JPH08840B2 - 抗ｐｃｉモノクローナル抗体、これを用いた抗ｐｃｉの精製法及び免疫学的測定法 - Google Patents

抗ｐｃｉモノクローナル抗体、これを用いた抗ｐｃｉの精製法及び免疫学的測定法

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JPH08840B2
JPH08840B2 JP61269588A JP26958886A JPH08840B2 JP H08840 B2 JPH08840 B2 JP H08840B2 JP 61269588 A JP61269588 A JP 61269588A JP 26958886 A JP26958886 A JP 26958886A JP H08840 B2 JPH08840 B2 JP H08840B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト胎盤より分離精製した抗血液凝固活性
を有する物質（以下PCIと略称する）に対して特異的な
モノクローナル抗体およびその利用に関する。
〔従来の技術〕 細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報告（Na
ture,495〜497頁,1975年）以来急速に発展した。すなわ
ち、哺乳動物の脾細胞とミエローマ（骨髄腫）細胞とを
融合させた雑種細胞（ハイブリドーマ）は、用いた脾細
胞の性質に応じて種々の抗体を産生することが知られて
いる。そしてこのハイブリドーマの性質を利用してクロ
ーニングをすることにより、種々の蛋白質、ホルモン等
の生体物質に対するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを作製すること、並びにモノクローナル抗体
を生産する試みがなされている（E.Dale Servier et a
l,Clinical Chemistry,Vol.27,No.11,1797〜1806,198
1）。
一方、本出願人は先にヒトの胎盤から抗血液凝固活性
を有する物質（PCI）を分離精製することに成功し、特
許出願した（特願昭60−217512号）。PCIは下記の性質
を有する医薬として有用な物質である。
分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法，還元状態） 34,000±2,000 等電点（アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） 4.7±0.1 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH4〜10で安定 ハ 血漿中37℃、30分で安定 作 用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、1/
2シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイ
シン、チロシン、フエニルアラニン、ヒスチジン、リジ
ン及びアルギニンの存在が認められる。
PCIの製造法は、その一例を後記実施例１に示した
が、要約すれば以下のとおりである。
まず、ヒト胎盤から胎盤ホモジユネートを調製し、遠
心分離をおこなう。ホモジナイズ操作は、胎盤より羊膜
等を切除した後、生理食塩水にて充分洗浄し、ワーリン
グブレンダー及びポリトロンを用いておこなう。得られ
たホモジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得
る。
こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣は、緩衝液で
充分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取し、以
後の抽出操作に付す。即ち、洗浄沈渣は、EDTA、EGTA、
シユウ酸、クエン酸、ニトリロ三酢酸ナトリウム、リン
酸等のキレート剤を含む緩衝液及び／又は、トリトンＸ
−100、ルブロール、SDS、デオキシコール酸等の界面活
性剤を含む緩衝液に浸し、４℃〜８℃にて一晩放置後、
遠心分離して上清を集め抽出液を得る。この場合、抽出
は、キレート剤及び界面活性剤の両方を用いて行なうこ
ともできる。
一方、胎盤ホモジネート上清は、更に50,000〜100,00
0gの超遠心分離して沈渣部分であるマイクロゾーム分画
を得る。このマイクロゾーム分画を洗浄後、上記と同様
にして、キレート剤及び／又は界面活性剤抽出を行なつ
た後、超遠心分離して上清を集め抽出液を得る。
このようにして得られた抽出液は、硫安分画に付され
る。硫安分画は、先づ上記抽出液に35％飽和となるよう
に固形硫安を加えて遠心分離し上清を分取する。次い
で、上清に対し85％飽和となるように硫安を加えて遠心
分離し、沈渣を分取することによりおこなわれる。
得られた硫安分画は、更に公知の分離・精製手段、例
えば透析、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、
吸着クロマトグラフイー、疎水性クロマトグラフイー、
等電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体を用いたア
フイニテイー・クロマトグラフイー等を単独又は組合せ
用いることにより精製され、PCIが得られる。例えば、
キレート剤又は／及び界面活性剤は抽出液を硫安分画し
て得られた画分を充分透析し、この透析液をDEAE−トヨ
パールを用いる直線濃度勾配法により溶出させ、活性画
分を透析した後、ブルーセフアロースを通過させる。次
いで活性画分を濃縮し、セフアデツクスＧ−100を用い
るゲル過させることによりPCIを得る。
