DE2256168A1

DE2256168A1 - Histidinreiches 3,8 s-alpha tief 2glykoprotein und verfahren zu seiner isolierung aus humanserum

Info

Publication number: DE2256168A1
Application number: DE19722256168
Authority: DE
Inventors: Heinz Haupt; Norbert Dr Heimburger
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1972-11-16
Filing date: 1972-11-16
Publication date: 1974-06-27
Also published as: DE2256168C3; DE2256168B2

Description

Histidinreiches 3,8 S-Alpha2-Glykoprotein und Verfahren zu seiner Isolierung aus Humanserum Gegenstand dieser meldung ist ein histidinreiches 3,8 S-Alpha2-Glykoprotein und ein Verfahren zu seiner Isolierung.
Das histidinreiche 3,8 S-Alpha2-Glykoprotein ist bisher nicht bekannt gewesen. Es ist gekennzeichnet durch a) einen Peptidanteil von 84 + 4% b) einen Kohlenhydratanteil von 16 + 4%, c) einen Histidinanteil von 9,9 # 0,5%, d) ein elektrophoretisches Verhalten von Alpha2-Glykoproteinen des Plasmas mit einem isoelektrischen Punkt im schwachsauren Bereich, vorzugsweise zwischen : 5,6 u.6,2, e) eine Sedimentationskonstante in der Ultra-Zentrifuge von 3,8 + 0,4 8, f) ein Molekulargewicht zwischen 50.000 und 62.500, g) die Fähigkeit Heparin zu binden und durch Protamin aus dieser Verbindung verdrängt zu werden, h) die Fähigkeit mit einem spezifischen Antiserum zu präzipitieren.
Entsprechend den vorstehenden Angaben kann der Peptid-Anteil des histidinreichen 3,8 S-Alpha2-Glykoproteim zwischen 80 und 88 % schwanken und liegt vorzugsweise bei 84%. Der Kohlenhydratanteil beträgt 12 - 20 %, vorzugsweise 16%, der Histidinanteil 9,4 bis 10,4, vorzugsweise 9,9%. Die Sedimentationskonstante liegt im BereIch von 3,4 bis 4,2, vorzugsweise bei das 1(jolekulargewicilt liegt im Bereich zwischen 50.000 und 62.500, vorzugsweise bei 58.500.
Das Verfahren zur erstellung des histilreichen 3,8 S-Alpha2-Glykoproteins ist dadurch gekennzeichnet, dass man Humanserum bei schwachsaurem pH-Wert mit einem Adsorbens behandelt, das gewaschene Adsorbens mit einem Salzgradienten eluiert, den ersten Eluatgipfel isoliert, auf eine Konzentration von mindestens 2, bringt, im schwach alkalischen Medium einer präparativen Zonenelektrophorese unterwirft, die Alph2-Globulinzone gewinnt, erneut ankonzentriert und gegebenenfalls anschliessend in an sich bekannter weise weiterreinigt.
Besonders gute Ergebnisse werden bei dem Anreicherungsverfahren erzielt, wenn das Humanserum mit destilliertem Wasser verdünnt wird, wobei insbesondere eine Verdünnung von 1z1 Volumen vorteilhaft ist; wenn der pH-Wert bei der Behandlung mit dem Adsorbens bei etwa 6 liegt; wenn als Adsorbens Carboxymethylcellulose verwendet wird; wenn zur Elution das Adsorbens in eine Chromatographie säule eingeschlämmt wird; wenn für den Salzgradienten Ammoniumhydrogencarbonat -erazendet wird; wenn die Konzentration mit Hilfe eines Ultrafilters erfolgt; wenn der pH-Wert bei der präparativen Zonenelektrophorese etwa 8,6 beträgt; wenn als Medium für die Zonenelektrophorese Polyvinylchlorid, zweckmässig in Form eines Granula-ts, verwendet wird und die Feldstärke 3 - 6 V/cm beträgt und wenn die Weiterreinigung des Produkts in Form einer Gelfiltration mit einem Molekularsieb mit definierten Auschlussgrenzen, beispielsweise einem solchen aus vernetztem Dextran (Sephadex G 100) oder Polyacrylamid erfolgt.
Als Adsorbens eignen sich Trägerstoffe wie sie in der Adsorptionschromatographie oder der Affinitätschromatographie üblicherweise verwendet werden, insbesondere Carboxymethylcellulose oder ein auf an sich bekannte Weise an einen festen Trägerstoff kovalent gebundenes Heparin.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist einfach im Vergleich zu denen, die zur Gewinnung anderer Spurenproteine des Serums herangezogen. werden. Die Ausbeute ist mit etwa 60% als gut zu bezeichnen. Das Verfahren beruh-t im wesentlichen auf der Bindung des 3,8 S-Alpha2-Glykoproteins an dem Adsorbens. Die Bindung an einem Adsorbens mit Kationenaustauscher-Rigenschaften ist ungewöhnlich und war wegen des schwachsauren isoelektrischen Punktes des Verfahrensproduktes nicht zu erwarten oder vorauszusehen. Die Adsorption ist nicht durch üblichen Ionenaustausch zu erklären Vielmehr muss angenommen werden, dass zusätzliche Wechselwirkungen, die in Beziehung zu der physiologischen Funktion des Proteins stehen, dafür in Betracht zu ziehen sind. Darauf ist schliesslich die hohd Selektivität des beschriebenen Verfahrens zurückzuführen.
