JPH0544478B2 - - Google Patents
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Description
本発明はPP4と呼ばれる組織蛋白質ならびにそ
の単離法に関する。 PP4は特定の器官の疾患を識別するために、疾
患経過監視用または治療制御用「マーカー」とし
て体液中のPP4の検出および測定に役立てられう
る抗血清の調製に使用されうる。 本発明は下記(a)〜(g)すなわち (a) α1およびα2グロブリンの範囲内にある電気泳
動移動度、 (b) 等電点4.85±0.15、 (c) 沈降係数S0 20,W3.3±0.2S、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
クリルアミドゲルにおいて測定された分子量
35000±5000、 (e) 吸光率Ｅ１％ 1cm（280nｍ）5.9±0.6、 (f) 炭水化物割合2.4±0.94％（ｇ／100ｇ）（マ
ンノース0.3±0.2％、ガラクトース0.4±0.2％、
キシロース0.1±0.04％、グルコース0.2±0.1
％、グルコサミン1.0±0.2％、ノイラミン酸0.4
±0.2％）および (g) 下記アミノ酸組成すなわち
の単離法に関する。 PP4は特定の器官の疾患を識別するために、疾
患経過監視用または治療制御用「マーカー」とし
て体液中のPP4の検出および測定に役立てられう
る抗血清の調製に使用されうる。 本発明は下記(a)〜(g)すなわち (a) α1およびα2グロブリンの範囲内にある電気泳
動移動度、 (b) 等電点4.85±0.15、 (c) 沈降係数S0 20,W3.3±0.2S、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
クリルアミドゲルにおいて測定された分子量
35000±5000、 (e) 吸光率Ｅ１％ 1cm（280nｍ）5.9±0.6、 (f) 炭水化物割合2.4±0.94％（ｇ／100ｇ）（マ
ンノース0.3±0.2％、ガラクトース0.4±0.2％、
キシロース0.1±0.04％、グルコース0.2±0.1
％、グルコサミン1.0±0.2％、ノイラミン酸0.4
±0.2％）および (g) 下記アミノ酸組成すなわち
【表】
【表】
を特徴とする蛋白質PP4に関する。
組織蛋白質の特徴的指標を以下に詳細に説明す
る。 電気泳動移動度はベツクマン・インスツルメン
ト（Beckman Instruments）社製のミクロゾー
ン（Microzone）R200型装置を用いアセチルセ
ルロース箔（Sartorius社製品）上PH8.6のジエチ
ルバルビツール酸ナトリウム緩衝液を使用して微
修正で測定された。 等電点はストツクホルムのエル・ケー・ビー
（LKB）社製のカラム（440ml）を用いて測定さ
れた。アムフオリン（Ampholin ）混合物は4.0
〜6.0のPH範囲を有した。 沈降係数はベツクマン社製の分析用超遠心器
〔スピンコ（Spinco）装置Ｅ型〕中においてダブ
ルセクターセル中60000rpmにてUVスキヤンナ
ー技術を用いて280nｍで測定された。溶媒とし
ては0.2モル／のNaClを含有するPH6.8の0.05モ
ル／燐酸塩緩衝液が用いられた。蛋白質濃度は
光学濃度約３に調整された。沈降係数は20℃の水
に基いて換算された。 SDSを含有するポリアクリルアミドゲル中にお
ける分子量の測定には0.1ｇ／100mlのドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）を含有する7.5ｇ／100mlの
ポリアクリルアミド（PAA）を有するゲルが使
用された。比較物質としてヒト胎盤ラクトジエン
（HPL）およびヒトアルブミンおよびその集合物
が用いられた。 吸光率の測定には物質１mgを蒸留水中に溶解さ
せて１mlの溶液とした。 炭水化物は下記のようにして測定された。すな
わち配糖体結合を加水分解後遊離された中性糖を
ボレート複合体として陰イオン交換体カラムで分
離し〔「Anal.Biochem.」第27巻第567頁（1969
年）参照〕、溶出液中にビシンコニン酸第１銅試
薬を混合することにより着色させ〔「Anal.
Biochem.」第56巻第440頁（1973年）参照〕そし
て内部標準としてラムノースを使用して定量的に
測定した。アミノ糖はニンヒドリンとその反応に
より検出されそして測定された。ノイラミン酸含
量はウオレン（Warren）氏による方法
〔「Methods in Enzymology」第巻第463〜465
頁（1963年）参照〕を用いて測定された。 アミノ酸分析はムーア（S.Moore）氏等の
「Anal.Chem.」第30巻第1185頁（1958年）に記載
された方法に従い、ベツクマン社製の液体クロマ
グラフイー用マルチクローム（Multichrom）Ｂ
を使用して実施された。シスチンは蛋白質を過蟻
酸を用いて酸化し〔「Anal.Chem.」第30巻第1185
頁（1958年）参照〕そして次にクロマトグラフイ
ー〔（J.Biol.Chem.」第238巻第235頁（1963年）
参照〕した後システイン酸として測定された。ト
リプトフアン含量はエーデルホフ（H.Edelhoch）
氏の「Biochemistry」第６巻第1948頁（1967年）
記載の方法により直接側光測定された。 種々の人間の器官からの抽出物を調査すると
PP4は胎盤、胃、膀胱、腎臓、副腎、皮膚および
脾臓中において免疫化学的方法を用いて比較的高
濃度に検出された。心臓、肺、肝臓、結腸、直腸
および子宮のような人間の他の器官からの抽出物
はこの蛋白質を含有しないかまたは相当微量にし