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかし、胎盤中のPCIは微量であり、また通常使用さ
れる各種クロマト法では、PCIとの特異的結合が充分で
はなく、高純度のPCIを取得することは困難であり、加
えて工程が長く回収率も満足のいくものではなかつた。
従つて、高純度のPCIを簡便に高回収率で取得する特
異的精製法の開発が望まれていた。また、抗血液凝固剤
としての用途において、PCIの作用メカニズムの解明、
血中濃度の測定等の手段として、PCIの高感度検出法の
開発も望まれていた。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らは、これらの問題点を解決すべく鋭意研究
を重ねた結果、細胞融合によりPCIに対して特異的なモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、この
ハイブリドーマを利用してPCIに特異的なモノクローナ
ル抗体を取得できること、さらに該モノクローナル抗体
を利用すればPCIの高純度精製、免疫学的定量ができる
ことを見い出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、下記の性質； 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法、還元状態） 34,000±2,000 等電点（アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） 4.7±0.1 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH4〜10で安定 ハ 血漿中37℃、30分で安定 作用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、1/
2シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイ
シン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジ
ン及びアルギニンの存在が認められる を有するヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特
異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を免
疫吸着剤として使用することを特徴とするPCIの精製
法、並びに該モノクローナル抗体の標識体を使用するこ
とを特徴とするPCIの免疫学的測定法を提供するもので
ある。
本発明におけるPCI（以下、単に「PCI」と言う）に対
して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマは、例えば次の如くして製造される。すなわち、
（１）抗原としてPCIを用いて免疫した動物から抗体産
生細胞を調製し、（２）別に骨髄腫細胞を調製し、
（３）これらの細胞を融合させ、（４）得られたハイブ
リドーマを選択的に増殖させ、（５）該ハイブリドーマ
から抗体産生ハイブリドーマを検索し、（６）クローニ
ングにより目的とするモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマを得る。次に各工程について説明する。
（１） 抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよく、抗
原であるPCIで動物を免疫し、その動物の抗体産生細胞
を取得する方法によればよい。動物としては、マウス、
ラツト、ウサギ、モルモツト、ヒツジなどが例示され、
抗体産生細胞としては脾臓、リンパ節、末梢血液等から
分離した細胞などが使用される。免疫方法としては、フ
ロイントのコンプリートアジユバントを併用する方法が
使用される。
（２） 骨髄腫細胞の調製 細胞融合に使用する骨髄腫細胞は、特に限定されず、
多くの哺乳動物の細胞株が利用できるが、抗体産生細胞
の調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するの
が好ましい。用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合
の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマ
だけが増殖できるようにすることによつて、未融合細胞
と融合細胞とを分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗
性を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵
抗性の細胞は、HAT培地中で生育できない性質を有する
ため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞
株PAI、P3−X63−Ag8,P3−X63−Ag8−U1,P3−NSI/1−Ag
4−1,X63−Ag8−6.5.3.,PS2/0−Ag14,FO,S194/5XXO.BU.
1,MPC11−45.6.TG.1.7等が用いられる。
（３） 細胞融合 細胞融合は、通常MEM培地、RPMI1640培地、IMDM培地
などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合（混
合比は通常1:4〜1:10）することにより行なわれる。融
合促進剤としては、平均分子量1,000〜6,000のポリエチ
レングリコール（PEG）が使用できる。PEGの使用濃度は
通常30〜50％である。
（４） ハイブリドーマの選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、10％FCS含有IMDM培地など
