JPS6361318B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、血清中および人間の胎盤の抽出物中
に認められそしてそこから単離され得る新規な糖
蛋白質ならびにその製法に関する。 人間の胎盤を水性抽出することにより得られる
蛋白質溶液は周知のように多数の成分を包含して
おり、一部は血清蛋白に属しそして他の一部は組
織蛋白に属する。 本発明は、これまでにまだ知られていない糖蛋
白質を人間の胎盤の抽出物から単離し、それを用
いて新規な糖蛋白質に対する特異的な抗血清を調
製するという課題を達成したものであり、それに
より血清中の糖蛋白質が定性的に確認されるかあ
るいは定量的に測定されうる。 本発明の目的は、血清および人間の胎盤の抽出
物から得られる新規な糖蛋白質にある。このもの
は、次の諸性質すなわち 本質的にはα―アミノ酸から成る蛋白部分 89
±４％、 炭水化物部分11.1±2.2％（そのうちヘキソー
ス5.3±1.1％、Ｎ―アセチル化ヘキソースアミン
2.8±0.5％、Ｎ―アセチル化ノイラミン酸2.9±
0.6％）、 沈降係数 S_20W 3.2±0.3S、 分子量 32000±6000、 等電点 PH4.3±0.3、 吸光率 Ｅ１％ １cm（280nm）13.8±1.0 アルブミンとα₁―グロブリンとの間の範囲の電
気泳動易動度、 この蛋白質に対する特異的な抗体との特異的な
免疫学的反応、および 蛋白分解作用 を特徴とする。 この糖蛋白質は人間の血清中におけるその濃度
が通常非常にわずかであるので痕跡蛋白として示
され得る。 この糖蛋白質の特徴的な指標を以下に説明す
る。 沈降係数の測定はベツクマン社製分析用超遠心
分離器（Spinco装置型式Ｅ）中280nmでUV走査
技法を用いて二重区画セル中6000UpMで行われ
る。溶媒としては0.2モル／のNaClを含有する
0.05Mりん酸緩衝液（PH6.8）が用いられる。蛋
白質濃度は0.1％である。沈降係数は20℃の水を
基準にして換算される。 分子量の計算には沈降平衡法およびポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動が使用される。超遠心分離
における測定は9000rpmで行われる。評定は部分
比容0.74ml／ｇに基づいて行われる。超遠心分離
においては分子量28100±2000が得られる。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動には２つの方
法が用いられる。正常のポリアクリルアミド
（PAA）ゲルでの分離は「ツアイトシユリフト・
フユア・クリニツシエ・ヘミー（Z.Klin.
Chem.）」第４巻第58頁（1966）の方法により行
われる。ドデシル硫酸ナトリウム含有ゲル中にお
ける調査にはドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
0.1％を含有する7.5％PAAを有するゲルを用い
る。還元には蛋白質は１％SDS中１％メルカプト
エタノールとインキユベートされる。蛋白質の着
色はアミド黒を用いて行われる。SDS含有PAA
ゲル中における移動から糖蛋白の分子量35000±
3000が導き出される。 等電点の測定はカラム（440ml）を用いて行わ
れる。いわゆるアンフオリン（Ampholin）―混
合物は糖蛋白質の研究でPH３〜５を有する。 電気泳動挙動の研究はPH8.6のジエチルバルビ
ツール酸ナトリウム緩衝液を用い酢酸セルロース
箔上ベツクマン装置を少しく変形した装置で行わ
れる。 炭水化物の測定は「バイオヘミツシエ・ツアイ
トシユリフト（Biochem.Z.）」第329巻第490頁
（1958）に記載されている方法で行われる。 アミノ酸分析は「アナリテイカル・ケミストリ
ー（Anal.Chem.）」第30巻第1185頁（1958）記載
の方法に従いベツクマン社製液相クロマトグラフ
イー用マルチクローム（Multichrom）Ｂを使用
して行われる。1/2シスチンはこの蛋白質を過蟻
酸を用いて酸化（Anal.Chem.第30巻第1185頁
（1958）参照）後、続いてクロマトグラフイー
（J.Biol.Chem.第238巻第235頁（1963）参照）す
ることによりシステイン酸として測定される。ト
リプトフアン含量は「バイオケミストリー
（Biochemistry）」第６巻第1948頁（1967）によ
り直接測光することにより測定される。 この物質の免疫学的特性化は、抗原すなわち糖
蛋白およびこの糖蛋白に対する抗体または抗体に
関して純化されてない抗血清が相互に例えば寒天
のような担体媒質中に拡散する既知の拡散法を用
いて最も簡単に行われる。両反応成分が好都合な
割合で重なり合つて出会つた場合、目に見える沈
澱が生成する。この知見により新規な糖蛋白質そ
してまたこの糖蛋白質に対する抗体の検出と測定
にすべての免疫学的技法が可能であることは専門
家にとつて明白である。 体液あるいは組織抽出物中の糖蛋白質の定量的
測定のための簡単でほぼ充分に正確な方法はいわ
ゆるローレル（Laurell）技法である。これは
「アナリテイカル・バイオケミストリー（Analyt.