か含有しなかつた。PP4は人間の赤血球からの溶
解質中に低濃度にしか存在しなかつた（緻密な洗
浄された赤血球100ml当りPP4約0.6mg）。PP4と免
疫化合的に同一のまたは本質的に関連する蛋白質
は猿ならびに牛および羊の胎盤からの抽出物中に
も検出できた。 従つてPP4を単離するにはこの蛋白質が存在す
る人間または動物の器官および細胞が使用されう
る。これには特に充分量得られそしてこの蛋白質
を充分に高濃度に含有する成熟した人間の胎盤が
適当である。 成熟した人間の胎盤は平均して約50mgのPP4を
含有する。胎盤中に含有されるPP4はその器官を
稀塩溶液または緩衝溶液、例えば生理食塩溶液で
抽出すると一部分しか溶液に移行しない（胎盤１
個当り約２〜５mg）。しかしながらこの蛋白質の
主要量は組織中において膜と連合していると思わ
れそして可溶化剤例えばポリエチレングリコール
−ｐ−イソオクチルフエニルエーテル〔トリトン
（Triton Ｘ−100〕のような非イオン系洗浄剤
を使用してはじめて溶液中に移行する。従つて
PP4を単離するには胎盤から稀塩溶液を用いて得
られた蛋白抽出物のみならず溶性成分を洗い出し
たのちに組織残留物からトリトンＸ−100を用い
て可溶化することにより得られる胎盤の蛋白抽出
物も使用されうる。この２種の抽出法により得ら
れた蛋白質はそれらの物理化学的および免疫化学
的性質において同一である。 PP4はこれらの性質に相当する措置をとること
によりその単離法において使用されうる下記の性
質を有する。 (1) 硫酸アンモニウムを用いてPH7.0および40〜
70％飽和で水溶液から沈殿する。 (2) 水溶性アクリジン塩基例えば２−エトキシ−
６，９−ジアミノアクリジンラクテート〔リバ
ノール（Rivanol ）〕を用いてPH４〜９およ
び塩基濃度0.2〜0.8ｇ／100mlで沈殿する。PH
6.0およびリバノール濃度0.4ｇ／100mlで一部
分沈殿する。 (3) 電気泳動による分離においてPH8.6でα1とα2
グロブリンの間にみられる。 (4) 等電焦束においてPH4.7〜5.0に見られる。 (5) セフアデツクス（Sephadex ）でのゲル
過において分子量20000〜50000を有する蛋白質
と同様に挙動する。 (6) 稀塩溶液中約０〜２ｍＳの伝導度でカオリ
ン、例えばメルク社製ボラスアルバ（bolus
alba）に吸着されそしてそこからより濃度の高
い塩溶液例えばPH6.8の0.1モル／燐酸塩緩衝
液で再び溶離されうる。 (7) 弱塩基性イオン交換体例えばDEAEセルロー
スまたはDEAEセフアデツクスに伝導度約０〜
２ｍＳおよびPH約７〜９で結合しそしてより濃
度の高い塩溶液（NaCl1〜５ｇ／100ml溶液）
で溶離されうる。 (8) 水溶液から免疫吸着により富化されそして単
離されうる。 従つて本発明はまたこの蛋白質を含有する器官
から稀塩溶液または緩衝溶液を用いて得られた抽
出物を下記(a)〜(g)の操作すなわち (a) PH５〜８および40〜70％の飽和における硫酸
アンモニウムを用いる蛋白質PP4の沈殿、 (b) PH４〜９および塩の濃度0.2〜0.8ｇ／100ml
における水溶性アクリジン塩基を用いる蛋白質
PP4の沈殿、 (c) α1およびα2グロブリンの間の蛋白フラクシヨ
ンが単離される調製用ゾーン電気泳動、 (d) 分子量20000〜50000を有する蛋白質が単離さ
れるゲル過または限外過、 (d) カオリンへの吸着および蛋白質PP4の溶離、 (f) 弱塩基性イオン交換体への吸着および蛋白質
PP4の溶離、 (g) 免疫吸着的富化 の一つまたはそれ以上に付することを特徴とする
PP4の単離または富化法にも関する。 硫酸アンモニウムと並んで他の調製的生化学に
慣用される中性塩もPP4の沈殿に使用されうる。
アクリジン塩基の他に蛋白質分別に知られている
ようなキノリン塩基の水溶性誘導体も本発明によ
る方法の範囲内で使用されうる。それらの電気泳
動挙動、および分子量のような負荷に相当して、
指示された性質を有する蛋白質を他の蛋白質から
分離するのに適する他の操作も蛋白質の単離に使
用されうる。 この目的には調製的電気泳動、等電焦束、ゲル
過または限外過なる種々の方法あるいはまた
弱塩基性イオン交換体に結合されそしてそこから
再び溶離されうるPP4の性質も用いられうる。 しかしながら特に稀緩衝溶液中でカオリンに吸
着されそしてそこから再び強緩衝溶液で溶離され
うるPP4の特殊な性質がこの蛋白質の単離に抜群
に適する。 PP4の富化または他の蛋白質からのこの蛋白質
の分離をもたらす前記した操作の好都合な組み合
せによりPP4が単離されうる。 それゆえ本発明はさらにこの蛋白質を含有する
器官を粉砕しそして生理的塩溶液を用いてすべて
の溶性成分が除去されるまで洗い、組織残留物を
可溶化剤例えばポリエチレングリコール−ｐ−イ
ソオクチルフエニルエーテルのような非イオン系
洗浄剤の溶液を用いて抽出しそして得られた抽出
液を充分に透析したのち前記した(a)〜(g)の操作の
１種またはそれ以上に付することを特徴とする
PP4の単離または富下法にも関する。 非イオン系洗浄剤の代りに例えば３モル／の
KSCN溶液または６モル／の尿素溶液もPP4の
可溶化に使用されうる。 PP4の富化および単離のために指示された前記
操作はすべて決して強制的なものではなくそして
また前記された順序で実施されねばならぬもので
もない。 人間の胎盤の稀塩抽出物からPP4を単離するに
は、抽出物中の蛋白質をはじめに水溶性のアクリ
ジン塩基および硫酸アンモニウムを用いて分別し
そして次にカオリンに吸着させる前にゲル過に
よりさらに富化させることが好都合であることが