で適当に希釈し、遠心分離する。沈渣を選択培地（たと
えば、HAT培地）で浮遊し、96ウエルマイクロプレート
に接種した後、５％炭酸ガス培養装置で培養する。選択
培地で生育してくる細胞はハイブリドーマである。
（５） 抗体産生ハイブリドーマの検索 抗体産生ハイブリドーマの検索は、常法に従えばよ
く、特に限定されない。たとえば、ハイブリドーマの増
殖した培養液を採取し、PCIと反応させたのち、酵素、
ケイ光物質、発光物質などでラベルした第２抗体との反
応により検索できる。
（６） クローニング 抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウ
エル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行
ない、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
以上の操作によつてPCIに特異的なモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマPCI−H39、PCI−H46、PCI−H16
7、PCI−H169、PCI−H176、PCI−H180を得た。これらの
ハイブリドーマはそれぞれPCIに特異的なモノクローナ
ル抗体を産生する新規な細胞である。そこでこれらの細
胞について工業技術院微生物工業技術研究所に寄託すべ
く手続きを行なつたが、61微寄文第1415号として拒否さ
れた。
PCIに特異的なモノクローナル抗体は、上記で得られ
た抗体産生ハイブリドーマを利用することにより調製さ
れる。すなわち、抗体産生ハイブリドーマを適当な培地
中で培養することにより、その培養上清から本発明モノ
クローナル抗体が得られる。また、モノクローナル抗体
を大量に製造するには、骨髄腫細胞の由来動物と同種の
動物にプリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデ
カン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、抗体産生ハイ
ブリドーマを接種することにより、インビボで抗体産生
ハイブリドーマを大量に増殖させる方法が用いられる。
この方法によれば、接種した動物の血清および腹水中に
高濃度のモノクローナル抗体が生ずる。モノクローナル
抗体の分離精製は、通常の血清からの抗体の精製に使用
されている方法に従つて実施できる。
斯くして得られた本発明モノクローナル抗体は、使用
する抗体産生ハイブリドーマの種類によりPCI−A39、PC
I−A46、PCI−Ａ−167、PCI−A169、PCI−A176およびPC
I−A180の６種類存在する。これらのモノクローナル抗
体は、表１に示す性質を有する。なお表１中、分子量は
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、等電
点は等電点電気泳動法（LKB−カラム等電点電気泳動装
置）により、免疫グロブリンサブクラスはオクタローニ
ーの二重免疫拡散法〔ウサギポリクローナル抗体（マイ
ルズ社製）使用〕により測定した。
本発明モノクローナル抗体を免疫吸着剤として利用す
ることによつて、PCIを精製する方法は、例えば本発明
モノクローナル抗体をデキストランゲル、アガロースゲ
ル、ポリビニルゲル等の不溶性担体に結合させ、該モノ
クローナル抗体結合担体を免疫吸着剤として用い、カラ
ムクロマトグラフイーに付すことにより実施される。不
溶性担体とモノクローナル抗体との結合は、ブロムシア
ン法やエポキシ、アミノ、カルボキシル、もしくはホル
ミル基等を介して結合させることができる。
このモノクローナル抗体結合不溶性担体からなるカラ
ムに粗PCIを添加し、カラムに吸着したPCIを溶出させる
ことにより高純度のPCIが得られる。
本発明モノクローナル抗体の標識体を利用するPCIの
免疫測定法は、例えば本発明モノクローナル抗体を酵
素、各種のアイソトープ、螢光物質等の標識剤で標識
し、これにPCIを含む試料を加え、PCIと標識体との免疫
反応生成物の標識量を測定することによつて実施され
る。また一般的な方法としてELISA法を用いることもで
きる。
〔発明の効果〕
本発明のPCIに対して特異的なモノクローナル抗体を
用いれば、PCIの分離精製工程を短縮でき、極めて高純
度のPCIを高回収率で得ることができる。さらに、モノ
クローナル抗体と結合させた不溶性担体は、洗浄すれば
再使用可能であり、精製工程の短縮だけでなく、経済的
であることから工業的に極めて有用である。
また、本発明の抗PCIモノクローナル抗体は、血液の
凝固線溶系の異常疾患の治療におけるPCIの免疫定量に
使用できる。
〔実施例〕
次に実施例を挙げて本発明を説明する。
参考例 抗PCIモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製
造： （１） 抗原（PCI）の精製 （ｉ） ヒト胎盤５個（約2500g）より、膜等を除去
し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。次いでワーリ
ングプレンダーを用いて破砕し、これに更に、50mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.4）２を加え、ポリトロン（Pol
ytron）で磨砕する。得られたホモジネートを7,000rpm1
5分間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣に再
度50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）２を加え、ポリ
トロンでホモジナイズし、7,000rpm15分間遠心分離して
洗浄沈渣を得た。この操作を数回繰り返し、血液成分を
