JPS6361319B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血清、尿および人の胎盤抽出物中にお
いてその存在が証明され、そしてそれから単離す
ることができる新規な糖蛋白質、ならびにその製
造法に関する。 人の胎盤を水で抽出することにより得られる蛋
白質溶液は周知の如く多数の成分を含有してお
り、その一部は血清蛋白質に帰することができ、
他の部分は組織蛋白質に帰することができる。 本発明は未だ知られていない血清糖蛋白質を人
の胎盤抽出物から単離し、それを用いてその新規
な糖蛋白質に指向された特定の抗血清を製造する
ことを主題とし、そしてその抗血清を用いて血清
および尿中の前記新規な糖蛋白質を定性的に証明
あるいは定量的に測定することができる。 体液中の前記糖蛋白質の濃度を測定することに
より種々の病気を診断することができる。例えば
尿中の前記糖蛋白質の濃度は任娠中毒症の際に劇
的に増大するのでその診断に利用することができ
る。 本発明の対象は、血清、尿および人の胎盤抽出
物から得られる新規な糖蛋白質である。それは以
下の性質を特徴とする。 本質的にα―アミノ酸からなる蛋白質部分は75
±６％である。 炭水化物部分は24.6±5.2％であり、それはヘ
キソース8.9±２％、Ｎ―アセチル化されたヘキ
ソサミン7.1±1.5％、フコース0.2±0.2％、Ｎ―
アセチル化されたノイラミン酸8.4±1.5％からな
る。 沈降係数S_20Wは2.5±0.3Sである。 分子量は超遠心機を用いる測定によれば35000
±5000であり、またナトリウムドデシルサルフエ
ートを含有するポリアクリルアミドゲル中での測
定によれば65000±10000である。 等電点はPH3.4±0.4である。 吸光率Ｅ１％ １cm（280nm）は1.9±0.3である。 電気泳動移動度はα₁―およびα₂―グロブリンの
範囲内にある。 この糖蛋白質に対して指向される特定の抗体と
特異的免疫学的反応を示す。 本発明の糖蛋白質の前記の特徴を以下の記載に
よりさらに詳細に説明する。 沈降係数の測定はベツクマン社製の分析用超遠
心機（スピンコ（Spinco）装置モデルＥ）を使
用し、6000UpMにおいて二重扇形セル中280nm
においてUV走査法の助けにより行なわれる。溶
媒としては0.2モル／のNaCl含有する0.05モル
の燐酸塩緩衝液（PH6.8）が使用される。蛋白質
濃度は２％である。沈降係数は20℃の水を基準に
して換算される。 分子量測定のために沈降平衡法およびポリアク
リルアミドゲル電気泳動が使用される。超遠心機
を用いる測定は9000UpMにおいて行なわれる。
0.74ml／ｇの部分的比容に基づいて評価が行なわ
れる。超遠心機を使用した結果35000±5000の分
子量が得られた。 ポリアクリルアミドゲル―電気泳動に対しては
二つの方法が使用される。普通のポリアクリルア
ミド（PAA）―ゲル中での分離はツヴアイスラ
ー（Zwisler）氏等の方法〔Z.Klin.Chem.、第４
巻、第58頁（1966年）参照〕により行なわれる。
ナトリウムドデシルサルフエート含有ゲル中での
測定に対しては、7.5％のPAAとともに0.1％のナ
トリウムドデシルサルフエート（SDS）を含有す
るゲルが使用される。還元するためにはその蛋白
質を１％のメルカプトエタノールと共に１％の
SDS中で加温する。その蛋白質はアミドブラツク
で着色する。SDS含有PAA―ゲル中での移動度
からその糖蛋白質に対して65000±10000の分子量
が導かれた。 等電点の測定はLKB社製のカラム（440ml）を