証明された（後記例１参照）。 胎盤組織を洗浄剤で抽出することにより得られ
た蛋白フラクシヨンからPP4を単離する場合、
PP4をはじめに免疫吸着工程により富化させそし
てさらに精製するために続いてゲル過をするこ
とが好ましいことが証明された（例２参照）。 例えば分離操作からのフラクシヨン中において
PP4を検出および測定するには、指示されたパラ
メーターと並んでまた免疫化学的方法も役立てら
れうる。何故ならPP4は抗原性質を有するからで
ある。 この目的に使用されうる抗血清は下記の方法で
取得されうるすなわち洗浄剤で可溶化された胎盤
組織蛋白フラクシヨンを用いて家兎に免疫賦与す
ることによりなかんずくPP4に対する抗体をも含
有する多価抗血清が得られる。 この抗血清は一方ではPP4の免疫学的検出に、
もう一方ではPP4の富化および単離に使用されう
る免疫吸着剤の調製に役立てられうる。 本明細書の例１記載の方法により得られる精製
されたPP4を用いて既知方法により動物に免疫賦
与することにより単一特異的な抗血清が調製され
うる。 PP4を免疫学的に検出するにはオウヒターロニ
イ（Ouchterlony）によるゲル拡散技法
〔SchultzeおよびHeremans両氏「Molecular
Biology of Human Proteins」第１巻第134頁参
照〕または必要な場合は、放射線免疫検定または
酵素免疫検定のようなより感度の良い方法も用い
られうる。 PP4の検出および測定は診断上重要である。
PP4はある種の器官中にのみ比較的高濃度に存在
する組織蛋白質である。これらの器官の疾患に際
しては細胞破壊の増大により患者の血清または他
の体液、例えば尿中における組織蛋白PP4の濃度
が正常値以上に上昇しうる。それゆえ体液中にお
けるPP4の検出および測定はこれらの器官の疾患
を識別するためあるいはまた疾患経過の監視およ
び治療の制御のためのマーカーとして使用されう
る。 PP4はまたPP4の検出および測定に役立てられ
うる抗血清の調製にも使用されうる。 下記の例により本発明を説明する。 例 １ (A) 胎盤の抽出およびアクリジン塩基および硫酸
アンモニウムを用いる抽出物の分別 冷凍された人間の胎盤1000Kgを切断混合機中
で粉砕しそして0.4％（ｇ／100ml）の食塩溶液
1000を用いて抽出した。この抽出液から遠心
分離により組織残留物を分離したのち20％
（ｇ／100ml）酢酸を用いてPH6.0に調整しそし
て撹拌下に２−エトキシ−６，９−ジアミノア
クリジン−ラクテート（リバノール、Hoechst
社製品）の３％（ｇ／100ml）溶液200を加え
た。沈殿を遠心分離により分離し、2.5％
（ｇ／100ml）のNaCl溶液500を加えそして４
時間撹拌した。分離してきた２−エトキシ−
６，９−ジアミノアクリジンクロライドを遠心
分離除去した。上澄み液から25％（ｇ／100ml）
硫酸アンモニウムの添加により随伴蛋白質の一
部分を沈殿させた。蛋白質PP4は主に溶液中に
残存した。これは硫酸アンモニウム（20ｇ／
100ml）をさらに添加することによりそこから
沈殿されそして遠心分離によりとり出された。
それにより以下にフラクシヨンＡとして表示さ
れる湿つたペースト約３Kgが得られた。 (B) セフアデツクスＧ−150でのゲル過 フラクシヨンA500ｇを水に溶解させ、まだ
存在するリバノールを除去するためにベントナ
イトＡ〔Erbsloen ＆ Co社製品）約2.5ｇを
加えそして遠心分離したのち0.05％（ｇ／100
ml）のNaN3を含有する0.01モル／のトリス
（Tris）HCl緩衝液（PH8.0）（緩衝溶液）で
透析した。残留する溶液をセフアデツクスＧ−
150を充填したカラム（20×100cm）に適用しそ
して緩衝溶液を用いて溶離した。低分子蛋白
質（分子量10000〜60000）を含有する溶出液を
合しそして蛋白質を沈殿させるために45％
（ｇ／100ml）の硫酸アンモニウムを加えた。沈
殿を遠心分離にとり出した（フラクシヨンＢ）。 (C) カオリンへの吸着および溶離 フラクシヨンＢを水約100ml中に溶解させそ
して緩衝溶液で透析した。この溶液150mlに
つきカオリン〔メルク社製ボラスアルバ〕15ｇ
を加えてそして20℃で１時間撹拌した。それに
よりPP4はカオリンに結合され、一方他の蛋白
質は大部分溶液中に残留した。遠心分離したの
ちカオリンを緩衝溶液を用いて２回短時間洗
浄しそして終りにPH6.8の0.1モル／燐酸ナト
リウム緩衝液150mlずつを用いて続けて２回溶
離するとPP4が再び溶液中に移行した。遠心分
離によりカオリンを分離したのち溶出液を合し
そして限外過器を用いて10〜20mlまで濃縮し
た。 (D) 高度精製 カオリンへの吸着により得られた生成物は純
度約90％を有していた。まだ存在する不純物の
主要量は１モル／のNaClおよび0.1％（ｇ／
100ml）のナトリウムアジドを含有するPH８の
0.1モル／のトリス−HCl緩衝溶液（緩衝溶
液）を使用してウルトロゲル（Ultrogel）
AcA−44カラム（4.5×100cm）でゲル過する
ことにより分離できた。また痕跡量に残存する
血清蛋白質は逆のまたは負の免疫吸着により、
すなわち人間の血清の蛋白質に対する家兎の単
体と結合した抗体を用いて除去された。この方
法で得られたPP4は99％以上の純度を有した。
このPP4溶液を水で透析してそして次に凍結乾
燥した。フラクシヨンＡのペースト500ｇから
PP4約30mgが得られた。 例 ２ (A) 胎盤の粉砕および洗浄 PP4の膜と会合した部分を単離するために分
娩に際して得られるような成熟した人間の胎盤
を冷凍された状態で切断混合機を用いて粉砕し
そして使用までこの形態で−20℃で貯蔵した。
