeira acumule muitas cópias do vector de expressão e, por sua vez, sintetize elevados níveis de um polipéptido desejado codificado pelo vector de expressão (Sambrook et ai., supra). Os sistemas de expressão transiente, compreendendo um vector de expressão e uma célula hospedeira adequados, permitem a conveniente identificação positiva dos polipéptidos codificados pelos ADN clonados, bem como a rápida pesquisa de tais polipéptidos quanto às propriedades biológicas ou fisiológicas desejadas. Assim, os sistemas de expressão transientes são particularmente úteis no invento para fins de identificação de análogos e variantes de Apo2L/TRAIL que sejam Apo2L/TRAIL biologicamente activos.
Outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese de Apo2L/TRAIL em cultura de células recombinantes de vertebrado são descritos em Gething et ai., Nature 293: 620-625 (1981); Mantei et ai., Nature 281: 40-46 (1979); EP 117060; e EP 117058. Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores daqui incluem células procariotas, leveduras ou células eucariotas superiores. Procariotas adequados para este fim incluem mas não se limitam a eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, p.ex., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ex., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ex., Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis 34 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ (p.ex., Β. licheniformis 41Ρ divulgada em DD 266710 publicada a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces. De preferência, a célula hospedeira deve segregar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. A E. coli é a célula hospedeira preferida para utilizar no presente invento. E. coli está particularmente bem adaptada para a expressão de Apo2L/TRAIL (compreendendo os aminoácidos 114-281 da Figura 1), um polipéptido abaixo dos 20 kDa de tamanho sem requisitos de glicosilação. Como hospedeiro de produção, a E. coli pode ser cultivada até uma densidade celular relativamente elevada e é capaz de produzir níveis relativamente elevados de proteínas heterólogas.
Para além dos procariotas, micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores codificando Apo2L/TRAIL. As células hospedeiras adequadas para a expressão de Apo2L/TRAIL glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de todas essas células hospedeiras, incluindo células CHO, são melhor descritos na publicação PCT N.° W097/25428.
As células hospedeiras são transfectadas e de preferência transformadas com os vectores de expressão ou clonagem acima descritos para produção de Apo2L/TRAIL e cultivadas em meios nutrientes modificados conforme apropriado para indução de promotores, selecção de transformantes ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas. A transfecção refere-se à tomada de um vector de expressão por uma célula hospedeira sejam ou não expressas de facto quaisquer sequências de codificação. Numerosos métodos de transfecção são conhecidos dos peritos da arte, por exemplo, CaP04 e electroporação. A transfecção bem sucedida é geralmente reconhecida quando qualquer indicação da operação deste vector ocorre dentro da célula hospedeira.
Transformação significa a introdução de ADN num organismo de modo a que o ADN seja replicável, como elemento extracromossómico ou como integrante cromossómico. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é feita 35 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ utilizando técnicas padrão apropriadas a tais células. O tratamento de cálcio empregando cloreto de cálcio, tal como descrito em Sambrook et al., supra, ou a electroporação são geralmente utilizados para procariotas ou outras células que contêm barreiras de parede celular substanciais. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de certas células vegetais, tal como descrito (Shaw et al., Gene 23: 315 (1983) e Publicação PCT N.° WO89/05859) . Adicionalmente, as plantas podem ser transfectadas utilizando tratamento de ultra-sons, Publicação PCT N.° WO91/00358 publicada a 10 de Janeiro de 1991.
Para células de mamífero sem tais paredes celulares, pode ser empregue o método de precipitação com fosfato de cálcio (Graham e van der Eb, Virology 52: 456-457 (1978)). Aspectos gerais das transformações de sistemas hospedeiros de células de mamífero foram descritos na Patente U.S. N°. 4399216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact. 130: 946 (1977) e Hsiao et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 3829 (1979). No entanto, outros métodos para a introdução de ADN nas células, tais como através de micro-injecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas ou policatiões, p.ex., polibreno, poliornitina, podem também ser utilizados. Para várias técnicas para transformação de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology 185: 527-537 (1990) e Mansour et al., Nature 336: 348-352 (1988) .
As células procarióticas utilizadas para produzir Apo2L/TRAIL podem ser cultivadas em meios de cultura adequados tal como descrito geralmente em Sambrook et al., supra. Formas particulares de meios de cultura que podem ser empregues para cultura de E. coli são descritas no pedido PCT WO01/00832. As células hospedeiras de mamífero utilizadas para produzir Apo2L/TRAIL podem ser cultivadas numa variedade de meios de cultura.
Exemplos de meios de cultura comercialmente disponíveis incluem FIO de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma). Qualquer um desses meios pode ser 36 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco Gentamicina”), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presentes a concentrações finais no intervalo micromolar) , e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos a concentrações apropriadas que serão conhecidas dos peritos na arte. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão aparentes aos vulgares peritos na arte.
Em geral, os princípios, protocolos e as técnicas práticas para maximização da produtividade das culturas celulares de mamífero podem ser verificados em "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. (IRL Press, 1991). A expressão do Apo2L/TRAIL pode ser medida directamente numa amostra, por exemplo, através de Southern blotting, Northern blotting para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 5201-5205 (1980)), dot blotting (análise do ADN) , ou em hibridação in situ convencionais, utilizando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas sequências aqui proporcionadas. Vários marcadores podem ser empregues, mais habitualmente isótopos radioactivos e particularmente P. No entanto, podem também ser utilizadas outras técnicas, tais como a utilização de nucleótidos modificados com biotina para introdução num polinucleótido. A biotina serve então como local para ligação a avidina ou a anticorpos, que podem ser marcados com uma ampla variedade de marcadores, tais como nucleótidos radioactivos, fluoróforos ou enzimas. Alternativamente, podem ser empregues anticorpos que podem reconhecer duplexes específicos, incluindo duplexes de ADN, duplexes de ARN e duplexes híbridos de ADN-ARN ou duplexes de ADN-proteína. Os anticorpos podem por sua vez ser marcados e o ensaio pode ser realizado onde o duplex está ligado a uma superfície, de modo a que após a formação do 37 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ duplex à superfície, possa ser detectada a presença do anticorpo ligado ao duplex. A expressão génica pode ser, alternativamente, medida através de métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecido e ensaio da cultura celular ou dos fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Com técnicas de coloração imuno-histoquímica, é preparada uma amostra celular, tipicamente através de desidratação e fixação, seguida de reacção com anticorpos marcados específicos para o produto do gene ligado, em que os marcadores são habitualmente visualmente detectáveis, tais como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes ou marcadores luminescentes e semelhantes.
Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipéptido Apo2L/TRAIL nativo ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui proporcionadas ou contra uma sequência exógena fundida com o ADN de Apo2L/TRAIL e codificando um epítopo de anticorpo específico. O Apo2L/TRAIL é de preferência recuperado a partir do meio de cultura como um polipéptido segregado, embora também possa ser recuperado a partir de lisados de células hospedeiras quando directamente produzido sem um sinal secretor. Se o Apo2L/TRAIL estiver ligado à membrana, pode ser libertado da membrana utilizando uma solução detergente adequada (p.ex., Triton-X 100) ou a sua região extracelular pode ser libertada através de clivagem enzimática.
Quando Apo2L/TRAIL é produzido numa célula recombinante diferente de uma de origem humana, o Apo2L/TRAIL é livre de proteínas ou polipéptidos de origem humana. No entanto, é habitualmente necessário recuperar ou purificar Apo2L/TRAIL a partir de proteínas ou polipéptidos celulares recombinantes para obter preparações que sejam substancialmente homogéneas em relação ao Apo2L/TRAIL. Como primeiro passo, o meio de cultura ou lisado pode ser centrifugado para remover restos 38 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ celulares particulados. A partir daí Apo2L/TRAIL é purificado a partir de proteínas e polipéptidos solúveis contaminantes, sendo os seguintes procedimentos exemplares de procedimentos de purificação adequados: através de fraccionamento numa coluna de permuta iónica tal como SP-Sepharose ou CM-Sepharose; hidroxiapatite; cromatografia de interacção hidrófoba; precipitação em etanol; cromatofocagem; precipitação em sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; e diafiltração. O Apo2L/TRAIL pode ser isolado através de cromatografia de afinidade. Os fragmentos ou variantes de Apo2L/TRAIL nos quais foram suprimidos, inseridos ou substituídos resíduos são recuperados do mesmo modo que o Apo2L/TRAIL nativo, tendo em conta quaisquer mudanças substanciais nas propriedades ocasionadas pela variação. Por exemplo, a preparação de uma fusão de Apo2L/TRAIL com outra proteína ou polipéptido, p.ex., um antigénio bacteriano ou virai, facilita a purificação; pode ser utilizada uma coluna de imunoafinidade contendo anticorpo para o antigénio para adsorver o polipéptido de fusão.
Um inibidor de proteases tal como fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) pode também ser útil para inibir a degradação proteolítica durante a purificação e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes acidentais. Um perito na arte apreciará que os métodos de purificação adequados para o Apo2L/TRAIL nativo podem requerer uma modificação que seja responsável por alterações no carácter de Apo2L/TRAIL ou suas variantes após expressão em cultura celular recombinante.
Durante quaisquer tais passos de purificação, pode ser desejável expor o Apo2L/TRAIL recuperado a uma solução contendo ião metálico bivalente ou ao material de purificação (tal como um meio ou suporte de cromatografia) contendo um ou mais iões metálicos bivalentes. Os iões metálicos bivalentes e/ou o agente redutor podem ser utilizados durante a recuperação ou purificação do Apo2L/TRAIL. Opcionalmente, tanto os iões metálicos bivalentes como o agente redutor, tal como DTT ou BME, podem ser utilizados durante a recuperação ou purificação do Apo2L/TRAIL. Crê-se que a utilização de iões metálicos bivalentes durante a recuperação ou purificação 39 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ ajude a proporcionar estabilidade do trímero de Apo2L/TRAIL ou conserve o trimero de Apo2L/TRAIL formado durante o passo de cultura celular.
PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES
Na preparação das formulações daqui, observa-se que a qualidade ou "grau" recomendado dos componentes empregues dependerá da utilização final da formulação. Para utilizações terapêuticas, é preferido que o componente ou componentes sejam de todos os graus permissíveis (tais como "GRAS") como aditivo de produtos farmacêuticos.
Em certas concretizações, são proporcionadas composições compreendendo Apo2L/TRAIL e um ou mais excipientes que proporcionam suficiente força iónica para aumentar a solubilidade e/ou estabilidade do Apo2L/TRAIL, em que a composição tem um pH de 6 (ou cerca de 6) a 9 (ou cerca de 9) . A proteína Apo2L/TRAIL pode ser preparada através de qualquer método adequado para alcançar a pureza desejada da proteina, por exemplo, de acordo com os métodos de cima. Em concretizações preferidas, a proteina Apo2L/TRAIL compreende os aminoácidos 114-281 da Figura 1, e de preferência, a proteina Apo2L/TRAIL é expressa de forma recombinante em células hospedeiras de E. coli. A concentração da proteina Apo2L/TRAIL na formulação pode variar dependendo, por exemplo, da utilização pretendida da formulação. Os peritos na arte podem determinar sem demasiada experimentação a concentração desejada da proteina Apo2L/TRAIL. Para fins terapêuticos, a concentração da proteina Apo2L/TRAIL na formulação é opcionalmente de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/ml, de cerca de 1 a cerca de 20 mg/ml, de cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml, ou cerca de 20 mg/ml. O um ou mais excipientes nas formulações que proporcionam suficiente força iónica para aumentar a solubilidade e/ou estabilidade do Apo2L/TRAIL incluem um sal de arginina ou sulfato de sódio, e opcionalmente um ácido orgânico ou inorgânico poli-iónico, aspartato, succinato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, Captisol”, Tris, outro aminoácido, açúcares e polióis tais como trealose e sacarose. O tipo de sal empregue e a concentração do sal é de preferência tal que 40 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ a formulação tem uma força iónica relativamente elevada que permite que o Apo2L/TRAIL na formulação seja estável (i.e., reduz a precipitação e aumenta o teor de trimero) e/ou que permite que a concentração de proteína solúvel exceda 2 mg/ml, de preferência, exceda 5 mg/ml, ainda de preferência exceda 10 mg/ml, e de maior preferência alcance uma concentração de pelo menos cerca de 20 mg/ml. Opcionalmente, o sal está presente na formulação a uma concentração de cerca de 20 mM a cerca de 0,5 M. Opcionalmente, o sal de arginina pode compreender citrato de arginina, tartarato de arginina, maleato de arginina, succinato de arginina, fosfato de arginina, e sulfato de arginina. De preferência, o sal de arginina está presente numa concentração de cerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M. Observa-se que embora o tartarato de arginina seja útil como excipiente nas formulações aqui descritas, a utilização de ácido tartárico como veículo a concentrações superiores (tais como centenas de mM) pode não ser desejável para administração parentérica ou aplicações clínicas humanas. Os Requerentes observaram num estudo animal in vivo que concentrações de veículo de arginina 0,5 M neutralizada com tartarato 0,25 M administrada intravenosamente a mais de 5 ml/kg/h podem ter um efeito prejudicial no tecido renal. Concordantemente, pode haver uma concentração limiar superior de ácido tartárico além da qual um perito na arte não seleccionaria para utilizações clínicas terapêuticas. A composição tem de preferência um pH de 6 (ou cerca de 6) a 9 (ou cerca de 9), de preferência cerca de 6,5 a cerca de 8,5, e ainda de preferência de cerca de 7 a cerca de 7,5. Num aspecto preferido desta concretização, a composição compreenderá um tampão para manter o pH da composição pelo menos a cerca de 6 a cerca de 8. Exemplos de tampões que podem ser empregues incluem mas não se limitam a Tris, HEPES, e histidina. Quando se emprega Tris, o pH pode ser opcionalmente ajustado a cerca de 7 a 8,5. Quando se emprega Hepes ou histidina, o pH pode ser opcionalmente ajustado a cerca de 6,5 a 7. Opcionalmente, o tampão é empregue a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 50 mM na formulação, e de preferência a uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 20 mM.