用いて行なわれる。いわゆるアンホリン
（Ampholin）混合物は前記の糖蛋白質の測定に
おいては2.5〜4.0のPH範囲を有する。 電気泳動移動度の測定はベツクマン・インスツ
ルメンツ社のマイクロモデイフイケイシヨン中PH
8.6のナトリウムジエチルバルビツレート緩衝液
を用いてセルロースアセテート膜上で行なわれ
る。 炭水化物の定量はH.E.シユルツエ（Schultze）
氏等によりBiochem.Z.第329巻、第490頁（1958
年）に記載された方法により行なわれる。 アミノ酸分析はS.モーレ（Moore）氏等の方法
〔Anal.Chem.、第30巻、第1185頁（1958年）参
照〕により、ベツクマン社製の液体クロマトグラ
フイー用マルチクロムＢを使用して行なわれる。
１／２シスチンは蛋白質を過蟻酸で酸化〔S.Moore
氏外著、Anal.Chem.、第30巻、第1185頁（1958
年）参照〕後、引き続いてクロマトグラフイー
〔S.Moore氏著、J.Biol.Chem.、第238巻、第235
頁（1963年）参照〕を行なうことによりシステイ
ン酸として測定される。トリプトフアン含量は
H.エデルホツフ（Edelhoch）氏による直接分光
学的測定法〔Bio Chemistry、第６巻、第1948頁
（1967年）参照〕により測定される。 その物質の免疫学的同定は最も簡単には既知の
拡散方法により行なわれる。その場合抗原すなわ
ち新規な糖蛋白質およびこの新規な糖蛋白質に対
して指向されている抗体または該抗体に関して富
化されていない抗血清が担体媒質たとえば基天中
で互いに向つて拡散する。これらの両反応成分が
都合のよい割合で出会うと可視的な沈殿が形成さ
れる。この知見によれば、前記新規な糖蛋白質な
らびにその糖蛋白質に対して指向された抗体の確
認および測定に対してすべての免疫学的技術が適
用可能であることが当業者に明らかであろう。 体液中または組織抽出物中の本発明の糖蛋白質
を定量的に測定するための簡単でしかも通常充分
に正確な方法は、いわゆるロウレルー法である。
それはAnalyt.Biochem.（ニユーヨーク）、第15
巻、第45頁（1966年）に記載されている。 さらに本発明の目的は前記の特徴を有する糖蛋
白質の製造法であり、この方法は前記の糖蛋白質
を含有する体液または器官の抽出物を、本発明に
より見出された以下の基準に基づいて分画するこ
とを特徴とする。 前記の糖蛋白質は中性塩の助けにより沈殿させ
ることができる。そのような沈殿生成のために通
常使用される硫酸アンモニウムにより、前記の糖
蛋白質は前記の塩の飽和濃度30〜60％において、
中和点付近のPH範囲中で沈殿する。 前記の糖蛋白質はその分子量に対応して、
25000ないし75000の分子量を有する物質の分離に
適した方法により得ることができる。このために
はゲル過または限外過の方法が有利に使用さ
れる。 前記の糖蛋白質は中性または弱アルカリ性のPH
値において弱塩基性イオン交換体に吸着される。
その際比較的低濃度の緩衝液を使用するのが有利
である。なぜならば塩の濃度を高めるかまたはそ
のPH値を下げることにより吸着を阻止することが
できるからである。他方、このような挙動の知見
により、その糖蛋白質を吸着させ、そして一層高
濃度の塩溶液または低められたPH値を有する緩衝
液を使用して溶出することが可能になる。 本発明の新規な糖蛋白質は、蛋白質を沈殿させ
るために通常使用されるアクリジンおよびキノリ
ン系の水溶性の有機塩基により沈殿しないことが
見出された。前記糖蛋白質はこの方法で通常使用
される濃度において水性の上澄み液に留まつてい
る。従つてアクリジン塩基たとえば２―エトキシ