Biochem.）」第15巻第45頁（1966）に記載されて
いる。 糖蛋白質の蛋白分解作用はフイブリン寒天―電
気泳動板で確認される〔N.HeimbargerおよびG.
Schwick両氏編「Prot ides of the Biological
Fluids」第９輯第303頁（1961）参照〕。 本発明の目的はさらに、糖蛋白質を包含してい
る体液あるいは器官抽出物を以下の本発明により
見出された標準に基づいて分別することを特徴と
する上記に特性化された糖蛋白質の製法にある。 この糖蛋白質は中性塩で沈殿しうる。かかる沈
殿に慣用される硫酸アンモニウムを用いると糖蛋
白質は塩の飽和濃度の30〜60％で中性点附近のPH
で沈殿する。 その分子量に相当して糖蛋白質は分子量25000
〜40000を有する物質の分離に適した処置により
取得されうる。好ましくはこれにはゲル過ある
いは限外過法が用いられる。 この糖蛋白質は中性あるいは弱アルカリ性PHで
弱塩基性イオン交換体に吸着される。その際好ま
しくは比較的低濃度の緩衝溶液が用いられる。そ
の理由は塩濃度を高めることによりあるいはまた
PH値を低めることにより吸着が妨害されうるから
である。他方この関係を知ると、糖蛋白質を吸着
させそして高濃度の塩溶液またはPH値の低い緩衝
溶液を用いて再び溶離させる可能性が生じる。 蛋白質沈殿法に慣用されるアクリジンおよびキ
ノリン系列の水溶性有機塩基で新規な糖蛋白質が
沈殿しないことは示されている。これはこの方法
に慣用の濃度で水性上澄液中に残存する。次い
で、２―エトキシ―６，９―ジアミノアクリジン
乳酸塩のようなアクリジン塩基あるいはビス―
（２―メチル―４―アミノ―キノリル―６）―カ
ルバミド塩酸塩のようなキノリン塩基が附随蛋白
の沈殿に使用でき、その際本発明による糖蛋白質
は上澄液中に残留する。 水酸燐灰石を蛋白質の吸着剤として使用する際
にも同様の考えが通用する。新規な糖蛋白質は水
酸燐灰石に対して何ら親和性を示さないが、これ
に対して附随蛋白質の系列は水酸燐灰石にしつか
り捕捉される。糖蛋白質のこの挙動は特徴的であ
り、従つて本発明者は、この糖蛋白質を水酸燐灰
石通過性グロブリン（HPG―１）として表示す
ることを提案する。 電気泳動上の挙動の知見に基づいて糖蛋白質の
純化または単離に調製用ゾーン電気泳動が用いら
れうる。 その免疫学的動作に基づく糖蛋白質の親和性
は、糖蛋白質をいわゆる免疫吸着法を用いて純化
するのに用いられうる。これにはそれ自体知られ
た方法で免疫吸着剤すなわち担体と結合した抗体
が新規糖蛋白質に対して調製でき、このものは糖
蛋白質を特異的に結合せしめうる。次いで糖蛋白
質は文献にしばしば記載されているように媒質条
件を変えることにより再び溶離されうる。 一方では糖蛋白質の純化に、そして他方では残
りの附随蛋白からの分離に至る上記方法の選択さ
れた組み合せにより本発明による物質の単離が行
われうる。それゆえに本発明の目的は新規な糖蛋
白質の個々の純化段階および純化のための処置の
組み合せにより生じる方法においてその精製に注
意を払うことである。糖蛋白質の製法にとつての
準線は、新規糖蛋白質に対する抗血清との陽性な
免疫学的反応を生じる部分をそれぞれ取得するこ
とにある。 上記工程段階実施後に時おり、糖蛋白質がまだ
他の免疫学的に確認されうる附随物質で汚染され
ていることが示される。これは大抵新規な糖蛋白
質自体がそうであるように痕跡蛋白質である。こ
の場合汚染物はその特異的な吸着により除去され
うる。その際、記載されている方法により、除去
されるべき蛋白質に対する担体と結合している抗
体が吸着剤として用いられる慣用の免疫吸着技法