Particularmente para formulações líquidas (ou formulações liofilizadas reconstituídas), pode ser desejável incluir um ou 41 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ mais tensioactivos na composição. Tais tensioactivos podem, por exemplo, compreender um tensioactivo não iónico como TM TM , TWEEN ou PLURONICS (p.ex., polissorbato ou poloxamero). De preferência, o tensioactivo compreende polissorbato 20 ("Tween 20") . O tensioactivo será opcionalmente empregue a uma concentração de cerca de 0,005% a cerca de 0,2%.
Formulações preferidas são aquelas nas quais o excipiente ou excipientes proporcionam um teor de trimero de Apo2L/TRAIL optimizado e minimizam a quantidade de formação de dimeros de Apo2L/TRAIL (ou formação de agregados) ou alterações na distribuição de cargas. Opcionalmente, a formulação não contém mais de 5% de agregados de Apo2L/TRAIL, não mais de 10% de dimero de Apo2L/TRAIL ligado por dissulfureto (da quantidade total de proteina Apo2L/TRAIL na formulação), e/ou não mais de 10% de alteração na distribuição de cargas inicial.
Em concretizações preferidas, o presente invento proporciona composições compreendendo cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de Apo2L/TRAIL e um sal de arginina, em que a composição tem um pH de cerca de 6,5 a cerca de 8,5 (opcionalmente, 6,8 a 7,5). Opcionalmente, as composições compreendem ainda um tampão tal como Tris e/ou um tensioactivo tal como polissorbato 20. De preferência, a proteina
Apo2L/TRAIL não inclui (i.e., não está ligada nem fundida com) qualquer molécula ou moléculas de marcador epitópico ou molécula ou moléculas de fecho de leucina.
Em concretizações ainda mais preferidas, o presente invento proporciona composições compreendendo cerca de 2 a cerca de 20 mg/ml de Apo2L/TRAIL, sal de arginina de cerca de 0,4 a cerca de 0,5 M, e tampão, em que a composição tem um pH de cerca de 6,5 a cerca de 7,5.
Opcionalmente, pode ser incluído um ião metálico bivalente nas formulações. O ião metálico bivalente pode ser uma molécula de zinco, tal como sulfato de zinco, cloreto de zinco, ou acetato de zinco. O ião metálico bivalente pode ser opcionalmente incluído na formulação a uma concentração de cerca de 50 micromolar a cerca de 400 micromolar. 42 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
As formulações do presente invento podem incluir, para além de Apo2L/TRAIL e dos componentes descritos acima, mais vários outros excipientes ou componentes. Opcionalmente, a formulação pode conter, para administração parentérica, um transportador farmaceuticamente ou parentericamente aceitável, i.e., um que seja não tóxico para os receptores nas dosagens e concentrações empregues e seja compatível com outros ingredientes da formulação. Opcionalmente, o transportador é um transportador parentérico, tal como uma solução que seja isotónica com o sangue do receptor. Exemplos de tais veículos transportadores incluem água, solução salina ou uma solução tamponada tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução de Ringer, e solução de dextrose. Vários transportadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais são melhor descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, Osol, A. ed. (1980).
As formulações daqui podem conter também um ou mais conservantes. Exemplos incluem cloreto de octadecildimetilbenzilamónio, cloreto de hexametónio, cloreto de benzalcónio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamónio nos quais os grupos alquilo são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetónio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos, alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno, e m-cresol. Antioxidantes incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; álcool butílico; alquilparabenos tais como as metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; ou polietilenoglicol (PEG). 43 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Exemplos adicionais de tais transportadores incluem lecitina, proteínas do soro, tais como albumina do soro, substâncias tampão tais como glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicéridos de ácidos gordos vegetais saturados, água, sais ou electrólitos como sulfato de protamina, cloreto de sódio, polivinilpirrolidona, e substâncias baseadas em celulose. Transportadores para formas baseadas em gel incluem polissacáridos tais como carboximetilcelulose ou metilcelulose de sódio, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros de blocos de polioxietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol e álcoois de ceras de madeira. Formas de depósito convencionais incluem por exemplo, microcápsulas, nanocápsulas, lipossomas, emplastros, formas de inalação, vaporizadores nasais e preparações de libertação sustida.
As composições do invento podem compreender formulações líquidas (soluções líquidas ou suspensões líquidas) e formulações liofilizadas, bem como formulações de suspensão nas quais a proteína Apo2L/TRAIL está na forma de cristais ou precipitado amorfo. A formulação final, se for um líquido, é de preferência armazenada congelada a <20°C. Alternativamente, a formulação pode ser liofilizada e proporcionada como um pó para reconstituição com água para injecção que opcionalmente pode ser armazenada a 2-30°C. A formulação a utilizar para administração terapêutica tem de ser estéril. A esterilidade é facilmente alcançada por filtração através de membranas de filtração estéril (p.ex., membranas de 0,2 micrómetros). As composições terapêuticas são colocadas num recipiente possuindo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco de injecção intravenosa ou frasco possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica. A composição será vulgarmente armazenada em recipientes de dose unitária ou de múltiplas doses, por exemplo, ampolas ou frascos selados, como uma solução aquosa ou como uma formulação liofilizada para reconstituição. Os recipientes podem ser quaisquer recipientes disponíveis na arte e enchidos 44 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ utilizando métodos convencionais. Opcionalmente, a formulação pode ser incluída num dispositivo de injecção em caneta (ou um cartucho que se ajuste num dispositivo forma em caneta), tais como os disponíveis na arte (ver, p.ex., Patente U.S. N.° 5370629), que são adequados para distribuição terapêutica da formulação. Como exemplo de uma formulação liofilizada, são enchidos frascos de 10 ml com 5,5 ml de solução aquosa de Apo2L/TRAIL a 2% (p/v) esterilizada por filtração, e a mistura resultante é liofilizada. Uma solução de injecção pode ser preparada através da reconstituição da formulação de Apo2L/TRAIL liofilizada utilizando, por exemplo, Água para Injecção.
Noutras concretizações mais particulares das formulações, são proporcionadas composições que incluem cristais de Apo2L/TRAIL. Por exemplo, a composição pode compreender uma formulação de suspensão compreendendo cristais de Apo2L/TRAIL. Os Requerentes verificaram surpreendentemente que o estado sólido da proteína Apo2L/TRAlL a -5°C é cristalino em condições iónicas moderadas a baixas, ao contrário de muitas outras proteínas conhecidas na arte que são solúveis ou formam precipitados amorfos sob condições semelhantes. Mais, verificou-se que o estado sólido dos cristais de Apo2L/TRAIL solubiliza de modo reversível quando trazido para a temperatura ambiente (i.e., temperatura da sala) sem perda da actividade biológica da proteína ou efeitos adversos nas propriedades bioquímicas da proteína. Esta observação foi bastante diferente da desnaturação ou precipitação irreversível observada para outras proteínas conhecidas na arte.
Opcionalmente, os cristais de Apo2L/TRAIL são preparados através de arrefecimento de uma solução super-saturada de proteína Apo-2L/TRAIL de cerca de 20 a cerca de 30°C até abaixo de cerca de 15°C, de preferência cerca de 2 a 8°C, e de maior preferência, abaixo de cerca de 2-8°C. A cristalização pode ser realizada em modo de lotes ou semi-lotes num grande intervalo de escalas, de poucos mililitros a centenas de litros de solução. A velocidade de cristalização pode ser controlada através de arrefecimento e agitação programados. O equipamento pode incluir, mas não se limita a, tanques agitados ou estáticos com controlo da temperatura superficial 45 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ e/ou interna. Podem também ser utilizados deflectores internos e tubos de aspiração para aumentar a mistura em tanques agitados. A nucleação dos cristais pode também ser controlada por inoculação (Moore, "AIChE Practical Engineering Perspectives, Distillation and Other Industrial Separations", pág. 239-245) . O grau de super-saturação, composição de sal, velocidade de arrefecimento, velocidade de agitação, e inoculação pode afectar a velocidade de formação dos cristais, a distribuição de tamanhos dos cristais, e o rendimento dos cristais.
Opcionalmente, para preparar os cristais, a solução da proteina Apo-2L/TRAIL contém sulfato de sódio ou cloreto de sódio. Opcionalmente, as concentrações de sal são de cerca de 100 mM a cerca de 150 mM e opcionalmente o pH é de cerca de 6 a cerca de 9 (de preferência, pH de cerca de 6,5 a cerca de 8,5) . A lama de cristais de Apo2L/TRAIL pode ser lavada para remover os sais. Opcionalmente, a lama de cristais pode ser lavada com água. Alternativamente, a lama de cristais pode ser equilibrada até uma força iónica baixa. Subsequentemente, o material pode ser seco para armazenamento ou preparação para formulações parentéricas. Os métodos de secagem de cristais podem incluir mas não se limitam a secagem estática em vácuo, secagem em vácuo com vibração, rotação ou movimento de agitação auxiliado por fluxo de ar seco/N2, liofilização, secagem por vaporização e secagem em leito fluidificado.
Os cristais secos podem ser reconstituídos numa formulação líquida e esterilizados para injecção parentérica. Alternativamente, os cristais secos podem ser suspensos num meio biocompatível de alta viscosidade para administração subcutânea ou intramuscular. O meio de suspensão pode ser aquoso ou não aquoso. Exemplos de suspensões aquosas incluem sistemas baseados em celulose tais como carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, ou sistemas baseados em polímeros como poli-ácido láctico-ácido glicólico (PGLA). Um exemplo de meio não aquoso é isobutirato de acetato de sacarose (SAIB) pré-dissolvido em solventes tais como etanol, carbonato de propileno, ou N-metilpirrolidona. Uma suspensão de distribuição de tamanhos uniforme pode ser preparada através 46 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ da homogeneização dos cristais secos em meio viscoso utilizando, por exemplo, um homogeneizador de sonda ou um microfluidificador.
MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO E OUTRAS APLICAÇÕES
Apo2L/TRAIL pode ser purificada por cristalização. Mais particularmente, os métodos de purificação empregam cristalização de Apo2L/TRAlL e os cristais podem ser secos para armazenamento. Os métodos proporcionam uma alternativa eficaz, eficiente e económica, por exemplo, protocolos de purificação requerendo purificações múltiplas em coluna. A secagem do material cristalino pode também proporcionar um volume relativamente baixo, um modo eficaz de armazenamento em massa que evita congelação do material purificado em recipientes em massa e descongelação do material congelado em massa.
Nos métodos, é proporcionada uma preparação de
Apo2L/TRAIL, tal como uma pasta celular contendo proteína Apo2L/TRAIL expressa de forma recombinante. Opcionalmente, embora não seja necessário, a pasta celular pode ser processada (por exemplo, pode ser exposta a um ou mais agentes redutores tais como DTT ou BME) ou parcialmente purificada utilizando quaisquer métodos adequados conhecidos na arte, tais como métodos de cromatografia de permuta catiónica. Os materiais da cromatografia de permuta catiónica podem ser opcionalmente SP-Sepharose, CM-Sepharose, ou resina HS cerâmica Macro-prep. A Apo2L/TRAIL processada ou parcialmente purificada na preparação pode ser cristalizada a partir de, por exemplo, uma solução super-saturada através da diminuição da temperatura e agitação utilizando os métodos aqui descritos. Os cristais podem então ser recolhidos e lavados com tampão (ou água) (de preferência um tampão frio a uma temperatura de cerca de 2 a 8°C). Os cristais lavados podem ser ressuspensos ou novamente dissolvidos à temperatura ambiente. A Apo2L/TRAIL solubilizada de novo pode ser mais purificada através de cromatografia de interacção hidrófoba, recristalizada, lavada e armazenada como material bruto cristalino húmido. Alternativamente, a interacção hidrófoba ou 47 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ outro passo de cromatografia pode ser omitido a favor de simples recristalização. O material bruto cristalino húmido pode ser armazenado a -20 °C ou seco para armazenamento à temperatura ambiente (temperatura da sala) ou a 2-8°C. De preferência, o material cristalino seco é solubilizado de novo numa formulação contendo succinato de arginina descrita acima. Opcionalmente, uma tal formulação pode ser esterilizada por filtração e/ou enchida em frascos de dosagem individuais, e liofilizada para posterior reconstituição ou suspensão. Opcionalmente, a formulação cristalina seca pode ser enchida como um pó em frascos e tornada numa solução ou suspensão.
