JP4194681B2 - 可溶性γ−リベチン複合体の製造法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、可溶性γ−リベチン複合体の製造法に関する。更に詳しくは、従来の免疫反応性を高めた可溶性γ−リベチン複合体の製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来のγ−リベチンは抗原結合部位が1箇所しか存在しないため分子間架橋が作りにくく、検査薬として使用する際、測定する抗原の種類によっては満足する沈降反応が得られない欠点があった。
架橋を作りやすくする方法として、1.5Mの塩化ナトリウムを添加する事が開示されている(大谷、日本畜産学会北陸支部会報、57、p16-25(1988))。この方法は、1.5Mの塩化ナトリウム存在下ではγ−リベチンは2量体として存在することにより4価となり格子を作りやすく、沈降反応の判定が行いやすくなる性質を利用したものであるが、大量の塩化ナトリウムを必要とする為、測定する抗原の種類によっては沈降反応判定を困難とする欠点があった。
【0003】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明は、高い凝集反応性を有する可溶性γ−リベチン複合体の製造法を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決しようとする手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、γ−リベチンに不可逆な反応を施すことにより高い凝集反応性を有する可溶性複合体が得られることを見い出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、不可逆反応を用いることを特徴とするγ−リベチンを主構成成分とする可溶性γ−リベチン複合体の製造法である。
【0005】
【発明の実施の形態】
本発明における不可逆な反応とは、γ−リベチン間もしくはγ−リベチンと夾雑する蛋白質との間における共有結合を形成する反応のことをいい、少なくともγ−リベチンが2分子以上共有結合する反応のことをいう。特に限定するものではないが、共有結合を判定する方法として例えばSDS-PAGE法が挙げられる。本発明の可溶性γ−リベチン複合体はこの方法において測定される分子量が360kDa以上の蛋白質複合体である。高塩濃度下で生じるγ−リベチン同士の二量体や塩析物である多重合体は疎水結合又はイオン結合でありSDS-PAGEでは単量体として存在するものであり、本発明の可溶性γ−リベチン複合体とは異なる。
本発明における不可逆反応法は、特に限定するものではないが加熱反応法、超高圧反応法、還元剤を用いた反応法が挙げられ、好ましくは加熱反応法である。
加熱反応法における加熱条件は、γ−リベチンの活性が90%以上残存する条件が選ばれる。具体的にはγ−リベチン含有溶液を60〜80℃、10〜120分間加熱することが好ましく、その際のγ−リベチン含有溶液の濃度は、1mg/mlから50mg/ml未満の濃度が好ましい。更に好ましくは、5mg/mlから30mg/mlの濃度が好ましい。濃度が1mg/mlより低いと可溶性複合体を形成しにくくなり、又50mg/ml以上の濃度ではγ−リベチンが不溶性の凝集体の割合が多くなってしまう。
【0006】
本発明における加熱処理前のγ−リベチン含有溶液のpHは、pH5.0からpH11.0が好ましく、さらに好ましくは、pH7.0からpH9.0である。pHがpH5.0より酸性側、又はpH11.0よりアルカリ性側に傾くとγ−リベチンの持つ活性が失活する恐れがある。
本発明において主構成成分とは、γ−リベチン複合体中に占めるγ−リベチンの割合が50%以上を占める事を言う。
本発明において可溶性とは、水に対する溶解性を言う。
本発明の可溶性のγ−リベチン複合体はさらに精製して使用してもよく、その精製法としては、特に限定するものではないが膜分離法、塩析法、クロマトグラフィー法、超遠心法等が挙げられ、特に、膜分離法、塩析法は好適に使用できる。
【0007】
膜分離法とは、特に限定するものではないが限外濾過膜、精密濾過膜、逆浸透膜もしくは濾紙、濾板、ガラスフィルターより選ばれた1種類以上の膜を使用して分離する方法が挙げられ、特に限外濾過膜は好適に使用できる。