Man.erhält durch das erfindungsgemässeVerfahren ein Produkt, das nach allen Kriterien der Proteinchemie einschliesslich immunologischer Verfahren r ei n ist. Das auf diese Weise gewonnene Protein ist ein Glykoprotein mit einer Sedimentationskonstante von 3,8 S und hat die Beweglichkeit eines Alpha2-Globulins.
Neben dem besonders kennzeichnenden Kriterium des relativ hohen Hist-idingehalts von 9,9% zeigt die quantitative Aminosäureanalyse folgende Anteile: Grenzwerte Mittelwerte Histidin 8.9 - 10.9 9,9 % Lysin 3.2 - 4.0 3,6 % Arginin 6.) - 7.9 7,2 % Asparaginsäure 8.2 - 10.0 9,1 % Threonin 1.8 - 2.2 2,0 % Serin 3.4 - 4.2 3,8 % Glutaminsäure 9.0 - 11.0 10,0 % Prolin 7.3 - 8.9 8,1 % Giycin 2.4 - 3.0 2,7 % Alanin 1.8 - 2.2 2,0 V 1/2 Cystin 2.3 - 2.9 2,6 % Valin 4.0 - 4.8 4,4 % Methionin 0 % Isoleucin 2.1 - 2.5 2,3 % Leucin 4.8 - 5.8 5,3 % Tyrosin 2.9 - 3.5 3,2 & Phenylalanin 5.5 - 6.7 6,1 % Tryptophan 0.6 - 0.8 0,7 % Der Kohlenhydratanteil des vorli@genden Glykoproteins von insgesamt 16 # 4 % ist gekennzeichnet durch einen Gehalt von H@xosen, darunter Galaktose und Manose, Acetylhexosamin und Acetylneuraminsäure. Aus der Analyse der Bestandteile des Hydrolysats errechnet sich ein mittleres Molek@@@@@ gewich@ von 55.500.
Beispiel 3 1 Humanserum werden 1 : 1 mit destilliertem Wasser verdünnt und mit 1 molarer Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt. 120 g Carboxymethyl-Cellulose werden als feuchter Filterkuchen dem Serum zugesetzt und die Suspension eine Stunde bei 200C gerührt.
Anschliessend wird das Adsorbens auf einem Büchner-Filter zurückgewonnen, der Filterkuchen mit Wasser gewaschen und als wässrige Suspension in eine Chromatographies.iule von 1 x 20 cm überführt. Für die Gradienten-Elution der Säule werden zwei miteinander verbundene Flaschen angeschlossen, von denen die eine 300 ccm Wasser und die andere 300 ccm 0,5 Molar Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung enthält. Das Eluat wird kontinuierlich im Durchflussphotometer vermessen und in 3.5 ml engen gesammelt. Nach der Elutionskurve wird der erste Gipfel gepoolt und auf einem Ultrafilter konzentriert. Das Konzentrat wird gegen eine 0,075 mol arc Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung dialysiert und anschliessend in einer präparativen Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlirid (Geon X 427 von Serva, Heidelberg) als Träger bei einer Feldstärke von 4 V/cm und 15 Stunden Laufzeit getrennt. Nach der Elektrophorese wird die Alpha2-Globulin-Zone mit Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung om Träger eluiert und auf dem Ultrafilter konzentriert. Die auf 3, Protein angereicherte Alpha2-Globul in- Zone wird über einer Molekularsieb-Kolonne(Sephadex @ G 100 von Deutsche Pharmacia Frankfurt(10) weitergereinigt, das 3,8 S-Alpha2-Glykoprotein chromatographiert im letzten Gipfel und kann nach Dialyse gegen Wasser und anschliessende Gefriertrockung als salzfreies Trockenprodukt gewonnen werden.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1) Histidinreiches 3,8 S-Alpha2-Glykoprotein, gekennzeichnet durch a) einen Peptidanteil von 84 + 4 %, b) einen Kohlenhydratanteil von 16 + 4 ,', c) einen l1istidinanteil von 9,9 + 0,5 %, d) ein elektrophoretisches Verhalten von Alpha2-Glykoproteinen des Plasmas mit einem isolelektrischen Punkt im schwachsauren Bereich, vorzugsweise zwischen pH 5,6 u. pH 6,2 e) eine Sedimentationskonstante in der Ultra-Zentrifuge von 3,8 8 zur S, f) ein Molekulargewicht zwischen 50.000 und 62.500, g) die Fähigkeit Heparin zu binden und durch Protamin aus dieser Verbindung verdrängt zu werden, h) die Fähigkeit mit einen spezifischen Antiserum zu präzipitieren.