As formulações de Apo2L/TRAIL aqui descritas podem ser empregues numa variedade de aplicações terapêuticas e não terapêuticas. Entre estas aplicações estão métodos de tratamento de distúrbios, tais como cancro, condições relacionadas com o sistema imunitário ou condições virais. Tais aplicações terapêuticas e não terapêuticas estão ainda descritas, por exemplo, em W097/25428, WO97/01633 e WO 01/22987.
As formulações de Apo2L/TRAIL podem ser directamente administradas ao mamífero através de qualquer técnica adequada, incluindo infusão ou injecção. A via de administração específica dependerá, p.ex., da história médica do paciente, incluindo quaisquer efeitos secundários sentidos ou antecipados utilizando Apo2L/TRAIL e o distúrbio particular a corrigir. Exemplos de administração parentérica incluem administração subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-arterial, e intraperitoneal da composição. As formulações são de preferência administradas como injecções ou infusões intravenosas (i.v.), subcutâneas (s.c.), intramusculares (i.m.) repetidas, infusões intracranianas ou como formulações de aerossol adequadas para distribuição intranasal ou intrapulmonar (para distribuição intrapulmonar ver, p.ex., EP 257956) .
Observa-se que a pressão osmótica das injecções pode ser importante na injecção subcutânea e intramuscular. As soluções injectáveis, quando hipotónicas ou hipertónicas, podem causar dor a um paciente após infusão. Habitualmente, para as formulações terapêuticas injectáveis daqui, é preferido que a 48 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ osmolaridade relativa da solução injectável seja de cerca de 300 mosm a cerca de 600 mosm.
Apo2L/TRAIL pode também ser administrado na forma de preparações de libertação sustida. Exemplos adequados de preparações de libertação sustida incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo a proteína, matrizes que estão na forma de artigos moldados, p.ex., películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustida incluem derivados de celulose (p.ex., carboximetilcelulose), isobutirato de acetato de sacarose (SABER™) em meios não aquosos, poliésteres, hidrogéis (p.ex., poli(2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et ai., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982) ou poli (álcool vinílico)), polilactidas (Patente U.S. N.° 3773919, EP 58481), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato gama (Sidman et ai., Biopolymers 22: 547-556 (1983) ), etileno-acetato de vinilo não degradável (Langer et al., supra), copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico tal como Lupron Depot (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133988). Um método opcional de distribuição para fármacos de acção sistémica envolve a administração através de infusão contínua (utilizando, p.ex., dispositivos de libertação lenta ou minibombas tais como bombas osmóticas ou adesivos da pele) ou através de injecção (utilizando, p.ex., meios intravenosos ou subcutâneos, incluindo administração de bolo único). A composição a utilizar na terapia será formulada e doseada de um modo consistente com as boas práticas médicas, tendo em conta a condição clínica de cada paciente, o local de distribuição da composição, o método de administração, o agendamento da administração, e outros factores conhecidos dos praticantes. As "quantidades eficazes" de cada componente para os fins daqui são assim determinadas por tais considerações e são quantidades que resultam na biodisponibilidade do Apo2L/TRAIL ou outros fármacos para o mamífero.
Como proposta geral, a quantidade total farmaceuticamente eficaz dos polipéptidos Apo2L/TRAIL administrados estará no intervalo de cerca de 1 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia com 49 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ base nos kg de peso corporal do paciente embora, tal como observado acima, isto esteja sujeito à discrição terapêutica.
Embora seja preferida a injecção, pode também ser empregue um dispositivo de infusão para infusões contínuas. Pode também ser empregue uma solução de saco intravenosa.
Está contemplado que possam ainda ser empregues nos métodos outras terapias. A terapia ou outras terapias mais podem incluir mas não se limitam a, administração de terapia de radiação, citoquina(s), agente ou agentes inibidores do crescimento, agente ou agentes quimioterapêuticos, agente ou agentes citotóxicos, inibidores de tirosina-quinase, inibidores de ras-farnesil-transferase, inibidores de angiogénese, e inibidores de quinases dependentes de ciclina que são conhecidos na arte e melhor definidos particularmente da Secção I acima. Adicionalmente, terapias baseadas em anticorpos terapêuticos que se dirigem a antigénios tumorais tais como Rituxan ou Herceptm bem como anticorpos anti-angiogénicos tais como anti-VEGF, ou anticorpos que se dirigem a receptores de Apo2L, tais como DR5 ou DR4. A preparação e os programas de dosagem para agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante ou tal como determinado empiricamente pelo perito profissional. A preparação e os programas de dosagem para tal quimioterapia estão também descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) .
Pode ser desejável administrar também anticorpos contra outros antigénios, tais como anticorpos que se ligam a CD20, CDlla, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, factor endotelial vascular (VEGF), ou outros membros da família TNFR (tais como DR4, DR5, OPG, TNFR1, TNFR2) . Alternativamente, ou adicionalmente, dois ou mais anticorpos que se liguem ao mesmo ou a dois ou mais antigénios diferentes aqui divulgados podem ser co-administrados ao paciente. Por vezes, pode ser benéfico administrar também uma ou mais citoquinas ao paciente. Numa concretização, as formulações de Apo2L são co-administradas com um agente inibidor do crescimento. 50 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ A formulação de Apo2L/TRAIL pode ser administrada concorrentemente ou sequencialmente com tais outros agentes. Por exemplo, a formulação de Apo2L/TRAIL pode ser administrada como um pré-tratamento (antes da administração de tais outros agentes), tal como um pré-tratamento de células de cancro que podem ser de outro modo resistentes aos efeitos apoptóticos de Apo2L/TRAIL. O invento proporciona também estojos que incluem uma formulação aqui descrita. Um estojo típico compreenderá um recipiente, de preferência um frasco, para Apo2L/TRAIL num ou mais excipientes tal como descrito acima; e instruções, tal como um folheto ou etiqueta, orientando o utilizador em como empregar a formulação de Apo2L/TRAIL. Este proporcionará de preferência uma formulação farmacêutica. De preferência, a formulação farmacêutica é para tratamento de cancro ou uma condição relacionada com o sistema imunitário. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma formulação de Apo2L/TRAIL que é eficaz para diagnóstico ou tratamento do distúrbio e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). A etiqueta no recipiente, ou associada a este, indica que a formulação é utilizada para diagnóstico ou tratamento do distúrbio escolhido. O artigo de fabrico pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo água-para-injecção, uma solução farmaceuticamente aceitável, solução salina, solução de Ringer, ou solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e folhetos com instruções para utilização.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se pretende que limitem de modo algum o âmbito do presente invento. Os reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante a menos que indicado em 51 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ contrário. A fonte das células identificadas nos seguintes exemplos, e ao longo do fascículo, através de números de entrada ATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia.
Foram preparadas formulações e foram conduzidos ensaios para identificar formulações de Apo2L/TRAIL possuindo características desejáveis de um ponto de vista terapêutico, de diagnóstico e/ou comercial. Em particular, os Requerentes procuraram identificar componentes de formulação e condições que, entre outras coisas, pudessem aumentar a solubilidade de Apo2L/TRAIL biologicamente activo, particularmente a concentrações até pelo menos 20 mg/ml, e pudessem proporcionar estabilidade após armazenamento a 2-8°C ou à temperatura ambiente. Os Requerentes procuraram também identificar formulações de Apo2L/TRAIL para utilizar na clínica que possam conservar o teor de trímero não covalente nativo, distribuição de cargas, e/ou actividade biológica da proteína durante o armazenamento. EXEMPLO 1: Formulações Líquidas de Apo2L/TRAIL com Maior Solubilidade e Estabilidade
Proteína Apo2L/TRAIL consistindo nos aminoácidos 114-281 (ver Figura 1) foi expressa em E. coli sob o controlo do promotor de AP (preparação e expressão descritas no Exemplo 8 (Secção A) de WO 01/00832 publicado a 4 de Janeiro de 2001), e purificada a partir de lisados celulares de E. coli através de três passos cromatográficos consistindo em permuta catiónica, hidroxiapatite, e cromatografia de interacção hidrófoba (WO 01/00832, Exemplo 8, Secção C) . Na terceira separação cromatográfica, a proteína Apo2L/TRAIL foi eluída em sulfato de Na 600 mM ou sulfato de amónio 400 mM, Tris 50 mM, pH 7,5. Foi então mudado o tampão da proteína para os vários excipientes de formulação listados na Tabela 1 através de diálise, que foi a seguir concentrada à temperatura ambiente utilizando filtração em Centricon-10 até concentrações de 20 mg/ml. As amostras foram então filtradas através de filtros de 0,22 micrómetros e armazenadas a 2-8°C ou 30°C para avaliar a solubilidade e a estabilidade. 52 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Tal como mostrado na Tabela 1, foram examinados cerca de 20 excipientes diferentes. Foram utilizados excipientes de grau NF, USP, ou EP de elevada pureza de fontes comerciais comuns (Sigma, Mallindkrodt) a menos que indicado em contrário como se segue: di-hidrato de alfa,alfa-trealose (Pfanstiehl ou Senn), sacarose (Pfanstiehl), Captisol” (Cydex), base livre de Arginina (Ajinomoto ou Kyowa Hakko Kogyo). Os critérios utilizados para a pesquisa inicial de excipientes incluíram (1) solubilidade a 2-8°C (a condição de armazenamento de preparações em massa antes de encher nos frascos), (2) solubilidade sob passos de ultrafiltração e diafiltração à escala de fabrico, (3) estabilidade líquida a curto prazo e estabilidade a congelação-descongelação, e (4) estabilidade física da formulação liofilizada. A solubilidade a 2-8°C foi avaliada através de avaliação visual periódica de precipitação durante até 1 mês e confirmada através de varrimento de espectroscopia de UV utilizando um coeficiente de extinção de 1,53 a 278 nm. A Tabela 1 indica que os excipientes possuindo condições de força iónica relativamente elevada proporcionaram solubilidade a concentrações de Apo2L/TRAIL acima de 10 mg/ml a 2-8 °C. 53 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ TABELA 1
Excipiente Solubilidade a 2-8°C Trealose a 8% <3 mg/ml Sacarose a 8% <3 mg/ml Sacarose a 16% <2 mg/ml Lactitol a 6% <2 mg/ml Sacarose a 4%/Manitol a 4% < 2mg/ml PEG3350 a 5% <5 mg/ml Glicerol a 20% <5 mg/ml NaCl 0,15 M <5 mg/ml fosfato de Na 0,25 M <5 mg/ml Glicina 0,5 M <12 mg/ml Aspartato 0,5 M 10-20 mg/ml sulfato de Na 0,5 M 10-20 mg/ml acetato de Na 0,5 M >20 mg/ml cloreto de Na 0,5 M >20 mg/ml Sulfobutiléter de beta-ciclodextrina a 24% (Captisol”) >20 mg/ml Tris 0,5M >20 mg/ml tartarato de arginina 0,5M >20 mg/ml A estabilidade liquida a curto prazo (período de armazenamento de 1 semana a 30°C) foi então avaliada quanto a várias das preparações mostradas na Tabela 1 que proporcionaram solubilidade de Apo2L/TRAlL a concentrações de cerca de 20 mg/ml. A estabilidade a curto prazo foi avaliada através de avaliação visual da turbidez, HPLC de exclusão de tamanho (SEC) para determinar a quantidade de trímero nativo e de agregados nas preparações, e através de HPLC de permuta iónica (IEX) para determinar a distribuição de cargas. A SEC foi conduzida utilizando uma coluna de Superose 12 (Pharmacia) e uma corrida da fase móvel de fosfato de Na 13 mM, sulfato de amónio 400 mM (pH 6,5) a uma taxa de 0,6 ml/min. A IEX foi conduzida utilizando uma coluna ProPac WCX-10 (Dionex) a 40°C e uma corrida de gradiente de NaCl a um caudal de 0,5 ml/min. 54 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Os resultados são mostrados na Figura 2. As preparações de sulfato de sódio, tartarato de arginina, captisol”, e acetato de sódio exibiram maior estabilidade num ou em ambos os ensaios (Figura 2).
Exemplo 2: Formulações de Apo2L/TRAIL Liofilizadas Contendo Sais de Arginina
Os Requerentes verificaram que formulações de Apo2L/TRAIL contendo sais de arginina podiam ser facilmente concentradas a >20 mg/ml de proteína através de ultrafiltração e diafiltração. Devido a certas propriedades farmacocinéticas in vivo da forma da proteína Apo2L/TRAIL de 114-281 aminoácidos (descrita no Exemplo 1), os Requerentes procuraram particularmente identificar uma formulação estável possuindo A 20 mg/ml de proteína Apo2L/TRAIL.