また塩析法に使用する塩とはNaCl、KCl、CaCl2 、MgCl2 、NaH2 PO4 、Na2 HPO4 、Na2 SO4 、(NH4)2 SO4 、MgSO4 より選ばれる1種又は2種以上の塩であり、濃度はそれぞれの塩の種類によっても異なるが2〜12%が好ましく、更に好ましくは5〜10%、最も好ましくは8〜10%である。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、これらによって発明を制限するものではない。
【0008】
【実施例】
実施例1
抗S.mutans γ−リベチン含有卵黄水溶性蛋白質溶液の調製
特定抗原として、ストレプトコッカス・ミュータンス MT8148(以下S.mutansという)菌体を含む菌溶液(CFU 108)を調製し、産卵鶏を免疫した。得られた卵より卵黄を分離し均質化した溶液を卵黄液とした。
得られた卵黄液1kgに対し1kgの水を加え均質化し、そこに0.15%のλ−カラギーナン水溶液を4kg加え撹拌した。静置後、吸引濾過を行い濾液を分取した。このとき得られた濾液を卵黄水溶性蛋白質溶液とした。
【0009】
実施例2
抗S.mutans γ−リベチン含有粉末の調製
実施例1で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液1Lに硫酸ナトリウム 150gを少しずつ加え溶解した後、30分間静置し遠心(常温、8000rpm ×15分間)する。上清を捨て、沈殿物に10mM Na2 HPO4 バッファー200mlを加え溶解する。得られた溶液を用い上記同様の方法にて再度塩析法を行った。本溶液を10mM Na2 HPO4 バッファーを用い一晩透析を行う。得られた溶液を凍結乾燥し、特異的γ−リベチン含有粉末を得た。
得られた粉末は、ゲル濾過法(”蛋白質I”、日本生化学会編、第11章、東京化学同人(1990))により全蛋白質に対するγ−リベチンの割合が90%以上であることを確認した。
【0010】
実施例3
可溶性抗S.mutans γ−リベチン複合体の調製
実施例2で得られた抗S.mutansγ−リベチン含有粉末を純水を用い10mg/mlの濃度に調製した。調製した溶液200mlを耐熱性の容器に封入し70℃の恒温層にて30分間加熱し可溶性の複合体とγ−リベチン単体の混合溶液を得た。この混合溶液を膜分離法(日本ポール:500kDa cut off)によるダイアフィルトレーション法を用いてγ−リベチン単量体を分離し、可溶性γ−リベチン複合体を凍結乾燥機にて乾燥させ粉末を得た。
【0011】
試験例1
特異的γ−リベチン複合体の不可逆反応の確認
実施例3で得られた粉末を用いSDS-PAGEにて泳動させ、本複合体の結合様式を確認した。
使用したポリアクリルアミドゲルはパジェル( AE-6000 NPG-310L :アトー株式会社)(分画分子量40〜500kDa)を用い泳動を行った。泳動サンプルは実施例3又は4で得られた粉末を1mg/mlの濃度で溶かし本溶液5μlをゲルにアプライした。
その結果実施例3又は4で得られたサンプルは、ほとんど泳動されず上端部分で止っていた。このことより本サンプルは共有的な結合を有し、もとの単量体には戻ることのない500kDa以上の蛋白質であることが確認された。
【0012】
試験例2
特異抗体活性回収率の比較
実施例3により得られた特異的γ−リベチン複合体粉末のS.mutansに対する特異的抗体力価を、酵素免疫測定法(以下 ELISA法という)により測定し特異抗体活性回収率の比較を行った。各試料液を100μl/ウエルの割合で、抗原として用いたS.mutansを固相へコーティングした ELISAプレート(96穴, ヌンク社製)へ添加し、25℃、2時間静置することにより、抗原と特異的抗体の反応を行った。各ウエルをPBS-Tween で充分洗浄した後、抗ニワトリIgGウサギIgG−アルカリホスファターゼコンジュゲート(ザイメット社)のPBS-Tween 希釈液(2000倍)を100μl/ウエルの割合で添加した。25℃で1時間放置することにより、抗原と反応した特異的抗体と上記コンジュゲートの反応を行った。各ウエルをPBS-Tween で充分洗浄した後、0.1% P−フェニルジソジウムホスフェート溶液(0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.6に溶解)を基質として100μl/ウエルの割合で添加し、25℃、15分間酵素反応を行った。反応の停止は2M水酸化ナトリウム溶液を50μl /ウエル添加することにより行い、405nmにおける各ウエルの吸光度をプレートリーダーにより測定した。