除去して、洗浄沈渣930gを得た。
（ii） （ｉ）で得た沈渣900gに、50mMEDTAを含む50mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）を約２加え、ワーリン
グブレンダーでホモジナイズする。このホモジネートを
４℃にて、一夜撹拌後7,000rpm15分間遠心分離して、抽
出液２を得た。
（iii） （ii）で得た抽出液に固形硫安を加え、35％
飽和とし、４℃で30分〜数時間放置後、7,000rpm15分間
遠心分離し上清を分取した。この上清に更に硫安を加
え、85％飽和とし、４℃で２時間放置した後7,000rpm15
分間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣を20mM
トリス−塩酸緩衝液の少量に溶かし、同緩衝液に対し、
４℃で一夜、充分に透析した。透析中に生じた沈澱は、
7000rpm15分間遠心分離して除き、透析液390mlを得た。
（iv） 得られた透析液を、20mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.4）で平衡化したDEAE−トヨパール（φ5.5×19c
m）に吸着させ、同緩衝液にて充分洗浄した後、０〜0.3
M塩化ナトリウムを含む同緩衝液４を用い、直線濃度
勾配により１分画20mlとなる様に溶出させた。活性画分
は、ほぼ0.15M塩化ナトリウム濃度付近にて溶出され、3
80mlの活性画分を得た。
（ｖ） 得られた活性画分を、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）に対し、４℃で一夜充分に透析し、同緩衝液にて平
衡化したブルーセフアロース（φ2.5×12cm）カラムを
通過させた。A280の吸収を示す通過画分（480ml）を集
め、これをダイアフロー メンブランフイルターYM−10
を用いて濃縮した。
（vi） （ｖ）で得た濃縮液をセフアデツクスＧ−100
を用いるゲル過（φ4.5×75cm）に付し、生理食塩水
で１分画8mlになるように溶出させ、活性画分88〜104を
集め、これを限外過により濃縮して、PCI14.5ml（蛋
白重量136.1ml,Lowry法）を得た。
なお、各精製段階において得た蛋白の収量を下に示
す。
工程 蛋白重量（mg） （ii）工程（EDTA抽出） 7226 （iii）工程（硫安分画、透析） 3184 （iv）工程（DEAE−トヨパール吸着） 531 （ｖ）工程（ブルー−セフアロース吸着） 163 （vi）工程（セフアデツクスＧ−100吸着） 136 （２） 免疫脾細胞の調製 上述の如く精製したPCI100μｇをフロイント・コンプ
リート・アジユバントに乳濁化させ、BALB/C系マウスの
腹腔内に投与した。
以後、２週間の間隔で50μｇのPCIとアジユバント乳
濁液を２回投与し、最後にPCI50μｇのみを投与し免疫
を完了した。
３日後にマウスを殺し、脾臓を摘出、細断した後100
メツシユのナイロン網で過し、脾臓の単離細胞を得
た。
（３） ハイブリドーマの調製 得られた免疫脾細胞に低張液（155mM塩化アンモニウ
ム）を加え赤血球を溶血した後Iscove′s Modified Dul
becco′s Modium（IMDM）で細胞を３回洗い、マウス骨
髄腫細胞PAIはIMDMで３回洗つた。両細胞数を計測し、
脾細胞とPAI細胞の割合を５対１にして遠心した。上清
を捨て、細胞沈渣を十分解きほぐした後ポリエチレング
リコール（PEG）4,000を培地で希釈した45％液を0.5ml
滴下して融合を行つた。37℃、30秒間静置した後、IMDM
1mlを１分間かけて静かに添加した。続いて10mlを５分
間かけて加え、最終40mlにした遠心管を1,000rpm8分間
遠心した。
沈渣を10％Fes添加IMDMで浮遊し再度遠心して上清を
捨てた。
ヒポキサンチン 10-4M、アミノプテリン ４×10-7M
及びチミジン 1.6×10-5Mを加えた（HAT−）10％FCS添
加IMDMを用い沈渣を再浮遊し、96ウエルマイクロプレー
トに100μずつ分注した。３〜４日ごとに培地50μ
追加し、細胞の増殖を見た。
HAT選択により、ハイブリドーマのみ増殖することを
確認した。
（４） 抗体産生ハイブリドーマの検索 ハイブリドーマが増殖したウエルの培養液を採取し酵
素免疫法により、PCIに対する抗体産生ハイブリドーマ
を調べた。まず、96ウエルマイクロプレート（イムノプ
レートＩ、ヌンク社製）にPCIを0.1μg/100μ／ウエ
ル分注し、25℃で18時間静置し吸着させる。次いで検体
である培養液を100μ／ウエル注入し、25℃で２時間
反応させる。0.05％Tween20を含むリン酸緩衝食塩水（P
BS−Tween）で３回洗浄後、ワサビパーオキシダーゼ標
識ヤギ抗マウスIgG（カペル社製）を100μ／ウエル加
え、２時間後PBS−Tweenで３回洗浄する。これに、0.00
1％過酸化水素、0.4mg/mlオルトフエニレンジアミン
（シグマ社製）の0.1Mクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH4.0）を加え、波長492nmの吸光度を測定した。
検体中、PCIに対する抗体が存在したウエルにのみ発
色が観察されるので、発色したウエルの細胞を採取し
た。
（５） PCIに対するモノクローナル抗体産生細胞のク
ローニング マウスの腹腔にIMDMを注射して採取した腹腔細胞をフ
イーダー細胞として使用した。
10％FCS添加IMDMに浮遊した腹腔細胞（１×105個/m
l）を96ウエルマイクロプレートに100μずつ分注し
た。翌日、抗体産生ハイブリドーマを５個/mlに調製
し、各ウエルに100μずつ分注した。３日ごとに培地
を交換し適当な量まで細胞が増殖したウエルから順に培
養上清を採取し、上記と同一の方法により、抗体産生を