Para identificar os sais de arginina que proporcionam produtos liofilizados farmaceuticamente e comercialmente viáveis, foi avaliada a estabilidade física de formulações veículo contendo diferentes sais de arginina. Os sais de arginina foram preparados através de titulação de base livre de Arginina 0,5 M com vários ácidos (mostrados na Tabela 2) para dar uma solução de pH 7 em Tris 20 mM. Foram enchidas preparações de 2 ml em frascos de vidro de 5 cm3 e sujeitas a um longo ciclo conservativo de secagem por congelação (liofilização) (congelação a -50°C, secagem primária a 0°C e secagem secundária a 42°C) . A osmolalidade das soluções (antes da liofilização) foi também determinada utilizando métodos de depressão da pressão de vapor para identificar as preparações que podem ser adequadas para administração IV num cenário clínico. A Tabela 2 indica que as preparações liofilizadas contendo ácidos polianiónicos orgânicos ou inorgânicos exibiram mais estabilidade física desejável que as preparadas utilizando ácidos monoaniónicos. Os produtos liofilizados dos sais polianiónicos surgiram como bolos secos intactos sólidos (indicados na Tabela 2 como "sim"), em vez de cascas em forma de ovo ou fragmentadas fundidas, gelificadas, colapsadas, fenestradas (indicadas na Tabela 2 como "não") . 55 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Adicionalmente, sais de arginina 0,5 M de ácidos polianiónicos demonstraram uma osmolalidade que pode ser adequada para administração IV (menos de cerca de 2 vezes hipertónica), ao contrário dos sais de arginina monoiónicos (p.ex. o lactato de arginina 0,5 M dá uma solução 3,1* hipertónica) e algumas das outras preparações de força iónica relativamente elevada que exibiram boa solubilidade e estabilidade liquida (p.ex., o acetato de sódio 0,5 M dá uma solução 3,4 vezes hipertónica). TABELA 2
Sais de arginina Estabilidade física lio. aceitável? Osmolalidade da solução 0,5 M* citrato de Arg Sim 505 tartarato de Arg Sim 530 maleato de Arg Sim 573 succinato de Arg Sim 630 oxalato de Arg Sim ND lactato de Arg Não 927 glicolato de Arg Não ND acetato de Arg Não 978 glutamato de Arg Não 899 fosfato de Arg Sim 465 sulfato de Arg Sim 462 nitrato de Arg Não 774 Arg-HCl Não 830 *Os valores são mosmol/kg. As soluções isotónicas têm uma osmolalidade de aproximadamente 292-300. "ND" indica que o valor não foi determinado.
Com base nos resultados obtidos no estudo relatado na Tabela 2, várias formulações contendo Apo2L/TRAIL liofilizadas foram então avaliadas quanto à estabilidade bioquimica da proteína após armazenamento a várias temperaturas. Apo2L/TRAIL (resíduos 114-281; preparada tal como descrito no Exemplo 1) foi formulada através de ultrafiltração/diafiltração até 10 mg/ml em tartarato de arginina ou citrato de arginina 56 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 0,5 Μ, ou até 3 mg/ml em sacarose ou trealose a 8%. Todas estas preparações continham Tris 20 mM, pH 7,0 e polissorbato 20 a 0,01%. As amostras foram então liofilizadas tal como descrito acima. A estabilidade foi avaliada através da medição do teor de trimero nativo e de agregados utilizando SEC (descrita no Exemplo 1) e a distribuição de cargas utilizando IEX (descrita no Exemplo 1).
Após 4 meses de armazenamento a 40°C, a % de trimero e a % do pico principal de IEX foi determinada relativamente a uma solução de controlo não liofilizada que foi armazenada a -70°C (ver Figura 3A). Os dados na Figura 3A indicam que as formulações liofilizadas contendo sal de arginina exibiram maior estabilidade em comparação com as preparações de formulações contendo sacarose ou trealose.
Para examinar melhor os efeitos do tipo de sal de arginina na estabilidade de formulações de Apo2L/TRAIL, ambas as formulações liquidas e liofilizadas de quatro formulações diferentes de Apo2L/TRAIL contendo sal de arginina a 20 mg/ml foram monitorizadas quanto à estabilidade bioquímica da proteína. A estabilidade líquida foi monitorizada a 2-8°C e à temperatura ambiente durante até 1 mês (Tabela 3) e a estabilidade liofilizada foi monitorizada a 50°C durante um mês (Figura 3B).
Para além da condução de ensaios de SEC e IEX descritos no Exemplo 1, a formação de dímeros covalentes foi monitorizada através de SEC sob condições desnaturantes (SDS-SEC). O ensaio SDS-SEC foi conduzido utilizando uma coluna TSK-2000XL (TosoHaas) corrida a 0,6 ml/min numa fase móvel consistindo em fosfato de sódio 25 mM, SDS a 0,1%, NaCl 200 mM. As amostras foram diluídas até 1 mg/ml de proteína com uma solução que deu Tris 50 mM (pH 7,0), NaCl 200 mM, SDS 0,5%, pH 9 e iodoacetamida 5 mM (Sigma). As amostras foram então incubadas a 50°C durante 10 minutos antes da análise de HPLC. A bioactividade da Apo2L/TRAIL foi também determinada nas várias formulações utilizando células SK-MES-1 e coloração de Azul de Alamar para contagem das células viáveis. No ensaio, a formulação de Apo2L/TRAIL (50 μΐ a 2 pg/ml) foi adicionada ao 57 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ meio de ensaio (Albumina de Soro Bovino a 0,1%, RPMI 1640) e foram feitas diluições em série de 2 vezes em placas de 96 poços. Depois, foram adicionados aos poços 50 μΐ de células SK-MES-1 (linha celular de carcinoma pulmonar humano, ATCC HTB58) a uma densidade de 20 000 células/poço. As placas foram incubadas durante 24 horas a 37°C e foi adicionado Azul de Alamar durante as últimas 4 horas do tempo de incubação de 24 horas. A intensidade da coloração foi determinada num leitor de placas de fluorescência com comprimento de onda de excitação regulado a 530 nm e emissão a 590 nm. Um ajuste aos dados de quatro parâmetros no intervalo do ensaio de 0,1 a 1000 ng/ml dá a ED50, ou a concentração de Apo2L/TRAIL que induz 50% de morte das células. A potência de morte celular aumenta com a diminuição da ED50.
Tal como mostrado na Tabela 3, após 1 mês de armazenamento das formulações liquidas a 2-8°C, as quatro formulações contendo sal de arginina mostraram apenas pequenas diferenças na qualidade de Apo2L/TRAIL. A formulação de sulfato de arginina exibiu o teor mais elevado de formação de agregados. A formulação de maleato de arginina exibiu a maior extensão de formação de dímeros, e as formulações de fosfato de arginina e de maleato de arginina mostraram a maior mudança na % da área do pico principal de IEX.
Após 2 semanas de armazenamento à temperatura ambiente, as formulações de sulfato de arginina e de succinato de arginina mantiveram o nível mais elevado de bioactividade (Tabela 3).
Globalmente, a formulação de succinato de arginina demonstrou de algum modo características de estabilidade superiores para Apo2L/TRAIL no estado líquido. 58 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ TABELA 3
Formulações % de Trímero1 % do pico principal de IEX restante1 (% de controlo) % de Monómero1 bioactividade2 Maleato de arginina 96,2 105,1 93,4 77, 0 Succinato de arginina 96,2 94,7 94,9 88, 5 Sulfato de arginina 95,4 93,4 93,3 90,5 Fosfato de arginina 96,0 91,0 91,8 74,3 10s dados são para 1 mês de armazenamento a 2-8°C. 20s dados são para 2 semanas de armazenamento à temperatura ambiente. A estabilidade das formulações liofilizadas contendo estes sais de arginina, após 1 mês de armazenamento a 50°C foi também avaliada através de SEC, IEX e SDS-SEC (utilizando os protocolos descritos acima). Não foram observadas mudanças nas propriedades fisico-quimicas (ver Figura 3B), sugerindo que uma estabilização significativa de Apo2L/TRAIL pode ser alcançada através de liofilização de formulações de Apo2L/TRAIL contendo sais de arginina. Um perfil de Arrhenius utilizando estabilidade de temperatura acelerada de uma formulação de Apo2L/TRAIL liofilizada a 10 mg/ml em tartarato de arginina 0,5 M, Tris 20 mM, pH 7,0, polissorbato 20 a 0,01%, sulfato de Zn 0,33 mM é mostrado na Figura 3C, e prevê um prazo de validade relativamente longo a 2-8°C, e um prazo de validade > 2 anos à temperatura ambiente. Os Requerentes verificaram que uma formulação liofilizada ("lio") contendo 20 mg/ml de Apo2L/TRAIL em Tris 20 mM, pH 7,2, succinato de arginina 0,5 Me polissorbato 20 a 0,02% era estável a temperaturas tão elevadas como 50°C durante pelo menos 12 meses (Tabela 4) . A cinética da mudança na % do pico principal de IEX prevê um prazo de validade significativamente longo (>7 anos) a 2-8°C (bem como à temperatura ambiente), tal como com a formulação descrita acima na Figura 3C. 59 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ TABELA 4
Temperatura % de Trímero % do pico principal de IEX % de Monómero controlo líquido a -70°C 97,4 46,1 99,0 Lio, 2-8°C, 12 meses 97,5 46,5 99,0 Lio, 30°C, 12 meses 97,3 45,4 98,8 Lio, 40°C, 12 meses 97,4 44,6 98,8 Lio, 50°C, 12 meses 97,3 42,5 98,7
EXEMPLO 4: Efeitos do pH em Formulações de Apo2L/TRAIL
Tal como descrito em WO 01/00832 publicado a 4 de Janeiro de 2001 (ver também, Hymowitz et al., Biochemistry 39: 633-640 (2000)), a proteína Apo2L/TRAIL forma um homotrímero com um tiol coordenado em Zn na posição da cisteína 230 de cada monómero, e a formação de uma ligação dissulfureto intramolecular na cisteína 230 resulta em perda de bioactividade da proteína. As proteínas contendo cisteína são tipicamente formuladas a baixo pH, bem abaixo do pKa dos grupos tiol, para prevenir a formação de ligações dissulfureto (ver, p.ex., N. Derby e T. Creighton, "Disulfide Bonds in Protein Folding and Stability", Methods in Enzymology, Vol. 40 (Editado por B.A. Shirley; Humana Press Inc, Totowa, NJ) , Capítulo 10 (1995)). Surpreendentemente, tal como os resultados discutidos abaixo revelam, verificou-se que a estabilidade do trímero de Apo2L/TRAIL nativo, não covalente diminuía com a diminuição do pH.
Apo2L/TRAIL consistindo nos aminoácidos 94-281 (Figura 1) (aqui referida e na Figura 4 como "Apo2L/TRAIL.2") foi preparada essencialmente tal como descrito em WO 01/00832, excepto que foi utilizada uma cromatografia de afinidade de quelação de Ni, em vez da CIH, como terceiro passo cromatográfico. As formulações foram preparadas através de análise em succinato de Na 10 mM (pH no intervalo de 5,5 a 6,5) ou fosfato de Na 10 mM (pH no intervalo de 7 a 7,5) . A estabilidade líquida destas formulações foi avaliada através 60 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ de SEC e ensaios de bioactividade de acordo com procedimentos descritos nos Exemplos acima.
Em um dia de armazenamento à temperatura ambiente, as formulações possuindo pH abaixo de cerca de pH 6,5 perderam teor de trímero e bioactividade (ver Figura 4A) . Este perfil de estabilidade do pH foi observado com outras variantes da proteína Apo2L/TRAIL. Por exemplo, uma formulação de Apo2L/TRAlL marcada com poli-histidina consistindo nos aminoácidos 114-281 (Figura 1) (His-Apo2L/TRAIL; preparada essencialmente tal como descrito por Ashkenazi et al., "Safety and Antitumor Activity of Recombinant Soluble Apo2 ligand", JCI 104: 155-162 (1999)) foi preparada nos tampões succinato de Na 10 mM (pH 5,5 a 6) ou fosfato de Na 10 mM (pH 6,5 a 7). Após armazenamento a 30°C durante 1 semana, foi verificado que a estabilidade do trímero e a bioactividade (determinada tal como descrito acima para as formulações da Figura 4A) eram aumentadas a pH 2 6,5 (ver Figura 4B). A análise da estrutura cristalina de Apo2L/TRAIL revela que a coordenação de um átomo intrínseco de Zn para três tióis livres da cisteína 230 é necessária para uma dobragem correcta e estabilidade estrutural nativa da proteína (ver WO 01/00832 e Hymowitz et al., supra). Crê-se que o perfil de estabilidade do pH inesperado de Apo2L/TRAIL, embora não completamente compreendido, esteja associado à perda da ligação de Zn ao trímero à medida que a porção tiol se torna mais protonada a pH inferiores (ver Figura 5). Crê-se que pH neutro no intervalo de cerca de 6,5 a cerca de 8,5 será preferido para a manutenção da bioactividade e da estabilidade físico-química das formulações de Apo2L/TRAIL.
EXEMPLO 5: Efeito do tensioactivo na estabilidade de Apo2L/TRAIL
Para examinar o efeito do tensioactivo na estabilidade de formulações de Apo2L/TRAIL, formulações contendo 20 mg/ml de Apo2L/TRAIL (proteína 114-281 (Figura 1); preparada tal como descrito no Exemplo 1) em succinato de arginina 0,5 M, Tris 20 mM, pH 7,2, e concentrações variáveis de Tween 20 (0,005%, 0,01%, 0,02%, ou nenhum (como controlo)) foram preparadas e agitadas a 70 rpm e à temperatura ambiente durante até 61 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 24 horas em frascos de vidro posicionados horizontalmente. Ao fim de 1 hora de agitação, foi observado um aumento na dispersão luminosa (medida por absorvância no intervalo de 340-360 nm) à medida que a concentração de Tween 20 caia abaixo de 0,005% (Figura 6).