―６，９―ジアミノアクリジンラクテートまたは
キノリン塩基たとえばビス―（２―メチル―４―
アミノキノリル―６）―カルバミド塩酸塩を付随
する蛋白質を沈殿させるために使用することがで
きる。その際本発明の糖蛋白質は上澄み液に留ま
る。 同様の考えは蛋白質に対する吸着剤として水酸
燐灰石を使用する際にも適用することができる。
本発明の新規な糖蛋白質は水酸燐灰石に対して親
和力を示さないが、他方付随する蛋白質系は水酸
燐灰石により保持される。従つてその糖蛋白質は
水酸燐灰石通過グロブリンに属する。本発明者は
それを水酸燐灰石通過性グロブリン（HPG―２）
と命名することを提唱する。 電気泳動移動度の知見に基づいて、前記の糖蛋
白質を富化するかまたは単離するためにプレパラ
テイブゾーン電気泳動を使用することができる。 前記の糖蛋白質の免疫学的挙動に基づいた親和
力は、いわゆる免疫吸着法の助けによりその糖蛋
白質を富化するために使用することができる。こ
のためにはそれ自体既知の方法で、その親規な糖
蛋白質に対する免疫吸着剤すなわち担体に結合さ
れた抗体を製造することができ、該免疫吸着剤は
前記の糖蛋白質と特異的に結合することができ
る。その後環境条件を変えることによりたとえば
工業用の文献にしばしば記載されているようにし
て再びその糖蛋白質を溶出することができる。 一方では前記の糖蛋白質を富化し、そして他方
では残りの付随する蛋白質からその糖蛋白質の分
離を行なう、前述の方法を選択して組み合わせる
ことにより、本発明による物質の単離を行なうこ
とができる。従つて本発明の目的は新規な糖蛋白
質に対する単一の富化段階および富化操作の組み
合わせによつて達成されるその精製方法にある。
その糖蛋白質の精造法の基準線は新規な糖蛋白質
に対して指向された抗血清と陽性の免疫学的反応
を示す部分がそれぞれ得られるということにあ
る。 上記の操作段階を行なつた後に、その糖蛋白質
がなお免疫学的に証明しうる別の付随する蛋白質
により汚染されているということがしばしば示さ
れる。この場合には特殊な吸着法によりその不純
物が除去される。その際、慣用されている免疫吸
着の技術が使用され、その場合前述の方法によ
り、除去されるべき蛋白質に対して担体と結合し
た抗体が吸着剤として使用される。さらに精製さ
れた新規な糖蛋白質にはなお痕跡量の妊娠に特異
的なβ₁―糖蛋白質および（または）容易に沈殿し
うるα₁―糖蛋白質としても記載されるα₁B―糖蛋
白質が付随していることがしばしばある。それを
分離するためには、交さ結合された寒天製剤たと
えばセフアロース（SEPHAROSE）と共有結合
される、その蛋白質に対して指向された免疫グロ
ブリンを使用することができる。 特定の免疫吸着剤を充填したカラムに加えられ
る蛋白質溶液はカラムにより妨げられない限り通
過し、その際その成分に対して担体が免疫学的に
活性な相手を含むような成分だけが結合される。
この方法により新規な糖蛋白質が不純物から分離
されることができる。 本発明の新規な糖蛋白質を製造するためには上
記の数種の操作法を互いに組み合わせ、そしてそ
の新規な糖蛋白質を免疫学的に確認することがで
きる部分をそれぞれさらに後処理し、一方残りの
部分は捨てる。 本発明の新規な糖蛋白質を製造するための出発
物質としては、その糖蛋白質を免疫学的に確認す
ることができる任意の体液または器官の抽出物が
使用されうる。好ましくは人の胎盤抽出物が使用
され、それは人の胎盤を粉砕しそして水または希
薄な、適当には10％以下の塩溶液、有利には0.5
％の中性塩溶液たとえば塩化ナトリウム溶液で抽