が用いられる。しばしば、広く純粋な新規糖蛋白
質はまだ、妊娠特異性β₁―糖蛋白質および／また
は容易に沈殿しうるα₁―糖蛋白質としても示され
るα₁―Ｂ―糖蛋白質の痕跡といつしよになる。そ
の分離には、例えばセフアロース
（SEPHAROSE）のような湿潤寒天と共有結合し
ている蛋白質に対する免疫グロブリンが使用され
得る。 特異的な免疫吸着剤で充填されたカラムに注が
れる蛋白質溶液は、担体がそれに対して免疫学的
に活性な相手を包含している成分に結合されるの
みで、支障なくカラムを進行する。新規な糖蛋白
質はこの方法で汚染物から分離される。 新規な糖蛋白質の製造のためには前掲の処置の
いくつかが相互に組み合され、その際、免疫学的
に新規な糖蛋白質が確認されるフラクシヨンをさ
らに処理し、他方残りのフラクシヨンを捨てる。 新規糖蛋白質の製造のための出発物質として、
糖蛋白質が免疫学的に確認されうるあらゆる体液
あるいはあらゆる器官抽出物が使用できる。好ま
しくは人間の胎盤の抽出物が使用され、これは粉
砕し、水を用いてあるいは希薄（合目的的には10
％以下の）塩溶液好ましくは例えば塩化ナトリウ
ムのような0.5％中性塩溶液を用いて抽出するこ
とにより取得できる。合目的々には胎盤１Kgに対
しておよそ１〜５の抽出溶液を使用する。不溶
部分は遠心分離あるいは過により抽出物から分
離する。 純化のための工程は、新規糖蛋白質を包含して
いる体液に以下の処置の少くとも一つを適用し続
いて糖蛋白質に関して純化されたフラクシヨンを
取得することを特徴とする。 (a) アクリジンあるいはキノリン塩基の水溶性誘
導体なかんずく２―エトキシ―６，９―ジアミ
ノアクリジン乳酸塩をPH５〜10なかんずくおよ
そPH８でおよそ0.8％（重量／容量）の最終濃
度まで添加する。その際糖蛋白質は概して上澄
液中に残留する。 (b) 糖蛋白質が沈殿するまで中性塩なかんずく硫
酸アンモニウムをおよそ中性のPH５〜８で硫酸
アンモニウムの飽和濃度の30〜60％まで添加す
る。 (c) ジエチルアミノエチルセルロースのような弱
塩基性イオン交換体に、この溶液の伝導度０〜
2msで中性あるいは弱アルカリ性PH（６〜９）
で、例えばPHおよそ８の約0.01M緩衝液を使用
して糖蛋白質を吸着させる。 好適に使用される緩衝液は例えばトリ―ヒド
ロキシメチルアミノメタン塩酸塩である。糖蛋
白質の溶離はPHを7.0以下に下げるかあるいは
伝導度を5ms以上に上げることにより達成され
る。 (d) 分子の大きさに基づく分離（分子ふるい分
別）。特に適しているのは、相当する大きさの
孔を有する重合体例えば分子量およそ50000を
有する蛋白質の純化を目的としたセフアデツク
ス（SEPHADEX）（登録商標）として入手で
きるエピクロルヒドリン交叉結合デキストラン
で充填されたカラム中におけるゲル過であ
る。しかしまたLKB社ウルトロゲル
（ULTROGEL）（登録商標）あるいはバイオー
ラド・ラボラトリーズ社のバイオーゲル（BIO
―GEL）Ｐ（登録商標）のような製品も用いら
れる。 (e) 水酸燐灰石を用いる吸着の実施。糖蛋白質は
希りん酸緩衝溶液中で水酸燐灰石と結合しない
ので、糖蛋白質の附随蛋白を溶液から除去する
ために水酸燐灰石は適した試薬である。これに
は蛋白質溶液を合目的々には中性附近のPHに調
整して溶液の伝導度をおよそ1msに保持する。 (f) 調製用ゾーン電気泳動。電気泳動の実施に適
しているのは糖蛋白質を包含している溶液、な
かんずくアルカリ性緩衝溶液例えばPH8.6およ
びイオン強度0.1のジエチルバツビツール酸ナ
トリウム緩衝液中における溶液である。例えば