次に生理食塩溶液で洗浄することによりすべて
の溶性組織蛋白質を除去した。そのためには粉
砕された胎盤組織500ｇに食塩溶液700mlを加
え、短時間均質化させ、次に４℃で数時間撹拌
しそして終りに遠心分離した。上澄み液を捨
て、残留物を新たに食塩溶液700mlと数時間撹
拌しそして再び遠心分離した。この洗浄操作を
合計６回反復した。この方法で胎盤組織から溶
性成分を実質的に除去した。 (B) 洗浄剤を用いる胎盤組織の抽出 膜と会合した抗原を可溶化させるために組織
残留物を洗浄後水中のトリトンＸ−100の２％
溶液各700mlずつを用いて続けて３回抽出し、
その際４℃でそれぞれ20時間撹拌しそして次に
遠心分離した。この抽出液をはじめ水で、そし
て次に１モル／のNaClおよび0.1％（ｇ／
100ml）のナトリウムアジドを含有する0.1モ
ル／のトリス−HCl−緩衝液（PH8.0）（緩衝
溶液）で透析した。透析後この溶液を限外
過器（Amicon社製品）上PM−10膜を使用し
てそれぞれ約200mlまで濃縮した。胎盤組織500
ｇの残留物からの抽出物は平均して合計約25mg
のPP4を含有していた（フラクシヨン2A）。 (C) 免疫吸着によるPP4の富化 (1) 免疫吸着剤の調製 家兎を可溶化された胎盤蛋白質（フラクシ
ヨン2A）を用いて免疫賦与することにより
多価抗血清を調製した。このものはPP4に対
する抗体もそしてまた洗浄剤で溶解する他の
抗原に対する抗体をも含有した。かかる抗血
清プール350mlを0.02モル／の燐酸塩緩衝
液（PH7.0）で透析しそして免疫グロブリン
を分離するために同じ緩衝液を用いDEAEセ
ルロールでクロマトグラフイーした。通過液
（蛋白質3.63ｇ）中の免疫グロブリンフラク
シヨンをブロムシアン45.3mmを用いて活性化
した球形の特別に精製されたアガロース
〔Pharmacia社製品、セフアロース
（Sepharose ）〕363ｇと反応させそして担
体に共有結合させた。この方法はAxen氏他
により「Nature」第214巻第1302頁（1967
年）に記載されている。この方法で調製され
た免疫吸着剤を用いてPP4を他の可溶化され
た抗原と共に胎盤フラクシヨン2Aからさら
に富化できた。 (2) 免疫吸着の実施 免疫吸着剤を緩衝溶液に懸濁させ、クロ
マトグラフイー用カラム（5.0×20cm）に充
填しそして緩衝溶液で洗つた。次にフラク
シヨン2Aをカラムに適用するとその際PP4
および他の可溶化された抗原が免疫吸着的に
結合された。次にこのカラムを緩衝液で充
分に洗浄した。次に吸着された蛋白質を６モ
ル／の尿素溶液約600mlを用いてカラムか
ら溶離させた。PP4を含有する溶出液を緩衝
溶液で透析しそして限外過器を用いて約
20mlまで濃縮した。カラム中の吸着剤を蛋白
質の溶離後直ちに緩衝溶液を用いて再び中
和しそして充分に洗浄した。これは可溶化さ
れた抗原の免疫吸着的結合にあらためて使用
される。 (D) ゲル過によるPP4の分離 免疫吸着的に結合された他の抗原からのPP4
の分離はアクリルアミドアガロースAcA−34
（LKB社製品）でのゲル過により実施され
た。このためには免疫吸着により得られたフラ
クシヨンを合し、60mlまで濃縮しそして緩衝溶
液を使用してAcA−34カラム（５×110cm）
でクロマトグラフイーした。その際PP4は大抵
より高い分子量（100000以上）を有しそしてそ
れゆえPP4より速かにカラムを移動する他の可
溶化された膜抗原から明瞭に分離された。PP4
の主要量を含有するフラクシヨンを合し、そし
て限外過器中で10〜20mlまで濃縮した。 (E) 高度精製 ゲル過により得られた生成物はまだ微量の
血清蛋白質特にアルブミンにより汚染されてい
た。これは逆の免疫吸着、すなわちなお随伴蛋
白質として存在する血清蛋白質に対する担体と
結合した抗体を用いて除去できた。
る。 電気泳動移動度はベツクマン・インスツルメン
ト（Beckman Instruments）社製のミクロゾー
ン（Microzone）R200型装置を用いアセチルセ
ルロース箔（Sartorius社製品）上PH8.6のジエチ
ルバルビツール酸ナトリウム緩衝液を使用して微
修正で測定された。 等電点はストツクホルムのエル・ケー・ビー
（LKB）社製のカラム（440ml）を用いて測定さ
れた。アムフオリン（Ampholin ）混合物は4.0
〜6.0のPH範囲を有した。 沈降係数はベツクマン社製の分析用超遠心器
〔スピンコ（Spinco）装置Ｅ型〕中においてダブ
ルセクターセル中60000rpmにてUVスキヤンナ
ー技術を用いて280nｍで測定された。溶媒とし
ては0.2モル／のNaClを含有するPH6.8の0.05モ
ル／燐酸塩緩衝液が用いられた。蛋白質濃度は
光学濃度約３に調整された。沈降係数は20℃の水
に基いて換算された。 SDSを含有するポリアクリルアミドゲル中にお
ける分子量の測定には0.1ｇ／100mlのドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）を含有する7.5ｇ／100mlの
ポリアクリルアミド（PAA）を有するゲルが使
用された。比較物質としてヒト胎盤ラクトジエン
（HPL）およびヒトアルブミンおよびその集合物
が用いられた。 吸光率の測定には物質１mgを蒸留水中に溶解さ
せて１mlの溶液とした。 炭水化物は下記のようにして測定された。すな
わち配糖体結合を加水分解後遊離された中性糖を
ボレート複合体として陰イオン交換体カラムで分
離し〔「Anal.Biochem.」第27巻第567頁（1969
年）参照〕、溶出液中にビシンコニン酸第１銅試
薬を混合することにより着色させ〔「Anal.