出することにより得られる。適当には胎盤１Kgに
対して約１〜５の抽出溶液が使用される。非溶
解性部分は遠心分離または過によりその抽出物
から分離される。 富化方法は下記の操作の少なくとも１種を、新
規な糖蛋白質を含有する体液に適用し、そして次
にその糖蛋白質に関して富化された部分を得るこ
とを特徴とする。 (a) アクリジンまたはキノリン塩基の水溶性誘導
体、好ましくは２―エトキシ―６，９―ジアミ
ノアクリジンラクテートを５〜10のPH範囲好ま
しくはPH約８で最終濃度が約0.8％（Ｗ／Ｖ）
になるまで加える。その場合前記の糖蛋白質は
本質的に上澄み液中に残存する。 (b) 前記の糖蛋白質が沈殿するまで、中性塩好ま
しくは硫酸アンモニウムを５〜８のほぼ中性の
PH値において硫酸アンモニウムの飽和濃度30〜
60％まで加える。 (c) 糖蛋白質を弱塩基性イオン交換体たとえばジ
エチルアミノエチルセルロースに、その溶液の
伝導率０〜2mSそして中性または弱アルカリ性
のPH値（６〜９）において吸着させる。たとえ
ばPH値約８の約0.01M緩衝液を使用して行な
う。好適に使用される緩衝液はたとえばトリス
―ヒドロキシメチルアミノメタン―HClであ
る。その糖蛋白質の溶出はPH値をPH7.0以下に
下げるか、または伝導率を5mS以上に高めるこ
とにより達成される。 (d) 分子の大きさに基づいて分離する（分子ふる
いによる分画化）。対応する大きさの孔を有す
る重合体たとえばエピクロルヒドリン―交さ結
合デキストラン、たとえば分子量約50000の分
子量を有する蛋白質の富化を目的としてフアル
マシア社によりセフアデツクス（商標名）とし
て製造されたものを充填したカラムを使用する
ゲル過が特に適当である。しかしながらウル
トロゲル（ULTROGEL：商標名、LKB社製）
またはバイオ―ゲル（BIO―GEL：商標名、
バイオーラド・ラポラトリーズ社製）のような
製品もまた使用することができる。 (e) 水酸燐灰石による吸着を行なう。前記の糖蛋
白質は水酸燐灰石の希薄な燐酸塩緩衝液中で結
合されないので、水酸燐灰石は前記糖蛋白質に
付随する蛋白質をその溶液から除去するための
適当な試薬である。 (f) プレパラテイブゾーン電気泳動。電気泳動を
行なうためには、前記の糖蛋白質を含有する溶
液好ましくはアルカリ性緩衝溶液たとえばPH
8.6、イオン強度0.1のナトリウムジエチルバル
ビツレート緩衝液中の溶液が適当である。その
溶液はプレパラテイブ電気泳動のための装置た
とえばN.ハイムブルゲル（Heimburger）氏等
によりベーリングヴエルケ報告、第43巻、第88
頁以下特に第119〜120頁に記載された装置に入
れられる。その装置を使用する場合には、電気
泳動の際に発生するジユール熱を発散させるた
めに、その担体物質を10℃以下に冷却する開放
槽中で、電気泳動で使用される担体を水平に配
置することが重要である。担体物質としては蛋
白質と反応しない物質、有利にはポリビニルク
ロリドまたはその微細な顆粒状共重合体が使用
される。 アルカリ性のPH範囲有利にはPH約8.6、イオン
強度0.08〜0.12、且つ電界強度４〜６ボルト／cm
において電気泳動を行なうことが好適である。PH
値8.6の0.1Mナトリウムジエチルバルビツレート
緩衝液を使用した場合には、本発明の糖蛋白質は
血漿蛋白質のα₁―およびα₂―グロブリンの間に存
在する範囲内の電場で移動する。 本発明の新規な糖蛋白質を得るためにはそれに
関係したゾーンを切りとり、水または水性の塩溶
液たとえば0.5〜１％食塩溶液を用いて不活性な
担体物質から溶出させる。 本発明により製造された糖蛋白質は抗原として