なお、対照としては試料の代わりにPBS-Tween を用いた。各試料につき、4ウエルを用いた。各試料の示す吸光度の平均値から対照の示す吸光度を引き、それぞれの試料重量を乗じた値(総吸光度)を各試料の総抗体活性とした。
総抗体活性を測定した結果、実施例2により得られた特異的γ−リベチン粉末と実施例3により得られた特異的γ−リベチン複合体粉末を比較すると、特異的γ−リベチン粉末を100%として特異的γ−リベチン複合体粉末は約90%抗体活性回収率が得られた。
【0013】
実施例4
可溶性特異的γ−リベチン複合体のSRID法への応用
ヒト口腔内に存在するS.mutans菌量を定量する手段としてSRID(一元放射免疫拡散)法(G.Mancini et al., Immunochemistry , 2 , 235 (1965) )を用いた。
人ボランティアを募り純水にて口腔内を洗浄した。この口腔内の洗浄液を測定サンプルとした。測定用のプレートとして、実施例2で得られた抗S.mutans γ−リベチンを1%加えた2%寒天プレート(プレートA)、プレートAに1.5Mになるように塩化ナトリウムを添加したプレート(プレートB)及び実施例4で得られた可溶性の抗S.mutans γ−リベチン複合体を用いプレートAと同様に調製した(プレートC)上にできる沈降輪の大きさから菌量を求めることを試みた。
その結果、プレートA,B上にできた沈降輪は不明瞭であり、菌量を求めることはできなかったのに対しプレートC上にできた沈降輪は明瞭であり、この大きさよりγ−リベチン濃度を求め、その値に溶液の体積量を乗じてS.mutans菌量を求めることができた。
このことより、従来SRID法では沈降輪がはっきりしないことから測定することが困難であった抗原も測定が可能になった。
本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下の通りである。
【0014】
(1)不可逆な反応を用いることを特徴とするγ−リベチンを主構成成分とする可溶性γ−リベチン複合体の製造法。
(2)不可逆な反応が加熱処理である前記1記載の可溶性γ−リベチン複合体の製造法。
(3)加熱反応が60〜80℃、10〜120分、γ−リベチン溶液濃度が1〜50mg/ml未満であり、且つ反応生成物から不溶成分を取り除くことを特徴とする前記1記載の可溶性γ−リベチン複合体の製造法。
(4)不可逆な反応が超高圧処理である前記1記載のγ−リベチン複合体の製造法。
【0015】
(5)不可逆な反応が還元剤を用いることを特徴とする前記1記載のγ−リベチン複合体の製造法。
(6)2量体以上の可溶性γ−リベチン複合体を膜を使って精製することを特徴とする前記1記載のγ−リベチン複合体の製造法。
(7)膜が限外濾過膜、精密濾過膜、逆浸透膜であることを特徴とする前記1記載のγ−リベチン複合体の製造法。
(8)2量体以上の可溶性γ−リベチン複合体を塩を使って精製することを特徴とする前記1記載のγ−リベチン複合体の製造法。
【0016】
(9)塩がNaCl、KCl、CaCl2 、MgCl2 、NaH2 PO4 、Na2 HPO4 、Na2 SO4 、(NH4)2 SO4 、MgSO4 より選ばれる1種又は2種以上を10%以下添加して精製することを特徴とする請求項4記載の分子量が500kDaより大きいγ−リベチン複合体ならびにその分離法。
(10)2量体以上の可溶性γ−リベチン複合体をクロマトグラフィー法を使って精製することを特徴とする前記1記載のγ−リベチン複合体の製造法。
【0017】
【発明の効果】
本発明は、γ−リベチンを不可逆な反応を使って可溶性の複合体にすることにより、従来のγ−リベチンが持つ機能を飛躍的に高める効果があり、更にγ−リベチンの応用範囲を広げ産業上への貢献も大である。
Claims (3)
- γ−リベチン溶液を60℃〜70℃で、10〜30分加熱する反応を用いることを特徴とするγ−リベチンを主構成成分とする水溶性γ−リベチン複合体の製造法。
- γ−リベチン溶液濃度が1〜50mg/ml未満であり、且つ反応生成物から水不溶成分を取り除くことを特徴とする請求項1記載の水溶性γ−リベチン複合体の製造法。
- 加熱反応の後、γ−リベチンの活性が90%以上残存することを特徴とする請求項1又は2記載の水溶性γ−リベチン複合体の製造法。
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