Biochem.」第56巻第440頁（1973年）参照〕そし
て内部標準としてラムノースを使用して定量的に
測定した。アミノ糖はニンヒドリンとその反応に
より検出されそして測定された。ノイラミン酸含
量はウオレン（Warren）氏による方法
〔「Methods in Enzymology」第巻第463〜465
頁（1963年）参照〕を用いて測定された。 アミノ酸分析はムーア（S.Moore）氏等の
「Anal.Chem.」第30巻第1185頁（1958年）に記載
された方法に従い、ベツクマン社製の液体クロマ
グラフイー用マルチクローム（Multichrom）Ｂ
を使用して実施された。シスチンは蛋白質を過蟻
酸を用いて酸化し〔「Anal.Chem.」第30巻第1185
頁（1958年）参照〕そして次にクロマトグラフイ
ー〔（J.Biol.Chem.」第238巻第235頁（1963年）
参照〕した後システイン酸として測定された。ト
リプトフアン含量はエーデルホフ（H.Edelhoch）
氏の「Biochemistry」第６巻第1948頁（1967年）
記載の方法により直接側光測定された。 種々の人間の器官からの抽出物を調査すると
PP4は胎盤、胃、膀胱、腎臓、副腎、皮膚および
脾臓中において免疫化学的方法を用いて比較的高
濃度に検出された。心臓、肺、肝臓、結腸、直腸
および子宮のような人間の他の器官からの抽出物
はこの蛋白質を含有しないかまたは相当微量にし
か含有しなかつた。PP4は人間の赤血球からの溶
解質中に低濃度にしか存在しなかつた（緻密な洗
浄された赤血球100ml当りPP4約0.6mg）。PP4と免
疫化合的に同一のまたは本質的に関連する蛋白質
は猿ならびに牛および羊の胎盤からの抽出物中に
も検出できた。 従つてPP4を単離するにはこの蛋白質が存在す
る人間または動物の器官および細胞が使用されう
る。これには特に充分量得られそしてこの蛋白質
を充分に高濃度に含有する成熟した人間の胎盤が
適当である。 成熟した人間の胎盤は平均して約50mgのPP4を
含有する。胎盤中に含有されるPP4はその器官を
稀塩溶液または緩衝溶液、例えば生理食塩溶液で
抽出すると一部分しか溶液に移行しない（胎盤１
個当り約２〜５mg）。しかしながらこの蛋白質の
主要量は組織中において膜と連合していると思わ
れそして可溶化剤例えばポリエチレングリコール
−ｐ−イソオクチルフエニルエーテル〔トリトン
（Triton Ｘ−100〕のような非イオン系洗浄剤
を使用してはじめて溶液中に移行する。従つて
PP4を単離するには胎盤から稀塩溶液を用いて得
られた蛋白抽出物のみならず溶性成分を洗い出し
たのちに組織残留物からトリトンＸ−100を用い
て可溶化することにより得られる胎盤の蛋白抽出
物も使用されうる。この２種の抽出法により得ら
れた蛋白質はそれらの物理化学的および免疫化学
的性質において同一である。 PP4はこれらの性質に相当する措置をとること
によりその単離法において使用されうる下記の性
質を有する。 (1) 硫酸アンモニウムを用いてPH7.0および40〜
70％飽和で水溶液から沈殿する。 (2) 水溶性アクリジン塩基例えば２−エトキシ−
６，９−ジアミノアクリジンラクテート〔リバ
ノール（Rivanol ）〕を用いてPH４〜９およ
び塩基濃度0.2〜0.8ｇ／100mlで沈殿する。PH
6.0およびリバノール濃度0.4ｇ／100mlで一部
分沈殿する。 (3) 電気泳動による分離においてPH8.6でα1とα2
グロブリンの間にみられる。 (4) 等電焦束においてPH4.7〜5.0に見られる。 (5) セフアデツクス（Sephadex ）でのゲル
過において分子量20000〜50000を有する蛋白質
と同様に挙動する。 (6) 稀塩溶液中約０〜２ｍＳの伝導度でカオリ
ン、例えばメルク社製ボラスアルバ（bolus
alba）に吸着されそしてそこからより濃度の高
い塩溶液例えばPH6.8の0.1モル／燐酸塩緩衝
液で再び溶離されうる。 (7) 弱塩基性イオン交換体例えばDEAEセルロー
スまたはDEAEセフアデツクスに伝導度約０〜
２ｍＳおよびPH約７〜９で結合しそしてより濃
度の高い塩溶液（NaCl1〜５ｇ／100ml溶液）
で溶離されうる。 (8) 水溶液から免疫吸着により富化されそして単
離されうる。 従つて本発明はまたこの蛋白質を含有する器官
から稀塩溶液または緩衝溶液を用いて得られた抽
出物を下記(a)〜(g)の操作すなわち (a) PH５〜８および40〜70％の飽和における硫酸
アンモニウムを用いる蛋白質PP4の沈殿、 (b) PH４〜９および塩の濃度0.2〜0.8ｇ／100ml
における水溶性アクリジン塩基を用いる蛋白質
PP4の沈殿、 (c) α1およびα2グロブリンの間の蛋白フラクシヨ
ンが単離される調製用ゾーン電気泳動、 (d) 分子量20000〜50000を有する蛋白質が単離さ
れるゲル過または限外過、 (d) カオリンへの吸着および蛋白質PP4の溶離、 (f) 弱塩基性イオン交換体への吸着および蛋白質
PP4の溶離、 (g) 免疫吸着的富化 の一つまたはそれ以上に付することを特徴とする
PP4の単離または富化法にも関する。 硫酸アンモニウムと並んで他の調製的生化学に
慣用される中性塩もPP4の沈殿に使用されうる。
アクリジン塩基の他に蛋白質分別に知られている
ようなキノリン塩基の水溶性誘導体も本発明によ
る方法の範囲内で使用されうる。それらの電気泳
動挙動、および分子量のような負荷に相当して、