確認した。陽性のウエルは再度クローニングし、抗PCI
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。これら
のハイブリドーマは、６種類得られ、前記表１の如くそ
れぞれ産生する抗PCIモノクローナル抗体の種類によ
り、PCI−H39、PCI−H46、PCI−H167、PCI−H169、PCI
−H176、PCI−H180と命名した。
実施例１ 抗PCIモノクローナル抗体の調製： ７週令以上のBALB/C系マウスにプリスタン（アルドリ
ツチ社製）0.5mlを腹腔内投与し、約１週間後、上記で
得たハイブリドーマ１×106個／マウス腹腔内接種し
た。約10日後、マウス腹腔より腹水を採取した。これを
3,000rpm、10分間遠心分離し、上清を分取しその5mlに
硫酸アンモニウムを終濃度が50％飽和濃度になるように
加え、４℃で一夜放置する。次いで、3,000rpm、15分間
遠心分離し、沈渣を0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8）に
溶かし同緩衝液に対して透析した。これを同緩衝液で平
衡化したProtein A Sepharose CL−4B（フアルマシア社
製）カラムクロマトグラフイーに付した。
モノクローナル抗体の溶出は、0.1Mグリシン−0.15M
塩化ナトリウム緩衝液（pH2.7）で行い、抗PCIモノクロ
ーナル抗体を得た。PCI−H39を用いた場合は、PCI−A39
14.2mg、PCI−H46を用いた場合は、PCI−A46 20.2mg、
PCI−H167を用いた場合は、PCI−A167 22.9mg、PCI−H
169を用いた場合はPCI−A169 25.0mg、PCI−H176を用
いた場合は、PCI−A176 25.0mg、PCI−H180を用いた場
合は、PCI−A180 8.6mgをそれぞれ得た。これらの抗PC
Iモノクローナル抗体は、前記表１の性質を示した。
実施例２ 免疫吸着クロマトグラフイーによるPCIの精製： （１） 抗PCIモノクローナル抗体の担体への結合 ブロムシアン活性化セフアロース4B（0.4g）を、1mM
塩酸、0.1M重炭酸ナトリウム−0.5M塩化ナトリウム（pH
8.3）緩衝液で順次洗浄し、ブロムシアン活性化セフア
ロース4Bのカツプリング緩衝液（1.5ml）溶液を調製し
た。
これに、精製モノクローナル抗体PCI−A46 2mgのカ
ツプリング緩衝液（1ml）溶液を加え、室温で２時間振
とうしグラスフイルターで脱水した。更に、0.1Mトリス
−塩酸緩衝液（pH8.0）10mlを加え、室温で２時間振と
うし、残つた活性部位をブロツクした。
得られた抗体結合セフアロース4Bを、0.1Mトリス−塩
酸−0.5M塩化ナトリウム緩衝液（pH8.3）、0.1M酢酸−
0.5M塩化ナトリウム緩衝液（pH4.0）で交互に３回洗浄
し、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）で平衡化し、抗
体カラム46を得た。
（２） 抗体カラムによるPCIの精製 上記で作製した抗体カラム46に、参考例−（ｉ）−
（ii）で得た粗PCI溶液をかけ、平衡化に用いた緩衝液
で充分洗浄した。
PCIの溶出は、0.1M酢酸−0.5M塩化ナトリウム緩衝液
（pH5.0）を用いる方法あるいは、0.1Mトリス−塩酸−
0.1M塩化カルシウム（pH7.4）を用いる方法で行うこと
ができる。
PCIは、素通り画分には認められず、溶出画分から70
％以上の回収率で精製することができた。
尚、精製係数などの結果は表２に示した。PCIの測定
は、実施例３の方法で行つた。
実施例３ 抗PCIモノクローナル抗体を用いるPCIの測定： S.Yoshitakeらの方法〔J.Biochem.92,1413−1424,198
2〕に準じてホースラデイツシユ（西洋わさび）ペオキ
シダーゼ（以下HRPと略す）を、抗PCIモノクローナル抗
体を結合させた。このHRP標識抗PCIモノクローナル抗体
を用いて、以下の如くELISA法によりPCIの測定を行なつ
た。96ウエル平底マイクロプレートの各ウエルに0.05M
炭酸ナトリウム（pH9.6）に溶解したモノクローナル抗
体を100μずつ添加し、25℃で２時間コーテイングし
た。PBS−Tweenで洗浄後、試料の0.1M Tris−HCl、25m
MEDTA、0.05％Tween20（pH7.4）緩衝液溶液100μを加
えた。25℃で一晩反応させた後、PBS−Tweenで洗浄し、
HRP標識モノクローナル抗体のPBS−Tween希釈溶液を100
μ加え、25℃で２時間反応させた。PBS−Tweenで洗浄
後、100μの基質溶液（オルトフエニレンジアミン0.4
mg/mlおよび0.01％過酸化水素の0.1Mクエン酸リン酸緩
衝液、pH5.0）を添加し、25℃で30分間反応させた。4.5
M硫酸50μを加えて反応を停止させた後、492nmにおけ
る吸光度を測定した。その結果、表３に示す如く、コー
テイング用モノクローナル抗体としてPCI−A46を用い、
標識用モノクローナル抗体としてPCI−A39、169、176、
180を用いた場合、及びコーテイング用モノクローナル
抗体としてPCI−A176を用い、標識用モノクローナル抗
体としてPCI−A46、180を用いた場合には、５〜100ng/m
lの範囲のPCIを検出できる。
また、コーテイング用モノクローナル抗体としてPCI
−A46及び176を用い、標識用モノクローナル抗体として
PCI−A180を用いた場合の検量線は、図１に示す如く極
めて感度が高く、しかも良好な直線性を示した。また、
コーテイング用モノクローナル抗体としてPCI−A46を用
い、標識用モノクローナル抗体としてPCI−A39、169及
び176を用いた場合の検量線は図２に示す如く、良好な
直線性を示した。
【図面の簡単な説明】 図１及び２は、実施例３のPCI測定法におけるPCI濃度と