の性質を有する。それを用いて既知の方法により
行なわれる動物の免疫化は、免疫化された動物の
血液中に特定の抗体を生成するために行なわれ
る。その血清は通常の方法より得ることができ、
そしてそれに含有される抗体を富化することがで
きる。この抗血清は既知の免疫学的方法により体
液特に血清中の新規な蛋白質を確認しそして測定
するために使用することができる。 本発明をさらによく理解せしめるために以下に
実施例をあげて説明する。 実施例 冷凍胎盤150Kgを粉砕しそして0.5％水性塩化ナ
トリウム溶液150で抽出する。抽出液を2N水酸
化ナトリウムでPH８に調節し、且つジアミノエト
キシアクリジンラクテートの３％水性溶液50を
加える。１時間放置後、本発明の糖蛋白質
（HPG―２）を含有する上澄み液をサイホンで吸
収し、なお溶液中に残存するジアミノエトキシア
クリジン―ラクテートを分離するために５％の固
体状塩化ナトリウム（11Kg）を加えて過し、そ
して（その液体の重量に基づいて）30％の固体状
硫酸アンモニウムを加え且つ充分に撹拌する。１
時間後に沈殿を別する。 フイルター上に集められた沈殿500gを蒸留水
500mlに溶解し、そして0.05％ナトリウムアジド
を含有するPH値7.0の0.01モルトリス（オキシメ
チル）―アミノメタン―塩酸塩緩衝液に対して透
析する。透析された溶液を遠心分離し、上澄み液
に上記と同一の緩衝液を加えて2000mlとなし、
0.1N水酸化ナトリウム溶液でPH8.0に調節し、且
つ湿つたジエチルアミノエチルセルロース（ゼル
ヴア社製）500gとともに１時間撹拌する。 つぎにジエチルアミノエチルセルロースを過
によりその溶液から分離し、PH値8.0の0.01モル
トリス―（オキシメチル）―アミノメタン―塩酸
塩緩衝液１ずつで２回洗浄し、その後0.85％塩
化ナトリウムおよび0.05％ナトリウムアジドを含
むPH6.5の0.02モルトリス―（オキシメチル）―
アミノメタン―塩酸塩緩衝液500mlずつで３回溶
出させる。 合した溶出液にその液体の重量に基づいて30％
の硫酸アンモニウムを加え、且つ全体を撹拌す
る。前記の蛋白質（HPG―２）を含有する沈殿
を蒸留水300mlに溶解する。その蛋白質溶液を、
１あたり1.0モルの塩化ナトリウムを含有する
PH8.0のトリス―ヒドロキシメチル―アミノメタ
ン―塩酸塩緩衝液に対して透析し、セフアデツク
スＧ―150を充填したカラム（100×20cm）に加
え、且つ上記の緩衝液で溶出させる。溶出の間に
蛋白質の分画化がその分子の大きさに従つて生起
する。 次に特定の抗血清を用いてその溶出液を試験
し、前記の糖蛋白質（HPG―２）を含有する部
分を合し、前述のようにして固体状硫酸アンモニ
ウムを30％加えてその溶液から蛋白質を再度沈殿
させる。 さらに精製するために上記の沈殿を水50mlに溶
解し、PH6.8の0.005M燐酸塩緩衝液に対して透析
し、且つ水酸燐灰石を充填したカラム３×23cmに
加える。そのカラムの展開はPH6.8の0.005M燐酸
塩緩衝液を用いて行なわれる。 前記の糖蛋白質（HPG―２）は流出液中に溶
出されてくる。これを限外過器で濃縮する。次
に濃縮物をPH7.0の0.01Mトリス―HCl緩衝液に対
して透析し、且つDEAE―セフアデツクス（カラ
ム３×23cm）に吸着させる。吸着された蛋白質を
溶出し且つ分離するために０〜２％のNaClグレ
ージエント溶液が使用される。その糖蛋白質
（HPG―２）を含有する溶出部分を合して濃縮す
る。 さらに精製するために上記の濃縮された溶出液
を0.075M炭酸水素アンモニウム溶液に溶解し、