指示された性質を有する蛋白質を他の蛋白質から
分離するのに適する他の操作も蛋白質の単離に使
用されうる。 この目的には調製的電気泳動、等電焦束、ゲル
過または限外過なる種々の方法あるいはまた
弱塩基性イオン交換体に結合されそしてそこから
再び溶離されうるPP4の性質も用いられうる。 しかしながら特に稀緩衝溶液中でカオリンに吸
着されそしてそこから再び強緩衝溶液で溶離され
うるPP4の特殊な性質がこの蛋白質の単離に抜群
に適する。 PP4の富化または他の蛋白質からのこの蛋白質
の分離をもたらす前記した操作の好都合な組み合
せによりPP4が単離されうる。 それゆえ本発明はさらにこの蛋白質を含有する
器官を粉砕しそして生理的塩溶液を用いてすべて
の溶性成分が除去されるまで洗い、組織残留物を
可溶化剤例えばポリエチレングリコール−ｐ−イ
ソオクチルフエニルエーテルのような非イオン系
洗浄剤の溶液を用いて抽出しそして得られた抽出
液を充分に透析したのち前記した(a)〜(g)の操作の
１種またはそれ以上に付することを特徴とする
PP4の単離または富下法にも関する。 非イオン系洗浄剤の代りに例えば３モル／の
KSCN溶液または６モル／の尿素溶液もPP4の
可溶化に使用されうる。 PP4の富化および単離のために指示された前記
操作はすべて決して強制的なものではなくそして
また前記された順序で実施されねばならぬもので
もない。 人間の胎盤の稀塩抽出物からPP4を単離するに
は、抽出物中の蛋白質をはじめに水溶性のアクリ
ジン塩基および硫酸アンモニウムを用いて分別し
そして次にカオリンに吸着させる前にゲル過に
よりさらに富化させることが好都合であることが
証明された（後記例１参照）。 胎盤組織を洗浄剤で抽出することにより得られ
た蛋白フラクシヨンからPP4を単離する場合、
PP4をはじめに免疫吸着工程により富化させそし
てさらに精製するために続いてゲル過をするこ
とが好ましいことが証明された（例２参照）。 例えば分離操作からのフラクシヨン中において
PP4を検出および測定するには、指示されたパラ
メーターと並んでまた免疫化学的方法も役立てら
れうる。何故ならPP4は抗原性質を有するからで
ある。 この目的に使用されうる抗血清は下記の方法で
取得されうるすなわち洗浄剤で可溶化された胎盤
組織蛋白フラクシヨンを用いて家兎に免疫賦与す
ることによりなかんずくPP4に対する抗体をも含
有する多価抗血清が得られる。 この抗血清は一方ではPP4の免疫学的検出に、
もう一方ではPP4の富化および単離に使用されう
る免疫吸着剤の調製に役立てられうる。 本明細書の例１記載の方法により得られる精製
されたPP4を用いて既知方法により動物に免疫賦
与することにより単一特異的な抗血清が調製され
うる。 PP4を免疫学的に検出するにはオウヒターロニ
イ（Ouchterlony）によるゲル拡散技法
〔SchultzeおよびHeremans両氏「Molecular
Biology of Human Proteins」第１巻第134頁参
照〕または必要な場合は、放射線免疫検定または
酵素免疫検定のようなより感度の良い方法も用い
られうる。 PP4の検出および測定は診断上重要である。
PP4はある種の器官中にのみ比較的高濃度に存在
する組織蛋白質である。これらの器官の疾患に際
しては細胞破壊の増大により患者の血清または他
の体液、例えば尿中における組織蛋白PP4の濃度
が正常値以上に上昇しうる。それゆえ体液中にお
けるPP4の検出および測定はこれらの器官の疾患
を識別するためあるいはまた疾患経過の監視およ
び治療の制御のためのマーカーとして使用されう
る。 PP4はまたPP4の検出および測定に役立てられ
うる抗血清の調製にも使用されうる。 下記の例により本発明を説明する。 例 １ (A) 胎盤の抽出およびアクリジン塩基および硫酸
アンモニウムを用いる抽出物の分別 冷凍された人間の胎盤1000Kgを切断混合機中
で粉砕しそして0.4％（ｇ／100ml）の食塩溶液
1000を用いて抽出した。この抽出液から遠心
分離により組織残留物を分離したのち20％
（ｇ／100ml）酢酸を用いてPH6.0に調整しそし
て撹拌下に２−エトキシ−６，９−ジアミノア
クリジン−ラクテート（リバノール、Hoechst
社製品）の３％（ｇ／100ml）溶液200を加え
た。沈殿を遠心分離により分離し、2.5％
（ｇ／100ml）のNaCl溶液500を加えそして４
時間撹拌した。分離してきた２−エトキシ−
６，９−ジアミノアクリジンクロライドを遠心
分離除去した。上澄み液から25％（ｇ／100ml）
硫酸アンモニウムの添加により随伴蛋白質の一
部分を沈殿させた。蛋白質PP4は主に溶液中に
残存した。これは硫酸アンモニウム（20ｇ／
100ml）をさらに添加することによりそこから
沈殿されそして遠心分離によりとり出された。
それにより以下にフラクシヨンＡとして表示さ
れる湿つたペースト約３Kgが得られた。 (B) セフアデツクスＧ−150でのゲル過 フラクシヨンA500ｇを水に溶解させ、まだ
存在するリバノールを除去するためにベントナ
イトＡ〔Erbsloen ＆ Co社製品）約2.5ｇを
加えそして遠心分離したのち0.05％（ｇ／100
ml）のNaN3を含有する0.01モル／のトリス
（Tris）HCl緩衝液（PH8.0）（緩衝溶液）で
透析した。残留する溶液をセフアデツクスＧ−
150を充填したカラム（20×100cm）に適用しそ