吸光度（492nm）との関係を示す図面である。 図1:コーテイング用モノクローナル抗体としてPCI−A46
及び176使用 標識用モノクローナル抗体としてPCI−A180使用 図2:コーテイング用モノクローナル抗体としてPCI−A46
使用 標識用モノクローナル抗体としてPCI−A39、169及び176
使用
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ａｃｔａ．Ｏｂｓｔ．Ｇｙｎａｅｃ．Ｊ ｐａｎ．，36［12］（1984）Ｐ．2583− 2592 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅ ｃ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．，17［２− ３］（1984）Ｐ．149−154 Ａｒｃｈ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，237［Ｓ ｕｐｐｌ．］（1985）Ｐ．385 細胞工学．１［１］（1982）Ｐ．23−29

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の性質； 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
    法、還元状態） 34,000±2,000 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気
    泳動法） 4.7±0.1 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH4〜10で安定 ハ 血漿中37℃、30分で安定 作用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
    ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、1/
    2シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイ
    シン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジ
    ン及びアルギニンの存在が認められる を有するヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特
    異的なモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】下記の性質； 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
    法、還元状態） 34,000±2,000 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気
    泳動法） 4.7±0.1 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH4〜10で安定 ハ 血漿中37℃、30分で安定 作用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
    ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、1/
    2シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイ
    シン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジ
    ン及びアルギニンの存在が認められる を有するヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特
    異的なモノクローナル抗体を免疫吸着剤として使用する
    ことを特徴とするヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質の
    精製法。
  3. 【請求項３】下記の性質； 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
    法、還元状態） 34,000±2,000 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気
    泳動法） 4.7±0.1 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH4〜10で安定 ハ 血漿中37℃、30分で安定 作用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
    ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、1/
    2シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイ
    シン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジ
    ン及びアルギニンの存在が認められる を有するヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特
    異的なモノクローナル抗体の標識体を使用することを特
    徴とするヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質の免疫学的
    測定法。
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