2) Verfahren zur Gewinnung eines histidinreichen 3,8 Alpha2-Glykoproteins gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichn@ dass man Humanserum bei schwachsaurem pH-Wert mit cinem Adsorbens behandelt, das gewaschene Adsorbens mit einem Salzgradienten eluiert, den ersten Eluatgipfel isoliert, auf mindestens 2,0 ¼ Proteingehalt konzentriert, in schwach alkalischem pH-Bereich einer Zonenelektrophore se unterwirft, die Alpha2-Clobulinzone abtrennt, konzentriert und gegebenenfalls in an sich bekannter Weise weiterreinigt.

3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das llumanserum vor der Weiterverarbeitung mit destilliertem Wasser r verdünnt wird.

4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Humanserum mit Wasser im Verhältnis 1:1 Volumen verdünnt wird.

5) Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert bei der Behandlung mit Adsorbens bei etwa 6 liegt.

6) Verfahren nach Ansprüchen- 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Adsorbens Carboxymethylcellulose verwendet wird.

7) Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Adsorbens ein auf an sich bekannte Weise an einen fcsten Trägerstoff kovalent gebundenes Heparin verwendet wird.

8) Verfah-en nach Ansprüchen 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das adsorbens zur Elution in eine Chromatographiesäule eingeschlämmt wird.

9) Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Salzgradi ent aus Ammoniumhydrogencarbonat verwendet wird

10) Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration mit Hilfe eines Ultrafilters erfolgt

11) Verfahren nach Anspruchen 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert bei der präparativen Zonenelektrophorese etwa 8,6 beträgt.

12) Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das als Medium für die Zonenelektrophorese Polyvinylchlorid verwendet wird und die Feldstärke 3 bis 6 V/cm beträgt.

13) Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Weiterreinigung des Produkts in Form einer Gelfiltration mit einem Molekularsieb mit definierten Ausschlussgrenzen erfolgt.