Crê-se portanto que pode ser preferível incluir um ou mais tensioactivos não iónicos tal como Tween 20 nas formulações de Apo2L/TRAlL para aumentar a estabilização contra a agitação e o manuseamento que podem desnaturar a proteína bruta nas interfaces ar-água.
EXEMPLO 6: Efeito do sulfato de Zn na estabilidade de formulações líquidas de Apo2L/TRAIL
Uma formulação líquida da proteína Apo2L/TRAIL consistindo nos resíduos 114-281 (Figura 1) (preparada tal como descrito no Exemplo 1) foi preparada utilizando 20 mg/ml de Apo2L/TRAlL, tartarato de arginina 0,5 M, Tris 20 mM, pH 7,0, na presença de sulfato de Zn zero, 117 μΜ, ou 330 μΜ. Após armazenamento a 30°C ou 2-8° durante até 2 meses, a estabilidade foi avaliada através de SEC, IEX, e SDS-SEC (tal como descrito acima nos Exemplos 1 e 2) relativamente às amostras de controlo a -70°C.
Tal como mostrado na Figura 7, a adição de sulfato de Zn às formulações proporcionou maior estabilização contra a formação de dímeros intramoleculares ligados por dissulfureto. Embora o sulfato de Zn não tenha afectado a estabilidade de Apo2L/TRAIL a 2-8°C, melhorou a estabilidade em relação a formação de dímeros a temperaturas mais elevadas (Figura 7).
EXEMPLO 7 : Cristalização_Reversível_de_Apo2L/TRAIL
Biologicamente Activa
Os Requerentes verificaram que sob condições de baixa solubilidade de Apo2L/TRAIL (por exemplo, força iónica moderada a baixa), a proteína pode ser cristalizada. Tal como aqui descrito, a velocidade de cristalização, o tamanho das partículas e o rendimento podem ser controlados para dar métodos industriais úteis para purificação, armazenamento em 62 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ massa e formulação em suspensão de libertação controlada de Apo2L/TRAIL.
A proteína Apo2L/TRAIL consistindo nos resíduos 114-281 (Figura 1) (preparada tal como descrito no Exemplo 1) foi formulada à temperatura ambiente utilizando uma coluna NAPS (Pharmacia), eluição em Tris 20 mM, pH 7,2 e várias concentrações de sulfato de Na. Após eluição à temperatura ambiente, dentro de horas, foram observados cristais de forma hexagonal de comprimentos variáveis (ver Figura 8). A solubilidade em equilíbrio foi alcançada quando as amostras foram continuamente giradas durante 3-4 dias a uma dada temperatura. Houve um mínimo de solubilidade a uma força iónica de aproximadamente 10-50 mM. A solubilidade aumentou até ao máximo a aproximadamente 0,3 M de sulfato de Na e depois diminuiu até à solubilidade limitante do sal ser alcançada. O padrão foi semelhante a temperaturas mais elevadas, mas a solubilidade aumentou com o aumento da temperatura. A observação de solubilidade crescente da proteína (diminuição assim da cristalização) com o aumento da concentração de sal no intervalo das centenas de milimolar de sal é contrária ao entendimento comum em relação a outras proteínas, onde a propensão para cristalização tende a aumentar com o aumento da concentração de sal (ver, p.ex., A. Ducruix e MM Reis-Kautt, "Solubility Diagram Analysis and the Relative Effectiveness of Different Ions on Protein Crystallization", "METHODS: A Companion to Methods in Enzymology", Vol. 1, pág. 25-30 (1990)).
Sais catiónicos monovalentes (tais como cloreto de sódio) proporcionaram a maior propensão para cristalização tal como mostrado na Figura 9, enquanto os sais catiónicos bivalentes (p.ex. cloreto de cálcio e cloreto de magnésio) reduziram significativamente a cristalização. A cristalização ocorreu também em soluções de aminoácidos de carga positiva (sais de lisina e sais de arginina) e de carga negativa (ácido aspártico) numa concentração abaixo de 0,3 molar (ver
Figura 9), embora os sais de arginina tenham reduzido a propensão para a cristalização à mesma força iónica.
Para identificar vários parâmetros do processo de cristalização, uma solução de 0,5 1 contendo 5 mg/ml de 63 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Apo2L/TRAIL (resíduos 114-281; preparada tal como descrito no Exemplo 1), Na2S04 0,1 M e Tris 20 mM a pH 7,2 foi sujeita a um arrefecimento de um único passo da temperatura ambiente para 5°C. Foram efectuadas quatro experiências com velocidades de agitação variando de 0 a 200 rpm. A concentração de sobrenadante de Apo2L/TRAIL foi medida em intervalos de 10 minutos utilizando espectroscopia de UV para monitorizar o progresso da cristalização. A Figura 10A mostra que a cristalização ficou mais de 90% completa em 2 horas quando a proteína bruta foi agitada a 50 rpm ou mais depressa. Em comparação a cristalização sem agitação foi muito mais lenta. A cristalização estática não alcançou 90% da completação até 2 dias após o arrefecimento ter começado. A velocidade de cristalização pareceu aumentar com o aumento da velocidade de agitação. A Figura 10B representa o perfil de dissolução de cristais de Apo2L/TRAlL sob agitação. A lama de cristais foi aquecida de 5°C a 30-35°C com a mesma velocidade de aquecimento em cada experiência de dissolução. A concentração de Apo2L/TRAIL no sobrenadante foi medida em intervalos de 5 minutos para monitorizar a velocidade de dissolução. A velocidade de dissolução dos cristais aumentou quando a velocidade de agitação foi aumentada de 50 rpm para 200 rpm. A velocidade de transferência de calor entre a camisa do tanque e a lama de cristais foi também aumentada quando a velocidade de agitação aumentou. À velocidade de agitação de 100 rpm, foi alcançada dissolução completa em meia hora quando a temperatura da amostra estava a aproximadamente 35°C. A Figura 10C mostra a distribuição dos tamanhos dos cristais em função da velocidade de agitação durante a cristalização. A distribuição do tamanho dos cristais foi medida utilizando um Analisador do Tamanho de Partículas Malvern MasterSizerX. O diâmetro médio (D(v, 0,5)) diminuiu à medida que a velocidade de agitação aumentou, e a distribuição dos tamanhos dos cristais (D(v, 0,1) a D (v, 0,9)) tornou-se mais uniforme com agitação mais rápida. Portanto, a manipulação da velocidade de agitação durante a cristalização parece ser eficaz no controlo do diâmetro médio dos cristais de Apo2L/TRIAL bem como na distribuição dos tamanhos dos 64 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ cristais, ο que pode ser desejável para formulações de libertação controlada.
Exemplo 8: Secagem dos Cristais de Apo2L/TRAlL
Para avaliar a viabilidade da secagem de cristais de Apo2L/TRAIL para formulação de libertação controlada ou armazenamento em massa, foram avaliados três métodos de secagem diferentes. O primeiro método de secagem avaliado foi a secagem estática em vácuo. Apo2L/TRAIL (aminoácidos 114-281; purificada de acordo com o método descrito no Exemplo 1) foi cristalizada em Tris 20 mM, sulfato de sódio 0,1 M, pH 7,2 e lavada com água fria para remover o excesso de sal. A lama de cristais foi enchida em frascos de vidro abertos e seca sob vácuo a 29-30 polegadas de mercúrio à temperatura ambiente de um dia para o outro. Os cristais secos foram dissolvidos até 2-3 mg/ml em água ou em sal de arginina 0,5 M, Tris 20 mM, pH 7,2. O segundo método de secagem avaliado foi a secagem com vácuo vibracional (aparelho obtido em SWECO Co.) para permitir um melhor fluxo e diminuição da aglomeração de sólidos. A lama de cristais foi carregada num filtro de 20 ym para remover o liquido bruto, e os cristais húmidos foram lavados com tampão Tris frio (20 mM, pH 7,5) ou mistura de etanol-água (50%, 63%, 75%, 100%, v/v). Os cristais lavados foram secos através de passagem de gás de azoto desumidificado desde o fundo do filtro. Um ligeiro vácuo (8-10 polegadas de mercúrio) a partir do topo da câmara do filtro facilitou a velocidade de secagem. Para além disso, a câmara do filtro contendo os cristais húmidos vibrou a 1800 rpm para quebrar o bolo húmido num pó fino durante o processo de secagem. O processo de secagem foi monitorizado utilizando um sensor de humidade relativa. O produto seco foi recuperado através de uma porta de descarga. As lavagens de mistura de etanol-água produziram um pó mais fino e mais solto que os cristais lavados com tampão Tris, que por sua vez aumentaram o rendimento do processo. Estes
cristais foram dissolvidos numa sal de arginina 0,5 M tamponado, tal como descrito para os cristais secos em vácuo. 65 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ Ο terceiro método de secagem avaliado foi a liofilização. Neste método, a lama de cristais foi lavada com água fria e enchida em frascos de vidro. O excesso de água total foi removido após o assentamento dos cristais. A lama foi então congelada a -50°C. A secagem primária e secundária foram realizadas a -25°C e 0°C, respectivamente. Estes cristais eram pós mais soltos e facilmente dissolvidos em sais de arginina 0,5 M tamponados. A qualidade da proteína nos cristais dissolvidos foi então avaliada utilizando ensaios SEC, SDS-SEC, IEX, e de bioactividade tal como discutido nos Exemplos 1 e 2. A Tabela 5 e as Figuras 11A-11B mostram que cristais de Apo2L/TRAIL secos com os diferentes métodos permaneceram bioquimicamente equivalentes à preparação de controlo líquida congelada não cristalizada. TABELA 5 Método de secagem % de trímero através de SEC % de monómero através de SDS-SEC % do pico principal de IEX Controlo (material de partida congelado) 98,0 96,8* 53,6 Secagem em vácuo vibracional-lavagem com água 97,4 98,1 54,9 Secagem em vácuo vibracional-lavagem com etanol a 50% 97,7 97,5 53,7 Secagem em vácuo vibracional-lavagem com etanol a 62,5% 97,9 97,5 53,4 Secagem em vácuo vibracional-lavagem com etanol a 75% 97,7 97,7 52,8 Secagem em vácuo vibracional-lavagem com etanol a 100% 97,8 98,0 53,3 *A aparente menor % de monómero na amostra de controlo através de SDS-SEC é devida a impurezas no material de partida que co-eluem com o dímero de Apo2L em SDS-SEC. 66 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Os dados sugerem que a cristalização de Apo2L/TRAIL e a subsequente secagem do material não afecta adversamente a estrutura ou a função proteica.