エヌ・ハイムブルガーおよびアール・シユミツ
トベルガー両氏によりベーリングウエルケ社報
告（Behringwerke―Mitteilungen）第43編第
83頁以下特に第119〜120頁に記載されているよ
うに、溶液を調製用電気泳動のための装置に加
える。装置においては開口槽中の担体電気泳動
の水平配置が肝要で、その槽中では電気泳動に
際して生じるジユール熱を除くために担体物質
を10℃以下に冷却してある。担体物質としては
蛋白質に対して不活性な物質好ましくはポリ塩
化ビニル、あるいは微細な顆粒の形をしたその
共重合体が用いられる。 電気泳動をアルカリ性PH範囲好ましくはおよ
そPH8.6で、イオン強度0.08〜0.12でそして電界
強度４〜６ボルト／cmで行うのが好適である。
PH8.6の0.1Mジエチルバルビツール酸ナトリウ
ム緩衝液を使用すると、糖蛋白質は電場で血漿
蛋白質のアルブミンとα₁―グロブリンとの間に
ある範囲に移動する。 新規糖蛋白質を取得するには、当該ゾーンを切
断し不活性な担体物質から水あるいは塩水溶液例
えば0.5〜１％食塩溶液を用いて溶離する。 本発明により製造される蛋白質は抗原性質を有
している。それを用いて既知方法により動物の免
疫化を行うと免疫化された動物の血液中に特異的
な抗体が形成されるに至る。その血清を慣用の方
法で取得しその中に包含されている抗体を純化し
うる。抗血清は既知の免疫学的方法で体液中特に
血清中の新規蛋白質の確認および測定に使用され
る。その上この糖蛋白質は蛋白分解およびフイブ
リン分解性質を有する。血栓溶解作用および血小
板撒解作用も同様に認められる。従つて本発明に
よる糖蛋白質は価値ある医薬の性質を有する。 以下の実施例により本発明を更に説明する。 低温凍結してある胎盤150Kgを粉砕し0.5％塩化
ナトリウム水溶液150で抽出する。この抽出物
を2n水酸化ナトリウムでPH８に調整し、ジアミ
ノエトキシアクリジン乳酸塩の３％水溶液50を
加える。１時間待機したのち、本発明による糖蛋
白質（HPG―１）を包含している上澄液を吸上
げてとり出し、まだ溶液中に残留しているジアミ
ノエトキシアクリジン乳酸塩を分離するために固
形塩化ナトリウム５％（11Kg）を加え、過し、
液体の重量に基づいて30％の固形硫酸アンモニウ
ムを加えそしてよく撹拌する。１時間後に沈殿を
過する。 過器上に集められた沈殿500gを蒸留水500ml
中に溶解し、ナトリウムアジド0.05％を包含して
いるPH7.0の0.01Mトリ（オキシメチル）アミノ
メタン／塩酸緩衝溶液で透析する。透析した溶液
を遠心分離し、上澄みを同じ緩衝溶液を用いて
2000mlとなし、0.1n水酸化ナトリウム溶液を用い
てPH8.0に調整し、湿つたジエチルアミノエチル
セルロース500gと１時間撹拌する。 次いでジエチルアミノエチルセルロースを過
により溶液から分離し、PH8.0の0.01Mトリ（オ
キシメチル）アミノメタン／塩酸緩衝液各１を
用いて２回洗い、次いで塩化ナトリウム0.85％お
よびナトリウムアジド0.05％を包含しているPH
6.5の0.02Mトリ（オキシメチル）アミノメタ
ン／塩酸緩衝液500mlずつを用いて３回溶離する。 合した溶離液に、液体の重量を基準にして30％
の硫酸アンモニウムを加え、全体を撹拌する。糖
蛋白質（HPG―１）を包含している沈殿を蒸留
水300ml中に溶解する。蛋白質溶液を、1.0モル／
の塩化ナトリウムを包含しているPH8.0のトリ
（オキシメチル）アミノメタン／塩酸緩衝液で透
析し、セフアデツクスＧ―150を充填したカラム
（100×20cm）に加えそして上記緩衝液を用いて溶
離する。溶離間にその分子の大きさによる蛋白質