して緩衝溶液を用いて溶離した。低分子蛋白
質（分子量10000〜60000）を含有する溶出液を
合しそして蛋白質を沈殿させるために45％
（ｇ／100ml）の硫酸アンモニウムを加えた。沈
殿を遠心分離にとり出した（フラクシヨンＢ）。 (C) カオリンへの吸着および溶離 フラクシヨンＢを水約100ml中に溶解させそ
して緩衝溶液で透析した。この溶液150mlに
つきカオリン〔メルク社製ボラスアルバ〕15ｇ
を加えてそして20℃で１時間撹拌した。それに
よりPP4はカオリンに結合され、一方他の蛋白
質は大部分溶液中に残留した。遠心分離したの
ちカオリンを緩衝溶液を用いて２回短時間洗
浄しそして終りにPH6.8の0.1モル／燐酸ナト
リウム緩衝液150mlずつを用いて続けて２回溶
離するとPP4が再び溶液中に移行した。遠心分
離によりカオリンを分離したのち溶出液を合し
そして限外過器を用いて10〜20mlまで濃縮し
た。 (D) 高度精製 カオリンへの吸着により得られた生成物は純
度約90％を有していた。まだ存在する不純物の
主要量は１モル／のNaClおよび0.1％（ｇ／
100ml）のナトリウムアジドを含有するPH８の
0.1モル／のトリス−HCl緩衝溶液（緩衝溶
液）を使用してウルトロゲル（Ultrogel）
AcA−44カラム（4.5×100cm）でゲル過する
ことにより分離できた。また痕跡量に残存する
血清蛋白質は逆のまたは負の免疫吸着により、
すなわち人間の血清の蛋白質に対する家兎の単
体と結合した抗体を用いて除去された。この方
法で得られたPP4は99％以上の純度を有した。
このPP4溶液を水で透析してそして次に凍結乾
燥した。フラクシヨンＡのペースト500ｇから
PP4約30mgが得られた。 例 ２ (A) 胎盤の粉砕および洗浄 PP4の膜と会合した部分を単離するために分
娩に際して得られるような成熟した人間の胎盤
を冷凍された状態で切断混合機を用いて粉砕し
そして使用までこの形態で−20℃で貯蔵した。
次に生理食塩溶液で洗浄することによりすべて
の溶性組織蛋白質を除去した。そのためには粉
砕された胎盤組織500ｇに食塩溶液700mlを加
え、短時間均質化させ、次に４℃で数時間撹拌
しそして終りに遠心分離した。上澄み液を捨
て、残留物を新たに食塩溶液700mlと数時間撹
拌しそして再び遠心分離した。この洗浄操作を
合計６回反復した。この方法で胎盤組織から溶
性成分を実質的に除去した。 (B) 洗浄剤を用いる胎盤組織の抽出 膜と会合した抗原を可溶化させるために組織
残留物を洗浄後水中のトリトンＸ−100の２％
溶液各700mlずつを用いて続けて３回抽出し、
その際４℃でそれぞれ20時間撹拌しそして次に
遠心分離した。この抽出液をはじめ水で、そし
て次に１モル／のNaClおよび0.1％（ｇ／
100ml）のナトリウムアジドを含有する0.1モ
ル／のトリス−HCl−緩衝液（PH8.0）（緩衝
溶液）で透析した。透析後この溶液を限外
過器（Amicon社製品）上PM−10膜を使用し
てそれぞれ約200mlまで濃縮した。胎盤組織500
ｇの残留物からの抽出物は平均して合計約25mg
のPP4を含有していた（フラクシヨン2A）。 (C) 免疫吸着によるPP4の富化 (1) 免疫吸着剤の調製 家兎を可溶化された胎盤蛋白質（フラクシ
ヨン2A）を用いて免疫賦与することにより
多価抗血清を調製した。このものはPP4に対
する抗体もそしてまた洗浄剤で溶解する他の
抗原に対する抗体をも含有した。かかる抗血
清プール350mlを0.02モル／の燐酸塩緩衝
液（PH7.0）で透析しそして免疫グロブリン
を分離するために同じ緩衝液を用いDEAEセ
ルロールでクロマトグラフイーした。通過液
（蛋白質3.63ｇ）中の免疫グロブリンフラク
シヨンをブロムシアン45.3mmを用いて活性化
した球形の特別に精製されたアガロース
〔Pharmacia社製品、セフアロース
（Sepharose ）〕363ｇと反応させそして担
体に共有結合させた。この方法はAxen氏他
により「Nature」第214巻第1302頁（1967
年）に記載されている。この方法で調製され
た免疫吸着剤を用いてPP4を他の可溶化され
た抗原と共に胎盤フラクシヨン2Aからさら
に富化できた。 (2) 免疫吸着の実施 免疫吸着剤を緩衝溶液に懸濁させ、クロ
マトグラフイー用カラム（5.0×20cm）に充
填しそして緩衝溶液で洗つた。次にフラク
シヨン2Aをカラムに適用するとその際PP4
および他の可溶化された抗原が免疫吸着的に
結合された。次にこのカラムを緩衝液で充
分に洗浄した。次に吸着された蛋白質を６モ
ル／の尿素溶液約600mlを用いてカラムか
ら溶離させた。PP4を含有する溶出液を緩衝
溶液で透析しそして限外過器を用いて約
20mlまで濃縮した。カラム中の吸着剤を蛋白
質の溶離後直ちに緩衝溶液を用いて再び中
和しそして充分に洗浄した。これは可溶化さ
れた抗原の免疫吸着的結合にあらためて使用
される。 (D) ゲル過によるPP4の分離 免疫吸着的に結合された他の抗原からのPP4
の分離はアクリルアミドアガロースAcA−34
（LKB社製品）でのゲル過により実施され
た。このためには免疫吸着により得られたフラ
クシヨンを合し、60mlまで濃縮しそして緩衝溶
液を使用してAcA−34カラム（５×110cm）
でクロマトグラフイーした。その際PP4は大抵
より高い分子量（100000以上）を有しそしてそ
れゆえPP4より速かにカラムを移動する他の可