Exemplo 9: Formulação Liofilizada Contendo Apo2L/TRAIL
Cristalina em Sulfato de Sódio
Para avaliar a estabilidade em armazenamento de Apo2L/TRAlL contendo cristais, foram preparadas formulações liofilizadas com Apo2L/TRAIL cristalina (residuos 114-281) em Tris 20 mM, pH 7-7,5, sulfato de sódio 0,2-0,5 M, e Tween 20 0,01-0,05%. As amostras foram armazenadas a várias temperaturas durante até 4 meses. Após reconstituição com água estéril, as formulações foram testadas quanto à estabilidade fisico-quimica utilizando os ensaios SEC, IEX, e SDS-SEC descritos nos Exemplos 1 e 2. A Tabela 6 resume os dados para uma formulação de Apo2L/TRAIL a 20 mg/ml em sulfato de Na 0,2 M, Tris 20 mM, pH 7,2, Tween 20 a 0,01% após 3 meses de armazenamento. TABELA 6
Temperatura % de Trimero % do pico principal de IEX % de Monómero Controlo liquido a -70°C 99,3 56,1 99,1 Lio, 2-8°C, 3 meses 99,1 58,2 99,3 Lio, 30°C, 3 meses 97,0 56,4 98,3 Lio, 40°C, 3 meses 94,1 52,9 95,9 Lio, 50°C, 3 meses 90,1 44,8 91,7
Assumindo uma cinética de degradação de pseudo-primeira ordem, os perfis de Arrhenius preveem um prazo de validade significativamente maior que 2 anos para esta formulação a 2-8°C (ver Figura 12) . Estas preparações, embora enchidas como soluções liquidas transparentes de Apo2L/TRAIL, cristalizam a vários graus durante a porção de congelação do ciclo de liofilização, demonstrando que as formulações secas contendo Apo2L/TRAIL cristalizada e sulfato de sódio têm estabilidade em armazenamento a longo prazo. 67 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
Exemplo 10: Cristalização de Apo2L/TRAIL como Método de Recuperação e Purificação A propensão para cristalização de Apo2L/TRAlL em soluções de sulfato de Na foi utilizada como meio de purificação da proteína Apo2L/TRAIL a partir de extractos de E. colí. O seguinte protocolo pode ser empregue para recuperação e purificação de Apo2L/TRAIL recombinante sem efeitos adversos na qualidade da proteína. O caldo de células inteiras colhido derivado de E. colí (descrito no Exemplo 1) foi ajustado a pH 7,5 com Hepes 1,5 M (ou Tris 1,5 M) e depois homogeneizado num homogeneizador (Gaulin Corporation, Everett, MA). O homogenato foi condicionado com DTT 5 mM e floculado com polietilenoimina a 0,1% durante 1-2 horas. O material floculado foi centrifugado numa centrífuga de alimentação contínua BTPX205 (Alfa Lavai Separation AB, Suécia) e clarificado através de filtração em profundidade. O lisado celular clarificado (extracto) foi condicionado com Triton-X100 até uma concentração final de 0,05%. O lisado celular condicionado, clarificado foi então carregado numa coluna de permuta catiónica (resina de permuta catiónica SP-Sepharose FF, Amersham Pharmacia, Suécia) equilibrada em Hepes 50 mM (ou Tris 50 mM)/Triton-X 100 a 0,05%/DTT 1 mM, pH 7,5. Apo2L/TRAIL ligou-se à coluna ao mesmo tempo que as proteínas que não se ligaram fluíram através da coluna e foram removidas através de lavagem com tampão de equilíbrio até a absorvância a 280 nm alcançar o limiar. A coluna foi então lavada com 3 volumes da coluna de NaCl 0,1 M em tampão de equilíbrio. A Apo2L/TRAIL foi eluída por passos utilizando NaCl 0,1 M (ou Na2SC>4 0,1 M) em tampão Hepes, Tris e Trietanolamina 50 mM cada, Triton-X 100 a 0,05% e DTT 1 mM, pH 7,8. O banco de Apo2L/TRAIL à temperatura ambiente colhido da coluna SP foi colocado num tanque de aço inoxidável com uma camisa isoladora para aquecimento e arrefecimento. O tanque foi equipado com um fundo cónico e uma válvula de lavagem no fundo para uma recuperação máxima da proteína cristalizada. O banco foi agitado utilizando uma hélice de tipo marinho sob condições de mistura modestas. Foi utilizado um patim de controlo da temperatura para descer linearmente a temperatura 68 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ de aproximadamente 25°C para aproximadamente 4°C ao longo de um curso de 1 hora. A cristalização espontânea foi observada em minutos após o banco alcançar 4°C. Após mais de 12 horas sob estas condições, a cristalização estava completa à medida que ficava quase estabelecida a solubilidade em equilíbrio. Os cristais foram então capturados numa montagem de filtração contendo uma frita de polipropileno de 20 ym. Após a deposição dos cristais na superfície do filtro, os cristais foram lavados com Tris 20-50 mM arrefecido a pH 7,5. Um volume igual de tampão de lavagem em comparação com o volume do banco de SP de Apo2L/TRAIL foi então utilizado para remover o licor original residual (sobrenadante) dos cristais depositados. Após a lavagem, os cristais foram dissolvidos em sulfato de sódio 100 mM/Tris 20 mM a pH 7,5 através de recirculação do tampão de dissolução pelo leito dos cristais a aproximadamente 30°C. A dissolução dos cristais foi observada em aproximadamente 4 horas. A Apo2L/TRAIL dissolvida purificada foi então esterilizada por filtração num recipiente e armazenada congelada a -70°C. A pureza das preparações de Apo2L/TRAIL foi determinada através dos ensaios ELISA de proteína total de E. coli (ECP), ensaios de Lisado de Amebócito de Limulus (LAL), e coloração de prata em SDS-PAGE. O ELISA de ECP foi efectuado através da imobilização de anticorpos anti-ECP inteira de cabra purificados por afinidade em poços de placa de microtitulação, incubação das amostras e depois ECP conjugadas com peroxidase de rábano. A actividade enzimática da peroxidase foi então quantificada com o-fenilenodiamina através de leitura da absorvância a 490 nm num leitor de placas de microtitulação. O nível de endotoxina foi determinado utilizando o ensaio de lise do coágulo de Amebócito de Limulus. A coloração de prata em SDS-PAGE foi efectuada num gel de poliacrilamida com gradiente de 10 a 20% (Daiichi Pure Chemicals) em tampão Tris-glicina contendo SDS a 0,1%. A electroforese foi conduzida a uma corrente constante de 50 mA até a frente do corante chegar próximo do fundo do gel. Os géis foram fixados e corados através dos métodos de Azul Brilhante de Coomassie ou coloração de prata de Merrill. 69 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ A qualidade da proteína foi avaliada através de SEC, SDS-SEC, IEX e bioactividade de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 e 2. A pureza e a qualidade da Apo2L/TRAIL recuperada utilizando o método de cristalização de cima numa escala de fermentação de 60 1 são mostradas na Tabela 7. Para comparação, é também mostrado um padrão de referência purificado através de um método de três passos cromatográficos tal como descrito no Exemplo 1. TABELA 7
Prep. de Apo2L/ TRAIL Pureza da Proteína Qualidade da Proteína ECP (ppm) LAL (EU/mg) SDS-PAGE % de Trímero através de SEC % de Monómero através de SDS-SEC % de Bioactividade do controlo (± 20%) % de pico principal de IEX Apo2L/TRAIL purificada através de cristalização 10 0,034 Sem banda a 10 kDa 99, 0 99,0 126 63 Material de referência purificado através de cromatografia padrão 0,82 0,023 Banda a -10 kDa 98, 9 98, 9 86 61
Tal como mostrado na Tabela 7 e na Figura 13, a preparação de Apo2L/TRAIL a uma escala de fabrico teve um elevado grau de pureza adequado para utilização terapêutica. Em particular, uma proteína de ligação a ADN de E. coli de 10 kDa que tende a co-purificar com Apo2L/TRAIL foi removida através do processo de cristalização. Os dados indicam que a proteína Apo2L/TRAIL purificada do passo de "uma coluna" é passível de cristalização e tem uma pureza comparável ou melhor que a proteína Apo2L/TRAIL purificada através do método de purificação de três colunas descrito no Exemplo 1. A Figura 14 mostra o efeito do tipo de sal na cristalização de
uma Apo2L/TRAIL purificada no passo de uma coluna. O "envenenamento" da cristalização por catiões bivalentes foi observado para Apo2L/TRAIL parcialmente purificada (Fig. 14), semelhante ao observado para a Apo2L/TRAIL >99% purificada mostrada na Figura 9. 70 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ
As propriedades bioquímicas de Apo2L/TRAIL também não foram afectadas adversamente pela cristalização da Apo2L/TRAIL parcialmente purificada (ver Tabela 7). Os dados sugerem que a cristalização de Apo2L/TRAIL expressa de forma recombinante, quando num estado parcialmente purificado, pode ser um meio eficaz, eficiente e rentável para a sua purificação. Opcionalmente, tais cristais podem ser utilizados para a preparação de massa seca para armazenamento ou formulações de libertação controlada tal como descrito nos Exemplos 8 e 9. O presente invento não está limitado no âmbito pelas concretizações específicas aqui descritas. De facto, várias modificações do invento para além das aqui descritas tornar-se-ão aparentes aos peritos na arte a partir da descrição anterior e das figuras anexas. Pretende-se que tais modificações estejam dentro do âmbito das reivindicações anexas.
Lisboa, 2010-12-29

Claims (51)

  1. ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação estável de ligando de Apo-2, compreendendo ligando de Apo-2 e de cerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M de sal, em que a referida formulação tem um pH de cerca de 6 a cerca de 9 e o sal é um sal de arginina ou sulfato de sódio.
  2. 2. Formulação da reivindicação 1, em que o referido sal é sal de arginina.
  3. 3. Formulação da reivindicação 1 ou da reivindicação 2, em que a concentração do referido sal de arginina na formulação é de cerca de 0,4 Ma cerca de 0,5 M.
  4. 4. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o sal de arginina é seleccionado de entre o grupo que consiste em succinato de arginina, sulfato de arginina, maleato de arginina, citrato de arginina, tartarato de arginina e fosfato de arginina.
  5. 5. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o sal de arginina é succinato de arginina.
  6. 6. Formulação da reivindicação 1, em que o sal é sulfato de sódio.
  7. 7. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o ligando de Apo-2 compreende proteína cristalizada.
  8. 8. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida formulação é liofilizada.
  9. 9. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o pH da referida formulação é de cerca de 6,5 a cerca de 8,5.
  10. 10. Formulação da reivindicação 9, em que o pH da referida formulação é de cerca de 7 a cerca de 7,5. ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 2/5
  11. 11. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a concentração de ligando de Apo-2 é de cerca de 1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml.
  12. 12. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido Apo-2 compreende os aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO:l (Figura 1).
  13. 13. Formulação da reivindicação 12, em que o referido ligando de Apo-2 não está ligado ou fundido com um marcador epitópico.
  14. 14. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida formulação compreende ainda tensioactivo.
  15. 15. Formulação da reivindicação 14, em que o referido tensioactivo é um polissorbato ou poloxâmero.
  16. 16. Formulação da reivindicação 14, em que a concentração do referido tensioactivo na formulação é de cerca de 0,005% a cerca de 0,2%.
  17. 17. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida formulação compreende ainda tampão.
  18. 18. Formulação da reivindicação 17, em que o referido tampão é tampão Tris.
  19. 19. Formulação da reivindicação 18, em que o pH da formulação é de cerca de 7 a cerca de 7,5.
  20. 20. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida formulação compreende ainda um ou mais iões metálicos bivalentes.
  21. 21. Formulação da reivindicação 20, em que os referidos um ou mais iões metálicos bivalentes são zinco.
  22. 22. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda um conservante. ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 3/5
  23. 23. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida formulação é estável em armazenamento durante pelo menos 12 meses.
  24. 24. Formulação da reivindicação 23, em que a referida formulação é estável em armazenamento durante pelo menos 24 meses.
  25. 25. Formulação estável liofilizada de ligando de Apo-2, compreendendo de cerca de 1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de ligando de Apo-2, de cerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M de sal de arginina, tampão, e tensioactivo, em que a referida formulação tem um pH de cerca de 6 a cerca de 9.
  26. 26. Formulação da reivindicação 25, em que o referido sal de arginina é succinato de arginina.
  27. 27. Formulação da reivindicação 26, em que a concentração do referido succinato de arginina é de cerca de 0,4 Ma cerca de 0,5 M.
  28. 28. Formulação da reivindicação 25, em que o referido tampão é tampão Tris.
  29. 29. Formulação da reivindicação 25, em que o referido tensioactivo é um polissorbato.
  30. 30. Formulação da reivindicação 25, em que o referido ligando de Apo-2 compreende os aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO:1 (Figura 1).
  31. 31. Formulação da reivindicação 25, em que a referida formulação compreende ainda um ou mais iões metálicos bivalentes.
  32. 32. Formulação estável de ligando de Apo-2, compreendendo de cerca de 1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de ligando de Apo-2, de cerca de 0,2 Ma cerca de 0,5 M de sulfato de sódio, tampão e tensioactivo, em que o referido ligando de Apo-2 compreende proteína cristalizada e a referida formulação tem um pH de cerca de 6 a cerca de 9. ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 4/5
  33. 33. Formulação da reivindicação 32, em que o referido tampão é tampão Tris.
  34. 34. Formulação da reivindicação 32, em que o referido tensioactivo é polissorbato.
  35. 35. Formulação da reivindicação 32, em que a referida formulação tem um pH de cerca de 7 a cerca de 7,5.
  36. 36. Método de produção de uma formulação estável de ligando de Apo-2, compreendendo os passos de (a) proporcionar de cerca de 1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de ligando de Apo-2, de cerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M de sal de arginina ou sulfato de sódio, tampão, e tensioactivo, (b) combinar ou misturar os ingredientes do passo (a) para produzir uma formulação, e (c) ajustar o pH da formulação do passo (b) a cerca de 6 a cerca de 9.
  37. 37. Método da reivindicação 36, em que o referido sal de arginina é succinato de arginina.
  38. 38. Método da reivindicação 37, em que a concentração do referido succinato de arginina é de cerca de 0,4 Ma cerca de 0,5 M.
  39. 39. Método da reivindicação 36, em que o referido tampão é tampão Tris.
  40. 40. Método da reivindicação 36, em que o referido tensioactivo é um polissorbato.
  41. 41. Método da reivindicação 36, em que o referido ligando de Apo-2 compreende os aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO:l (Figura 1).
  42. 42. Dispositivo para administração de uma formulação de ligando de Apo-2 a um mamífero, compreendendo um recipiente contendo pelo menos uma unidade de dosagem da formulação de ligando de Apo-2 de qualquer uma das reivindicações 1 a 35.
  43. 43. Dispositivo da reivindicação 42, em que o referido dispositivo é um dispositivo injector em caneta. ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 5/5
  44. 44. Dispositivo da reivindicação 42, em que o recipiente é um cartucho.
  45. 45. Artigo de fabrico compreendendo um recipiente que inclui a formulação de Apo2L/TRAIL de qualquer uma das reivindicações 1 a 35, e instruções impressas para utilizar a referida formulação de Apo-2L/TRAIL.
  46. 46. Artigo de fabrico da reivindicação 45, em que o referido recipiente é uma garrafa, frasco, seringa ou tubo de ensaio.
  47. 47. Artigo de fabrico da reivindicação 45 que compreende um segundo recipiente que inclui água-para-injecção, solução salina de Ringer ou solução de dextrose.
  48. 48. Método in vitro de indução de apoptose em células de mamífero, compreendendo a exposição de células de mamífero a uma quantidade eficaz da formulação de ligando de Apo-2 da reivindicação 1, 25 ou 32.
  49. 49. Método da reivindicação 48, em que as referidas células de mamífero são células de cancro.
  50. 50. Formulação de qualquer uma das reivindicações 1 a 35 para utilizar em tratamento de cancro num mamífero.