そしてプレパラテイブゾーン電気泳動に付す。
HPG―２を含有するゾーンを分離後切りとり、
且つ生理食塩溶液で溶出し、次にその溶出液を限
外過器で濃縮する。 不純物としてなお依然として存在するα₁B―糖
蛋白質は対応する免疫吸着剤の助けにより除去さ
れる。免疫吸着剤を製造するためには、α₁B―糖
蛋白質に対する抗体をセフアロースと共有結合さ
せる。そしてそのようにして得られた吸着剤をバ
ツチ法によるかまたはカラム中で上記の溶出液と
接触させる。それによりα₁B―糖蛋白質は担体と
結合した抗体に吸着され、他方前記の糖蛋白質
HPG―２は溶液中に留まる。今やHPG―２のみ
を含有する溶液を水に対して透析し且つ凍結乾燥
する。本発明の新規な糖蛋白質であるHPG―２
が約10〜30mg得られる。 前記糖蛋白質は次のアミノ酸組成を示す。（組
成が変動係数（VK）％とともに示される）。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 蛋白質部分が75±６％であり、 (b) 炭水化物部分が24.6±5.2％（ヘキソース8.9
   ±２％、Ｎ―アセチル化されたヘキソサミン
   7.1±1.5％、フコース0.2±0.2％、Ｎ―アセチ
   ル化されたノイラミン酸8.4±1.5％からなる）
   であり、 (c) 沈降係数S_20Wが2.5±0.3Sであり、 (d) 超遠心機を使用して測定された分子量が
   35000±5000であり、 (e) 等電点がPH3.4±0.4であり、 (f) 吸光率Ｅ１％ １cm（280nm）が1.9±0.3であり、 (g) 電気泳動移動度がα₁―およびα₂―グロブリン
   の範囲内であり、 (h) その糖蛋白質に指向された特定の抗体と特異
   的な免疫学的反応を示す ことを特徴とする新規な糖蛋白質。 ２ (a) 蛋白質部分が75±６％であり、 (b) 炭水化物部分が24.6±5.2％（ヘキソース8.9
   ±２％、Ｎ―アセチル化されたヘキソサミン
   7.1±1.5％、フコース0.2±0.2％、Ｎ―アセチ
   ル化されたノイラミン酸8.4±1.5％からなる）
   であり、 (c) 沈降係数S_20Wが2.5±0.3Sであり、 (d) 超遠心機を使用して測定された分子量が
   35000±5000であり、 (e) 等電点がPH3.4±0.4であり、 (f) 吸光率Ｅ１％ １cm（280nm）が1.9±0.3であり、 (g) 電気泳動移動度がα₁―およびα₂―グロブリン
   の範囲内であり、 (h) その糖蛋白質に指向された特定の抗体と特異
   的な免疫学的反応を示す ことで特徴づけられる糖蛋白質が免疫学的に確認
   されうる蛋白質溶液を、少なくとも一種の以下の
   操作すなわち (i) 前記の糖蛋白質が沈殿するまで中性塩を添加
   する、 (ii) 分子ふるいにより分画化し25000〜75000分子
   量を有する部分を得る、 (iii) 前記の糖蛋白質を弱塩基性イオン交換体に吸
   着させ、それから溶出する、 (iv) アクリジンまたはキノリン塩基の水溶性誘導
   体をPH５〜10の範囲内で最終濃度が約0.8％に
   なるまで添加する、 (v) 前記糖蛋白質溶液を水酸燐灰石で処理する、 (vi) プレパラテイブゾーン電気泳動に付しα₁―お
   よびα₂―グロブリンの間のゾーンを得る、 (vii) 前記の蛋白質溶液を免疫吸着剤で処理する に付し、そして前記糖蛋白質に関して富化された
   分画を得ることを特徴とする、上記の糖蛋白質を
   製造する方法。 ３ 人の胎盤から得られた抽出液が蛋白質溶液と
   して使用される前記第２項記載の方法。