溶化された膜抗原から明瞭に分離された。PP4
の主要量を含有するフラクシヨンを合し、そし
て限外過器中で10〜20mlまで濃縮した。 (E) 高度精製 ゲル過により得られた生成物はまだ微量の
血清蛋白質特にアルブミンにより汚染されてい
た。これは逆の免疫吸着、すなわちなお随伴蛋
白質として存在する血清蛋白質に対する担体と
結合した抗体を用いて除去できた。
第１ａ図は寒天含有ゲル中の電界での分離後に
おけるPP4と家兎の特異的な抗血清（Auti−
PP4）との免疫学的反応を示す図であり、そして
第１ｂ図はヒト血清（HS）に対する家兎の抗血
清（Anti−HS）とのその免疫反応により視認可
能になされた血清蛋白質の分離を示す図である。
おけるPP4と家兎の特異的な抗血清（Auti−
PP4）との免疫学的反応を示す図であり、そして
第１ｂ図はヒト血清（HS）に対する家兎の抗血
清（Anti−HS）とのその免疫反応により視認可
能になされた血清蛋白質の分離を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記(a)〜(g)すなわち (a) α1およびα2グロブリンの範囲内にある電気泳
動移動度、 (b) 等電点4.85±0.15、 (c) 沈降係数S0 20,W3.3±0.2S、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
クリルアミドゲルにおいて測定された分子量
35000±5000、 (e) 吸光率Ｅ１％ 1cm（280nｍ）5.9±0.6、 (f) 炭水化物割合2.4±0.94％（ｇ／100ｇ）（マ
ンノース0.3±0.2％、ガラクトース0.4±0.2％、
キシロース0.1±0.04％、グルコース0.2±0.1
％、グルコサミン1.0±0.2％、ノイラミン酸0.4
±0.2％）および (g) 下記アミノ酸組成すなわち 【表】 【表】 を特徴とする蛋白質PP4。 ２ 下記(a)〜(g)すなわち (a) α1およびα2グロブリンの範囲内にある電気泳
動移動度、 (b) 等電点4.85±0.15、 (c) 沈降係数S0 20,W3.3±0.2S、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
クリルアミドゲルにおいて測定された分子量
35000±5000、 (e) 吸光率Ｅ１％ 1cm（280nｍ）5.9±0.6、 (f) 炭水化物割合2.4±0.94％（ｇ／100ｇ）（マ
ンノース0.3±0.2％、ガラクトース0.4±0.2％、
キシロース0.1±0.04％、グルコース0.2±0.1
％、グルコサミン1.0±0.2％、ノイラミン酸0.4
±0.2％）および (g) 下記アミノ酸組成すなわち 【表】 を有する蛋白質PP4を単離するに当り、この蛋白
質を含有する器官から希塩溶液または緩衝溶液を
用いて得られた抽出物を下記(a)〜(g)の操作すなわ
ち (a) PH５〜８および40〜70％の飽和における硫酸
アンモニウムを用いる蛋白質PP4の沈殿、 (b) PH４〜９および塩基濃度0.2〜0.8ｇ／100ml
における水溶性アクリジン塩基を用いる蛋白質
PP4の沈殿、 (c) α1およびα2グロブリンの間の蛋白フラクシヨ
ンが単離される調製用ゾーン電気泳動、 (d) 分子量20000〜50000を有する蛋白質が単離さ
れるゲル過または限外過、 (e) カオリンへの吸着および蛋白質PP4の溶離、 (f) 弱塩基性イオン交換体への吸着および蛋白質
PP4の溶離、および (g) 免疫吸着的富化 の一つまたはそれ以上に付することを特徴とする
方法。 ３ この蛋白質を含有する器官を粉砕しそして生
理的塩溶液を用いてすべての可溶性成分が除去さ
れるまで洗い、次に組織残留物を可溶化剤好まし
くは非イオン系洗浄剤の溶液を用いて抽出しそし
て得られた抽出液を透析後に前記特許請求の範囲
第２項の記載のようにして処理することを特徴と
する前記特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 特定の器官の疾患を識別するために、疾患の
経過を監視または治療を制御するための「マーカ
ー」として体液中の蛋白質、すなわち下記(a)〜(g) (a) α1およびα2グロブリンの範囲内にある電気泳
動移動度、 (b) 等電点4.85±0.15、 (c) 沈降係数S0 20,W3.3±0.2S、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
クリルアミドゲルにおいて測定された分子量
35000±5000、 (e) 吸光率Ｅ１％ 1cm（280nｍ）5.9±0.6、 (f) 炭水化物割合2.4±0.94％（ｇ／100ｇ）（マ
ンノース0.3±0.2％、ガラクトース0.4±0.2％、
キシロース0.1±0.04％、グルコース0.2±0.1
％、グルコサミン1.0±0.2％、ノイラミン酸0.4
±0.2％）および (g) 下記アミノ酸組成すなわち 【表】 【表】 を有する蛋白質PP4を検出および測定するための
抗血清の調製における該蛋白質含有抗原。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3315000.1 | 1983-04-26 | ||
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