  51. 51. Utilização de uma formulação de qualquer uma das reivindicações 1 a 35 para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancro num mamífero. Lisboa, 2010-12-29 EP 1 450 847/PT 1/19 TTTCCTCACTGACTATAAAAGAATAGAGAAGGAAGGGCTTCAGTGACCGGCTGCCTGGCTGACTTACAGCAGTCAGACTCTGACAGGATC F-> «i «C 3 O a <3 C < a O >. t* « E* M t* n E* O 51¾ «<H «c λ < H «e λ OH E* M A 3t A ·* X hU OO «ca uo «c α oo <*-- t*t* UX O uf 3 Λ n < o> X o o o < a E* Vi O 3 U P. o ~t* «> #< —O M uu •UW- E* a «c «_ <C oo «C J aa ΟΡ o«< «ca f*t* UO o«e o f-. u «C 3 H H Ε-· >t o > «C 3 Λ G A >i O i-> f* u a a t* a o H Oh «Ch O H E* a t- £- U Í-O 13> oo OO OO oo õ o <x f- 13 G o a O 9 «C cn O 3 f* « Oh t* W u α E* < <-l e*x t* « O u t* a «Ch e- a «c >, < a O OO t*B« ua «C«C ο α ox o> t« È* o«< < O 3 E*» ο g -< 3 t- « o a Õ U «C 3 a a u t* a O >1 «CH «C H OH Í-* H t* a «CH E*H E* -OfJ t*u oo oo (3í< X M «CS OO «CM E* 0 3 E* <0 t* © «C tn 13 tn OH < c «c a O 3' < E- OH O M o VI < >. t* a «C r* UH E* a e* O o o«e Orf <>< «ca o> OO o< E*a o Orl E* a O 3 OH «C 3 O 3 •C M t* Ol O a «< t- Λ t* « e-< a «C H t* a «c > «C a At* o 0> «CM ua o> Oo UJ <a U< OX f* < u O >1 a c < 3 t* c «C 3 ο α A a o O X OH t*« < ta «CH «<« < >, «C H «< «CE* 13 O oo OJ << OO o-c <o OO A u Φ t· U o a o o O a E-* >· U G E* U E* C A E«Λ o a o u o u «C >t OH «C a O a < n O H D- <«A í-t* OO* «ca OlP «c «< f*« <«c t* O S> «C <9 O a f- u o fci E* C O a ο α «C V· υ £- M «C >i «C >. o « o a < n «C >. 13 OX o «CM «CO «c x t-w (-IA << «ca í-t* «CE* «< OH u w OH t*a O G Ο σ» «c u t- a «Ch A f- i« O a t* a E* H «C a O u ox O >1 E* O > f*U o> 4|M «<«< cc f-O o> «C U$ U »4 «c c t* G «£ O O 3 U G t* í* E* i« «c hrl «c 3, <«* U M e* a A a 0 » O a o <H E*E* OO «c< ΟΡ E*a <A «CU E*U o O 3 O » Ο Λ < G Ε* W o a A 3 E* G f*H «C E-· a A >1 o w Ο Φ «CH «C H -C « t" a «c UJ E*E* oo t*ia ox oo «C«C 0> «c Oh o Ο O a «C t- E- v- 0 3 A a A Dl E* a -C « E* Λ Χ tn O >1 «CH o a E- V «c > O Vi f*í“ A < o> o*< to uo E-« e* α «c α «c <c E* o- O o O w o c O 0 o a O 3 o c «c« E* Λ E* « «c < O >1 «CH o u «< >> t* a <C a E*H UH E* H < o E-U oo ΟΡ «ca f*a «C«< <H o*c «C M «< «c O V- O*» Ο 1« Λ 3 < w O Vi A 3 E* Vi «C tn o < ox E* a O V «CH ox O O Ch o a O M o «< «CE* -<X «CU oo «Cf «C u OO -CU «C«C Ε- u O C o c o G «t c U G O 3 O 3 «C m ο α Ο A <H «CH 4 U <H < te E* a «Ch A >t «C th o A UO oo «c«< oo «C«c UJ OO «ca OX A A «C >1 o » O ** r-l O W o a O c O u E* G O O OH *Ç >t t* « f- « O a t*x «CH E- a A a E* A O o «ca < x o> «cu E* P- oo AX A A O A O 3 O 3 t* w «C W < Oi «C Vt E* « O 3 A 3 A Qt A E* a f- a O V ox O V- o a ex H a «C H A *J < UJ oa <M <E- «c-c E*W t*P- e*o oo E* W O O M O 3 O 3 t* u < >1 E* « A 0) O 3 O a O >1 o o a «C H C H o a OH «CH O H t-> a A >> OH «< < V) oo oo e-« OO UX o«c e* α <a o o o υ o O G «C 3 t* a «c b» o >, t*« *c a E* 3 E* H É* u u «< 19 <H t*H O 14 OH E*X t* a E* a o Oft. *C«C oo «CM «c*< oo E*P< «CH ua ρ·> t* a s O M ο α Ο M O 1« t* N O Vi E* 0 O 3 < 3 A o H ux < a tj ox o a A % U M «Ch t* a A oo «ct* o< «ct* «CE* «cu t* É* OP- oo E*a A o >. E* a Em J3 «e 3 O >1 o o» A Vi u α t* V t* a A Oh t*X «c a «CH OH o u OX A a E*X E*X A OO e- & «<*c oo oo «c«c A E* o-c E Q· E*A A O C o 1* o o o 3 e* u «C V. «c c E- O A a u a O < H «C >1 O vi «Çrl ox u a A H U M É* H OH 6* uo É-É* ΟΡ oo C f" t*u OO u p. «C M o «c t* OH Oh Ο a t* u < a «C vi o u t- VI < >. o >, t* 6" Λ e a A a o a t* Ή o a o a < > 13 H O H O o> θ> o< F- to «ο E*rn E*« E- f* OO oo E* O 3 O M o a o u υ a «C 3 E- V( E* V- o >, u a < <H «C >1 o W ox «C-rt «Ch -< >, O « a h E*x O OO e-e- E-e* <e OX 13 O E* E* CU oo t* a- A o -J t* u t- u < W ο α u a «C M << c E-. qg A ux A >t O 1« ςΐΗ o (* E*H ux <H E-X O <X A 6* Ht* <«c o«c E* E* «Cm •CE* OO t*X E* O «CH t* u O 3 «c fl U Vi O v. u v< E* N E* V «c t* « t* a O a t* a OH o a A >, < > A >. o a E* <s o> «c U í-a o< t*M E- E* E* E* E*E* «cu O t· <0 t* a O ft «Ch O G O V* < tn U a O a «c Oh OH «c a »™f t*« «< u X >1 A >t t* r—4 Oh o o*c o«c o«c < M o> •c «c «ca << M O A A O O H E* a O A-í C tn <C «i t* a o v- O Vi 3 E- t- <B t-· a «c a O w H m* E*X A >, O a A «* A <X o> o< «CX «C«C < H t*o- E* t t*w OO O η n H *-< Η M H »4 H H Η H H H Η H #4 H H *a( M 09 Γ* IP ^ m. vm ^U1 r-tcn O t> «n «Hf ct *# UI H u> M r- ft α N <Λ Γ€ « Cdg; EP 1 450 847/PT 2/19 Figura 2 - Estabilidade líquida de Apo2L/TRAIL em várias preparações após 1 semana de armazenamento a 30°C. % de Trímero restante 305C, 1 semana de armazenamento
    •70 65 60 55 50 LO o" ta z ω a o 4-> Π 10 o" σι < ω Ό Ο φ* ta LO o” ca Z o Ό 0 Φ4 a o CM O M LO θ' ca Z LO O ca Z a> Ό in o' cn •75 % de pico principal de IEX restante Q. ca O 3 tf) ta t ta H O fl) Ό 0 4-1 ca +4 O o < cac ca CL ca< Q - % de Trímero % de pico principal de IEX EP 1 450 847/PT 3/19 Figura 3A Estabilidade das preparações de Apo2L/TRAIL liofilizadas após 4 meses de armazenamento a 40°C. % de Trímero (círculos) 100 99' 98-97-96-95 J 40eC, 4 meses 10 mg/ml de Apo2L/TRAIL. sais de Arg e sulfato de Na 10 mg/ml de Apo2L/TRAIL, açúcares r» 100 90 80 70 60 50 40 30 % de pico principal de IEX (triângulos) 94 T- -1- l -r s Ξ a Lft s? ΙΛ s> ó co o” < a <c (Q dj < φ z Ό Ci 0 d) O Ό Ό Π π 0 M a) 1- 0 (0 1- ò 3 V) -Ç- 00 (Q <L) <fí O <0 O co </) 20 ΕΡ 1 450 847/PT 4/19 Figura 3B - Estabilidade de várias formulações de Apo2L/TRAIL liofilizadas contendo sal de arginina após 1 mês de armazenamento a 50 C. s Mal Arg Succ Arg Arg S04 □ Arg P04
    % de Trímero
    % de Monómero 102 -j 101-100- 99- 98- 97 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 5/19 Figura 3C - Perfil de Arrhenius de uma formulação liofilizada de Apo2L/TRAIL a 10 mg/ml em tartarato de arginina 0,5 M, Tris 20 mM, pH 7,0, polissorbato 20 a 0,01%, sulfato de Zn 0,33 mM
    1ΓΤ ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 6/19 Figura 4 Perfil de estabilidade do pH de Apo2L/TRAIL
    pH a- His-Aoo2UTRAIL d ««",
    % de Trímero (quadrados) 5 7.5 pH ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 7/19 Figura 5 - Coordenação de Zn para Apo2L/TRAIL e efeito do pH
    J i ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 8/19 Figura 6 - Efeito de polissorbato (Tween) 20 na estabilização de Apo2UTRAIL
    Tempo (horas) ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 9/19 Figura 7 - Efeito de Zn na estabilização térmica de Apo2UTRAIL após 2 meses de armazenamento como formulação líquida contendo tartarato de arginina 0,5 M, Tris 20 mM, pH 7,0. -70°C B 2-8*C □ 30°C 100-,
    Sem Zn Com Zn 0,12 mM Com Zn 0,33 mM EP 1 450 847/PT 10/19 Figura 8 - Cristalização de Apo2L/TRAIL em formulações de sulfato de sódio Solubilidade em equilíbrio de Apo2L.O em N^SO, pH 7.2 ~30;sidex180 Jit Solubilidade (mg/ml)
    0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 [Na2SOJ (molar) ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 11/19 Figura 9 - Dependência iónica da cristalização de Apo2UTRAIL. A cristalização foi observada em todos os sais, mas os sais de arginina e Mg maximizaram a solubilidade da proteína no estreito intervalo de condutividade de 10-11,5 mS/cm.
    ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 12/19 Figura 10a - Efeito da velocidade de agitação (linhas contínuas) na cristalização de Apo2L/TRAIL. É também mostrada a temperatura da amostra durante o ciclo de arrefecimento (linhas a tracejado). c n Ό cn c Φ 1_ Δ O Ui o c ffi u '3 α d c o O σι £
    Tempo de cristalização (h) O ffi £ O □3 ffi i_ 3 2 & E s I- - >-200 rpm, Cone. no sobrenadante —100 rpm. Cone. no sobrenadante —50 rpm, Cone. no sobrenadante Q rpm. Cone. no sobrenadante .....200 rpm, temp. global -O·· 100 rpm, temp. global Δ 50 rpm, temp- global o 0 rpm, temp. global ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 13/19 Figura 10b - Efeito da velocidade de agitação na dissolução dos cristais de Apo2L/TRAIL (linhas contínuas). É também mostrada a temperatura da amostra durante o ciclo de aquecimento (linhas a tracejado).
    40 Tempo de dissolução (min.) 35 30 £ "i 25 o Dl m 20 5 ra 15 o. E (U 10 μ _b— 200 rpm, Cone. no sobrenadante —·— 100 rpiTl, Cone. no sobrenadante —50 rpm. Cone. no sobrenadante 200 rpm, temp. global O- '100 rpm, temp. global Δ 50 rpm, temp. global EP 1 450 847/PT 14/19 Figura 10c - Efeito da velocidade de agitação na distribuição de tamanhos dos cristais de Apo2L/TRAIL Diâmetro hidrodinâmico dos cristais |§. m)
    Velocidade de agitação durante a cristalização (rpm) Dív, 0.1] D[v, 0.5] —A— D[v, 0.9] ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 15/19 Figura 11 a - Perfil de IEX de Apo2L/TRAIL após reconstituição dos cristais secos em vácuo A-Perfil de IEX
    Tempo de retenção (min.) EP 1 450 847/PT 16/19 Figura 11b - Bioactividade de Apo2L/TRAIL após reconstituição de cristais secos em vácuo. B-Bioactividade Unidaddes de fluorescência relativa
    [Apo2/TRAIL] ng/ml 1 ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 17/19 Figura 12 - Perfil de Arrhenius de uma formulação liofilizada de Apo2L/TRAIL a 20 mg/ml em sulfato de Na 0,2 M, Tris 20 mM, pH 7,2, Tween 20 a 0,01%.