の分別が行われる。 溶離液は順次特異的な抗体を用いて試験して糖
蛋白質（HPG―１）を包含しているフラクシヨ
ンを集め、そこからもう一度上記のようにして30
％固形硫酸アンモニウムを用いて蛋白質を析出さ
せる。 さらに精製するには沈殿を水50ml中に溶解し、
PH6.8の0.005Mりん酸緩衝液で透析し、そして水
酸燐灰石を充填したカラム（３×23cm）に加え
る。カラムの展開はPH6.8の0.005Mりん酸緩衝液
を用いて行われる。糖蛋白質（HPG―１）は溶
離液中に現れる。これを限外過で濃縮する。続
いて濃縮物をPH7.0の0.01M（オキシメチル）アミ
ノメタン／HCl緩衝液で透析しDEAE―セフアデ
ツクス（３×23cmカラム）に吸着させる。吸着さ
れた蛋白質の溶離および分離には０〜２％の
NaCl勾配を用いる。糖蛋白質（HPG―１）包含
している溶離液フラクシヨンを集め、濃縮し、水
で透析しそして凍結乾燥する。純度99％以上の新
規糖蛋白質約20mgが得られる。 このものは以下のアミノ酸組成を示す〔％にお
ける変動係数（VK）を伴なう頻度〕。

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下の性質すなわち (a) 蛋白部分 89±４％ (b) 炭水化物部分 11.1±2.2％（そのうちヘキ
   ソース5.3±1.1％、Ｎ―アセチル化ヘキソース
   アミン2.8±0.5％、Ｎ―アセチル化ノイラミン
   酸2.9±0.6％）、 (c) 沈降係数 S_20W3.2±0.3S、 (d) 分子量 32000±6000、 (e) 等電点 PH4.3±0.3、 (f) 吸光率 Ｅ１％ １cm（280nm）13.8±1.0、 (g) アルブミンとα₁―グロブリンの間の範囲の電
   気泳動易動度、 (h) 糖蛋白質に対する特異的な抗体との特異的な
   免疫学的反応、および (i) 蛋白分解作用 を特徴とする新規な糖蛋白質。 ２ 糖蛋白質が免疫学的に確認されうる蛋白質溶
   液を以下の手段すなわち (a) 糖蛋白質が沈殿するまでの中性塩を添加、 (b) 分子ふるい分別および分子量25000〜40000を
   有するフラクシヨンの取得、 (c) 弱塩基性イオン交換体への糖蛋白質の吸着お
   よびそれからの溶離、 (d) 最終濃度およそ0.8％までへのPH範囲５〜10
   におけるアクリジンもしくはキノリン塩基の水
   溶性誘導体の添加、 (e) 水酸燐灰石での糖蛋白質溶液の処理、 (f) 調製用ゾーン電気泳動およびアルブミンとα₁
   ―グロブリンとの間のゾーンの取得、 (g) 免疫吸着剤での糖蛋白質溶液の処理 の少くとも一つに付しそして糖蛋白質に関して純
   化されたフラクシヨンを取得することを特徴とす
   る、以下の性質すなわち (a) 蛋白部分 89±４％、 (b) 炭水化物部分 11.1±2.2％（そのうちヘキ
   ソース5.3±1.1％、Ｎ―アセチル化ヘキソース
   アミン2.8±0.5％、Ｎ―アセチル化ノイラミン
   酸2.9±0.6％）、 (c) 沈降係数 S_20W3.2±0.3S、 (d) 分子量 32000±6000、 (e) 等電点 PH4.3±0.3、 (f) 吸光率 Ｅ１％ １cm（280nm）13.8±1.0、 (g) アルブミンとα₁―グロブリンの間の範囲の電
   気泳動易動度、 (h) 糖蛋白質に対する特異的な抗体との特異的な
   免疫学的反応、および (i) 蛋白分解作用 を有する糖蛋白質の純化法。 ３ 糖蛋白質溶液として人間の胎盤からの抽出物
   が使用されることを特徴とする、前記第２項によ
   る方法。