    1/T ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 18/19 Figura 13 - Pureza por coloração de prata em SDS-PAGE de Apo2L/TRAIL purificada através de cristalização em comparação com um material de referência purificado em três passos de coluna. o T3 «3 N tó Q. (O cc c 3 Õ O cc Ό o o Ό ra O ** 3 £ O O c CD 0Q ω S £
    B O c <01 <u lii ai •a o 3 λ- £ ffl d) <S 2 }:r .;·?· Dímero de Apo2L/TRAIL tm-i. im tm tH λ Λ-}·:·:·:·-·
    Monómero de Apo2L/TRAIL ***jwí| ΕΡ 1 450 847/ΡΤ 19/19 Figura 14 - Efeito do tipo de sal na cristalização de Apo2L/TRAIL parcialmente purificada. Após purificação parcial de Usados clarificados de E. coli em coluna de permuta catiónica SP-Sepharose, a proteína foi eluída a 5-10 mg/ml em Tris 20 mM, pH 8 e 0,2 M de um dos sais mostrados. As amostras foram armazenadas a 2-8BC durante 3-7 dias. Foi então filtrada uma alíquota e a concentração proteica solúvel foi medida através de varrimento do espec. de UV. Ό « N 75 O vP
    CM Õ u>
    O (fí u> O cu Z c*J 7¾ o y n z (D Ό O o cn CM CUz
    cu < 2 Õ
PT02784443T 2001-11-13 2002-11-12 Formulações de ligando de apo2/trail e suas utilizações PT1450847E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33824901P 2001-11-13 2001-11-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1450847E true PT1450847E (pt) 2011-01-05

Family

ID=23324037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT02784443T PT1450847E (pt) 2001-11-13 2002-11-12 Formulações de ligando de apo2/trail e suas utilizações

Country Status (11)

Country Link
US (3) US7741282B2 (pt)
EP (3) EP2332531B1 (pt)
JP (2) JP2005521640A (pt)
AT (1) ATE482716T1 (pt)
CA (1) CA2466054C (pt)
DE (1) DE60237841D1 (pt)
DK (1) DK1450847T3 (pt)
ES (1) ES2351786T3 (pt)
IL (3) IL161812A0 (pt)
PT (1) PT1450847E (pt)
WO (1) WO2003042344A2 (pt)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ537920A (en) * 1999-06-28 2006-10-27 Genentech Inc An isolated Apo-2 ligand variant polypeptide comprising an amino acid sequence which differs from the native sequence Apo-2 ligand
US7741285B2 (en) * 2001-11-13 2010-06-22 Genentech, Inc. APO-2 ligand/trail formulations
DK1581251T3 (da) 2002-12-31 2016-06-27 Althea Tech Inc Krystaller af humant væksthormon og fremgangsmåder til fremstilling deraf
NZ571243A (en) * 2002-12-31 2010-04-30 Altus Pharmaceuticals Inc Complexes of protein crystals and ionic polymers comprising human growth hormone and protamine
US20060019234A1 (en) * 2004-07-22 2006-01-26 Shanbrom Technologies, Llc Modern blood banking employing improved cell preservation composition
US20060051347A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Winter Charles M Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof
US20060188498A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Genentech, Inc. Methods of using death receptor agonists and EGFR inhibitors
US20090155247A1 (en) * 2005-02-18 2009-06-18 Ashkenazi Avi J Methods of Using Death Receptor Agonists and EGFR Inhibitors
KR20080019025A (ko) * 2005-06-06 2008-02-29 노보 노르디스크 에이/에스 안정화된 ｉｌ-21 조성물
ES2376479T3 (es) * 2005-08-16 2012-03-14 Genentech, Inc. Sensibilidad apoptótica a apo2l/trail mediante el ensayo de expresión de galnac-t14 en células y tejidos.
US9309316B2 (en) 2005-12-20 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Stable subcutaneous protein formulations and uses thereof
AR058567A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Formulaciones de proteinas estables
GB0710529D0 (en) 2007-06-01 2007-07-11 Circassia Ltd Vaccine
SI2083856T1 (sl) 2007-08-15 2011-02-28 Circassia Ltd Peptidi za desenzibilizacijo proti alergijam
EP2399610A3 (en) 2007-09-24 2012-09-05 Bar-Ilan University Polymer nanoparticles coated by magnetic metal oxide and uses thereof
EP2111871A1 (de) * 2008-04-26 2009-10-28 Sandoz AG Stabilisierte Flüssigformulierung
CA2742817A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Biogen Idec Ma Inc. Arginine inactivation of viruses
GB0821806D0 (en) 2008-11-28 2009-01-07 Circassia Ltd Compositions with reduced dimer formation
DE102008064553B4 (de) * 2008-12-22 2015-05-13 Technische Universität Dresden Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung hormonell wirksamer Substanzen
US8277651B2 (en) 2009-03-13 2012-10-02 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography
ES2968448T3 (es) 2009-12-18 2024-05-09 Csl Ltd Procedimiento de purificación de polipéptidos
SG10201502398RA (en) * 2010-04-27 2015-05-28 Scil Technology Gmbh Stable MIA/CD-RAP formulations
MX2012012743A (es) * 2010-05-03 2012-11-23 Genentech Inc Composiciones y metodos utiles para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen proteina.
WO2012151317A1 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Genentech, Inc. Vascular disruption agents and uses thereof
IN2014DN09097A (pt) * 2012-05-11 2015-05-22 Novartis Ag
CN105530950A (zh) * 2013-06-09 2016-04-27 艾弗兰纳特有限公司 包含Gc-巨噬细胞活化因子的组合物及其用途
US11279768B1 (en) 2015-04-03 2022-03-22 Precision Biologics, Inc. Anti-cancer antibodies, combination therapies, and uses thereof
US10501744B2 (en) 2016-05-04 2019-12-10 Indiana University Research And Technology Corporation Presentation of bioactive proteins

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
JPS5829958B2 (ja) * 1977-03-07 1983-06-25 工業技術院長 タンパク質結晶の形成方法
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
JPS60126084A (ja) * 1983-12-13 1985-07-05 Toyo Jozo Co Ltd グリセロリン酸オキシダーゼの安定化法
JPS62283932A (ja) 1986-05-29 1987-12-09 Green Cross Corp:The 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タの乾燥製剤
EP0257956B2 (en) 1986-08-19 2000-11-22 Genentech, Inc. Use of polypeptide growth factors and cytokines for the manufacture of a device and of a dispersion
JP2602850B2 (ja) * 1987-10-27 1997-04-23 富士通株式会社 単結晶作製方法
JPH04501201A (ja) 1987-12-21 1992-03-05 ジ・アップジョン・カンパニー 発芽植物種子類のアグロバクテリウム媒介形質転換
DK168302B1 (da) 1989-06-29 1994-03-07 Danisco Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller
DE59010908D1 (de) 1989-09-12 2000-08-10 Hoffmann La Roche TNF-bindende Proteine
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
CH682806A5 (de) 1992-02-21 1993-11-30 Medimpex Ets Injektionsgerät.
JP3007785B2 (ja) * 1993-03-16 2000-02-07 旭化成工業株式会社 トロンボモジュリン組成物およびその変性防止方法
US5763223A (en) * 1995-06-29 1998-06-09 Immunex Corporation DNA encoding a cytokine that induces apoptosis
US6284236B1 (en) 1995-06-29 2001-09-04 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
US6030945A (en) 1996-01-09 2000-02-29 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
TW518219B (en) 1996-04-26 2003-01-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Erythropoietin solution preparation
NZ334309A (en) 1996-10-25 2000-08-25 Human Genome Sciences Inc Neutrokine alpha protein, a member of the TNF family, and its use in treating and/or detecting immune disorders
EP2314695A3 (en) 1996-12-23 2011-12-21 Immunex Corporation Ligand for receptor activator of NF-kappa B, ligand is member of TNF superfamily
ATE362982T1 (de) 1997-01-28 2007-06-15 Human Genome Sciences Inc ßDEATH-DOMAINß-ENTHALTENDER REZEPTOR 4 (DR4), EIN MITGLIED DER TNF-REZEPTOR SUPERFAMILIE, WELCHER AN TRAIL (APO-2L) BINDET
US6072047A (en) 1997-02-13 2000-06-06 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US20010010924A1 (en) 1997-03-14 2001-08-02 Keith Charles Deen Tumor necrosis factor related receptor, tr6 polynecleotides
CA2285040C (en) 1997-03-17 2009-01-27 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5
US6140475A (en) * 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
WO1998046643A1 (en) 1997-04-16 1998-10-22 Millennium Biotherapeutics, Inc. TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR RELATED PROTEINS TANGO-63d AND TANGO-63e
CZ302262B6 (cs) 1997-04-16 2011-01-19 Amgen Inc. Izolovaná nukleová kyselina, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou, expresní vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu, hostitelská bunka transfekovaná tímto expresním vektorem, izolovaný protein vázající osteoprotegerin, protilátka vázající
ES2293682T5 (es) 1997-05-15 2011-11-17 Genentech, Inc. Anticuerpo anti-apo2.
JP2002508663A (ja) 1997-06-18 2002-03-19 ジェネンテク，インコーポレイテッド Ａｐｏ−２ＤｃＲ
CA2294729C (en) 1997-07-02 2003-05-06 The Procter & Gamble Company Suspension for adding a controlled amount of ingredient to a food product
AU8400398A (en) 1997-07-11 1999-02-08 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Nucleic acid encoding a novel chemotherapy-induced protein, and methods of use
WO1999006673A1 (en) 1997-07-30 1999-02-11 Eg & G Sealol, Inc. Improved brush seal and method of making same
AU8784498A (en) 1997-08-15 1999-03-08 Idun Pharmaceuticals, Inc. Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
ES2331900T3 (es) 1997-08-26 2010-01-19 Genentech, Inc. Receptor rtd.
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
US6541606B2 (en) 1997-12-31 2003-04-01 Altus Biologics Inc. Stabilized protein crystals formulations containing them and methods of making them
AU2325199A (en) 1998-01-15 1999-08-02 Genentech Inc. Apo-2 ligand
JP4194681B2 (ja) * 1998-01-20 2008-12-10 太陽化学株式会社 可溶性γ−リベチン複合体の製造法
AU765003B2 (en) 1998-03-27 2003-09-04 Genentech Inc. Apo-2 ligand-anti-her-2 antibody synergism
GB2349636A (en) 1998-09-17 2000-11-08 Adv Liquid Packaging Corp Resealable can
FR2783596B1 (fr) 1998-09-23 2001-03-09 Eurokera Ensemble prefabrique destine a la realisation de tables de cuisson
DK1192185T3 (da) 1999-06-09 2006-10-23 Genentech Inc Apo-2L-receptoragonist og CPT-11-synergisme
NZ537920A (en) 1999-06-28 2006-10-27 Genentech Inc An isolated Apo-2 ligand variant polypeptide comprising an amino acid sequence which differs from the native sequence Apo-2 ligand
AUPQ312699A0 (en) 1999-09-28 1999-10-21 Electrical Moulded Components Pacific Pty Ltd Electrical reticulation apparatus
CA2386002A1 (en) 1999-09-30 2001-04-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Trail: an inhibitor of autoimmune inflammation and cell cycle progression
CZ20021186A3 (cs) 1999-10-04 2002-11-13 Chiron Corporation Farmaceutické prostředky obsahující stabilizovaný kapalný polypeptid
PT1129720E (pt) * 2000-02-29 2004-08-31 Pfizer Prod Inc Factor estimulador de colonias de granulocitos estabilizado
DK1303293T3 (da) 2000-07-27 2009-03-30 Genentech Inc Sekventiel indgivelse af CPT-11 og APO-2L-polypeptid
US20040186051A1 (en) * 2001-10-02 2004-09-23 Kelley Robert F Apo-2 ligand variants and uses thereof
US7741285B2 (en) * 2001-11-13 2010-06-22 Genentech, Inc. APO-2 ligand/trail formulations

Also Published As

Publication number Publication date
EP1450847A4 (en) 2007-08-29
DK1450847T3 (da) 2010-12-13
US7741282B2 (en) 2010-06-22
CA2466054C (en) 2012-01-03
IL197705A0 (en) 2009-12-24
WO2003042344A2 (en) 2003-05-22
JP5042959B2 (ja) 2012-10-03
IL161812A (en) 2013-02-28
EP1450847B1 (en) 2010-09-29
US20050020498A1 (en) 2005-01-27
IL161812A0 (en) 2005-11-20
JP2005521640A (ja) 2005-07-21
EP2332531B1 (en) 2019-07-10
EP2322165A1 (en) 2011-05-18
EP2332531A1 (en) 2011-06-15
EP1450847A2 (en) 2004-09-01
US20050080006A1 (en) 2005-04-14
WO2003042344A3 (en) 2003-11-27
US20110269947A1 (en) 2011-11-03
DE60237841D1 (de) 2010-11-11
ES2351786T3 (es) 2011-02-10
US8470969B2 (en) 2013-06-25
CA2466054A1 (en) 2003-05-22
JP2009108040A (ja) 2009-05-21
ATE482716T1 (de) 2010-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5042959B2 (ja) Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ製剤
US20090137476A1 (en) Apo-2 ligand variants and uses thereof
ES2368445T3 (es) Método de purificación de ligando apo-2/trail utilizando cristalización en frío.
AU2010201713B2 (en) APO2 ligand/trail formulations
US7842668B1 (en) Apo-2 ligand/trail formulations
AU2002346376A1 (en) Apo2 ligand/trail formulations